專利名稱：雞蛋清活性抽出物之提取及活性測定技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，醫(yī)藥，保健食品。
背景技術(shù)：
雞蛋清也稱雞蛋蛋白作為食物是可每天食用的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來源。然而，遺憾的是雞蛋清中所含的更有價值的生物活性物質(zhì)及其功能一直鮮為人們所關(guān)注。那是因?yàn)樘烊坏碾u蛋清中的堿性環(huán)境以及蛋清中某些蛋白質(zhì)的阻礙作用，抑制了雞蛋清中所含的活性物質(zhì)的生物活性。而且該活性物質(zhì)不穩(wěn)定對熱敏感，所以雞蛋清煮熟后就不可逆地失去了其生物活性。另外缺乏快速有效生物活性物質(zhì)檢測方法也是制約人們發(fā)現(xiàn)雞蛋清生物活性成份的重要因素之一。
凡培養(yǎng)過動物細(xì)胞的人都知道，在絕大部分的動物細(xì)胞培養(yǎng)中胎牛血清是必不可少的添加物。因?yàn)樘ヅＱ逯泻写碳ぜ?xì)胞增殖和發(fā)育所必需的復(fù)合成份。雞蛋清作為雞胚胎發(fā)育的營養(yǎng)供應(yīng)體，可以推測雞蛋清含有類似于血清中那些刺激細(xì)胞增殖和發(fā)育的成份。1957年Evans等首次報(bào)導(dǎo)說全雞蛋抽出物中含有刺激細(xì)胞增殖成份。然而，1983年Fujii and Gospodarowicz卻報(bào)導(dǎo)說雞蛋黃中含有刺激細(xì)胞增長成份而雞蛋清中含有阻礙細(xì)胞增長成份。1989年Yamada等報(bào)導(dǎo)說雞蛋黃中的脂蛋白(lipoprotein)可刺激human-human hybridoma HB4C5細(xì)胞生產(chǎn)免疫球蛋白。
在當(dāng)今的西藥開發(fā)過程中，動物細(xì)胞模型已成為藥物篩選所不可少的重要工具。能否建立一個合適的特定的細(xì)胞模型是關(guān)系到能否成功地篩選到某一特定藥物的關(guān)鍵。尋找雞蛋清中的活性成份也不例外。一個有效的提取方法還要配合一個合適的活性檢測方法，二者缺一都只能得到陰性結(jié)果，而且還將弄不清是沒有提取到活性成份還是檢測方法不對使得到的活性成份沒有被測出來。通常在動物細(xì)胞培養(yǎng)中都添加10％的胎牛血清，在這條件下因?yàn)樘ヅＱ灞旧順O強(qiáng)的促細(xì)胞生長的作用會給檢測帶來極大的背景，而在無血清情況下培養(yǎng)的動物細(xì)胞其生命力是很弱的，除非被測成份對細(xì)胞生長有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，否則細(xì)胞很快就會死掉。故若在這兩種情況下篩選活性物質(zhì)一定會有很多活性物被漏篩或忽略掉，因此不能在這兩種情況下尋找那些活力還較弱的未完全精制或未濃縮的活性成份。另外，要直接測定某一活性成份對細(xì)胞增殖的影響一般需要2至5天時間。這么長的時間既影響效率又不利于活性不穩(wěn)定成份的篩選。
本發(fā)明通過幾種溫和方法的有機(jī)組合在不同的變性臨界點(diǎn)把雞蛋清中阻礙活性的蛋白質(zhì)逐級除去后以CV-1細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)液中的貼壁和伸展速率作為快速且靈敏的生物活性成份的初篩工具，再通過使用PC12，Jurket等多種哺乳動物細(xì)胞株在低濃度的胎牛血清下的進(jìn)一步檢測，首次分離出具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化和神經(jīng)突起的生長，促進(jìn)免疫細(xì)胞和上皮纖維細(xì)胞增殖等效果的多功能的生物活性組分---雞蛋清活性抽出物，簡稱為CEWAE(Chicken Egg White Active Extract)。

發(fā)明內(nèi)容
需解決的技術(shù)問題由于天然雞蛋清中的堿性環(huán)境和蛋清中某些蛋白(如粘蛋白)的抑制作用，雞蛋清活性組分本身的不穩(wěn)定性以及缺乏合適有效的生物活性檢測方法制約了人們對雞蛋清中所含的生物活性物質(zhì)的關(guān)注和應(yīng)用。因此，如何提取和穩(wěn)定雞蛋清中的生物活性成份以及如何測定其活性以避免誤失已提取到的生物活性成份是本發(fā)明所需解決的技術(shù)問題。
技術(shù)方案本發(fā)明通過對雞蛋清進(jìn)行超聲波處理，稀釋，改變pH值，電泳，硫酸銨沉淀等溫和方法的有機(jī)組合在不同的變性臨界點(diǎn)將蛋清中那些阻礙活性的蛋白質(zhì)逐級除去后，再重新調(diào)節(jié)其緩沖體系以活化和穩(wěn)定蛋清中的生物活性成份，并以CV-1細(xì)胞株在低血清培養(yǎng)液中的貼壁和伸展速率作為快速篩選蛋清生物活性成份的方法，再配合使用PC12，Jurket等多種哺乳動物細(xì)胞株在低濃度的胎牛血清下檢測被測成份的活性，從而獲得了具有高生物活性的雞蛋清活性抽出物CEWAE(Chichen Egg White Active Extract)。其基本技術(shù)路線如下(細(xì)節(jié)另見“具體實(shí)施方式
”)新鮮雞蛋->除去蛋黃分離出蛋清->超聲波處理->稀釋蛋清->酸化->超高速離心->分離出上清液->電泳->硫酸銨沉淀->攪拌過夜->超高速離心->除去上清液->溶解沉淀->透析過夜->無菌過濾->細(xì)胞培養(yǎng)鑒定活性組分->低溫保存。
有益效果以本發(fā)明所述的技術(shù)分離和鑒定出來的雞蛋清活性抽出物CEWAE(Chicken EggWhite Active Extract)是一組多功能的活性復(fù)合物。經(jīng)動物細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)證明CEWAE可刺激PC12細(xì)胞的分化和神經(jīng)突起的生長，促進(jìn)淋巴T細(xì)胞Jurket，巨噬細(xì)胞MG7，巨大細(xì)胞HMC-1的增長，促進(jìn)或保護(hù)纖維細(xì)胞CV-1，UC373，BHK2，A549；上皮細(xì)胞IEC-18的生長?？赏脕黹_發(fā)生產(chǎn)一系列既有助于健腦，增強(qiáng)免疫力，防止皮膚老化等功能，又無副作用適合長期使用的純天然多功能的生物藥劑，保健營養(yǎng)品，食品添加劑，化妝品和生物醫(yī)藥以及供科學(xué)試驗(yàn)及動物細(xì)胞培養(yǎng)用的試劑等。
本技術(shù)也適合于提取其它禽蛋蛋清生物活性抽出物。本發(fā)明者應(yīng)用該提取技術(shù)已成功地從鴨蛋清和鵪鶉蛋清中提取到了類似于CEWAE的活性組分，并發(fā)現(xiàn)鵪鶉蛋蛋清活性抽出物QEWAE(Quail Egg White ActiveExtract)的活力與CEWAE的活力相近，而鴨蛋蛋清活性抽出物DEWAE(Duck Egg WhiteActiveExtract)的活力卻不到CEWAE活力的三分之一。相對而言，由于雞蛋來源廣泛且價格便宜從而使大規(guī)模生產(chǎn)雞蛋清活性抽出物CEWAE具有更高的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式I，CEWAE的提取新鮮雞蛋破殼除去蛋黃分離出蛋清，在0至4℃下用超聲波間歇地處理蛋清5次每次1分鐘，再于每100ml的蛋清中加入200ml的蒸餾水并攪拌，在攪拌的同時用鹽酸調(diào)此稀釋的蛋清pH值至5，然后放在冷庫(0至4℃)里靜置2小時。隨后用超高速離心機(jī)離心20分鐘(30000g，4℃)，棄去沉淀收集上清液。將此上清液靜置于臥式電泳槽的陰極槽上同時加緩沖液于陽極槽上，電泳過夜。次日收集陽極槽上溶液，加入等量的飽和硫酸氨溶液，攪拌60分鐘后再放在冷庫(0至4℃)里靜置過夜。次日用超高速離心機(jī)離心20分鐘(40000g，4℃)，棄去上清液收集沉淀物，用100ml的PBS緩沖液溶解所收集的沉淀物，將此溶液裝入透析袋并于3立升的PBS緩沖液中透析過夜，如此再重復(fù)透析一次。然后用高速離心機(jī)離心20分鐘(10000g，4℃)，棄去沉淀收集上清液，用0.2u的濾膜無菌過濾后即為雞蛋清活性抽出物CEWAE(Chicken Egg White Active Extract)。取出5ml作細(xì)胞培養(yǎng)以鑒定其活性，其余的保存于冷庫中。
II，CEWAE的活性鑒定本發(fā)明通過對多種哺乳動物細(xì)胞株對CEWAE之生物活性反應(yīng)的反復(fù)考察后，確立了以CV-1細(xì)胞株為代表的生物活性成份的快速初篩方法，以PC12細(xì)胞株為代表的神經(jīng)細(xì)胞模型和以T-細(xì)胞株Jurket為代表的免疫細(xì)胞模型作為CEWAE生物活性的鑒定方法，現(xiàn)分述如下1，用CV-1細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)中快速測定CEWAE促進(jìn)纖維細(xì)胞貼壁及伸展的活性將Confluent CV-1細(xì)胞用PBS緩沖液輕蕩兩遍后以0.5％Tripsin-0.5％EDTA懸浮，再以10倍以上含2％FBS(胎牛血清)的細(xì)胞培養(yǎng)液MEM稀釋細(xì)胞至密度為100000cells/ml；準(zhǔn)備一個6槽的細(xì)胞培養(yǎng)盤(6-well plate)，在每個槽中分別注入1.8毫升上述細(xì)胞懸浮液，將其成兩組(每組各三個槽)測試組和對照組。在測試組的每個槽中添加0.2毫升(即10％)CEWAE，而在對照組的每個槽中添加0.2毫升PBS緩沖液(無CEWAE)，然后在37℃，5％CO2保溫箱里培養(yǎng)。在接種后3，6，24及48小時等不同時間用顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。試驗(yàn)結(jié)果是接種3小時后，在測試組的每個培養(yǎng)槽中約有80％的細(xì)胞都貼壁甚至伸展出纖維突起；而在對照組的每個培養(yǎng)槽中大多細(xì)胞仍然和剛接種時一樣圓滾滾的。3天后計(jì)數(shù)活細(xì)胞并比較兩組培養(yǎng)液中的平均活細(xì)胞數(shù)。其試驗(yàn)結(jié)果是在添加了10％CEWAE的培養(yǎng)液中的CV-1細(xì)胞密度比接種時高出一倍以上，而對照組(無CEWAE)的每個培養(yǎng)槽中的細(xì)胞80％以上都已死亡。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞接種3小時后的觀察結(jié)果可以用作快速初篩以判斷被測組分是否含有生物活性的方法。
2，用PC12細(xì)胞株在低濃度的血清培養(yǎng)中鑒定CEWAE誘導(dǎo)神經(jīng)生長的活性將ConfluentPC12細(xì)胞用PBS緩沖液輕蕩兩遍后以0.5％tripsin/0.5％EDTA懸浮，再以10倍以上的含有15％FBS(胎牛血清)的細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640稀釋細(xì)胞至密度為50,000cells/ml；準(zhǔn)備一個6-槽的細(xì)胞培養(yǎng)盤(6-well plate)，在每個槽中注入2毫升上述細(xì)胞懸浮液，并放在37℃，5％CO2保溫箱里培養(yǎng)。一天后，將上述6個接種PC12細(xì)胞的培養(yǎng)槽分成兩組(每組各三個槽)測試組和對照組。除去每個槽中的舊培養(yǎng)液，加入3ml的PBS緩沖液輕蕩后也除去，再在測試組的每個槽中加入1.8ml含有1％FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液EME和0.2ml的CEWAE(終濃度為10％)，而在對照組的每個槽中加入1.8ml含1％FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液EME和0.2ml的PBS緩沖液(無CEWAE)。然后置于37℃，5％CO2保溫箱里繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述方法，每天更換培養(yǎng)液并持續(xù)培養(yǎng)7天。用顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。試驗(yàn)結(jié)果是7天后在測試組的每個培養(yǎng)槽中有30％的細(xì)胞長出細(xì)長的神經(jīng)纖維；而在對照組的每個培養(yǎng)槽中大多細(xì)胞都已死亡并無明顯的神經(jīng)纖維被觀察到。
3，用Jurket細(xì)胞株在低濃度的血清培養(yǎng)中鑒定CEWAE促進(jìn)淋巴T細(xì)胞增殖的活性取5毫升懸浮培養(yǎng)于RPMI-1640/10％FBS細(xì)胞培養(yǎng)液中密度約為1,000,000cells/ml的Jurkat細(xì)胞，在室溫下離心(1000rpm/5min)后除去舊培養(yǎng)液，再以含2％FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640懸浮細(xì)胞并調(diào)至細(xì)胞密度為300,000cells/ml；準(zhǔn)備一個6-槽的細(xì)胞培養(yǎng)盤(6-well plate)，在每個槽中分別注入1.8毫升上述細(xì)胞懸浮液，將其分成兩組(每組各三個槽)；測試組和對照組。在測試組的每個槽中添加0.2毫升(即10％)CEWAE，而在對照組的每個槽中添加0.2毫升PBS緩沖液(無CEWAE)，然后在37℃，5％CO2保溫箱里培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)活細(xì)胞并比較兩組培養(yǎng)液中的平均活細(xì)胞數(shù)。其試驗(yàn)結(jié)果是在添加了10％CEWAE的培養(yǎng)液中的Jurkat細(xì)胞密度比對照組(無添加CEWAE)的培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度高出1倍以上。
權(quán)利要求
1，一種禽蛋蛋清活性抽出物之提取技術(shù)，其特征是通過對禽蛋蛋清進(jìn)行超聲波處理，稀釋，改變pH值，電泳及硫酸銨沉淀等溫和方法的有機(jī)組合在不同的變性臨界點(diǎn)把蛋清中阻礙活性的蛋白質(zhì)逐級除去后再用pH值中性的緩沖液活化和穩(wěn)定蛋清中的生物活性成份。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋清活性抽出物之提取技術(shù)，其特征是將蛋清稀釋后調(diào)pH值至酸性，然后高速離心除去沉淀收集上清液。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋清活性抽出物之提取技術(shù)，其特征是通過電泳分離蛋清活性成份并以硫酸氨濃縮該活性成份，然后用中性的緩沖液透析除去硫酸氨。
4，一種禽蛋蛋清生物活性測定技術(shù)，其特征是在等于或低于2％血清的培養(yǎng)液中測定蛋清生物活性成份促進(jìn)纖維細(xì)胞貼壁及伸展的活性，或誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)生長的活性，或促進(jìn)CV-1和Jurkat增殖的活性.
5，根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽蛋蛋清生物活性測定技術(shù)，其特征是通過顯微鏡觀測并比較CV-1或A-549細(xì)胞或其他纖維細(xì)胞株在添加了被測成份的培養(yǎng)液中接種3小時后已貼壁和伸展開的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例是否大于30％并明顯大于對照組(在無添加被測成份的培養(yǎng)液中細(xì)胞)作為判斷該被測成份是否有活性的快速篩選方法。
6，根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽蛋蛋清生物活性測定技術(shù)，其特征是通過顯微鏡觀測PC12細(xì)胞株在添加了被測成份并含有等于或低于2％FBS的培養(yǎng)液EME中，經(jīng)5天以上培養(yǎng)后是否長出細(xì)長的神經(jīng)纖維作為判斷該被測成份是否有促神經(jīng)生長活性的方法。
7，根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽蛋蛋清生物活性測定技術(shù)，其特征是比較動物纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞在添加了被測成份并含有等于或低于2％FBS的培養(yǎng)液中經(jīng)3天以上培養(yǎng)后其活細(xì)胞數(shù)是否比接種時高，并明顯高于(＞1.5倍)對照組(在無添加被測成份的培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù))作為判斷該被測成份是否具有促該被測細(xì)胞的增殖活性的方法。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于雞蛋清活性抽出物CEWAE的提取及活性成分的測定技術(shù)。天然雞蛋清中的鹼性環(huán)境和某些蛋白質(zhì)的阻礙作用以及該活性物質(zhì)的不穩(wěn)定性使得雞蛋清活性組分鮮為人們所關(guān)注。本發(fā)明通過超聲波處理，稀釋，酸化，電泳，硫酸銨沉淀等溫和方法的有機(jī)組合及應(yīng)用快速且靈敏的活性測定技術(shù)從天然雞蛋清中提取到了多功能的生物活性抽出物。本技術(shù)也適合于提取其它禽蛋蛋清生物活性物質(zhì)且無需使用有機(jī)溶劑和有害化學(xué)物質(zhì)。以本技術(shù)提取的蛋清活性抽出物具有刺激神經(jīng)生長，促進(jìn)免疫細(xì)胞和上皮纖維細(xì)胞增殖等效果，可望用來開發(fā)一系列有助于健腦，增強(qiáng)免疫力，防止皮膚老化等純天然生物藥品或食品和用于科學(xué)試驗(yàn)的試劑等。
文檔編號C07K1/14GK1611227SQ20031010374
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者鄒潮 申請人:鄒潮