專利名稱：紫杉醇的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用紫杉醇的藥理作用靶點-微管蛋白，純化紫杉醇與三尖杉寧堿(Cephalomannine)混合物中紫杉醇的方法。是屬于紫杉醇的進一步純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種二萜類化合物，具有廣泛的抗癌活性，于1992年首先經(jīng)美國FDA(Food and Drug Administration)批準用于治療卵巢癌和乳腺癌，目前還在進行治療其它癌癥如肺癌、結(jié)腸癌的臨床實驗。
從紅豆杉植物的枝、莖、葉中提取的紫杉醇混合物，是指主要含有紫杉醇與三尖杉寧堿的產(chǎn)物，為獲得純品紫杉醇，需要進一步純化，將紫杉醇與三尖杉寧堿分開，但是由于三尖杉寧堿的結(jié)構(gòu)和物性與紫杉醇具有極其相似性，它們的分離工作非常困難。目前有關(guān)的分離方法見如下文獻1、文獻“J.Nat.Prod.，1984，47(1)131-137”報道中指出，被富集紫杉醇與三尖杉寧堿共存，最后用HPLC分離紫杉醇與三尖杉寧堿。
2、文獻“J.Nat.Prod.，1992，55(252)259”報道中指出，在氧化鋨存在條件下，催化氧化三尖杉寧堿側(cè)鍵雙鍵，得到二醇，然后用層析法和重結(jié)晶方法與紫杉醇分離。
3、文獻“US Patent 5,334,732和5,336,648”報道重指出，用臭氧氧化三尖杉寧堿側(cè)鏈的方法。
4、專利“CN1182424”報道中指出，通過溴化不飽和側(cè)鏈紫杉醇尤其是三尖杉寧堿，然后層析分離并從極性和非極性溶劑混合物中結(jié)晶出紫杉醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用微管蛋白純化紫杉醇混合物中紫杉醇的方法。
本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種用微管蛋白純化紫杉醇混合物中紫杉醇的方法，包括下列步驟(1)將紫杉醇混合物溶解于二氯甲烷中；(2)將微管蛋白混合于摩爾比為20∶100∶1∶1的由磷酸鈉、谷氨酸鈉、乙二胺四乙酸及二硫蘇糖醇組成的緩沖液水相中；(3)將上述有機溶液與上述緩沖液水相混合，攪拌，靜置，分層取出水相液；
(4)向上述水相液中加入有機溶劑和解離劑，攪拌，靜置分層后，取出有機相液；(5)將上述有機相液蒸發(fā)，結(jié)晶，過濾后得到純品。
上述方法中所述解離劑為氯化鈣或氯化鎂本發(fā)明具有下述有益效果該方法具有過程簡單，獲取的產(chǎn)品純度高的特點。
具體實施例方式
紫杉醇的藥理作用機理是催化微管蛋白聚合成微管并結(jié)合到微管上穩(wěn)定和抑制微管解聚，這樣對于迅速分裂的癌細胞，紫杉醇阻滯其有絲分裂紡錘體，使癌細胞停止在G2期和M期直至死亡。利用微管蛋白聚合-解聚這一個可逆過程，在一定的條件下，使紫杉醇被聚合的微管“吸附”，然后在另外的條件下使微管解聚成二聚體的形式，使結(jié)合的紫杉醇“脫附”到溶劑中，整個過程通過紫杉醇的相轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)。最后通過重結(jié)晶等方法得到高純度的紫杉醇，從而使紫杉醇與其它不與微管蛋白作用的組分分離，達到純化目的。本發(fā)明所用的紫杉醇藥理作用靶點-微管蛋白是參照文獻(Farrell K W，Wilson L.Biochemistry，1984，233714)自牛腦制得。本發(fā)明的實施，主要技術(shù)是選擇紫杉醇混合物的溶解劑和紫杉醇-微管蛋白復(fù)合物的解離劑。紫杉醇混合物溶解劑的選擇，要求對紫杉醇的溶解度大，與水不互溶，為此經(jīng)過大量的重復(fù)性的實驗，最后選擇最為適宜的二氯甲烷。解離劑是用于解離紫杉醇-微管蛋白復(fù)合物，要求它即具有上述解離作用又能溶于水。通過實驗，確定氯化鎂氯化鈣最為適宜。
本發(fā)明具體操作時，注意掌握有機溶劑和緩沖液的加入量，他們的加入量一方面要與紫杉醇混合物的總量相匹配，又要做到與紫杉醇的量相匹配，這樣有利于產(chǎn)物的后處理及減少工作量，降低制備成本。本發(fā)明對紫杉醇分析為高效液相色譜法，采用外標法定量。
下面以實施例對本發(fā)明加以進一步的說明。
實例一將含有58.2％紫杉醇和39.8％三尖杉寧堿的混合物50mg加入到100ml二氯甲烷中于30℃下溶解，并與150ml微管蛋白含量為1.5mg/ml緩沖液(20mM磷酸鈉+100mM谷氨酸鈉+1mM乙二胺四乙酸+1mM二硫蘇糖醇)混合，靜置30分鐘后，兩相分層。用分液漏斗分出水相，再向水相中分別加入新鮮的二氯甲烷50ml和5mg氯化鎂并冷卻至5℃，保持30分鐘。然后將水相與有機相分開，將有機相蒸發(fā)至干得殘余物，再用30ml丙酮-己烷(1∶1)溶解殘余物，放置在冰箱中結(jié)晶并過濾得到含量為98.3％的紫杉醇23.6mg。
實例二將含有65.6％紫杉醇和30.2％三尖杉寧堿的混合我30mg加入到100ml二氯甲烷中于25℃下溶解，并與150ml微管蛋白含量為1.5ml/ml緩沖液(20mM磷酸鈉+100mM谷氨酸鈉+1mM乙二胺四乙酸+1mM二硫蘇糖醇)混合，靜置30分鐘后，兩相分層。用分液漏斗分出水相，再向水相中分別加入新鮮的二氯甲烷50ml和5mg氯化鎂并冷卻至5℃，保持30分鐘。然后將水相與有機相分開，將有機相蒸發(fā)至干得殘余物，再用30ml丙酮-己烷(1∶1)溶解殘余物，放置在冰箱中結(jié)晶并過濾得到含量為98.5％的紫杉醇18.1mg。
實例三將含有36.8％紫杉醇和55.1％三尖杉寧堿的混合物60mg加入到100ml二氯甲烷中于25℃下溶解，并與150ml微管蛋白含量為1.5mg/ml緩沖液(20mM磷酸鈉+100mM谷氨酸鈉+1mM乙二胺四乙酸+1mM二硫蘇糖醇)混合，靜置30分鐘后，兩相分層。用分液漏斗分出水相，再向水相中分別加入新鮮的二氯甲烷50ml和5mg氯化鎂并冷卻至5℃，保持30分鐘。然后將水相與有機相分開，將有機相蒸發(fā)至干得殘余物，再用30ml丙酮-己烷(1∶1)溶解殘余物，放置在冰箱中結(jié)晶并過濾得到含量為98.1％的紫杉醇20.3mg。
權(quán)利要求
1.一種紫杉醇的提取方法，其特征在于，包括下列步驟(1)將紫杉醇混合物溶解于二氯甲烷中；(2)將微管蛋白混合于摩爾比為20∶100∶1∶1的由磷酸鈉、谷氨酸鈉、乙二胺四乙酸及二硫蘇糖醇組成的緩沖液水相中；(3)將上述有機溶液與上述緩沖液水相混合，攪拌，靜置，分層取出水相液；(4)向上述水相液中加入有機溶劑和解離劑，攪拌，靜置分層后，取出有機相液，；(5)將上述有機相液蒸發(fā)，結(jié)晶，過濾后得到純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇的提取方法，其特征在于，所述解離劑為氯化鈣或氯化鎂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫杉醇的提取方法，包括下列步驟將紫杉醇混合物溶解于二氯甲烷中；將微管蛋白混合于摩爾比為20∶100∶1∶1的由磷酸鈉、谷氨酸鈉、乙二胺四乙酸及二硫蘇糖醇組成的緩沖液水相中；將上述有機溶液與上述緩沖液水相混合，攪拌，靜置，分層取出水相液；向上述水相液中加入有機溶劑和解離劑，攪拌，靜置分層后，取出有機相液；將上述有機相液蒸發(fā)，結(jié)晶，過濾后得到純品。
文檔編號C07D305/00GK1623989SQ200310107188
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者張峰 申請人:張峰