專利名稱：多塞瑞龍化合物與制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用真菌發(fā)酵液提取的化合物與制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
(2)背景技術紅樹林是熱帶和亞熱帶海岸潮間帶特有的植物類群，是海岸重要的濕地生態(tài)系統，除分布著大量的海洋動植物和微生物外，還存在豐富的內生真菌資源。據報道(1、Strol，G.A.Endophytes as sources of bioactive products.Microbes and Infection.20035535-544；2、Schmidt，K.，Gunther，W.，Stoyanova，S.，et al.a neurotrophicpyridone alkaloid from Paecilomyces militaris.Org Lett.2002，24；4(2)197-199；3、Bandaranayake，W.M.Bioactivities，bioactive compounds and chemical constituentsof mangrove plants.Wetland Ecology and Management 2002，10421-452.)世界上50％的真菌都能從紅樹植物中分離到，但目前對紅樹林內生真菌進行的系統報道相對很少，而且主要集中在生態(tài)學領域。紅樹植物特殊的生長環(huán)境，決定了其內生真菌有特殊的代謝途徑，能產生特異結構的代謝產物。在對其次級代謝產物化學成分進行的不多的研究中，人們已發(fā)現了具有很高生理活性和全新結構的物質，例如具有選擇性細胞毒性的新結構環(huán)肽類化合物等?？傊畬t樹植物內生真菌的研究才剛剛起步，它具有較高的理論價值和實際應用價值。
(3)發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一類新的來源于紅樹植物內生真菌的具有潛在藥用價值的化合物及其提取分離方法，以及它們在制備抗腫瘤藥物方面的應用。
本發(fā)明所說的多塞瑞龍化合物是從紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3，簡稱HTF3)的發(fā)酵液中提取分離到四種結構類似的化合物，結構分別為多塞瑞龍A，[3，5-二羥基-2-(7-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(記為化合物A)、多塞瑞龍B，[3，5-二羥基-2-(6-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(記為化合物B)、多瑞塞龍C，[3，5-二羥基-2-(8-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(記為化合物C)和多塞瑞龍D，6，8-二羥基-1(R)-(5-羥基-己基)-異苯并二氫吡喃-3-酮(記為化合物D)。
本發(fā)明所用的紅樹植物內生真菌HTF3已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學校內)，保藏號為CCTCC NOM203067，保藏日期為2003年8月29日，其分類命名為小穴殼菌屬(Dothiorella SP.)。
化合物A、化合物B、化合物C和化合物D的結構式分別為 本發(fā)明所說的多塞瑞龍化合物的制備方法為1)內生真菌的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基以克為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5-2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，室溫下培養(yǎng)5-8天；2)內生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以克為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)5-8天；3)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體；4)將過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/(0.1～4)為洗脫劑梯度洗脫；5)收集、濃縮得化合物產物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集5-6分鐘和6.5-7.5分鐘時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集18-19分鐘的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集14-15分鐘的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
化合物A的實驗數據EMSm/z(rel.int.)339.1[M+1]+(60.9)，356.3[M+NH4]+(43.6)，361.2[M+Na]+(100)，694.2[2M+NH4]+(4.3)，698.5[2M+Na]+(58)；1H NMR and13C NMR(400MHz，DMSO-d6)見表1和表2；化合物B的實驗數據EMSm/z(rel.int.)339.0[M+H]+(24.1)，356.3[M+NH4]+(21.8)，361.1[M+Na](21.3)，698.4[2M+Na]+(9.8)；1H NMR and13C NMR(400MHz，CDCl3)見表1和表2；化合物C的實驗數據Colourless oil；EMSm/z(rel.int.)339.3[M+H](100)；1H NMR and13C NMR(400MHz，CDCl3)見表1和表2；化合物D的實驗數據EMSm/z(rel.int.)281.0[M+H]+(90)；1H NMR and13C NMR(400MHz，DMSO-d6)見表1和表2。
表1化合物A、B、C和D的1H-NMR數據
表2化合物A、B、C和D的13C-NMR數據
本發(fā)明所說的多塞瑞龍化合物可用于制備抗腫瘤藥物。以下給出抗腫瘤活性檢測實驗結果。
1)腫瘤細胞株人B淋巴瘤Raji細胞、人口腔皮樣癌KB細胞等。
2)材料a MTT(噻唑藍)用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到終濃度5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃避光保存；b SDS裂解液100g十二烷基磺酸鈉(SDS)，1N HCl 10ml，加熱溶解，蒸餾水定容至1000ml。
c 細胞培養(yǎng)基(全培)一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)細胞培養(yǎng)基溶于1L雙蒸水中；加入2g NaHCO3攪勻溶解后封口，置于4℃過夜，以自然沉淀除去雜質；次日加入10-15％已滅活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混勻后用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
3)化合物A、B、C和D的配置分別取一定量的化合物A、B、C和D，用甲醇溶解并調整濃度為5mg/ml，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)腫瘤細胞的培養(yǎng)a 細胞活化取一干凈燒杯，裝入干凈溫水，水溫調至37-40℃；將凍存管從液氮中取出迅速投入溫水解凍，并將凍存細胞接入預裝有細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內，在37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，及時更換培養(yǎng)液、分瓶。
b 細胞計數選對數生成期細胞，胰酶消化，移入離心管中，加全培至10ml，取一滴滴入計數板一側凹槽中，倒置顯微鏡下計數。調整細胞數至1×105/ml。
c 活性檢測①96孔板在超凈工作臺內紫外光下照射1小時；②在各孔中加入細胞懸液80μl，37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)24小時；③加入20μl用全培梯度稀釋成一系列濃度的A、B、C和D溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；④每孔加入MTT溶液10μl，輕輕震搖使顆粒溶解，37℃放置3小時；⑤取出培養(yǎng)板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解過夜；⑥用酶聯反應儀570nm測定各孔吸光值(參比波長為655nm)，按下列公式計算抑制率抑制率＝(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％⑦以抑制率為縱坐標，受試樣品濃度的對數為橫坐標作圖，求出抑制率為50％時的濃度即為IC50。
d 試驗結果化合物A、B、C和D對人口腔上皮癌KB細胞的IC50分別是16μg/ml、18μg/ml、20μg/ml和20μg/ml；對人淋巴瘤Raji細胞的IC50分別是12μg/ml、9μg/ml、10μg/ml和8μg/ml。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點是提供了一類來源于紅樹林內生真菌、實驗中對人口腔上皮癌和淋巴瘤等有抑制作用的新結構化合物，它們可用于制備抗口腔上皮癌和淋巴瘤等的藥物。另外，這些化合物的制備方法簡單，適于產業(yè)化生產。
(4)具體實施方式
實施例1內生真菌的種子培養(yǎng)將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1g，瓊脂1.6g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，25℃下培養(yǎng)6天。
內生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)6天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體，將過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集330s和400s時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集1100s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集880s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實施例2將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1.5g，瓊脂1.8g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，30℃下培養(yǎng)8天；再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃培養(yǎng)8天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/0.1為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集310s和420s時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1140s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集840s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實施例3將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2g，瓊脂1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，28℃下培養(yǎng)5天。再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)6天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/2為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集360s和390s時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1080s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集860s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實施例4將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2.5g，瓊脂2.0g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，20℃下培養(yǎng)7天。再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1.5為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集300s和450s時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1120s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集900s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實施例5
將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖3g，瓊脂1.7g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，23℃下培養(yǎng)6天。再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖3g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/4為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集340s和420s時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1100s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集850s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
權利要求
1.多塞瑞龍化合物，所說的多塞瑞龍化合物是從紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF3的發(fā)酵液中提取分離的化合物，所說的小穴殼菌HTF3的保藏號為CCTCC NOM203067，其特征在于其結構分別為化合物A多塞瑞龍A，[3，5-二羥基-2-(7-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯、化合物B多塞瑞龍B，[3，5-二羥基-2-(6-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯、化合物C多瑞塞龍C，[3，5-二羥基-2-(8-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯和化合物D多塞瑞龍D，6，8-二羥基-1(R)-(5-羥基-己基)-異苯并二氫吡喃-3-酮；化合物A、化合物B、化合物C和化合物D的結構式分別為
2.多塞瑞龍化合物的制備方法，其特征在于其步驟為1)內生真菌的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基以克為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5-2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，室溫下培養(yǎng)5-8天；2)內生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以克為單位；馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)5-8天；3)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體；4)將過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/(0.1～4)為洗脫劑梯度洗脫；5)收集、濃縮得化合物產物(1)、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集5-6分鐘和6.5-7.5分鐘時的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A；(2)、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集18-19分鐘的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；(3)、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集14-15分鐘的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
3.多塞瑞龍化合物，其特征在于可用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
涉及一種利用真菌發(fā)酵液提取的化合物與制法及在制備抗腫瘤藥物中的應用。多塞瑞龍化合物是從紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF
文檔編號C07C69/738GK1541994SQ20031011404
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月8日 優(yōu)先權日2003年11月8日
發(fā)明者徐慶妍, 黃耀堅, 鄭忠輝, 宋思揚, 蘇文金 申請人:廈門大學