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      一種對蝦基因Intlp及其編碼的多肽的制作方法

      文檔序號:3581286閱讀:265來源:國知局
      專利名稱:一種對蝦基因Intlp及其編碼的多肽的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種新的對蝦基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及對蝦IntlP多肽的cDNA序列,該多肽蛋白是一種抗病毒蛋白。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。
      背景技術(shù)
      對蝦是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一種很重要的經(jīng)濟(jì)動物,但對蝦疾病自從九十年代初在世界范圍陸續(xù)爆發(fā)以來,給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。造成這一結(jié)果的根本原因就是病毒病,直到現(xiàn)在它仍是困擾對蝦養(yǎng)殖的主要問題。由于對蝦病毒病尚無法治療,因此目前只能從優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境,阻斷病原的傳播,提高對蝦種質(zhì),增強(qiáng)對蝦基礎(chǔ)免疫力等方面入手,以期實(shí)行對養(yǎng)殖對蝦病害的有效控制和預(yù)防。國內(nèi)外學(xué)者在這些方面做了大量的工作,也取得了一些成果。如利用滅活的弧菌疫苗,可有效地提高養(yǎng)成期及苗期日本對蝦的成活率(J of Aquatic Animal Health,1991,3151-2);利用口服免疫增強(qiáng)劑(如β-1,3-葡聚糖和肽聚糖)可增強(qiáng)對蝦血細(xì)胞的吞噬活性及對細(xì)菌性感染的抵抗能力(Fish.Chimes.,1996,1641-42);一些富含多糖、生物堿、有機(jī)酸等多種成分的天然物質(zhì)對對蝦有免疫刺激作用(海洋與湖沼,1995,2634-41)。但在現(xiàn)有的技術(shù)水平和養(yǎng)殖模式下這些方法都無法徹底解決問題。
      利用對蝦本身的抗病因子加強(qiáng)抗病力有望成為防治其病害的根本方法。對蝦屬甲殼類無脊椎動物,雖然它缺乏特異性免疫系統(tǒng),但是卻具有一定的抗病能力,以抵抗環(huán)境(水體)中多種病原的侵襲,這和對蝦體內(nèi)存在眾多的抗病因子(如各種酶、酶激活劑、酶抑制劑、細(xì)胞因子、抗菌肽、凝集素等)密切相關(guān),所以研究特異的抗病因子對病害防治具有根本意義。但無脊椎動物包括對蝦的免疫學(xué)特別是免疫分子生物學(xué)研究水平較人類及高等動物大為落后,以致在解決其養(yǎng)殖中的病害和良種培育等問題時(shí)缺乏科學(xué)支撐?,F(xiàn)在已經(jīng)開始從分子水平對對蝦自身的免疫機(jī)制展開研究,對蝦的一些免疫因子已被分離或克隆。如酚氧化酶原(proPO)激活系統(tǒng)是對蝦免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分,現(xiàn)在其中的一些成分或相關(guān)成分的結(jié)構(gòu)功能乃至基因都已經(jīng)研究得比較清楚(Current Opinion inImmunology,1998,1023-28);抗菌肽在對蝦抵抗細(xì)菌侵襲方面起著重要的作用,法國學(xué)者已從對蝦中獲得了三種抗菌肽(penaeidin)及其基因(CellMol.Life Sci.,2000,571260-71);凝集素是對蝦體內(nèi)基本的識別和防御分子,目前也已有多種凝集素被純化(Aquaculture,2000,19123-44)。
      本發(fā)明中的對蝦IntlP的cDNA核苷酸序列是如此獲得的。以日本對蝦為研究對象,運(yùn)用抑制性差減雜交(SSH法)對正常蝦和抗病蝦的基因表達(dá)差異進(jìn)行了比較研究,得到差異片斷,獲得了SEQ ID No.1的cDNA序列。然后證明它編碼的蛋白具有抗病毒功能。在本發(fā)明被公布之前,尚沒有任何人公開過本申請中涉及的對蝦抗病毒基因。本發(fā)明將可能為對蝦病害的防治提供新的途徑,促進(jìn)對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸,該核苷酸編碼一種新的抗病毒蛋白,此抗病毒蛋白被命名為IntlP。
      本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的對蝦抗病毒蛋白,該蛋白被命名為IntlP。
      本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的對蝦抗病毒蛋白的方法。
      本發(fā)明還提供了這種對蝦的抗病毒基因序列和多肽的應(yīng)用。
      在本發(fā)明的一個方面,提供了一種分離出的DNA分子,它包括一種分離出的DNA分子,其特征在于,它包括編碼對蝦IntlP蛋白活性的多肽的核苷酸序列,所述核苷酸序列與SEQ ID No.1中1-192的核苷酸序列有至少70%的同源性;或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID No.1中1-243的核苷酸序列雜交。較佳地,所述的序列編碼一多肽,該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地,該序列具有SEQ ID No.1中1-192位的核苷酸序列。
      在本方面的另一方面,提供了一種分離的IntlP蛋白多肽,它包括具有SEQID No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段,或其活性衍生物。較佳地,該多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
      在本發(fā)明的另一方面,提供了一種載體,它含有上述分離出的DNA。
      在本發(fā)明的另一方面,提供了一種產(chǎn)生具有IntlP蛋白活性的多肽的方法。
      在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中,本發(fā)明中分離的多核苷酸全長為192個核苷酸,其詳細(xì)序列見SEQ ID No.1,其中開放讀框位于1-192位核苷酸。
      在本發(fā)明中,“分離的”、“純化的”DNA是指,該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來,還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開,而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開?!皣?yán)謹(jǐn)條件”是指雜交的條件,如溫度和緩沖液成分等產(chǎn)生的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度的等級。
      在本發(fā)明中,術(shù)語“IntlP蛋白(或多肽)編碼序列”是指編碼具有IntlP蛋白活性的多肽的核苷酸序列,如SEQ ID No.1中的1-192位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指,位于SEQ ID No.1序列的編碼框1-192位核苷酸中,有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性,所以與SEQ ID No.1中1-192位核苷酸同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID No.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下,更佳地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下,與SEQ ID No.1中從核苷酸1-192位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID No.1中1-192的核苷酸序列的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。
      該術(shù)語還包括能編碼具有與對蝦IntlP相同功能的蛋白的、SEQ ID No.1序列的變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為1-90個,較佳地1-60個,更佳地1-20個,最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5’和/或3’添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi),較佳地為30個以內(nèi),更佳地10個以內(nèi),最佳地5個以內(nèi))核苷酸。
      在本發(fā)明中,“純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少50%,較佳地至少75%,更佳地至少90%(按干重或濕重計(jì))。純化可以用任何合適的方法進(jìn)行測量,如用柱層析、PAGE或HPLC測量多肽的純度。
      在本發(fā)明中,術(shù)語“IntlP蛋白多肽”指具有IntlP蛋白活性的SEQ ID No.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有抗病毒功能的、SEQ ID No.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個,較佳地1-30個,更佳地1-20個,最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi),較佳地為10個以內(nèi),更佳地5個以內(nèi))氨基酸。例如,在本領(lǐng)域中,用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí),通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括IntlP蛋白的活性片段和活性衍生物。
      該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、修飾形式、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與IntlP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗IntlP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其它多肽,如包含IntlP多肽或者其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外,本發(fā)明還包括了IntlP多肽的可溶性片段。通常,該片段具有IntlP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸,較佳地至少約30個連續(xù)氨基酸,更佳地至少約50個連續(xù)氨基酸,最佳地至少約80個連續(xù)氨基酸。
      本發(fā)明還提供IntlP蛋白或多肽的類似物,這些類似物與天然IntlP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異,也可以是不影響序列的修飾形式上的差異,或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體,誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到,如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變,還可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知分子生物學(xué)技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)類似物。應(yīng)理解,本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性多肽。
      修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?;螋然?。修飾還包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基的序列,還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
      本發(fā)明還包括一種探針分子,該分子通常具有IntlP多肽編碼序列的8-100個,較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼IntlP的核酸分子。
      本發(fā)明還包括檢測IntlP核苷酸序列的方法,它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交,然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地,該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物,其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于IntlP多肽的編碼序列,并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
      在本發(fā)明中,可選用本領(lǐng)域已知的各種載體,如市售的載體。
      在本發(fā)明中,術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地,該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞,如CHO、COS細(xì)胞等。
      另一方面,本發(fā)明還包括對IntlP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體或單克隆抗體,尤其是單克隆抗體。這里,“特異性”是指抗體能結(jié)合于IntlP基因產(chǎn)物或片段。較佳地,指那些能與IntlP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制IntlP蛋白的分子,也包括那些并不影響IntlP蛋白功能的抗體。
      本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合抗體。
      本發(fā)明的抗體抗原通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如,純化的IntlP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段,可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的,表達(dá)IntlP或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物以生產(chǎn)抗體。片段可以利用重組方法制備或利用合成儀合成。單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。
      具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press,2001)中所述的實(shí)驗(yàn)條件,或按照制造廠商所建議的條件。
      實(shí)施例1 IntlP cDNA序列的克隆和測定1.mRNA的提取用mRNA提取試劑盒(Quiagen,Valencia,CA)分別從正常對蝦和抗病對蝦的血細(xì)胞中提取。
      2.Smart cDNA的合成提取的mRNA迅速用試劑盒(Clontech,Palo Alto,CA)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
      3.SSH具體的操作按照試劑盒(Clontech,Palo Alto,CA)的說明書進(jìn)行。簡單敘述如下反轉(zhuǎn)錄的cDNA經(jīng)過適當(dāng)圈數(shù)的PCR擴(kuò)增,純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。然后用RsaI進(jìn)行酶切。酶切后的抗病毒蝦cDNA分成兩份,分別加上一種接頭(adaptor),然后分別與過量的正常蝦的酶切過cDNA雜交。之后把這兩份雜交的產(chǎn)物在進(jìn)行一次雜交。雜交后的結(jié)果分別進(jìn)行兩次PCR的過程,從而富集了具有差異的片斷。
      4.差異片斷的測序把差異的片斷與T載體連接后,篩選陽性克隆子送去測序。根據(jù)得到的核苷酸序列推導(dǎo)出IntlP的氨基酸序列,共64個氨基酸殘基,其氨基酸序列詳見SEQ ID No.1。
      實(shí)施例2 IntlP在大腸桿菌中的表達(dá)1.cDNA的擴(kuò)增IntlP的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA的開讀框的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增,獲得IntlP插入片段。
      5’寡核苷酸引物為5′-CGCGGATCCATGAGAAGAAAGCCCAGT-3′(SEQ IDNo.3),該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。3’寡核苷酸引物為5’-GCGCGAATTCTCACCATGTGCTTCTGCTCAA-3’(SEQ ID No.4),該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)、終止密碼子IntlP的編碼序列。
      PCR程序①95℃ 2min②30個循環(huán)94℃ 15sec;58℃ 30sec;72℃ 1min③68℃ 10min
      2.IntlP DNA的重組上述引物上的限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pGEX-20T上的酶切位點(diǎn)。用BamH I和EcoR I消化該載體,隨后將擴(kuò)增的IntlP片段連接到此載體。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在LB平板(含Amp100μg/ml)上。挑取菌落,提取質(zhì)粒,用PCR、酶切和測序的方法鑒定IntlP的DNA片段已正確插入了載體。
      3.IntlP重組蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性挑取含有IntlP重組質(zhì)粒的單菌落于4ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml),37℃搖培過夜。吸取1ml菌液于新的200ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml),37℃搖培至OD600為0.6左右,加入IPTG至終濃度0.5mM,繼續(xù)搖培4hr。
      離心菌液去上清,將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中,超聲裂解,離心去沉淀,上清中的IntlP重組蛋白用GST柱進(jìn)行親和純化。用SDS-PAGE鑒定純化蛋白的分子量和純度。
      實(shí)施例3抗體制備將實(shí)施例2中獲得的純化的重組蛋白用等體積的完全Freund’s佐劑乳化,用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白對小鼠進(jìn)行皮下注射。10天后用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣劑量的同樣抗原再注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫來免疫動物以產(chǎn)生抗體,每隔10天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫,至少進(jìn)行3次。分析所獲抗血清的滴度和特異性。
      在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
      序列表1.SEQ ID No.1的信息(1)序列特征(A)長度192bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型cDNA(3)序列描述SEQ ID No.11 ATGAGAAGAA AGCCCAGTGG GAGGCTGAAG GTCAGAAGAT GCTTTTTGAT GCCAAGCGAG61AAAATGTTGC ACTCCAGCTT GAAGCTGCTT ACAGAGAGAG GCTGGCAACT GTTCATGCTG121 AGGTCAAGAA AAGGTTGGAC TACCAGCTGG AGACCGCCAA TGTCAAAACT CGCATTGAGC181 AGAAGCACAT GG2.SEQ ID No.2的信息(1)序列特征(A)長度64個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型多肽(3)序列描述SEQ ID No.21 MRRKPSGRLK VRRCFLMPSE21KMLHSSLKLL TERGWQLFML41RSRKGWTTSW RPPMSKLALS61RSTW3.SEQ ID No.3的信息(1)序列特征(A)長度27bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID No.3CGCGGATCCATGAGAAGAAAGCCCAGT 27
      4.SEQ ID No.4的信息(1)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID No.4GCGCGAATTCTCACCATGTGCTTCTGCTCAA 3權(quán)利要求
      1.一種分離出的DNA分子,其特征在于,它包括編碼對蝦IntlP蛋白活性的多肽的核苷酸序列,或者所述核苷酸序列與SEQ ID No.1中1-192的核苷酸序列有至少70%的同源性,或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ IDNo.1中1-192位的核苷酸序列雜交。
      2.如權(quán)利要求1中所述的DNA分子,其特征在于,所述的序列編碼一多肽,該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。
      3.如權(quán)利要求1中所述的DNA分子,其特征在于,該序列具有SEQ ID No.1中從核苷酸1-192的核苷酸序列。
      4.一種分離的IntlP蛋白多肽,其特征在于,它包括具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
      5.如權(quán)利要求4所述的多肽,其特征在于,該多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
      6.一種載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
      7.一種產(chǎn)生具有IntlP蛋白活性的多肽的方法,其特征在于,該方法包括(a)將編碼具有IntlP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列,形成IntlP蛋白表達(dá)載體,所述的核苷酸序列與SEQ ID No.1中從核苷酸1-192位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,形成IntlP蛋白的重組細(xì)胞;(c)在適合表達(dá)IntlP蛋白多肽的條件下,培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞;(d)分離出具有IntlP蛋白活性的多肽。
      8.如權(quán)利要求7中所述的方法,其特征在于,該重組的編碼多肽的核苷酸序列為SEQ ID No.1中從核苷酸1-192位。
      9.一種能與權(quán)利要求4所述的IntlP蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
      10.一種探針分子,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種的對蝦基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及對蝦IntlP多肽的cDNA序列,該多肽蛋白是一種抗病毒蛋白。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。
      文檔編號C07K16/18GK1629291SQ20031012412
      公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
      發(fā)明者徐洵, 何南海 申請人:國家海洋局第三海洋研究所
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