專利名稱：使用飽和染料的擴(kuò)增子解鏈分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在雙鏈核酸結(jié)合染料存在的條件下進(jìn)行核酸分析的方法。
背景技術(shù)：
分析DNA序列變異的方法可以大體分為兩類1)對(duì)已知序列變異的基因分型和2)對(duì)未知變異的掃描。現(xiàn)有多種已知序列變異基因分型的方法，并可以采用使用熒光探針的單一步驟、同質(zhì)的、閉管的方法(Lay MJ等，Clin.Chem 1997；432262-7)。相反，大部分針對(duì)未知變異的掃描技術(shù)要求PCR之后的凝膠電泳或柱分離。這些技術(shù)包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Orita O等，Proc Natl Acad Sci USA1989；862766-70)、異源雙鏈分子遷移(Nataraj AJ等，Electrophoresis 1999；201177-85)、變性梯度凝膠電泳(Abrams ES等，Genomics 1990；7463-75)、溫度梯度凝膠電泳(Wartell RM等，J ChromatogrA 1998；806169-85)、酶或化學(xué)切割法(Taylor GR等，Genet Anal 1999；14181-6)以及DNA測(cè)序。通過測(cè)序識(shí)別新的突變也要求PCR之后的多個(gè)步驟，也就是測(cè)序和凝膠電泳循環(huán)。變性高效液相色譜(Xiao W等，Hum Mutat 2001；17439-74)涉及將PCR產(chǎn)物注入層析柱。
最近，用于突變掃描的同質(zhì)熒光方法已有報(bào)道。SYBR Green I(MolecularProbes，Eugene，Oregon)是一種在實(shí)時(shí)PCR中經(jīng)常用于監(jiān)測(cè)產(chǎn)物形成(WittwerCT等，BioTechniques 1997；22130-8)和解鏈溫度(Ririe KM等，Anal.Biochem1997；245154-60)的雙鏈特異性DNA染料。通過使用SYBR Green I的解鏈曲線分析，已經(jīng)在167bp以內(nèi)的產(chǎn)物中檢測(cè)到雜合子單一堿基改變的存在(LipskyRH等，Clin Chem 2001；47635-44)。然而，擴(kuò)增后在解鏈分析之前，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了純化并添加了高濃度的SYBR Green I。所述方法中用以檢測(cè)的SYBR Green I濃度抑制PCR反應(yīng)(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22130-1，134-8)；因而，該染料在擴(kuò)增后添加。希望能有一種能用于檢測(cè)雜合子單個(gè)堿基改變的存在并能在PCR之前加入的染料。
單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是目前為止在人類和其他物種中間觀察到的最常見的遺傳變異。在這些多態(tài)性中，個(gè)體之間僅有單個(gè)堿基的改變。所述改變可能引起蛋白中一個(gè)氨基酸的改變、改變轉(zhuǎn)錄速度、影響mRNA剪接、或?qū)?xì)胞過程沒有明顯作用。有時(shí)在所述改變沉默(例如，在其編碼的氨基酸沒有改變的情況下)的情況下，SNP基因分型可能仍具有價(jià)值，如果所述改變與由另一個(gè)遺傳改變引起的獨(dú)特表現(xiàn)型相連(關(guān)聯(lián)的)。
現(xiàn)有多種SNP基因分型的方法。大部分采用PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)以擴(kuò)增感興趣的模板?？梢允褂冒z電泳、質(zhì)譜和熒光在內(nèi)的同步或后續(xù)分析技術(shù)。由于其是同質(zhì)的，并且不需要在擴(kuò)增開始后添加試劑或?yàn)榱朔治龆鴮?duì)反應(yīng)物手工取樣，熒光技術(shù)是具有吸引力的。示范性的同類技術(shù)使用寡核苷酸引物定位感興趣的區(qū)域以及熒光標(biāo)記或染料用于產(chǎn)生信號(hào)。通過使用對(duì)DNA變性溫度穩(wěn)定的熱穩(wěn)定酶，示例性的基于PCR的方法是完全閉管的，這樣在加熱開始以后，不需要附加步驟。對(duì)于SNPs基因分型可以采用幾種閉管的、同質(zhì)的熒光PCR方法。這些方法包括使用有兩個(gè)相互作用的發(fā)光基團(tuán)的FRET寡核苷酸探針(鄰近雜交探針，TaqMan探針，Molecular Beacons，Scorpions)、僅有一個(gè)熒光基團(tuán)的單一寡核苷酸探針(G-淬滅探針，Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；29089-97以及SimpleProbes，Idaho Technology)、以及使用雙鏈DNA染料而不是共價(jià)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針的技術(shù)。由于不需要標(biāo)記的寡核苷酸探針，可以降低設(shè)計(jì)時(shí)間和檢測(cè)成本，所述染料技術(shù)是具有吸引力的。
已經(jīng)公開了兩種使用雙鏈DNA染料的SNP分型技術(shù)。存在雙鏈DNA染料情況下的等位基因特異性擴(kuò)增可被用于實(shí)時(shí)PCR基因分型(Germer S等，Genome Research 2000；10258-266)。在Germer的參考文獻(xiàn)的方法中，在存在一條共有反向引物的情況下，兩條3’-堿基存在差異的等位基因特異性引物差異擴(kuò)增一條或另一條等位基因。雖然不需要熒光標(biāo)記的寡核苷酸，基因分型要求3條引物以及針對(duì)每種基因型的兩個(gè)反應(yīng)池。此外，需要監(jiān)測(cè)每個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)PCR儀。
另一種基于染料的方法不需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，每種SNP基因型僅需要一個(gè)反應(yīng)池，并使用解鏈分析(Germer S等，Genome Research 1999；972-79)。在這種方法中，如前面的Germer方法一樣，也使用了需要3條引物的等位基因特異性擴(kuò)增。此外，所述引物中的一條含GC-發(fā)夾尾部，以提高一個(gè)擴(kuò)增子的解鏈溫度，使得在一個(gè)反應(yīng)池中通過解鏈溫度進(jìn)行區(qū)分成為可能。PCR擴(kuò)增后檢測(cè)熒光，而不需要實(shí)時(shí)獲得。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種僅需要常規(guī)PCR試劑、引物、以及在PCR前簡(jiǎn)單添加“飽和的”雙鏈DNA結(jié)合染料的方法。為了本發(fā)明的目的，“飽和的”染料是指該染料以為不存在染料情況下由PCR通常產(chǎn)生的雙鏈DNA量(例如約10納克/微升)提供最大熒光信號(hào)的濃度存在時(shí)，不會(huì)明顯抑制PCR反應(yīng)。雖然所述染料通過其飽和濃度時(shí)與PCR的兼容性進(jìn)行鑒別，需要理解的是所述染料能以低得多的濃度使用。擴(kuò)增過程中或緊隨擴(kuò)增之后，所述染料可以與使用標(biāo)記引物情況下類似的方式通過解鏈曲線分析用于區(qū)分異源雙鏈分子和同源雙鏈分子。異源雙鏈分子和同源雙鏈分子的鑒別可以用于包括突變掃描和SNP基因分型在內(nèi)的多種分析。術(shù)語“掃描”是指將一個(gè)核酸片段與一個(gè)參照核酸片段比較以檢測(cè)序列上任何差異的存在的過程。表示存在序列差異的陽性結(jié)果不一定反映序列變異的確切性質(zhì)或其在核酸片段上的位置。術(shù)語“基因分型”包括檢測(cè)和確定已知的核酸序列變異，這些變異包括但不限于SNPs、堿基缺失、堿基插入、序列重復(fù)、重排、倒置、堿基甲基化、短串聯(lián)重復(fù)數(shù)；以及在兩倍體基因組的情況下，基因組是否是序列變異的純合子或雜合子，以及一條DNA鏈上兩個(gè)或更多序列變異的順式/反式位置關(guān)系(單體型分析)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，鑒別了多種雙鏈DNA結(jié)合染料。本發(fā)明的雙鏈DNA結(jié)合染料能在擴(kuò)增中或擴(kuò)增后以對(duì)于DNA的充分飽和量存在，同時(shí)對(duì)PCR的抑制最小化。例如，在最大PCR相容濃度下，雙鏈DNA結(jié)合染料具有至少為50％的飽和百分比。在其他實(shí)施方式中，所述飽和百分比至少為80％，更特殊的至少為90％。在還有其他實(shí)施方式中，所述飽和百分比至少99％。需要理解的是，所述飽和百分比是與飽和濃度(也就是在存在預(yù)先確定的雙鏈DNA量的情況下提供可能的最高熒光強(qiáng)度的濃度)的相同染料的熒光相比的熒光百分比。舉例來說，預(yù)先確定的雙鏈DNA量是100納克/10微升，這是典型的PCR末期到達(dá)平臺(tái)期時(shí)產(chǎn)生的DNA量。需要進(jìn)一步理解到染料制劑可能包含抑制擴(kuò)增的雜質(zhì)。這樣的雜質(zhì)應(yīng)該在確定飽和百分比之前去除。也需要理解的是，飽和百分比熒光強(qiáng)度的測(cè)量在與檢測(cè)結(jié)合雙鏈DNA的染料良好匹配的波長(zhǎng)處進(jìn)行，而且如果可能的話，不在能檢測(cè)到來自游離染料或在高染料-堿基對(duì)比率下可能形成的染料結(jié)合的二級(jí)形式(例如，染料與雙鏈DNA-染料復(fù)合物結(jié)合或與單鏈核酸結(jié)合)的高本底熒光的波長(zhǎng)處檢測(cè)。
在本發(fā)明的還有另一個(gè)方面，雙鏈DNA結(jié)合染料在最大PCR相容濃度下具有大于50％的飽和度，而且具有可能與常規(guī)實(shí)時(shí)PCR儀不兼容的激發(fā)/發(fā)射光譜。用于實(shí)時(shí)PCR分析的“常規(guī)”儀器具有介于約450-490納米的激發(fā)波長(zhǎng)和介于約510-530納米的發(fā)射檢測(cè)波長(zhǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些“藍(lán)色”染料與這些系統(tǒng)兼容，雖然其激發(fā)/發(fā)射光譜可能有所不同。這樣，在本發(fā)明的這個(gè)方面，提供了一種PCR過程中或緊隨PCR之后使用常規(guī)實(shí)時(shí)PCR儀和雙鏈DNA結(jié)合染料分析的方法，其中雙鏈DNA結(jié)合染料正如在存在雙鏈DNA的PCR緩沖液中測(cè)得的具有介于410-465納米，尤其是介于430-460納米的最大激發(fā)波長(zhǎng)，并具有介于450-500納米，尤其是介于455-485納米的最大發(fā)射波長(zhǎng)。適當(dāng)?shù)膬x器可以使用上述激發(fā)/檢測(cè)區(qū)間，或可以按照染料的激發(fā)/發(fā)射峰值進(jìn)行改進(jìn)。檢測(cè)本發(fā)明的“藍(lán)色”染料以及檢測(cè)如熒光素和SYBR Green I等常規(guī)染料的適當(dāng)區(qū)間可以包括440-470納米的激發(fā)波長(zhǎng)和500-560納米的檢測(cè)波長(zhǎng)。
在一種實(shí)施方式中，所述染料是一種鑒別為L(zhǎng)ightCycler Green(也可稱為L(zhǎng)CGreen)的染料。下面描述了LC Green的合成，并在圖11中說明了LC Green的激發(fā)/發(fā)射光譜。表1中顯示了LC Green的附加特性。類似地，表1中鑒別為有效的其他染料可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用。雖然這些染料中一些染料的確切結(jié)構(gòu)仍是未知的，它們被認(rèn)為是不對(duì)稱的花青，并在表1中說明了這些熒光核酸染料的多種特性。
雖然這里所提供的實(shí)例是針對(duì)解鏈曲線分析的，需要理解的是，本發(fā)明的染料可以用于多種包括核酸定量、起始濃度測(cè)定、對(duì)存在一種核酸的檢測(cè)、用標(biāo)記探針的疊加檢測(cè)以及其他基于PCR的方法在內(nèi)的實(shí)時(shí)定量PCR分析。
此外，雖然提及的是PCR，其他擴(kuò)增方法可以與本發(fā)明的染料相容。這樣的合適的方法包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)、依賴于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、級(jí)聯(lián)滾環(huán)擴(kuò)增(CRCA)、Qβ復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增、等溫和嵌合引物啟動(dòng)的核酸擴(kuò)增(ICAN)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)等。因此，當(dāng)使用術(shù)語PCR的時(shí)侯，需要理解為包括其他可供選擇的擴(kuò)增方法。
此外，需要理解雙鏈DNA結(jié)合染料包括嵌入劑以及其他與核酸結(jié)合的染料，只要所述染料差異結(jié)合雙鏈和單鏈核酸，或以其他方式產(chǎn)生基于雙鏈核酸數(shù)量的差異信號(hào)。
這樣，本發(fā)明包括這里所述的用于定量或定性擴(kuò)增分析的一種或多種雙鏈結(jié)合染料。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種PCR反應(yīng)混合物，該混合物包括靶核酸、PCR試劑、為擴(kuò)增靶核酸而設(shè)置的寡核苷酸引物以及具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了核酸分析的方法。在一種實(shí)施方式中，提供了一種基因分型的方法，該方法包括在具有至少50％飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料存在條件下擴(kuò)增靶核酸，熔解擴(kuò)增的靶核酸以生成解鏈曲線，以及由解鏈曲線鑒別基因型等步驟。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種突變掃描的方法，該方法包括(a)向含靶核酸的樣品添加具有至少50％飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料，(b)在所述雙鏈DNA結(jié)合染料存在的條件下擴(kuò)增靶核酸，(c)熔解擴(kuò)增的靶核酸以生成解鏈曲線，在第二個(gè)樣品上重復(fù)步驟(b)和(c)以獲得第二條解鏈曲線，并比較所述解鏈曲線等步驟。在還有另一種實(shí)施方式中，提供了一種PCR分析的方法，該方法包括將具有至少50％飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料與包含靶核酸和為擴(kuò)增靶核酸而設(shè)置的引物的樣品混合，在所述雙鏈DNA結(jié)合染料存在的條件下擴(kuò)增靶核酸，以及監(jiān)測(cè)所述雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光等步驟。監(jiān)測(cè)可以發(fā)生在擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增之后或兩者皆有。
在本發(fā)明的還有另外一個(gè)方面，提供了包括一種PCR分析方法的步驟，包括將雙鏈DNA結(jié)合染料與含靶核酸和為擴(kuò)增靶核酸而設(shè)置的引物的樣品混合，在所述雙鏈DNA結(jié)合染料存在的條件下擴(kuò)增靶核酸，監(jiān)測(cè)所述雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光，產(chǎn)生針對(duì)靶核酸的解鏈曲線，標(biāo)準(zhǔn)化解鏈曲線，用至少另一個(gè)靶核酸重復(fù)混合、擴(kuò)增、曲線產(chǎn)生和標(biāo)準(zhǔn)化步驟，并比較標(biāo)準(zhǔn)化的解鏈曲線等步驟。
在本發(fā)明的一個(gè)附加方面，提供了核酸分析的一種方法，該方法包括將至少部分雙鏈的靶核酸與具有至少50％飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料混合以形成混合物，并隨著對(duì)混合物進(jìn)行加熱，通過測(cè)量所述雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光產(chǎn)生所述靶核酸的解鏈曲線等步驟。
在本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)方面，提供了包括擴(kuò)增試劑、為擴(kuò)增靶核酸而設(shè)置的寡核苷酸引物和具有至少50％飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料的試劑盒。所述試劑盒中可以使用這里所討論的任何染料。
正如這里所描述的，本發(fā)明的實(shí)施方式中可以使用多種雙鏈DNA結(jié)合染料。
根據(jù)以下說明性實(shí)施方式的詳細(xì)描述，本發(fā)明的附加特征對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員而言將會(huì)是顯而易見的。


圖1顯示了使用LightCycler Green的因子V Leiden的基因分型。顯示了解鏈曲線的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)(-dF/dT)。
圖2顯示了解鏈分析之前冷卻速度對(duì)異源雙鏈分子檢測(cè)的影響。
圖3顯示了解鏈分析過程中加熱速度對(duì)異源雙鏈分子檢測(cè)的影響。
圖4顯示了檢測(cè)異源雙鏈分子6種組合的模型系統(tǒng)。
圖5A-D顯示了基因分型方法的比較；圖5A顯示了囊腫性纖維化示意圖，其中一條引物上任選標(biāo)記的位置用星形(★)標(biāo)出，圖5B顯示了使用標(biāo)記引物的基因分型，圖5C顯示了使用LightCycler Green的基因分型，圖5D顯示了使用SYBR Green I的基因分型嘗試(純合子—--—wt，——F508del，雜合子—·—F508del，—-—I507del，----F508C)。
圖6顯示了在更長(zhǎng)的擴(kuò)增子上使用LightCycler Green的基因分型(—--—純合子(TT)，——純合子(CC)，—·—雜合子(TC))。顯示了三個(gè)個(gè)體(不是導(dǎo)數(shù))的解鏈曲線。
圖7A-B顯示了使用SYBR Green I(圖7A)和LightCycler Green(圖7B)的DNA混合物的導(dǎo)數(shù)解鏈曲線。
圖8顯示了多種類型DNA樣品存在時(shí)非線性的熒光變化。圖上顯示了LightCycler Green(○)和SYBR Green I(■)。
圖9A-B顯示了染料滴定以測(cè)定飽和百分比，圖9A中◆-SYBR Green，■-SYBR Gold，▲-Pico Green；圖9B中○-LightCycler Green，■SYTOXGreen。對(duì)于SYBR Green和LightCycler Green的示例性PCR范圍用陰影框表示。
圖10顯示了染料濃度對(duì)解鏈溫度的影響。
圖11A-B顯示了LightCycler Green(圖11A)和SYBR Green I(圖11B)的激發(fā)和發(fā)射光譜。
圖12A-D顯示了β球蛋白110bp的片段上6種不同基因型(—-—SS、——AA、—--—CC、—·—SC、………AC、-·-·-AS)一式四份樣品的高分辨率解鏈曲線分析。圖12A顯示了從每種基因型一式四份樣品的高分辨率解鏈獲得的原始數(shù)據(jù)；圖12B顯示了6種基因型一式四份樣品的經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的高分辨率解鏈曲線；圖12C顯示了6種基因型一式四份樣品的溫度移動(dòng)的、標(biāo)準(zhǔn)化的、高分辨率解鏈曲線。樣品溫度移動(dòng)以重疊5％和10％之間的熒光；圖12D顯示了由圖12C的數(shù)據(jù)得到的熒光差異曲線。每條差異曲線通過從標(biāo)準(zhǔn)(AA)曲線中扣除每種樣品以獲得差異數(shù)據(jù)獲得。當(dāng)采用一式四份樣品時(shí)，由于重疊的關(guān)系，在有些情況下看起來少于4份樣品。
圖13A顯示了人5-羥色胺受體2A(HTR2A)基因544bp片段的3種基因型的重復(fù)樣品的解鏈曲線分析(—-—TC，——CC，—--—TT)。使用10％和20％之間的熒光部分已對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化和溫度移動(dòng)處理。圖13B.同源雙鏈分子的理論解鏈?zhǔn)疽鈭D。單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)用(X)標(biāo)出。
圖14顯示了囊腫性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)控子(CFTR)基因612bp片段的6種基因型的差異曲線。通過30％和40％之間熒光部分的重疊對(duì)圖進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化和溫度移動(dòng)處理，并從一種野生型圖中扣除。
圖15顯示了CEPH參照的猶他家族1331的家系圖。猶他家族1331的HLA-A基因型如下A02011；B3101；C2402101；D03011；E01011。對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行了編號(hào)。女性(圈)；男性(方框)。
圖16A-B顯示了猶他家族1331成員的解鏈曲線。在17個(gè)家族成員中，存在著代表HLA-A外顯子2的6種基因型的6條不同的解鏈曲線。圖16A顯示了完整的解鏈曲線，圖16B顯示了放大的部分(表示在16A方框中)并在圓括號(hào)內(nèi)注明了基因型和個(gè)體。
圖17顯示了通過混合確定了兩個(gè)樣品的基因型(—BM15，—--—BM16，-----BM15+BM16)。兩個(gè)純合子樣品BM15(0101)和BM16(0201)在HLA-A外顯子2上有15bp的差異。分別檢測(cè)時(shí)BM15和BM16的解鏈曲線是相似的，但在混合時(shí)，15bp的錯(cuò)配使解鏈曲線發(fā)生偏移。
且基因型之間的明顯區(qū)分是可能的。本發(fā)明的染料也可以用于鑒別和區(qū)分反應(yīng)中存在的多種產(chǎn)物，例如通過純合子的多個(gè)基因基因座或多個(gè)目標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)生的同源雙鏈分子。相反，大概是由于染料的重新分布，使用SYBR Green I在大多數(shù)情況下只能觀察到少數(shù)產(chǎn)物(見圖7A)。
當(dāng)擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)雜合子靶標(biāo)時(shí)，使用本發(fā)明的染料可以容易地觀察到異源雙鏈分子。檢測(cè)并鑒定異源雙鏈分子的能力對(duì)于檢測(cè)雜合子基因型以及掃描未知突變來說尤其有用。采用用于實(shí)時(shí)PCR的如SYBR Green I、SYBR Gold以及溴化乙錠等不能觀察其中異源雙鏈分子產(chǎn)物的傳統(tǒng)雙鏈DNA染料是不可能實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的。
在解鏈過程中，異源雙鏈分子的鏈可以與其完全互補(bǔ)鏈重新結(jié)合并形成同源雙鏈分子。由于在PCR結(jié)束時(shí)產(chǎn)物濃度很高，這一重新結(jié)合過程快速發(fā)生。通過限制產(chǎn)物處于其解鏈溫度附近(尤其是處于異源雙鏈和同源雙鏈產(chǎn)物Tm值之間)的時(shí)間，所述的重新結(jié)合能被最小化。除了解鏈過程中鏈的重新結(jié)合，鏈與其完全匹配的或錯(cuò)配的互補(bǔ)鏈的選擇性雜交受到冷卻速度的影響。在這里所表示的條件下，快速冷卻最有利于異源雙鏈分子形成，而在低于-0.1℃/秒的速度下，異源雙鏈分子經(jīng)常會(huì)消失(圖2)。這與變性HPLC技術(shù)相反，后者的冷卻速度低得多(-0.01至約-0.02℃/秒)，仍有效形成異源雙鏈分子(Xiao W等，HumMutat 2001；17439-74)。同源雙鏈分子和異源雙鏈分子形成的相對(duì)速度也許非常依賴于產(chǎn)物大小，使用小的擴(kuò)增子獲得的結(jié)果對(duì)于dHPLC中更通常使用的更大的產(chǎn)物而言可能不具有典型性。
通過以更低的速度解鏈、花費(fèi)更多的分析時(shí)間，可以提高純合子基因型之間的辨別力。DNA濃度對(duì)Tm的影響是解鏈曲線基因分型中潛在誤差的一個(gè)來源。在PCR條件下使用50％GC含量的隨機(jī)100bp的擴(kuò)增子時(shí)，0.05μM和0.5μM的產(chǎn)物之間Tm值差異約為0.7℃(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；471956-61；Wetmur JG，Grit Rev Biochem Mol Biol 1991；26227-59)。當(dāng)不同純合子基因型的Tm值非常接近的時(shí)候，這一改變可能是重要的。然而，不同PCR樣品趨向于以相同產(chǎn)物濃度達(dá)到平臺(tái)期，那么擴(kuò)增后濃度差異通常是最小的。同時(shí)，可以通過實(shí)時(shí)熒光估計(jì)擴(kuò)增子濃度并對(duì)甚至更高的基因分型精度調(diào)節(jié)Tm值。另外，可以使用不對(duì)稱PCR以自動(dòng)限制PCR產(chǎn)物的終濃度。
用LightCycler Green有可能將所有單個(gè)堿基雜合子與純合子加以區(qū)分。在雜合子檢測(cè)中，絕對(duì)解鏈溫度和DNA濃度的影響不象使用涉及到區(qū)分純合子基因型的方法那么重要。異源雙鏈分子影響解鏈曲線的形狀，尤其是在轉(zhuǎn)變的“早期”低溫部分。通過X軸平移以使解鏈轉(zhuǎn)變的“晚期”高溫部分重疊，不同的解鏈曲線可以是溫度匹配的。然后可以以更高的精確度推斷異源雙鏈分子是否存在。
無論儀器的精確度，有些基因型的Tm值會(huì)是幾乎相同的。檢測(cè)具有相同Tm值的純合子變異的一種方法是將變異體共同混合。獲得的異源雙鏈分子會(huì)在比純合子更低的溫度下解鏈，在標(biāo)準(zhǔn)化的解鏈曲線中表現(xiàn)出在主要解鏈轉(zhuǎn)變之前的下降。
因而，使用目前可以利用的PCR擴(kuò)增裝置，LightCycler Green可以在解鏈曲線轉(zhuǎn)變中鑒別目前不能用SYBR Green I鑒別的異源雙鏈分子。圖7A中說明了為什么SYBR Green I不能簡(jiǎn)便地鑒別低溫解鏈轉(zhuǎn)變的一個(gè)可能原因。當(dāng)存在幾個(gè)穩(wěn)定性遞增的DNA片段時(shí)，使用SYBR Green I的低溫峰與使用LightCycler Green的相比很小。在解鏈過程中，SYBR Green I可能從低溫雙鏈分子上釋放，只與在更高溫度下解鏈的雙鏈相連。這引起每個(gè)后繼的峰比前一個(gè)高，使得最低溫度的峰即便能夠觀察到也很小。正如圖7B中所看到的，用LightCycler Green但不是通過SYBR Green I容易地檢測(cè)到了低溫解鏈的產(chǎn)物。
使用LC Green的優(yōu)點(diǎn)導(dǎo)致了對(duì)其他與PCR相容并在PCR相容濃度下適于基因分型的雙鏈DNA染料的鑒別。許多用于本發(fā)明的方法中的染料屬于花青家族?；ㄇ嗳玖鲜悄切┰谶B接兩個(gè)含氮雜環(huán)的鏈上含一個(gè)或多個(gè)二價(jià)“-C(R)＝”部分的染料?；鶊F(tuán)“R”可能是氫或任何碳取代基，例如氫或烷基，包括可以被任選取代的C1-6烷基。需要理解的是在其中有一個(gè)以上二價(jià)“-C(R)＝”部分的花青染料中，每個(gè)“R”可以是獨(dú)立選擇的。正如由這里所述的說明性通式所進(jìn)一步定義的，這樣的花青染料可以是單體或二聚體。除了花青染料，預(yù)計(jì)其他雙鏈DNA結(jié)合染料家族在這里所述的PCR反應(yīng)混合物、方法和組合物中也是有用的，這些家族包括但不限于菲啶嵌入劑和基于菲羅啉(phenanthroline-based)的金屬嵌入劑。
在所述PCR反應(yīng)混合物、方法和組合物中有用的示例性的染料包括PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTO 43、SYTO 44、SYTO 45、SYTOX Blue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、SYTO 11、SYTO 13、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 20、SYTO 23、TOTOTM-3、YOYO-3(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、GelStar(Cambrex Bio Science Rockland Inc.，Rockland，ME)、ThiazoleOrange(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)以及這里所述的新染料G5、H5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6和D8。
在這里所述的PCR反應(yīng)混合物、方法和組合物中使用的示例性花青染料也包括具有吡啶、嘧啶、喹啉、異喹啉或嘌呤核心結(jié)構(gòu)的非對(duì)稱花青的單體或二聚體以及那些通常由結(jié)構(gòu)式I描述的化合物 結(jié)構(gòu)式I其中 部分代表任選取代的稠合的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)或含氮的芳香雜環(huán)；X是氧、硫、硒、碲，或選自C(CH3)2和NR1的基團(tuán)，其中R1是氫或烷基，包括C1-6烷基和C2-6烷基；R2是烷基，包括C1-6烷基和C2-6烷基；環(huán)烷基，包括C3-8環(huán)烷基；芳基；芳烷基，包括芳基(C1-2烷基)；羥烷基；烷氧烷基；氨烷基；單烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基；三烷基銨烷基；烷基糖基和芳基糖基；烷羧酰胺和芳羧酰胺；烷基磺?；头蓟酋；?；烯基羧酸根；烯基羧酰胺；烯基磺酸根；烯基磺酸等，含雜原子的環(huán)部分，或含雜原子的脂肪族部分，其中每種可以被任選取代；示例性的含雜原子的部分包括任選取代的雜烷基，包括甲氧甲基、乙氧甲基等，雜環(huán)基，包括哌啶基等，烷基磺酸根和芳基磺酸根，包括甲基磺酸根、4-氯苯磺酸根等，烷氧基，包括甲氧基、乙氧基等，氨基，包括甲基氨基、二甲基氨基等，羰基衍生物，包括烷基和芳基羰基、烷氨基羰基、烷氧羰基等，雜烯基，包括烯基氨基烷基、烯氧基烷基、烷氨基烯基、烷氧基烯基、亞烷基氨基烷基等，雜烯丙基，酯，胺，酰胺，磷-氧以及磷-硫鍵；并包括美國(guó)專利5,658,751和PCT公開WO 00/66664中所描述的含雜原子的部分；每項(xiàng)公開都通過參考完整地組合在本發(fā)明中；
發(fā)明詳述由于其在PCR過程中表現(xiàn)出熒光的巨大變化，SYBR Green I是一種廣泛用于解鏈分析的染料(Wittwer CT等，Biotechniques 1997；22130-1，134-8；Wittwer CT等所著《Real-Time PCR》，見Persing D等主編，Diagnostic MolecularMicrobiologyPrinciples and Applications，ASM出版社，2004)。可以設(shè)想到，這樣的染料既可以用于純合子的基因分型，又可以用于對(duì)雜合子序列變化的掃描。SYBR Green I最初在解鏈分析中用以區(qū)分Tm值差別2℃或更多的不同PCR產(chǎn)物(Ririe KM等，Anal Biochem 1997；245154-160)。隨后，SYBR GreenI用于鑒別堿基缺失(Aoshima T等，Clin Chem 2000；46119-22)、基因型二核苷酸重復(fù)(Marziliano N等，Clin Chem 2000；46423-5)以及鑒別多種序列改變(Lipsky RH等，Clin Chem 2001；47635-44；Pirulli D等，Clin Chem 2000；461842-4；Tanriverdi S等，J Clin Microbiol.2002；403237-44；Hladnik U等，Clin Exp Med.2002；2105-8)。然而，基因型之間Tm差異可能很小并可能挑戰(zhàn)現(xiàn)有儀器的分辨率極限。事實(shí)上，已經(jīng)認(rèn)為SYBR Green I“不能在日常基因分型應(yīng)用中使用”(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；471331-1332)。采用通常使用的雙鏈特異性DNA染料的解鏈曲線基因分型可能包括隨著解鏈轉(zhuǎn)變區(qū)間加寬而提高的Tm值(Douthart RJ等，Biochemistry 1973；12214-20)和基因型之間Tm差異的壓縮(圖5D)。這些因素降低了SYBR Green I用于區(qū)分基因型的能力。
雜合子DNA的擴(kuò)增產(chǎn)生4種不同的單鏈，這些單鏈在變性并冷卻條件下產(chǎn)生2種同源雙鏈分子和2種異源雙鏈分子。理論上，所有4種產(chǎn)物具有不同的Tm值并且解鏈曲線應(yīng)該是所有4種雙鏈向單鏈轉(zhuǎn)變的合成。然而，雙鏈特異性DNA染料可能在解鏈過程中重新分布(Aktipis S等，Biochemistry 1975；14326-31)，這引起染料從低熔點(diǎn)的異源雙鏈分子上釋放并重新分布在更高熔點(diǎn)的同源雙鏈分子上。因?yàn)樵谂cPCR相容的濃度下SYBR Green I沒有飽和(Wittwer CT等，Biotechniques 1997；22130-1，134-8；圖9)，這樣的重新分布是可能的并與異源雙鏈分子解鏈轉(zhuǎn)變的缺失相一致(圖5D)。
LightCycler Green和本發(fā)明的其他染料能在基因分型和掃描的應(yīng)用中使用。在僅擴(kuò)增一種PCR產(chǎn)物并且序列是純合子的情況下，只形成同源雙鏈分子。使用本發(fā)明的染料，不同同源雙鏈分子之間Tm值差異沒有被壓縮(圖5C)，并
t＝0或1；Z是選自0或1的電荷數(shù)；R3、R9和R10各自獨(dú)立地從氫和烷基(包括C1-6烷基和C2-6烷基)中選擇；n＝0、1或2；以及Q是雜環(huán)，諸如吡啶、嘧啶、喹啉或嘌呤，其中每種可以被任選取代。
這里所使用的術(shù)語“烷基”通常是指包括1到約12個(gè)碳原子的線性或任選分支的碳?xì)洳糠?，例如包括但不限于甲?Me)、乙基、丙基、丁基、十二烷基、4-乙基戊基等。
這里所使用的術(shù)語“環(huán)烷基”通常是指包括3到約14個(gè)碳原子的線性或任選分支的碳?xì)洳糠?，至少其一部分形成一個(gè)或兩個(gè)環(huán)，例如包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、4-甲基環(huán)己基、2，3-二甲基環(huán)己基，3，5-二甲基環(huán)己基乙基等。
這里所使用的術(shù)語“芳基”通常是指芳香環(huán)部分，例如包括但不限于苯基(Ph)、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、異唑基、異噻唑基、氧氮茂基、噻唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基等。
這里所使用的術(shù)語“任選取代”通常是指包括碳、氮、氧或硫原子在內(nèi)的親本基團(tuán)上一個(gè)或多個(gè)氫原子用取代物任選取代，這里所述的取代物如鹵素；羥基；氨基；硫代基；烷基、環(huán)烷基、鹵代烷基、鹵代環(huán)烷基；烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵代烷氧基；單烷基氨基和二烷基氨基；氨烷基；單烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基；烷硫基；烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基和芳基糖基；烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基和芳羰氧基；烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基和芳基磺?；灰约叭玺人?、酯和酰胺的羧基衍生物。需要認(rèn)識(shí)到，包括偕的和連位的氫在內(nèi)的近側(cè)的氫原子的替代可能分別使替代這些氫的取代物共同形成一個(gè)螺環(huán)或一個(gè)稠環(huán)。
需要認(rèn)識(shí)到，上述每個(gè)術(shù)語可以用化學(xué)相關(guān)的方式組合用于表示其他部分，例如芳烷基指如這里所定義的芳基基團(tuán)與如這里所定義的烷基連接形成包括但不限于苯甲基、苯乙基、甲基吡啶基、3，5-二甲氧基甲基吡啶-4-基等的結(jié)構(gòu)。
需要認(rèn)識(shí)到，這里所描述的花青染料結(jié)構(gòu)可以包含手性中心。在這些情況下，除了另有說明以外，需要理解在這些花青染料結(jié)構(gòu)的描述中包括了所有立體異構(gòu)體。這樣的立體異構(gòu)體包括單純的光學(xué)活性異構(gòu)體、外消旋混合物、以及含任何相對(duì)量的一種或多種立體異構(gòu)構(gòu)象的非對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
也需要認(rèn)識(shí)到，這里所描述的花青染料結(jié)構(gòu)可以包含幾何中心。在這些情況下，除了另有說明以外，需要理解在花青染料結(jié)構(gòu)的描述中包括了所有幾何異構(gòu)體。這樣的幾何異構(gòu)體包括單純形式或多種混合的幾何構(gòu)象形式的順式、反式、E和Z異構(gòu)體。也需要理解，取決于花青染料結(jié)構(gòu)中所包含的雙鍵的特性，這樣的雙鍵異構(gòu)體可以依賴于如溶劑成分、溶劑極性、離子強(qiáng)度等條件在順式和反式之間、或是E和Z構(gòu)象之間互相轉(zhuǎn)化。
進(jìn)一步需要認(rèn)識(shí)到，當(dāng)電荷Z大于0時(shí)，可能存在結(jié)構(gòu)式I的化合物的幾種互變異構(gòu)體，也包括這樣的互變體的混合物。例如，電荷Z可以形式上位于如結(jié)構(gòu)式I所述的氮原子上，或位于形成連接兩個(gè)雜環(huán)的多烯烴鏈的一個(gè)碳原子上，或作為另一種選擇，電荷可以位于雜環(huán)Q上。結(jié)構(gòu)式I的帶電化合物的互變異構(gòu)體可以通過結(jié)構(gòu)式I的化合物的雙鍵-單鍵構(gòu)象的重新排列(如以下示例性結(jié)構(gòu))進(jìn)行描述。
其中 X、R2、R3、R9、R10和Q如結(jié)構(gòu)式I所定義，并且t＝1，Z＝1，且n＝1。這里所描述的花青染料化合物包括幾種可能的互變異構(gòu)體中的任意一種或這些互變異構(gòu)體的平衡混合物。需要理解的是，所述表面電荷的定位受到 X、R2、R3、R9、R10和Q部分的特性的影響。需要進(jìn)一步理解到，占優(yōu)勢(shì)的互變異構(gòu)體或互變異構(gòu)體的平衡混合物可能依賴于諸如溶劑成分、溶劑極性、離子強(qiáng)度、配方等條件。需要理解的是，術(shù)語“共振結(jié)構(gòu)”也指這些多種電荷定位并同樣地描述了以上公式。
也需要理解，在結(jié)構(gòu)式I的化合物攜帶凈電荷的情況下(諸如當(dāng)Z＝1時(shí)，或在結(jié)構(gòu)式I的化合物上存在如銨基團(tuán)、或磺酸基團(tuán)等帶電的取代物的情況下)，這些結(jié)構(gòu)式I的化合物伴有平衡離子。這里所包括的花青染料結(jié)構(gòu)的描述中包括任何單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)平衡離子。示例性的平衡離子包括如碘化物、氯化物、溴化物、氫氧化物、氧化物、醋酸根、三氟醋酸根、一磷酸根、二磷酸根、三磷酸根等帶負(fù)電的平衡離子，以及如鋰、鈉、鉀、銫、銨、多烷基銨等的帶正電的平衡離子。這樣的平衡離子可能源于所用的合成方法、純化方案、或其他離子交換過程。
相信平衡離子的性質(zhì)或種類似乎不會(huì)影響這里所述的花青染料的功能性。需要認(rèn)識(shí)到，當(dāng)這里所述的染料溶于用于實(shí)踐這里所述的PCR反應(yīng)混合物、方法和組合物的溶劑或其他介質(zhì)中時(shí)，伴隨的平衡離子可以與溶劑或其他介質(zhì)中存在的其他平衡離子交換。這樣的附加平衡離子可以是溶劑離子、根、緩沖液、和/或金屬。
需要認(rèn)識(shí)到，R2基團(tuán)實(shí)際上可以是任何源自結(jié)構(gòu)式I的親本化合物(其中t＝Z＝0) 和具有結(jié)構(gòu)式R2-L的化合物(其中L是適當(dāng)?shù)碾x去基團(tuán)、R2如上面所定義)之間親核反應(yīng)的基團(tuán)。例如，R2是任選取代的烷基、?；?、芳基、磺酸或磺?；鶊F(tuán)，其中每種可被任選取代。示例性的離去基團(tuán)L包括但不限于如氯化物和溴化物的鹵化物，如醋酸根、甲酸根、三氟醋酸根的?；?，如甲基磺酸根、三氟甲基磺酸根和甲苯基磺酸根的磺酸根，如甲基硫酸根的硫酸根等。在一種說明性的實(shí)施方式中，Q是一種雜環(huán)，例如但不限于
其中R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14是各自獨(dú)立選自氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、烯基、多烯基、炔基、聚炔基、烯炔基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷硫基、二烷基氨基，其中每種可以被任選取代。
在另一種說明性的實(shí)施方式中，R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一是如美國(guó)專利5,658,751中所述的含有雜原子的部分。在另一種說明性的實(shí)施方式中，R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一是一種反應(yīng)基，所述反應(yīng)基包括但不限于鹵素、羥基、烴氧基、胺、羧酸、鹵化物、乙醇、乙醛、硫醇、烷基和芳基硫醇、烷基和芳基磺酰基、琥珀酰亞胺酯、酮以及異硫氰酸，它們可以用于通過例如形成碳-碳鍵、酰胺、醚、硫醚、二硫鍵、酮、硫脲及希弗堿(Schiff bases)將所述部分連接到染料的核心結(jié)構(gòu)。在另一種說明性的實(shí)施方式中，R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一是具有以下結(jié)構(gòu)式的橋聯(lián)染料(BRIDGE-DYE) 其中 X、R2、t、Z、R3、R9、R10、Q和n如對(duì)結(jié)構(gòu)式I所作的定義，橋是一種單一的共價(jià)鍵，或是線性的或分支的、環(huán)或雜環(huán)的、飽和的或不飽和的共價(jià)鍵，具有1-16個(gè)如碳、氮、磷、氧和硫的非氫原子，這樣所述的鍵包括烷基、醚、硫醚、胺、酯或酰胺鍵；單鍵、雙鍵、三鍵或芳香碳-碳鍵；磷-氧、磷-硫、氮-氮或氮-氧鍵；或是芳香或雜芳香鍵的任意組合。需要認(rèn)識(shí)到，在有些實(shí)施方式中，這一二聚結(jié)構(gòu)在橋周圍是對(duì)稱的，在其他的實(shí)施方式中，這一二聚結(jié)構(gòu)在橋周圍是不對(duì)稱的，其中例如 X、R2、t、Z、R3、R9、R10和n中的任何一種在每種情況下在橋的每一側(cè)是各自獨(dú)立選擇的。
本發(fā)明中使用的示例性染料也包括具有吡啶或嘧啶核心結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)式I的花青染料，其中X代表氧或硫； 部分代表任選取代的熔苯、任選取代的熔萘、任選取代的熔吡啶、任選取代的熔嘧啶、任選取代的熔喹啉等；n＝0或1；t＝0或1；R2是烷基，如甲基和乙基，任選取代的芳基，如苯基或甲苯基，烯基磺酸根，如丙基烯磺酸，或烷基磺?；?，如CH3(CH2)mSO2，其中m為0、1、2或3；以及Q是選自以下結(jié)構(gòu)的雜環(huán)
其中R4是氫、烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等；烷硫基，包括甲硫基、乙硫基等；雜環(huán)烷基，包括任選取代的哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等；或包含帶電基團(tuán)的雜環(huán)烷基，包括4，4-二甲基哌嗪-1-基等；或反應(yīng)基，包括鹵素、羥基、烷氧基、硫代基、烷基和芳基硫基、烷基和芳基磺?；?、氨基、甲?；⑼榛头蓟驶?、羧基衍生物等；R5是C1-6烷基，包括甲基、乙基、丁基、仲丁基、異丁基等；任選取代的苯基；或(CH2)3N+(ME)3；以及R6、R7和R8是各自獨(dú)立的氫或甲基。
這里使用的示例性染料也包括具有吡啶或嘧啶核心結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)式I的花青染料，其中X是氧或硫； 部分代表形成任選取代的苯并噁唑或苯并噻唑環(huán)的任選取代的熔苯，或形成任選取代的萘并噁唑或萘并噻唑環(huán)的任選取代的熔萘；n＝0或1；t＝0或1；R2是烷基，如甲基，芳基，如苯基或甲苯基，烯基磺酸根，如丙烯磺酸，或烷基磺?；鏑H3(CH2)mSO2，其中m為0、1、2或3；以及Q是4-吡啶或4-嘧啶雜環(huán)。
這里所使用的示例性染料也包括在這里所述的PCR混合物、方法、和組合物中有用的具有喹啉核心結(jié)構(gòu)的花青染料，并通常用結(jié)構(gòu)式II描述 結(jié)構(gòu)式II其中 部分代表任選取代的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)或含氮雜芳環(huán)；X是氧、硫、或選自C(CH3)2和NR1的基團(tuán)，其中R1是氫或C1-6烷基；
R2是烷基，包括C1-6烷基和C2-6烷基，環(huán)烷基，包括C3-8環(huán)烷基，芳基，芳烷基，烯基磺酸根，含雜原子的環(huán)部分，或含雜原子的脂肪族部分，其中每種可以被任選取代；t＝0或1；Z是選自0或1的電荷數(shù)；R3、R9和R10各自獨(dú)立選自氫和包括C1-6烷基的烷基；n＝0、1或2；以及R4、R5、R8、R11、R12、R13和R14按這里對(duì)結(jié)構(gòu)式I所作的描述，假如R4是分子量小于約115，或示例性地分子量小于105的部分；本發(fā)明中使用的示例性染料也包括結(jié)構(gòu)式II的花青染料，其中 部分代表任選取代的熔苯，從而形成苯并噁唑或苯并噻唑環(huán)；X是氧或硫；n＝0或1；t＝0或1；R2是甲基；R4是氫、C1-6烷基，包括甲基，或任選取代的苯基；R5是C1-6烷基，包括甲基，或任選取代的苯基；R8是氫，以及R11、R12、R13和R14是氫或烷氧基，包括甲氧基。
在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明中所使用的染料也示例性地包括結(jié)構(gòu)式II的花青燃料，其中 部分代表任選取代的雜環(huán)，包括1-甲基吡啶并和3-溴-1-吡啶并甲基；X是氧或硫；n＝0或1；t＝Z＝0；R4是氫或C1-6烷基，包括甲基；R5是C1-6烷基，包括甲基，任選取代的苯基或環(huán)烷基，包括具有帶電基團(tuán)如基團(tuán)-(CH2)3N+(ME)3的環(huán)烷基；R8是氫；以及R11、R12、R13和R14是氫，烷基，包括甲基，或烷氧基，包括甲氧基。
在另一種實(shí)施方式中，將結(jié)構(gòu)式I的兩種化合物合并以形成二聚體。所述的兩種化合物通過用單一的二價(jià)連接物替代存在于結(jié)構(gòu)式I的每種化合物上的如以上所定義的取代物R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一互相連接。例如，合并結(jié)構(gòu)式I的兩種化合物以形成二聚體，其中存在于所述兩種結(jié)構(gòu)式I的化合物上的兩種R5取代物用單一的二價(jià)連接物替代。需要認(rèn)識(shí)到，這里考慮到了結(jié)構(gòu)式I化合物的對(duì)稱與非對(duì)稱二聚體。在結(jié)構(gòu)式I的化合物的非對(duì)稱二聚體的情況下，需要理解到，通過由具有不同取代方式的或具有不同雜環(huán)Q的結(jié)構(gòu)式I的化合物形成二聚體可以產(chǎn)生這樣的不對(duì)稱。進(jìn)一步，通過用所述二價(jià)連接物替代結(jié)構(gòu)式I的化合物的不同取代物而形成的二聚體可以產(chǎn)生這樣的不對(duì)稱，例如用所述二價(jià)連接物替代第一種結(jié)構(gòu)式I化合物上的R5并替代第二種結(jié)構(gòu)式I化合物上的R8。
在另一種實(shí)施方式中，將結(jié)構(gòu)式II的兩種化合物合并以形成二聚體。所述的兩種化合物通過用單一的二價(jià)連接物替代存在于結(jié)構(gòu)式II的每種化合物上的如以上所定義的取代物R4、R5、R8、R11、R12、R13和R14之一互相連接。例如，合并結(jié)構(gòu)式II的兩種化合物以形成二聚體，其中存在于所述兩種結(jié)構(gòu)式II的化合物上的兩種R5取代物用單一的二價(jià)連接物替代。需要認(rèn)識(shí)到，這里考慮到了結(jié)構(gòu)式II化合物的對(duì)稱與非對(duì)稱二聚體。在結(jié)構(gòu)式II的化合物的非對(duì)稱二聚體的情況下，需要理解到，通過由具有不同取代方式的或具有不同雜環(huán)Q的結(jié)構(gòu)式II的化合物形成二聚體可以產(chǎn)生這樣的不對(duì)稱。進(jìn)一步，通過用所述二價(jià)連接物替代結(jié)構(gòu)式II的化合物的不同取代物而形成的二聚體可以產(chǎn)生這樣的不對(duì)稱，例如用所述二價(jià)連接物替代第一種結(jié)構(gòu)式II化合物上的R5并替代第二種結(jié)構(gòu)式II化合物上的R8。
由結(jié)構(gòu)式I的化合物形成的二聚體花青染料結(jié)構(gòu)也可以用結(jié)構(gòu)式III表示 結(jié)構(gòu)式III其中 和 部分分別代表獨(dú)立選自任選取代的熔合單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)或含氮雜芳環(huán)；X和X’各自獨(dú)立選自氧、硫、硒、碲或選自C(CH3)2、NR1或NR1’的基團(tuán)，其中NR1和NR1’是各自獨(dú)立的氫或C1-6烷基；R2和R2’是各自獨(dú)立選自烷基，包括C1-6烷基，環(huán)烷基，包括C3-8環(huán)烷基，芳基，芳烷基，包括芳基(C1-2烷基)，含雜原子的環(huán)部分，或含雜原子的脂肪族部分，其中每種可以被任選取代；t＝0或1；t’＝0或1；Z和Z’各自是獨(dú)立選自0或1的電荷數(shù)；
R3、R9、R10、R3′、R9′和R10′各自獨(dú)立選自氫和烷基，包括C1-6烷基；n＝0、1或2；n’＝0、1或2；橋是由2到約30個(gè)二價(jià)單元構(gòu)成的二價(jià)連接物，所述的二價(jià)單元選自烯基、雜烯基、烷二胺基(alkylamindiyl)、烷基烷基二銨基(alkylalkylammoniumdiyl)等，如(CH2)P、(CH2)pN+Me2(CH2)q、(CH2)pN+Me2(CH2)qN+Me2(CH2)r等，其中p、q和r各自獨(dú)立選自1、2和3；以及Q和Q’是雜環(huán)，各自獨(dú)立選自下列結(jié)構(gòu) 其中R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14在每種結(jié)構(gòu)式III的化合物中獨(dú)立選自氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、烯基、多烯基、炔基、聚炔基、烯炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基，其中每種基團(tuán)可以被任選取代。
在本發(fā)明的PCR反應(yīng)混合物、方法和組合物中有用的示例性花青染料也包括但不限于LightCycler Green、PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTO 43、SYTO44、SYTO 45、SYTOX Blue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1，BOBOTM-3，以及具有通式IV的其他染料 結(jié)構(gòu)式IVa 結(jié)構(gòu)式IVb以及實(shí)施例14中所展示的染料G5、H5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6和D8，以及具有通式V的其他染料 結(jié)構(gòu)式Va 結(jié)構(gòu)式Vb其中n是0、1或2；R2是烷基、羥烷基、烷氧烷基、氨烷基、單烷基和二烷基胺烷基、三烷基銨烷基、烯基羧酸根、烯基羧酰胺、烯基磺酸根等；R5是烷基、羥烷基、烷氧烷基、氨烷基、單烷基和二烷基胺烷基、三烷基銨烷基、烯基羧酸根、烯基羧酰胺、烯基磺酸根、任選取代的苯基等；X是氧或硫；A、A’、和B各自代表一種或多種獨(dú)立選擇的任選取代物，如烷基、鹵素、氨基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、烷基和芳基磺?；Ⅺu代烷基磺?；⑼榛头蓟蚧?、甲?；⑼榛头蓟驶?、羧基衍生物、單烷基和二烷基氨基、三烷基銨、二烷基胺烷基、三烷基銨烷基、或包括吡咯烷并、哌啶并、哌嗪并的雜環(huán)(其中每種基團(tuán)可以用烷基、氨基、單烷基或二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基取代，或可用烷基在氮上任選季銨化)等；橋是具有結(jié)構(gòu)式(CH2)pN+Me2(CH2)q的二價(jià)連接物(其中p和q獨(dú)立地等于2或3)，包括二價(jià)連接物(CH2)3N+Me2(CH2)3。需要理解，當(dāng)這些染料具有凈電荷時(shí)，它們伴有一種或多種平衡離子，如包括鹵化物、鏈烷酸根、磷酸根等的平衡陰離子，以及包括鋰、鈉、鉀、銫、銨等的平衡陽離子。
這里所使用的其他示例性染料包括但不限于YO-PRO-1，TO-PRO-1、SYTO 11、SYTO 13、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 20、SYTO 23、TOTOTM-3、Y0Y0-3(Molecular Probes，Inc.)，GelStar(Cambrex Bio ScienceRockland Inc.，Rockland，ME)，Thiazole Orange(Aldrich)，以及具有通式VI的其他染料 結(jié)構(gòu)式VIa 結(jié)構(gòu)式VIb其中n是0、1或2；R2是烷基、羥烷基、烷氧烷基、氨烷基、單烷基和二烷基胺烷基、三烷基銨烷基、烯基羧酸根、烯基羧酰胺、烯基磺酸根等；R5是烷基、羥烷基、烷氧烷基、氨烷基、單烷基和二烷基胺烷基三烷基銨烷基、烯基羧酸根、烯基羧酰胺、烯基磺酸根、任選取代的苯基等；X是氧或硫；A、A’、和B各自代表一種或多種獨(dú)立選擇的任選取代物，如烷基、鹵素、氨基、單烷基和二烷基氨基、吡咯烷并、哌啶并、哌嗪并、苯基、羥基、烷氧基、硫代基和烷硫基，其中每種基團(tuán)可以用烷基、氨基、單烷基或二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基等取代；橋是具有結(jié)構(gòu)式(CH2)pN+Me2(CH2)q的二價(jià)連接物，其中p和q獨(dú)立地等于2或3，包括二價(jià)連接物(CH2)3N+Me2(CH2)3。需要理解，當(dāng)這些染料具有凈電荷時(shí)，它們伴有一種或多種平衡離子，如包括鹵化物、鏈烷酸根、磷酸根等的平衡陰離子，以及包括鋰、鈉、鉀、銫、銨等的平衡陽離子。
進(jìn)一步，表1(在下面實(shí)施例13中提供)表示了在PCR過程中或之后通常使用的幾種雙鏈DNA染料以及以前還未用于PCR分析的多種染料的比較。初始結(jié)果已經(jīng)表明，對(duì)于異源雙鏈分子的檢測(cè)，LC Green、PO-PROTM-1、JO-PROTM-1、BO-PROTM-1、G5、H5、D6、P6、Y6和D8是有希望的染料。這些染料具有幾個(gè)令人驚訝的性質(zhì)。第一，在50％的飽和度下，這些染料不會(huì)明顯抑制PCR。事實(shí)上，用這些染料中的三種，相當(dāng)接近100％的飽和水平是與PCR相容的。第二，雖然這些染料中的一些在藍(lán)光區(qū)間發(fā)光，它們可以在多種目前可用的儀器的熒光素通道中使用。為了更好地匹配這些染料的激發(fā)/發(fā)射廣譜而對(duì)光學(xué)器件的調(diào)?？梢赃M(jìn)一步提高它們?cè)诙炕蚨ㄐ詳U(kuò)增分析的使用中的靈敏度。
需要理解，以上的花青染料是示例性的，其他的花青染料也可以在所述的方法中使用。
諸如但不限于SYBR Green I、SYTOX Green、SYTO 14、SYTO 21、SYTO 24、SYTO 25、TOTOTM-1和YOYO-1的一些基于喹啉的不對(duì)稱花青沒有被證明可以用于異源雙鏈分子檢測(cè)或多種產(chǎn)物的閉管檢測(cè)。當(dāng)所述染料是一種基于喹啉的花青的單體時(shí)，緊靠喹啉環(huán)的氮的碳上(相當(dāng)于R4位置)大體積的取代可能干擾所述染料在本發(fā)明的方法中發(fā)揮功能的能力。大體積取代是指，例如，用分子量大于約105的支鏈脂肪族部分取代長(zhǎng)鏈分支的含雜原子脂肪族或芳香族部分。然而，這一限制不適用于前面提到的任何吡啶或嘧啶花青。在基于喹啉的花青二聚體的情況下，如由以下二價(jià)片段所定義的左右環(huán)系統(tǒng)之間的距離看來也決定功能性。
功能性可以如這里的實(shí)施例13-14中所述的那樣，通過異源雙鏈分子檢測(cè)得以確定。諸如SYBR Gold、Pico Green和溴化乙錠等以前描述的可用于PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的其他染料在閉管PCR系統(tǒng)的異源雙鏈分子檢測(cè)中也已被證明是無效的。
本發(fā)明中使用的染料可以在基于染料的SNP基因分型方法中使用，這只需要兩種未標(biāo)記的寡核苷酸引物和針對(duì)每種SNP基因型的一個(gè)反應(yīng)池，并不要求實(shí)時(shí)PCR。使用一種雙鏈DNA染料，這樣通過能改變擴(kuò)增后解鏈曲線形狀的異源雙鏈分子的存在鑒別雜合子。不同純合子基因型通過其Tm差異，或作為另一種選擇，通過已知純合子DNA樣品與未知樣品混合并尋找異源雙鏈分子進(jìn)行區(qū)分。例如，因?yàn)榭梢允褂煤芏痰臄U(kuò)增子，優(yōu)選的是直接與SNP側(cè)翼相接的擴(kuò)增子，PCR引物設(shè)計(jì)得到了極大簡(jiǎn)化。這樣的短的擴(kuò)增子同時(shí)非常有效地?cái)U(kuò)增，降低擴(kuò)增其他靶標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，并使非常快速的熱循環(huán)成為可能。
PCR引物設(shè)計(jì)不是一門精確的科學(xué)，經(jīng)常的嘗試和錯(cuò)誤是必然的。雖然一些PCR引物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)則被廣泛接受，這些準(zhǔn)則的正確性還沒有得到檢驗(yàn)。因?yàn)橛枚痰臄U(kuò)增子時(shí)不同基因型對(duì)解鏈曲線的影響更大，優(yōu)選短的擴(kuò)增子(≤100bp)，并且通常最好的是最短的可能的擴(kuò)增子(≤50bp)。因此，為了設(shè)計(jì)用于用雙鏈DNA染料基因分型的引物，例如從緊鄰SNP位點(diǎn)的每條側(cè)翼引物開始。這樣，擴(kuò)增子長(zhǎng)度將是引物1的長(zhǎng)度加上引物2的長(zhǎng)度加上需要進(jìn)行檢測(cè)的區(qū)域的長(zhǎng)度(一個(gè)SNP的長(zhǎng)度是1)。為了有效擴(kuò)增，兩條引物的解鏈溫度(Tm)應(yīng)該基本相同。引物適當(dāng)?shù)腡m可以是50-70℃。例如，最高Tm值的引物可以使最快的熱循環(huán)成為可能，而Tm值較低的引物通常較便宜并產(chǎn)生最短的擴(kuò)增子，這導(dǎo)致更大的基因分型差異。通常使用長(zhǎng)度介于12到30個(gè)堿基的引物。例如，每種引物從SNP往外構(gòu)建直到計(jì)算的Tm值最接近于希望的Tm值。計(jì)算Tm值的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的(例如Clin.Chem.2001；471956-61)。通常，當(dāng)Tm值盡可能匹配時(shí)，引物長(zhǎng)度應(yīng)是不一樣的。例如，在因子V的SNP分析(圖1)中使用的引物長(zhǎng)度是17和24個(gè)堿基，兩者具有接近62℃的計(jì)算匹配的Tm值。
因?yàn)閷?duì)于這樣短的擴(kuò)增子幾乎不需要引物延伸，擴(kuò)增的熱循環(huán)參數(shù)可以很短。熱循環(huán)以前的基因組DNA最初變性之后，不需要保持變性與退火溫度，延伸時(shí)間可以是10秒或更少。甚至可以將編程的延伸時(shí)間降為0，以使每個(gè)循環(huán)在20秒之內(nèi)進(jìn)行。另外，可以使用1秒的延伸時(shí)間。因?yàn)閿U(kuò)增子這么短，不需要大量的聚合酶(可以使用＜0.6單位每10微升)。
因而，按照本發(fā)明，可以按照以下示例性步驟進(jìn)行SNP基因分型1.選擇目標(biāo)Tm值并從緊鄰SNP位點(diǎn)的每種引物的3’末端開始。任選，引物可以從SNP位點(diǎn)稍微移開以避免引物之間3’互補(bǔ)從而降低形成引物二聚體的風(fēng)險(xiǎn)。
2.向外設(shè)計(jì)每種引物直至計(jì)算的Tm值盡可能接近目標(biāo)Tm值。
3.在存在PCR試劑和允許異源雙鏈分子檢測(cè)的雙鏈DNA染料存在的條件下對(duì)樣品進(jìn)行快速熱循環(huán)。
4.變性以后通過速度至少為-0.1℃/秒，優(yōu)選地至少-2℃/秒，最優(yōu)選地至少-5℃/秒的快速冷卻形成異源雙鏈分子。
5.以0.1-0.5℃/秒的速度加熱并獲得解鏈曲線。
6.如果所述擴(kuò)增失敗，將一條引物的3’末端外移1個(gè)堿基并重復(fù)所有步驟直到獲得成功。
在一個(gè)說明性的實(shí)例中，所有雜合子可以通過異源雙鏈分子對(duì)解鏈曲線的影響得以檢測(cè)(圖4)。除此以外，6種純合子差異中的4種(A對(duì)C、A對(duì)G、C對(duì)T、和G對(duì)T)很容易通過Tm移動(dòng)進(jìn)行區(qū)分(圖4，箭頭)。然而，為了區(qū)分A對(duì)T純合子，可能需要高分辨率解鏈，并且在有些情況下，即便使用高分辨率解鏈也不能區(qū)分C對(duì)G純合子。在純合子難于區(qū)分的情況下，擴(kuò)增前或擴(kuò)增后可以將已知純合子基因型的樣品以大致相當(dāng)?shù)牧颗c所述未知基因型混合。對(duì)這一混合物進(jìn)行擴(kuò)增(如果以前未擴(kuò)增)、變性和解鏈。如果所述基因型是相同的，混合物的解鏈曲線應(yīng)與已知的純合子基因型的解鏈曲線相同。如果所述基因型不同，會(huì)產(chǎn)生異源雙鏈分子并由解鏈曲線形狀的改變得以鑒別。例如，在對(duì)已知序列變異體進(jìn)行基因分型時(shí)，可以使用小的擴(kuò)增子。在掃描未知變異體時(shí)，可以優(yōu)選大的擴(kuò)增子。
不對(duì)稱的花青染料可以通過通常方法進(jìn)行制備，該方法通過一個(gè)或多個(gè)“-C(R)＝”基團(tuán)將分子的吲哚部分與吡啶(或喹啉、嘧啶、嘌呤)部分連接。如美國(guó)專利5,436,134及其引用的參考中所述，“-C(R)＝”基團(tuán)的數(shù)量由合成中使用的具體合成試劑決定。在如LC Green的單次甲基染料(R＝H，n＝0)的合成中，使用了試劑的一種組合，其中次甲基碳原子由作為甲基的吲哚鹽上的A或吡啶鹽上的B和A和B之外的反應(yīng)性離去基團(tuán)生成，所述離去基團(tuán)通常是甲硫基、甲基磺?；蚵然?，但可以是提供足夠反應(yīng)性以完成反應(yīng)的任何離去基團(tuán)。一種可以制備LC Green及其他類似染料的方法如下 起始材料化合物1通過將4-甲基-2-吡啶酮(Aldrich)用銅粉、碳酸鉀和碘代苯加熱至回流48小時(shí)進(jìn)行制備。將反應(yīng)冷卻至室溫，在水和乙酸乙酯之間相分配，過濾，并將有機(jī)層在硫酸鎂上干燥。粗產(chǎn)物在硅膠柱上純化，用1∶1的乙酸乙酯/己烷洗脫以收獲化合物1。
另一種起始材料，化合物2，是作為一種碘鹽通過向DMF中的甲基碘添加2-(甲硫基)苯并唑并在密封試管中150℃加熱1小時(shí)以獲得化合物2進(jìn)行制備。
化合物1、氧氯化磷以及二氯甲烷中催化量的DMF的混合物加熱至回流24小時(shí)。混合物冷卻至室溫并加入另一份體積的二氯甲烷，隨后加入化合物2和1當(dāng)量的三乙胺?；旌衔锸覝叵聰嚢?小時(shí)。通過過濾分離固體并用硅膠柱使用乙酸乙酯/氯仿/甲醇的混合物洗脫進(jìn)行純化。純化的化合物隨后重溶于甲醇并添加過量的碘化鈉水溶液?；衔?以碘鹽的形式通過過濾分離并真空干燥。
化合物3隨后與1，2-二氯乙烷中的1-甲基哌嗪混合并55℃加熱2小時(shí)。獲得的產(chǎn)物(化合物4)隨后通過添加過量的甲基碘和Proton Sponge(Aldrich)季銨化，預(yù)期收獲二碘化鹽形式的LightCycler Green(化合物5)。
實(shí)施例1PCR方案標(biāo)記的和未標(biāo)記的寡核苷酸從IT Biochem(Salt Lake City，UT)、QiagenOperon(Alameda，CA)或Synthegen(Houston，TX)處獲得。除了另有說明以外，10微升體積的PCR在LightCycler(Roche Applied Systems，Indianapolis，IN)上以20℃/秒的程序性變化進(jìn)行。除了另有說明以外，擴(kuò)增混合物包括了50納克作為模板的基因組DNA、每種dNTP各200μM、3mM MgCl2、100mM 2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇，pH 8.8，0.04單位/微升Taq聚合酶(Roche)、500微克/毫升BSA、以及每種引物各0.5μM?；蚍中偷娜祟惢蚪MDNA來自以前的研究(Gundry CN等，Genetic Testing，1999；3365-70；Herrmann M等，Clin Chem2000；46425-8)或來自Coriell細(xì)胞庫(kù)(Camden，NJ)。除了另有說明以外，PCR反應(yīng)中包含10μM的LightCycler Green。在使用SYBR Green I作為指示劑的情況下，使用了Molecular Probes儲(chǔ)存液的1∶10,000最終稀釋。在PCR之前添加染料，進(jìn)行擴(kuò)增，并在LightCycler上或通過高分辨率解鏈分析監(jiān)測(cè)擴(kuò)增子的解鏈轉(zhuǎn)變。通過擴(kuò)增子解鏈溫度(Tm)區(qū)分不同的純合子。通過能加寬總的解鏈轉(zhuǎn)變區(qū)間的異源雙鏈分子的低溫解鏈鑒別雜合子。解鏈分析需要約1分鐘，并且不需要PCR后的取樣過程。
為了研究LC Green、SYBR Green I和其他雙鏈DNA結(jié)合染料的靈敏度，分析了因子V Leiden、囊腫性纖維化(F508del，F(xiàn)508C，I507del，I506V)和HTR2A(T102C)基因中的多態(tài)性。此外，使用了工程質(zhì)粒以全面研究所有可能的單個(gè)堿基改變。通過雜合子DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的異源雙鏈分子最好通過解鏈分析過程中變性產(chǎn)物的快速冷卻(至少-2℃/秒)、隨后通過快速加熱(0.2到0.4℃/秒)進(jìn)行檢測(cè)。所有雜合子區(qū)別于純合子的是具有更寬范圍的解鏈轉(zhuǎn)變。不同的純合子經(jīng)常可以通過其Tm值加以區(qū)分。具有A到T堿基改變的純合子只能通過高分辨率解鏈分析或通過純合子混合進(jìn)行區(qū)分。純合子G到C堿基改變不進(jìn)行純合子混合的話，即使使用高分辨率分析也不能可重復(fù)地加以區(qū)分。所述擴(kuò)增子長(zhǎng)度在44到331bp之間變化。
雖然這里提供的實(shí)施例中使用了LC Green，應(yīng)該理解，可以使用對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的其他染料。
實(shí)施例2解鏈曲線分析循環(huán)后立即在LightCycler上或隨后在高分辨率解鏈裝置上(HR-1，IdahoTechnology，Salt Lake City，UT)進(jìn)行解鏈曲線分析。然而，需要理解到解鏈曲線分析可以在沒有擴(kuò)增的情況下進(jìn)行。在使用LightCycler時(shí)，樣品首先加熱到94℃，以-20℃/秒的程序化設(shè)置冷卻到60℃，然后以0.2℃/秒解鏈并連續(xù)獲得熒光。至于高分辨率解鏈，除了另有說明以外，樣品首先在LightCycler中擴(kuò)增，隨后在LightCycler中瞬間加熱至94℃并快速冷卻(程序設(shè)置-20℃/秒)到40℃。除了另有說明以外，然后將LightCycler毛細(xì)管每次一根轉(zhuǎn)移到高分辨率裝置并以0.3℃/秒加熱。HR-1是用鋁質(zhì)圓柱包圍一根LightCycler毛細(xì)管的單取樣裝置。系統(tǒng)通過環(huán)繞圓柱外部的螺旋凹槽由焦耳加熱進(jìn)行加熱。樣品溫度用同樣置于圓柱內(nèi)部的熱電偶監(jiān)測(cè)并轉(zhuǎn)換成16比特?cái)?shù)字信號(hào)。熒光通過位于圓柱底部的毛細(xì)管末端的內(nèi)置照明進(jìn)行監(jiān)測(cè)(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22176-81)并同樣轉(zhuǎn)換成16比特信號(hào)。對(duì)每℃獲得大約50個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
在有些情況下，PCR之后在獲得解鏈曲線之前產(chǎn)物不變性是有其好處的。例如，當(dāng)目標(biāo)是重復(fù)序列(例如STRs和VNTRs)的數(shù)量分型時(shí)，擴(kuò)增可以在平臺(tái)期之前的反應(yīng)指數(shù)期過程中的延伸步驟上終止，并隨后進(jìn)行解鏈分析。這樣，可以分析同源雙鏈分子延伸產(chǎn)物。在重復(fù)序列分型中，特別是因?yàn)樵S多不同的異源雙鏈分子產(chǎn)物可能由重復(fù)序列的不同對(duì)齊排列形成，所以同源雙鏈分子產(chǎn)物可以比異源雙鏈分子產(chǎn)物提供更多信息。在有些情況下，既獲得同源雙鏈分子解鏈曲線(未經(jīng)前期變性)，又獲得異源雙鏈分子解鏈曲線(經(jīng)變性并形成所有可能的雙鏈組合)可能是有益的。使用相同樣品作為“同源雙鏈對(duì)照”，這兩種解鏈曲線之間的差異給出了能夠形成的異源雙鏈分子程度的量度。
LightCycler和高分辨率解鏈數(shù)據(jù)用Lab View中編寫的定制軟件進(jìn)行分析。熒光-溫度圖通過首先定義每種樣品解鏈轉(zhuǎn)變之前和之后的線性基線在0到100％之間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。每種樣品中，每個(gè)獲得的熒光作為該獲得溫度下頂部和底部基線之間熒光百分比進(jìn)行計(jì)算。在有些情況下，導(dǎo)數(shù)解鏈曲線圖在每一點(diǎn)上由Savitsky-Golay多項(xiàng)式進(jìn)行計(jì)算(Press WH等人主編的《C語言中的數(shù)字處理》(Numerical recipes in C)，第二版，New YorkCambridge University Press，1992650-5)。Savitsky-Golay分析使用2次多項(xiàng)式和包括1℃間隔之內(nèi)所有點(diǎn)的數(shù)據(jù)窗口。通過使用非線性最小二乘回歸法以適合多重高斯函數(shù)，獲得了峰面積和解鏈溫度。在有些情況下，對(duì)每條標(biāo)準(zhǔn)化的解鏈曲線的X軸進(jìn)行移動(dòng)以使圖在一定的熒光區(qū)間內(nèi)重疊。這一“溫度移動(dòng)”校正了任何細(xì)微的運(yùn)行中的溫度變化并提高了將雜合子與純合子區(qū)分的能力?；蛐椭g的差異也可以通過在每一溫度下基因型之間的熒光差異作圖進(jìn)行放大。
實(shí)施例3使用LightCycler Green的單核苷酸多態(tài)性基因分型因子V Leiden突變基因分型由長(zhǎng)度為18和24個(gè)堿基、緊鄰因子V Leiden突變位點(diǎn)兩側(cè)的引物形成43bp的擴(kuò)增子。兩條引物均具有62℃的估計(jì)Tm值。樣品使用以下方案循環(huán)35次94℃不保持、60℃不保持、以及72℃保持10秒。擴(kuò)增以后，樣品在LightCycler內(nèi)瞬間加熱至94℃，快速冷卻(程序設(shè)置-20℃/秒)到60℃，PCR產(chǎn)物以0.2℃/秒解鏈并獲得連續(xù)熒光。
圖1中顯示了從因子V基因Leiden位點(diǎn)的不同基因型擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的導(dǎo)數(shù)解鏈曲線。LightCycler Green用于雙鏈和單鏈產(chǎn)物之間解鏈轉(zhuǎn)變的熒光監(jiān)測(cè)。Leiden突變位于擴(kuò)增子一端19個(gè)堿基處。顯示了從10個(gè)純合子野生型、2個(gè)雜合子以及1個(gè)純合子Leiden基因型獲得的結(jié)果。純合子突變體的擴(kuò)增子解鏈溫度比純合子野生型解鏈溫度低大約1℃。歸因于異源雙鏈分子形成，雜合子樣品表現(xiàn)出一個(gè)次級(jí)的、低溫解鏈轉(zhuǎn)變。使用SYBR Green I的類似實(shí)驗(yàn)沒有檢測(cè)到這一雜合子中的次級(jí)解鏈轉(zhuǎn)變(數(shù)據(jù)未公開)。
在LightCycler上使用雜合子因子V Leiden DNA研究了冷卻速度和加熱速度的影響。為了研究冷卻速度的影響，如上所述擴(kuò)增樣品，加熱至85℃，隨后以-20、-2、-0.5或-0.1℃/秒的速度從85℃冷卻到60℃，之后通過0.2℃/秒的恒定加熱速度以獲得解鏈曲線?？焖倮鋮s對(duì)于形成明顯的異源雙鏈分子是必需的(圖2)。當(dāng)冷卻速度是-0.1℃/秒或更低時(shí)，沒有觀察到異源雙鏈分子。當(dāng)毛細(xì)管樣品從沸水快速轉(zhuǎn)移到冰水中時(shí)，發(fā)生最大量的異源雙鏈分子形成(圖2)。采用在LightCycler上冷卻，異源雙鏈分子形成在快于-5℃/秒的設(shè)置速度時(shí)看來達(dá)到穩(wěn)定水平(圖2)。然而，實(shí)際樣品溫度的測(cè)量顯示，設(shè)置速度快于-5℃/秒時(shí)，冷卻速度僅有細(xì)微的提高當(dāng)裝置設(shè)置為-20℃/秒冷卻時(shí)，實(shí)際速度約為-6℃/秒。
通過以-20℃/秒的設(shè)置速度冷卻，隨后以0.05、0.1、0.3、或0.5℃/秒解鏈研究了加熱速度的影響。與更高的加熱速度相一致，觀察到的異源雙鏈分子的相對(duì)百分比更高(圖3)。隨著速度提高，表觀Tm值也向更高的溫度遷移，并且解鏈過程更大程度地從平衡狀態(tài)偏離(Gundry CN等，Genetic Testing，1999；3365-70)。
實(shí)施例4使用質(zhì)粒對(duì)SNP基因分型的系統(tǒng)研究為了對(duì)所有可能的單堿基改變的解鏈曲線基因分型進(jìn)行系統(tǒng)研究，使用了工程質(zhì)粒。所述質(zhì)粒(DNA Toolbox，Cambrex Bio Science Rockland Inc.)在40％GC含量中在定義位置上包含了A、C、G或T(Highsmith WE等，Electrophoresis 1999；201186-94)。Tm為62±1℃的引物緊鄰多態(tài)性位點(diǎn)。使用105拷貝的DNA模板并且采用94℃不保持、60℃不保持、75℃保持5秒的35個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。LightCycler用于解鏈分析。
圖4說明，由單堿基多態(tài)性形成的所有可能的異源雙鏈分子能與同源雙鏈分子區(qū)分。在每種情況下，異源雙鏈分子的存在導(dǎo)致在導(dǎo)數(shù)解鏈曲線圖上形成低溫肩部形態(tài)。當(dāng)樣品只包括由純合子擴(kuò)增形成的同源雙鏈分子時(shí)，不存在低溫肩部形態(tài)。而且，AA或TT純合子通過其解鏈溫度與CC或GG純合子明顯區(qū)分。由這些“低分辨率”圖形(在LightCycler上獲得)不能確定是否所有雜合子可以互相區(qū)分，或是否AA能與TT區(qū)分，CC能與GG區(qū)分。然而，高分辨率數(shù)據(jù)(未公開)表明，AA能與TT區(qū)分，并且絕大部分(如果不是全部)雜合子能被區(qū)分。CC和GG純合子的穩(wěn)定性看來非常相似，并且在現(xiàn)有的儀器上不通過純合子混合難以區(qū)分任何差異。
實(shí)施例5采用標(biāo)記引物、LightCycler Green或SYBR Green I的囊腫性纖維化基因的基因分型PCR中使用了KlenTaql聚合酶(0.04單位/微升，AB Peptides，St.Louis，MO)，88納克TaqStart抗體(ClonTech，Palo Alto，CA)以及50mM Tris，pH 8.3，而不是Taq聚合酶和2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇。用下列引物GGCACCATTAAAGAAAATAT(SEQ ID NO1)和TCATCATAGGAAACACCA(SEQ ID NO2)擴(kuò)增了一個(gè)44bp的片段。第一條引物或用Oregon Green進(jìn)行了5’標(biāo)記，或是反應(yīng)在SYBR Green I或LightCycler Green存在的條件下進(jìn)行。引物與包含F(xiàn)50gdel、I507del和F508C變異體的突變熱點(diǎn)相鄰。PCR經(jīng)過85℃和58℃(保持0秒)的40個(gè)循環(huán)進(jìn)行。在LightCycler上解鏈曲線獲得過程中監(jiān)測(cè)了6個(gè)樣品。
圖5B-D顯示了由囊腫性纖維化基因I507/F508區(qū)域上不同基因型擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的導(dǎo)數(shù)解鏈曲線。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為41或44個(gè)堿基(圖5A)。5’標(biāo)記引物(圖5B)、LightCycler Green(圖5C)或SYBR Green I(圖5D)用于單鏈和雙鏈產(chǎn)物之間解鏈轉(zhuǎn)變的熒光監(jiān)測(cè)。顯示了由兩種純合子和三種雜合子基因型獲得的結(jié)果。
不同基因型的雙鏈穩(wěn)定性遵循理論計(jì)算(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；471956-61)，其中F508del～I(xiàn)507del＜野生型＜F508C。除了F508del和I507del，基因型通過它們主要轉(zhuǎn)變的Tm值是可以區(qū)分的。在LightCycler上解鏈時(shí)，10次重復(fù)野生型樣品的Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.12℃。在高分辨率裝置上解鏈時(shí)，相同10個(gè)樣品的Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.04℃。
當(dāng)雜合子樣品通過PCR擴(kuò)增時(shí)，預(yù)期兩種同源雙鏈分子和兩種異源雙鏈分子(Nataraj AJ等，Electrophoresis 1999；201177-85)。然而，當(dāng)SYBR Green I用作熒光指示劑時(shí)，對(duì)于每種基因型只能看見單一的解鏈峰(圖5D)。相反，當(dāng)在相同條件下使用標(biāo)記引物或LightCycler Green時(shí)，出現(xiàn)了兩個(gè)明顯定義的峰(圖5B和5C)。低溫峰總是小于高溫的峰，大概表示一種或全部?jī)煞N異源雙鏈分子產(chǎn)物的解鏈轉(zhuǎn)變。正像可能預(yù)期的，3bp缺失的雜合子(F508del和I507del)導(dǎo)致了比單堿基改變(F508C)的異源雙鏈分子峰更不穩(wěn)定的異源雙鏈分子峰。F508C雜合子的主要的峰位于比野生型更高的溫度，這反映了T到G轉(zhuǎn)換的更高穩(wěn)定性(Gundry CN等，Genetic Testing，1999；3365-70)。
實(shí)施例6采用LC Green的突變掃描研究了HTR2A的單核苷酸多態(tài)性。按照對(duì)囊腫性纖維化位點(diǎn)的描述用KlenTaq、TaqStart和Tris進(jìn)行PCR。羥色胺受體2A(HTR2A)基因的331bp片段包括了外顯子1內(nèi)部的共有多態(tài)性(T102C)(Lipsky RH等，Clin Chem 2001；47635-44)。反應(yīng)在95℃不保持、62℃保持2秒以及74℃保持20秒之間循環(huán)40次。獲得了高分辨率解鏈曲線。
圖6表明，LightCycler Green可被用于對(duì)序列變異的掃描。就是說不需要知道序列變異的位置。任何變異的存在可以在一個(gè)大的擴(kuò)增子內(nèi)部進(jìn)行檢測(cè)。如圖6所示，HTR2A基因中的所有三個(gè)單核苷酸多態(tài)性基因型(純合子T、純合子C和雜合子T/C)可以在331bp的擴(kuò)增子內(nèi)進(jìn)行區(qū)分。解鏈曲線的精確度和區(qū)分不同基因型的能力取決于裝置的溫度和熒光分辨率。
實(shí)施例7DNA大小標(biāo)記的解鏈曲線分析SYBR Green I與LightCycler Green的比較100納克含有6種不同種類雙鏈DNA的DNA大小標(biāo)記(低分子量DNA標(biāo)記，Gibco BRL)在3mM MgCl2、100mM 2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇，pH 8.7的緩沖液中與SYBR Green I(1∶10,000)或LightCycler Green(10μM)混合。以0.1℃/秒的速度在高分辨率裝置上獲得解鏈曲線。
如上所述，與SYBR Green I不同，LightCycler Green能夠以與PCR相容的濃度在解鏈曲線轉(zhuǎn)變中鑒別異源雙鏈分子。圖7中說明了為什么SYBRGreen I不能簡(jiǎn)便地鑒別低解鏈轉(zhuǎn)變的一個(gè)原因。在幾種穩(wěn)定性遞增的DNA片段存在的情況下，與LightCycler Green相比，采用SYBR Green I的低溫峰非常小。一個(gè)解釋是在解鏈過程中，SYBR Green I可能從低溫雙鏈分子上被釋放，只與在更高溫度下解鏈的雙鏈分子結(jié)合。這引起每個(gè)后繼的峰比前一個(gè)更高，使的最低溫度的峰即便能觀察到也非常小。以高得多的飽和水平存在的LightCycler Green對(duì)于甚至低溫雙鏈分子具有可見的峰。雖然本實(shí)施例中LCGreen以接近飽和水平存在時(shí)，令人驚訝的是，當(dāng)稀釋到5-20％的飽和水平時(shí)，LC Green可以檢測(cè)低溫峰。例如，圖13所表示的數(shù)據(jù)是通過使用1μM濃度的LC Green獲得的。因而，雖然還不理解其機(jī)制，LC Green和本發(fā)明的多種其他飽和染料在解鏈過程中看來沒有重新分布。
如果測(cè)定圖7中每個(gè)峰的面積并除以每種DNA的已知數(shù)量，可以估算對(duì)于每種DNA的相對(duì)靈敏度(圖8)。如圖8所示，采用LightCycler Green有利于低溫解鏈峰，而采用SYBR Green I時(shí)，在高溫下觀察到信號(hào)的顯著增強(qiáng)。
實(shí)施例8通用雙鏈DNA染料的滴定曲線以及PCR中LightCycler Green可用濃度區(qū)間的測(cè)定100納克低分子量DNA標(biāo)記與不同濃度的通用雙鏈DNA染料在終體積10微升的含3mM MgCl2、50mM Tris，pH 8.3、250微克/毫升BSA和每種dNTP各200μM的溶液中混合。樣品轉(zhuǎn)移到LightCycler管并在實(shí)時(shí)熒光計(jì)上測(cè)量40℃的熒光。用每種特定染料所獲得的最大熒光值對(duì)熒光進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。
使用152bp的HTR2A擴(kuò)增子在終體積10微升的含3mM Mg2+，50mMTris-HCl，pH 8.3，500微克/毫升BSA，每種dNTP各200μM，每種引物各0.5μM，50納克基因組DNA，0.4單位Taq聚合酶以及88納克TaqStart抗體的溶液中，用稀釋度位于2μM到100μM區(qū)間之內(nèi)的LC Green進(jìn)行稀釋研究。95℃ 10秒的初始變性之后，以95℃ 0秒、62℃ 2秒、以及72℃ 20秒循環(huán)40次。在LightCycler上附加的溫度條件作用(95℃ 0秒，55℃ 0秒)以后，樣品以0.3℃/秒的斜率在高分辨率裝置上進(jìn)行解鏈。
圖9A-B表示了與PCR相容的SYBR Green I和LC Green的濃度。在與PCR相容的濃度下，SYBR Green I遠(yuǎn)未使PCR末期通常存在的DNA量飽和。相反，LightCycler Green可以在包括使之飽和的廣泛的濃度區(qū)間上使用。圖10中顯示了LightCycler Green濃度的相差50倍的區(qū)間上的典型的解鏈曲線。
實(shí)施例9SYBR Green I和LightCycler Green的熒光光譜與DNA結(jié)合的SYBR Green I和LightCycler Green的激發(fā)和發(fā)射光譜在Photon Technology公司的熒光計(jì)(FL-1)上測(cè)量。在含100納克DNA(低分子量DNA標(biāo)記)的終體積60微升的3mM MgCl2，50mM Tris，pH 8.3，250微克/毫升BSA和每種dNTP各200μM的溶液中添加LightCycler Green(10μM)或SYBR Green I(1∶10,000)。
LightCycler光學(xué)器件與SYBR Green I激發(fā)與發(fā)射良好匹配(圖11)。即便LightCycler Green與LightCycler光學(xué)器件匹配不良，在LightCycler上用有些PCR相容濃度的LightCycler Green觀察到的熒光信號(hào)比通常從SYBR Green I觀察到的信號(hào)更強(qiáng)(數(shù)據(jù)未公開)。
實(shí)施例10使用X軸調(diào)整和熒光差異分析的β-球蛋白的基因分型從11號(hào)染色體(登錄號(hào)NG 000007)的人β-球蛋白區(qū)域擴(kuò)增110bp的片段。這一110bp片段包括了常見的β-球蛋白突變HbS和HbC的位點(diǎn)。DNA從每種常見基因型的4個(gè)不同個(gè)體的干血斑中提取。這些基因型包括了3個(gè)純合子(AA、SS和CC)和3個(gè)雜合子(AS、AC和SC)類型。正向引物和反向引物分別是ACACAACTGTGTTCACTAGC(SEQ ID NO3)和CAACTTCATCCACGTTCACC(SEQ ID NO4)。每10微升反應(yīng)體系包含了50納克基因組DNA、各0.5μM每種引物、10μM LC Green、3mM MgCl2、50mMTris，pH 8.3、500微克/毫升BSA、每種dNTP各0.2mM、0.04單位/微升KlentaqTM(AB Peptides，St.Louis，MO)、88納克TaqStartTM抗體(CloneTech，Palo Alto，CA)。PCR反應(yīng)條件如下循環(huán)前95℃ 5秒變性；94℃ 0秒、50℃ 2秒、72℃ 2秒循環(huán)35次，斜率為每秒2℃。對(duì)每個(gè)樣品在延伸2秒后獲得單一的熒光值。PCR擴(kuò)增之后，樣品以-20℃的設(shè)定速度冷卻。緊接著快速冷卻后，在定制的16比特高分辨率解鏈裝置上以0.30℃/秒的速度從70℃到93℃進(jìn)行解鏈，同時(shí)連續(xù)獲得熒光讀數(shù)。
隨著樣品溫度提高，通過測(cè)量熒光獲得高分辨率解鏈曲線數(shù)據(jù)。圖12A中顯示了從β-球蛋白6種基因型的一式四份樣品獲得的原始數(shù)據(jù)。注意由于樣品體積差異和毛細(xì)管光學(xué)器件變動(dòng)引起的不同樣品之間熒光值的量是變動(dòng)的。
樣品之間量級(jí)差異可以通過使用主要轉(zhuǎn)變之前和之后每條曲線的線性基線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。具體地說，選擇兩個(gè)線性區(qū)域，其中一個(gè)在主要轉(zhuǎn)變之前，一個(gè)在這之后。這些區(qū)域?yàn)槊織l曲線定義兩條直線，上面的100％的熒光直線和下面的0％的熒光直線。轉(zhuǎn)變過程中(這兩個(gè)區(qū)域之間)每個(gè)溫度下的熒光百分?jǐn)?shù)以推斷的上面的和下面的直線之間的距離百分?jǐn)?shù)來計(jì)算。圖12B中顯示了β-球蛋白數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。每種基因型的一式四份樣品明顯聚合在一起，最明顯的是在84-85℃附近。每種基因型內(nèi)部仍有一些對(duì)于運(yùn)行中間的溫度偏差而言(注意在10-20％熒光值附近在基因型內(nèi)部一式四份樣品之間有約0.2℃的離散范圍)是次要的偏差。這一樣品偏差可以在兩個(gè)不同樣品之間或甚至在相同樣品的兩次不同運(yùn)行之間發(fā)生。不同制劑，包括不同鹽濃度的制劑，也可以引起溫度偏差。然而，對(duì)于至少最初的近似，這些差異不影響曲線的形狀。
運(yùn)行之間的溫度偏差可以通過移動(dòng)每條曲線的溫度軸進(jìn)行校正，這樣它們?cè)谝粋€(gè)給定的熒光區(qū)間上重疊。例如，選擇一個(gè)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，并將熒光區(qū)間內(nèi)的點(diǎn)對(duì)一個(gè)二次方程進(jìn)行擬合。對(duì)每條剩余的曲線，計(jì)算為了將所述熒光區(qū)間內(nèi)的每個(gè)點(diǎn)轉(zhuǎn)化到所述二次方程上所需要的溫度移動(dòng)值。然后每條曲線以平均移動(dòng)值平移使所述曲線在選定的熒光區(qū)間內(nèi)重疊。雜合子擴(kuò)增產(chǎn)生異源雙鏈分子的低溫解鏈轉(zhuǎn)變以及同源雙鏈分子的高溫解鏈轉(zhuǎn)變。如圖12C中所看到的，如果移動(dòng)曲線以將其高溫同源雙鏈分子區(qū)域(低熒光百分?jǐn)?shù))重疊，異源雙鏈分子可以通過其在更低溫度下的早期下降得以鑒別。然而，由于不同的同源雙鏈分子的曲線形狀沒有很大變化，不同同源雙鏈分子的溫度移動(dòng)可能掩蓋它們之間的任何差異。
最后，通過將標(biāo)準(zhǔn)化的(以及非強(qiáng)制地溫度移動(dòng)的)解鏈曲線之間的熒光差異作圖最易于觀察到不同的基因型。先選擇一種標(biāo)準(zhǔn)基因型(例如，使用β-球蛋白野生型AA)。隨后如圖12D所示，將每條曲線與標(biāo)準(zhǔn)之間的差異對(duì)溫度作圖。標(biāo)準(zhǔn)基因型在所有溫度下是0(減去了其本身)。其他基因型遵循獨(dú)特的路線并能通過視覺模式匹配進(jìn)行鑒別。特征提取的自動(dòng)化方法也可以用于確定基因型。此外，雖然說明性的實(shí)施例使用了飽和染料和異源雙鏈分子檢測(cè)，需要理解到，溫度移動(dòng)和溫度差異作圖可以用于不存在異源雙鏈分子情況下的基因分型，例如可以用于其中基因組是單倍體的病毒基因分型。這樣的高分辨率基因分型的例子包括丙型肝炎基因分型、人乳頭瘤病毒基因分型、HIV基因分型以及通過核糖體DNA擴(kuò)增的細(xì)菌鑒定。
可以設(shè)計(jì)與基因型相關(guān)聯(lián)的單一參數(shù)。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)化的曲線以確定不同基因型比如10％解鏈的(90％熒光值)溫度。這樣顯著區(qū)分了一些基因型，但不能顯著區(qū)分其他基因型(圖12B)。另外，可以使用曲線的最大斜率以區(qū)分純合子與雜合子，但在最大斜率下不同的純合子經(jīng)常是相似的。最后，可以使用不同曲線下的面積(圖12D)以定義基因型，但是這樣的曲線可以具有相似的面積卻遵循不同的路線。雖然參數(shù)的組合可能證實(shí)對(duì)于自動(dòng)化基因分型確定是有效的，這一技術(shù)非常適合于視覺模式匹配。
需要理解到，其他的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)是可以利用的并且包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，HR-1(Idaho Technology，Salt Lake City，UT)具有能夠在事先確定的溫度下自動(dòng)調(diào)整熒光值的設(shè)置(例如40℃時(shí)為100的熒光值)，并且所有樣品的解鏈曲線能根據(jù)相同的熒光值對(duì)齊排列。上述的標(biāo)準(zhǔn)化與這一機(jī)器控制的標(biāo)準(zhǔn)化之間的差異在于使用機(jī)器控制的標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，轉(zhuǎn)變前和轉(zhuǎn)變后曲線的斜率沒有被拉平。
實(shí)施例11較大的擴(kuò)增子的分析雖然短的擴(kuò)增子通常導(dǎo)致更大的基因分型差異，LightCycler Green也可以用于更大的擴(kuò)增子的基因分型。DNA解鏈結(jié)構(gòu)域通常長(zhǎng)度約50-500bp，更大的擴(kuò)增子，例如500-800bp的擴(kuò)增子，具有多個(gè)解鏈結(jié)構(gòu)域。一個(gè)結(jié)構(gòu)域中的序列改變可能不影響其他結(jié)構(gòu)域的解鏈，并且一個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)部觀察到的變異可以獨(dú)立于擴(kuò)增子長(zhǎng)度。因而，雖然提供了400-650bp區(qū)間內(nèi)的例子，對(duì)于能用于掃描存在序列變更的PCR產(chǎn)物的大小可以沒有上限。
而且，因?yàn)橐粋€(gè)結(jié)構(gòu)域的解鏈看來是獨(dú)立于其他結(jié)構(gòu)域的接連的，一個(gè)固定的結(jié)構(gòu)域可以用作內(nèi)參照以調(diào)整X軸(溫度軸)由于裝置或樣品運(yùn)行的變化。由于解鏈曲線形狀的不同，雜合子相互之間及其與純合子之間是可以區(qū)分的。解鏈曲線的形狀由存在的異源雙鏈分子和同源雙鏈分子的穩(wěn)定性和/或動(dòng)力學(xué)解鏈速度定義。由于在更大的擴(kuò)增子中存在多個(gè)解鏈結(jié)構(gòu)域，形狀上的改變可以發(fā)生在曲線的任何部分。通過調(diào)整多條曲線的X軸定位以使曲線的固定部分重疊，更易于辨別曲線的變化部分。另外，通過重疊曲線的變化部分，如果存在多種基因型，曲線的其余部分會(huì)有所不同。X軸調(diào)整另外可以通過在PCR之前或解鏈之前向每個(gè)樣品添加(1)外參照核酸，或(2)具有第二個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)的染料，該染料不與核酸相互作用但其熒光依賴于溫度(如Cy5的具有良好溫度系數(shù)的染料)進(jìn)行。溫度軸移動(dòng)應(yīng)當(dāng)隨后按照所述對(duì)照核酸的解鏈轉(zhuǎn)變的位置或按照所述對(duì)照染料的強(qiáng)度曲線進(jìn)行。
圖13A和14舉了兩個(gè)分析更大的擴(kuò)增子的例子。圖13A顯示了人5-羥色胺受體2A(HTR2A)基因外顯子2(登錄號(hào)NM 000621.1)544bp片段的擴(kuò)增。正向引物和反向引物分別是CCAGCTCCGGGAGA(SEQ ID NO5)和CATACAGGATGGTTAACATGG(SEQ ID NO6)。每10微升反應(yīng)體系包含50納克基因組DNA、每種引物各0.5μM、1μM LC Green、2mM MgCl2、50mM Tris，pH 8.3、500微克/毫升BSA、每種dNTP各0.2mM、0.4單位KlentaqTM(ABPeptides，St.Louis，MO)以及88納克TaqStartTM抗體(CloneTech，Palo Alto，CA)。
PCR反應(yīng)條件如下92℃ 0秒、60℃ 2秒、74℃ 25秒循環(huán)40次。PCR擴(kuò)增之后，樣品以-20℃/秒的設(shè)定速度冷卻。緊隨著快速冷卻，在定制的16比特高分辨率解鏈裝置上以0.30℃/秒的速度從70℃到93℃進(jìn)行解鏈，同時(shí)連續(xù)獲得熒光。
如圖13A所示，擴(kuò)增并分析每種基因型(CC、TC、和TT)一式兩份樣品。除了曲線在10和20％之間重疊以外，對(duì)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理與溫度移動(dòng)如實(shí)施例10所述進(jìn)行。圖13B表示同源雙鏈分子的預(yù)測(cè)解鏈圖和在較低溫度解鏈結(jié)構(gòu)域中的多態(tài)性位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了兩個(gè)表觀解鏈結(jié)構(gòu)域。所有基因型在較高溫度解鏈結(jié)構(gòu)域中是類似的。基因型在較低溫度解鏈結(jié)構(gòu)域中存在差異，其中雜合子表現(xiàn)出低溫解鏈異源雙鏈分子的典型行為，表現(xiàn)為雜合子曲線與低溫解鏈純合子曲線交叉，并隨著溫度升高接近于更高溫度的純合子。
圖14表示囊腫性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控子(CFTR)基因外顯子10(登錄號(hào)M55115)612bp片段擴(kuò)增的差異曲線。正向引物和反向引物分別是AGAATATACACTTCTGCTTAG(SEQ ID NO7)和TATCACTATATGCATGC(SEQ ID NO8)。每10微升反應(yīng)體系包含50納克基因組DNA、每種引物各0.5μM、10μM LC Green、3mM MgCl2、50mM Tris，pH 8.3、500微克/毫升BSA、每種dNTP各0.2mM、0.4單位KlentaqTM(AB Peptides，St.Louis，MO)以及88納克TaqStartTM抗體(CloneTech，Palo Alto，CA)。PCR反應(yīng)條件如下89℃ 0秒、58℃ 8秒、74℃ 35秒循環(huán)35次。對(duì)每個(gè)樣品在35秒延伸之后取得單一熒光值。PCR擴(kuò)增之后，樣品以-20℃/秒的設(shè)定速度冷卻。緊隨著快速冷卻，在定制的16比特高分辨率解鏈裝置上以0.30℃/秒的速度從60℃到87℃進(jìn)行解鏈，同時(shí)連續(xù)獲得熒光。在這個(gè)例子中，當(dāng)曲線的中間部分(30-40％熒光)用于X軸調(diào)整時(shí)，雜合子區(qū)分效果最好。最后，從野生型曲線中的一條上減去每條曲線的熒光得到了如圖14所示的差異圖。每種序列改變與野生型明顯不同并能區(qū)分所有基因型。
實(shí)施例12采用LightCycler Green的目標(biāo)檢測(cè)和多路技術(shù)LightCycler Green可以用作供體以激發(fā)與寡核苷酸探針相連的受體染料。由于LightCycler Green可以以達(dá)到或接近飽和的濃度用于高密度結(jié)合雜交探針(每3個(gè)堿基對(duì)約2個(gè)染料分子)，貫穿雙鏈DNA全長(zhǎng)的染料可以用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在PCR之前在反應(yīng)體系中添加具有受體染料的探針，擴(kuò)增并在與產(chǎn)物雜交的情況下進(jìn)行檢測(cè)。LightCycler Green以高密度與雙鏈分子的結(jié)合促進(jìn)了對(duì)探針上受體染料的激發(fā)，這產(chǎn)生了高強(qiáng)度的受體熒光。以前，使用了具有高bp/染料比的染料并只產(chǎn)生了低水平的受體熒光。
采用多種探針可以進(jìn)行多色實(shí)驗(yàn)。例如，整個(gè)擴(kuò)增子解鏈可以在470納米處監(jiān)測(cè)，熒光素標(biāo)記探針的發(fā)射光可以在515納米處監(jiān)測(cè)，HEX標(biāo)記探針(與引物內(nèi)的不同DNA片段雜交)在第三個(gè)波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)，TET標(biāo)記探針(與引物內(nèi)另一個(gè)不同的DNA片段雜交)在第四個(gè)波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)。正如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，色彩補(bǔ)償用以對(duì)重疊的四種信號(hào)去卷積。結(jié)果是第一種信號(hào)可用于對(duì)整個(gè)擴(kuò)增子的突變掃描，而第二、第三和第四種信號(hào)使擴(kuò)增子內(nèi)部更小區(qū)域的基因分型成為可能。
實(shí)施例13其他雙鏈DNA結(jié)合染料表1總結(jié)了37種不同染料的性質(zhì)和特征。在對(duì)雜合子ΔF508基因型進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，12種檢測(cè)的染料不產(chǎn)生異源雙鏈分子峰(無效的)。使用37種不同染料中的25種檢測(cè)到了異源雙鏈分子峰(有效的)。當(dāng)使用LightCycler Green時(shí)，產(chǎn)生了最強(qiáng)的異源雙鏈分子信號(hào)，使用其他幾種染料也表現(xiàn)出良好的異源雙鏈分子信號(hào)。大部分顯示異源雙鏈分子的染料在飽和或接近飽和濃度時(shí)與PCR相容。這一相關(guān)性允許對(duì)能通過解鏈曲線分析檢測(cè)異源雙鏈分子的染料進(jìn)行合理預(yù)測(cè)。50％飽和度提供了對(duì)異源雙鏈分子的合理預(yù)測(cè)。雖然錯(cuò)過了一些有效的染料，約80％、90％或甚至99％的飽和度百分比可用于鑒別能檢測(cè)異源雙鏈分子的染料。
同時(shí)，許多有效的非對(duì)稱花青染料在50％飽和度時(shí)具有低的bp/染料比，特別是低于4.0bp/染料以及更特殊地低于2.0bp/染料。最初認(rèn)為，由于這一低bp/染料比，在解鏈的早期階段防止了或最小化了重新分布，并且這樣異源雙鏈分子更易于檢測(cè)。然而，如表1所示，已經(jīng)發(fā)祥有些染料即便具有足夠高的bp/染料比，仍能檢測(cè)異源雙鏈分子。而且，具有低bp/染料比的染料即便在充分低于飽和水平的濃度下仍能檢測(cè)異源雙鏈分子。因而，低bp/染料比在鑒別對(duì)于異源雙鏈分子形成適當(dāng)?shù)娜玖蠒r(shí)只是一個(gè)因素。
優(yōu)選地，當(dāng)摩爾消光系數(shù)高時(shí)(＞30,000)，熒光更強(qiáng)。最好的兩種染料(在異源雙鏈分子檢測(cè)方面)表現(xiàn)出在430-455納米處的最大激發(fā)波長(zhǎng)以及450-480納米處的最大發(fā)射波長(zhǎng)。通常，這些是比在典型的實(shí)時(shí)裝置的熒光素通道中通常使用的波長(zhǎng)更短的波長(zhǎng)。即便如此，來自LightCycler Green的熒光信號(hào)比得自SYBR Green I的信號(hào)更強(qiáng)，考慮到SYBR Green I具有與使用的濾光器好得多的波長(zhǎng)匹配，這一發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的(圖11)。
表1


1.按照生產(chǎn)商數(shù)據(jù)的摩爾消光系數(shù)2.由生產(chǎn)商提供的，或是(上標(biāo)a)在PCR緩沖液(3mM MgCl2，50mM Tris，pH 8.3，每種dNTP各200μM，500微克/毫升BSA)中使用2.5μM bp(100納克/60微升)雙鏈DNA和最大PCR相容濃度的染料在熒光計(jì)上獲得的熒光光譜。Ex＝最大激發(fā)波長(zhǎng)；Em＝最大發(fā)射波長(zhǎng)。
3.能存在于PCR混合液中不對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生明顯抑制的染料的最大濃度。有些染料濃度表示為對(duì)生產(chǎn)商提供的材料的稀釋倍數(shù)(上標(biāo)b)。
4.均在15μM bp DNA(100納克雙鏈DNA/10微升)和PCR緩沖液存在的條件下，最大PCR相容染料濃度時(shí)熒光百分比與相同染料在飽和濃度時(shí)的(也就是提供可能的最高熒光強(qiáng)度的濃度)熒光的比較。
5.在存在15μM bp DNA的條件下，產(chǎn)生50％可獲得的最大熒光強(qiáng)度(即飽和時(shí)的強(qiáng)度)所需要的染料濃度或bp/染料比。
6.使用以0.3℃/秒加熱斜率獲得的實(shí)施例5的del F508雜合子的44bp擴(kuò)增子的解鏈曲線，在HR-1高分辨率裝置上用450-490納米激發(fā)和510-530納米檢測(cè)光學(xué)器件測(cè)量的異源雙鏈分子特征峰的峰面積百分比。
實(shí)施例14基于嘧啶基的DNA結(jié)合染料的制備和使用制備了具有以下嘧啶基核心結(jié)構(gòu)的染料的某些實(shí)施方式 其中 X、R2、R3、和R5按這里對(duì)結(jié)構(gòu)式I所作的定義，B如結(jié)構(gòu)式V中所作的定義。
雖然存在多種制備具有這一結(jié)構(gòu)式的染料的方法，一種方法如下 其中化合物6有商業(yè)現(xiàn)貨，或可以通過常規(guī)方法制備?；衔?a通過在中性或堿性條件下，包括烷基鋰、芳香族和脂肪族胺、K2CO3等，使用如烷基鹵化物、烷基硫酸鹽等的烷基化試劑在N(3)位置上對(duì)化合物6烷基化進(jìn)行制備。類似地，化合物7a通過由如銅、鈀、鉑等金屬化合物及其他催化劑催化的芳族鹵化物、硼酸鹽等的芳香族偶聯(lián)反應(yīng)在N(3)位置上對(duì)化合物6芳基化進(jìn)行制備?；衔?b通過比如使用過氧化氫、包括m-CPBA的過氧酸等的常規(guī)氧化反應(yīng)從化合物7a進(jìn)行制備。在有些情況下，化合物7a和化合物7b有商業(yè)現(xiàn)貨?；衔?有商業(yè)現(xiàn)貨，或是通過如這里所述的N(1)位置上的烷基化或芳基化等常規(guī)方法進(jìn)行制備。另外，化合物8通過適當(dāng)取代的1，3-二酮和尿素或硫脲的聚合進(jìn)行制備。進(jìn)一步，在C(2)位上具有如這里所定義的并包括鹵化物、烷基磺?；?、芳基磺?；入x去基團(tuán)的化合物8可以通過在中性或堿性條件下在C(2)位引入如基于氮、氧和硫的親核試劑的親核試劑進(jìn)行修飾。進(jìn)一步，在C(2)位具有氧或硫的親核基團(tuán)的化合物8可以通過在中性或堿性條件下在C(2)羥基或巰基上引入烷化物或酰化物進(jìn)行修飾?；衔?通過如這里所述的化合物7和化合物8在中性或堿性條件下反應(yīng)進(jìn)行制備。
具有所述結(jié)構(gòu)式的示例性化合物如這里所述進(jìn)行制備，采用三乙胺-醋酸銨作為流動(dòng)相通過HPLC進(jìn)行純化，以其相應(yīng)的醋酸鹽的形式進(jìn)行分離。這些示例性化合物在表2中加以說明。
表2 化合物D6通過首先在乙腈回流條件下4-甲基嘧啶與(3-溴丙基)三甲銨溴反應(yīng)；所得的乙腈中的產(chǎn)物(化合物A6)與3-甲基-2-甲磺?；讲⑧邕蝙拥饣?Aldrich)在存在無水吡啶和三乙胺條件下在氬氣中回流反應(yīng)進(jìn)行制備。
化合物E6按照用于從3-甲基-2-甲磺?；讲Ⅹ冗蝙拥饣?通過2-甲磺酰基苯并噻唑與二甲基硫酸鹽反應(yīng)進(jìn)行制備)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物G5按照用于從2-甲硫基-3-苯基苯并噻唑碘化物(Aldrich)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物H5按照用于從5-二氟甲磺?；?3-甲基-2-甲硫苯并噻唑甲基硫酸酯(通過5-二氟甲磺酰基-2-甲硫苯并噻唑(Aldrich)與二甲基硫酸鹽反應(yīng)進(jìn)行制備)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物P6按照用于從5-氯-2-(甲硫基)-3-(3-磺丙基)-苯并噻唑氫氧化物(Aldrich)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物R6按照用于從6-氨基-3-甲基-2-甲硫苯并噻唑甲基硫酸酯(通過6-氨基-2-甲硫苯并噻唑(Aldrich)與二甲基硫酸鹽反應(yīng)進(jìn)行制備)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物Y6按照用于從3-甲基-2-甲磺?；敛1，2-d]唑甲基硫酸酯(通過2-甲磺酰基萘并[1，2-d]唑(Chem Bridge Product List，San Diego，CA)與二甲基硫酸鹽反應(yīng)進(jìn)行制備)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物Z6按照用于從3-甲基-2-甲磺?；敛1，2-d]噻唑甲基硫酸酯(通過2-甲磺酰基萘并[1，2-d]噻唑(Specs、Rijswijk，The Netherlands)與二甲基硫酸鹽反應(yīng)進(jìn)行制備)和化合物A6制備化合物D6的通用步驟進(jìn)行制備。
化合物D8通過在HCl/乙醇中回流加熱N-苯基硫脲和2，4-戊二酮溶液進(jìn)行制備。獲得的嘧啶硫酮與3-甲基-2-甲磺?；讲⑧邕蝙拥饣镌诖嬖谌野返臈l件下在氯仿/甲醇(10∶1)中回流過夜反應(yīng)以生成化合物D8進(jìn)行制備。
化合物I5、K5、L5、G8、K8、L8、18、M8、N8、C8、E8、F7和O8可以通過上述相似的方法進(jìn)行制備。這些染料預(yù)計(jì)能用于檢測(cè)異源雙鏈分子。
這里所述的基于嘧啶的花青染料，例如G5、H5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6和D8，是新染料并可用于異源雙鏈分子的檢測(cè)、突變掃描及基因分型。表3總結(jié)了在異源雙鏈分子檢測(cè)中使用這些染料的結(jié)果。需要注意到，對(duì)于LC Green來說表3中異源雙鏈分子百分比比表1中高。這一差異可能是由于獲得表3中的數(shù)據(jù)時(shí)使用了更大的擴(kuò)增子。
表3

1.在PCR緩沖液中(3mM MgCl2，50mM Tris，pH 8.3，每種dNTP各200μM，500微克/毫升BSA)使用2.5μM bp(100納克/60微升)雙鏈DNA和最大PCR相容濃度的染料在熒光計(jì)上獲得的最大激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(Em)。有些染料由于發(fā)射或激發(fā)波長(zhǎng)峰較寬，具有波長(zhǎng)一個(gè)區(qū)間。
2.都在存在15μM bp DNA(100納克雙鏈DNA/10微升)和PCR緩沖液的條件下，能存在于PCR混合液中不對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生明顯抑制的染料的最大濃度，以與飽和濃度(即提供可能的最大熒光強(qiáng)度的濃度)的相同染料的熒光相比的熒光百分比表示。
3.使用以0.3℃/秒加熱斜率獲得的del F508雜合子解鏈曲線，用420-490納米激發(fā)和450-530納米檢測(cè)光學(xué)器件測(cè)量的異源雙鏈分子特征峰的峰面積百分比。本組實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增子長(zhǎng)度為57bp，通過引物GGCACCATTAAAGAAAATAT(SEQ ID NO23)和TCTGTATCTATATTCATCATAGG(SEQ ID NO24)產(chǎn)生。記錄了最大百分比。
實(shí)施例15用于基因型比較的高分辨率解鏈曲線分析本發(fā)明的染料可以用于確定任意兩個(gè)個(gè)體在一個(gè)基因片段上是否共有相同的等位基因。在以前的例子中，一個(gè)參照樣品的基因型(包括確切的等位基因、雜合性以及單體型)是已知的。在有些應(yīng)用中，不需要知道參照樣品的確切基因型，只要高分辨率解鏈曲線分析能確定另一個(gè)個(gè)體的(或未知來源的)樣品是否與參照相同。一個(gè)說明性的例子是家族成員中共有的HLA等位基因的鑒別。
人白細(xì)胞抗原(HLA)是白血球細(xì)胞和機(jī)體其他組織的細(xì)胞表面蛋白，在免疫識(shí)別以及移植耐受或排斥中起關(guān)鍵作用。對(duì)于器官移植來說，供體和受體之間的HLA等位基因配對(duì)是重要的。HLA蛋白形成兩個(gè)主要類別I類和II類。每個(gè)類別有多個(gè)基因編碼。目前公認(rèn)的用于確定組織的HLA等位型的技術(shù)包括用特異性抗體試劑的血清分型、與核酸探針的雜交以及HLA基因的直接測(cè)序。由于需要檢測(cè)大量基因和位點(diǎn)，測(cè)定HLA等位型的成本超過了每人1,000美元。當(dāng)供體與受體無關(guān)時(shí)，HLA的完全基因分型是必需的。然而，在同胞之間有約25％HLA完全匹配的機(jī)會(huì)，因此當(dāng)HLA匹配說明其可行時(shí)，優(yōu)選同胞之間的器官移植。在這種情況下，只需要證明供體與受體親屬共有相同的HLA等位基因。沒有必要測(cè)定所述共有的等位基因的嚴(yán)格一致性。
CEPH/家系猶他家族1331的基因組DNA樣品得自Coriell研究所。在這一家族中有3代17人，包括4個(gè)祖父母、兩個(gè)父母及11個(gè)子女(圖15顯示了家族1331的家系圖)。具有熟知的純合子基因型HLA-A BM15(0101)和BM16(0202)的兩個(gè)其他樣品也得自Coriell。
HLA-A的兩個(gè)外顯子的擴(kuò)增如下進(jìn)行I類HLA基因在其編碼外顯子的全長(zhǎng)上如此相似，以致難以設(shè)計(jì)僅擴(kuò)增HLA-A基因而不擴(kuò)增相關(guān)的I類基因的PCR引物。采用了巢式PCR策略，其中第一輪PCR特異性擴(kuò)增HLA-A基因的一個(gè)大片段(948bp)，隨后用內(nèi)側(cè)引物對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。用于第一輪PCR的引物與HLA-A內(nèi)含子1(正向引物5′-GAAAC(C/G)GCCTCTG(C/T)GGGGAGAAGCAA(SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12))和內(nèi)含子4(反向引物5′-TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC(SEQ ID NO13))雜交。第二輪PCR中使用了正向引物5′AGCCGCGCC(G/T)GGAAGAGGGTCG(SEQ ID NO14，SEQ ID NO15)和反向引物5′GGCCGGGGTCACTCACCG(SEQ ID NO16)以擴(kuò)增HLA-A外顯子2的335bp片段。正向引物5′CCC(G/A)GGTTGGTCGGGGC(SEQ ID NO17，SEQ IDNO18)和反向引物5′ATCAG(G/T)GAGGCGCCCCGTG(SEQ ID NO19，SEQ ID NO20)用于擴(kuò)增HLA-A外顯子3的366bp片段。在本實(shí)施例的引物序列中，(N/N′)代表所述引物是在該位置具有相等百分比的N和N’的核苷酸序列的混合物。例如，如序列No 17和No 18所代表的，HLA-A外顯子2的335bp片段的正向引物在第4個(gè)位置上含兩種核苷酸(G或A)的相等混合物。HLA-A內(nèi)含子1的正向引物具有2個(gè)這樣的位點(diǎn)，因而是如序列9、10、11、12所代表的4種核苷酸的相等混合物。
所有PCR使用Roche LightCycler在玻璃毛細(xì)管中進(jìn)行。第一輪PCR在10微升體系中含0.5μM正向和反向引物、含50納克基因組DNA的緩沖液(3mM Mg++，50mMTris-HCl pH 8.3，500微克/毫升BSA和20μM的D6染料)。循環(huán)條件是94℃ 20秒，隨后94℃ 1秒、62℃ 0秒、72℃ 1分鐘循環(huán)40次。第二輪巢式PCR包含0.25μM正向和反向引物、在含2mM Mg++的相同緩沖液中1/10000的第一輪PCR產(chǎn)物。循環(huán)條件是94℃ 5秒，隨后94℃ 1秒、65℃ 0秒、72℃ 8秒循環(huán)25次。
第二次擴(kuò)增之后，玻璃毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到高分辨率解鏈裝置HR-1上，并進(jìn)行解鏈。樣品以0.3℃/秒的速度從60℃加熱到95℃并且每40秒獲得熒光(450納米激發(fā)波長(zhǎng)/470納米發(fā)射波長(zhǎng))和溫度測(cè)量值(圖16A-B)。巢式測(cè)序產(chǎn)物用ABI3700進(jìn)行測(cè)序。4.0版本的Sequencher用于序列分析。
解鏈曲線分析和測(cè)序結(jié)果的吻合程度如下測(cè)定從CEPH/家系猶他家族1331的17位成員擴(kuò)增的外顯子2和外顯子3PCR產(chǎn)物的解鏈曲線分析聚類成6個(gè)不同的組(圖16A-B)。這說明在這一家族中有6種不同的基因型。對(duì)外顯子2和外顯子3PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，并且結(jié)果證實(shí)了解鏈曲線分析，鑒別出的6種基因型是家族成員1、4、7、12的HLA-A 02011/3101(這里稱為基因型AB)；家族成員3、5、6、11、17的HLA-A 3101/2402101(基因型BC)；家族成員2、9、10、16的HLA-A02011/2402101(基因型AC)；家族成員13、14的HLA-A 02011/03011(基因型AD)；家族成員8的HLA-A 02011/02011(基因型AA)以及家族成員15的HLA-A2402101/01011(基因型CE)(圖16A-B顯示了外顯子2的結(jié)果)。
在有些情況下，來自同胞的擴(kuò)增產(chǎn)物雖然具有不同的基因型，可能表現(xiàn)出一致的或接近一致的解鏈曲線。在這種情況下，在第一輪PCR之前混合來自兩個(gè)同胞的基因組DNA，隨后進(jìn)行兩個(gè)擴(kuò)增步驟，并且解鏈曲線分析可以區(qū)分相同和不同的基因型。在特殊情況下，如果同胞具有相同的基因型，混合的解鏈曲線會(huì)與那些單獨(dú)進(jìn)行的相同。如果同胞具有不同的基因型，那么混合的解鏈曲線會(huì)與單獨(dú)的解鏈曲線不同。每組中的混合實(shí)驗(yàn)證實(shí)每組的成員共有相同的基因型。
用兩個(gè)純合子樣品BM15(0101)和BM16(0201)說明了混合分析技術(shù)的另一個(gè)例子。在這種情況下，所述兩個(gè)等位基因在HLA-A外顯子2的全長(zhǎng)上總共散布著15個(gè)核苷酸差異，但兩者表現(xiàn)出相似的解鏈曲線。由于在由HLA-A外顯子2混合樣品PCR產(chǎn)生的異源雜交分子上存在15個(gè)錯(cuò)配，混合樣品的解鏈曲線明顯左移(更低的解鏈溫度)(見圖17)。
實(shí)施例16使用飽和染料的擴(kuò)增實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)用分別的正向和反向引物ACCAGGCTCTACAGTAA(SEQ ID NO21)和GTTAAATGCATCAGAAG(SEQ ID NO 22)擴(kuò)增了HTR2A基因的60bp片段。除了對(duì)循環(huán)參數(shù)的改動(dòng)(使用LightCycler 95℃ 0秒、62℃ 2秒、74℃ 20秒)之外，使用實(shí)施例11中所述的試劑進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)混合物中各自獨(dú)立地存在不同濃度的SYBRGreen I，GelStar和SYTO 16。每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)獲得熒光數(shù)據(jù)，直至循環(huán)40次。獲得了如下以擴(kuò)增圖(X軸上繪制循環(huán)數(shù)相對(duì)Y軸上繪制熒光強(qiáng)度)的二級(jí)導(dǎo)數(shù)最大值計(jì)算的熒光交叉點(diǎn)(Cp)。
表4

當(dāng)反應(yīng)中存在的抑制劑影響擴(kuò)增效率的時(shí)候，代表其中信號(hào)高過本底的循環(huán)數(shù)的Cp值預(yù)計(jì)會(huì)提高。然而，在這些實(shí)驗(yàn)的條件下，被遞增量的染料的抑制導(dǎo)致的不是Cp值的逐步提高，而是擴(kuò)增的突然完全停止。由于擴(kuò)增子的大小較小(導(dǎo)致了與更大的擴(kuò)增子相比更小的信號(hào))，SYBR Green I染料只能在兩倍濃度區(qū)間中用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。相反，GelStar和SYTO 16可以在8倍濃度區(qū)間內(nèi)使用。預(yù)計(jì)許多飽和染料具有能用于擴(kuò)增實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的寬的濃度區(qū)間。
上述的討論公開并描述了僅僅是本發(fā)明的示例行實(shí)施方式。精通本領(lǐng)域的人員從這樣的討論以及伴隨的附圖和權(quán)利要求容易地認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)其進(jìn)行各種改變、改進(jìn)和變更而沒有離開如下面的權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范圍。
這里所引用的所有參考通過參考完整地結(jié)合在本說明書中。
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<210>5<211>14<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5ccagctccgg gaga14<210>6<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6catacaggat ggttaacatg g21<210>7<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7agaatataca cttctgctta g21<210>8<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>8tatcactata tgcatgc 17<210>9<211>26<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9gaaaccgcct ctgcggggag aagcaa 26<210>10<211>26<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10gaaacggcct ctgcggggag aagcaa 26<210>11<211>26
<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11gaaaccgcct ctgtggggag aagcaa 26<210>12<211>26<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12gaaacggcct ctgtggggag aagcaa 26<210>13<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>13tgttggtccc aattgtctcc cctc 24<210>14<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14agccgcgccg ggaagagggt cg 22<210>15<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15agccgcgcct ggaagagggt cg 22<210>16<211>18<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16ggccggggtc actcaccg18<210>17<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17
cccgggttgg tcggggc 17<210>18<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>18cccaggttgg tcggggc 17<210>19<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19atcagggagg cgccccgtg 19<210>20<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>20atcagtgagg cgccccgtg 19<210>21<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21accaggctct acagtaa 17<210>22<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>22gttaaatgca tcagaag 17<210>23<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>23ggcaccatta aagaaaatat 20<210>24
<211>23<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>24tctgtatcta tattcatcat agg 2權(quán)利要求
1.一種PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述混合物包括靶核酸PCR試劑為擴(kuò)增靶核酸設(shè)置的寡核苷酸引物，以及具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料。
2.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述雙鏈DNA結(jié)合染料具有至少80％的飽和百分比。
3.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述雙鏈DNA結(jié)合染料具有至少90％的飽和百分比。
4.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述雙鏈DNA結(jié)合染料具有至少99％的飽和百分比。
5.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料具有約410到460納米之間的最大激發(fā)波長(zhǎng)，以及450到500納米之間的最大發(fā)射波長(zhǎng)。
6.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料具有約430到460納米之間的最大激發(fā)波長(zhǎng)，以及460到490納米之間的最大發(fā)射波長(zhǎng)。
7.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料是一種能在解鏈溫度分析中檢測(cè)雜合子的花青染料。
8.如權(quán)利要求7所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述花青染料具有吡啶、嘧啶或喹啉的核心結(jié)構(gòu)。
9.如權(quán)利要求7所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述花青染料是具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物 其中 部分代表任選取代的稠合的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)或含氮的雜芳環(huán)；X是氧、硫、硒、碲或選自C(CH3)2和NR1的基團(tuán)，其中R1是氫或烷基；R2是烷基；t＝0或1；Z是選自0或1的電荷數(shù)；R3、R9和R10各自獨(dú)立選自氫和烷基；n＝0、1或2；以及Q是一個(gè)雜環(huán)，如吡啶、嘧啶、喹啉或嘌呤，其中每種可以被任選取代。
10.如權(quán)利要求7所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述花青染料是一種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物 其中 部分代表任選取代的稠合的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)或含氮的雜芳環(huán)；X是氧、硫、硒、碲或選自C(CH3)2和NR1的基團(tuán)，其中R1是氫或C1-6烷基；R2是烷基；t＝0或1；Z是選自0或1的電荷數(shù)；R3、R9和R10各自獨(dú)立選自氫和烷基；n＝0、1或2；以及R4、R5、R8、R11、R12、R13和R14按這里對(duì)結(jié)構(gòu)式I所作的描述，條件是R4是分子量小于約115的部分，或例如分子量小于約105。
11.如權(quán)利要求7所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述花青染料是LightCyclerGreen。
12.如權(quán)利要求7所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述花青染料是一種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物
13.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料選自以下物質(zhì)JO-PROTM-1、GelStar、SYTO44、SYTO45、POPOTM-3、SYTO12、TOTOTM-3、SYTO16、SYTOXBlue、Thiazole Orange、YOYO-3、SYTO43、SYTO11、SYTO13、SYTO15、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、SYTO23、SYTO20、BOBOTM-1、POPOTM-1、G5、H5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6和D8。
14.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料以PCR相容最大濃度的至少50％的濃度存在。
15.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料以PCR相容最大濃度的90-100％的濃度存在。
16.如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)混合物，其特征在于，所述染料以不高于PCR相容最大濃度的20％的濃度存在。
17.一種基因分型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟在具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料存在的條件下擴(kuò)增靶核酸，將擴(kuò)增的靶核酸解鏈以生成解鏈曲線，以及由解鏈曲線鑒別基因型。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述解鏈曲線通過使用具有450-490納米的激發(fā)波長(zhǎng)區(qū)間和510-530納米的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)區(qū)間的熒光計(jì)以及具有410-465納米最大激發(fā)波長(zhǎng)和450-500納米最大發(fā)射波長(zhǎng)的染料產(chǎn)生。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述染料的最大激發(fā)波長(zhǎng)位于430-460納米的區(qū)間內(nèi)，并最大發(fā)射波長(zhǎng)位于450-500納米的區(qū)間內(nèi)。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包含單核苷酸多態(tài)性，且鑒別步驟包括鑒別生成的異源雙鏈分子和同源雙鏈分子。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述解鏈步驟發(fā)生在擴(kuò)增之后。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述解鏈步驟在擴(kuò)增過程中發(fā)生。
23.一種突變掃描的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在含有靶核酸的樣品中添加具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料，(b)在存在所述雙鏈DNA結(jié)合染料的條件下擴(kuò)增靶核酸，(c)將擴(kuò)增的靶核酸解鏈以產(chǎn)生解鏈曲線，(d)在第二個(gè)樣品上重復(fù)步驟(b)和(c)以獲得第二條解鏈曲線，以及(e)比較所述解鏈曲線。
24.一種PCR分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟將具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料與含有靶核酸及為擴(kuò)增靶核酸而設(shè)置的引物的樣品混合，在存在所述雙鏈DNA結(jié)合染料的條件下擴(kuò)增靶核酸，以及監(jiān)測(cè)所述雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟生成針對(duì)靶核酸的解鏈曲線，對(duì)解鏈曲線的量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)至少一個(gè)另外的靶核酸重復(fù)混合、擴(kuò)增、曲線生成、標(biāo)準(zhǔn)化處理步驟，以及比較標(biāo)準(zhǔn)化解鏈曲線。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化曲線之間的溫度差異制圖的步驟。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過重疊每條曲線的一部分對(duì)解鏈曲線進(jìn)行溫度移動(dòng)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)溫度移動(dòng)曲線之間的溫度差異制圖的步驟。
29.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，其中所述染料選自下列物質(zhì)LC Green、Gel Star和SYTO16。
30.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，其中所述染料選自下列物質(zhì)PO-PROTM-1、JO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTO44、SYTO45、YO-PRO-1、POPOTM-3、SYTO12、TOTOTM-3、SYTOXBlue、Thiazole Orange、YOYO-3、SYTO43、SYTO11、SYTO13、SYTO15、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、SYTO23、TO-PRO-1、SYTO20、BOBOTM-1、POPOTM-1、G5、H5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6和D8。
31.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，在擴(kuò)增過程中對(duì)所述熒光進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
32.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，在擴(kuò)增后的解鏈曲線分析中對(duì)所述熒光進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
33.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述樣品還包括設(shè)置成與靶核酸雜交的探針，所述探針用受體染料標(biāo)記以接受來自雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，并且還包括監(jiān)測(cè)來自所述受體染料的熒光的步驟。
34.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述靶核酸不大于100bp。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述靶核酸不大于50bp并只包含一個(gè)單一的解鏈結(jié)構(gòu)域。
36.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包含一個(gè)可變的解鏈結(jié)構(gòu)域和一個(gè)固定的解鏈結(jié)構(gòu)域。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟生成針對(duì)所述靶核酸的解鏈曲線，對(duì)至少另外一條靶核酸重復(fù)所述混合、擴(kuò)增和曲線生成步驟，使用所述固定解鏈結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)溫度軸，以及將所述靶核酸的解鏈曲線與所述另外的靶核酸的解鏈曲線進(jìn)行比較。
38.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述染料選自下列物質(zhì)LC Green、PO-PROTM-1、JO-PROTM-1和BO-PROTM-1。
39.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)在閉管中發(fā)生，并且在擴(kuò)增開始以后試管中不再添加試劑。
40.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述監(jiān)測(cè)步驟在擴(kuò)增步驟之后發(fā)生并包括解鏈曲線分析。
41.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述監(jiān)測(cè)步驟在擴(kuò)增過程中發(fā)生。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述方法還包括進(jìn)行擴(kuò)增后解鏈曲線分析的步驟。
43.一種PCR分析的方法，其特征在于，所述方法包括將如權(quán)利要求1-17所述的PCR混合物在至少退火溫度和變性溫度之間循環(huán)以擴(kuò)增靶核酸，生成所述靶核酸的解鏈曲線，以及使用所述解鏈曲線以確定所述靶核酸是否具有與第二條核酸相同的序列。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述循環(huán)與曲線生成步驟在閉管中發(fā)生，并且在擴(kuò)增開始以后試管中不再添加試劑。
45.一種PCR分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟將一種雙鏈DNA結(jié)合染料與含靶核酸和為擴(kuò)增靶核酸而設(shè)置的引物的樣品混合，在存在所述雙鏈DNA結(jié)合染料的條件下擴(kuò)增靶核酸，監(jiān)測(cè)所述雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光，生成所述靶核酸的解鏈曲線，對(duì)解鏈曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)至少另外一個(gè)靶核酸重復(fù)混合、擴(kuò)增、曲線生成和標(biāo)準(zhǔn)化處理的步驟，以及比較標(biāo)準(zhǔn)化的解鏈曲線。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化曲線之間的溫度差異制圖的步驟。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過重疊每條曲線的一部分對(duì)解鏈曲線進(jìn)行溫度移動(dòng)的步驟。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)溫度移動(dòng)曲線之間的溫度差異制圖的步驟。
49.一種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物 其中 部分代表任選取代的稠合的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)或任選取代的稠合的單環(huán)或多環(huán)的含氮雜芳環(huán)；X是氧、硫、硒、碲或選自C(CH3)2和NR1的基團(tuán)，其中R1是氫或C1-6烷基；R2選自C1-6烷基、C3-8環(huán)烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、羥烷基、烷氧烷基、氨烷基、單烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、烯基羧酸根、烯基羧酰胺、烯基磺酸根、任選取代的含雜原子的環(huán)部分或任選取代的含雜原子的脂肪族部分；t＝0或1；Z是選自0或1的電荷數(shù)；R3、R9和R10各自獨(dú)立選自氫和C1-6烷基；n＝0、1或2；以及Q是選自以下結(jié)構(gòu)的雜環(huán) 其中R4、R5、R6、R7和R8獨(dú)立選自氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯烴炔基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷硫基或二烷基氨基，其中每種可被任選取代；含雜原子的脂肪族部分或含雜原子的環(huán)部分；橋聯(lián)染料；以及活性基團(tuán)，其中每種任選含一個(gè)四價(jià)銨部分。
50.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述 部分代表選自任選取代的苯并和任選取代的萘并的任選取代的稠合的單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)。
51.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述 部分代表具有選自鹵素、烷基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺?；?、鹵代烷基磺酰基或任選取代的苯基磺?；娜〈锏谋讲⒒蜉敛?。
52.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述X是氧或硫。
53.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述R2選自C1-6烷基、C3-8環(huán)烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、烯基磺酸根、任選取代的含雜原子環(huán)部分或任選取代的含雜原子脂肪族部分。
54.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述R3、R9、和R10各自獨(dú)立選自氫和甲基。
55.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述Q是雜環(huán)
56.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述R4、R5、R6、R7和R8獨(dú)立選自氫、鹵素、巰基、烷基、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、哌啶并、哌嗪并、4-甲基哌嗪-1-基或芳基。
57.如權(quán)利要求49所述的化合物，其特征在于，所述t＝1、n＝0，并且至少R4、R5、R6、R7和R8之一選自鹵素、巰基、C2-6烷基、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、哌啶并、哌嗪并、4-甲基哌嗪-1-基或芳基。
58.如權(quán)利要求57所述的化合物，其特征在于，所述R5選自鹵素、巰基、C2-6烷基、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、哌啶并、哌嗪并、4-甲基哌嗪-1-基或芳基。
59.如權(quán)利要求57所述的化合物，其特征在于，所述 部分代表具有選自鹵素、烷基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰基、鹵代烷基磺?；约叭芜x取代的苯基磺酰基的取代基的苯并或萘并；并且X是氧或硫。
60.如權(quán)利要求57所述的化合物，其特征在于，所述R2選自C1-6烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基或烯基磺酸根。
61.如權(quán)利要求57所述的化合物，其特征在于，所述R3、R9和R10各自是氫；R2選自C1-6烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基或烯基磺酸根。
62.如權(quán)利要求57所述的化合物，其特征在于，所述R5選自C2-6烷基、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、哌啶并、哌嗪并、4-甲基哌嗪-1-基或芳基。
63.一種核酸分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟將至少部分雙鏈的靶核酸與具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料混合以形成混合物，以及隨著加熱所述化合物，通過測(cè)量來自雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光生成所述靶核酸的解鏈曲線。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將靶核酸的解鏈曲線與第二種核酸的解鏈曲線相比較的步驟。
65.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述靶核酸是來自第一個(gè)體的HLA基因的一個(gè)基因座并且所述第二種核酸是來自第二個(gè)體的HLA基因的相同基因座。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述靶核酸的解鏈曲線類似于第二種核酸的解鏈曲線，并且還包括以下步驟生成針對(duì)靶核酸與第二種核酸混合物的解鏈曲線，以及將針對(duì)靶核酸或第二種核酸的解鏈曲線與針對(duì)靶核酸和第二種核酸混合物的解鏈曲線進(jìn)行比較。
67.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟將靶核酸與第二種核酸混合生成混合物，添加雙鏈DNA結(jié)合染料，加熱及冷卻混合物，生成針對(duì)混合的靶核酸和第二種核酸的解鏈曲線，以及將針對(duì)混合的靶核酸和第二種核酸的解鏈曲線與針對(duì)靶核酸的解鏈曲線相比較。
68.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟在所述混合物中添加一對(duì)寡核苷酸引物和擴(kuò)增試劑，擴(kuò)增所述混合物，其中擴(kuò)增步驟發(fā)生在生成解鏈曲線步驟之前。
69.一種用于擴(kuò)增靶核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括擴(kuò)增試劑，為擴(kuò)增所述靶核酸而設(shè)置的寡核苷酸引物，以及一種具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料。
70.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述雙鏈DNA結(jié)合染料具有至少90％的飽和百分比。
71.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述雙鏈DNA結(jié)合染料具有至少99％的飽和百分比。
72.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述染料是LC Green。
73.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述染料選自JO-PROTM-1、GelStar、SYTO44、SYTO45、POPOTM-3、SYTO12、TOTOTM-3、SYTO16、SYTOXBlue、Thiazole Orange、YOYO-3、SYTO43、SYTO11、SYTO13、SYTO15、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、SYTO23、SYTO20、BOBOTM-1、POPOTM-1、G5、H5、D6、P6、Y6或D8。
74.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述染料具有約410到460納米之間的最大激發(fā)波長(zhǎng)以及約450到500納米之間的最大發(fā)射波長(zhǎng)。
75.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增試劑包括一種熱穩(wěn)定聚合酶。
76.一種制備具有以下結(jié)構(gòu)式的染料方法， 其特征在于，所述方法包括將一種具有結(jié)構(gòu)式 的化合物與一種具有結(jié)構(gòu)式 的化合物反應(yīng)的步驟，其中W是-C(R8)＝或-N＝；A是氫，或A代表一個(gè)或多個(gè)各自獨(dú)立選自下列基團(tuán)的取代基烷基、鹵素、氨基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、烷基磺?；Ⅺu代烷基磺?；⒎蓟酋；⑼榱蚧?、芳硫基、甲?；?、烷基糖基、芳基糖基、羧酸衍生物、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、哌啶并、哌嗪并，其中每種可被烷基、氨基、單烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基任選取代，或可用烷基在氮上任選季銨化；B是氫，或B代表一個(gè)或多個(gè)各自獨(dú)立選自下列基團(tuán)的取代基烷基、鹵素、氨基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、烷基磺?；?、鹵代烷基磺?；⒎蓟酋；?、烷硫基、芳硫基、甲酰基、烷基糖基、芳基糖基、羧酸衍生物、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、哌啶并、哌嗪并，其中每種可以用烷基、氨基、單烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基任選取代，或可用烷基在氮上任選季銨化；R2選自C1-6烷基、C2-6烷基、C3-8環(huán)烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、羥烷基、烷氧烷基、氨烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、烷基糖基、芳基糖基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、烯基羧酸根、烯基羧酰胺、烯基磺酸根或烯基磺酸；R5選自C1-6烷基、C2-6烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、芳基、雜芳基，其中每種可被任選取代；R8選自氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯炔基、芳基、雜芳基、烷氧基、烷硫基或二烷基氨基，其中每種可被任選取代的；含雜原子的脂肪族部分或含雜原子的環(huán)部分；橋聯(lián)染料；以及反應(yīng)基團(tuán)；X是氧或硫；以及L是離去基團(tuán)。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)步驟包括一種具有結(jié)構(gòu)式 的化合物發(fā)生反應(yīng)，其中L是鹵素、烷硫基、芳硫基、烷基磺酰基或芳基磺?；?。
78.如權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)步驟包括一種具有結(jié)構(gòu)式 的化合物發(fā)生反應(yīng)，其中R5是C2-6烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、芳基、雜芳基，其中每種可以被任選取代。
79.如權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)步驟包括一種具有結(jié)構(gòu)式 的化合物發(fā)生反應(yīng)，其中R4選自鹵素、烷硫基、芳硫基、烷基磺?；蚍蓟酋；?。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使一種具有結(jié)構(gòu)式 的化合物與一種能置換R4基團(tuán)的親核試劑發(fā)生反應(yīng)。
81.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述W是-CH＝。
82.如權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述R5選自C2-6烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨、二烷基氨基烷基、三烷基銨烷基、芳基、雜芳基，其中每種可以被任選取代。
全文摘要
提供了用于核酸分析的方法，其中一種至少部分雙鏈的靶核酸與一種具有至少50％的飽和百分比的雙鏈DNA結(jié)合染料混合以形成混合物。在一種實(shí)施方式中，所述核酸在所述雙鏈DNA結(jié)合染料存在的條件下擴(kuò)增，在另一種實(shí)施方式中，隨著加熱所述混合物，通過測(cè)量來自所述雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光生成針對(duì)所述靶核酸的解鏈曲線。也提供了用于核酸分析的染料以及制備染料的方法。
文檔編號(hào)C07D279/16GK1934270SQ200380102099
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2003年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月23日
發(fā)明者C·T·威特沃, V·E·杜喬勒, G·里德, L·周 申請(qǐng)人:猶他大學(xué)研究基金會(huì), 愛達(dá)荷州技術(shù)股份有限公司