專利名稱：Il－17產(chǎn)生的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用白介素-23的拮抗劑(IL-23)來(lái)抑制T細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子白介素-17(IL-17)。本發(fā)明還涉及IL-23的拮抗劑在治療特征在于存在升高水平的IL-17的炎性疾病中的用途。
相關(guān)技術(shù)描述IL-17是來(lái)自T細(xì)胞的促炎分子，其刺激上皮、內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)其它的炎性細(xì)胞因子和趨化因子，包括IL-6，IL-8，G-CSF，和MCP-1(S.Aggarwal，A.L.Gurney，J Leukoc Biol 71，1(2002)；Z.Yao等，Immunity 3，811(1995)；J.Kennedy等，J Interferon Cytokine Res 16，611(1996)；F.Fossiez等，JExp Med 183，2593(1996)；A.Linden，H.Hoshino，M.Laan，Eur Respir J 15，973(2000)；X.Y.Cai，C.P.Gommoll，Jr.，L.Justice，S.K.Narula，J.S.Fine，Immunol Lett 62，51(1998)；D.V.Jovanovic等，J lmmunol 160，3513(1998)；和M.Laan等，J Immunol 162，2347(1999))。
IL-17也與其它細(xì)胞因子，包括TNF-α和IL-1β協(xié)同作用來(lái)進(jìn)一步誘導(dǎo)趨化因子的表達(dá)(Jovanovic等，見(jiàn)上，和M.Chabaud，F(xiàn).Fossiez，J.L.Taupin，P.Miossec，J Immunol 161，409(1998))。在以下情況中發(fā)現(xiàn)IL-17水平顯著提高類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜中(S.Kotake等，J Clin Invest 103，1345(1999)；和M.Chabaud等，Arthritis Rheum 42，963(1999))，同種異體(allograft)移植排斥過(guò)程中(M.A.Antonysamy等，Transplant Proc 31(1999)；M.A.Antonysamy等，J Immunol 162，577(1999)；C.C.Loong，C.Y.Lin，W.Y.Lui，TransplantProc 32(2000)；和H.G.Hsieh，C.C.Loong，W.Y.Lui，A.Chen，C.Y.Lin，Transpl Int 14，287(2001))，和其它慢性炎性疾病，包括多發(fā)性硬化(multiplesclerosis)(K.Kurasawa等，Arthritis Rheum 43，2455(2000))和牛皮癬(C.Albanesi等，J Invest Dermatol 115，81(2000)，和B.Homey等，J Immunol164，6621(2000))。盡管IL-17由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生是清楚的，以前的報(bào)告并沒(méi)有提供它在以Th1和Th2為兩極的(polarized)細(xì)胞因子圖譜(profile)范例內(nèi)的明確分類。
IL-23是異源二聚體細(xì)胞因子，它與白介素-12(IL-12)共享亞基p40，該亞基與獨(dú)特的亞基p19結(jié)合(B.Oppmann等，Immunity 13，715(2000))。已經(jīng)報(bào)道IL-23促進(jìn)T細(xì)胞，特別是記憶T細(xì)胞的增殖(D.M.Frucht，Sci STKE2002 Jan 82002(114)PE1)。近來(lái)描述轉(zhuǎn)基因p19小鼠顯示了復(fù)雜的全身性炎癥(profound systemic inflammation)和中性白細(xì)胞增多癥(neutrophilia)(M.T.Wiekowski等，J Immunol 166，7563(2001))。
至今還沒(méi)有建立細(xì)胞因子IL-17和IL-23的表達(dá)和生物作用之間的相關(guān)性。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及抑制T細(xì)胞產(chǎn)生白介素-17的方法，其包括用白介素-23(IL-23)的拮抗劑處理T細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面涉及治療哺乳動(dòng)物受試者中的炎性疾病的方法，所述疾病特征在于白介素17(IL-17)的表達(dá)提高，其包括給藥所述受試者有效量的白介素-23的拮抗劑(IL-23)。
本發(fā)明另一方面涉及鑒定抗炎制劑的方法，其包括如下步驟(a)在存在或缺無(wú)候選分子時(shí)，保溫(incubate)T細(xì)胞培養(yǎng)物與IL-23；(b)監(jiān)測(cè)(monitor)所述培養(yǎng)物中IL-17的水平；并(c)如果在所述候選分子存在時(shí)IL-17的水平比該候選分子缺無(wú)時(shí)的IL-17水平低，鑒定所述候選分子為抗炎制劑。
本發(fā)明另一方面涉及誘導(dǎo)在哺乳動(dòng)物受試者中產(chǎn)生IL-17的方法，其包括給藥所述受試者IL-23的激動(dòng)劑。
所有方面，拮抗劑或激動(dòng)劑都優(yōu)選是抗IL-23抗體或抗IL-23受體的抗體，其包括抗體片段。炎性疾病優(yōu)選是慢性炎性疾病，如例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，可導(dǎo)致同種異體排斥的移植物抗宿主反應(yīng)，多發(fā)性硬化(MS)或牛皮癬。IL-17產(chǎn)生的誘導(dǎo)通常用于患細(xì)菌感染諸如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的病人。
附圖簡(jiǎn)述

圖1不同細(xì)胞種類中的IL-17產(chǎn)生(A)從C57/BL-6小鼠制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，并通過(guò)密度梯度離心從懸浮的脾細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell)。在存在或缺無(wú)微生物脂肽(microbiallipopeptide)LBP(100ng/ml)，LPS(100ng/ml)或LTA(100ng/ml)時(shí)，培養(yǎng)2×106細(xì)胞/ml 3天，之后收集所述細(xì)胞并用ELISA分析IL-17。(B)從鼠脾細(xì)胞獲得純化的T細(xì)胞，之后篩選經(jīng)FACS分選的、CD90標(biāo)記的細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞。在平板結(jié)合的抗CD3(5μg/ml)，或來(lái)自活化的樹(shù)突細(xì)胞(LPS-處理的)的上清存在或缺無(wú)時(shí)培養(yǎng)這些細(xì)胞(1×106細(xì)胞/ml)3天，收集培養(yǎng)物上清并用ELISA試劑盒分析IL-17水平。所述樹(shù)突細(xì)胞來(lái)自巨噬細(xì)胞(從脾細(xì)胞懸液作為粘附性細(xì)胞群(adherent population)獲得)，該過(guò)程是通過(guò)用rmGM-CSF(2ng/ml)和rmIL-4(1000U/ml)處理巨噬細(xì)胞4天，用LPS(0.5μg/ml)洗滌并重新活化(re-activating)實(shí)現(xiàn)的。顯示3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的代表性(Representative)結(jié)果。
圖2IL-23刺激IL-17的產(chǎn)生A.用100U/ml重組IL-2培養(yǎng)從脾細(xì)胞分離的單個(gè)核細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)并在存在或缺無(wú)各種濃度的IL-23(0.1-1000ng/ml)時(shí)保溫6天。用ELISA測(cè)定在培養(yǎng)物上清累積的IL-17水平。B.用定量RT-PCR測(cè)定應(yīng)答于IL-23處理的IL-17mRNA水平變化。圖中顯示的(Plotted)是PCR反應(yīng)Ct(循環(huán)閾值(cycle threshold))的相對(duì)變化。每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)相對(duì)于存在于每個(gè)樣本中的3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)mRNA水平取準(zhǔn)，然后再次在樣品間相對(duì)于零時(shí)間(time zero)未刺激狀況時(shí)存在的IL-17 mRNA水平取準(zhǔn)。因?yàn)槊總€(gè)Ct對(duì)應(yīng)一個(gè)PCR循環(huán)，一個(gè)Ct約等于mRNA豐度(abundance)變化的2倍。在括號(hào)中注明5Ct和10Ct變化的大致mRNA倍數(shù)差異。用來(lái)自4只小鼠的脾細(xì)胞做試驗(yàn)，用x代表單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)并用條型柱(bar column)表示Ct變化的均值。C.如圖2B的說(shuō)明，用定量RT-PCR測(cè)量IL-17家族成員IL-17F應(yīng)IL-23處理的mRNA水平變化。
圖3IL-23作用于記憶T細(xì)胞來(lái)刺激IL-17產(chǎn)生用(a)CyC-CD4+PE-CD44或(b)CyC-CD4+PE-CD62L對(duì)從鼠脾細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞懸液分離的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行染色，并分選具有以下性質(zhì)的CD4+細(xì)胞CD44高/CD62L低或CD44低/CD62L高，前者是記憶表型，后者是原初表型。在存在或缺無(wú)IL-23(或其煮制物(boiled prep)作為對(duì)照)、平板結(jié)合的抗CD3(5μg/ml)和抗CD28(1μg/ml)的條件下，用100U/ML的重組IL-2培養(yǎng)所分選的細(xì)胞5天，洗滌并用抗CD3的抗體再刺激(re-stimulate)另外24小時(shí)。收集上清并用ELISA測(cè)量IL-17水平。
圖4IL12 p40抗體阻斷IL-23依賴性IL-17產(chǎn)生(A)用IL-23(100ng/ml)在37℃預(yù)保溫濃度漸增加的p40抗體或不相關(guān)的同種型(isotype)-匹配的對(duì)照抗體1小時(shí)，然后在重組IL-2存在時(shí)，與從小鼠的脾分離的單個(gè)核細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)再保溫5-6天。收獲上清并用ELISA測(cè)量IL-17水平(左邊的組(panel))。將最適濃度的IL-12p40抗體或不相關(guān)的同種型匹配的-對(duì)照抗體與經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突細(xì)胞(10％v/v)的經(jīng)調(diào)節(jié)的(conditioned)培養(yǎng)基在37℃預(yù)保溫1小時(shí)，然后在重組IL-2存在時(shí)，與從小鼠的脾分離的單個(gè)核細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)另外保溫5天。收獲上清并用ELISA測(cè)量IL-17水平(右邊的圖)。(B)在存在ConA時(shí)培養(yǎng)從脾細(xì)胞分離的單個(gè)核細(xì)胞3天，并用ELISA測(cè)量上清中的IL-17水平，所述脾細(xì)胞來(lái)自野生型小鼠(C57/BL6)或缺少IL-12組分之一，即IL12a-/-(p35敲除)或IL12b-/-(p40敲除)的小鼠。
圖5IL-12對(duì)IL-17產(chǎn)生的效果。(A)在存在純化的IL-23(1nM)及指定濃度的IL-12時(shí)，保溫從脾細(xì)胞培養(yǎng)物分離的單個(gè)核細(xì)胞5天，然后洗滌并用ConA再刺激另外24小時(shí)。用ELISA試劑盒測(cè)量細(xì)胞上清中的IL-17水平。(B)在存在或缺無(wú)純化的IL-23(1nM)時(shí)，保溫從脾細(xì)胞培養(yǎng)物分離的單個(gè)核細(xì)胞5天，然后洗滌并用ConA再刺激另外24小時(shí)，所述脾細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)自野生型或缺乏IL-12Rβ2(IL-12Rβ2-/-ko)的小鼠。用ELISA試劑盒測(cè)量細(xì)胞上清中的IL-17和IFN-γ水平。
圖6IL-23p19基因座的靶向。A除非另外用雙斜線標(biāo)出的位置，按比例(to scale)描繪了天然的IL-23p19基因座(頂部)，靶向型(targeting)構(gòu)建體(中間)，及正確靶向的基因座(底部)，。空心方塊(Open box)指示出編碼型外顯子，陰影方塊代表編碼所得到的信使RNA(mRNA)的5′和3′未翻譯區(qū)的外顯子。對(duì)p19基因的四個(gè)編碼外顯子編號(hào)。帶箭頭的方塊指示了新霉素(neo)的啟動(dòng)子區(qū)和胸苷激酶(thymidine kinase)(tk)選擇性盒子，標(biāo)記有EGFP的空心方塊指示了增強(qiáng)的綠色熒光蛋白報(bào)道基因的位置。用于克隆和臂分析的限制性位置被如下標(biāo)記B，BamHI；S，Sac II；E，Eco RI；Bg，Bgl II；X，XhoI。用來(lái)擴(kuò)增短臂的反義引物的位置用字母P和箭頭指示。在野生型(WT)和突變型(MUT)基因座中標(biāo)出用Bam HI和Eco RI消化所得的限制性片段大小，并且用粗線顯示用于通過(guò)southern印跡來(lái)檢測(cè)這些片段的兩個(gè)探針的位置。B和C分別為用探針I(yè)檢測(cè)的Bam HI消化產(chǎn)物和用探針I(yè)I探測(cè)的Eco RI消化產(chǎn)物的Southern印跡分析。從野生型(WT)胚胎干(ES)細(xì)胞，從ES克隆1c5，并從野生型、雜合的(HET)、和敲除(KO)小鼠提取DNA。在印跡左側(cè)指明帶的名稱(identity)，而在右側(cè)給出帶的大小。
圖7IL-23 p19-/-小鼠的總血清免疫球蛋白水平。用同種型特異性ELISA確定16只野生型(實(shí)心圓)和IL-23p19-/-(空心圓)小鼠的免疫球蛋白同種型血清水平。在圖底端指出免疫球蛋白的同種型。
圖8IL-23 p19-/-小鼠的體液免疫反應(yīng)。A-G用卵清蛋白(OVA)免疫一次(1st)和兩次(2nd)后IgG1(A)，IgG2a(B)，IgG2b(C)，IgG3(D)，IgE(E)，和IgA(F)的OVA特異性水平。實(shí)心圓，野生型小鼠；空心圓，IL-23p19-/-小鼠，灰色圓，IL-12p40-/-小鼠。如方法和材料部分所述計(jì)算任意單位(Arbitraryunit)。在圖底端用黑色水平條和數(shù)值指出每組均值。用星號(hào)標(biāo)記小于0.05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的P值。
圖9T非依賴性B細(xì)胞反應(yīng)在IL-23 p19-/-小鼠是正常的。用ELISA確定用TNP-LPS(I型，左)或TNP-Ficoll(II型，右)免疫的小鼠的TNP特異性IgM血清水平。實(shí)心圓，野生型小鼠；空心圓，IL-23 p19-/-小鼠。
圖10記憶性T細(xì)胞功能。在第0日用卵清蛋白免疫野生型(實(shí)心圓)和IL-23 p19-/-小鼠(空心圓)，并在第21天用TNP-OVA攻擊。在第0，14和26天收獲血清，并用ELISA檢驗(yàn)TNP-特異性IgG1(A)和IgG2a(B)的存在。對(duì)于IgG1，使用可購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品(standard)。對(duì)于IgG2a，如方法和材料部分所述計(jì)算任意單位。
圖11遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)(Delayed type hypersensitivity(DTH)reaction)。抗原特異性腫脹用足墊厚度相對(duì)于攻擊前剛測(cè)定的足墊厚度的增加百分比來(lái)計(jì)算。取每組的所有六只小鼠的結(jié)果的均值，用誤差條(error bar)代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。將未致敏的第二個(gè)野生型組用作單獨(dú)被抗原誘導(dǎo)的腫脹的對(duì)照。各種符號(hào)內(nèi)的星號(hào)表明對(duì)應(yīng)組和野生型小鼠之間的差別是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P＜0.05)。WT，野生型；p19 ko，IL-23 p19-/-小鼠；p40 ko，IL-12 p40-/-小鼠。
圖12IL-23 p19-/-抗原遞呈細(xì)胞的T細(xì)胞引發(fā)正常但產(chǎn)生的IL-17水平降低。Abalb/c T細(xì)胞與野生型(黑色條)或IL-23p19-/-(白色條)樹(shù)突細(xì)胞的聯(lián)合體外異源刺激(allostimulation)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)FACS分離原初CD4+T細(xì)胞和CD8-/CD11c+/MHC-II+細(xì)胞，并在存在或缺無(wú)細(xì)菌脂肽(BLP)時(shí)保溫它們。保溫5天后，確定上清中的增殖和細(xì)胞因子水平。APC，抗原遞呈細(xì)胞。B體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)。分離來(lái)自用KLH免疫的野生型(黑色條)或IL-23 p19-/-(白色條)小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞懸液，并在體外用25μg/ml的KLH再刺激。培養(yǎng)5天后測(cè)量增殖和IL-17水平。
優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)描述A.定義除非另外限定本文所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的同義。見(jiàn)例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，X Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(ColdSprings Harbor，NY 1989)。為本發(fā)明目的，如下限定如下術(shù)語(yǔ)。
本文術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”以最廣義使用。IL-23“拮抗劑”是無(wú)論機(jī)制如何，部分或完全阻斷，抑制，中和，預(yù)防(prevent)或干擾IL-23生物活性的分子。為本發(fā)明目的，所述生物活性優(yōu)選是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的能力。鑒定IL-23的拮抗劑，例如可基于它們抑制，阻斷，或逆轉(zhuǎn)IL-23介導(dǎo)的、由活化(例如記憶)T細(xì)胞群產(chǎn)生IL-17的能力。例如可在被試化合物(testcompound)存在或缺無(wú)時(shí)保溫活化的T細(xì)胞培養(yǎng)物與IL-23，并例如通過(guò)ELISA，監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物上清的IL-17水平。如果IL-17的水平在所述被試化合物存在時(shí)比其缺無(wú)時(shí)低，那么所述被試化合物是IL-23的拮抗劑?；蛘?，在用被試化合物處理前后，可用實(shí)時(shí)RT-PCR監(jiān)測(cè)組織中的IL-17mRNA表達(dá)，該組織也表達(dá)IL-23。所述被試化合物存在時(shí)IL-17的mRNA水平下降指示該化合物是IL-23的拮抗劑。IL-23拮抗劑的例子包括但不限于抗天然序列的IL-23多肽亞基，例如p40亞基的中和性抗體，包含與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合的IL-23亞基的免疫粘附素(immunoadhesin)，小分子，能抑制編碼天然序列的IL-23多肽亞基的基因的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄的反義寡核苷酸，引誘物(decoy)，例如IL-23基因的遺傳引誘物等。類似地，IL-23的拮抗劑包括但不限于抗天然IL-23受體的亞基，例如IL-23Rβ1或IL-23R亞基的中和性抗體，包含與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合的IL-23受體亞基的免疫粘附素，小分子，能抑制編碼天然序列IL-23受體多肽亞基的基因的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄的反義寡核苷酸，引誘物，例如IL-23受體基因的遺傳引誘物等。
本文術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”以最廣義使用。IL-23的激動(dòng)劑是無(wú)論機(jī)制如何，模擬天然序列IL-23介導(dǎo)的生物活性的任何分子。為本發(fā)明目的，所述生物活性優(yōu)選是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的能力。IL-23的激動(dòng)劑的例子包括但不限于抗亞基，例如天然IL-23受體的IL-12Rβ1或IL-23R亞基的激動(dòng)劑抗體，肽和有機(jī)小分子。
“反義寡脫氧核苷酸”或“反義寡核苷酸”(所述術(shù)語(yǔ)互換使用)被限定為能以序列特異性方式抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“反義”指的是核酸與所述靶基因的編碼(“有意義(sense)”)遺傳序列互補(bǔ)的事實(shí)。通過(guò)沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對(duì)，反義寡核苷酸與新生(nascent)mRNA以反向平行定向(antiparallel orientation)雜交。通過(guò)結(jié)合靶mRNA模板，反義寡核苷酸阻斷被編碼的蛋白的成功翻譯。該術(shù)語(yǔ)特異地包括叫做“核酶”的反義制劑(agent)，通過(guò)加入有天然自身剪接活性的序列，它已經(jīng)被設(shè)計(jì)來(lái)誘導(dǎo)靶RNA的催化裂解(Warzocha和Wotowiec，″Antisensestrategybiological utility and prospects in the treatment of hematologicalmalignancies.″Leuk.Lymphom24267-281 )。
本文術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣義使用，并且特異性包括單克隆抗體(包括拮抗劑，例如中和性抗體和激動(dòng)劑抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段。所述單克隆抗體特異性包括“嵌合”抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與來(lái)自具體物種(species)或?qū)儆诰唧w抗體種類或亞類的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的其它部分與來(lái)自其它物種或?qū)儆谄渌贵w類或亞類的抗體、以及這種抗體的片段中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，只要它們表現(xiàn)出了所需的生物活性(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855 )。所述單克隆抗體還包括“人源化”抗體或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合型的亞序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多數(shù)情況(For themost part)，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來(lái)自所述受者CDR的殘基被具有理想的特異性、親合力和載量(capacity)的非人物種(供者抗體)的CDR的殘基所取代，所述非人物種諸如小鼠、大鼠或兔。有時(shí)，人免疫球蛋白Fv FR殘基被對(duì)應(yīng)的非人殘基所取代。另外，人源化抗體可包含不存在于受者抗體也不存在于引入的(imported)CDR或框架序列發(fā)現(xiàn)的殘基。做這些修飾來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)(refine)抗體并使其性能(performance)達(dá)到最大化。通常，人源化抗體基本包含所有的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于那些非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且所有或基本所有的FR區(qū)是那些人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。所述人源化抗體也最適地包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，其通常來(lái)自人免疫球蛋白。更多細(xì)節(jié)見(jiàn)Jones等，Nature，321522-525(1986)；和Reichmann等，Nature，332323-329(1988)。所述人源化抗體包括PRIMATIZED抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)源自用感興趣的抗原免疫恒河猴(macaque monkey)產(chǎn)生的抗體。
“抗體片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，和Fv片段；雙抗體(diabodies)；線性抗體(Zapata等，Protein Erg 8(10)1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。
本文術(shù)語(yǔ)“炎性疾病”或“炎性病癥(disorder)”指導(dǎo)致炎癥的病理狀態(tài)，其通常由中性粒細(xì)胞趨化作用(neutrophil chemotaxis)造成。此種疾病的例子包括炎性皮膚病(inflammatory skin disease)，其包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis)；全身性硬皮病(systemic scleroderma)和硬化(sclerosis)；與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)(IBD)(如克隆氏病(Crohn′s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎)相關(guān)的反應(yīng)；缺血再灌注疾病(ischemic reperfusion disorder)，其包括外科手術(shù)組織再灌注損害(surgical tissue reperfusion injury)，心肌缺血性疾病(condition)如心肌梗塞，心臟停搏，心臟手術(shù)后再灌注和經(jīng)皮經(jīng)血管冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty)后的狹窄(constriction)，中風(fēng)，和腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm)；繼發(fā)于中風(fēng)的腦水腫；顱創(chuàng)傷(cranial trauma)，低血容量性休克；窒息；成人型呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome)；急性肺損傷；白塞病(Behcet′sdisease)，皮肌炎；多發(fā)性肌炎；多發(fā)性硬化(MS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎(uveitis)；骨關(guān)節(jié)炎；狼瘡腎炎；自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，干燥綜合征(Sjorgen′s syndrome)，血管炎；涉及白細(xì)胞滲出(leukocyte diapedesis)的疾病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病，繼發(fā)于敗血癥(septicaemia)或創(chuàng)傷的多器官損傷綜合征(multiple organ injury syndrome)；酒精性肝炎；細(xì)菌性肺炎；抗原抗體復(fù)合體介導(dǎo)的疾病，其包括腎小球腎炎；膿毒病(sepsis)；結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)；對(duì)組織/器官移植的免疫病理性反應(yīng)；肺的炎癥，其包括胸膜炎，肺泡炎，血管炎，肺炎，慢性支氣管炎，支氣管擴(kuò)張，彌散性全細(xì)支氣管炎(panbronchiolitis)，超敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis)，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF)，和囊性纖維化等。優(yōu)選的適應(yīng)征包括但不限于慢性炎癥，自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，類風(fēng)濕性脊椎炎(rheumatoidspondylitis)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis)，及其它關(guān)節(jié)炎疾病(arthriticcondition)，多發(fā)性硬化(MS)，哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systhemic lupuserythrematosus)，成人型呼吸窘迫綜合征，白塞病，牛皮癬，慢性肺炎性疾病(pulmonary inflammation disease)，移植物抗宿主反應(yīng)，克隆氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎癥性腸病(IBD)，阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease)，和發(fā)熱(pyresis)，以及涉及炎癥和病癥的任何疾病或紊亂。
術(shù)語(yǔ)“治療”指治療性治療和預(yù)防(prophylactic or preventative)的措施，其中目的是為了預(yù)防或減緩(減輕(lessen))不希望的生理改變或紊亂。為本發(fā)明目的，有益或理想的臨床結(jié)果包括但不限于，癥狀的減輕(alleviation)，疾病范圍(extent of disease)的縮小(diminishment)，疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即未惡化)，疾病進(jìn)展的遲發(fā)或減慢，疾病狀態(tài)的改善或緩和(palliation)，及癥狀緩解(remission)(無(wú)論部分或整體)，而無(wú)論其可檢測(cè)與否?！爸委煛币仓概c未接受治療時(shí)的預(yù)期存活期相比延長(zhǎng)的存活期。需要治療的對(duì)象包括已患所述疾病，和易于患所述疾病，或有待預(yù)防所述疾病的那些對(duì)象。
“慢性”給藥指以與急性方式相對(duì)的持續(xù)方式來(lái)給予一或多種制劑，從而維持理想效果延長(zhǎng)的(extended)一段時(shí)間。
“間歇”給藥不是連續(xù)無(wú)間斷的治療，而是循環(huán)的(cyclic in nature)。
“聯(lián)用”一或更多其它治療制劑給藥包括以任何順序同時(shí)(共同(concurrent))和連續(xù)給藥。
“受試者”是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人。
本文術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”指任何被分類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，其包括但不限于人，家養(yǎng)(domestic)和飼養(yǎng)(farm)動(dòng)物，和觀賞動(dòng)物(zoo animal)，競(jìng)技動(dòng)物(sports animal)或?qū)櫸飫?dòng)物，如綿羊，狗，馬，貓，母牛等。優(yōu)選，本文哺乳動(dòng)物是人。
“有效量”是足夠?qū)崿F(xiàn)有益或理想治療性(包括預(yù)防性)結(jié)果的量?？梢酝ㄟ^(guò)一或更多給藥來(lái)給予有效量。
B.本發(fā)明實(shí)施方式除非另外指出，本發(fā)明實(shí)踐使用本領(lǐng)域內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)的常用技術(shù)。文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋了這些技術(shù)，如″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2ndedition(Sambrook等，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；″Methods inEnzymology″(Academic Press，Inc.)；″Handbook of Experimental Immunology″，4th edition(D.M.Weir & C.C.Blackwell，eds.，Blackwell Science Inc.，1987)；″Gene TransferVectors for Mammalian Cells″(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；″CurrentProtocols in Molecular Biology″(F.M.Ausubel等eds.，1987)；″PCRThePolymerase Chain Reaction″，(Mullis等，eds.，1994)；和″Current Protocols inImmunology″(J.E.Coligan等，eds.，1991)。
如前述，本發(fā)明是基于如下認(rèn)識(shí)IL-23誘導(dǎo)活化T細(xì)胞，特別是記憶細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，并且IL-23的拮抗劑能抑制此進(jìn)程。因此，IL-23的拮抗劑是治療炎癥狀況的有希望的侯選藥物(promising drug candidate)，所述炎癥狀況的特征為IL-17水平升高。相反，IL-23的激動(dòng)劑可用于誘導(dǎo)對(duì)多種感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)，包括分枝桿菌感染，如例如，結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染。
1.鑒定IL-23的拮抗劑或激動(dòng)劑的篩選試驗(yàn)本發(fā)明包括鑒定IL-23的拮抗劑的篩選試驗(yàn)，所述拮抗劑具有治療特征為存在水平升高的IL-17的炎癥性狀況的功效。本發(fā)明還包括鑒定IL-23的激動(dòng)劑的篩選試驗(yàn)，所述激動(dòng)劑具有刺激對(duì)感染如結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的功效。
候選拮抗劑藥物的篩選試驗(yàn)可被設(shè)計(jì)用來(lái)鑒定化合物，其與IL-23(包括亞基或它的其它片段)或IL-23受體(包括亞基或它的其它片段)結(jié)合或復(fù)合，或另外干預(yù)IL-23與其它細(xì)胞蛋白的相互作用，從而干預(yù)IL-23產(chǎn)生或起作用。本文提供的篩選試驗(yàn)包括適合高通量(high-throughput)篩選化學(xué)文庫(kù)的試驗(yàn)，使它們特別適合鑒定小分子候選藥物。通常，結(jié)合試驗(yàn)和活性試驗(yàn)是已知的。
可以多種形式進(jìn)行所述試驗(yàn)，其包括但不限于本領(lǐng)域公知的蛋白-蛋白結(jié)合試驗(yàn)，生物化學(xué)篩選試驗(yàn)，免疫測(cè)定，和基于細(xì)胞的試驗(yàn)。
對(duì)于拮抗劑和激動(dòng)劑的所有試驗(yàn)都是常用的，因?yàn)樗鼈冃枰谝欢l件下使候選藥物與IL-23多肽，或和IL-23受體多肽，或所述多肽的片段(特別是包括IL-23和IL-23受體亞基)接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)使這兩種組分相互作用。例如，所述人IL-23p19亞基是189個(gè)氨基酸的多肽，其序列以登錄號(hào)AF301620可得自EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI 605580；GenBank AF301620；Oppmann等，如上述)。IL-23多肽亞基p40的序列也已知(也稱為IL-12p40亞基；NCBI161561)。IL-23所結(jié)合的IL-12Rβ1的序列以登錄號(hào)NCBI 601604可得。制備結(jié)合所述多肽的抗體或小分子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
結(jié)合試驗(yàn)中，所述相互作用是結(jié)合，并且形成的復(fù)合體可被分離或在反應(yīng)混合物中被檢測(cè)。具體實(shí)施方案中，IL-23或IL-23受體多肽或所述候選藥物通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接(attachment)被固定在固相上，例如在微量滴定板上。非共價(jià)連接通常通過(guò)用IL-23或IL-23受體多肽的溶液包被固體表面并干燥來(lái)完成。或者，可使用對(duì)待固定的IL-23多肽或IL-23受體多肽具有特異性的固定化抗體，例如單克隆抗體來(lái)將其錨定(anchor)到固體表面。進(jìn)行所述試驗(yàn)是通過(guò)將可以使用檢測(cè)標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記的未固定組分，加入到固定的組分，例如含有所述被錨定組分的被包被的表面。當(dāng)所述反應(yīng)完成時(shí)，例如通過(guò)洗滌來(lái)去除未反應(yīng)組分，再檢測(cè)錨定到固體表面的復(fù)合體。當(dāng)原來(lái)未固定的組分?jǐn)y帶檢測(cè)標(biāo)簽時(shí)，檢測(cè)到固定在表面的標(biāo)簽表明出現(xiàn)了復(fù)合。當(dāng)原來(lái)未固定的組分不攜帶標(biāo)簽時(shí)，可例如通過(guò)使用特異性結(jié)合所述固定化復(fù)合體的經(jīng)標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)所述復(fù)合。
如果候選化合物是與IL-23或IL-23受體相互作用但不與之結(jié)合的多肽，可用已知檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的方法來(lái)測(cè)定其與各自的多肽的相互作用。此試驗(yàn)包括傳統(tǒng)途徑，如例如交聯(lián)，共免疫沉淀和用梯度或?qū)游鲋餐兓?。另外，可用基于酵母的遺傳系統(tǒng)監(jiān)測(cè)蛋白-蛋白相互作用，其如Fields及其合作者描述(Fields和Song，Nature(London)，340245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))如Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)公開(kāi)。很多轉(zhuǎn)錄活化物(activator)，如酵母GAL4，其由兩個(gè)物理上不連續(xù)的模塊區(qū)(physically discretemodular domain)組成，一個(gè)作為DNA結(jié)合區(qū)，另一個(gè)用作轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(activation domain)。在上述文獻(xiàn)中描述的酵母表達(dá)系統(tǒng)(通常指“雙雜合體(two-hybrid)系統(tǒng)”)利用這個(gè)性質(zhì)，并使用兩個(gè)雜合蛋白(hybrid protein)，其中之一是靶蛋白，其與GAL4的DNA結(jié)合區(qū)融合，并且另一個(gè)是候選活化蛋白，其與活化區(qū)融合。受GAL4-活化的啟動(dòng)子控制的GAL1-lacZ報(bào)道基因的表達(dá)依賴于經(jīng)蛋白-蛋白相互作用的GAL4活性重建。包含相互作用的多肽的集落(Colonies)用β-半乳糖苷酶的(chromogenic)產(chǎn)色底物來(lái)檢測(cè)。用雙雜合體技術(shù)鑒定兩個(gè)特異性蛋白間的蛋白-蛋白相互作用的完整試劑盒(MATCHMAKERTM)從Clontech可購(gòu)。此系統(tǒng)也能擴(kuò)展到定位(map)涉及特異性蛋白相互作用的蛋白結(jié)構(gòu)域并精細(xì)到(pinpoint)對(duì)這些相互作用關(guān)鍵的氨基酸殘基。
可如下測(cè)定干預(yù)IL-23與其它細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外組分，具體是IL-17的相互作用的化合物。通常制備包含IL-23和細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外組分(例如IL-17)的反應(yīng)混合物，在一定條件下允許兩個(gè)產(chǎn)物相互作用足夠長(zhǎng)的時(shí)間。為測(cè)定候選化合物抑制IL-23和IL-17相互作用的能力，在被試化合物缺無(wú)和存在時(shí)進(jìn)行該反應(yīng)。另外，可將安慰劑加入反應(yīng)混合物來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。既然IL-23已經(jīng)顯示誘導(dǎo)了IL-17的產(chǎn)生，可例如通過(guò)在被試化合物缺無(wú)和存在時(shí)測(cè)量IL-17的量來(lái)測(cè)定被試化合物抑制IL-23/IL-17相互作用的能力。如果IL-17的量在候選化合物缺無(wú)時(shí)比在其存在時(shí)低，那么所述候選化合物是本發(fā)明限定的IL-23的拮抗劑。
基于它們抑制IL-23誘導(dǎo)IL-17產(chǎn)生的能力來(lái)鑒定的IL-23拮抗劑是治療炎性疾病的候選藥物，所述疾病的特征是存在水平提高的IL-17。
基于它們促進(jìn)IL-23誘導(dǎo)IL-17產(chǎn)生的能力來(lái)鑒定的IL-23激動(dòng)劑是候選藥物，其誘發(fā)或支持對(duì)感染，如結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)，結(jié)果治療了傳染病(infectious disease)，如結(jié)核病。
強(qiáng)調(diào)這里特異性討論的篩選試驗(yàn)僅僅是為了解釋。根據(jù)所篩選的候選拮抗劑種類(例如多肽，肽，非肽的小有機(jī)分子，核酸等)選擇的多項(xiàng)其它試驗(yàn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并且同等適用本發(fā)明目的。
2.抗IL-23和抗IL-23受體的抗體具體實(shí)施方案中，IL-23的拮抗劑或激動(dòng)劑是IL-23(例如IL-23亞基)的單克隆抗體，包括抗體片段。其它具體實(shí)施方案中，IL-23的拮抗劑和激動(dòng)劑包括IL-23受體(例如IL-23受體的亞基)的單克隆抗體。上面已經(jīng)討論了IL-23，包括其亞基。IL-23的受體包含兩個(gè)亞基IL-12Rβ1，和近來(lái)被討論叫做IL-23R的亞基(Parham等，J.Immunol.1685699-5798(2002))。對(duì)任一亞基的抗體都特異地在本發(fā)明范圍內(nèi)。對(duì)于拮抗劑的情況，具體優(yōu)選特異性結(jié)合IL-23R亞基的抗體，因?yàn)樗鼈兲禺愋宰钄嗔薎L-23介導(dǎo)的生物活性。
生產(chǎn)單克隆抗體的方法本領(lǐng)域公知。因此，可用雜交瘤方法制備單克隆抗體，如Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)描述的那些。雜交瘤方法中，通常用免疫制劑免疫小鼠、豚鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，來(lái)激發(fā)(elicit)產(chǎn)生或能產(chǎn)生會(huì)特異性結(jié)合到免疫制劑的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，可在體外免疫淋巴細(xì)胞。
所述免疫制劑通常包括IL-23或IL-23受體多肽或其融合蛋白。一般來(lái)說(shuō)，如果需要人源的細(xì)胞那么使用外周血淋巴細(xì)胞(″PBL″)，或如果需要非人哺乳動(dòng)物來(lái)源那么使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后用合適的融合制劑，如聚乙二醇將所述淋巴細(xì)胞與固定細(xì)胞系融合來(lái)形成雜交瘤細(xì)胞[Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103]。固定的細(xì)胞系通常是經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體是嚙齒動(dòng)物、牛和人來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞。通常用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。所述雜交瘤細(xì)胞可能被培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，其優(yōu)選包含一或更多可抑制未融合的固定化細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如如果親代細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(guanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT或HPRT)，那么雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶(″HAT培養(yǎng)基″)，所述物質(zhì)防止HGPRT-缺陷的細(xì)胞生長(zhǎng)。
優(yōu)選的固定細(xì)胞系是高效融合的，其支持由所選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定高水平地表達(dá)抗體，并且對(duì)培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感。更優(yōu)選的固定細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，其例如可得自the Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the AmericanType Culture Collection，Manassas，Virginia)。也描述了產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63]。
也可測(cè)定用于培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中抗IL-23或IL-23受體的單克隆抗體的存在。優(yōu)選，所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)確定。所述技術(shù)和試驗(yàn)本領(lǐng)域已知。所述單克隆抗體的結(jié)合親合力可例如，用斯卡查德分析(Scatchard analysis)，Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)確定。
鑒定了理想的雜交瘤細(xì)胞后，可用限制性稀釋方法亞克隆所述克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長(zhǎng)[Goding，如上述]。適合此目的培養(yǎng)基包括，例如Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)和RPMI-1640培養(yǎng)基。或者，所述雜交瘤細(xì)胞可在體內(nèi)如在哺乳動(dòng)物的腹水(ascite)內(nèi)生長(zhǎng)。
可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基或腹水分離或純化由所述亞克隆分泌的單克隆抗體，所述方法如例如，蛋白A-瓊脂糖凝膠(Sepharose)，羥基磷灰石(hydroxylapatite)層析，凝膠電泳，透析或親和層析。
也用重組DNA方法，如美國(guó)專利4,816,567所述的那些來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體。用常規(guī)方法可容易地分離并測(cè)序編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA(例如，通過(guò)使用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。用本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞作為所述DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，可將所述DNA置入表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)染到不會(huì)另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白的宿主細(xì)胞，如猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞，來(lái)在重組細(xì)胞中合成單克隆抗體。也可修飾所述DNA，例如通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源鼠序列[美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，如上述]或通過(guò)使免疫球蛋白編碼序列與所有的或部分的非免疫球蛋白多肽編碼序列共價(jià)連接。所述非免疫球蛋白多肽可以被本發(fā)明抗體恒定區(qū)取代、或可被本發(fā)明抗體一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)取代來(lái)產(chǎn)生嵌合的二價(jià)抗體。
所述抗體可以是單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法本領(lǐng)域公知。例如，一種方法涉及重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和被修飾的重鏈。通常在Fc區(qū)的任何點(diǎn)截短所述重鏈來(lái)避免重鏈交聯(lián)?；蛘?，通過(guò)相關(guān)的半胱氨酸殘基被其它氨基酸殘基取代或缺失來(lái)避免交聯(lián)。體外方法也適合制備單價(jià)抗體。
本發(fā)明抗IL-23和抗IL-23受體的抗體還可以是人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠)抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，和F(ab′)2或抗體的其它抗原-結(jié)合亞序列)，其包含來(lái)自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來(lái)自受者互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被具有所需的特異性、親合力和載量的來(lái)自非人物種(供者抗體)的CDR殘基取代，所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。有時(shí)，所述人免疫球蛋白Fv FR框架殘基被對(duì)應(yīng)的非人殘基取代。人源化抗體還可包含不在受者抗體和輸入的CDR或框架序列發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，所述人源化抗體基本包含所有的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于那些非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且所有或基本所有的FR區(qū)是那些人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。所述人源化抗體也最適包含免疫球蛋白通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)]。
人源化非人抗體的方法本領(lǐng)域公知。通常人源化抗體具有由非人來(lái)源引入它的一或更多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“輸入(import)”殘基，其通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化基本用Winter及合作者的方法進(jìn)行[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature.332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)]，它是將嚙齒動(dòng)物的CDR或CDR序列取代為人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，此“人源化的”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，其中基本上不足完整(less than intact)的人可變區(qū)已經(jīng)被來(lái)自非人物種的對(duì)應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被來(lái)自嚙齒類動(dòng)物抗體中類似位置(analogous site)的殘基取代。
也可用多種本領(lǐng)域公知技術(shù)生產(chǎn)人抗體，所述技術(shù)包括噬菌體顯示文庫(kù)(phage display libraries)[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。也可用Cole等和Boerner等的技術(shù)來(lái)制備人單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(186-95(1991)]。同樣，可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因已被部分或全部失活的小鼠。攻擊后觀察人抗體產(chǎn)生，它與在人中見(jiàn)到的所有方面十分類似，包括基因重排(rearrangement)，裝配(assembly)和抗體庫(kù)(repertoire)。此方法的描述例如見(jiàn)美國(guó)專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及如下科學(xué)文獻(xiàn)Marks等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 21826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
Mendez等(Nature Genetics 15146-156(1997))進(jìn)一步改進(jìn)了技術(shù)并產(chǎn)生了名為“Xenomouse II”的轉(zhuǎn)基因小鼠系，用抗原攻擊它時(shí)會(huì)產(chǎn)生高親和力的完全人抗體。通過(guò)將巨堿基(megabase)人重鏈和輕鏈基因座種系整合(germ-line integration)到如上缺失內(nèi)源性JH節(jié)段的小鼠中來(lái)實(shí)現(xiàn)它。所述Xenomouse II容納(harbor)了1,020kb的人重鏈基因座，其包含大約66個(gè)VH基因，完全的DH和JH區(qū)，以及三個(gè)不同的恒定區(qū)(μ，δ和χ)，它還容納了800kb的人κ基因座，其包含32個(gè)Vκ基因，Jκ節(jié)段和Cκ基因。這些小鼠產(chǎn)生的抗體十分類似在人見(jiàn)到的所有方面，包括包括基因重排，裝配和抗體所有組成成分。所述人抗體優(yōu)選表達(dá)超過(guò)內(nèi)源性抗體，因?yàn)閮?nèi)源性JH節(jié)段的缺失避免了鼠基因座上的基因重排。
或者，可使用噬菌體顯示技術(shù)(McCafferty等，Nature348，552-553(1990))，用未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成成分在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到如M13或fd的絲狀噬菌體(filamentous bacteriophage)的主要或次要外殼蛋白(major orminor coat protein)基因編碼框內(nèi)(in-frame)，并在噬菌體顆粒表面上顯示為有功能的抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于所述抗體功能性質(zhì)進(jìn)行選擇也就選擇了編碼表現(xiàn)出那些性質(zhì)的抗體的基因。因此，所述噬菌體模擬了B細(xì)胞的一些性質(zhì)。可用多種形式進(jìn)行噬菌體顯示有關(guān)它們的綜述見(jiàn)例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3，564-571(1993)?？捎酶鞣NV-基因節(jié)段來(lái)源來(lái)作噬菌體顯示。Clackson等，Nature352，624-628(1991)分離了抗噁唑酮(oxazolone)抗體的多樣性陣列(array)，所述抗體來(lái)自源自免疫小鼠脾臟的V基因的小隨機(jī)組合文庫(kù)(random combinatorial library)?？蓸?gòu)建來(lái)自未免疫的人供者的V基因的所有組成成分，并且可基本依據(jù)如Marks等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J12，725-734(1993)所述的技術(shù)分離抗多種抗原陣列(包括自身抗原)的抗體。天然免疫反應(yīng)中，抗體基因以高速(at a high rate)累積突變(體細(xì)胞高變(somatic hypermutation))。一些引入的變化會(huì)使親和力更高，并且在隨后的抗原攻擊中優(yōu)選使顯示高親和力的表面免疫球蛋白的B細(xì)胞復(fù)制并分化?？赏ㄟ^(guò)使用“鏈改組(chain shuffling)”的技術(shù)來(lái)模擬此天然過(guò)程(Marks等，BiolTechnol.10，779-783 )。此方法中，要提高通過(guò)噬菌體顯示獲得的“第一(primary)”人抗體的親合力，可通過(guò)用從未經(jīng)免疫的供者獲得的V區(qū)基因的天然存在變體庫(kù)(庫(kù))取代重鏈和輕鏈V區(qū)的基因。此技術(shù)可產(chǎn)生親合力在nM范圍的抗體和抗體片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)已描述了制造非常大的噬菌體抗體所有組成成分的策略。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了產(chǎn)生抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)得到這些片段(見(jiàn)例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science 22981(1985))。然而現(xiàn)在可直接由重組細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，可直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)來(lái)形成F(ab′)2片段(Carter等，Biol Technology 10163-167(1992))。另一個(gè)實(shí)施方案中，用亮氨酸拉鏈(zipper)GCN4形成F(ab′)2，從而促進(jìn)F(ab′)2分子的裝配。根據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離Fv，F(xiàn)ab或F(ab′)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域試驗(yàn)人員明顯可知。
本發(fā)明范圍也包括由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體組成的異偶聯(lián)(Heteroconjugate)抗體。此抗體已例如，被建議用來(lái)使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)，并用來(lái)治療HIV感染(PCT申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO91/00360和WO 92/200373)?？墒褂萌魏畏奖愕慕宦?lián)方法，用公知、可購(gòu)的交聯(lián)制劑來(lái)制備同種異型偶聯(lián)抗體。
更多涉及產(chǎn)生單克隆抗體的信息也見(jiàn)Goding，J.W.，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，3rdEdition，Academic Press，Inc.，London，San Diego，1996；Liddell和WeeksAntibody TechnologyA ComprehensiveOverview，Bios Scientific PublishersOxford，UK，1995；Breitling和DubelRecombinant Antibodies，John Wiley&Sons，New York，1999；和PhageDisplayA Laboratory Manual，Barbas等，editors，Cold Springs HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，2001。
3.靶疾病IL-17涉及多種炎性疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)。RA的主要特征之一是關(guān)節(jié)周圍骨的侵蝕(erosion)。破骨細(xì)胞在骨的重吸收中起主要作用，但破骨細(xì)胞從祖細(xì)胞形成的機(jī)制并未被完全理解。近來(lái)，Kotake等，(J.Clin.Invest.1031345(1999))報(bào)道，在共培養(yǎng)小鼠造血細(xì)胞和初級(jí)(primary)破骨細(xì)胞時(shí)白介素17(IL-17)可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞樣細(xì)胞形成。由IL-17誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成(osteoclastogenesis)顯示被環(huán)加氧酶(cyclooxygenase)-2(COX-2)的選擇性抑制物吲哚美辛(indomethacin)抑制。與骨關(guān)節(jié)炎(OA)病人相比發(fā)現(xiàn)，RA病人的滑液(synovial fluid)包含特別高水平的IL-17。另外，使用免疫染色，在RA病人的滑膜組織但沒(méi)有在OA病人的組織內(nèi)檢測(cè)出IL-17陽(yáng)性的單個(gè)核細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)現(xiàn)被解釋為表明IL-17有助于RA的骨侵蝕和關(guān)節(jié)損害，因此可以是被抑制的靶。
與健康受試者相比，白塞病的病人已經(jīng)顯示IL-17的血清水平驚人提高。Hamzaoui等，Scand.J.Rheumatol.31(4)205-10(2002)。
在哮喘性氣道(asthmatic airway)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)IL-17的水平提高，并且提示IL-17可能通過(guò)釋放其它促炎介質(zhì)，如α-趨化因子來(lái)放大炎癥性反應(yīng)。Molet等，J.Allergy Clin.Immunol.108(3)430-8(2001)；和Wong等，Clin.Exp.Immunol.125(2)177-83(2001)。
在患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病人已報(bào)道了IL-17水平提高。Wong等，Lupus9(8)589-93(2000)。
已描述IL-17在牛皮癬中起作用。Homey等，J.Immunol.164(12)6621-32(2000)。
已報(bào)道IL-17mRNA在多發(fā)性硬化的血和CSF單個(gè)核細(xì)胞中被放大(augment)。Matusevicius等，Mult.Scler.5(2)101-4(1999)。
基于這些以及諸多類似報(bào)道，抑制了IL-23誘導(dǎo)IL-17產(chǎn)生的能力從而降低了IL-17的水平的IL-23拮抗劑，是治療多種(慢性)炎癥狀況和疾病的有價(jià)值的候選物。所述疾病的例子包括但不限于慢性炎癥，自身免疫性糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，類風(fēng)濕性脊椎炎，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，及其它關(guān)節(jié)炎狀況，多發(fā)性硬化(MS)，哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，成人型呼吸窘迫綜合征，白塞病，牛皮癬，慢性肺炎性疾病，移植物抗宿主反應(yīng)，克隆氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎癥性腸病(IBD)，阿爾茨海默病，和發(fā)熱。
已知IL-17是通過(guò)促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生并因此誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來(lái)在對(duì)某些傳染病，如肺結(jié)核產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)中起重要作用的。因此，IL-23的激動(dòng)劑，包括激動(dòng)劑抗體，對(duì)誘導(dǎo)針對(duì)多種感染(如結(jié)核分枝桿菌引起的肺結(jié)核)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效，并且是治療每年全球殺死三百萬(wàn)人以上的傳染病的有希望的候選藥物。
4.藥物組合物可以以藥物組合物形式給藥由上文披露的篩選試驗(yàn)鑒定的、特異性結(jié)合IL-23或IL-23受體的抗體，以及其它IL-23的拮抗劑或激動(dòng)劑分子，來(lái)治療多種疾病，特別是炎性疾病或由于誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)造成的疾病。
使用抗體片段時(shí)，優(yōu)選特異性結(jié)合到靶蛋白結(jié)合區(qū)的最小抑制性片段。例如，基于抗體可變區(qū)序列，可設(shè)計(jì)保持結(jié)合靶蛋白序列的能力的肽分子?？苫瘜W(xué)合成和/或用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)此肽。見(jiàn)例如，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。
也可以例如用團(tuán)聚(coacervation)技術(shù)或界面聚合(interfacialpolymerization)，將所述活性組分包載(entrapped)在制備的微膠囊(microcapsule)中，例如羥甲基纖維素酯(hydroxymethylcellulose)或明膠-微膠囊和聚-(methylmethacylate)微膠囊可分別在膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，微球白蛋白(albumin microsphere)，微乳狀液(microemulsion)，納米顆粒(nano-particle)，和納米膠囊(nanocapsule))或在大分子乳狀液(macroemulsion)中。這些技術(shù)披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，如上述。
用于體內(nèi)給藥的劑型(formulation)必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)濾過(guò)無(wú)菌濾過(guò)膜來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)。
可以制備緩釋(Sustained-release)制備物。緩釋制備物的適當(dāng)例子包括包含抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)，該基質(zhì)為成型(shaped)顆粒，例如膜(film)或微膠囊的形式。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯，水凝膠(例如，聚羥乙基甲基丙烯酸酯(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))，或聚乙烯醇(poly(vinylalcohol))，多乳酸化合物(polylactide)(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸(glutamate)的共聚物，非降解的(non-degradable)乙烯-醋酸乙烯(ethylene-vinyl acetate)，降解的乳酸-羥基乙酸(glycolic acid)共聚物如LUPRON DEPOTTM(注射的微球，其由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-羥基乙酸使分子釋放超過(guò)100天，某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間段卻較短。當(dāng)被囊化的(encapsulated)抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持，由于在37℃暴露于濕氣(moisture)，它們可變性或聚集，導(dǎo)致失去生物活性并可能改變免疫原性。根據(jù)所涉及的機(jī)制可設(shè)計(jì)穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫代-二硫互換(interchange)形成的分子間S-S鍵，那么可通過(guò)修飾巰基殘基，在酸性溶液超低溫凍干(lyophilizing)，控制濕度含量，使用合適添加劑，并開(kāi)發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物，來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定化。
本文制劑也可包含一種以上對(duì)要治療的特定適應(yīng)癥必要的活性化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性但不負(fù)面影響彼此的那些。所述分子適合以達(dá)到目的的有效量聯(lián)合物存在，或可分別制劑(formulate)，并合并或以任何順序連續(xù)給藥。
例如，本發(fā)明IL-23的拮抗劑可與現(xiàn)在用于治療靶疾病和狀況的抗炎制劑和其它活性化合物聯(lián)合給藥。所述化合物包括皮質(zhì)類固醇；非類固醇(non-steroidal)的抗炎藥物(NSAID)，如阿司匹林，布洛芬(ibuprofen)，和COX-2抑制物，例如Celebrex和Vioxx；可改善疾病的(disease-modifying)抗類風(fēng)濕藥物(DMARDs)，如氨甲喋呤，來(lái)氟洛米(leflunomide)，柳氨磺吡啶(sulfasalazine)，硫唑嘌呤(azathioprine)，環(huán)孢菌素(cyclosporine)，羥氯喹啉(hydroxychloroquine)，和D-青霉胺；和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(modifier)(BRM)，如TNF和IL-1的抑制物。
提供如下實(shí)施例是為了闡述，而不是從任何一方面限制本發(fā)明范圍。
所有本說(shuō)明書(shū)引用的專利和參考文獻(xiàn)都全文引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1白介素-23(IL-23)促進(jìn)以白介素-17(IL-17)產(chǎn)生為特征的獨(dú)特的CD4T細(xì)胞活化狀態(tài)盡管IL-17由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生是清楚的，以前的報(bào)告并沒(méi)有提供它在以Th1和Th2為兩極的細(xì)胞因子圖譜范例內(nèi)的清楚分類。此實(shí)施例描述最初的試驗(yàn)是為了檢查應(yīng)答于與Th1或Th2反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)不同的(distinct from)信號(hào)來(lái)表達(dá)IL-17的可能性。
實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)物-從C57/BL-6小鼠制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，并通過(guò)密度梯度離心從懸浮的脾細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞。在多種刺激存在或缺無(wú)時(shí)(如圖說(shuō)明所指的時(shí)間)用IL-2(100單位/ml)培養(yǎng)2×106細(xì)胞/ml，之后收集細(xì)胞并用ELISA(R & D Systems，Mineapolis，MN)分析IL-17。所述樹(shù)突細(xì)胞來(lái)自巨噬細(xì)胞(從脾細(xì)胞懸液以粘附性細(xì)胞群獲得)，獲得它是通過(guò)用rGM-CSF(2ng/ml)和rIL-4(1000單位/ml)處理巨噬細(xì)胞4天，用LPS(0.5μg/ml)洗滌并重新活化。分離記憶和原初T細(xì)胞是如下進(jìn)行用CyC-CD4+PE-CD44或CyC-CD4+PE-CD62L染色從鼠脾細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞懸液分離的單個(gè)核細(xì)胞，并并分選CD4+細(xì)胞，CD44高/CD62L低是記憶表型或CD44低/CD62L高是原初表型。
體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化-用抗CD4的磁珠(Miltenyi Biotech)從野生型C57/BL6小鼠的脾純化CD4+細(xì)胞。通過(guò)在包被了5μg/ml抗CD3和1g/ml抗CD28的抗體的平板上劃線來(lái)活化純化的T細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)3天。所述培養(yǎng)物補(bǔ)充了IL-2，并用IL-12(20mM)+抗IL4(0.5μg/ml)(為了Th1分化)或IL-23(10nM)(為產(chǎn)生IL-17)來(lái)處理。在最初的活化后，充分洗滌所述細(xì)胞培養(yǎng)物并用抗CD3(1μg/ml)再刺激另外24小時(shí)，之后用ELISA分析細(xì)胞上清中的多種被分泌的細(xì)胞因子。
IL-12 p40抗體抑制IL-17誘導(dǎo)-將抗IL-12抗體(R & D Systems，目錄號(hào)(cat.no.)AF-419-NA)或無(wú)關(guān)的對(duì)照抗體(抗FGF-8b(R & D Systems，目錄號(hào)AF-423-NA)與IL-23(100ng/ml)或LPS-刺激的樹(shù)突細(xì)胞(10％v/v)的條件培養(yǎng)基在37℃預(yù)保溫1小時(shí)，再與從小鼠脾分離的單個(gè)核細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)保溫另外5-6天。收集上清并用ELISA測(cè)量IL-17水平。
純化IL-23-鼠IL-23-通過(guò)在人胚胎腎細(xì)胞(293個(gè)細(xì)胞)中共表達(dá)羧基末端His-標(biāo)記的p19和FLAG0標(biāo)記的p40來(lái)產(chǎn)生IL-23組分，并用鎳親合樹(shù)脂純化分泌的蛋白。低于0.2內(nèi)毒素單位/μg的內(nèi)毒素水平不可檢測(cè)。
結(jié)果首先，檢測(cè)多種微生物產(chǎn)物刺激IL-17產(chǎn)生的能力。近來(lái)Infante-Duarte等J Immunol 165，6107(2000)觀察到IL-17應(yīng)答于致萊姆病(Lyme disease)螺旋菌(spirochete)B.burgdorferi的微生物脂肽反應(yīng)而增加。存在多種微生物肽包括LPS(革蘭氏陰性細(xì)菌)，LTA(革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)或LBP(細(xì)菌脂肽)時(shí)，脾細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)產(chǎn)生IL-17(圖1)。純化的T細(xì)胞自身，或純化的巨噬細(xì)胞自身都不產(chǎn)生IL-17。在用平板結(jié)合的抗CD3與受體交聯(lián)，并用來(lái)自活化巨噬細(xì)胞/樹(shù)突細(xì)胞的上清處理后，純化的T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17增加，這表明存在由這些細(xì)胞釋放的未被鑒定的一或多種因子，該因子作用于T細(xì)胞上來(lái)促進(jìn)IL-17產(chǎn)生。
在繪圖(profile)可能負(fù)責(zé)促進(jìn)IL-17活性的候選分子的表達(dá)時(shí)，用實(shí)時(shí)RT-PCR觀察到在活化的樹(shù)突細(xì)胞中，IL-23組分p19和p40的mRNA表達(dá)增加了100-1000倍(B.Oppmann等，Immunty 13，715(2000))(未示)，從而檢查了IL-23的效果。
通過(guò)在人胚胎腎細(xì)胞(293個(gè)細(xì)胞)中共表達(dá)羧基末端的His-標(biāo)簽的p19和FLAG-標(biāo)記的p40來(lái)產(chǎn)生鼠IL-23組分，并用鎳親合樹(shù)脂來(lái)純化分泌的蛋白。低于0.2EU/μg的內(nèi)毒素水平不可檢測(cè)。在存在IL-2(100U/ml)和ConA(2.5μg/ml)時(shí)，在Th1誘導(dǎo)條件下(IL-12+抗IL-4)、Th2誘導(dǎo)條件下(IL-4+抗IFN-γ)，或與純化的IL-23(100ng/ml)保溫脾細(xì)胞培養(yǎng)物3-4天，之后洗滌所述培養(yǎng)物并用ConA再刺激另外24小時(shí)。用ELISA測(cè)量多種細(xì)胞因子的水平。低于ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的最低稀釋度水平被記錄為‘不可檢測(cè)的(N.D.)’。如下結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的試驗(yàn)。
在IL-12-刺激的Th1誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)脾細(xì)胞導(dǎo)致勉強(qiáng)在檢測(cè)限以上的(marginal)IL-17生成，而在Th2誘導(dǎo)條件下IL-17的產(chǎn)生不超過(guò)對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)下表1所示。
表1

培養(yǎng)物中存在的IL-23以劑量依賴方式導(dǎo)致高水平IL-17產(chǎn)生的(圖2)。IL-23也使GM-CSF水平高于在Th1誘導(dǎo)條件下觀察到的水平。相反，IFN-γ水平顯著低于在Th1誘導(dǎo)條件得到的水平。TNF-α水平與Th1條件類似。單獨(dú)的IL-12 p40不會(huì)使IL-17產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未示)。IL-23促進(jìn)IL-17mRNA水平升高(圖2B)。暴露于IL-23六小時(shí)以內(nèi)，IL-17mRNA的水平增加數(shù)百倍，并在IL-23持續(xù)存在時(shí)保持升高。存在抗IL-17的抗體不抑制此效果，這提示IL-17自身對(duì)此過(guò)程(process)沒(méi)有幫助(未示)。另外，近來(lái)鑒定的IL-17家族成員IL-17F的mRNA，也被發(fā)現(xiàn)應(yīng)答于IL-23而上調(diào)(圖2C)。
已經(jīng)報(bào)道IL-23促進(jìn)記憶的但非原初T細(xì)胞的增殖(D.M.Frucht，如上述)。因此，檢查了相對(duì)于IL-23對(duì)記憶T細(xì)胞群的影響而言，IL-23對(duì)原初T細(xì)胞群IL-17產(chǎn)生的影響。通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)從脾細(xì)胞分離純化的CD4+T細(xì)胞。選擇記憶細(xì)胞群為CD4+CD44高(R.C.Budd等，J Immunol138，3120(1987)，或CD4+CD62低(T.M.Jung，W.M.Gallatin，I.L.Weissman，M.O.Dailey，J Immunol 141，4110(1988))，并選擇原初細(xì)胞群為CD4+CD44低或CD4+CD62L高。如圖3所見(jiàn)，IL-23只在記憶細(xì)胞群(CD44高和CD62L低)而不在原初細(xì)胞(CD44低或CD62L高)中刺激IL-17的產(chǎn)生。
存在中和型IL-12抗體時(shí)，IL-23介導(dǎo)的IL-17產(chǎn)生被完全阻斷，該中和抗體與和IL-23共享的p40亞基相互作用(圖4A，左組)。因?yàn)榇嬖跓o(wú)關(guān)抗體時(shí)IL-17的產(chǎn)生無(wú)變化，所以此效果不是由于Fc受體連接到抗原遞呈細(xì)胞上。此抗體也抑制應(yīng)答與來(lái)自LPS刺激的樹(shù)突細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)觀察到的IL-17產(chǎn)生誘導(dǎo)的＞50％(圖4A，右圖)。缺乏IL-12 p40組分的小鼠(品系B6.129S1-IL12btmlJm)與野生型小鼠或缺乏IL-12 p35組分的小鼠(品系B6.129S1-IL12a)相比，前者脾細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)ConA刺激可見(jiàn)IL-17的產(chǎn)生明顯下降但不是完全缺無(wú)(abrogation)(圖4B)。
為了檢測(cè)IL-12在IL-17產(chǎn)生中的作用，將增加量的(0.001-1nM)鼠IL-12加入包含IL-23(1nM)的培養(yǎng)物。如圖5A所見(jiàn)，IL-12以劑量依賴方式降低IL-17的水平。
另外，用純化的IL-23處理脾細(xì)胞，該脾細(xì)胞來(lái)自缺乏IL-12受體β鏈2(IL-12Rβ2)的小鼠(Wu等，J Immunol 165，6221(2000))，所述IL-12受體β鏈2為IL-12的特異性受體組分(A.O.Chua，V.L.Wilkinson，D.H.Presky，U.Gubler，J Immunol 155，4286(1995))。IL-12Rβ2-/-小鼠的脾細(xì)胞應(yīng)IL-23刺激，IL-17產(chǎn)生增多超過(guò)了未經(jīng)刺激的對(duì)照(圖5B)，但是該刺激并不影響IFN-γ水平。令人驚異的是，這些小鼠的IL-17背景水平與野生型小鼠相比超過(guò)10倍，這表明IL-12可能負(fù)向(negative)調(diào)節(jié)IL-23誘導(dǎo)的IL-17產(chǎn)生。然而，與IL-12Rβ2敲除小鼠相反，我們未在IL-12p35敲除小鼠的脾培養(yǎng)物觀察到IL-17增加。此不同的原因未知，但可能與p35缺無(wú)時(shí)IL-12p40的功能改變、或遺傳背景或病原體暴露不同有關(guān)。
討論總而言之，這些數(shù)據(jù)提示了IL-23在促進(jìn)獨(dú)特T細(xì)胞活化狀態(tài)中的作用，所述T細(xì)胞表達(dá)IL-17作為效應(yīng)(effector)細(xì)胞因子。已描述Th1和Th2作為促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相對(duì)于體液的免疫反應(yīng)的示例。這些反應(yīng)分別提供了針對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病原體的重要防御，并且這些反應(yīng)任一中的缺陷都與對(duì)具體病原體的易感性增加有關(guān)。相反，IL-23可用來(lái)促進(jìn)對(duì)病原體的獲得性免疫反應(yīng)，該病原體的特征為嚴(yán)重地依賴被認(rèn)為主要用作先天免疫反應(yīng)介質(zhì)(mediator)的細(xì)胞。作為此反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，IL-17能夠通過(guò)誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞更迅速地募集(recruitment)。另外，對(duì)IL-23的反應(yīng)中觀察到高水平的GM-CSF產(chǎn)生，這可證明有另外的髓樣細(xì)胞(myeloid cell)產(chǎn)生。由局部IL-17刺激的基質(zhì)細(xì)胞(stromal cell)的G-CSF產(chǎn)生會(huì)使其進(jìn)一步增加。然而，此獲得性反應(yīng)的特征并非僅依賴于髓樣譜系(lineage)反應(yīng)的吞噬細(xì)胞，因?yàn)橐阎狪L-17促進(jìn)IL-17誘導(dǎo)ICAM，從而為進(jìn)一步的T細(xì)胞反應(yīng)提供重要的共刺激。
近來(lái)數(shù)項(xiàng)研究指出了p35缺陷的小鼠和p40缺陷的小鼠之間的顯著差別(Decken等，Infect Immun.664994-5000(2002)；Cooper等，J Immunol.1681322-1327(2002)；Elkins等，Infection & Immunity 701936-1948；Holscher等，J.Immunol.1676957-6966(2001))。這些研究都發(fā)現(xiàn)，通常在多種生物體模型(model organism)的免疫介導(dǎo)的清除(clearance)中缺失p40比缺失p35更有害。
IL-17的表達(dá)與數(shù)項(xiàng)嚴(yán)重炎性疾病相關(guān)提示IL-23的拮抗劑可以是治療這些疾病的有希望的候選藥物。
實(shí)施例2白介素-23(IL-23)缺陷的小鼠為進(jìn)一步研究IL-23與IL-17的體內(nèi)關(guān)系，比較IL-23缺陷的小鼠和IL-17缺陷的動(dòng)物的表型。
實(shí)驗(yàn)步驟小鼠在無(wú)特殊病原體(specific pathogen free)條件飼養(yǎng)(house)所有小鼠。從the Jackson laboratory(Bar Harbor，MA)獲得IL-12 p40-/-小鼠，并從CharlesRiver laboratories(San Diego，CA)獲得C57BL/6小鼠。
試劑除非另外指出，從如下供應(yīng)商購(gòu)買試劑從BD Pharmingen(SanDiego，CA)獲得抗體和ELISA試劑，從R & D systems(Minneapolis，MN)獲得細(xì)胞因子，從Biosearch Technologies(Novato，CA)獲得TNP-偶聯(lián)的抗原，從Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得組織培養(yǎng)試劑。
IL23 p19缺陷的小鼠的產(chǎn)生。用Genome Systems(Incyte Genomics，PaloAlto，CA)自基因組BAC文庫(kù)的克隆198a3分離包含鼠IL23 p19基因座的基因組DNA。用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)，從如下DNA片段構(gòu)建靶載體，該載體被設(shè)計(jì)為用EGFP報(bào)道基因來(lái)取代整個(gè)IL23 p19編碼區(qū)胸苷激酶選擇盒；由分別在遠(yuǎn)端和近端的內(nèi)源性SacII和Bgl II位點(diǎn)限定的5403堿基對(duì)的5′同源性臂；用BamHI(5′末端)和AflIII(3′末端)從pEGFP-1切割的EGFP表達(dá)盒(BD Clontech，Palo Alto，CA)；PGK-neo抗性盒；和由在近端的內(nèi)源性XhoI位點(diǎn)和在遠(yuǎn)端的引物5′-GCTTGGTGGCCCACCTATGAT-3′(SEQ ID NO1)限定的1203個(gè)bp的短臂(圖6A)。將此構(gòu)建體電穿孔到129/SvEv胚胎干(ES)細(xì)胞(Huang等，Science 2591742(1993))，用G418和Gancyclovir選擇后在600個(gè)克隆中的9個(gè)出現(xiàn)同源重組。為確認(rèn)正確靶向所述基因座，用southern印跡分析ES細(xì)胞和動(dòng)物的基因組DNA。用BamHI消化之后，使膜與探針1(用寡聚物(oligo)5′-AGACCCTCAAAGTTCATGAC-3′(有義)(SEQ ID NO2)和5′-CTGACGGCGCT TTCTCTACC-3′(反義)(SEQ ID NO3)通過(guò)PCR獲得的831bp的基因組DNA片段)雜交，產(chǎn)生了對(duì)于野生型等位基因7027bp的片段和對(duì)于正確靶向的突變等位基因11788bp的片段。類似地，用EcoRI消化基因組DNA之后，膜與探針2(用寡聚物5′-TTTTGCCAGTGGGATACACC-3′(有義)(SEQ ID NO4)和5′-AACTGCTGGGGCTGTTACAC-3′(反義)(SEQ ID NO5)通過(guò)PCR獲得的390bp的基因組DNA片段)雜交，野生型等位基因產(chǎn)生了9197bp的片段，正確靶向的突變等位基因產(chǎn)生了6211bp的片段。將兩個(gè)ES細(xì)胞克隆(lc5和3h6)注射到胚泡(blastocyst)，并獲得在其種系中傳遞了突變等位基因的嵌合動(dòng)物。對(duì)于常規(guī)基因分型(genotyping)，我們所用的基于PCR的方法使用了常用反義引物(5′-GCCTGGGCTCACTTTTTCTG-3′)(SEQ ID NO6)，和對(duì)野生型特異的有義引物(5′-GCGTGAAGGGCAAGGACACC-3′)(SEQ ID NO7)以及敲除-特異性有義引物(5′-AGGGGGAGGATTGGGAAGAC-3′(SEQ ID NO8))。此引物三聯(lián)體(triplet)對(duì)于野生型等位基因擴(kuò)增了210bp的片段，并對(duì)于突變等位基因擴(kuò)增了289bp的片段。在Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行PCR，其條件如下1個(gè)循環(huán)，94℃，60″；35個(gè)循環(huán)，94℃，30″，58℃，30″，72℃，60″；1個(gè)循環(huán)，72℃，7″。
血細(xì)胞亞型(subset)FACS分析從6-8周齡小鼠分離脾，胸腺和淋巴結(jié)，并用標(biāo)準(zhǔn)方法制備單個(gè)細(xì)胞懸液。通過(guò)心臟穿刺取外周血并用EDTA處理來(lái)避免凝固，用ACK裂解緩沖液(lysing buffer)(Biosource，Camarillo，CA)裂解紅細(xì)胞。所有細(xì)胞在冰上在補(bǔ)充了2％的熱滅活的胎牛血清的Hanks平衡的鹽溶液(HBSS)中保溫30分鐘。然后用偶聯(lián)了藻紅蛋白，生物素或CychromeTM的各種抗體以1μg/百萬(wàn)細(xì)胞在相同的緩沖液中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。使用生物素化的抗體時(shí)，用偶聯(lián)了鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)的PE-TR偶聯(lián)物(Caltag，Burlingame，CA)來(lái)檢測(cè)。用相同的緩沖液洗滌兩次后，用Epics-XL流式細(xì)胞儀(flow cytometry)系統(tǒng)(Beckman Coulter Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)檢測(cè)熒光。
刺激同種異型(allotypic)T細(xì)胞從6-8周齡balb/c小鼠的脾用兩步分離法分離CD4和CD62L雙陽(yáng)性T細(xì)胞。首先，用陰性磁選擇(magneticselection)(Miltenyi，Auburn，CA)除盡(deplete)其它細(xì)胞類型的T細(xì)胞。然后用抗CD4和CD62L的抗體標(biāo)記這些細(xì)胞并在MoFlo分選儀(sorter)(DakoCytomation，F(xiàn)ort Collins，CO)上用FACS分選。用兩步分離法分離均在C57BL/6背景中的野生型或IL-29 p19-/-小鼠的樹(shù)突細(xì)胞。用磁分離(magnetic separation)(Miltenyi，Auburn，CA)陽(yáng)性選擇CD11c陽(yáng)性脾細(xì)胞后，用抗CD11c，II類MHC，和CD8的抗體標(biāo)記所述細(xì)胞。然后用FACS，再用MoFlo分選儀分選CD11c+/MHC-II+/CD8-細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)中使用的群是純度至少98％。為誘發(fā)同種異型刺激(allostimulatory)反應(yīng)，在補(bǔ)充了青霉素-鏈霉素和10％熱滅活胎牛血清(clone，Logan，UT)的總共200μl IMDM中一式雙份保溫了104個(gè)樹(shù)突細(xì)胞和105個(gè)T細(xì)胞。有些情況下，加入100ng/ml的細(xì)菌脂肽來(lái)刺激樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。保溫5天后，取出120μl的上清來(lái)通過(guò)ELISA測(cè)量細(xì)胞因子，并置換為含有每孔1μCi3H-胸苷的新鮮培養(yǎng)基。16小時(shí)后用Top Count液體閃爍計(jì)數(shù)器(liquid scintillationcounter)(Packard Instruments，Meriden，CT)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)確定胸苷摻入。
體內(nèi)T細(xì)胞分化將75μg的匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpethemocyanin)(KLH)(Sigma，St.Louis，MO)諸如每組的四只雄和四只雌的小鼠左后足墊用于免疫，其中所述匙孔血藍(lán)蛋白在30μlCFA(BD Biosciences，SanDiego，CA)和PBS1∶1乳狀液中。5天后收獲引流的(Draining)腹股溝(inguinal)和腘窩(popliteal)淋巴結(jié)并在補(bǔ)充了青霉素-鏈霉素，10％的熱滅活胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，和25μg/ml KLH的IMDM中再刺激。就增殖試驗(yàn)而言，一式三份接種200μl的5×105個(gè)細(xì)胞到96孔板，使其增殖112小時(shí)，并在保溫階段的最后18小時(shí)每孔加入1μCi3H-胸苷。用Top Count液體閃爍計(jì)數(shù)器(Packard Instruments，Meriden，CT)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)確定胸苷摻入。就細(xì)胞因子分泌而言，在48孔板中保溫2.5×106個(gè)細(xì)胞1ml，并在72小時(shí)后收獲上清。通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞因子分泌。所示數(shù)據(jù)是三個(gè)完整試驗(yàn)的一個(gè)代表。
遲發(fā)型超敏反應(yīng)在每組6只小鼠的腹部三個(gè)位置經(jīng)皮下注射200μg甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)(Sigma，St.Louis，MO)，所述血清白蛋白混合在總量為200μl的CFA(BD Biosciences，San Diego，CA)和PBS的1∶1乳狀液中。在免疫后第8天，通過(guò)注射20μl 5mg/ml PBS中的mBSA到一個(gè)后(rear)足墊來(lái)攻擊所述小鼠，而給予另一后足墊20μl PBS。在攻擊后18，42，66小時(shí)用一系列裝了7根彈簧(7spring-loaded)的卡尺(caliper)(Mitutoyo，City ofIndustry，CA)測(cè)量足墊腫脹。通過(guò)注射了抗原和PBS的足墊之間的足墊厚度差別確定DTH反應(yīng)的強(qiáng)弱(magnitude)。
T依賴性體液反應(yīng)和免疫球蛋白分析為測(cè)量總免疫球蛋白水平，從8只雄的和8只雌的6-9周齡、各個(gè)基因型的未經(jīng)免疫的小鼠獲得血清。用Luminex珠試驗(yàn)(Upstate，Lake Placid，NY)測(cè)量總免疫球蛋白同種型的水平。為估計(jì)OVA特異性體液免疫反應(yīng)，在第0日(day 0)用CFA中的OVA免疫每種基因型的7只小鼠(4只雄的和3只雌的)，并在第21和42天用不完全福氏佐劑(IFA)(Sigma，St.Louis，MO)中的相同抗原對(duì)其加強(qiáng)免疫。為作血清分析，在免疫前和免疫后第14，28和49天通過(guò)眶后放血(retro-orbital bleeding)取血。以O(shè)VA作為俘獲制劑(capture agent)和檢測(cè)用的同種型特異性第二抗體，通過(guò)ELISA檢測(cè)OVA特異性免疫球蛋白同種型。為了在ELISA的線性范圍內(nèi)，如下稀釋血清樣本對(duì)于IgG1為1∶3125000，對(duì)于IgG2a為1∶25000，對(duì)于IgG2b為1∶625000，并且對(duì)于IgG3，IgM，IgA和IgE為1∶1000。因?yàn)榧兓腛VA特異性同種型不可購(gòu)，用得自以前實(shí)驗(yàn)的OVA-免疫小鼠的連續(xù)稀釋的血清作為標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果用任意單位(arbitrary unit)表示，其中最后放血(last bleed)的野生型組的均值被設(shè)為100。為評(píng)估記憶T細(xì)胞對(duì)于體液反應(yīng)的作用，在第0日用CFA中的OVA免疫任一基因型的5-6只小鼠的組，并在第21天用IFA中的TNP11-OVA對(duì)其加強(qiáng)免疫。為作血清分析，在免疫前和免疫后第14和28天通過(guò)眶后放血來(lái)取血。通過(guò)ELISA，用TNP28-BSA作為俘獲制劑和檢測(cè)用的同種型特異性第二抗體來(lái)檢測(cè)TNP特異性免疫球蛋白同種型。對(duì)于TNP-特異性IgG1，使用可購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于TNP-特異性IgG2a，使用從以前實(shí)驗(yàn)中的TNP免疫小鼠獲得的連續(xù)稀釋的血清，并如上述計(jì)算結(jié)果。樣本稀釋度對(duì)于IgG1為1∶31250并且對(duì)于IgG2a為1∶1250。
T非依賴性體液反應(yīng)用PBS中的50μg TNP1-LPS或100μgTNP20-AECM-Ficoll經(jīng)腹膜內(nèi)免疫每個(gè)基因型的6只小鼠的組。10天后收獲血清，并通過(guò)ELISA，用TNP28-BSA作為俘獲制劑和檢測(cè)用的IgM特異性第二抗體來(lái)分析TNP-特異性IgM。用TNP特異性IgM抗體作為ELISA的標(biāo)準(zhǔn)品樣本稀釋度對(duì)于Ficoll為1∶1280，對(duì)于LPS為1∶5120。
結(jié)果缺失IL-23 p19基因。為確定IL-23的非豐余(non-redundant)體內(nèi)效應(yīng)，產(chǎn)生了IL-23缺失但能夠產(chǎn)生IL-12的小鼠。構(gòu)建靶向載體，其中4個(gè)外顯子組成的p19完整編碼區(qū)被增強(qiáng)的GFP(eGFP)報(bào)道基因和新霉素抗性盒取代(圖6)。在兩個(gè)正確靶向的ES細(xì)胞克隆1c5和3h6得到種系傳遞，并用每個(gè)染色體3個(gè)標(biāo)記物高速同類系法(speed congenics)以將突變回交(backcross)到C57BL/6背景中?；诖朔治觯贿x擇來(lái)自129背景的遺傳污染對(duì)于實(shí)驗(yàn)而言少于5％的實(shí)驗(yàn)的小鼠。eGFP表達(dá)的模式與內(nèi)源性p19 mRNA(數(shù)據(jù)未示)可比。
IL-23 p19-/-小鼠無(wú)明顯表型。如IL-23/IL-12雙缺陷的IL-12 p40-/-小鼠的表型那樣，IL-23 p19-/-動(dòng)物不表現(xiàn)任何明顯表型，其出生符合孟德?tīng)栴l率(mendelian frequencies)。經(jīng)組織病理檢查未發(fā)現(xiàn)器官異常，并且進(jìn)一步分析臨床化學(xué)和血液參數(shù)發(fā)現(xiàn)野生型和敲除動(dòng)物之間無(wú)差異。另外，IL-23 p19-/-小鼠的大小和體重正常，并且兩性都是完全可育的。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析胸腺細(xì)胞，脾細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的多種細(xì)胞表面標(biāo)記物表明，野生型和IL23 p19-/-動(dòng)物之間無(wú)任何顯著不同(表2)。因?yàn)橐阎狪L-23作用于記憶T細(xì)胞，我們測(cè)定了每個(gè)亞型的記憶細(xì)胞(CD44高CD62L-)與原初(CD62L+)細(xì)胞的比率，但野生型和IL-23 p19-/-小鼠之間未發(fā)現(xiàn)不同。在整個(gè)分析中，兩個(gè)基因型之間唯一可見(jiàn)的不同在于樹(shù)突細(xì)胞亞群略偏向CD8+表型。在此效應(yīng)不明顯(minor)時(shí)，由于數(shù)據(jù)的緊密性(tightness)它具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義，這與近來(lái)觀察到的IL-23對(duì)抗原遞呈細(xì)胞有作用是一致的。總而言之，正常發(fā)育沒(méi)有顯示需要IL-23，并且引入eGFP盒不會(huì)對(duì)任何所檢驗(yàn)的細(xì)胞類型有毒性作用。
表2胸腺 野生型 敲除 P(diff.)CD4+ 5.7 +/- 0.55.5 +/- 0.0 0.504CD8+ 3.3 +/- 0.13.1 +/- 0.3 0.397DN25.0 +/- 4.217.0 +/- 8.0 0.202.
DP65.9 +/- 3.774.3 +/- 8.0 0.174脾野生型 敲除 P(diff.)CD4+2 4.3 +/- 0.822.5 +/- 2.7 0.342％naive 69.0 +/- 1.367.5 +/- 2.1 0.090％memory 29.1 +/- 1.231.0 +/- 1.9 0.029CD8+ 15.2 +/- 1.212.3 +/- 2.0 0.101％naive 64.1 +/- 5.467.0 +/- 2.8 0.199％memory 18.1 +/- 1.818.3 +/- 1.4 0.0841-A(b)+/CD11c +2.0 +/- 0.22.2 +/- 0.2 0.041％CD8+12.8 +/- 0.916.3 +/- 1.7 0.000％CD8-87.2 +/- 0.983.6 +/- 1.8 0.000CD19+ 52.4 +/- 2.055.2 +/- 6.5 0.512B220+ 52.0 +/- 2.055.5 +/- 5.3 0.360NK1.1+3.2 +/- 0.12.8 +/- 0.1 0.055外周血野生型 敲除 P(diff.)CD3+ 47.9 +/- 2.644.9 +/- 3.6 0.053CD4+ 28.2 +/- 2.326.9 +/- 2.5 0.270CD8+ 16.5 +/- 0.815.6 +/- 1.7 0.150CD19+ 43.2 +/- 3.245.2 +/- 3.6 0.215B220+ 44.9 +/- 3.546.4 +/- 4.8 0.466DX5+ 9.9 +/- 3.09.7 +/- 5.0 0.929CD16+ 8.0 +/- 0.98.6 +/- 1.5 0.3021-A(b)+ 44.0 +/- 1.945.4 +/- 4.9 0.428IL-23 p19-/-小鼠的體液免疫反應(yīng)。為確定IL-23在產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)中的作用，首先測(cè)量任何基因型的16只小鼠血清中的所有免疫球蛋白同種型總水平。野生型和IL-23 p19-/-小鼠之間沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的不同(圖7)，這表明IL-23不是保持正常的免疫球蛋白水平必需的。另外，我們確定了IL-23是否參與產(chǎn)生針對(duì)在佐劑中遞送的蛋白抗原的T依賴性體液反應(yīng)。至此為止，用卵清蛋白(OVA)免疫每組7只小鼠，，并在兩次連續(xù)免疫的每一次之后(圖8)估計(jì)前血清(preserum)中OVA-特異性免疫球蛋白同種型(都為陰性，數(shù)據(jù)未示)。初次免疫后，所有組的OVA特異性IgG1，IgG2b，IgG3，和IgE都無(wú)顯著不同。然而，初次免疫后觀察到IL-23 p19-/-和IL-12 p40-/-動(dòng)物的OVA特異性IgG2a和IgA水平顯著下降。如預(yù)期那樣，再次免疫后所有同種型的水平都急劇升高。此時(shí)，IL-23 p19-/-和IL-12 p40-/-小鼠顯示所有被檢測(cè)的同種型明顯下降。這兩個(gè)基因型之間的不同通常并不顯著，這表明內(nèi)源性IL-12在IL-23缺無(wú)的體液反應(yīng)中不起主要作用。
因?yàn)轶w液免疫反應(yīng)依賴于B和T細(xì)胞的適當(dāng)功能，隨后我們意圖確定是什么機(jī)制使IL-23起刺激作用。為確定B細(xì)胞功能是否直接受IL-23缺無(wú)的影響，我們測(cè)定了IL-23缺陷的小鼠啟動(dòng)(mount)抗T非依賴性(TI)抗原的B細(xì)胞反應(yīng)的能力。TI-1抗原三硝基苯基-(TNP-)LPS導(dǎo)致經(jīng)由CD14和TLR4激活B細(xì)胞，而TI-2抗原TNP-Ficoll通過(guò)表面B細(xì)胞受體簇集(clustering)激活B細(xì)胞。IL-23 p19-/-小鼠啟動(dòng)了對(duì)兩種抗原的正常B細(xì)胞反應(yīng)(圖9)，表明IL-23在T非依賴性B細(xì)胞反應(yīng)中不起作用。另外，IL-23 p19-/-小鼠的B細(xì)胞應(yīng)LPS，抗IgM，和抗CD40在體外正常增殖，并且應(yīng)IL-4經(jīng)歷正常同種型轉(zhuǎn)換(switching)(未示)。IL-23刺激B細(xì)胞不使增殖或同種型轉(zhuǎn)換增加(未示)，因此我們得出結(jié)論IL-23不直接影響B(tài)細(xì)胞功能。
因?yàn)轶w液免疫反應(yīng)主要在再次免疫階段被削弱(compromise)，并因?yàn)锽細(xì)胞功能在IL-23 p19-/-小鼠表現(xiàn)正常，我們假設(shè)可能由于抗原特異性輔助性T細(xì)胞的低效(inefficient)再活化而造成此表型。為更直接說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題，我們?cè)诘?天用OVA免疫了數(shù)個(gè)5-6只小鼠的組，之后用TNP偶聯(lián)的OVA在第14天再次免疫。用此免疫方案(regimen)，經(jīng)由再次免疫再次活化對(duì)OVA特異的記憶T細(xì)胞，但在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)只有新的一組對(duì)TNP有特異性的B細(xì)胞被活化。因此，所述OVA特異性記憶B細(xì)胞亞型不對(duì)TNP-特異性免疫球蛋白的形成起作用。增強(qiáng)(booster)后7天，我們測(cè)定了血清中的TNP特異性IgG1和IgG2a，并且發(fā)現(xiàn)兩種同種型都在IL-23 p19-/-小鼠顯著降低(圖10A，B)。此結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了IL-23在T依賴性B細(xì)胞反應(yīng)中的重要性。
IL-23 p19-/-小鼠中的遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)。為進(jìn)一步調(diào)查記憶CD4+細(xì)胞在IL-23 p19+/-小鼠的作用，評(píng)估這些動(dòng)物啟動(dòng)DTH反應(yīng)的能力。DTH反應(yīng)為強(qiáng)T細(xì)胞依賴性，過(guò)去報(bào)道它在IL-12 p40-/-小鼠是缺陷的(defective)，但在缺無(wú)IL-12 p35的小鼠中呈正常，這提示它們可能被IL-23介導(dǎo)。針對(duì)此問(wèn)題，我們用完全福氏佐劑(CFA)中的甲基化BSA(mBSA)使野生型，IL-23p19-/-，和IL-12 p40-/-組(每組6只)的動(dòng)物致敏，并在7天后通過(guò)注射mBSA到足墊來(lái)誘發(fā)DTH反應(yīng)。為作非特異性腫脹的對(duì)照，我們也攻擊了一組未致敏化的野生型小鼠。攻擊后18，42，和66小時(shí)測(cè)量特異性足墊腫脹，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，特異性足墊腫脹可在IL-12 p40-/-和IL-23 p19-/-小鼠以類似程度被抑制(圖11)。動(dòng)力學(xué)也是類似的，在IL-12 p40-/-和IL-23 p19-/-小鼠都顯示在42和66而不是18小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)有力地減輕腫脹。因此，IL-23是DTH反應(yīng)的主要介質(zhì)，并且IL-23缺陷導(dǎo)致記憶CD4+T細(xì)胞反應(yīng)低效。
IL-23 p19-/-樹(shù)突細(xì)胞刺激T細(xì)胞的能力。為排除在IL-23 p19-/-小鼠觀察到的缺陷是由于IL-23缺陷抗原遞呈細(xì)胞的低效T細(xì)胞引發(fā)造成的可能性，我們又觀察了IL-23 p19-/-DC刺激分離自balb/c小鼠脾的同種型原初CD4+T細(xì)胞的能力。缺無(wú)DC時(shí)，這些T細(xì)胞既不增殖也不分泌可觀察量的細(xì)胞因子(圖12A)。加入任一種基因型的DC使得兩種基因型強(qiáng)(robust)增殖并產(chǎn)生IL-2。我們已經(jīng)顯示IL-23是IL-17的有效(potent)誘導(dǎo)物，之后我們又用細(xì)菌脂肽誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-23，所述細(xì)菌脂肽是有效的Toll-樣受體-(TLR-)2激動(dòng)劑和產(chǎn)生IL-23的誘導(dǎo)物。所以這種情況下，wt DC有力地誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17(圖12A，底組)，而用IL-23 p19-/-DC刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生明顯更少的IL-17。為在更生理化的設(shè)置(more physiological setting)中確認(rèn)這些觀察數(shù)據(jù)，我們又用完全福氏佐劑(CFA)中的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)免疫數(shù)個(gè)8只小鼠的組來(lái)誘發(fā)體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)。5天后收獲引流的淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)并用KLH在體外再刺激。我們又觀察到從IL-23 p19-/-小鼠收獲的LNC產(chǎn)生明顯更少的IL-17(圖12B，底組)。兩個(gè)基因型中的LNC增殖是可比的(圖12B，頂組)，這表明wt和IL-23 p19-/-小鼠啟動(dòng)了針對(duì)所述抗原的強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)。因此，IL-23缺陷不嚴(yán)重(grossly)損害樹(shù)突細(xì)胞的刺激能力，但使T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17減少。
討論用IL-23 p19缺陷的小鼠評(píng)估IL-23的并不豐富體內(nèi)功能，發(fā)現(xiàn)IL-23缺陷使T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)，如體液免疫反應(yīng)和DTH反應(yīng)減弱。
在IL-23 p19-/-小鼠觀察到顯著降低的體液免疫反應(yīng)，它影響到所有的免疫球蛋白同種型。同樣(in parallel)，IL-12 p40-/-小鼠的反應(yīng)被抑制到類似或稍高水平。我們的結(jié)果支持如下結(jié)論即有效的體液反應(yīng)絕對(duì)需要IL-23，而仍需要通過(guò)使用IL-12 p35-/-小鼠來(lái)確定是否IL-23對(duì)于IL-12缺無(wú)時(shí)的正常體液反應(yīng)是足夠的。
總而言之，IL23 p19-/-小鼠的體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)減弱，其明顯表現(xiàn)為DTH和體液免疫反應(yīng)減弱，并且在表型上類似IL-17缺陷的小鼠。我們的結(jié)果表明，臨床給藥IL-23或其激動(dòng)劑可能有益于在免疫方案和免疫受損的病人中支持T細(xì)胞。
雖然已經(jīng)參考被認(rèn)為是具體的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，仍應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案。相反，本發(fā)明應(yīng)包括在所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的多種修改和等同替代。
序列表<110>Gurney，Austin<120>IL-17產(chǎn)生的抑制<130>39766/0125<140>未知<141>2003-10-30<150>60/423,090<151>2002-10-30<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gcttggtggc ccacctatga t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2agaccctcaa agttcatgac 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgacggcgc tttctctacc 20
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ttttgccagt gggatacacc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5aactgctggg gctgttacac 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gcctgggctc actttttctg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gcgtgaaggg caaggacacc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8agggggagga ttgggaagac 20
權(quán)利要求
1.抑制T細(xì)胞產(chǎn)生白介素-17(IL-17)的方法，其包括用白介素-23(IL-23)的拮抗劑處理所述T細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞是經(jīng)活化的T細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞是記憶細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述處理在體內(nèi)進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述處理在哺乳動(dòng)物受試者中進(jìn)行。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是人。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述拮抗劑是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體是抗體片段。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗體片段選自Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，或F(ab′)2。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體是全長(zhǎng)抗體。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體是嵌合的抗體。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體是人抗體。
14.治療哺乳動(dòng)物受試者中的炎性疾病的方法，所述炎性疾病特征在于白介素17(IL-17)的表達(dá)升高，所述方法包括給藥所述受試者有效量的白介素-23(IL-23)的拮抗劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是人。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述炎性疾病選自慢性炎癥，自身免疫性糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，類風(fēng)濕性脊椎炎，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，及其它關(guān)節(jié)炎疾病，多發(fā)性硬化(MS)，哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，成人型呼吸窘迫綜合征，白塞病，牛皮癬，慢性肺炎性疾病，移植物抗宿主反應(yīng)，克隆氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎癥性腸病(IBD)，阿爾茨海默病，或發(fā)熱。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述炎性疾病是慢性炎性疾病。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述慢性炎性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，移植物抗宿主反應(yīng)，多發(fā)性硬化(MS)，或牛皮癬。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述拮抗劑是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是抗體片段。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗體片段選自Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，或F(ab′)2。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是全長(zhǎng)抗體。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是嵌合的抗體。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是人抗體。
26.權(quán)利要求15的方法，其中所述拮抗劑與另外的治療劑聯(lián)用給藥。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述另外的治療劑是抗炎分子。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗炎分子選自皮質(zhì)類固醇或非類固醇抗炎藥(NSAID)。
29.鑒定抗炎制劑的方法，其包括如下步驟(a)在存在或缺無(wú)候選分子時(shí)，將T細(xì)胞培養(yǎng)物與IL-23保溫；(b)監(jiān)測(cè)所述培養(yǎng)物中IL-17的水平；以及(c)如果在所述候選分子存在時(shí)的IL-17水平比該候選分子缺無(wú)時(shí)的IL-17水平低，將所述候選分子鑒定為抗炎制劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述候選分子是非肽小有機(jī)分子。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述候選分子是肽。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述候選分子是多肽。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述候選分子是抗體。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述T細(xì)胞是活化的T細(xì)胞。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述T細(xì)胞是記憶細(xì)胞。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述IL-17的水平用ELISA監(jiān)測(cè)。
37.抗炎制劑，其用權(quán)利要求29的方法鑒定。
38.誘導(dǎo)在哺乳動(dòng)物受試者中產(chǎn)生IL-17的方法，其包括給藥所述受試者IL-23的激動(dòng)劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是人。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述人受試者已經(jīng)暴露于細(xì)菌感染。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述人受試者已經(jīng)暴露于由結(jié)核分枝桿菌造成的感染。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述IL-23的激動(dòng)劑是抗體。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體是抗體片段。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗體片段選自Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′或F(ab′)2。
46.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體是全長(zhǎng)抗體。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體是嵌合的抗體。
48.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。
49.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體是人抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用白介素－23(IL－23)的拮抗劑來(lái)抑制T細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子白介素－17(IL－17)。本發(fā)明還涉及IL－23的拮抗劑在治療炎性疾病中的用途，所述疾病的特征是存在升高水平的IL－17。IL－23的拮抗劑包括但不限于，特異性結(jié)合亞基或IL－17或IL－17受體的抗體。本發(fā)明另外涉及通過(guò)使用IL－23的激動(dòng)劑來(lái)誘導(dǎo)IL－7的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C07K16/24GK1711282SQ200380102707
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月30日
發(fā)明者奧斯汀·L·格尼 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司