專利名稱：改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)使用表達(dá)豆血紅蛋白和/或血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物而改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量的方法、涉及對(duì)應(yīng)植物并涉及它們的用途。
植物中的貯藏儲(chǔ)備物充當(dāng)儲(chǔ)備物質(zhì)，由植物組織形成，并沉積于胞內(nèi)。貯藏儲(chǔ)備物的實(shí)例是多糖(碳水化合物如地衣淀粉、淀粉、糖原、多聚果糖)、蛋白質(zhì)、脂肪、多磷酸鹽和多羥基鏈烷酸酯。如果需要，貯藏儲(chǔ)備物可返回至新陳代謝和高能物質(zhì)(energetics)，例如當(dāng)缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)、在種子萌芽、生長(zhǎng)和其它消耗能量的過(guò)程期間。
貯藏儲(chǔ)備物是有價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)原料(谷類、堅(jiān)果、水果、香料等)，構(gòu)成許多人類食物的基礎(chǔ)，并且也可提供工業(yè)脂肪和油類。由于其藥理活性成分，一些貯藏儲(chǔ)備物當(dāng)作藥物使用(來(lái)源CD Rmpp Chemie Lexikon-Version 1.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1995)。
為了工業(yè)目的，貯藏儲(chǔ)備物也日益用于可更新和生態(tài)上可接受的原料，例如通過(guò)使用淀粉而產(chǎn)生包裝材料，或例如使用植物油作為燃料，如作為生物柴油(biodiesel)或潤(rùn)滑劑。
公知的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物(也見(jiàn)新陳代謝)(例如色素、毒素、精油、生物堿、果酸)通常不屬于貯藏儲(chǔ)備物(來(lái)源Rmpp Lexikon Chemie-Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1999“Reservestoffe”[貯藏物質(zhì)])。
在植物中，貯藏儲(chǔ)備物由種子或貯藏器官中的碳水化合物前體形成。蔗糖是碳和能量的主要來(lái)源，由葉輸送至生長(zhǎng)中的種子或貯藏器官。葉中的蔗糖從由光合作用獲得的淀粉而形成。輸送至生長(zhǎng)中的種子的蔗糖不僅用于合成貯藏脂類的脂肪酸，而且合成貯藏蛋白質(zhì)和貯藏淀粉。
例如，種子包含總共三個(gè)不同形式的貯藏儲(chǔ)備物貯藏脂類、貯藏蛋白質(zhì)和淀粉。三種貯藏儲(chǔ)備物之間的比例根據(jù)植物的不同而有所改變。因此，例如，根據(jù)干物質(zhì)，油料種子油菜(oilseed rape)品種包含約48％貯藏脂類、19％淀粉和21％貯藏蛋白質(zhì)，而大豆包含22％脂類，12％淀粉和37％蛋白質(zhì)(Biochemistry & Molecular Biology of the Plant，Buchanan，Gruissem，Jones編輯，2000，American Society of Plant Physiologists)。
從植物油(脂類)中獲得的脂肪酸是特別令人感興趣的。例如，它們可用于增塑劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑、化妝品等的原料，或者用于食品和飼料工業(yè)中的有價(jià)值原料。因此，既然有生產(chǎn)表面活性劑的特殊需要，例如，提供具有中鏈脂肪酸的菜籽油是特別有益的。
借助于重組方法，植物代謝途徑的靶向調(diào)整可允許植物的新陳代謝有利地以某種方式得到改變，其中不管怎樣，如果采用傳統(tǒng)養(yǎng)育方法，這種方式僅可通過(guò)艱苦的步驟得到實(shí)現(xiàn)。因此，例如，稀有脂肪酸例如某些多不飽和脂肪酸僅在某些植物中合成或從不合成，并因此通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)所討論的酶(例如Millar等，(2000)Trends Plant Sci 595-101)而以靶向的方式產(chǎn)生。
作為貯藏儲(chǔ)備物，淀粉不僅貯藏于種子中，也貯藏于其它貯藏器官中。淀粉的重要貯藏器官是下胚軸和根。薄壁組織皮質(zhì)細(xì)胞的增加和擴(kuò)大產(chǎn)生塊根，如馬鈴薯塊莖；根頸的膨脹產(chǎn)生塊根作物，如甜菜或薯蕷。
因此，例如淀粉是馬鈴薯干物質(zhì)的主要成分。除了用作糧食外，因此馬鈴薯也用作飼料和獲得淀粉和醇的原料。1988年，全球收獲2.697億噸馬鈴薯(來(lái)源CD Rmpp Chemie Lexikon-Version 1.0，Stuttgart/NewYorkGeorg Thieme Verlag 1995)。
專利US6,372,961、WO98/12913和WO00/00597描述了使用血紅蛋白或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)(肌紅蛋白、細(xì)菌血紅蛋白)以增加植物中氧氣的同化作用。這旨在提高對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因植物的萌芽或高能物質(zhì)，以及甚至在低氧條件下保證正常生長(zhǎng)。也認(rèn)為產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的量得到增加((WO 98/12913，第6頁(yè)第24行)。貯藏儲(chǔ)備物的產(chǎn)量增加在這些公開(kāi)中并不明顯。
因此，本發(fā)明的目的是增加植物貯藏器官中的貯藏儲(chǔ)備物的含量，以實(shí)現(xiàn)較好地利用栽培、肥料等的區(qū)域，并且依靠植物獲得更高的產(chǎn)量。特別地，用于提高或使生產(chǎn)淀粉或油成為可能。
根據(jù)本發(fā)明改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量的方法，通過(guò)采用表達(dá)豆血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，可實(shí)現(xiàn)本目的。通過(guò)表達(dá)豆血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物和它們的應(yīng)用，也可實(shí)現(xiàn)本目的。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)通過(guò)表達(dá)豆血紅蛋白，可產(chǎn)生包含貯藏儲(chǔ)備物的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中由于它們(更高的)的貯藏儲(chǔ)備物含量，這些植物可更好地使用栽培、肥料等的區(qū)域，以及因此獲得更高產(chǎn)量的貯藏儲(chǔ)備物，特別是淀粉和油。因此，根據(jù)本發(fā)明，使用這些植物而在經(jīng)濟(jì)上獲利是可能的。
豆血紅蛋白屬于血紅蛋白蛋白質(zhì)家族，其功能是氧氣的可逆結(jié)合和供給。它起源于豆類植物(豆科植物)的根瘤，并且以紅色物質(zhì)的形式存在，其可得到分離，并與脊椎動(dòng)物的肌紅蛋白類似。與O2可逆結(jié)合的結(jié)果是，當(dāng)根瘤菌固定氮時(shí)，豆血紅蛋白可保證高氧需求。由植物細(xì)胞形成脫輔基蛋白質(zhì)和由細(xì)菌形成血紅素(來(lái)源CD Rmpp Chemie Lexikon-Version1.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1995)。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的形式中，根據(jù)本發(fā)明改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量的方法中，采用表達(dá)血紅蛋白或豆血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。因此，本發(fā)明也涉及表達(dá)豆血紅蛋白和/或血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物和它們的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，將血紅蛋白理解為原卟啉的鐵(II)復(fù)合體。
在本申請(qǐng)中，表達(dá)理解為將起始DNA或RNA的遺傳信息轉(zhuǎn)移至基因產(chǎn)物(多肽或蛋白質(zhì)，在本文中是豆血紅蛋白或血紅蛋白)，并且也意指包含術(shù)語(yǔ)過(guò)量表達(dá)，以便以更高的量產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)或天然存在的蛋白質(zhì)，或在宿主細(xì)胞的總蛋白質(zhì)含量中占大部分，其中的過(guò)量表達(dá)意為表達(dá)增加。
轉(zhuǎn)化理解為將遺傳信息轉(zhuǎn)移至生物體，特別是植物。這意味著包括引入所有對(duì)熟練工作人員所公知信息的方法，例如顯微注射、電穿孔、粒子轟擊、農(nóng)桿菌或化學(xué)介導(dǎo)的攝入(例如聚乙二醇介導(dǎo)的DNA攝入、或通過(guò)碳酸硅纖維技術(shù))。遺傳信息可引入細(xì)胞，例如以DNA、RNA、質(zhì)?；蛞匀魏纹渌绞剑⑶乙酝ㄟ^(guò)重組摻入宿主基因組的方式，或以游離形態(tài)或獨(dú)立地作為質(zhì)粒存在。為了本發(fā)明的目的，因此轉(zhuǎn)化植物是經(jīng)遺傳修飾的植物。
貯藏儲(chǔ)備物理解為多糖，優(yōu)選的是碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、多磷酸鹽和多羥基鏈烷酸酯，特別優(yōu)選的是地衣淀粉、淀粉、糖原、多聚果糖。
在所提到的化合物中，碳水化合物和脂肪是非常特別地優(yōu)選的。最優(yōu)選的為貯藏儲(chǔ)備物是淀粉和油。
淀粉是熟練工作人員所公知的，對(duì)進(jìn)一步的信息，可參考RmppChemie Lexikon-CD Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg ThiemeVerlag 1999。
對(duì)于本發(fā)明的目的，“油”包含中性和/或極性脂類以及這些的混合物。表1中提到的那些以實(shí)例的方式給出，而不用于限制。
表1植物脂類的分類
中性脂類優(yōu)選地表示三酰甘油。不但中性脂類而且極性脂類也包含廣譜的不同脂肪酸。表2中提到的脂肪酸以實(shí)例的方式給出，而不是用于限制。
表2多種脂肪酸的概述(選擇)1鏈長(zhǎng)度雙鍵數(shù)目*植物中非天然存在的
對(duì)于進(jìn)一步的信息，也可參考Rmpp Chemie Lexikon-CD Version2.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1999。
根據(jù)本發(fā)明，所有植物適于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。
“植物”包含所有一年生和多年生的單子葉和雙子葉植物，并且以舉例而非限制的方式包括南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、核桃屬(Juglans)、草霉屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼佗羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)，太陽(yáng)花屬(Solarium)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬郁蘭屬(Majorana)、菊苣屬(Cichorium)，向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門(mén)冬屬(Asparagus)、金魚(yú)草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛莨屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、玉米屬(Zea)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)、云杉屬(Picea)及楊屬(Populus)。
優(yōu)選的植物來(lái)自于下述科的植物莧科(Amaranthaceae)、菊科(Asteraceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、石竹科(Carophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、蝶形花業(yè)科(Papilionoideae)、百合科(Liliaceae)、亞麻科(Linaceae)、錦葵科(Malvaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、番杏科(Tetragoniaceae)、山茶科(Theaceae)、傘形科(Umbelliferae)。
特別地，優(yōu)選的單子葉植物從單子葉作物植物選擇，如，禾本科(Graminae)如水稻、玉米、小麥、或其它谷類物種如大麥、小米和高梁、黑麥、黑小麥或燕麥，或甘蔗以及所有種類的草。本發(fā)明非常特別地更適宜應(yīng)用于雙子葉植物生物體。特別地，優(yōu)選的雙子葉植物從雙子葉作物植物中選擇，如，-菊科如向日葵、萬(wàn)壽菊屬或金盞草等。
-菊科，尤其是萵苣屬(Lactuca)，非常尤其是萵苣(Lactuca sativa)等。
-十字花科，尤其是蕓苔屬，非常特別的是歐洲油菜(Brassica napus)(油菜籽)、蕓苔(Brassica campestris)(甜菜)、Brassica oleracea cv Tastie(甘藍(lán))、Brassica oleracea cv Snowball Y(花椰菜)和Brassica oleracea cvEmperor(嫩莖花椰菜)和其它甘藍(lán)；以及擬南芥屬，非常特別的是擬南芥菜和水芹或卡諾拉油菜(Canola)等。
-葫蘆科，如甜瓜、南瓜或胡瓜等。
-豆科，特別是大豆屬(Glycine)，非常特別的是Glycine max(大豆)、黃豆和苜蓿、豌豆、黃豆或花生等。
-茜草科，優(yōu)選的是唇形亞綱(Lamiidae)，如小果咖啡(Coffeaarabica)或大果咖啡(Coffea liberica)等。
-茄科，特別是番茄屬(Lycopersicon)，非常特別的是Lycopersiconesculentum(番茄)；茄屬(Solanum)，非常特別的是Solanum tuberosum(馬鈴薯)和Solanum melongena(茄)、以及煙草或紅辣椒等。
-梧桐科，優(yōu)選的是五椏果亞綱(Dilleniidae)，如可可樹(shù)等。
-山茶科，優(yōu)選的是五椏果亞綱，如茶(Camellia sinensis或Theasinensis)等。
-傘形科，特別是胡蘿卜屬(非常特別的是胡蘿卜)和芹菜(非常特別的是graveolens dulce(芹菜))等；和辣椒屬，非常特別的是辣椒屬(胡椒)等。
以及亞麻子、大豆、棉花、大麻、亞麻、黃瓜、菠菜、胡蘿卜、甜菜和多種樹(shù)、堅(jiān)果和葡萄樹(shù)物種，特別是香蕉和獼猴桃。
也包括裝飾性植物、有用的或裝飾性的樹(shù)、花、切花、灌木或草皮。通過(guò)實(shí)例而不限制的所提到植物是被子植物、苔蘚植物，例如苔類(苔類)和蘚綱(苔蘚)，蕨類植物如蕨、馬尾和石松，裸子植物如針葉樹(shù)、蘇鐵科植物、銀杏和Gnetalae，薔薇科(Rosaceae)如玫瑰，杜鵑花科(Ericaceae)如杜鵑花及azaleas，大戟屬(Euphorbiaceae)如猩猩木及巴豆，石竹科(Caryophyllaceae)如康乃馨，茄科(Solanaceae)如牽牛花，苦苣臺(tái)科(Gesneriaceae)如非洲堇、鳳仙花科(Balsaminaceae)如勿碰我，蘭科(Orchidaceae)如蘭花，鳶尾科(Iridaceae)如洋蔥(gladioli)、鳶尾、小蒼蘭及番紅花，菊科(Compositae)如金盞草、牻牛兒苗科(Geraniaceae)如天竺葵，百合科(Liliaceae)如龍血樹(shù)，?？?Moraceae)如無(wú)花果，天南星科(Araceae)如喜林芋屬(philodendron)等。
此外，為本發(fā)明之目的的植物生物體是更多具有光合作用活性的生物體，如藻類、藍(lán)藻類細(xì)菌和苔蘚。優(yōu)選的藻類是綠藻如紅球藻屬(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、團(tuán)藻(Volvox)或杜氏藻(Dunaliella)。特別優(yōu)選的藻類是集胞藻屬(Synechocystis)。
最優(yōu)選的是油料植物，即已經(jīng)具有天然高油含量和/或用于工業(yè)產(chǎn)油的植物。這些植物具有高油含量和/或具有工業(yè)利益的特定脂肪酸組分。優(yōu)選的植物具有至少1％的脂類含量。油料植物包含例如Borago officinalis(琉璃苣)；蕓苔屬如蕓苔、歐洲油菜、芫青(B.Rapa)(芥菜或油料種子油菜)；Cannabis sativa(大麻)；Carthamus tinctorius(紅花)；Cocos nucifera(椰子)；Crambe abyssinica(海甘藍(lán))；萼距花屬(Cuphea)(萼距花屬物種提供中等鏈長(zhǎng)脂肪酸，特別是用于工業(yè)應(yīng)用)；Elaeis guinensis(非洲油棕)；Elaeis oleifera(美洲油棕)；Glycine max(大豆)；Gossypium hirsutum(美洲棉花)；Gossypium barbadense(埃及棉花)；Gossypium herbaceum(亞洲棉花)；Helianthus annuus(向日葵)；Linum usitatissimum(亞麻子或亞麻)；Oenothera biennis(月見(jiàn)草)；Olea europea(橄欖)；Oryza sativa(稻)；Ricinus communis(蓖麻)；Sesamum indicum(芝麻)；Glycine max(大豆)；小麥屬物種(小麥)；Zea mays(玉米)和多種堅(jiān)果物種如胡桃或杏仁。
如果使用的植物屬于豆科屬(豆類植物)的植物，本發(fā)明的范圍包括外源蛋白質(zhì)(豆血紅蛋白、血紅蛋白)即如共生生物一樣非天然存在的血紅蛋白和/或豆血紅蛋白的表達(dá)，或以過(guò)量表達(dá)天然存在的豆血紅蛋白的這種方式而修飾的植物。
最優(yōu)選的是馬鈴薯、擬南芥和油料種子油菜。
上述植物有利地表達(dá)的豆血紅蛋白和/或血紅蛋白選自植物黃羽扇豆(Lupinus luteus)(LGB1_LUPLU，LGB2_LUPLU)、大豆(LGBA_SOYBN、LGB2_SOYBN、LGB3_SOYBN)、紫苜蓿(Medicagosativa)(LGB1-4_MEDSA)、Medicago trunculata(LGB1_MEDTR)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(LGB1_PHAVU、LGB2_PHAVU)、蠶豆(Viciafaba)(LGB1_VICFA，LGB2_VICFA)、豌豆(Pisum sativum)(LGB1_PEA、LGB2_PEA)、豇豆(Vigna unguiculata)(LGB1_VIGUN)、日本百脈根(Lotus japonicus)(LGB_LOTJA)、四稜豆(Psophocarpus tetragonolobus)(LGB_PSOTE)、狗尾草(Sesbania rostrata)(LGB1_SESRO)、粗枝木麻黃(Casuarina glauca)(HBPA_CASGL)和Canvalaria lineata(HBP_CANLI)、Physcomitrella patens(HBL0_PHYPA)、擬南芥菜(HBL1_ARATH，HBL2_ARATH)、陸地棉(Gossypium hirsutum)(HBL1_GOSHI、HBL2_GOSHI)、紫苜蓿(Medicago sativa)(HBL1_MEDSA)、稻(Oryza sativa)(HBL1_ORYSA、HBL2_ORYSA、HBL3_ORYSA、HBL4_ORYSA)、歐洲油菜(Brassica napus)(HBL2_BRANA)、食用番茄(Lycopersicon esculentum)(HBL2_LYCES)、大麥(Hordeum vulgare)(HBL_HORVU)、玉米(Zea mays)(HBL_MAIZE)、Trema tomentosa(HBL_TRETO)、木麻黃(Casuarinaglauca)(HBP1_CASGL、HBP2_CASGL、HBPA_CASGL)、Parasponiarigida(HBPL_PARAD)的豆血紅蛋白和/或血紅蛋白。在括號(hào)內(nèi)顯示的是每一所述蛋白在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)。
特別有利的植物是那些包含編碼豆血紅蛋白的序列號(hào)1和/或編碼血紅蛋白的序列號(hào)3和/或5的植物。優(yōu)選地采用來(lái)源于日本百脈根的豆血紅蛋白和/或血紅蛋白?，F(xiàn)在，轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生貯藏儲(chǔ)備物的量增加。
為產(chǎn)生貯藏儲(chǔ)備物，本發(fā)明也包括表達(dá)如序列號(hào)1所示豆血紅蛋白和/或如序列號(hào)3和5所示血紅蛋白的植物。
本發(fā)明優(yōu)選的改變形式是采用以貯藏器官特異的方式表達(dá)豆血紅蛋白和/或血紅蛋白的植物的形式。
作為規(guī)則，上述植物在特異器官中沉積貯藏儲(chǔ)備物。實(shí)例是鱗莖、塊莖、種子、核、堅(jiān)果、葉等。對(duì)于本發(fā)明的目的，貯藏器官也可理解為是指果實(shí)。果實(shí)是作為營(yíng)養(yǎng)組織包圍種子的植物器官的總稱。不但要提到可食用的果實(shí)，特別是“果實(shí)”，而且要提到豆類、谷類、堅(jiān)果、香料和藥劑用藥物(apothecary drugs)(參見(jiàn)fructus、種子)。當(dāng)然，貯藏儲(chǔ)備物的貯藏也出現(xiàn)于所有植物中。
豆血紅蛋白和/或血紅蛋白優(yōu)選地以塊莖特異或種子特異的方式得到表達(dá)。
適合的植物是所有上面提到的那些。下述植物是優(yōu)選的馬鈴薯、擬南芥菜、油料種子油菜、大豆、花生、玉米、木薯、薯蕷、水稻、向日葵、黑麥、大麥、蛇麻草、燕麥、硬粒小麥和aestivum小麥、羽扇豆、豌豆、三葉草、甜菜、甘藍(lán)、藤本植物等，它們可在Saatgutverkehrsgesetz的品種列表的導(dǎo)則中找到[German seed trading act](Blatt für PMZ[officialgazette for patents and trademark law]1986，p.3，last modified in Blatt fürPMZ 2002，p.68)。
特別優(yōu)選的是產(chǎn)生塊莖的植物，尤其是馬鈴薯植物，或產(chǎn)生種子的植物，特別是擬南芥菜、油料種子油菜或大豆。
例如通過(guò)使用組織特異啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)組織特異的表達(dá)。例如，此類組織特異的表達(dá)例如見(jiàn)US6,372,961 B1，第11卷第44行以及下列等等。
此外，本發(fā)明涉及如序列號(hào)1所示的核苷酸序列、對(duì)應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)或載體、以及它們?cè)诒景l(fā)明植物中轉(zhuǎn)化的應(yīng)用，其中所述的核苷酸序列編碼植物使用的豆血紅蛋白。
特別地，本發(fā)明也包括編碼豆血紅蛋白的下述核苷酸序列的用途，其序列與序列號(hào)1的同一性約70％，優(yōu)選地是80％，特別優(yōu)選地是85％、90％，尤其是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
此外，本發(fā)明涉及如序列號(hào)3和5所示的核苷酸序列，和對(duì)應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)或載體，以及它們?cè)谵D(zhuǎn)化植物中的應(yīng)用，其中所述的核苷酸序列編碼植物使用的血紅蛋白。尤其是，本發(fā)明也包括編碼血紅蛋白的下述核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列與序列3和5的同一性約70％，優(yōu)選地是80％，特別優(yōu)選的是85％、90％，尤其是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”理解為所有的以下核苷酸序列，其序列(i)完全與所示序列相符；或(ii)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的限制下，包含至少一個(gè)與所示序列相符的核苷酸序列；或(iii)包含至少一個(gè)與核苷酸序列(i)或(ii)互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；并且，如果適當(dāng)，(iiii)在(i)中包含功能中性的有意突變。在本文中，術(shù)語(yǔ)“功能中性的有意突變”表示化學(xué)上類似的氨基酸的替換，如以丙氨酸替換甘氨酸或以蘇氨酸替換絲氨酸。
根據(jù)本發(fā)明，也包括的是編碼區(qū)(結(jié)構(gòu)基因)之前(5’或上游)和/或之后(3’或下游)的序列區(qū)。尤其是，這包括具有調(diào)節(jié)功能的序列區(qū)。它們可影響轉(zhuǎn)錄、RNA穩(wěn)定性、RNA加工和翻譯。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例尤其是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子、終止子或翻譯增強(qiáng)子。
所討論的蛋白質(zhì)(豆血紅蛋白和/或血紅蛋白)也包括同工型，其中所述的同工型可理解為具有相同或可比較的功能，但具有不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)修飾的形式理解為在序列中包含修飾的蛋白質(zhì)，例如在多肽的N-和/或C-末端，或在保守氨基酸的區(qū)域，然而，不會(huì)不利地影響蛋白質(zhì)的功能。通過(guò)公知的方法，以氨基酸替換的形式可實(shí)現(xiàn)這些修飾。
參考下述實(shí)驗(yàn)，詳細(xì)描述了本發(fā)明。
實(shí)施例1.模型生物利用馬鈴薯和擬南芥菜作為實(shí)驗(yàn)的模型生物。這兩種植物物種代表高等植物(種子植物)的成員。由于它們的DNA序列或多肽序列的高度同源性，可利用它們作為其它植物物種的模型植物。
2.一般方法a)馬鈴薯或擬南芥植物的栽培擬南芥植物在添加有0.5％蔗糖的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Ogas等，1997 Science 27791-94)或堆肥(Focks & Benning，1998 Plant Physiology11891-101)上生長(zhǎng)。為獲得一致的萌芽和開(kāi)花時(shí)間，首先將種子覆蓋，或撒在堆肥上，然后在4℃保存2天。開(kāi)花后，標(biāo)記豆莢。然后，根據(jù)標(biāo)記，在開(kāi)花后6-20天收獲豆莢。馬鈴薯植物按Dietze等，1995(基因轉(zhuǎn)移至植物，Potrykus和Spangenberg主編，Springer實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，柏林，海德?tīng)柋ぃ?4-29)所述生長(zhǎng)。
b)從植物中分離總RNA和poly-A+RNA為產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體，分離RNA和poly-A+RNA。從擬南芥豆莢或馬鈴薯塊莖或日本百脈根的根中分離RNA，如說(shuō)明書(shū)中所述，按以下步驟實(shí)施收獲6-40天的植物材料，并在液氮中快速冰凍。材料貯藏于-80℃直至進(jìn)一步的使用。在冷卻的研缽中將75mg材料研磨成細(xì)粉，并用200μlAmbion RNAqueos試劑盒的裂解緩沖液處理。然后，按照制造商的說(shuō)明書(shū)分離總RNA。用50μl洗脫緩沖液(Ambion)洗脫RNA，并使用光度計(jì)(Eppendorf)，在260nm以1∶100稀釋溶液的吸光度為基礎(chǔ)測(cè)定其濃度。40μg/ml RNA相當(dāng)于吸光度為1。使用無(wú)RNAse水，將RNA溶液的濃度調(diào)整至1μg/μl。通過(guò)瓊脂糖電泳檢驗(yàn)其濃度。
為分離polyA+RNA，按照制造商的說(shuō)明書(shū)使用Amersham Pharmacia的oligo(dT)纖維素。RNA和polyA+RNA貯藏于-70℃。
3.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建為從日本百脈根和擬南芥菜RNA中構(gòu)建cDNA文庫(kù)，使用小鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(Clontech)和Oligo-d(T)引物實(shí)現(xiàn)第一鏈的合成，而通過(guò)與DNA聚合酶I、Klenow酶孵育，并利用RNAse H在12℃(2小時(shí))、16℃(1小時(shí))和22℃(1小時(shí))切割，實(shí)現(xiàn)第二鏈的合成。通過(guò)在65℃孵育(10分鐘)終止反應(yīng)，隨后轉(zhuǎn)移至冰上。使用T4 DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分鐘)使雙鏈DNA成為平端。通過(guò)酚/氯仿抽提和Sephadex G50離心柱移去核苷酸。利用T4 DNA連接酶，將EcoR I/NotI接頭(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))連接至cDNA末端(Roche，12℃過(guò)夜)，使用Not I再切割，并通過(guò)與多核苷酸激酶孵育(Roche，37℃，30分鐘)進(jìn)行磷酸化。該混合物在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上經(jīng)過(guò)分離。使用制造商的材料，并按照它們的說(shuō)明書(shū)，超過(guò)200堿基對(duì)的DNA分子從凝膠中洗脫、酚抽提、在Elutip D柱(Schleicher und Schüll，Dassel，德國(guó))上濃縮、并連接至克隆載體pSPORT1(Invitrogen，Karlsruhe)。
4.DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)分析通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，尤其是使用ABI PRISM Big Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction試劑盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt，德國(guó))，通過(guò)鏈終止方法，將部分2中所述的cDNA文庫(kù)用于DNA測(cè)序。通過(guò)體內(nèi)大批切除和在瓊脂平板上再轉(zhuǎn)化DH5α，獲得從cDNA文庫(kù)中制備的預(yù)備質(zhì)粒后，進(jìn)行隨機(jī)單克隆的測(cè)序(材料和說(shuō)明書(shū)的細(xì)節(jié)來(lái)自Stratagene，Amsterdam，the Netherlands)。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，利用Qiagen DNA制備機(jī)器人從大腸桿菌(E.coli)的過(guò)夜培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA，其中所述的大腸桿菌在添加氨芐青霉素的Luria肉湯中生長(zhǎng)(見(jiàn)Sambrook等.(1989)(Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室出版社ISBN 0-87969-309-6))。
使用在商業(yè)上從Bio-Max(慕尼黑，德國(guó))獲得的標(biāo)準(zhǔn)軟件包EST-MAX，對(duì)序列進(jìn)行處理和注釋。使用比較算法和序列查詢，借助于BLAST程序執(zhí)行同源基因的搜尋(Altschul等，(1997)“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢程序”，Nucleic Acids Res.253389-3402)。
5.在馬鈴薯中塊莖特異性表達(dá)和在擬南芥中種子特異性表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生a)塊莖特異性表達(dá)使用Not I和Kpn I從載體pSportI上切除豆血紅蛋白基因Lljlb，通過(guò)與Klenow酶孵育使Not I切割位點(diǎn)平端化。為連接至載體pART33，將后者用BamH I消化，然后通過(guò)與Klenow酶孵育使切割位點(diǎn)平端化，隨后將產(chǎn)物用Kpn I消化。pART33已經(jīng)包含塊莖特異表達(dá)的B33啟動(dòng)子(1459bp，Liu XJ，Prat S，Willmitzer L，F(xiàn)rommer WB(1990)，順式調(diào)節(jié)元件指導(dǎo)嵌合型I類patatin啟動(dòng)子/GUS-基因融合產(chǎn)物的塊莖特異性和蔗糖誘導(dǎo)的表達(dá)，Mol Gen Genet.223(3)401-6)和OCS終止子(766bp)。使用Not I從pART33切除全部構(gòu)建體，并克隆至植物轉(zhuǎn)化載體pART27。
b)種子特異性表達(dá)從載體pART33中將豆血紅蛋白基因Lljlb再克隆至載體pBINUSP。為了這一目的，首先用Asp718I消化構(gòu)建體pART33-LegHb，并用Klenow片段使突出端平端化。此后，用XbaI消化線性構(gòu)建體，并將因此獲得的基因在4℃過(guò)夜連接至XbaI/SmaI切割的pBINUSP。
從載體pART33中將血紅蛋白基因1AtHb1再克隆至載體pBINUSP。為了這一目的，首先用Asp718I消化構(gòu)建體pART33-AtHb1，并用Klenow片段使突出端平端化。此后，用XbaI消化線性構(gòu)建體，并將因此獲得的基因在4℃過(guò)夜連接至XbaI/SmaI切割的pBINUSP。
從載體pART33中將血紅蛋白基因2AtHb2再克隆至載體pBINUSP。為了這一目的，首先用Asp718I消化構(gòu)建體pART33-AtHb2，并用Klenow片段使突出端平端化。此后，用XbaI消化線性構(gòu)建體，并將因此獲得的基因在4℃過(guò)夜連接至XbaI/SmaI切割的pBINUSP。
6.植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒雙元載體如pBIN可用于轉(zhuǎn)化植物(Bevan，M.，Nucleic Acids Res.12(1984)，8711-8721)。通過(guò)將cDNA以有意或反義方向連接至T-DNA，可構(gòu)建雙元載體。cDNA5’端的植物啟動(dòng)子激活cDNA的轉(zhuǎn)錄。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3’端。
使用組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)。例如，通過(guò)克隆cDNA5’端的napin或LeB4或USP啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)種子特異性表達(dá)。也可使用任何其它種子特異性啟動(dòng)子元件。CaMV 35S啟動(dòng)子可用于實(shí)現(xiàn)完整植物中的組成型表達(dá)。
7.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和植物轉(zhuǎn)化例如使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101株(pMP90)(Konez和Schell，Mol.Gen.Genet.204(1986)383-396)或LBA4404(Clontech)，可實(shí)施農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。使用熟練工作人員所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)，可轉(zhuǎn)化細(xì)菌(Deblaere等，Nucl.Acids.Tes.13(1984)，4777-4788)。
通過(guò)熟練工作人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)(Gelvin、Stanton B、Schilperoort、Robert A，植物分子生物學(xué)手冊(cè)，第二版，DordrechtKluwer學(xué)院出版社，1995，in Sect.，Ringbuch Zentrale SignaturBT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick，Bernard R.，Thompson，John E，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，Boca RatonCRC出版社，1993，360 S.，ISBN0-8493-5164-2)，同樣可實(shí)施農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物自身轉(zhuǎn)化。
通過(guò)Bechthold等，1993(C.R.Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie.，316，1194-1199)的方法，借助農(nóng)桿菌可實(shí)施擬南芥菜的轉(zhuǎn)化。對(duì)該方法進(jìn)行了改變，未采用真空浸潤(rùn)。
對(duì)于轉(zhuǎn)化，將擬南芥菜Col0種子播種于潮濕的堆肥上，于4℃保存2天，并在短日照條件下(8小時(shí)光照，21℃)生長(zhǎng)4-6周。為誘導(dǎo)開(kāi)花，然后將植物轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照，21℃)。約10天后，花序已足夠大，可以浸沒(méi)。花序浸沒(méi)在MS溶液(Murashige和Skoog，見(jiàn)下文)pH5.7、5％蔗糖、44μM芐氨基嘌呤(Sigma)和0.03％Silwet L-77(LehleSeeds，USA)的農(nóng)桿菌懸液中。農(nóng)桿菌懸液在600nm的光密度應(yīng)為0.8。細(xì)菌之前在YEB培養(yǎng)基(0.5％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％細(xì)菌用蛋白胨、0.1％酵母抽提物、0.5％蔗糖和2mM MgCl2)中生長(zhǎng)。
植物浸沒(méi)后，將后者繼續(xù)再潤(rùn)濕約3周。然后，終止灌溉，使植物干燥以獲得種子。將獲得的種子種于含MS溶液，pH5.7、50μg卡那霉素、250μg特美汀和0.8％瓊脂的平板上。分別挑出抗性苗，種于堆肥中。
通過(guò)Dietze等，在Gene transfer to plants(I.Potrykus和G.Spangenberg編輯，Springer Lab Manual，1995，24-29頁(yè))一書(shū)中的方法，實(shí)施馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)的轉(zhuǎn)化。使用的起始材料是培育品種Desiree。
對(duì)于轉(zhuǎn)化，將5-6片馬鈴薯品種Desiree的無(wú)菌苗培養(yǎng)物的葉在10ml添加2％蔗糖的2MS溶液(Murashige and Skoog的標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基，(1962)對(duì)煙草組織培養(yǎng)物迅速生長(zhǎng)和生物合成的改良培養(yǎng)基，Physiol.Plant.，15，473-497)中仔細(xì)地平衡。從葉的中央靜脈橫向切下長(zhǎng)度為1-2mm的切片，并置于新鮮的2MS培養(yǎng)基。將50μl已用T質(zhì)粒pART27-JpLeg轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌溶液加入該新鮮培養(yǎng)基。將農(nóng)桿菌溶液分散在葉片上，并在暗處將平板在22-24℃孵育2天。2天后，將葉節(jié)轉(zhuǎn)移至CIM培養(yǎng)基(添加1.5％葡萄糖、5mg/l NAA、0.1mg/l BAP、250mg/l頭孢噻肟和50mg/l卡那霉素或潮霉素的MS培養(yǎng)基)，并孵育7天。然后將葉片轉(zhuǎn)移至SIM培養(yǎng)基(添加2mg/l玉米素、0.02mg/l NAA、0.02mg/l GA3、250mg/l頭孢噻肟和50mg/l卡那霉素或潮霉素的MS培養(yǎng)基)。1-2周后，然后可切下所得到的轉(zhuǎn)基因苗(長(zhǎng)度為1-1.5cm)，并轉(zhuǎn)移至RIM培養(yǎng)基(添加250mg/l頭孢噻肟的MS培養(yǎng)基)。3-4周后，苗已形成葉和根，并且可挑出植物種于堆肥中。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)每種所采用的葉，可獲得2-3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系。
例如Freeling和Walbot，“玉米手冊(cè)”(1993)ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag New York)描述了使用粒子轟擊、聚乙二醇介導(dǎo)的DNA攝入或另一個(gè)備選的通過(guò)碳酸硅纖維技術(shù)進(jìn)行的植物轉(zhuǎn)化。
8.分析轉(zhuǎn)化植物中豆血紅蛋白和血紅蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平測(cè)量轉(zhuǎn)化植物中豆血紅蛋白的活性。
測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平(表示基因翻譯所采用的RNA的量)的合適方法是實(shí)施下文所述的Northern印跡(作為參考，見(jiàn)Ausubel等.(1988)CurrentProtocols in Molecular Biology，WileyNew York或上述的實(shí)施例部分)，其中與豆血紅蛋白結(jié)合的引物用可檢測(cè)的標(biāo)簽(通常是放射同位素或化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽)標(biāo)記，以便當(dāng)抽提生物體培養(yǎng)物的總RNA、在凝膠上分離、轉(zhuǎn)移至合適的基質(zhì)和與該探針?lè)跤龝r(shí)，本探針的結(jié)合和結(jié)合強(qiáng)度顯示所探討基因(豆血紅蛋白或血紅蛋白)的mRNA的存在以及也顯示它的量。本信息顯示轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄程度。使用均是本領(lǐng)域所公知的多種方法，如Bormann，E.R等。(1992)Mol.Microbiol.6317-326所述的方法，可從細(xì)胞、組織或器官中制備細(xì)胞總RNA。
Northern雜交對(duì)于RNA雜交，使用甲醛，在1.25％強(qiáng)度的瓊脂糖凝膠中通過(guò)凝膠電泳分離20μg總RNA或1μg poly(A)+RNA，如Amasino(1986，Anal.Biochem.152，304)所述；使用10×SSC，通過(guò)毛細(xì)管吸引轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜(Hybond N+，Amersham，Braunschweig)；通過(guò)紫外線固定，并使用雜交緩沖液(10％(w/v)葡聚糖硫酸酯、1M NaCl、1％SDS、100mg鯡魚(yú)精子DNA)在68℃預(yù)雜交3小時(shí)。使用α-32P-dCTP(Amersham Pharmacia，Braunschweig，德國(guó))，在預(yù)雜交步驟利用Highprime DNA標(biāo)記試劑盒(Roche，Mannheim，德國(guó))對(duì)DNA探針進(jìn)行標(biāo)記。已加入標(biāo)記的DNA探針后，在相同的緩沖液中于68℃過(guò)夜進(jìn)行雜交。在68℃，使用2×SSC，洗滌步驟進(jìn)行2次，15分鐘，并且使用1×SSC、1％SDS，進(jìn)行2次30分鐘。密封濾器的曝光在-70℃進(jìn)行1-14天。
9.分析重組豆血紅蛋白對(duì)目的產(chǎn)物產(chǎn)生的影響通過(guò)使經(jīng)修飾的微生物或經(jīng)修飾的植物在合適條件下(如上文所述的那些)生長(zhǎng)，并分析培養(yǎng)基和/或細(xì)胞成分中目的產(chǎn)物(即脂類或碳水化合物)的產(chǎn)量增加，可以測(cè)定植物、真菌、藻類、纖毛蟲(chóng)的遺傳修飾對(duì)目的化合物(如脂肪酸)產(chǎn)生的影響。這些分析技術(shù)是熟練工作人員所公知的，并且包含光譜學(xué)、薄層層析、多種染色方法、酶學(xué)和微生物學(xué)技術(shù)以及分析型色譜法如高效液相色譜(見(jiàn)，例如Ullman，Encyclopedia of IndustrialChemistry，Vol.A2，89-90頁(yè)和443-613頁(yè)，VCHWeinheim(1985)、Fallon，A等，(1987)“HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用”在Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.17、Rehm等.(1993)Biotechnology，Vol.3，Chapter III“產(chǎn)物回收和純化”，469-714頁(yè)，VCHWeinheim、Belter，P.A等.(1988)Bioseparationsdownstream processingfor Biotechnology，John Wiley and Sons、Kennedy，J.F和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological Materials，John Wiley and Sons、Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化學(xué)分離，在Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，Vol.B3；Chapter 11，1-27頁(yè)，VCHWeinheim、以及Dechow，F(xiàn).J.(1989)Separation and purificationtechniques in biotechnology，Noyes Publications)除上述方法外，如Cahoon等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)12935-12940和Browse等.(1986)Analytic Biochemistry 152141-145所述從植物材料中抽提植物脂類。Christie，William W.，Advances in LipidMethodology，Ayr/ScotlandOily Press(Oily Press Lipid Library；2)、Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr，ScotlandOily Press，1989，Repr.1992，IX，307 S.(Oily Press LipidLibrary；1)、“Progress in Lipid Research，OxfordPergamon Press，1(1952)-16(1977)在題為Progress in the Chemistry of Fats and OtherLipids CODEN的一文中描述了脂類或脂肪酸的定性和定量分析。
為測(cè)定產(chǎn)生化合物的總效率，除了測(cè)量發(fā)酵終產(chǎn)物外，分析用于產(chǎn)生目的化合物的代謝途徑的其它成分也是可能的，如中間體和次級(jí)產(chǎn)物。分析方法包含測(cè)量培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物量(例如糖、碳?xì)浠衔铩⒌?、磷酸鹽和其它成分)、測(cè)量生物量組分和其生長(zhǎng)、通過(guò)生物合成途徑分析正常代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、以及測(cè)量發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的氣體。Applied MicrobialPhysiology；A Practical Approach，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編著，IRL Press，103-129；131-163和165-192頁(yè)(ISBN0199635773)以及其中所引用的參考文獻(xiàn)描述了這些測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)方法。
一個(gè)例子是脂肪酸的分析(縮寫(xiě)FAMEs，脂肪酸甲酯；GC-MS，氣液色譜/質(zhì)譜；TAG，三酰甘油；TLC，薄層層析)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析程序進(jìn)行重組生物體的分析，可獲得脂肪酸產(chǎn)物存在的明確證據(jù)，其中所述的標(biāo)準(zhǔn)分析程序是GC、GC-MS或TLC，如之前Christie和此處的參考文獻(xiàn)(1997，在Advances on Lipid Methodology，第四版Christie，Oily Press，Dundee，119-169；1998，Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren[氣相色譜/質(zhì)譜法]，Lipide 33343-353)所述。
通過(guò)超聲、玻璃研磨器、液氮中磨碎和研磨，或通過(guò)任何其它可應(yīng)用的方法，可破壞所分析的材料。破壞后，將材料離心。將沉淀重懸于蒸餾水中、于100℃加熱10分鐘、冰上冷卻、并再次離心、然后于90℃在含有0.5％硫酸和2％二甲氧基丙烷的甲醇中抽提1小時(shí)，這導(dǎo)致水解油和水解脂類化合物而產(chǎn)生轉(zhuǎn)甲基脂類。在石油醚中抽提這些脂肪酸甲酯，并且最后使用毛細(xì)管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25微米，0.32mm)，經(jīng)過(guò)GC分析，溫度梯度170℃-240℃20分鐘和240℃5分鐘。使用可從商業(yè)來(lái)源(即Sigma)獲得的標(biāo)準(zhǔn)品定義所得到的脂肪酸甲酯的特性。
10.分析擬南芥成熟種子中百脈根豆血紅蛋白、擬南芥血紅蛋白1、擬南芥血紅蛋白2的表達(dá)為證明來(lái)自擬南芥菜的轉(zhuǎn)基因血紅蛋白1和血紅蛋白2(AtHb1和AtHb2)，以及來(lái)自日本百脈根的豆血紅蛋白(LjLegHb)的表達(dá)，進(jìn)行Northern印跡分析。為此目的，分離轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物成熟種子的總RNA，并通過(guò)電泳分開(kāi)，以及使用洋地黃毒苷標(biāo)記的探針檢測(cè)轉(zhuǎn)錄體。對(duì)每種品系進(jìn)行2-4次獨(dú)立的分析。通過(guò)舉例，

圖1顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥品系成熟T2種子表達(dá)分析的結(jié)果，其中所述的擬南芥品系表達(dá)百脈根血紅蛋白(LjLegHb)、擬南芥血紅蛋白1(AtHb1)或擬南芥血紅蛋白2(AtHb2)。因?yàn)榭蓹z測(cè)到對(duì)應(yīng)的mRNA，所以轉(zhuǎn)化基因幾乎在所有分析的品系中得到轉(zhuǎn)錄。相反，在對(duì)照中，未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本。
11.分析表達(dá)百脈根豆血紅蛋白和擬南芥血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥植物的油含量通過(guò)對(duì)總脂肪酸定量，可間接測(cè)定表達(dá)百脈根豆血紅蛋白、擬南芥血紅蛋白1或擬南芥血紅蛋白2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物種子的油含量。下述方法用于本目的。
通過(guò)Blight & Dyer，1959Can.J.Biochem.Physiol.37911的方法，從種子中抽提脂類。對(duì)于每次測(cè)量，將5-10個(gè)種子轉(zhuǎn)移至振蕩的1.2ml Qiagen微型管(Qiagen，Hilden)，在Retsch粉碎機(jī)中粉碎(MM300，Retsch(Haan))，并通過(guò)加入500μl氯仿/甲醇(2∶1，含作為內(nèi)標(biāo)的十五酸(C15))抽提總脂類。加入500μl 50mM磷酸鉀緩沖液pH7.5后，相得到分離。將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至Pyrex管，并蒸發(fā)至干燥。然后使用Benning & Sommerville，1992 J.Bacteriol.1746479-6487的方法，通過(guò)在80℃加入溶于甲醇的1N H2SO4和2％(v/v)二甲氧基丙烷1小時(shí)而衍生全部脂肪酸以產(chǎn)生脂肪酸甲酯。在石油醚中抽提這些脂肪酸甲酯，并最后使用毛細(xì)管柱(Chrompack，WCOTFused Silica，CP-Wax-52，25微米，0.32mm)，通過(guò)氣相色譜進(jìn)行分析。通過(guò)比較脂肪酸甲酯的信號(hào)面積和已知濃度內(nèi)標(biāo)的信號(hào)面積，對(duì)總脂肪酸定量。擬南芥菜中油含量的進(jìn)一步的指示劑實(shí)際上是唯一發(fā)現(xiàn)于貯藏脂類中的脂肪酸二十碳烯酸(20∶1Δ11)。
擬南芥菜轉(zhuǎn)化后，通過(guò)抗生素抗性對(duì)轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行選擇。為此目的，轉(zhuǎn)化的擬南芥植物的T1種子在含有潮霉素的選擇平板上萌芽。為了定量測(cè)定油含量，在每一情況下對(duì)4個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系的T2種子進(jìn)行了分析。對(duì)每一品系進(jìn)行了5-9次獨(dú)立的測(cè)量，并計(jì)算對(duì)應(yīng)的平均值。
通過(guò)表3和圖2中的例子，顯示測(cè)定表達(dá)百脈根豆血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因植物成熟T2種子中的油含量。根據(jù)本發(fā)明，品系4和5中百脈根豆血紅蛋白的表達(dá)導(dǎo)致油含量分別顯著增加17.14％和17.54％。
通過(guò)表4和圖3中的例子，顯示測(cè)定表達(dá)擬南芥血紅蛋白1的轉(zhuǎn)基因植物成熟T2種子中的油含量。根據(jù)本發(fā)明，品系35、13和39中擬南芥血紅蛋白1的表達(dá)導(dǎo)致油含量分別顯著增加9.78％、12.22％和51.16％。
通過(guò)表5和圖4中的例子，顯示測(cè)定表達(dá)擬南芥血紅蛋白2的轉(zhuǎn)基因植物成熟T2種子中的油含量。根據(jù)本發(fā)明，品系2、10和11中擬南芥血紅蛋白2的表達(dá)導(dǎo)致油含量分別顯著增加16.25％、21.86％和23.80％。
12.測(cè)定表達(dá)百脈根豆血紅蛋白的轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物中的淀粉含量采用如Schéele C.von，Svensson，G.和Rasmusson J.，Die Bestimmungdes Strkegehalts und der Trockensubstanz der Kartoffel mit Hilfe desspezifischen Gewichts[通過(guò)比重測(cè)定馬鈴薯的淀粉含量和干物質(zhì)].Landw.Vers Sta.12767-96，1937所述的密度測(cè)量法，以測(cè)定馬鈴薯的淀粉含量和塊莖。然后，轉(zhuǎn)換密度測(cè)量值，并將結(jié)果用于估計(jì)淀粉含量。下述公式用于轉(zhuǎn)換。
通過(guò)在空氣和水中稱重塊莖，測(cè)定其比重，X是空氣中的質(zhì)量以及Y是水中的質(zhì)量。然后，比重是x/(x-y)的結(jié)果。此外，計(jì)算560個(gè)測(cè)量樣品的平均值，并且建立下述關(guān)系式(Burton W.G.(1989)The Potato.Longman，New York)％干物質(zhì)＝24.182+[211.04*(比重-1.0988)]％淀粉＝17.546+[199.07*(比重-1.0988)]多種轉(zhuǎn)基因品系和對(duì)照植物的不同大小的馬鈴薯塊莖，可用于測(cè)量表達(dá)豆血紅蛋白的植物和用于比較目的的對(duì)照植物。不同大小用作再現(xiàn)所有塊莖大小中的觀測(cè)結(jié)果。
通過(guò)熟練工作人員所熟悉的常規(guī)方法，從表達(dá)豆血紅蛋白的馬鈴薯中進(jìn)行淀粉的檢查或回收，例如如美國(guó)專利申請(qǐng)2001/0041199 A1，第4頁(yè)，
為測(cè)量表達(dá)豆血紅蛋白的植物和為比較目的的對(duì)照植物的塊莖中的淀粉含量，將植物同時(shí)在溫室和polyhouse中生長(zhǎng)。不同栽培方法用作再現(xiàn)不同氣候條件下的觀察結(jié)果。為再現(xiàn)所有塊莖大小的觀察結(jié)果，采用不同大小的馬鈴薯塊莖用于測(cè)量。
通過(guò)舉例，表6顯示轉(zhuǎn)基因品系與對(duì)照植物的比較數(shù)據(jù)，其中所有的植物已經(jīng)在溫室中生長(zhǎng)。在每一情況下，顯示一個(gè)品系不同塊莖的6次測(cè)量值和所得到的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)本發(fā)明，在轉(zhuǎn)基因品系中，檢測(cè)到淀粉含量顯著增加40.77％。在更多的品系中獲得類似的數(shù)值。
圖5顯示4個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系與對(duì)照植物比較的平均淀粉含量，其中所有植物已在Golm的polyhouse中生長(zhǎng)，時(shí)間為2003年3月至2003年9月。平均數(shù)據(jù)是以334個(gè)塊莖(品系13)、358個(gè)塊莖(品系57)、380個(gè)塊莖(品系45)、384個(gè)塊莖(品系54)和151個(gè)塊莖(野生型)為根據(jù)的。根據(jù)本發(fā)明，在盛行于polyhouse的氣候條件下，也觀察到表達(dá)豆血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的塊莖中淀粉含量顯著增加，這證實(shí)了從溫室中獲得的結(jié)果。在培養(yǎng)期間，盛行于polyhouse的溫度條件顯示于圖6中。
表3.與對(duì)照比較，表達(dá)LjLegHb的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系T2種子中的油含量。在每一情況下，對(duì)5-10個(gè)種子進(jìn)行單獨(dú)測(cè)量，并且對(duì)應(yīng)的油含量以μg脂肪酸/種子表示。
表4.與對(duì)照比較，表達(dá)AtHb1的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系T2種子中的油含量。在每一情況下，對(duì)5-10個(gè)種子進(jìn)行單獨(dú)測(cè)量，并且對(duì)應(yīng)的油含量以μg脂肪酸/種子表示。
表5.與對(duì)照比較，表達(dá)AtHb2的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系T2種子中的油含量。在每一情況下，對(duì)5-10個(gè)種子進(jìn)行單獨(dú)測(cè)量，并且對(duì)應(yīng)的油含量以μg脂肪酸/種子表示。
表6.與對(duì)照植物比較，測(cè)定轉(zhuǎn)基因品系的比重
序列表<110>馬克思-普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)公司<120>改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量的方法<130>NAE 737/02 PCT<150>DE 10260707.9<151>2002-12-23<160>6<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>444<212>DNA<213>日本百脈根(Lotus japonicus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(444)<400>1atg ggt ttc act gcg cag caa gag gct cta gtg ggt agc tca tac gaa48Met Gly Phe Thr Ala Gln Gln Glu Ala Leu Val Gly Ser Ser Tyr Glu15 10 15aca ttc aag aaa aac ctt cct acc aac agt gtt ttg ttc tac acc gtt96Thr Phe Lys Lys Asn Leu Pro Thr Asn Ser Val Leu Phe Tyr Thr Val20 25 30ata ttg gag ata gca cca act gca aaa gac atg ttc tcc ttt cta aag144Ile Leu Glu Ile Ala Pro Thr Ala Lys Asp Met Phe Ser Phe Leu Lys35 40 45gag tct ggg cct aag cat agt cct cag ctc cag gcc cat gct gaa aag192
Glu Ser Gly Pro Lys His Ser Pro Gln Leu Gln Ala His Ala Glu Lys50 55 60gtt ttt gca ctg act cgt gat gct gcc act caa ctc gta gca aaa gga240Val Phe Ala Leu Thr Arg Asp Ala Ala Thr Gln Leu Val Ala Lys Gly65 70 75 80gaa gtg aca ctt gca gat gcc agc tta ggt gct gtc cac gtt cag aaa288Glu Val Thr Leu Ala Asp Ala Ser Leu Gly Ala Val His Val Gln Lys85 90 95gcc gtt act gat cct cat ttc gtg gtg gtt aaa gaa gcc ctg ctt caa336Ala Val Thr Asp Pro His Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Gln100 105 110aca gta aag gaa gca gtt ggg gcg gac gaa tgg agt gat gac ttg agc384Thr Val Lys Glu Ala Val Gly Ala Asp Glu Trp Ser Asp Asp Leu Ser115 120 125acc gct tgg gaa gga gca tat gat gga cta gca act gca att aag aag432Thr Ala Trp Glu Gly Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Thr Ala Ile Lys Lys130 135 140gca atg ggt taa 444Ala Met Gly145<210>2<211>147<212>PRT<213>日本百脈根<400>2Met Gly Phe Thr Ala Gln Gln Glu Ala Leu Val Gly Ser Ser Tyr Glu15 10 15
Thr Phe Lys Lys Asn Leu Pro Thr Asn Ser Val Leu Phe Tyr Thr Val20 25 30Ile Leu Glu Ile Ala Pro Thr Ala Lys Asp Met Phe Ser Phe Leu Lys35 40 45Glu Ser Gly Pro Lys His Ser Pro Gln Leu Gln Ala His Ala Glu Lys50 55 60Val Phe Ala Leu Thr Arg Asp Ala Ala Thr Gln Leu Val Ala Lys Gly65 70 75 80Glu Val Thr Leu Ala Asp Ala Ser Leu Gly Ala Val His Val Gln Lys85 90 95Ala Val Thr Asp Pro His Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Gln100 105 110Thr Val Lys Glu Ala Val Gly Ala Asp Glu Trp Ser Asp Asp Leu Ser115 120 125Thr Ala Trp Glu Gly Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Thr Ala Ile Lys Lys130 135 140Ala Met Gly145<210>3<211>483<212>DNA<213>擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>CDS
<222>(1)..(483)<400>3atg gag agt gaa gga aag att gtg ttc aca gaa gag caa gag gct ctt48Met Glu Ser Glu Gly Lys Ile Val Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu15 10 15gta gtg aag tct tgg agt gtc atg aag aaa aac tca gct gaa tta ggt96Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly20 25 30ctc aaa ctc ttc atc aag atc ttt gag att gca cca aca acg aag aag144Leu Lys Leu Phe Ile Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Thr Thr Lys Lys35 40 45atg ttc tct ttc ttg aga gac tca cca att cct gct gag caa aat cca192Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Pro Ile Pro Ala Glu Gln Asn Pro50 55 60aag ctc aag cct cac gca atg tct gtt ttt gtc atg tgt tgt gaa tca240Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Cys Cys Glu Ser65 70 75 80gca gta caa ctg agg aaa aca ggg aaa gtt acg gtg agg gag act act288Ala Val Gln Leu Arg Lys Thr Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Thr Thr85 90 95ttg aag aga ctt gga gcc agc cat tct aaa tac ggt gtc gtt gac gaa336Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser His Ser Lys Tyr Gly Val Val Asp Glu100 105 110cac ttt gag gtg gcc aag tat gca ttg ttg gag acg ata aag gag gca384His Phe Glu Val Ala Lys Tyr Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala115 120 125gtg ccg gag atg tgg tca ccg gag atg aag gtg gct tgg ggt cag gct
432Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Val Ala Trp Gly Gln Ala130 135 140tat gat cac ctt gtt gct gcc att aaa gct gaa atg aat ctt tcc aac480Tyr Asp His Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala Glu Met Asn Leu Ser Asn145 150 155 160taa 483<210>4<211>160<212>PRT<213>擬南芥菜<400>4Met Glu Ser Glu Gly Lys Ile Val Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu15 10 15Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly20 25 30Leu Lys Leu Phe Ile Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Thr Thr Lys Lys35 40 45Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Pro Ile Pro Ala Glu Gln Asn Pro50 55 60Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Cys Cys Glu Ser65 70 75 80Ala Val Gln Leu Arg Lys Thr Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Thr Thr85 90 95Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser His Ser Lys Tyr Gly Val Val Asp Glu
100 105 110His Phe Glu Val Ala Lys Tyr Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala115 120 125Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Val Ala Trp Gly Gln Ala130 135 140Tyr Asp His Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala Glu Met Asn Leu Ser Asn145 150 155 160<210>5<211>477<212>DNA<213>擬南芥菜<220>
<221>CDS<222>(1)..(477)<400>5atg gga gag att ggg ttt aca gag aag caa gaa gct ttg gtg aag gaa48Met Gly Glu Ile Gly Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Lys Glu15 10 15tcg tgg gag ata ctg aaa caa gac atc ccc aaa tac agc ctt cac ttc96Ser Trp Glu Ile Leu Lys Gln Asp Ile Pro Lys Tyr Ser Leu His Phe20 25 30ttc tca cag ata ctg gag ata gca cca gca gca aaa ggc ttg ttc tct144Phe Ser Gln Ile Leu Glu Ile Ala Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Ser35 40 45ttc cta aga gac tca gat gaa gtc cct cac aac aat cct aaa ctc aaa192Phe Leu Arg Asp Ser Asp Glu Val Pro His Asn Asn Pro Lys Leu Lys
50 55 60gct cat gct gtt aaa gtc ttc aag atg aca tgt gaa aca gct ata cag240Ala His Ala Val Lys Val Phe Lys Met Thr Cys Glu Thr Ala Ile Gln65 70 75 80ctg agg gag gaa gga aag gtg gta gtg gct gac aca acc ctc caa tat288Leu Arg Glu Glu Gly Lys Val Val Val Ala Asp Thr Thr Leu Gln Tyr85 90 95tta ggc tca att cat ctc aaa agc ggc gtt att gac cct cac ttc gag336Leu Gly Ser Ile His Leu Lys Ser Gly Val Ile Asp Pro His Phe Glu100 105 110gtg gtg aaa gaa gct ttg cta agg aca ttg aaa gag ggg ttg ggg gag384Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Arg Thr Leu Lys Glu Gly Leu Gly Glu115 120 125aaa tac aat gaa gaa gtg gaa ggt gct tgg tct caa gct tat gat cac432Lys Tyr Asn Glu Glu Val Glu Gly Ala Trp Ser Gln Ala Tyr Asp His130 135 140ttg gct tta gcc atc aag acc gag atg aaa caa gaa gag tca taa 477Leu Ala Leu Ala Ile Lys Thr Glu Met Lys Gln Glu Glu Ser145 150 155<210>6<211>158<212>PRT<213>擬南芥菜<400>6Met Gly Glu Ile Gly Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Lys Glu15 10 15Ser Trp Glu Ile Leu Lys Gln Asp Ile Pro Lys Tyr Ser Leu His Phe
20 25 30Phe Ser Gln Ile Leu Glu Ile Ala Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Ser35 40 45Phe Leu Arg Asp Ser Asp Glu Val Pro His Asn Asn Pro Lys Leu Lys50 55 60Ala His Ala Val Lys Val Phe Lys Met Thr Cys Glu Thr Ala Ile Gln65 70 75 80Leu Arg Glu Glu Gly Lys Val Val Val Ala Asp Thr Thr Leu Gln Tyr85 90 95Leu Gly Ser Ile His Leu Lys Ser Gly Val Ile Asp Pro His Phe Glu100 105 110Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Arg Thr Leu Lys Glu Gly Leu Gly Glu115 120 125Lys Tyr Asn Glu Glu Val Glu Gly Ala Trp Ser Gln Ala Tyr Asp His130 135 140Leu Ala Leu Ala Ile Lys Thr Glu Met Lys Gln Glu Glu Ser145 150 15權(quán)利要求
1.經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其表達(dá)至少一種豆血紅蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其包含至少一個(gè)編碼豆血紅蛋白的序列號(hào)1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其包含與序列號(hào)1具有約70％同一性的序列。
4.經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其表達(dá)至少一種血紅蛋白或表達(dá)至少一種豆血紅蛋白和至少一種血紅蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中豆血紅蛋白和/或血紅蛋白選自植物黃羽扇豆(Lupinus luteus)、大豆(Glycine max)、紫苜蓿(Medicago sativa)、Medicago trunculata、菜豆(Phaseolusvulgaris)、蠶豆(Vicia faba)、豌豆(Pisum sativum)、豇豆(Vignaunguiculata)、日本百脈根(Lotus japonicus)、四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)、狗尾草(Sesbania rostrata)、粗枝木麻黃(Casuarinaglauca)和Canvalaria lineata的豆血紅蛋白和/或血紅蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中豆血紅蛋白和/或血紅蛋白來(lái)源于日本百脈根和擬南芥菜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其以貯藏器官特異的方式表達(dá)豆血紅蛋白和/或血紅蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其以塊莖特異和/或種子特異的方式表達(dá)至少一種豆血紅蛋白和/或血紅蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其包含至少一個(gè)編碼血紅蛋白的序列號(hào)3和5，或其包含至少一個(gè)編碼豆血紅蛋白的序列號(hào)1和至少一個(gè)編碼血紅蛋白的序列號(hào)3和5。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其包含與序列號(hào)1、3和/或5具有約70％同一性的序列。
11.根據(jù)任一上述權(quán)利要求的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其產(chǎn)生淀粉和/或油。
12.根據(jù)任一上述權(quán)利要求的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其是單子葉作物植物，尤其是禾本科物種。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其是雙子葉作物植物，特別來(lái)自于菊科(Asteraceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)、茜草科(Rubiaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、山茶科(Theaceae)或傘形科(Umbelliferae)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其是馬鈴薯、擬南芥菜、大豆或油料種子油菜。
15.編碼豆血紅蛋白的序列號(hào)1中所示的核苷酸序列，其用于根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的植物中。
16.包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求15所述的核苷酸序列的基因結(jié)構(gòu)。
17.載體，其包含至少一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求15所述的核苷酸序列，或其包含一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求16所述的基因結(jié)構(gòu)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的植物，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求16所述的基因結(jié)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的植物，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求17所述的載體。
20.編碼血紅蛋白的序列號(hào)3和5中所示的核苷酸序列，其用于根據(jù)權(quán)利要求4-14中任意一項(xiàng)所述的植物中。
21.包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求20所述的核苷酸序列的基因結(jié)構(gòu)。
22.載體，其包含至少一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求20所述的核苷酸序列，或其包含一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求21所述的基因結(jié)構(gòu)。
23.根據(jù)權(quán)利要求4-14中任意一項(xiàng)所述的植物，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求21所述的基因結(jié)構(gòu)。
24.根據(jù)權(quán)利要求4-14中任意一項(xiàng)所述的植物，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求24所述的載體。
25.改變植物中貯藏儲(chǔ)備物含量的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)化植物，以使它們表達(dá)至少一種豆血紅蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中植物以使它們包含至少一個(gè)編碼豆血紅蛋白的序列號(hào)1的方式轉(zhuǎn)化。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中植物以使它們包含與序列號(hào)1具有約70％同一性的序列的方式轉(zhuǎn)化。
28.改變植物中貯藏儲(chǔ)備物含量的方法，其包括以使它們表達(dá)至少一種血紅蛋白或表達(dá)至少一種豆血紅蛋白和至少一種血紅蛋白的方式轉(zhuǎn)化植物。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任意一項(xiàng)所述的方法，其中豆血紅蛋白和血紅蛋白選自植物擬南芥菜、黃羽扇豆、大豆、紫苜蓿、Medicago trunculata、菜豆、蠶豆、豌豆、豇豆、日本百脈根、四棱豆、狗尾草、粗枝木麻黃和Canvalaria lineata的豆血紅蛋白和血紅蛋白。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-29中任意一項(xiàng)所述的方法，其中豆血紅蛋白和/或血紅蛋白來(lái)源于日本百脈根和擬南芥菜。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-30中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物以這種方式轉(zhuǎn)化，所述方式使它們以貯藏器官特異的方式表達(dá)豆血紅蛋白和血紅蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物以這種方式轉(zhuǎn)化，所述方式使它們以塊莖特異和/或種子特異的方式表達(dá)豆血紅蛋白和血紅蛋白。
33.根據(jù)權(quán)利要求25-32中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物以這種方式轉(zhuǎn)化，所述方式使它們包含至少一個(gè)編碼血紅蛋白的序列號(hào)3和/或5，或包含至少一個(gè)編碼豆血紅蛋白的序列號(hào)1和至少一個(gè)編碼血紅蛋白的序列號(hào)3和/或5。
34.根據(jù)上述權(quán)利要求26-33中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物以這種方式轉(zhuǎn)化，所述方式使它們包含與序列號(hào)1、3和/或5中的一個(gè)序列具有約70％同一性的序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-34中任意一項(xiàng)所述的方法，其中植物以這種方式轉(zhuǎn)化，所述方式使它們產(chǎn)生淀粉和/或油。
36.根據(jù)權(quán)利要求26-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)化單子葉作物植物，特別是禾本科物種。
37.根據(jù)上述權(quán)利要求26-36中任意一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)化雙子葉作物植物，特別是來(lái)自于菊科(Asteraceae)、蕓苔科、菊科(Compositae)、十字花科、葫蘆科、豆科、茜草科、茄科、梧桐科、山茶科或傘形科。
38.根據(jù)上述權(quán)利要求26-37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)化馬鈴薯、擬南芥菜、大豆或油料種子油菜。
39.根據(jù)上述權(quán)利要求26-38中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求15所述的核苷酸序列用于轉(zhuǎn)化。
40.根據(jù)權(quán)利要求25-39中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求16所述的基因結(jié)構(gòu)用于轉(zhuǎn)化。
41.根據(jù)權(quán)利要求25-40中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求17所述的載體用于轉(zhuǎn)化。
42.根據(jù)權(quán)利要求28-41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求20所述的核苷酸序列用于轉(zhuǎn)化。
43.根據(jù)權(quán)利要求28-42中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求21所述的基因結(jié)構(gòu)用于轉(zhuǎn)化。
44.根據(jù)權(quán)利要求28-43中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體用于轉(zhuǎn)化。
45.根據(jù)權(quán)利要求1-14、18或19中任意一項(xiàng)所述的植物的用途，用于產(chǎn)生淀粉和/或油。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-10、11-24中任意一項(xiàng)所述的植物的用途，用于產(chǎn)生淀粉和/或油。
全文摘要
本發(fā)明涉及改變植物中貯藏儲(chǔ)備物含量的方法、對(duì)應(yīng)的植物和它們的用途，其中采用的是表達(dá)豆血紅蛋白和/或血紅蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。
文檔編號(hào)C07K14/805GK1732265SQ200380107352
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月23日
發(fā)明者P·蓋根貝格爾, A·朗格, H·維格奧拉斯, M·施蒂特奈杰爾, T·J·范東恩, M·烏德沃爾迪 申請(qǐng)人:馬克思-普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)公司