專(zhuān)利名稱(chēng)：核苷酸衍生物和dna微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)發(fā)明涉及用于確定核苷酸序列中的特定堿基種類(lèi)的核苷酸衍生物，以及具有含有該核苷酸衍生物的捕獲探針的DNA微陣列。
背景技術(shù)：
隨著迎來(lái)后基因組時(shí)代，要求能夠正確、有效、進(jìn)而以低成本檢測(cè)核苷酸序列中的堿基種類(lèi)的新技術(shù)。例如，SNP(Single Nucleotide Polymorphism單核苷酸多態(tài)性)是在人類(lèi)基因組中以約0.1％(約1000堿基單核苷酸)的比例存在的頻率最高的多態(tài)性，已越來(lái)越明確，其有無(wú)狀態(tài)還會(huì)影響各種疾病(如與肺癌有關(guān)的p53基因的SNP非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，從而以診斷和遺傳治療法等為目的，正確判斷SNP的有無(wú)的技術(shù)(SNP分型)也就變得越來(lái)越重要。
作為SNP分型方法，已知有“利用雜交效率的方法”、“利用酶識(shí)別效率的方法”、“利用電氣性技術(shù)的方法”等，尤其是利用雜交效率的方法，正在被多方面研究應(yīng)用于DNA微陣列(如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1～4、非專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3)，如在非專(zhuān)利文獻(xiàn)4中報(bào)道了使用DNA微陣列(微陣列)的BRCAI基因SNP的檢測(cè)例。
但是，以往DNA微陣列不僅只限于檢測(cè)SNP，而且通常是由熒光等標(biāo)記目標(biāo)核苷酸序列，用熒光信號(hào)作為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)與微陣列的捕獲探針雜交的目標(biāo)核苷酸序列。因此，如調(diào)制目標(biāo)核苷酸序列時(shí)，使用采用了標(biāo)記dNTP的PCR擴(kuò)增等方法，但這會(huì)需要過(guò)多的勞力、時(shí)間和費(fèi)用。另外，檢測(cè)SNP等時(shí)，一般采用把雜交探針和目標(biāo)核苷酸序列時(shí)的熔解溫度作為指標(biāo)的方法，但此時(shí)，需要把雜交的嚴(yán)格度(stringency)條件對(duì)應(yīng)每個(gè)單個(gè)目標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行嚴(yán)格地設(shè)定，并且即使是如此設(shè)定條件，也會(huì)存在無(wú)法避免錯(cuò)誤雜交等引起的測(cè)定誤差的不良情況。
另一方面，已知有在天然的核酸堿基上連接熒光分子而得的熒光修飾核酸堿基，如在非專(zhuān)利文獻(xiàn)5中提出了利用根據(jù)所雜交的對(duì)鏈的情況而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度的熒光探針的方法。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1美國(guó)專(zhuān)利第5,474,796號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)2美國(guó)專(zhuān)利第5,605,662號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)3國(guó)際公開(kāi)第95/251116號(hào)小冊(cè)子專(zhuān)利文獻(xiàn)4國(guó)際公開(kāi)第95/35505號(hào)小冊(cè)子非專(zhuān)利文獻(xiàn)1Biros et al.Neoplasma 48(5)407-11，2001非專(zhuān)利文獻(xiàn)2Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9310614-10619，1996非專(zhuān)利文獻(xiàn)3Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942155，1997非專(zhuān)利文獻(xiàn)4Hacia JG et al.Nat.Genet.14441-447，1996非專(zhuān)利文獻(xiàn)5Nucleic Acids Res.30e97，2002發(fā)明內(nèi)容如上所述，為了確定SNP檢測(cè)等中的堿基種類(lèi)，尤其是考慮應(yīng)用DNA微陣列時(shí)，需要一種不需要用熒光等標(biāo)記目標(biāo)核苷酸序列，并且不依賴(lài)于熔解溫度測(cè)定等間接性指標(biāo)的新的方法。從這種觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，使用熒光修飾核酸堿基的探針(如非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)，可以把探針側(cè)的熒光信號(hào)變化作為指標(biāo)而直接確定堿基種類(lèi)，從這方面來(lái)說(shuō)是有效的方法。其中，該非專(zhuān)利文獻(xiàn)5的情況下，把與熒光修飾核酸堿基配對(duì)的堿基種類(lèi)的周邊環(huán)境(特定的堿基序列等)所對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)作為指標(biāo)，并非根據(jù)單堿基的種類(lèi)而變化熒光信號(hào)。
本申請(qǐng)發(fā)明就是鑒于如上所述的問(wèn)題而進(jìn)行的，其課題為提供能夠根據(jù)雜交的對(duì)方鏈的相應(yīng)堿基種類(lèi)而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度的新的核苷酸衍生物。
另外，本申請(qǐng)發(fā)明的課題為提供使用所述核苷酸衍生物的堿基種類(lèi)的確定方法、及以該方法為測(cè)定原理的DNA微陣列。
本申請(qǐng)的第一個(gè)發(fā)明是，在嘧啶堿基或嘌呤堿基上經(jīng)接頭(linker)連接了熒光色素嵌入劑而成的核苷酸衍生物，其特征為，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，當(dāng)該單鏈核苷酸序列的雜交對(duì)方鏈的相應(yīng)堿基為，(1)腺嘌呤時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鳥(niǎo)嘌呤時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的胞嘧啶衍生物；
(3)胞嘧啶時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的鳥(niǎo)嘌呤衍生物。
該第一個(gè)發(fā)明中，“核苷酸衍生物”是，在核苷酸，即嘌呤或嘧啶與糖進(jìn)行β-N-糖苷結(jié)合而得的核苷的磷酸酯(ATP、GTP、CTP、UTP；或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的任意位置，經(jīng)亞烷基鏈連接熒光色素嵌入劑而成的化合物。另外，該核苷酸衍生物“作為單鏈核苷酸序列的成員存在”是指，在3個(gè)核苷酸或其以上的核苷酸序列中的非端部位置，核苷酸衍生物與其左右的核苷酸形成磷酸二酯鍵的狀態(tài)。進(jìn)而，“熒光色素發(fā)光最強(qiáng)”是指，例如用熒光分光光度計(jì)測(cè)定時(shí)，如胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物時(shí)，與對(duì)應(yīng)的堿基種類(lèi)為鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶/尿嘧啶時(shí)相比，對(duì)應(yīng)的堿基種類(lèi)為腺嘌呤時(shí)可以得到更強(qiáng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
另外，在以下說(shuō)明中有時(shí)只用“尿嘧啶(U)”或“胸腺嘧啶(T)”來(lái)記載“胸腺嘧啶/尿嘧啶”。
該第一個(gè)發(fā)明的具體例是由以下通式(1)表示的胸腺嘧啶衍生物 由以下通式(2)表示的胞嘧啶衍生物
由以下通式(3)表示的腺嘌呤衍生物 以及，由以下通式(4)表示的鳥(niǎo)嘌呤衍生物
并且，本申請(qǐng)的第二個(gè)發(fā)明是所述各核苷酸衍生物的前體物質(zhì)的具體例，分別為如下的核苷衍生物。
是胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的前體物質(zhì)，且由以下通式(5)表示的核苷衍生物。

是胞嘧啶衍生物的前體物質(zhì)，且由以下通式(6)表示的核苷衍生物。
是腺嘌呤衍生物的前體物質(zhì)，且由以下通式(7)表示的核苷衍生物。
是鳥(niǎo)嘌呤衍生物的前體物質(zhì)，且由以下通式(8)表示的核苷衍生物。
上述通式(1)～(8)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同，表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
本申請(qǐng)的第三個(gè)發(fā)明是，將所述第一個(gè)發(fā)明的核苷酸衍生物(1)～(4)中的一個(gè)或其以上作為成員而具有的單鏈核苷酸序列。
該第三個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列中，可以是任一種核苷酸衍生物存在多個(gè)，也可以是兩種或其以上的核苷酸衍生物各自存在一個(gè)，或者各自存在多個(gè)。其中，如上所述，該單鏈核苷酸序列中，核苷酸衍生物不存在于序列的端部。
本申請(qǐng)的第四個(gè)發(fā)明是，確定所述第三個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列的雜交對(duì)方鏈的單堿基X的方法，是確定下述情況中的堿基種類(lèi)的方法(i)單鏈核苷序列中的胸腺嘧啶衍生物(1)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，則確定堿基X為腺嘌呤；(ii)單鏈核苷序列中的胞嘧啶衍生物(2)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，則確定堿基X為鳥(niǎo)嘌呤；(iii)單鏈核苷序列中的腺嘌呤衍生物(3)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，則確定堿基X為胞嘧啶；(iv)單鏈核苷序列中的鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，則確定堿基X為胞嘧啶或胸腺嘧啶。
該第四個(gè)發(fā)明的方法的優(yōu)選方案為，把在同一位置分別具有腺嘌呤衍生物(3)和鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)的兩條單鏈核苷酸序列分別與相同互補(bǔ)鏈雜交，進(jìn)行如下確定(v)腺嘌呤衍生物(3)和鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)雙方的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，則確定互補(bǔ)鏈的堿基X為胞嘧啶；(vi)只是鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，則確定互補(bǔ)鏈的堿基種類(lèi)X為胸腺嘧啶。
第四個(gè)發(fā)明的所述方案中，“兩條單鏈核苷酸序列”是指除了核苷酸衍生物(3)(4)以外由完全相同的堿基序列構(gòu)成的兩條單鏈核苷酸序列。
本申請(qǐng)的第五個(gè)發(fā)明是把所述第二個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針的DNA微陣列。
所述第五個(gè)發(fā)明的DNA微陣列的一個(gè)方案如下其是檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA微陣列，捕獲探針的組與目標(biāo)核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的區(qū)段互補(bǔ)，各個(gè)捕獲探針是，其對(duì)應(yīng)于目標(biāo)核苷酸序列的SNP核苷酸的部位的核苷酸各自為核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五個(gè)發(fā)明的DNA微陣列的另一個(gè)方案如下其是確定序列未知的n(n＝3～100)個(gè)核苷酸序列的DNA微陣列，捕獲探針是核苷酸序列完全不同的至少4n個(gè)探針的組，各捕獲探針從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五個(gè)發(fā)明的DNA微陣列的再一個(gè)方案如下其是檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列中是否存在與由n(n＝3～100)個(gè)核苷酸構(gòu)成的已知序列區(qū)段相同區(qū)段的DNA微陣列，捕獲探針組與目標(biāo)核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補(bǔ)，各個(gè)捕獲探針從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五個(gè)發(fā)明的DNA微陣列的又一個(gè)方案如下其是確定具有由n(n＝3～100)個(gè)核苷酸構(gòu)成的未知序列區(qū)段和已知序列區(qū)段的目標(biāo)核苷酸序列的未知序列區(qū)段的序列的DNA微陣列，捕獲探針組是具有對(duì)應(yīng)于目標(biāo)核苷酸序列中的已知序列區(qū)段的互補(bǔ)序列和核苷酸序列完全不同的探針序列區(qū)段的至少4n個(gè)探針的組，各探針序列區(qū)段從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物(1)～(4)。
本申請(qǐng)各發(fā)明中的具體構(gòu)成、用語(yǔ)和概念將在發(fā)明的實(shí)施方式的說(shuō)明和實(shí)施例中進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)定。另外，為了實(shí)施該發(fā)明而使用的各種技術(shù)，除了特別指出其出處的技術(shù)以外，都是基于公知的文獻(xiàn)等，只要是本行業(yè)熟練人員都可以容易且確實(shí)地實(shí)施。例如，基因工學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在Sambrookand Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989；Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等中有記載。
發(fā)明效果根據(jù)所述的第一個(gè)發(fā)明，提供對(duì)應(yīng)于雜交的對(duì)方鏈的相應(yīng)堿基種類(lèi)而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度的新的核苷酸衍生物。不需要目標(biāo)核苷酸序列的標(biāo)記操作，并且不用依賴(lài)于熔解溫度測(cè)定等間接性指標(biāo)，通過(guò)直接測(cè)定捕獲探針發(fā)出的熒光強(qiáng)度就可以測(cè)定目標(biāo)核苷酸序列的特定堿基種類(lèi)。并且，本發(fā)明的核苷酸衍生物不是以基于于堿基的周邊環(huán)境(特定的堿基序列等)的熒光信號(hào)為指標(biāo)，而只是基于配對(duì)的堿基種類(lèi)而變化熒光信號(hào)，因此不管目標(biāo)序列為何種序列都可以應(yīng)用。
根據(jù)所述的第二個(gè)發(fā)明，提供所述第一個(gè)發(fā)明的核苷酸衍生物的前體即核苷衍生物。通過(guò)使用該核苷衍生物，可以容易地制成所述第一個(gè)發(fā)明的核苷酸衍生物。
根據(jù)所述的第三個(gè)發(fā)明，提供具有所述第一個(gè)發(fā)明的核苷酸衍生物的單鏈核苷酸序列，通過(guò)把該核苷酸序列作為探針，可以確定目標(biāo)核苷酸序列中的未知堿基的堿基。
根據(jù)所述的第四個(gè)發(fā)明，提供通過(guò)把所述第三個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列用作探針，確定目標(biāo)核苷酸序列中的未知堿基的堿基種類(lèi)的方法。該方法可以把探針的熒光強(qiáng)度作為指標(biāo)而簡(jiǎn)便確實(shí)地確定未知堿基種類(lèi)。
根據(jù)所述的第五個(gè)發(fā)明，提供把所述第三個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針的DNA微陣列。由此，可以把捕獲探針的熒光強(qiáng)度作為指標(biāo)而簡(jiǎn)便確實(shí)地確定目標(biāo)核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、序列未知的核苷酸序列的序列、目標(biāo)核苷酸序列中是否存在與已知序列區(qū)段相同的區(qū)段等。


圖1表示分別使在第3位具有核苷酸衍生物的探針序列與在第3位含有未知堿基X的目標(biāo)核苷酸序列雜交來(lái)確定堿基X的例子。由于具有T衍生物的探針序列發(fā)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)，所以可以確定目標(biāo)核苷酸序列的未知堿基X是腺嘌呤。
圖2表示，分別使在第3位具有A衍生物及G衍生物的探針序列與在第3位含有未知堿基X的目標(biāo)核苷酸序列雜交，來(lái)確定堿基X的例子。由于在上部是具有A衍生物及G衍生物的探針序列發(fā)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)，所以可以確定目標(biāo)核苷酸序列的未知堿基X是胞嘧啶。由于在下部是具有G衍生物的探針序列發(fā)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)，所以可以確定目標(biāo)核苷酸序列的未知堿基X是胸腺嘧啶。
圖3表示，分別使在第4位具有核苷酸衍生物的探針序列與在第4位含有G/A多態(tài)性的雙鏈核苷酸序列雜交，來(lái)確定G/A多態(tài)性的例子。在上部表示的G/G純合時(shí)，在該位置含有C衍生物的探針發(fā)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)，在中部表示的G/A雜合時(shí)，則含有C衍生物的探針和含有T衍生物的探針發(fā)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)，在下部表示的A/A純合時(shí)，從含有T衍生物的捕獲探針得到強(qiáng)信號(hào)。
圖4表示確定序列未知的6-mer寡核苷酸(NNNNNN)的堿基序列的例子。對(duì)于第1位的X，從在該位置含有T衍生物的捕獲探針得到強(qiáng)信號(hào)，由此可以確定該寡核苷酸的第1位X是與胸腺嘧啶(T)互補(bǔ)結(jié)合的腺嘌呤(A)。同樣地通過(guò)研究第2～6位，從而確定該6-mer寡核苷酸是由AGGCGA構(gòu)成的序列。
圖5表示目標(biāo)核苷酸序列對(duì)于目的已知序列區(qū)段有一部分不一致時(shí)，確定其不一致堿基的例子。在第3位具有T衍生物的探針和在第6位具有C衍生物的探針各自發(fā)出強(qiáng)信號(hào)，從而可以知道目標(biāo)核苷酸序列的第3位被A取代，第6位被G取代。
圖6是本發(fā)明的核苷酸衍生物的一例(PyU(5)、PyC(5))的合成工序。Py是1-芘基、DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基。
圖7是本發(fā)明的核苷酸衍生物的一例(PyA(7))的合成工序。Py是1-芘基、DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基。
圖8是本發(fā)明的核苷酸衍生物的一例(PyG(8))的合成工序。
圖9表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上與PyC(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧鳥(niǎo)苷酸(G)時(shí)發(fā)出強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
圖10表示另一熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上與PyC(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧鳥(niǎo)苷酸(G)時(shí)發(fā)出強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
圖11表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上與PyU(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧鳥(niǎo)苷酸(A)時(shí)發(fā)出強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
圖12是圖11所表示結(jié)果的熒光照片圖像。
圖13表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上與PyU(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧鳥(niǎo)苷酸(A)時(shí)發(fā)出強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
圖14表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上與PyA(7)配對(duì)的核苷酸為脫氧胞苷酸(C)時(shí)發(fā)出強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
圖15表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上與PyG(8)配對(duì)的核苷酸為脫氧胞苷酸(C)時(shí)和脫氧胸腺酸(T)時(shí)發(fā)出強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
具體實(shí)施例方式
第一個(gè)發(fā)明是，在嘧啶堿基或嘌呤堿基上經(jīng)接頭連接了熒光色素嵌入劑而成的核苷酸衍生物，其特征為，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，可以識(shí)別該單鏈核苷酸序列雜交的對(duì)方鏈的相應(yīng)特定堿基，發(fā)出比其他堿基種類(lèi)相對(duì)較強(qiáng)的熒光信號(hào)。具體講是，(1)識(shí)別腺嘌呤(A)的胸腺嘧啶(T)衍生物；(2)識(shí)別鳥(niǎo)嘌呤(G)的胞嘧啶(C)衍生物；(3)識(shí)別胞嘧啶(C)的腺嘌呤(A)衍生物；以及
(4)識(shí)別胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的鳥(niǎo)嘌呤(G)衍生物。
“熒光色素嵌入劑”是能夠插入到雙鏈核苷酸序列的相鄰核苷酸對(duì)之間的物質(zhì)，同時(shí)也是發(fā)出熒光的物質(zhì)。作為這種物質(zhì)，可以使用發(fā)出熒光信號(hào)、且產(chǎn)生嵌入作用的芘(1-芘基)等?；蛘咭部梢允褂迷诠那度雱┥辖Y(jié)合同樣公知的熒光物質(zhì)而成的物質(zhì)。作為嵌入劑，可以使用如吖啶橙、普魯黃素、溴化乙錠、放線(xiàn)菌素D等芳香族色素分子。另外，作為熒光物質(zhì)，可以使用如熒光素異硫氰酸酯(FITC)、羅丹明衍生物(如羅丹明B異硫氰酸酯、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(RITC)、四甲基羅丹明異硫氰酸酯異構(gòu)體R)等。另外，嵌入劑和熒光物質(zhì)的結(jié)合是，可以利用硫醇基和馬來(lái)酰亞胺基的反應(yīng)、吡啶二硫化物和硫醇基的反應(yīng)、氨基和醛基的反應(yīng)等，可以從公知的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實(shí)施的方法、進(jìn)而它們經(jīng)修飾后的方法中適當(dāng)選擇應(yīng)用。
用于在嘧啶堿基或嘌呤堿基上連接嵌入劑的“接頭”可以使用如碳鏈或聚合物等。進(jìn)而，經(jīng)過(guò)接頭連接嵌入劑的嘧啶堿基或嘌呤堿基的位置，可以從各自的非取代碳位置任意選擇使用。即，嘧啶堿基時(shí)，為第4位或第5位，嘌呤堿基時(shí)，為第7位或第8位。
這種核苷酸衍生物，更具體地講，可以各自用前述通式(1)～(4)各自表示。即，式(1)是嘧啶堿基第5位取代的T衍生物、式(2)是嘧啶堿基第5位取代的C衍生物、式(3)是嘌呤堿基第7位取代的A衍生物、式(4)是嘌呤堿基第8位取代的G衍生物。在以下敘述中，用芘(Py)作為熒光色素嵌入劑時(shí)，這些核苷酸衍生物有時(shí)會(huì)各自被記載為PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)。
這些核苷酸衍生物可以使用嘧啶堿基或嘌呤堿基、接頭、及適宜的熒光色素嵌入劑，由例如后述實(shí)施例中記載的方法合成。另外，所述通式(1)～(4)中表示的核苷酸衍生物的情況下，可以通過(guò)前述通式(5)～(8)表示的核苷衍生物作為前體，來(lái)容易地制作。
另外，通式(1)～(8)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同，表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，表示亞烷基鏈長(zhǎng)度的整數(shù)n，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9的取代基是鹵原子、含氧基、含氮基、含硫基、及含有這些原子或取代基的烴基或雜環(huán)基等。更詳細(xì)地說(shuō)，取代基是鹵原子、烷氧基、酯基、氨基、取代氨基、硝基、酰胺基、氰基、氨基甲酸酯基、脲基、硫醇基、硫醚基、硫酯基等。另外，也可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R8并非同時(shí)為氫原子，可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中彼此相鄰基團(tuán)結(jié)合而形成苯基，該苯基可以具有取代基。
第3個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列是具有一個(gè)或多個(gè)前述核苷酸衍生物的3～200個(gè)、優(yōu)選是10～100個(gè)核苷酸的序列(寡核苷酸、或者核苷酸片段)。這種單鏈核苷酸序列可以采用如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic Acid Res.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美國(guó)專(zhuān)利第4,458,066號(hào)中記載的眾所周知的化學(xué)合成技術(shù)，在在試管中合成。另外，也可以使用DNA合成裝置自動(dòng)合成。
通過(guò)利用以上的單鏈核苷酸序列，可以實(shí)施本申請(qǐng)的第四個(gè)發(fā)明的堿基種類(lèi)確定方法。
該第四個(gè)發(fā)明是，使含有未知堿基X的目標(biāo)核苷酸序列和、在與堿基X相同的位置具有核苷酸衍生物的第三個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列(以下有時(shí)也記載為“探針序列”)進(jìn)行雜交，當(dāng)核苷酸衍生物(1)～(4)的各自熒光色素發(fā)出最強(qiáng)熒光信號(hào)時(shí)，如下確定堿基X(i)T衍生物的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，為腺嘌呤；(ii)C衍生物的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，為鳥(niǎo)嘌呤；(iii)A衍生物的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，為胞嘧啶；(iv)G衍生物的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，為胞嘧啶或胸腺嘧啶。
此時(shí)的“發(fā)光最強(qiáng)”是指，例如在觀(guān)察到，PyU(5)時(shí)與其他核苷酸相比為約大于等于3倍、PyC(5)時(shí)為大于等于1.5倍、PyA(7)時(shí)為大于等于2.5倍、PyG(8)時(shí)為大于等于2倍的發(fā)光信號(hào)的情況下，可以如上所述確定各自配對(duì)的堿基種類(lèi)。
具體講，例如圖1所示的例子中，對(duì)于在第3位含有未知堿基X的目標(biāo)核苷酸序列，準(zhǔn)備各自在第3位具有A衍生物、T衍生物、G衍生物、C衍生物的探針序列，把各個(gè)探針序列雜交到目標(biāo)核苷酸序列上，則由于具有T衍生物的探針序列發(fā)出最強(qiáng)的熒光信號(hào)，所以可以確認(rèn)目標(biāo)核苷酸序列的未知堿基X為腺嘌呤。
只是，所述第四個(gè)發(fā)明的方法中，A衍生物和G衍生物一同識(shí)別胞嘧啶，G衍生物分別識(shí)別胞嘧啶和胸腺嘧啶。因此，第四個(gè)發(fā)明的方法為，如在圖2所示，把在相同位置分別具有A衍生物和G衍生物的兩條單鏈核苷酸序列雜交到各自相同的對(duì)方鏈上，通過(guò)組合各自的熒光信號(hào)強(qiáng)度，如下確定堿基X。
(v)A衍生物和G衍生物雙方的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，為胞嘧啶；(vi)只是G衍生物的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，為胸腺嘧啶。
根據(jù)如上所述方法，可以檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列的SNP、確定未知序列的序列、是否存在與已知序列區(qū)段相同的區(qū)段、或者確定已知序列區(qū)段內(nèi)的未知序列等。這些可以作為使用所述探針序列的常規(guī)雜交分析來(lái)實(shí)施，尤其可以在把所述探針序列作為捕獲探針的DNA微陣列中實(shí)施。
第五個(gè)發(fā)明的DNA微陣列，除了把所述第三個(gè)發(fā)明的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針以外，可以與通常的DNA微陣列同樣地制作。作為DNA微陣列的制作方法，已知有在固相載體表面直接合成捕獲探針的方法(在片法)、把預(yù)先制備的捕獲探針固定在固相載體表面的方法，但本發(fā)明的DNA微陣列優(yōu)選采用后一方法制作。就把預(yù)先制備的捕獲探針固定在固相載體表面的情況而言，合成引入了官能團(tuán)的捕獲探針，在進(jìn)行了表面處理的固相載體表面點(diǎn)印捕獲探針，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.222121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.225456-5465，1994)。捕獲探針一般是在進(jìn)行了表面處理的固相載體上經(jīng)間隔子(spacer)或交聯(lián)劑進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。也已知有在玻璃表面排列聚丙烯酰胺凝膠的微小片，使其與捕獲探針進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法(Yershov，G. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944913，1996)。另外，也已知有在硅微陣列上制作微小電極陣列，在電極上設(shè)置含有鏈霉親和素的瓊脂糖的滲透層作為反應(yīng)部位，通過(guò)使該部位呈正電荷，固定生物素化捕獲探針，控制部位的電荷，以進(jìn)行高速而嚴(yán)格的雜交的方法(Sosnowski，R.G. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941119-1123，1997)。本發(fā)明的DNA微陣列可以用以上的任意方法制作。
另外，該DNA微陣列和目標(biāo)核苷酸序列的雜交也可以與通常的DNA微陣列同樣地進(jìn)行。即，使目標(biāo)核苷酸序列與DNA微陣列接觸，雜交到DNA微陣列的捕獲探針上。雜交可以通過(guò)分注到96孔或384孔塑料板上，把標(biāo)記cDNA水性液點(diǎn)印在微陣列上來(lái)實(shí)施。點(diǎn)印量可以是1～100nl左右。雜交優(yōu)選在室溫～70℃的溫度范圍、6～20小時(shí)的范圍實(shí)施。雜交結(jié)束后，使用表面活性劑和緩沖液的混合溶液進(jìn)行清洗，去除未反應(yīng)的標(biāo)記cDNA。作為表面活性劑，優(yōu)選使用十二烷基硫酸鈉(SDS)。作為緩沖液，可以使用檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、tris緩沖液、Good′s緩沖液等，但優(yōu)選使用檸檬素緩沖液。
其中，本發(fā)明的DNA微陣列時(shí)，由于雜交了目標(biāo)核苷酸序列的捕獲探針發(fā)出熒光信號(hào)，所以并不需要象通常的DNA微陣列那樣對(duì)目標(biāo)核苷酸序列附加標(biāo)記標(biāo)簽等。
本第五個(gè)發(fā)明的DNA微陣列的一個(gè)方式，是用于檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA微陣列。即，該DNA微陣列的捕獲探針組，與目標(biāo)核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的區(qū)段互補(bǔ)，各捕獲探針的與目標(biāo)核苷酸序列的SNP核苷酸對(duì)應(yīng)的位置的核苷酸是各自不同的核苷酸衍生物。從而，以捕獲探針中的核苷酸衍生物發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度作為指標(biāo)，可以檢測(cè)目標(biāo)寡核苷酸序列的SNP。例如，圖3所示G/A多態(tài)性的情況，G/G純合時(shí)是在該位置含有C衍生物的捕獲探針發(fā)出強(qiáng)熒光信號(hào)，而G/A雜合時(shí)則是含有C衍生物的捕獲探針和含有T衍生物的捕獲探針發(fā)出強(qiáng)熒光信號(hào)。另外，A/A純合體時(shí)是從含有T衍生物的捕獲探針得到強(qiáng)熒光信號(hào)。
本發(fā)明DNA微陣列的另一方案為，用于確定序列未知的n(n＝3～100)個(gè)核苷酸序列的DNA微陣列。即，該DNA微陣列中，捕獲探針是核苷酸序列完全不同的至少4n個(gè)探針的組，其特征在于，各捕獲探針從第1位到第n位是順次不同的核苷酸衍生物。例如，如圖4表示的序列未知的6-mer寡核苷酸(NNNNNN)時(shí)，對(duì)于第1位的X，從在該位置含有T衍生物的捕獲、針得到強(qiáng)信號(hào)時(shí)，該寡核苷酸的第1位X是與胸腺嘧啶(T)互補(bǔ)結(jié)合的腺嘌呤(A)。同樣地研究第2～6位，就可以確定該6-mer寡核苷酸是由AGGCGA構(gòu)成的序列。另外，通過(guò)比較如圖2所示的A衍生物和G衍生物的熒光，還可以確定含有胸腺嘧啶(T)的未知序列。并且，用通常的測(cè)序儀無(wú)法確定短鏈(3～100)的寡核苷酸的序列，但使用本發(fā)明的DNA微陣列，就可以簡(jiǎn)便且正確地確定短鏈寡核苷酸的序列。
本發(fā)明的DNA微陣列的再一個(gè)方案是，用于檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列中是否存在與由n(n＝3～100)個(gè)核苷酸構(gòu)成的已知序列區(qū)段(區(qū)域(domain)或模體(motif))相同區(qū)段的DNA微陣列。即，其特征在于，該DNA微陣列中的捕獲探針組與已知序列區(qū)段互補(bǔ)，各捕獲探針從第1位到第n位是順次不同的核苷酸衍生物。從而，如當(dāng)目標(biāo)核苷酸序列具有與目的的已知序列區(qū)段完全相同的序列時(shí)，可以從在對(duì)應(yīng)于已知序列的各位置含有給定核苷酸衍生物的所有捕獲探針得到強(qiáng)信號(hào)。另一方面，如圖5所示，當(dāng)?shù)?位被A取代、第6位被G取代時(shí)，在第3位含有T衍生物的捕獲探針和在第6位含有C衍生物的捕獲探針各自發(fā)出強(qiáng)信號(hào)。由此，不僅可以檢測(cè)是否存在與已知序列區(qū)段完全一致的序列，還可以簡(jiǎn)便且容易地檢測(cè)是否存在一部分不一致的相同序列。
進(jìn)而，本發(fā)明的DNA微陣列的再另一個(gè)方案是，確定具有由n(n＝3～100)個(gè)核苷酸構(gòu)成的未知序列區(qū)段和已知序列區(qū)段的目標(biāo)核苷酸序列的未知序列區(qū)段的序列的DNA微陣列。即，該DNA微陣列中，捕獲探針組是具有與目標(biāo)核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補(bǔ)的序列和核苷酸序列完全不同的探針序列區(qū)段的至少4n個(gè)探針的組，各探針序列區(qū)段從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物。此時(shí)，目標(biāo)核苷酸序列和捕獲探針是根據(jù)其已知序列區(qū)段的互補(bǔ)性而雜交，并根據(jù)與前述相同的用于確定未知序列的捕獲探針發(fā)出的熒光信號(hào)來(lái)確定其序列。
實(shí)施例下面，對(duì)于本發(fā)明的核苷酸衍生物表示實(shí)施例，但本發(fā)明并不受以下例子的限定。
實(shí)施例1核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))的合成按照?qǐng)D6和7，如下合成核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))。其中，化合物的序號(hào)對(duì)應(yīng)于圖6和7的序號(hào)。
方案i(化合物2的合成)把丙炔胺(1，和光純藥)和1-芘基羧酸(2，Aldrich(アルドリツチ))(1∶1)，在縮合劑PyBOP(1當(dāng)量，NOVA Biochem)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物2(91％)。
方案ii(化合物4PyU(5)的核苷衍生物的合成)把3(把5-碘-2’-脫氧尿苷(西格瑪)在4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(東京化成)和吡啶中攪拌而得到)和2(1∶1)在(四三苯膦)鈀(0.15當(dāng)量，和光純藥)、碘化銅(0.3當(dāng)量，和光純藥)、三乙胺(1當(dāng)量，和光純藥)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫?cái)嚢?0小時(shí)，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物4(82％)。
方案iii(化合物5的合成)把4在3％三氯醋酸-二氯甲烷溶液(Glen Research公司)中，在室溫?cái)嚢?分鐘，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物5(27％)。
方案iv(化合物6PyU(5)的合成)把4和2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1當(dāng)量，同仁化學(xué))存在下，在乙腈中，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，直接用于DNA合成儀。
方案v(化合物8的合成)把5-碘-2’-脫氧胞苷(7，生化學(xué)工業(yè))，在N，N-二甲基甲酰胺二乙縮醛(1當(dāng)量，東京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在55度攪拌2小時(shí)，并濃縮。粗產(chǎn)物8供于下一反應(yīng)。
方案vi(化合物9的合成)把化合物8和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(東京化成)(1∶1)，在吡啶中，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物9(50％在兩個(gè)步驟)。
方案vii(化合物10PyC(5)的核苷衍生物的合成)把化合物9和2(1∶1)在(四三苯膦)鈀(0.15當(dāng)量，和光純藥)、碘化銅(0.3當(dāng)量，和光純藥)、三乙胺(1當(dāng)量，和光純藥)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫?cái)嚢?2小時(shí)，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物10(47％)。
方案viii(化合物11PyC(5)的合成)把化合物4和2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1當(dāng)量，同仁化學(xué))存在下，在乙腈中，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，直接用于DNA合成儀。
方案ix(化合物13的合成)把化合物12(Ramzaeva and Seela，Helv.Chim.Acta 78，1083-1090(1995))和2(1∶2)在(四三苯膦)鈀(0.1當(dāng)量，和光純藥)、碘化銅(0.1當(dāng)量，和光純藥)、三乙胺(2當(dāng)量，和光純藥)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物13(88％)。
方案x(化合物14的合成)把化合物13，在N，N-二甲基甲酰胺二乙縮醛(1當(dāng)量，東京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在50度攪拌3小時(shí)，并濃縮。粗產(chǎn)物供于下一反應(yīng)。
方案xi(化合物15PyA(7)的核苷衍生物的合成)把化合物14和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(東京化成)(1∶1)，在N，N-二甲基氨基吡啶催化劑量存在下，在吡啶中，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，萃取，用柱色譜精制后，得到產(chǎn)物15(73％在兩個(gè)步驟)。
方案xii(化合物16PyA(7)的合成)把化合物4和2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1當(dāng)量，同仁化學(xué))存在下，在乙腈中，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，直接用于DNA合成儀。
實(shí)施例2核苷酸衍生物(PyG(8))的合成按照?qǐng)D8，如下合成核苷酸衍生物(PyG(8))。其中，化合物的序號(hào)對(duì)應(yīng)于圖8的序號(hào)。
方案1(化合物2的合成)使用1-溴化芘作為起始原料，通過(guò)與三甲基甲硅烷基乙酸甘油酯發(fā)生Sonogashira偶合反應(yīng)，得到化合物1。接著，在甲醇中由甲醇鈉去除保護(hù)基三甲基甲硅烷基，得到化合物2(芘單元)(生成率70％)。
方案2(化合物6PyG(8)的核苷衍生物的合成)在2’-脫氧鳥(niǎo)苷中加入N-溴化琥珀酰亞胺，通過(guò)在水中反應(yīng)而得到化合物3(生成率60％)。接著，用叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，由叔丁基二甲基甲硅烷基來(lái)保護(hù)化合物3的糖的3’位和5’位的羥基，然后與化合物2進(jìn)行Sonogashira偶合反應(yīng)而得到化合物5(生成率61％)。由TBAF去除化合物5的羥基保護(hù)基即叔丁基二甲基甲硅烷基而得到單體化合物6(生成率60％)。
方案3(化合物10PyG(8)的合成)使化合物3在DMF中與DMF二乙縮醛反應(yīng)而得到化合物7。由4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物在化合物7的5’位的羥基導(dǎo)入4，4’-二甲氧基三苯甲基，得到化合物8(生成率22％)。通過(guò)Sonogashira偶合反應(yīng)在該化合物8的8位導(dǎo)入化合物2，得到化合物9(生成率58％)。最后，在乙腈和二氯甲烷中與N，N，N’，N’-四異丙基氰乙基亞磷二酰胺，以四唑?yàn)樗嵝曰罨瘎┻M(jìn)行反應(yīng)，合成作為amidite單元的化合物10。把它作為0.1M乙腈溶液供于DNA合成儀。
實(shí)施例3寡脫氧核糖核苷酸的合成使用在實(shí)施例1制成的核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))、及在實(shí)施例2制成的核苷酸衍生物(PyG(8))，合成含有核苷酸衍生物的寡脫氧核糖核苷酸。寡脫氧核糖核苷酸是用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的392DNA/RNA合成儀按照通常的亞磷酰胺法合成。從固相載體切取及脫保護(hù)是，通過(guò)在25％的氨水中，孵育一定溫度和一定時(shí)間來(lái)進(jìn)行，然后利用高效液相色譜精制。
實(shí)施例4
含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(1)的熒光分析把在實(shí)施例3得到的含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyCCAAGCG-3；序列號(hào)1)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計(jì)在約25℃測(cè)定該溶液的熒光光譜的結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為329nm、發(fā)射波長(zhǎng)為400nm，在400nm的熒光強(qiáng)度為7.0。
在上述溶液中分別添加與含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互補(bǔ)的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列號(hào)2)；(T’)5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列號(hào)3)；(G’)5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列號(hào)4)；(C’)5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列號(hào)5)。
用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液的熒光光譜的結(jié)果是，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為4.1。添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為2.6；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為18.3；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為1.4。
這樣，對(duì)于含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上的與PyC(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧鳥(niǎo)苷酸時(shí)，可以觀(guān)察得到強(qiáng)發(fā)光，與此相比，當(dāng)為脫氧腺苷酸時(shí)，熒光就消光78％；當(dāng)為脫氧胸苷酸時(shí)，熒光就消光86％；當(dāng)為脫氧胞苷酸時(shí)熒光就消光92％。在圖9表示熒光光譜。
實(shí)施例5含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(2)的熒光分析把在實(shí)施例3得到的含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyCTAAGCG-3；序列號(hào)6)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計(jì)在約25℃測(cè)定該溶液的熒光光譜的結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為327nm、發(fā)射波長(zhǎng)為405nm，在405nm的熒光強(qiáng)度為9.2。
在上述溶液中分別添加與含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互補(bǔ)的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列號(hào)7)；(T’)5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列號(hào)8)；(G’)5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列號(hào)9)；(C’)5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列號(hào)10)。
用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液的熒光光譜的結(jié)果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A')時(shí)，在405nm的熒光強(qiáng)度為10.9。添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為8.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為18.2；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時(shí)，在400nm的熒光強(qiáng)度為11.9。
這樣，對(duì)于含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上的與PyC(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧鳥(niǎo)苷酸時(shí)，可以觀(guān)察得到強(qiáng)發(fā)光，與此相比，當(dāng)為脫氧腺苷酸時(shí)，熒光就消光40％；當(dāng)為脫氧胸苷酸時(shí)，熒光就消光52％；當(dāng)脫氧胞苷酸時(shí)，熒光就消光35％。在圖10表示熒光光譜。
比較該實(shí)施例5和所述實(shí)施例4的結(jié)果，可以確認(rèn)核苷酸衍生物PyC(5)與其配對(duì)的堿基的前后堿基種類(lèi)無(wú)關(guān)，對(duì)應(yīng)于特定的堿基種類(lèi)(G)而發(fā)出強(qiáng)熒光信號(hào)。
實(shí)施例6含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(1)的熒光分析把在實(shí)施例3得到的含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’CGCAACPyUCAAGCG-3；序列號(hào)11)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計(jì)在約25℃測(cè)定該溶液的熒光光譜的結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為344nm、發(fā)射波長(zhǎng)為398nm，在398nm的熒光強(qiáng)度為7.4。
在上述溶液中分別添加與含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分互補(bǔ)的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合
(A’)5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列號(hào)2)；(T’)5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列號(hào)3)；(G’)5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列號(hào)4)；(C’)5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列號(hào)5)。
用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液的熒光光譜的結(jié)果是，當(dāng)添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為29.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為4.5；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為3.7；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為3.3。
這樣，對(duì)于含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上的與PyU(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧腺苷酸時(shí)，可以觀(guān)察得到強(qiáng)發(fā)光，與此相比，當(dāng)脫氧胸苷酸時(shí)熒光就消光85％；脫氧鳥(niǎo)苷酸時(shí)熒光就消光88％；脫氧胞苷酸時(shí)熒光就消光89％。在圖11表示熒光光譜。另外，在圖12表示熒光照片圖像。
實(shí)施例7含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(2)的熒光分析把在實(shí)施例3得到的含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyUTAAGCG-3；序列號(hào)12)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計(jì)在約25℃測(cè)定該溶液的熒光光譜的結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為327nm、發(fā)射波長(zhǎng)為398nm，在398nm的熒光強(qiáng)度為6.3。
在上述溶液中分別添加與含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分為互補(bǔ)的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列號(hào)7)；(T’)5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列號(hào)8)；(G’)5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列號(hào)9)；(C’)5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列號(hào)10)。
用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液的熒光光譜的結(jié)果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為26.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為2.7；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為4.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時(shí)，在398nm的熒光強(qiáng)度為10.6。
這樣，對(duì)于含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上的與PyU(5)配對(duì)的核苷酸為脫氧腺苷酸時(shí)，可以觀(guān)察得到強(qiáng)發(fā)光，與此相比，當(dāng)為脫氧胸苷酸時(shí)，熒光就消光90％；當(dāng)為脫氧鳥(niǎo)苷酸時(shí)，熒光就消光82％；當(dāng)為脫氧胞苷酸時(shí)，熒光就消光59％。在圖13表示熒光光譜。
比較該實(shí)施例7和所述實(shí)施例6的結(jié)果，可以確認(rèn)核苷酸衍生物PyU(5)與其配對(duì)的堿基的前后堿基種類(lèi)無(wú)關(guān)，對(duì)特定的堿基種類(lèi)(A)發(fā)出強(qiáng)熒光信號(hào)。
實(shí)施例8含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸的熒光分析把在實(shí)施例3得到的含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸(5’CGCAACPyACAAGCG-3；序列號(hào)13)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計(jì)在約25℃測(cè)定該溶液的熒光光譜的結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為353nm、發(fā)射波長(zhǎng)為395nm，在395nm的熒光強(qiáng)度為4.3。
在上述溶液中分別添加與含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyA(7)以外的部分為互補(bǔ)的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列號(hào)2)；(T’)5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列號(hào)3)；(G’)5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列號(hào)4)；(C’)5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列號(hào)5)。
用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液的熒光光譜的結(jié)果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時(shí)，在395nm的熒光強(qiáng)度為2.5；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時(shí)，在395nm的熒光強(qiáng)度為1.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時(shí)，在395nm的熒光強(qiáng)度為7.4；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時(shí)，在395nm的熒光強(qiáng)度為18.2。
這樣，對(duì)于含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上的與PyA(7)配對(duì)的核苷酸為脫氧胞苷酸時(shí)，可以觀(guān)察得到強(qiáng)發(fā)光，與此相比，當(dāng)為脫氧胸苷酸時(shí)，熒光就消光90％；當(dāng)為脫氧腺苷酸時(shí)，熒光就消光86％；當(dāng)為脫氧鳥(niǎo)苷酸時(shí)，熒光就消光59％。在圖14表示熒光光譜。
實(shí)施例9含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸(2)的熒光分析把在實(shí)施例3得到的含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyGTAAGCG-3；序列號(hào)14)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計(jì)在約25℃測(cè)定該溶液的熒光光譜的結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為420nm、發(fā)射波長(zhǎng)為430nm和460nm，在430nm的熒光強(qiáng)度為16.0，而在460nm的熒光強(qiáng)度為15.3。
在上述溶液中分別添加與含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyG(8)以外的部分為互補(bǔ)的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列號(hào)7)；(T’)5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列號(hào)8)；(G’)5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列號(hào)9)；(C’)5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列號(hào)10)。
用熒光分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液的熒光光譜的結(jié)果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時(shí)，在430nm的熒光強(qiáng)度為65.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時(shí)，在430nm的熒光強(qiáng)度為144.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時(shí)，在430nm的熒光強(qiáng)度為65.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時(shí)，在430nm的熒光強(qiáng)度為136.0。
這樣，對(duì)于含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸，當(dāng)互補(bǔ)鏈上的與PyG(8)配對(duì)的核苷酸為脫氧胸苷酸和脫氧胞苷酸時(shí)，可以觀(guān)察得到強(qiáng)發(fā)光，與此相比，當(dāng)為脫氧鳥(niǎo)苷酸和脫氧腺苷酸時(shí)，熒光各自消光55％。在圖15表示相對(duì)熒光光譜。
實(shí)施例10使用DNA微陣列確定序列號(hào)15的寡脫氧核糖核苷酸(樣品DNA片段)的第8～11位的未知序列。作為DNA微陣列的捕獲探針，使用含有序列號(hào)16～31的核苷酸序列的DNA片段(探針DNA片段)(參照表1)。其中，樣品DNA片段含有序列號(hào)15的核苷酸序列，全長(zhǎng)50b；探針DNA片段1～16各自含有序列號(hào)16～31的核苷酸序列，全長(zhǎng)68～70b。
1.探針DNA片段的制備各自含有序列號(hào)16～31的核苷酸序列的探針DNA片段1～16，使用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的392DNA/RNA合成裝置，按照通常的亞磷酰胺法合成。從固相載體切取及脫保護(hù)是，通過(guò)在25％的氨水中孵育來(lái)進(jìn)行，然后利用高效液相色譜精制。
序列號(hào)16～31的各自第8位(T、G、C、A)為各核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8))。同樣，序列號(hào)20～23的第9位、序列號(hào)24～27的第10位、序列號(hào)28～31的第11位的T、G、C、A各自為PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)(參照表1)。
2.固定用基板的制備把在10％NaOH-60％乙醇水溶液中浸漬2小時(shí)且用純水清洗10次的76×26×1mm大小的玻璃制載片(slide)(松波硝子工業(yè)公司制)，在10％聚L-賴(lài)氨酸水溶液中浸漬1小時(shí)。用純水清洗10次后，以800rpm、離心5分鐘，去除水分，在室溫干燥，制備固定用基板。
3.DNA微陣列的制備把在上述1中制備的各個(gè)探針DNA片段，調(diào)整成最終濃度50pmol/μl，在上述2制備的基板上分別點(diǎn)印200pl(10nmol)。然后，在80℃干燥處理1小時(shí)，在各點(diǎn)上添加水，將DNA片段固定在基板上。把該基板用1％BSA封閉液(50mg/ml)5ml、10％SDS 1.25ml)振蕩45分鐘(42℃)。然后，分別用95℃純水浸漬1分鐘、用95％乙醇浸漬1分鐘，離心(800rpm、1分鐘)，來(lái)制備目的DNA微陣列。
4.樣品DNA片段的制備在含有由含有序列號(hào)15的核苷酸序列的全長(zhǎng)50b的寡脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的樣品DNA片段(15fmol/10.5μl)的樣品管中，添加20×SSC(3.75μl)和10％SDS(0.75μl)。用95℃加熱模塊(heatblock)進(jìn)行2分鐘加熱后，在室溫放置5分鐘，離心，來(lái)制備樣品液(最終濃度1nM)。
5.雜交在上述3制備的DNA微陣列上，把在上述2制備的樣品液點(diǎn)印在1點(diǎn)，12μl/點(diǎn)，用蓋玻片覆蓋，進(jìn)行雜交反應(yīng)(65℃、16小時(shí))。反應(yīng)終止后，在2×SSC-0.1％SDS溶液中浸漬5分鐘、20分鐘，在0.2×SSC-0.1％SDS溶液中浸漬20分鐘，然后在55℃進(jìn)一步浸漬2次，每次20分鐘。用同溶液沖洗后，進(jìn)而用0.05×SSC溶液沖洗。用900rpm離心1分鐘，放置，干燥。
6.測(cè)定使用熒光顯微鏡BX-50(奧林帕斯公司制)，測(cè)量各DNA點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，得到圖像文件后，進(jìn)行信號(hào)的數(shù)值化處理。結(jié)果示于表1。
表1

從表1所示的熒光強(qiáng)度的結(jié)果可以確定樣品DNA片段的序列號(hào)15的第8～11位的未知核苷酸如下。
(1)位于探針DNA片段1～4的第8位的各核苷酸衍生物的熒光強(qiáng)度為，探針DNA片段2的PyG(8)最高，探針DNA片段4的PyA(7)則明顯要低，因此樣品DNA片段的第8位確定為胸腺嘧啶(T)。
(2)位于探針DNA片段5～8的第9位的各核苷酸衍生物的熒光強(qiáng)度為，探針DNA片段5的PyU(5)最高，因此樣品DNA片段的第9位確定為腺嘌呤(A)。
(3)位于探針DNA片段9～12的第10位的各核苷酸衍生物的熒光強(qiáng)度為，探針DNA片段10的PyG(8)和探針DNA片段12的PyA(7)最高，因此樣品DNA片段的第10位確定為胞嘧啶(C)。
(4)位于探針DNA片段13～16的第11位的各核苷酸衍生物的熒光強(qiáng)度為，探針DNA片段15的PyC(5)最高，因此樣品DNA片段的第11位確定為鳥(niǎo)嘌呤(G)。
并且，從該結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明的核苷酸衍生物為，與配對(duì)的堿基的前后堿基種類(lèi)無(wú)關(guān)，對(duì)特定的堿基種類(lèi)發(fā)出強(qiáng)熒光信號(hào)。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性如在上面詳細(xì)說(shuō)明，本申請(qǐng)的發(fā)明可以大幅度簡(jiǎn)化使用DNA探針或DNA微陣列的SNP判定或序列確認(rèn)等中的試樣制備和測(cè)定過(guò)程。
序列表<110>齋藤烈和日本礙子株式會(huì)社(Isao Saito and NGK Insulators，Ltd.)<120>核苷酸衍生物和DNA微陣列<130>
<160>31<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
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<223>合成的寡核苷酸<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的鳥(niǎo)嘌呤衍生物<400>29agtcattatg gcgcctaatg 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>30agtcattatg ccgcctaatg 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物<400>31agtcattatg acgcctaatg 20
權(quán)利要求
1.一種核苷酸衍生物，其是熒光色素嵌入劑經(jīng)由接頭連接于嘧啶堿基或嘌呤堿基而成，其特征在于，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，當(dāng)與該單鏈核苷酸序列雜交的對(duì)方鏈的相應(yīng)堿基為(1)腺嘌呤時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鳥(niǎo)嘌呤時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的胞嘧啶衍生物；(3)胞嘧啶時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的鳥(niǎo)嘌呤衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物是由以下通式(1)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，胞嘧啶衍生物是由以下通式(2)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，腺嘌呤是由以下通式(3)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，鳥(niǎo)嘌呤衍生物是由以下通式(4)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
6.胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的前體物質(zhì)，其是由以下通式(5)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
7.胞嘧啶衍生物的前體物質(zhì)，其是由以下通式(6)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
8.腺嘌呤衍生物的前體物質(zhì)，其是由以下通式(7)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
9.鳥(niǎo)嘌呤衍生物的前體物質(zhì)，其是由以下通式(8)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團(tuán)，整數(shù)n表示亞烷基鏈長(zhǎng)度，當(dāng)X為亞甲基或烷基氨基時(shí)，是0～5，當(dāng)X為亞氨基、氧基或硫基時(shí)，是1～5。
10.將權(quán)利要求1的核苷酸衍生物(1)～(4)中的一個(gè)或其以上作為成員而具有的單鏈核苷酸序列。
11.確定與權(quán)利要求10的單鏈核苷酸序列雜交的對(duì)方鏈的單堿基X的方法，其中，(i)當(dāng)單鏈核苷酸序列中的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，確定堿基X為腺嘌呤；(ii)當(dāng)單鏈核苷酸序列中的胞嘧啶衍生物(2)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，確定堿基X為鳥(niǎo)嘌呤；(iii)當(dāng)單鏈核苷酸序列中的腺嘌呤衍生物(3)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，確定堿基X為胞嘧啶；(iv)當(dāng)單鏈核苷酸序列中的鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，確定堿基X為胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的堿基種類(lèi)確定方法，其特征在于，把在同一位置具有腺嘌呤衍生物(3)和鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)的兩條單鏈核苷酸序列各自雜交到同一對(duì)方鏈，(v)當(dāng)腺嘌呤衍生物(3)和鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)雙方的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，確定對(duì)方鏈的堿基X為胞嘧啶；(vi)只是鳥(niǎo)嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強(qiáng)時(shí)，確定對(duì)方鏈的堿基X為胸腺嘧啶/尿嘧啶。
13.把權(quán)利要求6的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針的DNA微陣列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA微陣列，其是檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA微陣列，其特征在于，捕獲探針的組與目標(biāo)核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的區(qū)段互補(bǔ)，各個(gè)捕獲探針的與目標(biāo)核苷酸序列的SNP核苷酸對(duì)應(yīng)的位置的核苷酸各自為核苷酸衍生物(1)～(4)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA微陣列，其是確定序列未知的n(n＝3～100)個(gè)核苷酸序列的DNA微陣列，其特征在于，捕獲探針是核苷酸序列完全不同的至少4n個(gè)的組，各捕獲探針從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物(1)～(4)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA微陣列，其是檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列中是否存在與由n(n＝3～100)個(gè)核苷酸構(gòu)成的已知序列區(qū)段相同的區(qū)段的DNA微陣列，其特征在于，捕獲探針組與目標(biāo)核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補(bǔ)，各捕獲探針從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物(1)～(4)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA微陣列，其是確定目標(biāo)核苷酸序列的未知序列區(qū)段的序列的DNA微陣列，所述目標(biāo)核苷酸序列具有由n(n＝3～100)個(gè)核苷酸構(gòu)成的未知序列區(qū)段和已知序列區(qū)段，其特征在于，捕獲探針組是具有與目標(biāo)核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補(bǔ)的序列和核苷酸序列完全不同的探針序列區(qū)段的至少4n個(gè)的組，各探針序列區(qū)段從第1位到第n位的至少一個(gè)為核苷酸衍生物(1)～(4)。
全文摘要
對(duì)應(yīng)于雜交的對(duì)方鏈的相應(yīng)堿基種類(lèi)而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度的新的核苷酸衍生物，其特征在于，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，與該單鏈核苷酸序列雜交的對(duì)方鏈的相應(yīng)堿基為，(1)腺嘌呤時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鳥(niǎo)嘌呤時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的胞嘧啶衍生物；(3)胞嘧啶時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶時(shí)，是熒光色素發(fā)光最強(qiáng)的鳥(niǎo)嘌呤衍生物。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1732181SQ200380107619
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者齋藤烈, 岡本晃充, 吉田安子 申請(qǐng)人:齋藤烈, 日本礙子株式會(huì)社