專利名稱：可用于治療由黃病毒科病毒如丙型肝炎及牛病毒性腹瀉病毒引起的感染的雙環(huán)糖類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體而言涉及可用于治療由黃病毒科病毒引起的感染的雙環(huán)糖類化合物。更具體而言，涉及可用于治療或改善由丙型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、西尼羅河病毒以及登革病毒引起的感染的這種化合物。
背景技術(shù)：
丙型肝炎于1975年被最初確認(rèn)為單獨(dú)的疾病體，其時，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)與輸血相關(guān)的肝炎病例并非僅由當(dāng)時已知的兩種肝炎病毒——甲型肝炎病毒及乙型肝炎病毒——所導(dǎo)致。這種疾病被稱作“非甲非已型肝炎”，并且發(fā)現(xiàn)其可傳染至黑猩猩。然而，直到1989年該非甲非乙肝炎病毒的克隆及測序才得以首次報道，且該病毒被重新命名為“丙型肝炎病毒”(HCV)。緊接著進(jìn)行了HCV抗體試驗(yàn)，而且篩查這種抗體仍為診斷的主要方法。
丙型肝炎病毒與黃病毒科病毒具有相同的病毒學(xué)及遺傳學(xué)特征。其基因組組構(gòu)與黃病毒屬以及瘟病毒的相似，且與這些病毒尤其是瘟病毒共有少量的序列同一性。任一這些病毒組都組成黃病毒科的獨(dú)立的屬黃病毒屬、瘟病毒屬以及丙肝病毒屬(hepacivirus)。丙型肝炎病毒是一種直徑約為50nm的球形包膜病毒。HCV的基因組為單鏈線性正義RNA。其為不分節(jié)段的。5’非編碼(NC)區(qū)由約340個核苷酸組成。緊鄰的下游為約9000個核苷酸的單個大的可讀框(ORF)。其最末為由約100個核苷酸組成的3’NC區(qū)。HCV的基因組高度不均一。該基因組最為高度保守的區(qū)域?yàn)?’NC區(qū)部分以及終端3’NC區(qū)部分。ORF的最為高度保守的區(qū)域?yàn)橐職せ颉Ｏ啾戎?，該基因組最不均一的部分為編碼包膜蛋白的基因?；谄溥z傳異質(zhì)性，HCV品系可被分為大組(major group)，該大組被稱作病毒型或病毒基因型(并被暫時分為獨(dú)立的物種)。各型中，HCV隔離種群(isolate)被分為許多亞型。最后，各個隔離種群由病毒基因組的異質(zhì)群體組成，這些異質(zhì)群體包括密切相關(guān)但不相同的病毒的“準(zhǔn)群”(quasispecies)或“群”(swarm)。HCV的一些基因型顯示出地理局限性，而其他的則分布于全世界。HCV更為廣泛的遺傳分析揭示，將隔離種群區(qū)分為型、亞型以及隔離種群在一定程度上為人為的產(chǎn)物，而病毒有可能作為遺傳多樣性的連續(xù)體存在。HCV遺傳多樣性的結(jié)果導(dǎo)致一種具有能夠逃避宿主免疫監(jiān)視的病毒，這使得重復(fù)暴露的個體慢性感染的比例高(80％以上)以及對再次感染缺乏免疫力。慢性以及缺乏可靠的免疫力可能都源于序列不同的病毒準(zhǔn)群的小種群的出現(xiàn)(www.HEPNET.com，the Hepatitis Information Network；Challand R.，Young R.J.(1997)Antiviral Chemotherapy.Biochemical & MedicinalChemistry Series.Spektrum Academic Publishers，Oxford，pp.87-92；CannA.J.(1997)Principles of Molecular Virology.Second Edition.AcademicPress，San Diego，pp.230-235)。其他重要的導(dǎo)致未得以滿足的醫(yī)學(xué)需要的黃病毒科病毒為西尼羅河病毒以及導(dǎo)致登革熱的病毒。
因此，存在強(qiáng)烈的醫(yī)學(xué)需求以發(fā)現(xiàn)并開發(fā)出新的能夠用于治療黃病毒科病毒感染而同目前可用的治療相比副作用更少且更小而療效更好的生物活性分子。

發(fā)明內(nèi)容
已發(fā)現(xiàn)某些具有以下通式的雙環(huán)糖類對由黃病毒科病毒包括丙型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、西尼羅河病毒以及登革病毒導(dǎo)致的感染具有活性 其中，R1為芳基或芐基，R2及R3為烷基或芳基，R4為芳基且X為O、N或S。本申請中記載典型的、當(dāng)前優(yōu)選的雙環(huán)糖類，但本領(lǐng)域技術(shù)人員易知其他雙環(huán)糖類化合物亦可用于治療由黃病毒科病毒導(dǎo)致的感染。本發(fā)明還包括這些化合物的藥物學(xué)可接受的鹽。


圖1為本發(fā)明雙環(huán)糖類的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其被指定為式A。
圖2為化合物A1及化合物A2的合成路線的圖示。
圖3為化合物A3的合成路線的圖示。
具體實(shí)施例方式
黃病毒科是一種重要的人類及動物RNA病毒病原體(Rice CM.1996.Flaviviridaethe viruses and their replication.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，eds.Fields virology.PhiladelphiaLippincott-Raven Publishers.Pp 931-960)。黃病毒科目前確認(rèn)的三個屬在傳播、宿主范圍及發(fā)病機(jī)制上表現(xiàn)出顯著的不同。該經(jīng)典的黃病毒的成員為黃熱病病毒、登革病毒以及瘟病毒，如牛病毒性腹瀉(BVDV)以及豬瘟病毒(CSFV)。該科最近得以表征的成員為常見及獨(dú)有的人類病原體——丙型肝炎病毒(HCV)。黃病毒屬是具有正義RNA基因組極性的單鏈RNA病毒。其他具有正義RNA的病毒科包括小RNA病毒科(Picornaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)以及冠狀病毒科(Coronaviridae)。
本發(fā)明化合物可以其本來的形式或鹽形式應(yīng)用。當(dāng)其中化合物的堿性或酸性足以生成穩(wěn)定的無毒的酸式鹽或堿式鹽時，適宜以鹽形式給藥該化合物。藥物學(xué)可接受的鹽的實(shí)例為由能生成生理學(xué)可接受的陰離子的酸生成的有機(jī)酸加成鹽，例如乙酸鹽、抗壞血酸鹽、安息香酸鹽、檸檬酸鹽、etoglutarate、甘油磷酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、琥珀酸鹽以及酒石酸鹽。也可生成適宜的無機(jī)鹽，包括碳酸氫鹽、碳酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽以及硫酸鹽。
本發(fā)明的化合物可方便地以含有該化合物以及適宜的賦形劑的藥物組合物的形式給藥，該組合物可用于抵抗病毒感染。視該制劑是用于治療內(nèi)部感染或外部感染而定，本發(fā)明的化合物和組合物可非胃腸道給藥、局部給藥、陰道內(nèi)給藥、口服給藥或直腸給藥。
用于非胃腸道給藥時，活性化合物或其鹽的溶液可在水中制備，任選與無毒的表面活性劑混合。還可在甘油、液體聚乙二醇、三醋精、及其混合物以及油中制備分散體。
本發(fā)明可用的劑量可通過比較它們的體內(nèi)活性來確定。將有效劑量外推至人類的方法為本領(lǐng)域所周知。
該化合物可方便地以單元劑量的形式給藥，例如每個單元劑量形式含有0.1-2000mg、適宜地100-1000mg、最適宜地100-500mg的活性成分。預(yù)期的劑量可便利地存在于單一劑量中或?yàn)橐赃m宜的間隔給藥如每日二、三、四次或更多分次劑量的分劑量形式。該分次劑量本身還可再分，例如分為許多離散的寬松地間隔的給藥，如由吹藥器多次吸入或通過多次向眼中滴入施用。
對于內(nèi)部感染，該組合物可以以游離堿計算約1-30mg/kg哺乳動物體重、優(yōu)選為1-10mg/kg哺乳動物體重的劑量水平口服或非胃腸道給藥。
給藥此處所公開的化合物及組合物的精確方案將必然地取決于接受治療的個體的需要、治療的類型以及顯而易見還取決于主治醫(yī)師的判斷。本發(fā)明的化合物可給藥于需要治療的動物。在多數(shù)情況下其為人類，但對牲畜以及寵物的治療同樣也被明確地認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例方法及材料式A化合物的合成該化合物如下合成1.化合物A1及化合物A2的合成化合物A1和化合物A2的合成如圖2所示。
化合物1.1的合成在RT(室溫)下向2，3，4，6-四-O-苯甲基-D-葡萄糖(10.0g，18.5mmol)在CH2Cl2(125ml)及DMF(6.25ml)中的溶液內(nèi)逐滴加入至草酰溴溶液(2.5ml在CH2Cl2中的10M溶液，1.35eq)。同時伴隨強(qiáng)烈的氣體生成。在Ar氣氛下于室溫將反應(yīng)混合物攪拌60分鐘。然后將反應(yīng)混合物倒入冰水(125ml)中。相分離后，用冰水(2×125ml)洗滌有機(jī)相。用MgSO4干燥后，過濾并真空蒸發(fā)，得到黃色油狀化合物1.1(圖1)，其無需進(jìn)一步純化即可用于以下的反應(yīng)步驟。
分子式C34H35BrO5分子量603.55Rf0.53(環(huán)己烷/乙酸乙酯85∶15)1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.37(3H，m)，7.33(5H，m)，7.31(5H，m)，7.28(5H，m)，7.15(2H，m)，6.43(1H，d，J＝3.7)，4.98(1H，d，J＝5.0)，4.83(2H，dd，app.t，J＝10.9)，4.58(1H，d，J＝12.1)，4.50(1H，d，J＝10.7)，4.46(2H，d，J＝12.1)，4.06(1H，m)，4.03(1H，dd，app.t，J＝9.2)，3.80(1H，m)，3.78(1H，m)，3.76(1H，d，J＝4.6)，3.65(1H，dd，J＝11.0，2.0)，3.54(1H，dd，J＝9.2，3.7)
化合物1.2的合成向冷卻至0℃的化合物1.1(理論量18.5mmol)在無水Et2O(250ml)中的溶液內(nèi)緩緩加入芐基氯化鎂(在Et2O中1M-opl.150ml，8eq)。將混合物在0℃下攪拌1小時，然后將溫度緩緩升至室溫。于室溫下攪拌過夜后，將反應(yīng)混合物倒入H2O(500ml)以及AcOH中，然后分離個相。將有機(jī)相用3×500ml飽和NaHCO3溶液以及250ml飽和NaCl溶液洗滌。用MgSO4干燥，過濾并真空蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物。將其用柱色譜(60-230目二氧化硅，梯度甲苯∶環(huán)己烷8∶2，甲苯，環(huán)己烷∶乙酸乙酯9∶1)，得到6.47g無色油狀化合物1.2(57％，兩步)。
分子式C41H42O5分子量614.78Rf0.15(環(huán)己烷/二乙醚9∶1)[α]D20＝+85.3°；[α]36520＝+88.1°(c＝0.60，在氯仿中)IR(KBr)(cm-1)2862，2360，1604，1496，1454，1360，1209，1085，1028，735，697，668ES-MS632＝[M+NH4]+1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.36(5H，m)，7.34(5H，m)，7.31(5H，m)，7.29(5H，m)，7.26(2H，m)，7.22(3H，m)，4.96(1H，d，J＝11.0)，4.95(1H，d，J＝11.0)，4.91(1H，d，J＝11.0)，4.84(1H，d，J＝10.8)，4.69(1H，d，J＝11.0)，4.62(1H，d，J＝10.8)，4.59(1H，d，J＝12.2)，4.52(1H，d，J＝12.2)，3.74(1H，dd，app.t，J＝9.0)，3.69(1H，m)，3.68(1H，m)，3.66(1H，dd，app.t，J＝9.3)，3.52(1H，ddd，J＝18.3，9.2，2.3)，3.37(1H，dd，app.t，J＝9.0)，3.36(1H，m)，3.17(1H，dd，J＝14.3，2.0)，2.75(1H，dd，J＝14.3，8.8)APT-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)138.9(C)，138.7(C)，138.5(C)，138.3(C)，138.2(C)，129.7(CH)，128.6(CH)，128.6(CH)，128.5(CH)，128.4(CH)，128.2(CH)，128.0(CH)，127.9(CH)，127.8(CH)，127.7(CH)，127.6(CH)，126.2(CH)，87.5(CH)，81.8(CH)，80.1(CH)，79.0(CH)，78.7(CH)，75.7(CH2)，75.2(CH2)，75.1(CH2)，73.5(CH2)，69.0(CH2)，38.0(CH2)化合物1.3的合成在室溫下向化合物1.2(6.0g，9.76mmol)在無水EtOH(240ml)中的溶液內(nèi)加入Pd/C(600mg，10摩爾％)。將反應(yīng)混合物在Parr設(shè)備中于4個大氣壓的H2氣下振蕩5分鐘。用硅藻土(celite)過濾并真空濃縮得到2.62克黃白色泡沫。其用柱色譜(60-230目，CH2Cl2∶MeOH 9∶1)純化得到2.46克白色泡沫狀化合物1.3(99％)。
分子式C13H18O5分子量254.28Rf0.14(二氯甲烷/甲醇9∶1)IR(KBr)(cm-1)3381，2922，2360，2341，1641，1603，1496，1454，1379，1308，1226，1079，1031，897，754，701，668ES-MS272＝[254+NH4]+1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.29(2H，d，J＝7.0)，7.22(2H，dd，app.t，J＝7.3)，7.14(1H，m)，3.75(1H，dd，J＝11.9，2.4)，3.60(1H，dd，J＝11.8，5.4)，3.35(1H，m)，3.32(1H，m)，3.25(1H，dd，app.t，J＝9.4)，3.15(1H，m)，3.12(1H，m)，3.09(1H，dd，app.t，J＝9.3)，2.69(1H，dd，J＝14.5，8.5)APT-NMR(125MHz，CD3OD)δ(ppm)139.1(C)，129.4(CH)，127.6(CH)，125.6(CH)，80.4(CH)，80.1(CH)，78.6(CH)，73.7(CH)，70.6(CH)，61.6(CH2)，37.4(CH2)化合物1.4的合成室溫下，向化合物1.3(1.0g，3.93mmol)的二甲基甲酰胺(38.6ml)中的溶液內(nèi)相繼加入苯甲醛二甲縮醛(benzaldehyde dimethyl acetal)(708μl，1.2eq)以及D(+)-10-樟腦磺酸(274mg，0.3eq)。將反應(yīng)混合物在Ar氣氛下于室溫攪拌2小時。以EtOAc(150ml)稀釋，由此開始精制。然后用1N NaOH溶液(2×150ml)、飽和NaHCO3溶液(2×100ml)以及飽和NaCl溶液(2×100ml)洗滌。用MgSO4干燥，過濾并真空蒸發(fā)得到1.52g白色固體殘余物。以柱色譜純化(60-230目二氧化硅，CH2Cl2∶MeOH 99∶1)得到940mg白色固體化合物1.4(70％)。
分子式C20H22O5分子量342.39Rf0.20(環(huán)己烷∶乙酸乙酯6∶4)熔點(diǎn)43-44℃[a]D20＝-6.9°；[α]36520＝-10.7(c＝0.60，在氯仿中)IR(KBr)(cm-1)3478，3031，2871，2360，1604，1497，1454，1385，1317，1299，1271，1212，1124，1099，1077，998，973，919，673，699，668，655，625，552，510ES-MS343＝[M+H]+1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.49(2H，m)，7.38(3H，m)，7.31(2H，m)，7.28(2H，m)，7.25(1H，m)，5.51(1H，s)，4.28(1H，dd，J＝10.5，4.8)，3.74(1H，dd，app.t，J＝8.7)，3.68(1H，dd，app.t，J＝10.0)，3.58(1H，ddd，J＝9.6，8.2，2.6)，3.43(1H，dd，app.t，J＝9.2)，3.39(1H，m)，3.38(1H，dd，J＝10.5，4.0)，3.18(1H，dd，J＝14.4，2.5)，2.93(1H，brs)，2.79(1H，dd，J＝14.4，7.9)，2.69(1H，brs)APT-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)138.0(C)，137.1(C)，129.8(CH)，129.4(CH)，128.4(CH)，128.2(CH)，126.4(CH)，126.3(CH)，101.9(CH)，81.1(CH)，80.3(CH)，75.5(CH)，73.8(CH)，70.1(CH)，68.9(CH2)，37.9(CH2)
化合物A1的合成向冷卻至0℃的化合物1.4(100mg，0.292mmol)的溶液中加入NaH(51mg 60％分散體，4eq)。然后將混合物在Ar氣氛下于0℃攪拌30分鐘。然后逐滴緩緩加入正丙基溴(133μl，5eq)。在0℃下10分鐘后，于室溫下繼續(xù)攪拌過夜。TLC分析后，加入另外的2eq NaH以及1eqn-PrBr。在室溫下攪拌4小時后，將反應(yīng)混合物倒入H2O(25ml)，然后以3×30ml Et2O萃取。用50ml飽和NaCl溶液洗滌合并的有機(jī)層，并用MgSO4干燥。過濾并真空濃縮得到144mg白色晶體殘余物。以柱色譜(230-400目二氧化硅，戊烷∶乙醚9∶1)純化后，得到白色晶體產(chǎn)物化合物A1(117mg，94％)。
分子式C26H34O5分子量426.55Rf0.25(戊烷∶乙醚9∶1)熔點(diǎn)76-77℃[α]D20＝-41.4°；[α]36520＝-127.6°(c＝1.02，在氯仿中)IR(KBr)(cm-1)2963(m)，2918(m)，2873(m)，1454(m)，1369(m)，1121(s)，1104(s)，1089(s)，1030(m)，1008(m)，968(m)，951(m)，748(s)，697(s)，652(m)EI-MS(m/z)43(86)，91(100)，115(39)，149(26)，176(17)，217(5)，251(3)，277(32)，208(1)，335(3)，366(2)，426(8)[M+]，427(2)[M++1]1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.48-7.46(2H，m)，7.38-7.33(3H，m)，7.30-7.20(5H，m)，5.52(1H，s)，4.24(1H，dd，J＝10.4，5.0)，3.92(1H，dt，J＝8.8，6.6)，3.86(1H，dt，J＝9.3，6.6)，3.65(1H，dd，appt，J＝10.4)，3.64(1H，dt，J＝9.3，6.8)，3.57-3.48(4H，m)，3.29(1H，ddd，app dt，J＝10.0，5.0)，3.15(1H，dd，14.3，2.0)，3.08(1H，dd，J＝9.3，8.3)，2.70(1H，dd，J＝14.3，8.7)，1.62(4H，m)，0.98(3H，t，J＝7.4)，0.93(3H，t，J＝7.4)APT-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)139.5(C)，138.5(C)，130.5(CH)，129.7(CH)，129.1(CH)，129.0(CH)，127.1(CH)，126.9(CH)，101.8(CH)，84.4(CH)，83.2(CH)，82.6(CH)，81.6(CH)，76.1(CH2)，75.7(CH2)，71.1(CH)，69.8(CH2)，39.1(CH2)，24.5(CH2)，24.5(CH2)，11.6(CH3)，11.6(CH3)化合物A2的合成向冷卻至0℃的化合物1.4(100mg，0.292mmol)的溶液中加入NaH(51mg 60％分散體，4eq.)。在Ar氣氛下于0℃將混合物攪拌30分鐘。然后逐滴緩緩加入正丁基溴(157μl，5eq)。于0℃下攪拌10分鐘后，于室溫下繼續(xù)攪拌過夜。TLC分析后，加入另外的2eq NaH以及1eq n-BuBr。室溫下攪拌5小時后，將反應(yīng)混合物倒入H2O(25ml)中，用met 3×30mlEt2O萃取溶液。用50ml飽和NaCl溶液洗滌合并的有機(jī)相，并用MgSO4干燥。過濾并真空濃縮得到168mg黃白色殘余物。用柱色譜(230-400目二氧化硅，戊烷∶乙醚92∶8)純化得到125mg白色晶體化合物A2(94％)。
分子式C28H38O5分子量454.60Rf0.24(戊烷∶乙醚92∶8)熔點(diǎn)69-70℃[α]D20＝-38.7°；[α]36520＝-120.8°(c＝0.98，在氯仿中)IR(KBr)(cm-1)2963(s)，2929(s)，2873(s)，1454(m)，1375(m)，1172(m)，1092(s)，1030(m)，1008(m)，968(m)，748(m)，697(s)EI-MS(m/z)57(75)，91(100)，129(49)，177(12)，189(19)，235(2)，291(36)，307(4)，363(2)，454(5)[M+]1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.49-7.47(2H，m)，7.38-7.34(3H，m)，7.31-7.21(5H，m)，5.52(1H，s)，4.24(1H，dd，J＝10.4，5.0)，3.96(1H，dt，J＝8.9，6.6)，3.90(1H，dt，J＝9.4，6.6)，3.71-3.64(2H，m)，3.59(1H，dt，J＝8.9，6.6)，3.55-3.48(3H，m)，3.29(1H，ddd，app dt，J＝9.5，5.0)，3.15(1H，dd，J＝14.3，1.9)，3.08(1H，dd，app t，J＝8.8)，2.97(1H，dd，J＝14.3，8.7)，1.65-1.55(4H，m)，1.49-1.35(4H，m)，0.96(3H，t，J＝7.4)，0.90(3H，t，J＝7.4)APT-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)140.0(C)，139.0(C)，131.0(CH)，130.2(CH)，129.6(CH)，129.5(CH)，127.6(CH)，127.4(CH)，102.4(CH)，84.9(CH)，83.7(CH)，83.1(CH)，82.1(CH)，74.7(CH2)，74.3(CH2)，70.4(CH)，64.5(CH2)，39.6(CH2)，34.0(CH2)，33.9(CH2)，20.8(CH2)，20.7(CH2)，15.4(CH3)，15.3(CH3)2.化合物A3的合成化合物A3的合成如圖3所示。
化合物2.1的合成同(β)-D-葡萄糖五乙酸酯(24.6g，63.0mmol)中加入溴化氫的乙酸溶液(33重量％，100ml)。立刻出現(xiàn)咖啡色。將反應(yīng)混合物在氬氣氛下于室溫攪拌30分鐘。然后用甲苯(4×50ml)以真空恒沸蒸餾除去溶劑得到棕綠色固體化合物2.1。該粗產(chǎn)物無需進(jìn)一步純化即可用于以下的反應(yīng)步驟中。
分子式C14H19O9Br分子量411.20Rf0.46(環(huán)己烷/乙酸乙酯1∶1)IR(KBr)2962，2360，2342，1748，1435，1369，1218，1162，1112，1079，1042，911，752，668，601，563cm-1ES-MS433＝[410+Na]+，435＝[412+Na+]1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]6.61(1H，d，J＝4.0)，5.56(1H，dd，app.t，J＝9.7)，5.16(1H，dd，app.t，J＝9.7)，4.84(1H，dd，J＝10.0，4.0)，4.33(1H，m)，4.30(1H，m)，4.13(1H，dd，J＝12.3，1.5)，2.11(3H，s)，2.10(3H，s)，2.05(3H，s)，2.03(3H，s)
13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)170.37，169.70，169.64，169.31，86.34，71.91，70.39，69.94，66.94，60.76，20.48，20.48，20.38，20.38化合物2.2的合成通過插管向冷卻至0℃的苯基溴化鎂(200ml在二乙醚中的3M溶液，600mmol，9.5eq)在無水二乙醚(500ml)中的溶液內(nèi)加入溴化物化合物1.1(理論值63.0mmol)在無水二乙醚(500ml)中的溶液。在氬氣氛下于室溫攪拌該反應(yīng)混合物72小時。然后將該反應(yīng)混合物倒入水(2000ml)中，并加入乙酸(200ml)以溶解鎂鹽。分離這2層，并將有機(jī)層用水(3×500ml)洗滌。在減壓下濃縮合并的水相得到淺棕色固體殘余物。將殘余物溶于吡啶(500ml)中。在0℃下緩緩加入醋酐(340ml)。加入DMAP(200mg，1.64mmol)后，在氬氣氛下于室溫繼續(xù)攪拌20小時。接著，將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，然后用甲苯(1×250ml)恒沸蒸餾，并加入二乙醚(31)。將得到有機(jī)層用飽和NaHCO3溶液(2×11)、1N HCl溶液(2×11)以及水(2×11)洗滌。用MgSO4干燥，并在減壓下濃縮，得到25.1g淺棕色晶體。將其通過自2-丙醇中重結(jié)晶得到16.1g白色晶體化合物2.2(63％)。
分子式C20H24O9分子量408.40Rf0.42(環(huán)己烷/乙酸乙酯1∶1)熔點(diǎn)149-150CIR(KBr)2956，1753，1433，1368，1224，1104，1036，978，916，764，738，702，603cm-1ES-MS431＝[408+Na]+1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.39(5H，m)，5.24(1H，dd，app.t，J＝9.4)，5.24(1H，dd，app.t，J＝9.8)，5.14(1H，dd，app.t，J＝9.8)，4.40(1H，d，J＝9.9)，4.30(1H，dd，J＝17.2，4.7)，4.16(1H，dd，J＝12.2，1.5)，3.85(1H，m)，2.09(3H，s)，2.06(3H，s)，2.01(3H，s)，1.80(3H，s)13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)170.60，170.25，169.36，168.70，136.01，128.75，128.28，126.96，80.08，75.94，74.06，72.44，68.39，62.17，20.61，20.48，20.21化合物1.3的合成向四乙酸酯化合物2.2(16.08g，39.4mmol)在四氫呋喃(232ml)與甲醇(232ml)混合物中的溶液內(nèi)加入無水碳酸鉀(1.36g，9.84mmol，0.25eq)。將該混合物在氬氣氛下于室溫攪拌3小時。加入硅膠(40ml)并在減壓下除去溶劑。用柱色譜(二氯甲烷/甲醇85/15)純化產(chǎn)物化合物1.3得到9.50g產(chǎn)物化合物2.3(99％)。
分子式C12H16O5分子量240.26Rf0.12(二氯甲烷/甲醇9∶1)IR(KBr)3368，2919，2360，1636，1496，1455，1082，1042，891，764，701，595cm-1ES-MS258＝[240+NH4]+，263＝[240+Na]+1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.44(2H，d，J＝7.1)，7.35(2H，dd，app.t，J＝7.6)，7.30(1H，m)，4.15(1H，d，J＝9.4)，3.90(1H，dd，J＝12.1，1.6)，3.72(1H，dd，J＝12.0，5.2)，3.51(1H，dd，app.t，J＝8.7)，3.45(1H，dd，app.t，J＝9.4)，3.43(3H，m)，3.40(1H，dd，app.t，J＝9.2)13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)139.30，127.43，82.41，80.70，78.23，74.98，70.40，61.41化合物2.4的合成在氬氣氛下向四醇化合物2.3(1.15g，4.79mmol)在無水乙腈(3ml)中的溶液內(nèi)加入樟腦磺酸(279mg，1.20mmol，0.25eq)以及苯甲醛二甲縮醛(1.44ml，9.58mmol，2eq)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時。然后加入三乙胺(0.337ml，2.40mmol)中和該混合物。減壓下濃縮該反應(yīng)混合物得到2.70g淺黃色油。用柱色譜(CH2Cl2/iPrOH 1/1)純化得到1.53g白色固體化合物2.4(97％)。
分子式C19H20O5分子量328.36Rf0.27(環(huán)己烷/乙酸乙酯1∶1)熔點(diǎn)114-115℃[α]D20＝+9.3°；[α]36520＝+10.0°(c＝1.13，在氯仿中)IR(KBr)3433，2874，2357，1651，1496，1455，1385，1313，1272，1211，1109，1029，1009，913，765，733，700cm-1ES-MS346＝[328+NH4]+1H-NMR(500MHz，CDCl3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.53(2H，m)，7.40(5H，m)，7.39(3H，m)，5.59(1H，s)，4.37(1H，dd，J＝10.3，5.9)，4.30(1H，d，J＝9.3)，3.91(1H，dd，app.t，J＝8.6)，3.79(1H，dd，app.t，J＝10.3)，3.67(1H，dd，app.t，J＝9.3)，3.65(1H，m)，3.63(1H，m)13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)137.50，136.84，129.14，128.65，128.52，128.20，127.29，126.12，101.73，82.41，80.90，75.43，74.60，70.60，68.70化合物2.5的合成向冰冷的二醇化合物2.4(500mg；1.523mmol)在無水吡啶(15ml)中的溶液內(nèi)相繼加入DMAP(20mg；0.15mmol；0.1eq.)以及Ac2O(5ml)。移除冷卻并將該反應(yīng)混合物在Ar氣氛下于室溫攪拌18小時。然后在減壓下用甲苯恒沸除去吡啶以及Ac2O。將殘余物用柱色譜(Merckkieselgel；環(huán)己烷/EtOAc85/15)純化。得到收率為95％的化合物2.5(595mg；1.443mmol)。
分子式C23H24O5分子量412.4Rf0.21(環(huán)己烷/EtOAc85/15)熔點(diǎn)＞150℃升華[α]D20-78.46°(c＝1.010；CHCl3)IR(KBr-片，膜)(cm-1)3065(w)；3033(w)；2948(w)；2873(w)；2863(w)；1749(s)；1370(m)；1238(s)；1212(s)；1105(s)；1063(m)；1031(m)；999(m)；767(m)；701(m)MS(m/z)43(100)；91(17)；105(26)；107(13)；189(9)；219(11)；352(3)；369(＜1)1H-NMR(500MHz；CD3COCD3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.46(2H；m)；7.39(2H；m)；7.34(6H；m)；5.69(1H；s)；5.42(1H；dd(app.t)；J＝9.5)；5.19(1H；dd(app.t)；J＝9.5)；4.67(1H；d；J＝9.8)；4.31(1H；dd；J＝4.6，9.9)；4.98(1H；dd(app.t)；J＝9.4)；3.87(1H；dd(app.t)；J＝10.0)；3.82(1H；ddd；J＝4.6，9.5，10.0)；1.95(3H；s)；1.76(3H；s)APT(125MHz；CD3COCD3)δ(ppm)20.3(CH3)；20.7(CH3)；69.1(CH2)；71.7(CH)；73.8(CH)；74.3(CH)；79.6(CH)；81.2(CH)；102.1(CH)；127.2(CH)；128.2(CH)；128.8(CH)；129.0(CH)；129.3(CH)；129.6(CH)；138.3(C)；138.7(C)；169.2(C)；170.3(C)化合物2.6的合成將化合物2.5(400mg；0.970mmol)溶于干燥甲苯(5ml)中，并逐滴加入Petasis試劑(Cp2TiMe2)在甲苯(8.15ml；4.074mmol；4.2eq.)中的0.5M溶液。將反應(yīng)混合物遮光并在Ar氣氛下于70℃加熱60小時。然后將該反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并用柱色譜(Merck kieselgel；環(huán)己烷/CH2Cl2/EtOAc50/50/1)純化殘余物。
化合物A3的合成向烯醇醚2.6(320mg；0.783mmol)在無水EtOAc(17ml)中的溶液中加入無水Et3N(1.7ml)。然后加入Pd/C(10重量％鈀；320mg)，并將反應(yīng)混合物置于H2氣氛下。在室溫下攪拌22小時后，通過以硅藻土過濾而除去催化劑，并用EtOAc洗滌。用柱色譜(Merck kieselgel；戊烷/CH2Cl2/乙醚50/50/1)純化濃縮濾液后得到的殘余物。得到收率為82％的化合物A3(265mg；0.642mmol)。
分子式C25H32O5分子量0.22(戊烷CH2Cl2/ether50/50/1)熔點(diǎn)98-100℃[α]D20-31.02°(c＝1.100；CHCl3)IR(KBr-disc，film)(cm-1)3066(w)；3035(w)；2972(s)；2925(m)；2902(m)；2869(m)；1454(m)；1380(m)；1170(m)；1106(s)；1076(s)；1028(s)；1001(m)；764(m)；748(m)；700(s)MS(m/z)43(100)；91(62)；105(69)；107(56)；115(20)；149(88)；196(4)；238(12)；263(7)；369(＜1)；412(＜1；M+o)1H-NM[R(500MHz；CD3COCD3)[δ(ppm)；J(Hz)]7.51(2H；m)；7.27-7.43(8H；m)；5.65(1H；s)；4.25(1H；d；J＝9.2)；4.23(1H；dd；J＝5.0，10.2)；4.01(1H；h；J＝6.1)；3.76(1H；dd(app.t)；J＝10.1)；3.66(1H；dd(app.t)；J＝9.2)；3.62(1H；dd(app.t)；J＝9.2)；3.55(1H；ddd；J＝5.0，9.1，9.9)；3.28(1H；dd；J＝8.3，9.2)；3.19(1H；h；J＝6.1)；1.14(6H；2d(app.t)；J＝5.9)；0.96(3H；d；J＝6.1)；0.44(3H；d；J＝6.1)APT(125MHz；CD3COCD3)δ(ppm)21.9(CH3)；22.7(CH3)；23.0(CH3)；23.6(CH3)；69.4(CH2)；71.6(CH)；72.8(CH)；73.3(CH)；80.9(CH)；81.5(CH)；83.1(CH)；83.8(CH)；101.7(CH)；126.9(CH)；128.6(CH)；128.8(CH)；128.8(CH)；129.4(CH)；139.3(C)；140.7(C)
化合物生物活性篩選以各種病原性病毒如人免疫缺損病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、牛痘病毒(VV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)以及人類巨細(xì)胞病毒(CMV)對化合物進(jìn)行篩選。對于除CMV外的所有病毒，測定EC50(能夠以50％的抑制率抑制人CEM細(xì)胞培養(yǎng)物中的HIV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變(cytopathicity)、人胚胎成纖維細(xì)胞E6SM細(xì)胞培養(yǎng)物中的HSV以及VV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變、以及人類胚胎肺HEL細(xì)胞培養(yǎng)物中VZV誘導(dǎo)的噬斑形成的有效的化合物濃度)。對于測定表達(dá)為IC50的對CMV的抗病毒活性而言，將生長在96孔微板中的人類胚胎肺成纖維細(xì)胞(HEL)用每孔20PFU病毒進(jìn)行感染。
在37℃下溫育2小時后，以0.1ml的含受試化合物的系列稀釋液的培養(yǎng)基補(bǔ)充該受感染的細(xì)胞。在第7天，在用吉姆薩氏溶液對細(xì)胞染色后用顯微方法計數(shù)該噬斑。最小抗病毒濃度表達(dá)為以50％抑制率抑制病毒誘導(dǎo)的噬斑形成所需的劑量。
還以黃病毒對該化合物進(jìn)行篩選。由于沒有足夠的體內(nèi)試驗(yàn)可針對HCV進(jìn)行篩選的事實(shí)，因?yàn)榕２《拘愿篂a病毒(BVDV)與丙型肝炎病毒具有很多相似之處，因此我們選擇其進(jìn)行篩選。用BVDV的Pe515菌株在Madin Darby牛腎細(xì)胞(MDBK細(xì)胞)上評價抗病毒活性?？共《净钚砸约凹?xì)胞毒性都通過MTS方法測定。EC50為減少病毒誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變50％所需的濃度。MTC(最小毒性濃度)被定義為導(dǎo)致細(xì)胞代謝減少≥20％的濃度。
還通過鼠類白血病細(xì)胞(L1210/0)、鼠類乳腺癌細(xì)胞(FM3A)以及人類T一淋巴細(xì)胞(Molt4/C8，CEM/0)檢驗(yàn)了該化合物的抗腫瘤活性。
基于NCCLS文件M7-A4，Vol.17 No.2，M27-A，Vol 17 No.9以及M38-P，Vol 18 No.13，應(yīng)用自動讀數(shù)溫育器(reader-incubator)BioscreenC Analyser(Labsystems，F(xiàn)inland)開發(fā)出進(jìn)行抗細(xì)菌以及抗真菌篩選的微量稀釋方法(microdilution method)。其通過垂直光路光度測定(光密度)連續(xù)地測定生長、處理數(shù)據(jù)并提供打印結(jié)果。我們選擇為初級靶標(biāo)(primary target)的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC29213)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis ATCC 29212)、大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)以及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 27853)。白色假絲酵母(Candida albicans ATCC 24433)以及新型隱球菌(Cryptococcus neoformans ATCC 90112)被選作酵母靶標(biāo)。皮膚真菌須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533)以及侵襲性霉菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus ATCC 2895)被選作霉菌靶標(biāo)。優(yōu)化溫育所必需的所有參數(shù)可在Biolink軟件(Labsystems，F(xiàn)inland)中設(shè)定。所有細(xì)菌篩選都在35℃下溫育16小時。對假絲酵母以及隱球菌篩選所用的溫育參數(shù)分別為在35℃下24和48小時，侵襲性真菌煙曲霉為在30℃下溫育3天，皮膚真菌須癬毛癬菌為在30℃下溫育5天。使用以陽離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯(Oxoid，Belgium)作為細(xì)菌菌種生長培養(yǎng)基。推薦合成培養(yǎng)基用于真菌易感性試驗(yàn)RPMI 1640，含谷氨酰胺、不含碳酸氫鹽、且含pH指示劑(Oxoid)并補(bǔ)充1％葡萄糖。將25μl的10倍濃度的化合物吸入每個孔中。向每25μl試驗(yàn)化合物中加入225μl菌種生長培養(yǎng)基。使用通過Biolink軟件自動測定的生長曲線下面積作為抗細(xì)菌以及抗酵母篩選的測量工具。我們應(yīng)用終端OD測定于針對致病霉菌的篩選。在試驗(yàn)安排中包含每種微生物的參照抗生素用于內(nèi)部質(zhì)量控制。
結(jié)果與討論在第一組篩選中(表1)，針對HIV-1、HIV-2、HSV-1、HSV-2、VV、CMV以及VZV測定雙環(huán)糖類的抗病毒活性。僅化合物A3對VZV顯示出活性。
表1-針對HIV-1、HIV-2、HSV-1、HSV-2、VV、CMV以及VZV的篩選結(jié)果

a50％以50％的抑制率抑制的人淋巴細(xì)胞CEM細(xì)胞培養(yǎng)物中的HIV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變(cytopathicity)、人胚胎成纖維細(xì)胞E6SM細(xì)胞培養(yǎng)物中的HSV以及VV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變、以及人類胚胎肺HEL細(xì)胞培養(yǎng)物中CMV以及VZV誘導(dǎo)的噬斑形成的有效的化合物濃度。
表2-針對MDBK細(xì)胞中的BVDV的篩選結(jié)果

為檢測在牛腎(MDBK)細(xì)胞中的抗牛病毒性腹瀉病毒(BVDV-Pe515菌株)活性，進(jìn)行另一系列的病毒篩選(表2)。化合物A1的EC50分別為23、4以及3.2μg/ml?；衔顰2的EC50分別為7、53以及54μg/ml。兩種化合物的復(fù)制試驗(yàn)都是三個獨(dú)立的試驗(yàn)?；衔顰3的EC50＜0.8μg/ml。利巴韋林是目前用于治療HCV導(dǎo)致的感染的極好的標(biāo)準(zhǔn)。由表2中的結(jié)果可清楚看出，化合物A1、A2以及A3比利巴韋林有效得多。
當(dāng)以化合物A1、A2以及A3處理時，MTC未達(dá)到MDBK細(xì)胞的最高濃度(100μg/ml)。
針對L1210/0、FM3A/0、Molt4/C8以及CEM/0篩選化合物A1的抗腫瘤活性。未發(fā)現(xiàn)化合物A1對所有受試細(xì)胞系具有任何抗腫瘤活性?；衔?對受試細(xì)胞系具有中等的抗腫瘤活性(表3)。
表3-針對L1210/0、FM3A/0、Molt4/C8以及CEM/0的抗腫瘤篩選結(jié)果

針對四種標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌篩選抗細(xì)菌活性金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌(表4)。沒有化合物對所選微生物顯示出顯著的抗細(xì)菌活性。兩種化合物的最小抑制濃度為高于25μg/ml。
表4-對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗細(xì)菌篩選結(jié)果

針對兩種致病酵母以及霉菌篩選抗真菌活性(表5)。沒有化合物對所選微生物顯示出顯著的抗真菌作用。兩種化合物的最小抑制濃度為高于251μg/ml。
表5-針對致病真菌的篩選結(jié)果

結(jié)論在第一組對DNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的篩選中，沒有觀察到顯著的抗病毒活性。然而，在第二組針對BVDV(RNA病毒)的篩選中，我們清楚地發(fā)現(xiàn)化合物A1以及化合物A3具有顯著的抗病毒活性，而化合物A2具有中等活性。其他目前所測試的雙環(huán)糖類對BVDV不具有活性。此外，未發(fā)現(xiàn)顯著的抗腫瘤或抗微生物活性。由于BVDV以及HCV具有許多相似之處，化合物A1以及化合物A3以及可能的其他雙環(huán)糖類都可能對HCV具有強(qiáng)大的且選擇性的抗病毒性能。除化合物A1外，化合物A2及化合物A3同樣對其他黃病毒如西尼羅河病毒及登革病毒具有活性。從篩選可知，與為目前用于治療由如HCV導(dǎo)致的感染的極好標(biāo)準(zhǔn)的利巴韋林相比，化合物A1、A2以及A3對黃病毒科病毒具有更強(qiáng)的抗病毒活性。
盡管參考本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行描述，但應(yīng)明白，由于其中可進(jìn)行各種變化和改進(jìn)而不超出如所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的全部范圍，因此本發(fā)明的范圍不僅限于上述優(yōu)選的具體實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種治療黃病毒科病毒感染的方法，其包括給藥有效量的如下式所示的雙環(huán)糖類或其藥物學(xué)活性衍生物的步驟 其中，R1選自烷基、芳基和芐基；R2及R3選自烷基和芳基；R4為芳基；X選自O(shè)、N和S。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中R1選自苯基和芐基，R2和R3選自丙基、異丙基和丁基，R4為苯基以及X為O，或其藥物學(xué)可接受的鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述感染為丙型肝炎。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述感染為牛病毒性腹瀉。
5.一種治療正義RNA病毒感染的方法，其包括給藥有效量的權(quán)利要求1中的化合物的步驟。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述感染是丙型肝炎。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述感染是牛病毒性腹瀉。
全文摘要
本發(fā)明公開雙環(huán)糖類在治療丙型肝炎病毒感染中的應(yīng)用。針對DNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及人類和動物RNA病原體的重要家族黃病毒科病毒在體內(nèi)測試了不同的雙環(huán)糖類化合物。觀察到對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)具有顯著的活性。由于瘟病毒如BVDV同丙型肝炎病毒(HCV)具有許多相似之處，因此預(yù)期通常的雙環(huán)糖類以及更具體地優(yōu)選的雙環(huán)糖類可用于治療丙型肝炎病毒感染。
文檔編號C07D498/02GK1751057SQ200380108468
公開日2006年3月22日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月7日
發(fā)明者貝內(nèi)迪克特·薩斯, 約翰·范赫梅爾, 揚(yáng)·范登凱爾克霍弗, 埃里克·派斯, 約翰·范德艾肯, 巴爾特·魯滕斯, 揚(yáng)·巴爾扎里尼, 埃里克·德克萊爾, 約翰·奈伊茨 申請人:凱敏制藥歐洲股份有限公司