專利名稱：防止和治療癌轉(zhuǎn)移以及與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過給對(duì)象施用M-CSF拮抗劑來(lái)防止和治療癌轉(zhuǎn)移以及與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的方法。
背景技術(shù)：
癌轉(zhuǎn)移是癌癥病人手術(shù)后或治療后復(fù)發(fā)的主要原因。盡管對(duì)治療方法的發(fā)展付諸了很大的努力，但是癌轉(zhuǎn)移仍然很難治療。骨骼是多種人類癌癥(例如，乳房癌、肺癌、前列腺癌和甲狀腺癌)轉(zhuǎn)移的最常發(fā)生的位置之一。溶骨性轉(zhuǎn)移的發(fā)生會(huì)因難以控制的疼痛、對(duì)于骨折的高度易感性、神經(jīng)壓迫和高血鈣癥而引發(fā)嚴(yán)重的病癥。盡管這些臨床問題十分嚴(yán)重，但是目前幾乎沒有治療與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的療法。
破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨質(zhì)的重吸收(readsorption)。破骨細(xì)胞是由造血細(xì)胞分化而來(lái)的多核細(xì)胞。通常認(rèn)為，破骨細(xì)胞是由骨髓中的造血干細(xì)胞衍生而來(lái)的單核細(xì)胞前體融合形成的，而不是由不完全的細(xì)胞分裂形成的(Chambers，Boneand Mineral Research，61-25，1989；Gthling等人，Clin Orthop RelatR.120201-228，1976；Kahn等人，Nature 258325-327，1975，Suda等人，Endoer Rev 1366-80，1992；Walker，Science 180875，1973；Walker，Science 190785-787，1975；Walker，Science 190784-785，1975)。它們和單核細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞細(xì)胞系擁有共同的干細(xì)胞(Ash等人，Nature 283669-670，1980，Kerby等人，J.Bone Minver Res 7353-62，1992)。破骨細(xì)胞前體向成熟的多核破骨細(xì)胞的分化需要各種不同的因素，包括激素的和局部的刺激(Athanasou等人，Bone Miner 3317-333，1988；Feldman等人，Endocrinology1071137-1143，1980；Walker，Scienee 190784-785，1975；Zheng等人，Histochem J 23180-188，1991)，而且活的骨骼和骨細(xì)胞也被證實(shí)在破骨細(xì)胞的發(fā)育中起到重要的作用(Hagenaars等人，Bone Miner 6179-189，1989)。成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞同樣也是破骨細(xì)胞分化所需要的。這些細(xì)胞所產(chǎn)生的支持破骨細(xì)胞生成的因子之一就是巨嗜細(xì)胞集落刺激因子，M-CSF(Wiktor-Jedrzejczak等人，Proc Natl Acad Sci USA 874828-4832，1990；Yoshida等人，Nature 345442-444，1990)。NF-κB配體的受體活化因子(RANKL，也稱為TRANCE，ODF或OPGL)是另一個(gè)信號(hào)(Suda等人，Endoer Rev 1366-80，1992)，通過該信號(hào)成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞刺激破骨細(xì)胞的生成和通過位于破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體上的受體——RANK(TRANCER)——進(jìn)行再吸收(Lacey等人，Cell93165-176，1998；Tsuda等人，Biochem Biophys Res Co 234137-142，1997；Wong等人，J Exp Med 1862075-2080，1997；Wong等人，J Biol.Chem27225190-25194，1997；Yasuda等人，Endocrinology 1391329-1337，1998；Yasuda等人，Proc Natl Acad Sci US 953579-3602，1998)。成骨細(xì)胞還分泌出一種強(qiáng)烈抑制破骨細(xì)胞生成的蛋白，即骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG，也稱為OCIF)，該蛋白充當(dāng)RANKL的假受體，因此抑制破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間通過RANK和RANKL傳遞的正向信號(hào)。
破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)溶解礦物質(zhì)和有機(jī)骨基質(zhì)(Blair等人，J Cell Biol1021164-1172，1986)。破骨細(xì)胞代表終末分化的且表現(xiàn)出獨(dú)特極化形態(tài)的細(xì)胞，它具有特殊的細(xì)胞膜區(qū)域和幾個(gè)細(xì)胞膜和胞質(zhì)的標(biāo)記，例如耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)(Anderson等人1997)，碳酸酐酶II(Vaananen等人，Histochemistry 78481-485，1983)，降鈣素受體(Warshafsky等人，Bone6179-185，1985)和玻璃體結(jié)合蛋白受體(Davies等人，J Cell Biol1091817-1826，1989)。盡管多核破骨細(xì)胞通常含有不到10個(gè)細(xì)胞核，但是它們可含有直徑在10和100μm之間的多達(dá)100個(gè)細(xì)胞核(Gthling等人，ClinOrthop Relat R 120201-228，1976)。這使它們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下相對(duì)容易辨認(rèn)。處于活躍狀態(tài)時(shí)，這些細(xì)胞具有很多液泡，而且還含有許多線粒體，這暗示著很高的新陳代謝率(Mundy，骨代謝疾病和礦物代謝疾病的初級(jí)讀本(Primer onthe metabolic bone diseases and disorders of mineal metabolism)，18-22頁(yè)，1990)。因?yàn)槠乒羌?xì)胞在溶骨性骨質(zhì)轉(zhuǎn)移中起主要作用，所以在本領(lǐng)域中需要新的藥劑和方法來(lái)防止對(duì)破骨細(xì)胞的刺激作用。
因此，本領(lǐng)域一直需要確定新的藥劑和方法，以便用于防止或治療癌轉(zhuǎn)移，包括溶骨性骨質(zhì)轉(zhuǎn)移(bone metastases)。
發(fā)明概述本發(fā)明的組合物和方法填補(bǔ)了本領(lǐng)域中先前提到的和其它相關(guān)的需求。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種防止骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括給忠有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑，從而防止與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了一種治療轉(zhuǎn)移到骨的轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，該方法包括給所述的對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑，從而降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。在相關(guān)的實(shí)施例中，提供了上述的方法，其中所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物，或所述的哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明的方法是通過抑制M-CSF和其受體(M-CSFR)之間的相互作用而達(dá)到治療效果的。進(jìn)一步，抑制M-CSF/M-CSFR的相互作用，就抑制了由腫瘤細(xì)胞所引起的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，先前所述方法的M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所組成的組包含抗-M-CSF抗體的多肽；包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，在所提供的上述方法中，M-CSF拮抗劑是抗-M-CSF抗體。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑是包含抗-M-CSFR抗體的多肽。在又一實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑是包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。在還有一個(gè)實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑是包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑是一種抗體，該抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和前述的抗體中任一個(gè)的突變蛋白。在又一實(shí)施例中，抗體結(jié)合的抗原表位和單克隆抗體5H4(ATCC保藏號(hào)HB10027)所結(jié)合的抗原表位相同。
有許多轉(zhuǎn)移性癌癥可用本申請(qǐng)揭示的方法進(jìn)行治療。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移性癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、血細(xì)胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。
本發(fā)明同樣包括施用治療有效量的M-CSF拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑是一種抗體，其施用劑量在約0.01mg/kg和約100mg/kg之間。
在另一實(shí)施例中，提供與M-CSF相結(jié)合的非鼠源性抗體來(lái)治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象，其中所述的抗體有效地降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。
如本文所述，本發(fā)明的抗體抑制溶骨作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了非鼠源性單克隆抗體，該抗體與M-CSF特異結(jié)合的抗原表位和5H4與M-SCF所結(jié)合的抗原表位相同。在另一實(shí)施例中，所提供的非鼠源性單克隆抗體和5H4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合M-CSF。較佳地，該非鼠源性單克隆抗體和5H4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合M-CSF的程度超過10％；較優(yōu)地，該競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合程度超過25％；更優(yōu)地，超過50％；更優(yōu)地，超過75％；最優(yōu)地，超過90％。
應(yīng)理解，前述的任何一種抗體都可以施用于有需要的對(duì)象。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供一種藥物組合物，它含有前述的任何一種抗體和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用于治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥患者的非鼠源性抗體，其中該抗體有效地降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，前述的抗體選自由下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和前述的抗體中任一個(gè)的突變蛋白。在另一實(shí)施例中，抗體具有M-CSF特異性。在又一本發(fā)明的實(shí)施例中，抗體具有M-CSFR特異性。在其他實(shí)施例中，抗體是完全的人抗體或人源化抗體。在還有一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，提供了分泌前述抗體的雜交瘤細(xì)胞。
有許多轉(zhuǎn)移性癌癥可用本文揭示的抗體進(jìn)行治療。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移性癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、血細(xì)胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，提供了一種藥物組合物，它含有前述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
對(duì)防止或治療與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失具有潛在作用的M-CSF，可以用不同的試驗(yàn)進(jìn)行篩選。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種篩選M-CSF拮抗劑的方法，包括以下步驟使轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基、破骨細(xì)胞和候選拮抗劑相接觸；檢測(cè)破骨細(xì)胞的生成、增殖和/或分化；和將所述的候選拮抗劑確定為M-CSF拮抗劑，如果檢測(cè)到破骨細(xì)胞的生成、增殖和/或分化有所減少。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，所構(gòu)思的篩選方法中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基包括腫瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所提供的方法中接觸步驟在體內(nèi)進(jìn)行，所述的檢測(cè)步驟包括檢測(cè)骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的大小和/或數(shù)目，并且如果檢測(cè)到骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的大小和/或數(shù)目有所降低，那么所述的候選拮抗劑則被確定為M-CSF拮抗劑。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括以下步驟確定所述的候選拮抗劑是否與M-CSF相結(jié)合。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括以下步驟確定所述的候選拮抗劑是否抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。
應(yīng)理解，使用本文所述的篩選方法可以確定許多不同的拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施例中，所提供的方法中候選拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組包含抗-M-CSF抗體的多肽；包含其抗M-CSFR抗體的多肽；包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；肽；或小分子。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，所提供的方法中所述的候選拮抗劑是M-CSF突變蛋白。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，所提供的方法中候選拮抗劑是抗-M-CSF抗體。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，候選拮抗劑是M-CSF突變蛋白。在另一實(shí)施例中，候選拮抗劑是抗-M-CSF抗體。在還有一個(gè)實(shí)施例中，候選拮抗劑是抗-M-CSFR抗體。
本發(fā)明的另一實(shí)施例提供一種確定可以防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的M-CSF拮抗劑的方法，它包括以下步驟檢測(cè)候選拮抗劑與M-CSF的結(jié)合；和測(cè)定所述候選拮抗劑在體外或體內(nèi)防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的能力。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，提供了一種確定可以防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的M-CSF拮抗劑的方法，它包括以下步驟檢測(cè)候選拮抗劑與M-CSFR的結(jié)合；和測(cè)定所述候選拮抗劑在體外或體內(nèi)防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的能力。在另一實(shí)施例中，提供一種確定可以防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的M-CSF拮抗劑的方法，它包括以下步驟確定能夠抑制M-CSF和M-CSFR之間相互作用的候選拮抗劑；和測(cè)定所述候選拮抗劑在體外或體內(nèi)防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的能力。
更有利的是，將兩種或更多種M-SCF拮抗劑混合在一起，從而提高藥物對(duì)癌轉(zhuǎn)移和/或與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的療效。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一種防止骨質(zhì)轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)的方法，該方法包括給患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑和治療劑，從而防止與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失并防止腫瘤生長(zhǎng)。類似地，本發(fā)明的另一實(shí)施例提供一種治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑和治療劑，從而降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度并抑制腫瘤生長(zhǎng)。在相關(guān)方面，前述方法中的對(duì)象是哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施例中，對(duì)象是人。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所提供的前述方法中的拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。在又一實(shí)施例中，拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。在還有一個(gè)實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組包含抗-M-CSF抗體的多肽；包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
大量的M-CSF拮抗劑抗體在本發(fā)明的構(gòu)思之中。在一個(gè)實(shí)施例中，所提供的前述方法中的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和前述抗體中任一個(gè)的突變蛋白。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所提供的前述方法中，治療劑是二磷酸鹽(bisphosphonate)。在另一實(shí)施例中，所述的二磷酸鹽(bisphosphonate)是卓樂膦酸鹽(zeledronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、氯膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、替魯膦酸鹽(tilundronate)、阿倫膦酸鹽(alendronate)或伊班膦酸鹽(ibandronate)。在另一實(shí)施例中，所提供的治療劑是化療劑。應(yīng)理解，一些對(duì)象可以不接受二磷酸鹽治療。作為例子，如果對(duì)象對(duì)于二磷酸鹽沒有足夠的反應(yīng)，如果對(duì)象不能耐受二磷酸鹽治療，或者如果二磷酸鹽對(duì)于對(duì)象的特定癥狀(例如，腎衰竭)是禁忌使用的，那么該對(duì)象可以不接受二磷酸鹽治療。癌癥化療劑包括，但并不限于烷化劑，例如卡鉑和順鉑；氮芥烷化劑；亞硝基脲烷化劑，例如卡莫司汀(carmustine，BCNU)；抗代謝物，例如氨甲喋呤；嘌呤類似物抗代謝物，巰嘌呤(mercaptopurine)；嘧啶類似物抗代謝物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱(gemcitabine)；激素性抗腫瘤藥(hormonal antineoplastics)，例如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)、它莫西芬(tamoxifen)；天然抗腫瘤物質(zhì)，例如阿地白介素(aldesleukin)、白細(xì)胞介素-2、多西紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(etoposide，VP-16)、干擾素α、紫杉醇(paclitaxel)、和維甲酸(ATRA)；抗生素類天然抗腫瘤物質(zhì)，例如博萊霉素、更生霉素、紅必霉素、多柔比星、和絲裂霉素；以及長(zhǎng)春花堿類天然抗腫瘤物質(zhì)，例如長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春花新堿、去乙酰長(zhǎng)春酰胺；羥基脲；醋葡醛內(nèi)酯、阿霉素、異磷酰胺(ifosfamide)、依諾他濱(enocitabine)、阿柔比星(aclarubicin)、安西他濱(ancitabine)、尼莫司汀(nimustine)、鹽酸甲基芐肼、卡波醌(carboquone)、卡莫氟(carmofur)、色霉素A3、抗腫瘤多糖、抗腫瘤血小板因子、環(huán)磷酰胺、裂殖菌多糖(Schizophyllan)、阿糖胞苷、氮烯唑氨、硫肌苷、硫替派、替加氟(tegafur)、新抑癌蛋白(neocarzinostatin)、OK-432、博萊霉素、氟鐵龍(furtulon)、溴尿苷(broxuridine)、白消安(busulfan)、二磷酸己烯雌酚四鈉(honvan)、培洛霉素(peplomycin)、苯丁抑制素(Bestatin)(也稱為烏苯美司ubenimex)、干擾素β、美雄烷(mepitiostane)、二溴甘露醇(mitobronitol)、馬法蘭(merphalan)、層粘連蛋白肽、采絨革蓋菌(Coriolusversicolor)提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(estramustine)(雌激素/氮芥(mechlorethamine))。
進(jìn)一步，其它用作癌癥病人附加療法的藥物包括EPO、G-CSF、更昔洛韋(ganciclovir)、抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；疊氮胸苷(AZT)；白細(xì)胞介素1到18、包括其突變物和類似物；干擾素或細(xì)胞因子，例如干擾素α、β和γ；激素，例如促黃體生成素釋放激素(LHRH)及其類似物以及促性腺激素釋放激素(GnRH)；生長(zhǎng)因子，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子同源因子(FGFHF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)；腫瘤壞死因子-α和β(TNF-α和β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1至7(BMP1-7)；生長(zhǎng)抑素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；補(bǔ)體因子；抗血管生成因子；抗原性物質(zhì)；前體藥物；生長(zhǎng)因子受體激酶抑制劑；抗-Her2抗體；和VEGF中和抗體。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑有效地降低達(dá)到一定療效時(shí)所需的治療劑的施用劑量。因此，M-CSF拮抗劑可以提高另一種治療劑的效果，或減少與施用另一種治療劑有關(guān)的副作用，或提高另一種治療劑的安全性。M-CSF拮抗劑還可以提高另一種治療方式(諸如手術(shù)或放療)的療效、減少其副作用、或提高其安全性。在另一實(shí)施例中，上述方法進(jìn)一步包括以下步驟施用非M-CSF型集落刺激因子，例如G-CSF。在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，提供了一種包含M-CSF拮抗劑和癌癥治療劑的藥物組合物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了一種包裝、藥瓶或容器，它包括含有M-CSF拮抗劑的藥物和使用說明(即藥物應(yīng)當(dāng)與手術(shù)或放療聯(lián)合使用)。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了一種防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，該方法包括以下步驟給對(duì)象施用M-CSF拮抗劑并用手術(shù)或放療治療所述對(duì)象。
M-CSF拮抗劑可用作有效的免疫治療劑，這也在構(gòu)思之中。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一種靶向在細(xì)胞表面上表達(dá)膜結(jié)合M-CSF的腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟施用一種特異結(jié)合于膜結(jié)合M-CSF的胞外部分[SEQID NO2]的抗體。在另一實(shí)施例中，抗體偶聯(lián)于放射性核素或其他毒素。在另一實(shí)施例中，抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和前述抗體中任一個(gè)的突變蛋白。
在另一方面，本發(fā)明構(gòu)思了一種基于免疫療法的腫瘤治療方法，該方法通過施用抗-M-CSF抗體來(lái)靶向在細(xì)胞表面上表達(dá)膜結(jié)合M-CSF的腫瘤細(xì)胞。本文的實(shí)施例表明，多種癌細(xì)胞會(huì)表達(dá)膜結(jié)合形式的M-CSF，其中包括但并不限于乳房癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨肉瘤和甲狀腺癌。因此，本發(fā)明包括殺死表達(dá)膜結(jié)合M-CSF的腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)的方法，該方法包括以下步驟施用有效劑量的結(jié)合于M-CSF的抗體，該抗體可以是單獨(dú)的，也可以偶聯(lián)于細(xì)胞毒性分子。盡管優(yōu)選的是特異地與膜結(jié)合M-CSF相結(jié)合的抗體，然而任何與膜結(jié)合M-CSF的胞外部分相結(jié)合的抗體都可用于這些方法。
本發(fā)明還包括，將本發(fā)明中任一種M-CSF拮抗劑都可用于治療癌癥，包括非轉(zhuǎn)移性的癌癥。在其它方面，本發(fā)明包括將本發(fā)明的任一種拮抗劑用于治療高血鈣癥、佩吉特氏病或骨質(zhì)疏松。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種治療患有癌癥的對(duì)象的方法，其中組成所述癌癥的細(xì)胞不分泌M-CSF，該方法包括以下步驟施用M-CSF拮抗劑。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，提供了一種防止骨轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括給患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用一定劑量的M-CSF拮抗劑，使之有效地中和對(duì)象細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF，該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF的劑量。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種治療患有向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象的方法，該方法包括給該對(duì)象施用一定劑量的M-CSF拮抗劑，使之有效地中和對(duì)象細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF，該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF的劑量。
本發(fā)明還包括多種用途。舉例來(lái)說，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了將任何一種前述抗體用于藥物。類似地，提供了一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，該藥物用以防止患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。在另一實(shí)施例中，提供了一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，該藥物用以防止患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象發(fā)生與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，該藥物用以治療患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，該藥物用以降低患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象中所發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。
很多對(duì)象可從本文所述的M-CSF拮抗劑的用途和方法中獲益。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)象是哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物是指人。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了前面所述的用途，其中拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。在另一實(shí)施例中，拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。在另一實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組包含抗-M-CSF抗體的多肽；包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和上述任何一種抗體或片段的突變蛋白。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，在所提供的前述用途中，所述的抗體對(duì)M-CSF具有特異性。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，抗體是抗體5H4。在又一個(gè)實(shí)施例中，所述的抗體對(duì)M-CSFR具有特異性。
應(yīng)理解，很多種轉(zhuǎn)移性癌癥可作為本發(fā)明前述用途中相關(guān)的靶目標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移性癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、血細(xì)胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。在另一實(shí)施例中，前述用途中所述的M-CSF拮抗劑是一種抗體，該抗體的施用劑量在約0.01mg/kg和l00mg/kg之間。
本發(fā)明還構(gòu)思了很多種藥物。舉例來(lái)說，所提供的前述用途用于藥物生產(chǎn)，該藥物用以治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象。在另一實(shí)施例中，提供了將抗體用于藥物制備的用途，該藥物用以降低患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象所發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑和一種治療劑用于藥物制備的用途，該藥物用以防止發(fā)生在患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象中的骨轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑和一種治療劑用于藥物制備的用途，該藥物用以防止發(fā)生在患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象身上的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。
在另一實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑和一種治療劑用于藥物制備的用途，該藥物用以治療轉(zhuǎn)移性癌癥。在又一實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑和一種治療劑用于藥物制備的用途，該藥物用以在患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象中降低所發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度以及抑制腫瘤生長(zhǎng)。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供包含一種M-CSF拮抗劑和一種治療劑的產(chǎn)品的用途，該產(chǎn)品作為組合制劑，它們被同時(shí)、分別或依次用于癌癥的治療。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑用于藥物制備的用途，該藥物用以防止或治療骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥，其中該藥物同一種癌癥治療劑同時(shí)、分別或依次地施用。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供將一種癌癥治療劑用于藥物制備的用途，該藥物用以防止或治療骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥，其中該藥物同M-CSF拮抗劑同時(shí)、分別或依次地施用。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供一種包裝、藥瓶或容器，它包括含有M-CSF拮抗劑的藥物以及使用說明，即藥物應(yīng)當(dāng)與手術(shù)或放療聯(lián)合使用。進(jìn)一步，所提供的前述用途中，所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物。更進(jìn)一步，所提供的前述用途中，所述的哺乳動(dòng)物是人。在另一實(shí)施例中，前述用途中的拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。在又一個(gè)實(shí)施例中，拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。
在另一實(shí)施例中，所提供的前述用途中，所述的M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組包含抗-M-CSF抗體的多肽；包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。另外，在另一實(shí)施例中，所提供的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和任何一個(gè)前述抗體的突變蛋白。
本發(fā)明還包括多種治療劑。在一個(gè)實(shí)施例中，在所提供的前述用途中，所述的治療劑是二磷酸鹽(bisphosphonate)。另外，在另一實(shí)施例中，所述的二磷酸鹽(bisphonate)是卓樂膦酸鹽(zeledronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、氯膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、替魯膦酸鹽(tilundronate)、阿倫膦酸鹽(alendronate)或伊班膦酸鹽(ibandronate)。在又一個(gè)實(shí)施例中，治療劑是化療劑。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，對(duì)象不接受二磷酸鹽治療。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于降低施用于對(duì)象用以治療或防止骨轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)的治療劑的劑量。在另一實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子用于制備藥物的用途，該藥物用以防止在患有轉(zhuǎn)移性癌癥對(duì)象中發(fā)生的骨轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子用于制備藥物的用途，該藥物用以防止在患有轉(zhuǎn)移性癌癥對(duì)象中發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子用于制備藥物的用途，該藥物用以治療轉(zhuǎn)移性癌癥。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供將M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子用于制備藥物的用途，該藥物用以在患有轉(zhuǎn)移性癌癥對(duì)象中降低與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度以及抑制腫瘤生長(zhǎng)。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，提供前述的用途，其中非M-CSF型集落刺激因子是G-CSF。
本發(fā)明的另一實(shí)施例提供了一種特異地與膜結(jié)合M-CSF的胞外部分相結(jié)合的抗體在藥物制備中的用途，該藥物用以靶向在細(xì)胞表面上表達(dá)膜結(jié)合M-CSF的腫瘤細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，提供了一種抗體在藥物制備中的用途，其中該抗體(a)特異結(jié)合于膜結(jié)合M-CSF的胞外部分，并且(b)偶聯(lián)于放射性核素或其它毒素，而該藥物用于癌癥的治療。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，提供了前述的用途，其中所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和上述任何一種抗體的突變蛋白。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了非鼠源性抗-M-CSF抗體在制備癌癥治療藥物中的用途。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，癌細(xì)胞不分泌M-CSF。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了將一定劑量的M-CSF拮抗劑(該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量)用于藥物制備的用途，該藥物用于防止骨轉(zhuǎn)移。在又一個(gè)實(shí)施例中，提供了將一定劑量的M-CSF拮抗劑(該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量)用于藥物制備的用途，該藥物用于中和對(duì)象細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF。在還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了將一定劑量的M-CSF拮抗劑(該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量)用于藥物制備的用途，該藥物用于治療患有骨轉(zhuǎn)移性癌癥(metastatic cancer to bone)的對(duì)象。在另外一個(gè)實(shí)施例中，提供了將一定劑量的M-CSF拮抗劑(該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量)用于藥物制備的用途，該藥物用于治療癌癥。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還包括試劑盒。典型的試劑盒包括一個(gè)含有本發(fā)明拮抗劑的包裝、容器或藥瓶以及使用說明(例如產(chǎn)品插頁(yè)或標(biāo)簽)，其中使用說明用于指導(dǎo)用戶按本發(fā)明任一方法來(lái)使用藥劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示出截短的二聚體M-CSF中二硫鍵位置的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
圖2是C-α骨架的立體圖，其中每10個(gè)殘基都被標(biāo)出，而非結(jié)晶學(xué)對(duì)稱軸則用虛線表示。
圖3對(duì)比顯示了純化的M-CSF和來(lái)自MDA 23l細(xì)胞和MCF7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)對(duì)破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)活性。
圖4對(duì)比顯示了與來(lái)自MDA231細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)相比，單克隆抗體5H4對(duì)于純化的M-CSF的中和活性。
圖5顯示出5H4和其它抗人M-CSF抗體的中和活性。
圖6顯示了在各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組中，平均溶骨值≥2.5的動(dòng)物數(shù)目在接受了5A1+5H4抗體聯(lián)合治療的動(dòng)物組中是最低的。
圖7表明在各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組中，平均溶骨值≥2.5的動(dòng)物數(shù)目在接受了5A1+5H4抗體聯(lián)合治療的動(dòng)物組中是最低的。
圖8顯示M-CSF-特異性抗體結(jié)合于乳房癌細(xì)胞系MDA231或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RH77。
圖9顯示M-CSF普遍存在于多種腫瘤細(xì)胞的表面。
詳細(xì)描述具有轉(zhuǎn)移能力是癌癥的定義性特征。轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞向身體的其它部分?jǐn)U散，或者是指由這樣的擴(kuò)散所造成的狀況。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，包括細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變、改變的細(xì)胞發(fā)生不受控制的增殖從而形成原發(fā)性腫瘤、發(fā)展出用于原發(fā)性腫瘤的新血液供給、來(lái)自原發(fā)性腫瘤的細(xì)胞侵入循環(huán)系統(tǒng)、小簇的原發(fā)性腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散至身體的其它部分、和在那些部位的繼發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。
骨骼是人乳房癌、肺癌、前列腺癌和甲狀腺癌以及其它癌癥最常發(fā)生轉(zhuǎn)移的位置之一，而且尸體解剖發(fā)現(xiàn)多達(dá)60％的癌癥病人發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。溶骨性骨轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出獨(dú)特的破骨細(xì)胞骨質(zhì)重吸收步驟，這在轉(zhuǎn)移至其它器官的癌癥中并未發(fā)現(xiàn)。與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失是由破骨細(xì)胞(具有重新吸收礦化組織能力的多核巨大細(xì)胞)所介導(dǎo)的，而破骨細(xì)胞似乎是被腫瘤產(chǎn)物所激活的。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，集落刺激因子(CSF1)，也被稱為巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，對(duì)于破骨細(xì)胞的形成至關(guān)重要。此外，已經(jīng)證實(shí)，通過與其它可溶性因子協(xié)同作用以及成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用，M-CSF可調(diào)控成熟破骨細(xì)胞的破骨功能、這些細(xì)胞的遷移以及存活(Fixe和Praloran，Cytokine 103-7，1998；Martin等人，真核基因表達(dá)的重要回顧(Critical Rev.in Eukaryotic Gene Expression)8107-23(1998))。
全長(zhǎng)的人M-CSF mRNA編碼具有554個(gè)氨基酸的前體蛋白(SEQ ID NO4)。通過可變mRNA剪接和不同的翻譯后蛋白水解加工，M-CSF或者作為一種糖蛋白或含有蛋白聚糖的硫酸軟骨素而被分泌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，或者在產(chǎn)生M-CSF的細(xì)胞表面表達(dá)成為跨膜糖蛋白。細(xì)菌表達(dá)的人M-CSF氨基末端的150個(gè)氨基酸(這是要使該蛋白在體外仍保持完全的生物學(xué)活性所必需的最短序列)的三維結(jié)構(gòu)，暗示此蛋白是一個(gè)通過二硫鍵相連的二聚體，而每個(gè)單體則由4個(gè)α螺旋束和一個(gè)反平行β折疊構(gòu)成(Pandit等人，Science 2581358-62(1992))。通過可變剪接，產(chǎn)生三種不同的M-CSF。這三種多肽前體是具有256個(gè)氨基酸的M-CSFα(DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO1和2)、具有554個(gè)氨基酸的M-CSFβ(DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO3和4)、具有438個(gè)氨基酸的M-CSFγ(DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO5和6)。M-CSFβ是一種分泌蛋白，它不以膜結(jié)合形式出現(xiàn)。M-CSFα表達(dá)為整合膜蛋白，并且由于蛋白水解切割而緩慢釋放。M-CSFα在SEQ ID NO2中191-197位氨基酸處被切開。膜結(jié)合形式的M-CSF能與鄰近細(xì)胞上的受體相互作用，并由此介導(dǎo)特異的細(xì)胞-細(xì)胞接觸。
多種形式的M-CSF都是通過與靶細(xì)胞上的受體M-CSFR相結(jié)合而發(fā)揮其功能的。M-CSFR(其DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO7和8)是一種跨膜分子，它包含5個(gè)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜域和一個(gè)膜內(nèi)不連續(xù)的Src相關(guān)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)。M-CSFR是由c-fms原癌基因所編碼的。M-CSF與M-CSFR的胞外結(jié)構(gòu)域相結(jié)合導(dǎo)致受體的二聚體化，這就激活了胞漿內(nèi)的激酶域，引起其自磷酸化和其它細(xì)胞蛋白的磷酸化(Hamilton J.A.，J LeukocBiol.，62(2)145-55(1997))；Hamilton J.A.，Immuno Today.，18(7)313-7(1997)。
磷酸化的細(xì)胞蛋白引發(fā)了一系列生化事件的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致細(xì)胞做出反應(yīng)有絲分裂、分泌細(xì)胞因子、細(xì)胞膜褶皺、和調(diào)控它自身受體的轉(zhuǎn)錄(Fixe和Praloran，Cytokine 1032-37(1998))。
M-CSF在基質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞和其它細(xì)胞中表達(dá)。它還在乳房、子宮和卵巢腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。這些腫瘤組織中的表達(dá)程度與高評(píng)分等級(jí)和較差的預(yù)后相關(guān)(Kacinski Ann.Med.2779-85(1995))；Smith等人，Clin.CancerRes.1313-25(1995))。在乳房癌中，M-CSF主要在侵襲性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，這和管內(nèi)(侵入前)癌癥恰恰相反(Scholl等人，J.Natl.Cancer Inst.86120-6(1994))。除此以外，M-CSF顯示能夠加快哺乳動(dòng)物腫瘤向惡性轉(zhuǎn)化的進(jìn)程(Lin等人，J.Exp.Med.93727-39(2001))。對(duì)于乳房癌和卵巢癌，M-CSF的產(chǎn)生似乎導(dǎo)致巨嗜細(xì)胞被募集到腫瘤組織。
目前，沒有關(guān)于M-CSF拮抗劑用于防止或治療癌癥轉(zhuǎn)移或與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的報(bào)道。作為本發(fā)明的一部分，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)M-CSF拮抗劑能夠中和由轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞所誘發(fā)的破骨細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了用于治療或防止癌癥轉(zhuǎn)移和與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的組合物和方法。
如本文所用，“腫瘤”指各種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，不論是惡性的還是良性的，以及所有癌變前的和癌變的細(xì)胞和組織。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌變的”意指或用于描述哺乳動(dòng)物中以不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)為典型特征的生理情況。癌癥的例子包括但并不限于，癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。這些癌癥的更具體例子包括，乳房癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸道癌癥、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾腺癌、腎癌、肝癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各種不同類型的頭部和頸部癌癥。
“治療”是一種旨在防止疾病癥狀的發(fā)展或改變疾病癥狀的病理特征的干預(yù)手段。因此，“治療”不僅指治療性措施，也指預(yù)防性或防止性措施。那些需要接受治療的對(duì)象包括已經(jīng)表現(xiàn)出疾病癥狀的對(duì)象和有必要防止疾病癥狀出現(xiàn)的對(duì)象。在腫瘤(例如，癌癥)治療中，治療劑可以直接降低腫瘤細(xì)胞的病理情況，或者使腫瘤細(xì)胞對(duì)其它治療劑(例如，放療和/或化療)更加敏感。癌癥的“病理癥狀”包括危及病人健康的所有狀況。這包括，但并不限于不正常的或不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、干預(yù)鄰近細(xì)胞的正常功能、以失常水平釋放細(xì)胞因子或其它分泌物質(zhì)、抑制或加重炎癥應(yīng)答或免疫應(yīng)答等。
如本文所用，短語(yǔ)“轉(zhuǎn)移性癌癥”的定義是有能力向身體其它部分(尤其是骨)擴(kuò)散的癌癥。大量癌癥能夠轉(zhuǎn)移至骨，但是最常見的轉(zhuǎn)移性癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌和前列腺癌。舉例來(lái)說，其它能轉(zhuǎn)移至骨的癌癥包括，但并不限于腺癌、血細(xì)胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。
本發(fā)明特別構(gòu)思了對(duì)由腫瘤所引發(fā)的溶骨性病變的防止和治療。
I.拮抗劑如本文所用，術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”通常是指一個(gè)分子、化合物或其它試劑所具有的特性，例如干擾一種分子與另一種分子相結(jié)合的特性或干擾一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞激活的特性，其中這種干擾可以通過空間位阻、構(gòu)象改變或是其它生化機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。一方面，術(shù)語(yǔ)拮抗劑是指一種制劑所具備的阻止受體與其配體相結(jié)合的特性，例如，阻止M-CSF與M-CSFR的結(jié)合，從而抑制由M-CSF引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。拮抗劑這一術(shù)語(yǔ)不局限于任何特定的作用機(jī)制，而是泛指本文所定義的功能特性。本發(fā)明的拮抗劑包括，但并不限于M-CSF抗體和片段以及其突變蛋白和修飾形式，可溶性的M-CSF和其片段、突變蛋白以及修飾形式，以及與M-CSF或M-CSFR相結(jié)合的多肽以及其它化合物和分子，和抑制M-CSF和M-CSFR表達(dá)的反義化合物。任選地，本發(fā)明的拮抗劑可不包括靶向M-CSF的反義分子。本發(fā)明的任一種拮抗劑可以用本領(lǐng)域已知的任何方式施用。例如，M-CSF突變蛋白、M-CSFR突變蛋白或結(jié)合于M-CSF或M-CSFR的抗體片段可以通過基因治療的方法施用。
在合適的情況下，本發(fā)明的M-CSF拮抗劑包括功能等價(jià)物。例如，分子的長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、組分等可以不同，但是它們?nèi)钥赡鼙Ａ粢环N或多種所定義的功能。更具體地，本發(fā)明的抗體、抗體片段或肽的功能等價(jià)物可以包括模擬化合物，也就是設(shè)計(jì)用于模擬適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合構(gòu)象和/或取向的結(jié)構(gòu)體(constructs)。
優(yōu)選的M-CSF拮抗劑可任選地通過添加側(cè)基等方式進(jìn)行修飾，例如，通過氨基端的?；饔?、羧基端的酰胺化作用或通過向氨基酸側(cè)鏈偶聯(lián)額外的基團(tuán)。拮抗劑還可以含有一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸置換。“保守的氨基酸置換”是指在氨基酸序列中保留了被置換氨基酸的總電荷、疏水性/親水性和/或立體構(gòu)象(steric bulk)的那些置換氨基酸。例如，以下各組中的氨基酸置換是保守的Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Cys/Thr、和Phe/Trp/Tyr。這樣的置換基本上不會(huì)降低M-CSF拮抗劑的功效，而且還可能表現(xiàn)出一些有利的特性，例如在體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)或毒性的降低。
本發(fā)明還包括具有除了氨基酸的插入、缺失、或置換以外的修飾的多肽。舉例來(lái)說，修飾本質(zhì)上可以是共價(jià)的，并且包括如與聚合物、脂類、其它有機(jī)和無(wú)機(jī)部分之間的化學(xué)鍵。制備這些衍生物可以提高多肽的循環(huán)半衰期，或者可以設(shè)計(jì)改善多肽對(duì)希望靶向的細(xì)胞、組織、或器官的靶向能力。類似地，本發(fā)明還包括這樣的M-CSF或M-CSFR多肽，它們可以經(jīng)過共價(jià)修飾后含有一個(gè)或多個(gè)水可溶性聚合物附加體，例如聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”是指一定劑量的治療或預(yù)防用M-CSF拮抗劑，該劑量適合本發(fā)明的例子，并且根據(jù)期望的治療方法施用后可以獲得期望的治療或預(yù)防的效果或應(yīng)答。
如本文所用，人“M-CSF”是指與成熟的人M-CSFα、M-CSFβ或M-CSFγ多肽基本具有基本同樣的氨基酸序列的人多肽。M-CSFα、M-CSFβ或M-CSFγ多肽描述于Kawasaki等人，Science 230291(1985)，Cerretti等人，MolecularImmunology，25761(1988)，或Ladner等人，EMBO Journal 62693(1987)中，每一篇都引入本文作為參考。這樣的術(shù)語(yǔ)反映了這樣的認(rèn)識(shí)，即三種成熟的M-CSF具有不同的氨基酸序列(如上所述)，而且M-CSF的活性形式是以二硫鍵相連的二聚體形式；因此，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“M-CSF”指的是生物活性形式時(shí)，所指的是二聚體形式。“M-CSF二聚體”是指已經(jīng)成為二聚體的2個(gè)M-CSF多肽單體，并且包括同二聚體(由2個(gè)相同類型的M-CSF單體構(gòu)成)和異二聚體(由2種不同的單體構(gòu)成)。M-CSF單體可以在體外轉(zhuǎn)化成M-CSF二聚體，參見美國(guó)專利號(hào)4,929,700的描述，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
M-CSF抗體術(shù)語(yǔ)“抗體”采用其最廣義的含義，包括完全裝配的抗體、能夠結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab’、F’(ab)2、Fv、單鏈抗體、二體(diabodies))、以及含有上述抗體或片段的重組多肽。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從本質(zhì)相同的抗體群中所得到的抗體，也就是組成該群體的單獨(dú)抗體都是相同的，除了可能少量出現(xiàn)的自發(fā)突變之外。單克隆抗體是高度特異的，指向單一的抗原性位置。而且，傳統(tǒng)(多克隆)的抗體制劑一般包含指向不同決定簇(表位)的不同抗體，與此相反，每個(gè)單克隆抗體都指向抗原上的單一決定簇。除了特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們是通過均一的培養(yǎng)而制備，不會(huì)被具有不同特異性和特征的其它免疫球蛋白所污染。
修飾語(yǔ)“單克隆”代表該抗體是從本質(zhì)相同的抗體群中得到的這一特征，而并不能解釋成需要采用某種特殊的方法生產(chǎn)該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明所使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等人，Nature，256495(1975)最早描述的雜交瘤方法進(jìn)行制備，也可以用重組DNA的方法來(lái)制備(參見，例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。“單克隆抗體”還可以用如Clackson等人，Nature，352624628 中描述的方法從噬菌體抗體庫(kù)中分離得到。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二體；線性化抗體(Zapata等人，Protein Eng.，8(10)1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生2個(gè)完全相同的抗體結(jié)合片段，稱為“Fab”片段和一個(gè)殘留的“Fc”片段，每個(gè)“Fab”片段都有一個(gè)抗體結(jié)合區(qū)，而“Fc”片段的命名則反映出它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab’)2片段，該片段具有2個(gè)包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步在VH和VL之間含有一個(gè)多肽接頭，使Fv能夠形成有利于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見Pluckthun的“單克隆抗體的藥理學(xué)”(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，vol.113，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
術(shù)語(yǔ)“二體”是指具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段在同一個(gè)多肽鏈中包含相連的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)。所用的接頭太短至使同一條鏈上的兩個(gè)區(qū)域無(wú)法配對(duì)，于是這些區(qū)域只能和另一條肽鏈上的互補(bǔ)區(qū)域相配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)。二體在例如EP404,097；WO93/11161和30 Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中有更詳盡的描述。
“分離的”抗體是指已從存在于自然環(huán)境下的組分中識(shí)別、分離和獲得的抗體。自然環(huán)境中的污染組分是指會(huì)對(duì)該抗體的診斷和治療作用起干擾作用的物質(zhì)，這些物質(zhì)可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)類或非蛋白質(zhì)類溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體被純化至(1)由Lowry法測(cè)得的純度超過抗體的95wt％，更佳地超過99wt％，(2)其純度足以采用旋杯測(cè)序儀測(cè)定的N-末端或內(nèi)部的氨基酸序列的至少15個(gè)殘基，或者(3)在還原和非還原條件下，在SDS-PAGE中表現(xiàn)出均一性，其染色方法采用考馬斯藍(lán)染色或更佳地銀染。分離的抗體包括存在于重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)橹辽儆幸环N抗體自然環(huán)境中的組分不存在。然而，制備分離抗體通常需要至少一個(gè)純化步驟。
“Fv”是包含一個(gè)完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這一區(qū)域是由一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)通過緊密、非共價(jià)的締合所組成的二聚體。正是在這種構(gòu)象下，每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)CDR才相互作用并在VH VI二聚體表面界定一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR共同將特異性賦予抗體。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或僅含有三個(gè)抗原特異性CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，不過其親和力要比整個(gè)結(jié)合區(qū)的親和力低很多。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)以及重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab片段與Fab’片段的差異在于Fab片段多了重鏈CH1區(qū)羧基端的一些殘基，這些殘基包含一個(gè)或多個(gè)抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)中半胱氨酸殘基具有游離巰基的Fab’片段。最初產(chǎn)生的F(ab’)2抗體片段是在兩個(gè)Fab’片段之間含有鉸鏈半胱氨酸的Fab’片段配對(duì)物。
“中和抗體”是指能夠消除或大大減弱與其結(jié)合的靶抗原的效應(yīng)子功能的抗體分子。因此，“中和”的抗靶向抗體能夠消除或大大減弱效應(yīng)子功能，例如酶活性、配體結(jié)合、或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。
如本文所提供，在用于治療癌癥轉(zhuǎn)移和/或與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的組合物和方法中，可使用一種或多種抗體，它們可以單獨(dú)使用或與其它療法聯(lián)合使用而達(dá)到所需效果。本發(fā)明的抗體可以從動(dòng)物中分離獲得，該動(dòng)物因?yàn)榕c環(huán)境中的抗原直接接觸或用抗原進(jìn)行免疫而產(chǎn)生抗體?；蛘撸贵w可以使用本領(lǐng)域熟知的抗體表達(dá)系統(tǒng)通過重組DNA方法生產(chǎn)(參見，例如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1998))。這樣的抗體可以包括重組IgG、含有免疫球蛋白衍生序列的嵌合融合蛋白或“人源化”抗體，這些都可以根據(jù)本發(fā)明用于治療癌癥轉(zhuǎn)移和/或與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失。除了完整的、全長(zhǎng)的分子之外，術(shù)語(yǔ)“抗體”還指其片段(例如，scFv、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab)’2片段)或與M-CSF(或M-CSFR)結(jié)合的完整分子和/或片段的多聚體或集合體。這些抗體片段結(jié)合于抗原，并可以衍生化以具有有利于清除和攝取的結(jié)構(gòu)特征，例如，通過摻入半乳糖殘基。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，M-CSF拮抗劑是單克隆抗體，其制備方法基本上描述于Halenbeck等人的美國(guó)專利5,491,065(1997)，該文獻(xiàn)在此作為參考引入。M-CSF拮抗劑的典型實(shí)例包括結(jié)合于表觀結(jié)構(gòu)抗原表位(該抗原表位和重組或天然的二聚體M-CSF相關(guān))的單克隆抗體，并且還伴隨有中和的生物活性。這些抗體實(shí)質(zhì)上并不與無(wú)生物活性形式的M-CSF(包括M-CSF單體和化學(xué)衍生的M-CSF二聚體)起反應(yīng)。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，提供了人源化的抗-M-CSF單克隆抗體。短語(yǔ)“人源化抗體”是指從非人類的抗體(典型的是鼠單克隆抗體)衍生而來(lái)的抗體。或者，人源化抗體可以由嵌合抗體衍生而來(lái)，該抗體保留了或基本保留了親代、非人類抗體的抗原結(jié)合特性，但是在施用于人類時(shí)，它所表現(xiàn)的免疫原性與親代抗體相比有所減弱。如本文所用，短語(yǔ)“嵌合抗體”是指所包含的序列來(lái)源于兩個(gè)不同抗體的抗體(參見，例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，這兩個(gè)不同的抗體通常源自兩個(gè)不同的物種。最典型地，嵌合抗體包含人和鼠的抗體片段，通常是人抗體的恒定區(qū)和鼠抗體的可變區(qū)。
短語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”是指這樣的氨基酸序列，這些序列共同界定了天然免疫球蛋白結(jié)合區(qū)的天然Fv區(qū)域的結(jié)合親和力和特異性(參見，例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Kabat等人，美國(guó)健康和人類服務(wù)部NIH出版物(U.S.Dept of Health and Human Services NIH Publication)No.913242(1991))。短語(yǔ)“恒定區(qū)”是指抗體分子中賦予效應(yīng)子功能的部分。在本發(fā)明中，鼠抗體恒定區(qū)優(yōu)先用人抗體恒定區(qū)替換。該人源化抗體的恒定區(qū)可來(lái)源于人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可以選自5種同種型中的任一種α、δ、ε、γ或μ。
如果本發(fā)明的抗體結(jié)合到抗原的Ka大于或等于約104M-1，較佳地大于或等于約105M-1，更佳地大于或等于約106M-1，更佳地大于或等于約107M-1，最佳地大于或等于約108M-1、109M-1、或1010M-1，那么就稱這些抗體具有免疫特異性或是特異結(jié)合的。例如，合適的抗-M-CSF/M-CSFR特異性抗體結(jié)合于抗原的親和度至少為104M-1，較佳地大于或等于約105M-1，更佳地大于或等于約106M-1，更佳地大于或等于約107M-1，最佳地大于或等于約108M-1、109M-1、或1010M-1?？筂-CSF/M-CSFR抗體結(jié)合于不同的天然存在形式的M-CSF/M-CSFR，包括宿主/對(duì)象組織以及腫瘤所表達(dá)的M-CSF/M-CSFR。本文揭示的單克隆抗體對(duì)M-CSF和M-CSFR具有親和性，并且其特征是解離平衡常數(shù)(Kd)至少為10-4M，優(yōu)先為至少約10-7至約10-8M，更優(yōu)先為至少約10-8M至約10-12M。適用于本發(fā)明方法的單克隆抗體和其抗原結(jié)合片段，能夠特異地與M-CSF/M-CSFR結(jié)合。這樣的親和度可以很容易地用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，例如應(yīng)用平衡透析；應(yīng)用BIAcore2000儀器，采用制造商給出的通用程序；應(yīng)用125I標(biāo)記的M-CSF進(jìn)行放射免疫測(cè)定；或使用技術(shù)人員已知的其他方法。親和數(shù)據(jù)的分析可以用例如Scatchard等，Ann N.Y.Acad.Sci.，51660(1949)中給出的方法。因此，很顯然，優(yōu)選的M-CSF拮抗劑可表現(xiàn)出對(duì)M-CSF的高度特異性，而對(duì)其它分子的親和力則要低很多。
用于生產(chǎn)抗體的抗原可以是，例如，完整的M-CSF或是保留了所需抗原表位的M-CSF片段，并且可以任選地與另一多肽相融合，而該多肽要容許抗原表位仍表現(xiàn)出其天然構(gòu)象。
多克隆抗體優(yōu)選地，通過在皮下(sc)或腹腔內(nèi)(ip)多次注射相關(guān)抗原和佐劑，從而在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體是。要提高抗體反應(yīng)，可以將相關(guān)抗原偶聯(lián)于對(duì)免疫物種具有免疫原性的蛋白上，例如，鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑，偶聯(lián)可以用雙功能劑或衍生劑來(lái)完成，例如，馬來(lái)酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimideester)(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián))、戊二醛、琥珀酸酐或本領(lǐng)域已知的其他制劑。
動(dòng)物用抗原、免疫原性的偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫，通過將例如100μg或5μg的蛋白或偶聯(lián)物(分別用于免疫兔或小鼠)和3倍體積的Freund氏完全佐劑混合，然后將該溶液皮內(nèi)注射于多處部位。一個(gè)月后，這些動(dòng)物用1/5至1/10原數(shù)量的多肽或偶聯(lián)物(在Freund氏佐劑中)，通過多處皮下注射而進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在加強(qiáng)免疫注射后7-14天，給動(dòng)物放血，并檢測(cè)血清抗體的效價(jià)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到效價(jià)達(dá)到平臺(tái)值。優(yōu)選地，采用相同抗原的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫動(dòng)物，但是該偶聯(lián)物偶聯(lián)于不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑而偶聯(lián)。偶聯(lián)物還可以在重組細(xì)胞培養(yǎng)中作為融合蛋白產(chǎn)生。同樣地，諸如明礬之類的聚集劑適合用來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
單克隆抗體單克隆抗體可用雜交瘤方法制得，該方法首次由Kohler等人描述于Nature，256495(1975)，或可用重組DNA的方法制備。
在雜交瘤方法中，使用本文所述的方法免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，例如倉(cāng)鼠或獼猴，從而誘生出淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)特異地與用于免疫的蛋白相結(jié)合的抗體?；蛘撸馨图?xì)胞可以在體外進(jìn)行免疫。然后，用適當(dāng)?shù)娜诤蟿?，例如聚乙二醇，使淋巴?xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相融合，從而形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
這樣制得的雜交瘤細(xì)胞可接種并生長(zhǎng)于合適的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)先包含一種或多種抑制未融合的、親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于雜交瘤的典型培養(yǎng)基則含有次黃嘌呤、氨基喋呤、和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，而這些物質(zhì)阻礙HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是融合效率高、支持選出的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定而高水平地生產(chǎn)抗體、并且對(duì)于培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。人骨髓瘤和鼠-人雜合骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系均被描述已用于生產(chǎn)人單克隆抗體(Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
對(duì)雜交瘤細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，以分析是否產(chǎn)生針對(duì)抗原的單克隆抗體。優(yōu)選地，由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性是用免疫沉淀或體外結(jié)合分析(諸如，放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來(lái)確定。單克隆抗體結(jié)合的親和性可用例如Scatchard分析法加以確定(Munson等人，Anal.Biochem.，107220(1980))。
在雜交瘤細(xì)胞中識(shí)別出能夠產(chǎn)生具有所期望的特異性、親和性、和/或活性的抗體的雜交瘤之后，這些克隆可以用限制稀釋程序進(jìn)行亞克隆化，并用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)生長(zhǎng)(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合適培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以作為腹水瘤而在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。亞克隆分泌的單克隆抗體可從培養(yǎng)基、腹水、或血清中，用傳統(tǒng)的免疫球蛋白純化程序進(jìn)行合適的分離，例如，蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析。
編碼單克隆抗體的DNA可以用常規(guī)程序(例如，使用能夠特異地與編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因相結(jié)合的寡核苷酸探針)，從雜交瘤細(xì)胞中分離出并測(cè)序。一旦分離，DNA可以置于表達(dá)載體中，然后，再將該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，諸如E.coli細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或原本不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體?？贵w的重組生產(chǎn)在本領(lǐng)域是熟知的。
可以用如下方法獲得所需抗體的氨基酸序列變異體通過向編碼DNA中引入合適的核苷酸改變，或通過肽鏈合成。這些變異包括，例如，抗體的氨基酸序列中出現(xiàn)的殘基的缺失、和/或插入、和/或置換。可以實(shí)施任何缺失、插入、和置換的組合來(lái)完成最終的構(gòu)建，只要最終的構(gòu)建物具有期望的特征。氨基酸的變化還可以改變?nèi)嗽椿蜃儺惪贵w的翻譯后過程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
編碼抗體變異序列的核酸分子，可用本領(lǐng)域已知的各種不同方法制備。這些方法包括但并不限于，從天然來(lái)源中分離(在天然存在氨基酸序列變異的情況下)，或?qū)ο惹爸苽涞淖儺愋问交蚍亲儺愋问降目贵w采用寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))突變、PCR突變、和盒式突變的方法來(lái)制備。
因?yàn)榍逗系幕蛉嗽椿贵w在人體中所具有的免疫原性不如其親代鼠單克隆抗體的免疫原性強(qiáng)，所以它們可以用于人類治療而發(fā)生過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)性卻低得多。因此，在治療應(yīng)用涉及體內(nèi)施用于人體時(shí)，優(yōu)選使用這些抗體。
嵌合的單克隆抗體(其中鼠單克隆抗體的可變Ig區(qū)與人的恒定Ig區(qū)相融合)，能夠用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序生產(chǎn)(參見Morrison，S.L.，等人(1984)嵌合的人抗體分子；小鼠抗原結(jié)合區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6841-6855；和，Boulianne，G.L.，等人，Nature 312，643-646.(1984))。盡管已經(jīng)證實(shí)，一些嵌合的單克隆抗體在人中的免疫原性較低，但是鼠可變Ig區(qū)仍能引起顯著的人抗-鼠反應(yīng)。
人源化抗體可以用各種不同方法制備，其中包括例如(1)將非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)嫁接到人的骨架和恒定區(qū)上(這一過程在本領(lǐng)域中稱為通過“CDR嫁接”進(jìn)行人源化)，或者，(2)移植整個(gè)非人可變區(qū)，但是通過表面殘基的置換用人樣(human-like)的表面“覆蓋”該區(qū)域(這一過程在本領(lǐng)域中稱為“貼面”(veneering))。在本發(fā)明中，人源化抗體包括“人源化的”和“貼面的”抗體。這些方法揭示于，例如，Jones等人，Nature 321522 525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，816851 6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465 92(1988)；Verhoeyer等人，Science 23915341536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489 498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)169 217(1994)；和Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng.4(7)73383(1991)，以上每一文獻(xiàn)都引入本文作為參考。
CDR嫁接包括將鼠重鏈和輕鏈可變Ig域內(nèi)6個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)CDR引入人可變Ig域中合適的四個(gè)框架區(qū)域中，這也稱為CDR移植。這一技術(shù)(Reichmann，L.，等人，Nature 332，323(1998))，應(yīng)用保守的框架區(qū)域(FR1-FR4)作為支架來(lái)支持CDR環(huán)，這些CDR環(huán)是與抗原主要接觸的部分。然而，CDR嫁接的一個(gè)缺點(diǎn)是，這一方法會(huì)導(dǎo)致人源化抗體的結(jié)合親和力大大低于原始的鼠抗體的結(jié)合親和力，這是因?yàn)榭蚣軈^(qū)的氨基酸能對(duì)抗原結(jié)合有貢獻(xiàn)，以及因?yàn)镃DR環(huán)的氨基酸能影響兩個(gè)可變Ig域的結(jié)合。要保持人源化單克隆抗體的親和力，CDR嫁接可以通過選擇與原始鼠抗體的框架區(qū)最相似的人框架區(qū)加以改進(jìn)，或者由計(jì)算機(jī)模擬抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行協(xié)助，通過框架區(qū)或CDRs中單個(gè)氨基酸的定點(diǎn)突變加以改進(jìn)(例如，Co，M.S.，等人(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)。
一種對(duì)抗體進(jìn)行人源化方法包括比對(duì)非人的和人的重鏈和輕鏈序列，根據(jù)這樣的比對(duì)選擇出人的框架，并用它來(lái)置換非人的框架，分子模擬預(yù)測(cè)人源化序列的構(gòu)象并與親代抗體的構(gòu)象比較。這一過程以后就是對(duì)CDR區(qū)域殘基(所述的殘基干擾CDRs的結(jié)構(gòu))進(jìn)行回復(fù)突變，直至所預(yù)測(cè)的人源化序列模型的構(gòu)象十分接近于親代非人抗體的非人CDR構(gòu)象。這樣的人源化抗體可以進(jìn)一步衍生化，從而利于攝取和清除，例如，通過Ashwell受體(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,530,101和5,585,089，這些專利引入本文作為參考)。
已經(jīng)報(bào)道了很多鼠單克隆抗體經(jīng)過合理的設(shè)計(jì)而獲得人源化產(chǎn)物(參見，例如，出版于2002年6月11日的20020091240，WO92/11018和美國(guó)專利號(hào)，5,693,762，美國(guó)專利號(hào)，5,776,886)。
一種識(shí)別抗體中作為優(yōu)先突變位置的特定殘基或區(qū)域的有用方法，被稱為“丙氨酸掃描突變”，如Cunningham和Wells在Science，2441081-1085(1989)中所述。在此，一個(gè)或一組靶殘基被識(shí)別(例如，帶電荷的殘基如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)，并用中性的或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選的是丙氨酸或多聚丙氨酸)置換，從而影響氨基酸與抗原的相互作用。那些對(duì)置換表現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位點(diǎn)，再通過在該置換位點(diǎn)進(jìn)一步引入變異或引入其它變異而得到更精細(xì)化。因此，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先確定的，但是突變本身的性質(zhì)卻不需要預(yù)先確定。例如，為了分析在一個(gè)給定位點(diǎn)突變的效果，可對(duì)靶密碼子或靶區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)突變，再對(duì)表達(dá)的變異抗體篩選所需的活性。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的融合(其長(zhǎng)度從一個(gè)殘基到含有100個(gè)或甚至更多殘基的多肽不等)，以及序列間一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括具有N-端甲硫氨酸殘基的抗體或與表位標(biāo)簽融合的抗體。其它抗體分子的插入變異包括與可延長(zhǎng)抗體半衰期的多肽的融合。
另一個(gè)類型的變異是氨基酸取代變異。這些變異中，抗體分子內(nèi)至少去除了一個(gè)氨基酸殘基，并且在該位置插入另一個(gè)不同的殘基?？梢栽谌魏胃咦儏^(qū)或Cdr區(qū)或框架區(qū)內(nèi)的進(jìn)行取代突變。表1中以“優(yōu)選取代”為標(biāo)題列出了保守性取代。如果取代引起生物學(xué)活性的改變，那么可引入會(huì)產(chǎn)生更根本的變化(這些取代在表1中命名為“代表性取代”)，或者可進(jìn)一步按下文所述的氨基酸類別的引入取代，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行篩選。
表1最初的代表性優(yōu)選殘基取代形式Ala(A)val；leu；ile val Arg(R)lys；gln；asn lys Asn(N)gln；his；asp，lys；gln arg Asp(D)glu；asn glu Cys(C)ser；ala ser Gln(Q)asn；glu asn Glu(E)asp；gln asp Gly(G)ala His(H)asn；gln；lys；arg Ile(I)leu；val；met；ala；leu phe；正亮氨酸Leu(L)正亮氨酸；ile；val；ile met；ala；phe Lys(K)arg；gln；asn arg Met(M)leu；phe；ileleu Phe(F)leu；val；ile；ala；tyr Pro(P)ala Ser(S)thr Thr(T)serser Trp(W)tyr；phe tyr Tyr(Y)trp；phe；thr；ser phe Val(V)ile；leu；met；phe；leu ala；正亮氨酸抗體生物學(xué)特性的重大改變，是通過選用在以下一些方面上有很大區(qū)別的取代基團(tuán)而實(shí)現(xiàn)的(a)在取代區(qū)域仍然維持多肽的骨架結(jié)構(gòu)，例如，仍然維持片層或螺旋結(jié)構(gòu)；(b)仍然維持靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性；或(c)仍然維持側(cè)鏈的體積。天然存在的殘基根據(jù)其共同的側(cè)鏈特性可分為以下幾組(1)疏水的正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中度親水的Cys，Ser，Thr；(3)酸性的Asp，Glu；(4)堿性的Asn，Gln，His，Lys，Arg；(5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro；和(6)芳香族的Trp，Tyr，Phe。
非保守取代涉及用一個(gè)類別中的氨基酸成員置換另一類別中的成員。
任何對(duì)維持人源化或變異抗體的正確構(gòu)型不起作用的半胱氨酸殘基，也可以被取代，通常是用絲氨酸進(jìn)行取代，來(lái)提高分子氧化穩(wěn)定性，并且避免異常的交聯(lián)。相反地，在抗體中可以加入半胱氨酸鍵，從而改善其穩(wěn)定性(尤其當(dāng)抗體是抗體片段如Fv片段時(shí))。
親和成熟化包括制備和篩選在親代抗體的CDR內(nèi)含有取代的抗體變異體，并選出生物學(xué)特性有所改善的突變體，例如，與親代抗體相比其結(jié)合的親和度有所提高。生產(chǎn)這樣的取代變異體的方便方法，是使用噬菌體展示的親和成熟法。簡(jiǎn)而言之，對(duì)多個(gè)高可變區(qū)的位點(diǎn)(如6-7個(gè))進(jìn)行突變，在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的變異抗體以非共價(jià)結(jié)合的形式展示在絲狀噬菌體顆粒的表面，作為與包裝在每個(gè)噬菌體顆粒內(nèi)的M13基因III產(chǎn)物相融合的融合蛋白。然后，再根據(jù)其生物學(xué)活性(如，結(jié)合的親和度)來(lái)篩選噬菌體展示的變異體。
丙氨酸掃描誘變可以用來(lái)識(shí)別對(duì)抗原結(jié)合起很大作用的高可變區(qū)殘基。作為替換形式，或者額外地，對(duì)抗原-抗體復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)的進(jìn)行分析，從而識(shí)別出抗原和抗體之間的接觸位點(diǎn)是有利的。根據(jù)本文所述的技術(shù)，這些接觸殘基以及鄰近殘基作為取代的候選位點(diǎn)。這樣的突變一旦產(chǎn)生，那么就可用本文所述的方法對(duì)變異體群進(jìn)行篩選，并選出在一個(gè)或多個(gè)有關(guān)測(cè)試中表現(xiàn)出優(yōu)越特性的抗體，用于進(jìn)一步的開發(fā)。
抗體變異體還可以通過對(duì)親代抗體的糖基化模式進(jìn)行修飾而產(chǎn)生，例如去除抗體中一個(gè)或多個(gè)碳水化合物分子，和/或在抗體中加入一個(gè)或多個(gè)原先不存在的糖基化位點(diǎn)。
通常，抗體的糖基化為N-連接或O-連接。N-連接是指將碳水化合物組分連在天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸，是酶催化在天冬酰胺側(cè)鏈上加上碳水化合物組分的識(shí)別序列。多肽中存在任一種這樣的三肽序列即構(gòu)成潛在的糖基化位點(diǎn)。因此，可通過改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或更多個(gè)這樣的三肽序列，從而在抗體中引入N-連接的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖連于羥基氨基酸上，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以連在5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸上。可以通過在最初抗體序列中插入或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基，從而在抗體中引入O-連接的糖基化位點(diǎn)。
人源化的或人M-SCF抗體也可以用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不產(chǎn)生內(nèi)源性的免疫球蛋白，并且經(jīng)過基因工程改造而含有人免疫球蛋白基因座。例如，WO 98/24893揭示了具有一個(gè)人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中這些動(dòng)物由于內(nèi)源性的重鏈和輕鏈基因座失活而不能產(chǎn)生具有功能的內(nèi)源性免疫球蛋白。WO 91/741也揭示了轉(zhuǎn)基因的非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物宿主能對(duì)免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中抗體具有靈長(zhǎng)類的恒定區(qū)和/或可變區(qū)，而且其中的內(nèi)源性免疫球蛋白編碼基因座被取代或失活。WO 96/30498揭示了使用Cre/Lox系統(tǒng)修飾哺乳動(dòng)物體內(nèi)的免疫球蛋白基因座，例如替換恒定區(qū)或可變區(qū)的全部或一部分從而形成修飾的抗體分子。WO 94/02602揭示了具有失活的內(nèi)源性Ig基因座和功能性的人Ig基因座的非人哺乳動(dòng)物宿主。美國(guó)專利No.5,939,598揭示了轉(zhuǎn)基因鼠的制備方法，該轉(zhuǎn)基因鼠缺乏內(nèi)源性的重鏈，并且表達(dá)含有一個(gè)或多個(gè)異源恒定區(qū)的外源免疫球蛋白基因座。
使用上述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，能夠?qū)x定的抗原分子產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從該動(dòng)物中取出產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并用來(lái)制備分泌人單克隆抗體的雜交瘤。免疫方案和佐劑等在本領(lǐng)域中是已知的，并用來(lái)免疫例如WO 96/33735所述的轉(zhuǎn)基因鼠。這一出版物揭示了針對(duì)各種不同抗原分子(包括IL6、IL8、TNFα、人CD4、L選擇蛋白、gp39、和破傷風(fēng)毒素)的單克隆抗體。可以檢測(cè)單克隆抗體針對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)活性或生理效應(yīng)的抑制或中和能力。WO 96/33735揭示了抗IL-8的單克隆抗體，該抗體來(lái)源于用IL-8免疫的轉(zhuǎn)基因鼠的免疫細(xì)胞，該抗體可封閉IL-8引發(fā)中性粒細(xì)胞的功能。在WO 96/34096和美國(guó)專利申請(qǐng)2003019440以及美國(guó)專利申請(qǐng)20030031667中，還揭示了對(duì)用于免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗原具有特異性的人單克隆抗體。
還可參見，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，733(1993)和美國(guó)專利No5,591,669，美國(guó)專利No.5,589,369，美國(guó)專利No.、5,545,807；和美國(guó)專利申請(qǐng)No.20020199213。美國(guó)專利申請(qǐng)No.20030092125描述了將動(dòng)物的免疫應(yīng)答引向所需抗原表位的方法。人抗體也可以通過體外激活B細(xì)胞的方法來(lái)產(chǎn)生(參見美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。
重組人抗體基因庫(kù)制備技術(shù)的發(fā)展以及將編碼的抗體片段在絲狀噬菌體表面進(jìn)行展示技術(shù)，為直接制備人抗體提供了方法。用噬菌體技術(shù)產(chǎn)生的抗體作為細(xì)菌中的抗原結(jié)合片段產(chǎn)生，通常是Fv或Fab片段，也因此缺乏效應(yīng)子功能?？梢杂靡韵聝煞N策略之一來(lái)引入效應(yīng)子功能提供基因工程使片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)出完整的抗體，或使片段表達(dá)成為雙特異性的抗體片段而其第二結(jié)合區(qū)能夠引發(fā)效應(yīng)子功能。
通常，抗體的Fd片段(VH-CH1)和輕鏈(VL-CL)分別用PCR法進(jìn)行克隆，并在組合噬菌體展示庫(kù)中隨機(jī)重組，然后再選擇出可以與特定抗原結(jié)合的抗體。Fab片段在噬菌體表面表達(dá)，也就是與編碼它們的基因物理連接。這樣，通過抗原結(jié)合來(lái)選擇Fab，同時(shí)也共選擇到了Fab編碼序列，隨后，該序列可以進(jìn)行擴(kuò)增。通過幾輪抗原結(jié)合和再擴(kuò)增(該過程稱為淘洗)，抗原特異性的Fab得到了富集，并最終被分離。
1994年，描述了一種抗體的人源化方法，稱為“導(dǎo)向選擇(guidedselection)”。導(dǎo)向選擇利用了噬菌體展示技術(shù)對(duì)鼠單克隆抗體進(jìn)行人源化的功能(參見Jespers，L.S.，等人，Bio/Technology 12，899-903(1994))。為此，鼠單克隆抗體的Fd片段可以和人輕鏈庫(kù)聯(lián)合展示，所得的雜交Fab庫(kù)可以再用抗原進(jìn)行選擇。因此，鼠Fd片段充當(dāng)了指導(dǎo)該選擇的模板。隨后，選出的人輕鏈與人Fd片段庫(kù)相結(jié)合。選擇所得的庫(kù)就能得到完整的人Fab。
已經(jīng)描述了多種從噬菌體展示庫(kù)中獲得人抗體的程序(參見，例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol，222581-597(1991)；美國(guó)專利5,565,332和5,573,905；Clackson，T.，和Wells，J.A.，TIBTECH 12，173-184(1994))。特別地，源自噬菌體展示庫(kù)的抗體的體外選擇和演變已經(jīng)成為了一個(gè)強(qiáng)有力的工具(參見，Burton，D.R.，和Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)；和，Winter，G.，等，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；美國(guó)專利申請(qǐng)20020004215和WO92/01047；出版于2003年10月9日的美國(guó)專利申請(qǐng)20030190317以及美國(guó)專利6,054,287；美國(guó)專利5,877,293)。
Watkins的“通過捕捉提升法篩選噬菌體表達(dá)的抗體庫(kù)”，分子生物學(xué)方法，抗體的噬菌體展示方法和協(xié)議178187-193，和2003年3月6日出版的美國(guó)專利200120030044772，描述了用捕捉提升法篩選噬菌體表達(dá)的抗體庫(kù)或其它結(jié)合分子的方法，該方法包括將候選的結(jié)合分子固定在固相載體上。
可以采用本文中以“篩選方法”為標(biāo)題的部分中所述的試驗(yàn)或采用任何本領(lǐng)域已知的合適的試驗(yàn)進(jìn)行篩選，從而篩選出具有MCSF拮抗劑活性以及適用于本發(fā)明所述的治療方法的抗體產(chǎn)物。
M-SCF突變蛋白本發(fā)明進(jìn)一步提供了可根據(jù)本發(fā)明的方法用作MCSF拮抗劑的M-CSF突變蛋白。
如本文所用，“片段”是指完整的天然分子的一部分；例如，多肽片段是天然多肽的一個(gè)片段，其中缺失了N-末端或C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
如本文所用，涉及多肽的“突變蛋白”是指完整的天然分子的變異體或天然分子片段的變異體，其中取代、插入或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸，這樣的取代、插入或缺失可以發(fā)生在N-末端、C-末端或分子內(nèi)部，因此，術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”的范圍也包括天然分子的片段。插入的突變蛋白包括N-末端或C-末端的融合，例如，融合于免疫球蛋白的Fc部分，從而增加其半衰期。
根據(jù)本發(fā)明，用Smith-Waterman同源性檢索算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997))確定時(shí)，優(yōu)選的突變蛋白至少表現(xiàn)出與天然多肽之間具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高的序列同一性(同源性)，這可用MSPRCH程序(Oxford Molecular)采用仿射缺口(gap)檢索法進(jìn)行，其中采用如下的參數(shù)開口罰值12，以及缺口延伸罰值1。其它熟知的和常規(guī)使用的同源性/同一性掃描算法程序包括Pearson和Lipman，PNASUSA，852444-2448(1998)；Lipman和Pearson，Science，2221435(1985)；Devereaus等人，Nuc.Acids Res.，12387-395(1984)；或Altschul等人的BLASTP、BLASTN或BLASTX算法，Mol.Biol.，215403-410(1990)。使用這些算法的計(jì)算機(jī)程序也可購(gòu)買獲得，這些程序包括，但并不限于GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，它們都可以從遺傳計(jì)算組(GCG)軟件包(第8版，Madison.Wis.，USA)中購(gòu)得；也可用Intellegenetics，Mountain View Calif的PC/gene程序中的CLUSTAL程序。優(yōu)選地，序列同一性的百分比采用程序中給出的缺省參數(shù)來(lái)確定。
本文使用的“修飾”是指天然多肽、片段或突變蛋白的任何形式的修飾，例如糖基化、磷酸化、多聚物偶聯(lián)(例如與聚乙二醇偶聯(lián))，或加入其它的外來(lái)組分，只要其仍保持所需的活性(激動(dòng)劑或拮抗劑)。
在美國(guó)專利6,025,146和Koths，Mol.Reprod.Dev.1997年1月；46(1)31-38(這兩篇文獻(xiàn)均全文引入本文作為參考)中，描述了M-SCF單獨(dú)結(jié)晶和M-CSF同M-CSFR的復(fù)合物結(jié)晶情況，并且表征了M-CSF以及其參與受體結(jié)合的殘基的三維結(jié)構(gòu)。美國(guó)專利6,025,146還描述了，根據(jù)結(jié)構(gòu)信息在M-CSF中選擇候選的取代氨基酸的方法。圖1是一張拓樸圖，顯示了截短的二聚體M-CSF中的二硫鍵位置；圖2是C-α骨架的立體圖，其中每10個(gè)殘基均被標(biāo)注，而非-結(jié)晶學(xué)對(duì)稱軸用虛線表示。圖1所示的M-CSF形式的總體拓樸結(jié)構(gòu)是反平行的四α-螺旋束，其中的螺旋方向?yàn)樯?上-下-下，而不同于大多數(shù)的四α-螺旋中觀察到的上-下-上-下連接。螺旋A和螺旋B通過一個(gè)長(zhǎng)的交叉連接相連，而類似的連接也在螺旋C和D之間發(fā)現(xiàn)。在以二硫鍵相連的二聚體形式中，螺旋束尾-尾相連，形成一個(gè)很扁長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)(大致尺寸為85×35×25)。每個(gè)單體中有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(Cys7-Cys90，Cys48-Cys139，Cys102-Cys146)，所有的二硫鍵都位于分子的遠(yuǎn)端。如圖2所示，一個(gè)鏈間的二硫鍵(Cys31-Cys31)位于二聚體的交界處，非晶體學(xué)2次折疊對(duì)稱軸穿過該二硫鍵。突變實(shí)驗(yàn)表明，此M-CSF形式中所有的半胱氨酸殘基對(duì)其具備完全的生物學(xué)活性是必須的。本文描述的結(jié)構(gòu)表明它們的作用主要是結(jié)構(gòu)上的，并不與受體識(shí)別相關(guān)。美國(guó)專利6,025,146提供了截短的重組M-CSFα二聚體的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是通過識(shí)別序列中氨基酸殘基的α-C位置而得到的。
螺旋A、C和D中的特定殘基似乎涉及受體結(jié)合相互作用的特異性。由于M-CSFβ含有涉及Cys157和/或Cys159的鏈內(nèi)二硫鍵，M-CSF的C-末端區(qū)可能從結(jié)構(gòu)的背部延伸出來(lái)，為膜結(jié)合形式的M-CSF提供長(zhǎng)度可變的“系鏈”。因此，M-CSF的“前部”或受體結(jié)合區(qū)域位于分子的背面，由螺旋A、C和D內(nèi)或附近的溶劑可及殘基組成，分別含有天然M-CSF中大致從6-26、71-90和110-130的殘基。通過定點(diǎn)突變來(lái)改變這些區(qū)域的溶劑可及殘基來(lái)增強(qiáng)或減弱側(cè)鏈與受體之間的相互作用，可以產(chǎn)生M-CSF激動(dòng)劑或拮抗劑。根據(jù)在三肽gly-x-gly中可及氨基酸的表面積的歸一化結(jié)果，優(yōu)選的氨基酸殘基所含有的溶劑可及表面積大于約0.25，更佳地表面積大于約0.4(Kabsch，W.等人，Biopolymers 222577(1983))。優(yōu)選的氨基酸殘基不與蛋白質(zhì)的其它部分(如二聚體交界面)發(fā)生相互作用，以便維持單體的相關(guān)取向并避免干擾蛋白質(zhì)的折疊過程。另外，可以考慮的是選擇在人和鼠之間不保守的殘基，這些殘基不識(shí)別人的M-CSF受體。候選的氨基酸優(yōu)選用非保守的氨基酸取代，以便破壞與MCSF-R殘基之間的氫鍵和/或疏水作用。例如，將一個(gè)或多個(gè)組氨酸換成大小相似的非氫供體型氨基酸，這可以產(chǎn)生受體結(jié)合能力改變的M-CSF。優(yōu)選的氨基酸取代包括(但并不限于)H15、Q79、R86、E115、E41、K93、D99、L55、S18、Q20、I75、V78、L85、D69、N70、H9、N63和T34。據(jù)信，在受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的M-CSF殘基是由M-CSF中的不連續(xù)區(qū)域所組成的。為了使針對(duì)可能施用的基于M-CSF的蛋白質(zhì)藥物形成抗體的可能性降至最低，最好在任何可能的情況下，保留溶劑可及的親代M-CSF殘基(以便使其與天然分子相似)。
對(duì)N-末端/A螺旋區(qū)的H15和H9氨基酸突變后，所得突變蛋白的生物學(xué)活性以及與MCSF-R的結(jié)合能力都大大降低。這些結(jié)構(gòu)表明，與受體結(jié)合的親和度降低是引起生物學(xué)活性降低的原因；因此，這些組氨酸的接觸作用對(duì)M-CSF受體結(jié)合的親和度十分重要，所以如果要保持完全的受體結(jié)合能力，應(yīng)當(dāng)不對(duì)這些組氨酸作任何改變。鄰近的溶劑可及殘基，如Y6和S13及其它殘基，也可能是M-CSF受體的接觸殘基。構(gòu)建了一個(gè)M-CSF的雙突變受體(Q20A，V78K)來(lái)檢測(cè)螺旋A和C內(nèi)中央部分溶劑可及殘基的重要性。這一雙突變蛋白的生物學(xué)活性略有降低(8-10倍)，并且相應(yīng)地其受體結(jié)合活性也有所降低。對(duì)殘基Q17、R21、E115和E119的突變，改變了感興趣區(qū)域內(nèi)溶劑可及氨基酸的側(cè)鏈特性，但并不影響特異的生物學(xué)活性，這就表示在設(shè)計(jì)具有拮抗劑活性的突變蛋白時(shí)，并不需要對(duì)這些殘基作任何改變。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了將螺旋A和/或C和/或D中對(duì)受體結(jié)合起作用的殘基(例如，氨基酸6-26位，71-90位和/或110-130位)進(jìn)行非保守突變而得到的M-CSF突變蛋白。優(yōu)選地，這些突變蛋白與螺旋A、C或D內(nèi)的天然序列至少保持65％，70％，75％，80％，85％或90％的相似性(也就是氨基酸具有相同的或相似的特性)，而多肽的其余部分的天然序列則具有更高的相似性，例如，至少具有95％、98％或99％的相似性。此外，支持受體結(jié)合區(qū)三維構(gòu)型的殘基可以進(jìn)行非保守突變。
在另一實(shí)施例中，M-CSF突變蛋白是M-CSF的單體形式。M-CSF的二聚體形式是具有生物活性的形式，而M-CSF的單體形式通常不具備活性。單體間的二硫鍵似乎通過Cys31-Cys31鏈間連接而實(shí)現(xiàn)。因此，M-CSF的單體形式可適用作拮抗劑。這樣的形式包括Cys31的半胱氨酸缺失和/或半胱氨酸置換(例如，用丙氨酸取代半胱氨酸)，或半胱氨酸(尤其是Cys31)因經(jīng)過化學(xué)修飾而不能形成二硫鍵的突變蛋白。
在又一個(gè)實(shí)施例中，M-CSF突變蛋白含有一個(gè)或多個(gè)螺旋A、C或D、或其參與受體結(jié)合的部分(單獨(dú)的或與其它多肽相融合)，從而容許該片段展示出正確的三維構(gòu)型。
可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，方便地制備含有任何所需的保守和/或非保守突變的突變蛋白，這些技術(shù)包括重組生產(chǎn)或化學(xué)合成。
保守取代，尤其是在直接參與配體-受體結(jié)合的區(qū)域以外區(qū)域的取代，預(yù)計(jì)不會(huì)顯著地改變M-CSF突變蛋白(或M-CSFR突變蛋白)的結(jié)合特性?？梢愿鶕?jù)氨基酸的物理性質(zhì)以及對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)氨基酸進(jìn)行分類。本領(lǐng)域中的保守取代是指用具有相似特性的氨基酸取代另一氨基酸。典型的保守取代列于下表2中(來(lái)源于WO 97/09433，第10頁(yè)，1997年3月13日出版(PCT/GB96/02197，于9/6/96提交)。
表2保守取代I側(cè)鏈特征 氨基酸脂族的非極性 G A P I L V極性-不帶電荷 C S T M N Q極性-帶電荷D E K R芳香族的 H F W Y其它 N Q D E或者，保守氨基酸可以用Lehninger(生物化學(xué)，第二版；Worth Publishers，Inc.NYNY(1975)，71-77頁(yè))中所述的方法進(jìn)行歸類，如下面表3中列出的。
表3保守取代II側(cè)鏈特征 氨基酸非極性(疏水)A.脂肪族 A L I V PB.芳香族 F WC.含硫 MD.臨界 G不帶電荷-極性A.羥基 S T YB.氨基 N QC.巰基 CD.臨界 G帶正電(堿性) K R H帶負(fù)電(酸性) D E作為另一種選擇，典型的保守取代列于下面的表4中。
表4保守取代III原始?xì)埢? 典型取代Ala(A) Val，Leu，IleArg(R) Lys，Gln，AsnAsn(N) Gln，His，Lys，ArgAsp(D) GluCys(C) SerGln(Q) AsnGlu(E) AspHis(H) Asn，Gln，Lys，ArgIle(I) Leu，Val，Met，Ala，Phe，Leu(L) Ile，Val，Met，Ala，PheLys(K) Arg，Gln，AsnMet(M) Leu，Phe，IlePhe(F) Leu，Val，Ile，AlaPro(P) GlySer(S) ThrThr(T) SerTrp(W) TyrTyr(Y) Trp，Phe，Thr，SerVal(V) Ile，Leu，Met，Phe，Ala得到了編碼M-CSF的DNA序列后，就能使用各種表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)所需的多肽?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知的方法，用合適的DNA序列來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體以及進(jìn)行重組生產(chǎn)。這些技術(shù)和各種其它的技術(shù)通常根據(jù)Sambrook等人，分子克隆一實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.(1989)，和Kriegler，M.，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Stockton Press，New York(1990)來(lái)進(jìn)行，這兩篇文獻(xiàn)均引入本文作為參考。
對(duì)M-CSF一級(jí)序列的某些修飾，可以在不破壞所需結(jié)構(gòu)(如M-CSF的受體結(jié)合能力)的前提下，用熟知的重組DNA技術(shù)，通過對(duì)DNA序列所編碼的氨基酸進(jìn)行缺失、添加、或改變而實(shí)現(xiàn)。此外，技術(shù)人員會(huì)理解，個(gè)別氨基酸可以用氧化、還原或其它的修飾方法進(jìn)行取代或修飾，而對(duì)多肽進(jìn)行切割則可獲得仍然保留活性結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)信息的片段。這樣取代和改變得到的多肽所具有的氨基酸序列，屬于“與成熟的M-CSFα(SEQ ID NO2)、M-CSFβ(SEQ ID NO4)、和M-CSFγ(SEQ ID NO6)多肽具有基本相同的氨基酸序列”的多肽的定義范疇內(nèi)。
可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)液相或固相肽合成技術(shù)來(lái)合成多肽。在液相合成中，可以使用一系列連接方法和保護(hù)基團(tuán)(參見，Gross和Meienhofer，eds，.“肽分析、合成、生物學(xué)，”卷1-4(Academic Press，1979)；Bodansky和Bodansky，“肽合成操作，”第二版(Springer Verlag，1994))。此外，還可以加入中間純化和線性放大步驟。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，液相合成時(shí)需要考慮主鏈和側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)和活化方法，以及片段選擇，以便減少外消旋情況。
固相肽合成，通?？筛鶕?jù)Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.852149，1963中的方法進(jìn)行操作。該方法包括用受保護(hù)的氨基酸將線性肽鏈裝配到樹脂載體上。典型的固相肽合成使用Boc或Fmoc策略。Boc策略使用1％交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂。標(biāo)準(zhǔn)的α-氨基官能團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)是叔丁氧羰基(Boc)基團(tuán)。該基團(tuán)可以用諸如25％的三氟乙酸(TFA)之類的強(qiáng)酸稀釋液除去。下一個(gè)Boc-氨基酸通常用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與氨酰基藕合。裝配完成后，用無(wú)水HF處理肽-樹脂，從而切除芐基酯鍵并釋放出游離肽段。側(cè)鏈官能團(tuán)通常在合成時(shí)用芐基衍生的封閉基團(tuán)進(jìn)行封閉，封閉基團(tuán)同樣可以用HF切除。然后，游離的肽段用合適的溶劑從樹脂上萃取下來(lái)，純化并表征。新合成的肽段可以用例如，凝膠過濾、HPLC、分配層析和/或離子交換層析等方法進(jìn)行純化，并可以用例如，質(zhì)譜或氨基酸序列分析的方法進(jìn)行表征。在Boc策略中，可以用芐基羥胺(benzhydrylamine)樹脂或甲基芐基羥胺(methylbenzhydrylamine)樹脂得到C-末端酰胺化的肽段，用HF即可直接從樹脂上切下酰胺肽。另一種可選用的方法使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)，該方法應(yīng)用不同的試劑使側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)和肽-樹脂連接對(duì)用于切割N-α-Fmoc基團(tuán)的仲胺保持穩(wěn)定。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和肽-樹脂連接用溫和的酸解進(jìn)行切割。由于需要多次接觸堿試劑，Merrifield樹脂不適用于Fmoc化學(xué)方法，而通常使用p-烷氧基芐酯與樹脂相連。通常用TFA實(shí)現(xiàn)去保護(hù)和切割。N-末端的乙?；梢酝ㄟ^將最終產(chǎn)生的肽段與無(wú)水乙酸反應(yīng)獲得，然后再?gòu)臉渲锨懈钕聛?lái)。C-酰胺化是用合適的樹脂(如甲基芐基羥胺樹脂)，使用Boc技術(shù)完成的。
通常，可以很方便地用一系列熟知的技術(shù)對(duì)編碼M-CSF的多肽基因進(jìn)行修飾，例如，采用定點(diǎn)突變(參見，Gillman和Smith，Gene 881-97(1979)和Robers，S.等人，Nature 328731-734(1987)和美國(guó)專利5,032,676，這些文獻(xiàn)都引入本文作為參考)。大多數(shù)修飾產(chǎn)物的評(píng)估方法是用合適的分析來(lái)篩選所需的特征。例如，可以用合適的多肽作為參照，采用競(jìng)爭(zhēng)性檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定多肽與M-CSF受體結(jié)合特征的改變，或者用美國(guó)專利4,847,201(該專利引入本文作為參考)中所描述的生物學(xué)分析進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的插入變異體是指那些在M-CSF內(nèi)預(yù)先確定的位點(diǎn)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的變異體。例如，插入變異體可以在亞單位的氨基端或羧基端融合了異源蛋白質(zhì)或多肽的融合產(chǎn)物。取代變異體是指那些至少去除了一個(gè)殘基，并在該殘基所在的位置又插入了另一個(gè)不同殘基的變異體。非天然氨基酸(也就是通常并不存在于天然蛋白質(zhì)中的氨基酸)，以及等體積(isosteric)類似物(氨基酸或其它物質(zhì))也可適用于本發(fā)明。合適取代基的實(shí)例在本領(lǐng)域中是熟知的，例如Glu-＞Asp，Ser-＞Cys和Cys-＞Ser，His-＞Ala。另一類的變異體是缺失體，其特征為M-CSF中缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明的其它變異體可以通過對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾而產(chǎn)生(例如，焦碳酸二乙酯處理可以對(duì)組氨酸殘基加以修飾)。優(yōu)選的是對(duì)某些氨基酸側(cè)鏈特異的修飾?？赏ㄟ^使用針對(duì)待保護(hù)側(cè)鏈的特異抗體來(lái)封閉其它側(cè)鏈，從而實(shí)現(xiàn)特異性?；瘜W(xué)修飾包括如下反應(yīng)氧化、還原、酰胺化、脫酰胺化、或多糖或聚乙二醇之類的大基團(tuán)的取代(參見，美國(guó)專利4,179,337和WO91/21029，這兩篇文獻(xiàn)都引入本文作為參考)。
典型的修飾包括用琥珀酸或其它無(wú)水羧酸的酸酐與賴氨酰基以及氨基末端殘基反應(yīng)而進(jìn)行修飾。用這些試劑進(jìn)行修飾具有逆轉(zhuǎn)賴氨酸殘基所帶電荷的功能。修飾含氨基的殘基的其它合適試劑包括亞氨酸酯(如甲基吡啶酸甲酯(methyl picolinimidate))；磷酸吡哆醛；氫硼化氯吡哆醛(pyridoxalchloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲，2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽之間的反應(yīng)，和用聚乙二醇或其它大體積基團(tuán)取代的N-羥基琥珀酰胺酯。
精氨?；梢酝ㄟ^與很多試劑的反應(yīng)而加以修飾，包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、和水合茚三酮。由于胍基具有很高的pKa，所以對(duì)精氨酸殘基的修飾反應(yīng)要在堿性條件下進(jìn)行。此外，這些試劑也可以同賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸的ε-氨基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。
酪氨酰基也可以加以修飾，從而在酪氨酰基上特別引入光譜標(biāo)記，修飾的方法是用芳香族的重氮化合物或四硝基甲烷進(jìn)行反應(yīng)，從而分別形成O-乙酰酪氨?；衔锖?-硝基衍生物。酪氨酸殘基還可以用125I或131I碘化來(lái)制備放射性免疫分析所用的標(biāo)記蛋白質(zhì)。
羧基側(cè)鏈基團(tuán)(天冬氨?；蚬劝滨；?可以選擇性地與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R1)反應(yīng)加以修飾，其中的R和R1是不同的烷基，諸如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬氨?；凸劝滨；梢耘c銨鹽反應(yīng)，而轉(zhuǎn)變成天冬酰氨殘基(asparaginyl)和谷氨酰胺殘基(glutaminyl)。
相反地，天冬酰氨和谷氨酰胺殘基可以在溫和的酸性條件下脫酰胺而分別成為相應(yīng)的天冬氨酸和谷氨酸殘基。這些殘基的任一形式都屬于本發(fā)明的范圍。
其它的形式包括脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈中α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，79-86頁(yè)(1983))，N-末端氨基的乙?；腿魏蜟-末端羧基基團(tuán)的酰胺化。
很多方法可以用于確定M-CSF突變蛋白和天然M-CSF蛋白之間的相似性。例如，同源性百分比計(jì)算的是兩條比對(duì)序列中相同的氨基酸殘基在較短序列中所占的百分比(在長(zhǎng)達(dá)100個(gè)氨基酸的序列中，可以引入4個(gè)缺口來(lái)使比對(duì)最匹配)(Dayhoff，“蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖冊(cè)”(Atlas of Protein sequence andStructure)，卷5，124頁(yè)，國(guó)立生化研究基金，Washington，D.C.(1972)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)。用于序列比較的多肽序列比對(duì)，也可以用各種多重比對(duì)服務(wù)器來(lái)完成，目前在Internet上可以找到大多數(shù)這類服務(wù)器。例如，Clustal W，MAP，PIMA，Block Maker，MSA，MEME，和Match-Box。優(yōu)選地用Clustal W(Higgins等人，Gene(1988)73237-244；Higgins等人，Meth.Enzymol.(1996)266383-402)對(duì)多肽(和多核苷酸)進(jìn)行序列比對(duì)。類似地，BLASTP程序?qū)被岵樵冃蛄信c蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，而TBLASTN將蛋白質(zhì)查詢序列與對(duì)6個(gè)閱讀框(兩條鏈)進(jìn)行動(dòng)態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)加以比較，這同樣可以用于本發(fā)明。要確定2個(gè)氨基酸序列是否在很大程度上具有同源性(也就是相似或相同)，也可以根據(jù)Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448(1998)采用FASTA檢索。
具體地，優(yōu)選的確定同一性和/或相似性的方法設(shè)計(jì)為，使測(cè)試序列間有最大程度的匹配。用于確定同一性和/或相似性的方法，已經(jīng)被編程在公眾可以獲得的計(jì)算機(jī)程序(例如，諸如前述的程序)。優(yōu)選的確定兩序列間同一性和相似性的計(jì)算機(jī)程序方法包括(但并不限于)GCG程序包(包括GAP(Devereux等人，核酸研究(1984)12(1)387；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，WI))、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul等人，J.Molec.Biol.(1990)215403-410)。BLAST X程序在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和其它一些地方對(duì)外開放(Altschul等人，BLAST Manual，NCB NLM NIHBethesda，MD 20894；Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215403-410)。熟知的Smith Waterman算法也可以用來(lái)確定同一性。在用GAP程序比對(duì)多聚核苷酸序列時(shí)，優(yōu)選以下的缺省參數(shù)比較矩陣匹配＝+10，不匹配＝0，缺口罰值50，缺口長(zhǎng)度罰值3(Needleman等人，J.Mol Biol.(1970)48443-453)。
蛋白質(zhì)的相關(guān)性也可以用編碼它們的核酸之間的相關(guān)性來(lái)表征。確定多聚核苷酸序列的同一性和/或相似性的方法如上所述。此外，也可以用如下所述的方法，通過檢測(cè)多聚核苷酸在中等或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交能力來(lái)確定它們序列間的相似性。典型的中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件如下42℃，雜交液含有50％的甲酰胺、1％的SDS、1M的NaCl、10％的葡聚糖硫酸酯，60℃的條件下洗滌兩次，每次30min，洗滌液含有0.1×SSC和1％的SDS。高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件包括用含有0.1×SSC和1％的SDS的洗滌液在68℃的條件下洗膜。本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)理解，正如本領(lǐng)域中所述的那樣，改變溫度和緩沖液，或鹽濃度可以得到相同的嚴(yán)謹(jǐn)條件(Ausubel，等人編，分子生物學(xué)手冊(cè)，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.0.3至6.4.10)?？梢愿鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)，或根據(jù)引物長(zhǎng)度以及引物中鳥嘌呤/胞嘧啶(GC)堿基對(duì)的百分比含量精確計(jì)算，從而確定雜交條件的修改。雜交條件的計(jì)算方法可以參照Sambrook等人，(Eds.)，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版冷泉港，New York(1989)，9.47-9.51頁(yè)。
本發(fā)明的典型M-CSFR片段可以含有一個(gè)或多個(gè)，或兩個(gè)或多個(gè)參與M-CSF/受體結(jié)合的區(qū)域(據(jù)信是區(qū)域1，2和3)。優(yōu)選的M-CSFR片段包括M-CSFR中的1、2、3所有3個(gè)結(jié)合域。還可對(duì)這些片段或?qū)-CSFR的整個(gè)胞外區(qū)域引入額外的突變和/或修飾，并且可參照M-CSF突變蛋白部分中的描述進(jìn)行。
M-CSFR抗體本發(fā)明還提供了可根據(jù)本發(fā)明的方法用作M-CSF拈抗劑的M-CSFR抗體。M-CSFR(SEQ ID NO8)是含有5個(gè)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(其中的結(jié)構(gòu)域1-3被認(rèn)為參與配體-受體結(jié)合)，1個(gè)跨膜域和1個(gè)胞內(nèi)間斷Src相關(guān)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜分子。參照SEQ ID NO8，上述的結(jié)構(gòu)域的位置如下Ig域1氨基酸27-102；Ig域2氨基酸112-196；Ig域3氨基酸215-285；Ig域4氨基酸308-399；Ig域5氨基酸410-492；跨膜域氨基酸515-537；以及激酶域氨基酸582-910?！暗湫偷摹泵庖咔虻鞍讟咏Y(jié)構(gòu)域包含1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常由每個(gè)環(huán)末端的兩個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵所錨定。在M-CSF-R中，這些形成Ig樣環(huán)的半胱氨酸氨基酸定位如下結(jié)構(gòu)域142，84；結(jié)構(gòu)域2127，177；結(jié)構(gòu)域3224，278；結(jié)構(gòu)域4沒有半胱氨酸參與；結(jié)構(gòu)域5419，485。
完整的M-CSFR胞外部分或其能夠保留其免疫原性的任何片段(例如，1個(gè)或多個(gè)Ig樣環(huán))，可以用于誘生能與天然受體結(jié)合的抗體。多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR嫁接抗體、人源化抗體、完全的人抗體和它們的抗原結(jié)合片段，可以如上述M-CSF抗體那樣進(jìn)行制備?？梢杂帽疚闹幸浴昂Y選方法”為標(biāo)題的部分中所述的分析，或采用任何本領(lǐng)域已知的合適的試驗(yàn)，來(lái)篩選具有MCSF拮抗劑活性以及適用于本發(fā)明所述的治療方法的抗體產(chǎn)物。
可溶性M-CSFR本發(fā)明還提供了可根據(jù)本發(fā)明方法用作M-CSF拮抗劑的M-CSFR突變蛋白。
M-CSFR在體外的生物學(xué)功能，是通過結(jié)合和激活M-CSF受體而實(shí)現(xiàn)的，M-CSF受體也稱為c-fms基因產(chǎn)物。重組的人可溶性M-CSF受體(rhsM-CSFR)，代表SEQ ID NO8中的氨基酸20-511位(Coussens，L等人，Nature，320277(1986))，它用作體外試驗(yàn)試劑來(lái)測(cè)定M-CSF代表的受體結(jié)合能力。為了產(chǎn)生跨膜受體的可溶性形式，在桿狀病毒、昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)系統(tǒng)中只表達(dá)人M-CSF受體的胞外結(jié)構(gòu)域。為了在純化可溶性受體時(shí)不對(duì)三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，選用的純化方法是非變性層析的方法，如下所述。也可選擇其它的純化重組受體的方法。當(dāng)可以獲得受體的合適抗體或其配體之一時(shí)，可以采用親和層析?；蛘?，可以在重組受體的C-末端加上“標(biāo)簽”，也就是KT3抗體識(shí)別序列，并且用抗-標(biāo)簽抗體進(jìn)行純化，也就是用KT3柱進(jìn)行親和層析。在rhsM-CSFR糖基化的表達(dá)系統(tǒng)中，凝集素層析可用于富集特異性糖蛋白。
受體胞外域中的一個(gè)或多個(gè)上述的Ig樣環(huán)，可能足以抑制M-CSF和MCSFR之間的相互作用。因此，M-CSF和其突變蛋白的胞外域片段，可以方便地用本領(lǐng)域熟知的重組或化學(xué)合成的方法進(jìn)行制備?？梢杂帽疚闹幸浴昂Y選方法”為標(biāo)題的部分中所述的分析，或采用任何本領(lǐng)域已知的合適的試驗(yàn)，來(lái)篩選具有MCSF拮抗劑的活性和適用于本發(fā)明所述的治療方法的產(chǎn)物。
基因治療可以通過體外、原位或體內(nèi)的基因治療將治療性的蛋白質(zhì)遞送給合適的細(xì)胞內(nèi)，其中可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，包括物理的DNA轉(zhuǎn)移方法(例如，脂質(zhì)體或化學(xué)處理)，或使用病毒載體(例如，腺病毒、腺相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)。例如，對(duì)于體內(nèi)治療，可以直接將編碼所需蛋白質(zhì)的核酸單獨(dú)地或與載體、脂質(zhì)體、或沉淀劑一同注射到對(duì)象體內(nèi)，而在一些實(shí)施例中，注射的位置可以是需要表達(dá)蛋白化合物的位置。對(duì)于體外治療，可取出對(duì)象細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些細(xì)胞中，再將經(jīng)過修飾的細(xì)胞返回對(duì)象體內(nèi)，可以直接返回也可用其它方式，例如，包裹在多孔膜內(nèi)植入病人體內(nèi)。參見，例如美國(guó)專利4,892,538和5,283,187。已有各種不同技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)核酸是要轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，還是要轉(zhuǎn)移至宿主的體內(nèi)細(xì)胞中，所采用的技術(shù)有所不同。適用于將核酸轉(zhuǎn)移至體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合，DEAE-葡聚糖、和磷酸鈣沉淀。通常使用的核酸體外遞送載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒。
其它的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體轉(zhuǎn)染(如腺病毒、單純皰疹病毒I、或腺相關(guān)病毒)和脂類系統(tǒng)?？梢匀芜x地將核酸和轉(zhuǎn)染試劑與微粒相連。典型的轉(zhuǎn)染試劑包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、兩親型季氨DOTMA(溴化(二油酰氧基丙基)三甲基銨，商品名為L(zhǎng)ipofectin，由GIBCO-BRL生產(chǎn)))(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone等人(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86 6077-6081)；帶有側(cè)鏈三甲基銨鹽頭部的親脂性谷氨酸二酯(Ito等人(1990)Biochem.Biophys.Acta1023，124-132)；可代謝的親代脂類，諸如陽(yáng)離子脂質(zhì)二辛基癸酰胺甘氨酰精胺(DOGS，Transfectam，Promega)和二棕櫚酰磷脂酰基乙醇戊基精胺(DPPES)(J.P.Belir(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986)；可代謝的季銨鹽(DOTB，N-(1-[2，3-二油酰氧基]丙基)-N，N，N-三甲基銨甲磺酸鹽(DOTAP)(Boehringer Mannheim)，聚乙撐亞胺(PEI)，二油酰酯，ChoTB，ChoSC，DOSC)(Leventis等(1990)Biochim.Ihter.22，235-241)；3β[N-(N，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰]膽固醇(DC-Chol)，以1∶1混合的二油磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰]膽固醇DC-Chol(Gao等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺，精脒，脂多胺(Behr等人，Bioconjugate Chem，1994，5382-389)，親脂性多聚賴氨酸(LPLL)(Zhou等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，氫氧化[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基芐基銨(氫氧化DEBDA)與過量的磷脂酰膽堿/膽固醇(Ballas等.，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，溴化十六烷基三甲銨(CTAB)/DOPB混合物(Pinnaduwage等，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)，親脂性的谷氨酸二酯(TMAG)與DOPE，CTAB，DEBDA，溴化雙十二烷基銨(DDAB)，和硬脂胺與磷脂酰乙醇胺的混合物(Rose等人，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，GIBCO BRL)，和含有脂類的寡聚半乳糖?？梢约訌?qiáng)轉(zhuǎn)移效率的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑包括，例如，DEAE-葡聚糖，多聚季胺，破溶酶體肽(Ohmori NI等，Biochem Biophys Res Commun1997年6月27日；235(3)726-9)，基于軟骨素的蛋白多糖，硫酸蛋白多糖，聚氮丙啶，多聚賴氨酸(Pollard H等.J Biol Chem，1998 273(13)7507-11)，整合素結(jié)合肽CYGGRGDTP，非糖類線性葡聚糖，甘油，連接于寡核苷酸核苷間鍵的3’-末端的膽固醇基團(tuán)(Letsinger，R.L.1989 Proc Natl Acad Sci USA 86(17)6553-6)，溶血磷脂，溶血磷脂膽堿，溶血性磷脂酰乙醇胺和1-油基溶血磷脂膽堿。
在某些情況下，將核酸和試劑一同遞送是有利的，而該試劑能夠使攜帶核酸的載體指向靶細(xì)胞。這樣的靶向分子包括靶細(xì)胞表面膜蛋白的特異抗體、或靶細(xì)胞上受體的配體。使用脂質(zhì)體時(shí)，可以用能與細(xì)胞表面與胞吞作用相關(guān)的膜蛋白相結(jié)合的蛋白進(jìn)行靶向和/或促進(jìn)攝取。這些蛋白質(zhì)的例子包括對(duì)特定的細(xì)胞類型具有嗜性的衣殼蛋白及其片段，在循環(huán)過程中經(jīng)歷內(nèi)化的蛋白質(zhì)的抗體，和靶向胞內(nèi)定位以及延長(zhǎng)胞內(nèi)半衰期的蛋白。在其它的實(shí)施例中，可以利用受體介導(dǎo)的胞吞作用。這些方法在例如Wu等人，1987或Wagner等人，1990中有所描述。對(duì)于當(dāng)前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述，可參見Anderson 1992。也可參見WO 93/25673以及其中引用的參考資料。對(duì)于基因治療技術(shù)方面的其他綜述，參見Friedmann，Science，2441275-1281(1989)；Anderson，Nature，392卷(增補(bǔ))，No6679，25-30頁(yè)(1998)；Verma，ScientificAmerican68-84(1990)；和Miller，Nature，357455460(1992)Antisense。
本發(fā)明還提供了反義化合物及其使用方法?？梢杂檬熘姆戳x技術(shù)、基因“剔除”技術(shù)、核酶和/或三聯(lián)體螺旋方法來(lái)降低基因的表達(dá)水平，從而降低M-CSF和M-CSFR的活性。這些分子的生產(chǎn)和使用技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
反義化合物可以通過與目標(biāo)mRNA雜交并且抑制蛋白質(zhì)的翻譯而阻礙mRNA的翻譯，反義化合物包括與目標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸。這些化合物可以靶向編碼區(qū)，或更優(yōu)選地靶向轉(zhuǎn)錄的不翻譯的區(qū)域。絕對(duì)的互補(bǔ)是不必要的，只要有足夠的互補(bǔ)度就能與內(nèi)源的RNA或DNA雜交并形成穩(wěn)定的雙鏈或三鏈。雜交能力取決于互補(bǔ)度和反義核酸的長(zhǎng)度。與目的基因非編碼區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸也可用于反義技術(shù)，以便用來(lái)抑制內(nèi)源mRNA的翻譯。優(yōu)選的反義核酸的長(zhǎng)度在6-50個(gè)核苷酸之間。在具體的情況下，寡核苷酸至少含有10個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、或至少20個(gè)核苷酸。
首先進(jìn)行體外研究，以便定量檢測(cè)候選的反義寡核苷酸對(duì)目的基因表達(dá)的抑制能力。優(yōu)選地，這些研究設(shè)置對(duì)照組，從而能將反義鏈的基因抑制效應(yīng)與寡核苷酸的非特異性生物效應(yīng)區(qū)分開來(lái)。同樣優(yōu)選地，這些研究將目標(biāo)RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與內(nèi)源的對(duì)照RNA或蛋白質(zhì)的水平加以對(duì)比。
寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或其修飾物，而且可以是單鏈的或雙鏈的(例如，RNAi)?？梢詫?duì)寡核苷酸的堿基部分、糖基部分或磷酸骨架進(jìn)行修飾，從而改善如分子或雜交的穩(wěn)定性。例如，參見，WO 03/088921；Dean，Curr Opin Biotechnol.12(6)622-5，2001；Geary等人，Curr OpinInvestig Drugs.2(4)562-573，2001。寡核苷酸可以與其它的組分偶聯(lián)，這些組分包括肽(例如，用于體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞)，或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑(參見，Letsinger，等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866553-6556；Lemaitre等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84648-652；PCT出版號(hào)WO88/09810，1988年12月15日出版)，或促進(jìn)跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑(參見，例如，PCT出版號(hào)WO89/10134，1988年4月25日出版)，雜交引發(fā)的切割試劑(參見，例如Krol等人，1988，BioTechniques 6958-976)或嵌入劑(參見，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)。反應(yīng)化合物也可以是α-反構(gòu)體寡核苷酸，它能與互補(bǔ)的RNA形成特異的雙鏈平行雜交物(Gautier，等人，1987，Nucl.Acids Res.156625-6641)。寡核苷酸可以是2’-()-甲基核糖核苷酸(Inoue，等人，1987，Nucl.Acids Res.156131-6148)，或雜合的RNA-DNA類似物(Inoue，等人，1987，F(xiàn)EBS Lett.215327-330)。
反義分子應(yīng)當(dāng)被輸送給至體外表達(dá)目的基因的細(xì)胞中。已經(jīng)發(fā)展了很多將反義DNA或RNA遞送至細(xì)胞的方法。例如，反義分子可以直接注射到組織區(qū)域，或者可以全身施用經(jīng)過修飾能夠靶向所需細(xì)胞的反義分子(例如，反義分子上連接了特異地與靶細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原相結(jié)合的肽或抗體)。在另一種方法中，要使細(xì)胞內(nèi)反義鏈的濃度足以抑制內(nèi)源性mRNA的表達(dá)，可以通過構(gòu)建重組DNA的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，將反義寡核苷酸置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下。使用這樣的構(gòu)建體去轉(zhuǎn)染病人體內(nèi)的靶細(xì)胞，將會(huì)轉(zhuǎn)錄出足夠數(shù)量的單鏈RNA與內(nèi)源性的基因轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)堿基對(duì)，從而阻止目的基因mRNA的翻譯。例如，可以引入載體，例如該載體可被細(xì)胞攝取并指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。這樣的載體可仍舊以游離形式存在，也可以整合到染色體上，只要它可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的反義RNA即可。
設(shè)計(jì)用于催化切割目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子也可以用來(lái)阻止目的基因mRNA的翻譯，進(jìn)而阻止目的基因產(chǎn)物的表達(dá)(參見，例如，PCT國(guó)際出版物WO90/11364，出版于1990年10月4日；Sarver，等人，1990，Science247，1222-1225)。核酶是能夠催化RNA特異性切割的RNA酶類分子(參見Rossi，1994，Current Biology4469-471的綜述)。核酶的作用機(jī)制包括核酶分子與互補(bǔ)的目標(biāo)RNA序列特異性雜交，隨后發(fā)生核酸內(nèi)裂解切割事件。核酶分子的組成必須包括一個(gè)或多個(gè)與目的基因的mRNA互補(bǔ)的序列，優(yōu)選地，該互補(bǔ)序列位于5’末端附近，而且必須包含熟知的能夠起到mRNA切割作用的催化序列。對(duì)于該序列，參見，如美國(guó)專利5,093,246，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。也可以使用錘頭狀核酶，其切割mRNA的位點(diǎn)由與目標(biāo)mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的特異側(cè)翼區(qū)域決定。錘頭狀核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生在本領(lǐng)域中是已知的，并在Myers，1995，分子生物學(xué)和生物技術(shù)全面的桌面參考書，VCHPublishers，New York，(尤其參見833頁(yè)的圖4)，以及Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334585-591中有更詳細(xì)的描述，這些文獻(xiàn)作為參考全文引入本文。也可以使用RNA核酸內(nèi)切酶(也稱為“Cech型核酶”)。此類核酶(如天然存在于Tetrahymena thermophila中的核酶(也稱為IVS或L-19 IVSRNA))已在Zaug，等，1984，Science，224574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231470-475；Zaug，等，1986，Nature，324429-433；已出版的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 88/04300；以及Been和Cech，1986，Cell，47207-216中有所描述。Cech型核酶具有一個(gè)與目標(biāo)RNA序列雜交的8堿基對(duì)活性位點(diǎn)。核酶也由可以經(jīng)過修飾的寡核苷酸組成(例如，為了改善其穩(wěn)定性和靶向性等)，而且應(yīng)當(dāng)在體內(nèi)被呈遞至表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞中。不同于反義分子，核酶具有催化活性，因此要達(dá)到一定效果所需的細(xì)胞內(nèi)濃度更低。
還可以通過定向同源重組使目標(biāo)基因或其啟動(dòng)子失活或“剔除”，從而降低內(nèi)源性目的基因的表達(dá)(例如，參見Smithies，等人，1985，Nature 317230-234；Thomas和Capecchi，1987，Cell 51503-512；Thompson，等人，1989，Cell5313-321；每一篇都全文引入本文作為參考)。例如，可以使用目的基因的突變的、非功能靶基因(或完全不相關(guān)的DNA序列)，在其兩側(cè)加上內(nèi)源性目的基因的同源DNA序列(可以是目的基因的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū))，可以加入或不加選擇性標(biāo)記和/或反向選擇標(biāo)記，用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染在體內(nèi)表達(dá)目的基因的細(xì)胞。通過定向同源重組，該DNA構(gòu)建體即可插入目的基因，導(dǎo)致其失活。
或者，可以通過設(shè)計(jì)與目的基因調(diào)控區(qū)(也就是目的基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的脫氧核苷酸序列，使之與調(diào)控區(qū)形成三螺旋結(jié)構(gòu)來(lái)阻礙體內(nèi)靶細(xì)胞中目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低內(nèi)源性目的基因的表達(dá)。(一般參見，Helene，1991，Anticancer Drug Des.，6(6)569-584；Helene，等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66027-36；和Maher，1992，Bioassays 14(12)807-815)。
用于形成三螺旋從而抑制轉(zhuǎn)錄的核酸分子應(yīng)當(dāng)是單鏈的，并且由脫氧核苷酸組成。這些寡核苷酸的堿基組成必須設(shè)計(jì)成能夠提高根據(jù)Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則形成的三螺旋，該規(guī)則通常需要雙螺旋中的一條鏈中存在一大段嘌呤或嘧啶鏈。核苷酸序列以嘧啶堿基為基礎(chǔ)，這能夠使產(chǎn)生的三螺旋中跨三條相關(guān)鏈形成TAT和CGC+三聯(lián)體。富含嘧啶的分子給雙螺旋中一條單鏈的嘌呤密集區(qū)以該鏈的平行取向提供堿基互補(bǔ)。此外，也可以選用富含嘌呤的核酸分子，例如含有一段G殘基的核酸。這些分子能夠與富含GC堿基對(duì)的DNA雙螺旋形成三螺旋，目標(biāo)雙螺旋中的大部分嘌呤殘基均位于其中的一條鏈上，跨三螺旋的三條鏈形成GGC三聯(lián)體。或者，可以通過制造稱為“回轉(zhuǎn)(switchback)”的核酸分子，來(lái)增加潛在的可以形成三螺旋的序列?；剞D(zhuǎn)分子以交替的5’-3’，3’-5’方式合成，這樣它們先與雙螺旋中的第一條鏈形成堿基對(duì)，然后再與另一條形成堿基對(duì)，這樣就不需要雙螺旋中的一條鏈上含有一大段嘌呤或嘧啶鏈了。
如果反義鏈、核酶或三螺旋治療將目的基因的表達(dá)水平降至異常低，那么可以施用替代蛋白質(zhì)?；蛘?，可以用修飾過而不含有受反義鏈、核酶或三螺旋治療影響的序列的核酸進(jìn)行基因治療，從而來(lái)提高基因的表達(dá)量。
本發(fā)明的反義RNA和DNA、核酶和三螺旋分子可以用任何本領(lǐng)域已知的DNA和RNA分子的合成方法進(jìn)行制備。這些方法包括本領(lǐng)域熟知的寡聚脫氧核糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸的化學(xué)合成技術(shù)，例如，固相亞磷酰胺化學(xué)合成技術(shù)?；蛘?，可以用編碼治療性RNA分子的DNA序列，在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子。
化學(xué)合成方法包括使用市售的DNA自動(dòng)合成儀；寡核苷酸硫代磷酸酯可以用Stein，等人(1988，Nucl.Acids Res.163209)的方法合成，而甲基膦酸酯可以用可控的多孔玻璃聚合物載體來(lái)制備(Sarin，等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451)。
肽和小分子如本文所用，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括蛋白質(zhì)、寡肽、多肽、肽等。此外，術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)還可以指完整的分子和/或片段的片段、多聚體或聚集體。蛋白質(zhì)可以是天然存在的蛋白質(zhì)，也可以是用重組DNA方法或化學(xué)和/或酶方法合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。參見，例如，Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(第三版2001)。
術(shù)語(yǔ)“肽”是指相對(duì)較短的氨基酸鏈，優(yōu)選的是長(zhǎng)度在6至100個(gè)氨基酸之間的肽。
肽可以用噬菌體展示技術(shù)篩選所需的結(jié)合活性(例如，與M-CSF或M-CSFR結(jié)合)或生物學(xué)活性(參見，例如，Scott等Science 249386(1990)；Devlin等，Science 249404(1990)；1993年6月29日授權(quán)的美國(guó)專利5,223,409；1998年3月31日授權(quán)的美國(guó)專利5,733,731；1996年3月12日授權(quán)的美國(guó)專利5,498,530；1995年7月11日授權(quán)的美國(guó)專利5,432,018；1994年8月16日授權(quán)的美國(guó)專利5,338,665；1999年7月13日授權(quán)的美國(guó)專利；出版于1996年12月19日的WO 96/40987；以及出版于1998年4月16日的WO 98/15833(每一篇都作為參考引入本文))。在這樣的展示庫(kù)中，肽序列與絲狀噬菌體的衣殼蛋白相融合而展示。典型的，展示的肽對(duì)抗體固定化的受體胞外域進(jìn)行親和洗脫。保留的噬菌體可以通過一系列的親和純化和再增殖進(jìn)行富集?？梢詫?duì)結(jié)合性最好的肽進(jìn)行測(cè)序，來(lái)識(shí)別一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽家族內(nèi)的關(guān)鍵殘基。
還可以用其它方法篩選肽，如產(chǎn)生與lac阻遏物的羧基端相融合的文庫(kù)并在大腸桿菌中表達(dá)，或者將肽與肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)相融合而將其展示于大腸桿菌的外膜上。在另一種方法中，RNA的隨機(jī)翻譯在核糖體釋放之前就終止了，這樣就產(chǎn)生了一個(gè)相關(guān)RNA仍舊附著在上面的多肽文庫(kù)。其它方法應(yīng)用肽與RNA的化學(xué)連接方法(參見，例如，Roberts和Szostak，Proc Natl Acad SciUSA，9412297-303(1997))。已經(jīng)發(fā)展了化學(xué)衍生的肽文庫(kù)，其中的肽固定于穩(wěn)定的非生物材料上，如聚乙烯棒或溶劑通透性樹脂。其它化學(xué)衍生的肽文庫(kù)應(yīng)用光蝕刻技術(shù)將肽掃描固定化于玻璃片上?；瘜W(xué)肽篩選的優(yōu)點(diǎn)在于它可以容許使用D-氨基酸和其它非天然類似物，以及非肽元件(element)。生物和化學(xué)方法的綜述參見Wells和Lowman，Curr Opin Biotechnol 3355-62(1982)。
可以在DNA水平上進(jìn)行誘變而達(dá)到對(duì)肽的進(jìn)一步修飾?？梢詣?chuàng)建并篩選誘變文庫(kù)而進(jìn)一步優(yōu)化最佳結(jié)合物的序列(Lowman，Ann Rev Biophys BiomolStruct 26401-24(1997))。也可以從蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)分析中得到能夠模擬大分子蛋白配體結(jié)合活性的肽。在這樣的分析中，結(jié)晶結(jié)構(gòu)可提示了大分子蛋白配體中關(guān)鍵殘基的種類及相對(duì)取向，據(jù)此，就可以設(shè)計(jì)肽(參見，例如，Takasaki等人，Nature Biotech 151266-70(1997))。
隨機(jī)肽或從抗原結(jié)合CDRs衍生而來(lái)的肽可以以線性方式融合或作為三維支架的一部分，例如抗體或其部分(如恒定區(qū))，來(lái)創(chuàng)建能夠與所需抗原結(jié)合的新型大分子?？梢园送浑亩蔚亩鄠€(gè)拷貝或不同的肽段。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“模擬肽”是指由氨基酸側(cè)鏈、或藥效基團(tuán)、或其合適的衍生物裝配而成的非肽化合物，這些物質(zhì)裝配于支架上，這樣藥效基團(tuán)的空間取向基本模擬了天然肽的生物活性構(gòu)型。例如，模擬肽可以缺失氨基酸或肽鍵但仍舊保留親代肽中肽鏈基團(tuán)的特殊三維構(gòu)造，而此特殊構(gòu)造對(duì)結(jié)合活性是必須的。支架可包含雙環(huán)、三環(huán)或更多環(huán)的碳或雜原子骨架，或者可以一個(gè)或更多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(例如，吡啶、吲唑等)或酰胺鍵為基礎(chǔ)。這類支架可以通過間隔區(qū)與位于核心一端的酸性基團(tuán)(例如，羧酸官能團(tuán))相連接，并與位于核心另一端的堿性基團(tuán)(例如，含氮基團(tuán)，如脒或胍)相連。典型的模擬肽合成技術(shù)描述于2003年10月23日出版的美國(guó)專利申請(qǐng)20030199531中，和2003年7月24日出版的美國(guó)專利申請(qǐng)20030139348中。
除了抗體和其它蛋白質(zhì)以外，本發(fā)明還考慮了其它的M-CSF拮抗劑，包括但并不限于，同樣在治療癌轉(zhuǎn)移和/或與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失中有效的小分子。可以通過檢測(cè)此類小分子與M-CSF結(jié)合的能力和/或其抑制M-CSF與M-CSFR相互作用的能力而加以鑒定。
測(cè)定M-CSF與小分子結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中很容易獲得，包括，例如，競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。在該檢測(cè)中，用小分子干擾M-CSF和其受體M-CSFR或抗M-CSF抗體之間的相互作用。或者，可以采用直接結(jié)合試驗(yàn)來(lái)測(cè)定小分子與M-CSF之間的相互作用。舉例來(lái)說，可以將M-CSF吸附到不溶性的基質(zhì)上，如組織培養(yǎng)板或珠上，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。由于包含了感興趣的小分子，標(biāo)記的M-CSFR或抗M-CSF抗體與M-CSF的結(jié)合受阻?；蛘撸》肿优cM-CSF的結(jié)合可以用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)試驗(yàn)加以確定。采用這種方法，表達(dá)M-CSF的細(xì)胞與攜帶熒光標(biāo)簽的抗M-CSF抗體一同培養(yǎng)，或者在攜帶熒光標(biāo)簽的第二抗體重組的條件下與抗M-CSF抗體一同培養(yǎng)。可以根據(jù)與表達(dá)M-CSF的細(xì)胞結(jié)合的劑量依賴性熒光強(qiáng)度的減弱來(lái)評(píng)估小分子與M-CSF的結(jié)合情況。類似地，可以用例如放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記小分子物質(zhì)，將其與固定化的M-CSF或表達(dá)M-CSF的細(xì)胞一同培養(yǎng)并檢測(cè)結(jié)合的小分子的放射性或熒光強(qiáng)度，以此來(lái)評(píng)估小分子的之間結(jié)合情況。
篩選方法有效的治療依賴于鑒定有效且無(wú)明顯毒性的制劑?？梢杂枚喾N檢測(cè)方法篩選在預(yù)防或治療與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失中具有潛在功效的化合物。例如，候選的拮抗劑可以先在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表征以確定其在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成過程中中和M-CSF的能力。這樣的系統(tǒng)可以包括鼠顱腔破骨細(xì)胞與脾細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)(Suda等人，破骨細(xì)胞分化的調(diào)控，Endocr.Rev.1366 80，1992；Martin和Udagawa，Trends Endocrinol.Metab.96-12，1998)，鼠基質(zhì)細(xì)胞系(例如，MC3T3-G2/PA6和ST2)與鼠脾細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)(Udagawa等人，Endocrinol1251805 13，1989)，以及ST2細(xì)胞和骨髓細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)(Udagawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877260 4，1990；Sasaki等人，Cancer Res.58462 7，1998；Mancino等人，J.Surg.Res.10018-24，2001)。在沒有M-CSF拮抗劑存在的情況下，這樣的共培養(yǎng)系統(tǒng)中形成的單核細(xì)胞滿足破骨細(xì)胞的主要標(biāo)準(zhǔn)，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP，破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶)活性、降鈣素受體、p60C-STS，玻聯(lián)蛋白結(jié)合素受體、和在骨和牙片上形成重吸收坑的能力。有效的M-CSF拮抗劑的存在能抑制這樣的多核細(xì)胞的生成。
除了上述的共培養(yǎng)系統(tǒng)，候選的M-CSF拮抗劑抑制破骨細(xì)胞生成的能力也可以在無(wú)基質(zhì)細(xì)胞或無(wú)破骨細(xì)胞的系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。破骨細(xì)胞生成必須的M-CSF可由共培養(yǎng)的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞(例如MDA 231)提供或由這些癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基提供(Mancino等人，J.Surg.Res.018-24，2001)，或者可以加入純化的M-CSF。
給定的M-CSF拮抗劑在預(yù)防或治療與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失中的功效，也可以在任何的動(dòng)物骨質(zhì)損失模型系統(tǒng)中測(cè)定，這些系統(tǒng)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。這樣的模型系統(tǒng)包括，直接將腫瘤細(xì)胞注入骨髓腔的系統(tǒng)(Ingall，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，117819-22，1964；Falasko，Clin.Orthop.16920 7，1982)，直接將腫瘤細(xì)胞注入大鼠腹腔膜的系統(tǒng)(Powles等，Br.J.Cancer 28316 21，1973)，注入小鼠尾部側(cè)靜脈或左腦室的系統(tǒng)(Auguello等，Cancer Res.486876 81，1988)。在沒有有效的M-CSF拮抗劑存在的條件下，注入的腫瘤細(xì)胞形成的溶骨性轉(zhuǎn)移可以用(溶骨病變區(qū)域的)放射顯影圖來(lái)確定或用(骨及軟組織的)組織化學(xué)方法確定。Sasaki等，Cancer Res.5535517，1995；Yoneda等，J.Clin.Invest.992509 17，1997.Clohisy和Ramnaraine，Orthop Res.16660 6，1998。Yin等，Clin.Invest.103197206，1999。在存在有效的M-CSF拮抗劑的情況下，可以預(yù)防或抑制溶骨性骨質(zhì)轉(zhuǎn)移，使得轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量更少，和/或體積更小。
本發(fā)明的M-CSF拮抗劑也可以用于預(yù)防或治療癌轉(zhuǎn)移。候選的M-CSF拮抗劑在預(yù)防或治療癌轉(zhuǎn)移方面的有效性，可以用人羊膜基底膜侵入模型進(jìn)行篩選，如Filderman等人，Cancer Res 5236616，1992中所述。此外，還可以應(yīng)用各種類型癌癥轉(zhuǎn)移的任何動(dòng)物模型系統(tǒng)加以檢測(cè)。這樣的模型系統(tǒng)包括，但并不限于Wenger等人，Clin.Exp.Metastasis 19169 73，2002；Yi等人，Cancer Res.62917 23，2002；Tsutsumi等人，Cancer Lett 16977-85，2001；Tsingotjidou等人，Anticancer Res.21971 8，2001；Wakabayashi等人，Oncology 5975 80，2000；Culp和Kogerman，F(xiàn)ront Biosci.3D672 83，1998；Runge等人，Invest Radiol.32212 7；Shioda等人，J.Surg.Oncol.641226，1997；Ma等人，Invest Oplithalmol Vis Sci.372293 301，1996；Kuruppu等人，J Gastroenterol Hepatol.1126 32，1996中所述的系統(tǒng)。在存在有效的M-CSF拮抗劑的情況下，可以預(yù)防或抑制癌轉(zhuǎn)移，使得轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量更少，和/或體積更小。
也可以通過運(yùn)用許多已知的用于鑒定和獲得特異性地與其它蛋白質(zhì)或多肽相互作用的方法中的任意一種來(lái)鑒定其它的M-CSF拮抗劑，例如，諸如美國(guó)專利5,283,173所述的酵母雙雜交系統(tǒng)或等價(jià)的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以將編碼M-CSF的cDNA或其片段克隆到一個(gè)雙雜交誘餌載體中，并用其在互補(bǔ)的靶文庫(kù)中篩選具有M-CSF結(jié)合活性的蛋白。
特定的M-CSF拮抗劑或M-CSF拮抗劑的組合物的抗腫瘤活性，可以用合適的動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估。例如，異源淋巴癌模型，該模型中人的淋巴細(xì)胞被引入免疫受損的動(dòng)物體內(nèi)，如裸鼠或SCID小鼠。也可以用測(cè)定腫瘤形成、腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等的抑制率的試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)其功效。
本發(fā)明提供的氨基酸序列信息，同樣可用于鑒定與M-CSF或M-CSF多肽或多核苷酸相互作用的結(jié)合伙伴化合物。鑒定結(jié)合伙伴化合物的方法包括溶液試驗(yàn)、體外試驗(yàn)(其中，M-CSF或M-CSF多肽被固定化)、和細(xì)胞試驗(yàn)。M-CSF或M-CSFR的結(jié)合伙伴化合物的鑒定，為治療或預(yù)防性干預(yù)與M-CSF或M-CSFR的正常或異常生物學(xué)活性相關(guān)的病理學(xué)提供了候選化合物。
本發(fā)明包括幾個(gè)鑒定M-CSF或M-CSF多肽結(jié)合伙伴的測(cè)試系統(tǒng)。在溶液試驗(yàn)中，本發(fā)明的方法包括以下幾個(gè)步驟(a)使M-CSF或M-CSF多肽與一種或多種候選的結(jié)合伙伴化合物相接觸；(b)鑒定與M-CSF或M-CSF多肽結(jié)合的化合物，可以通過分離M-CSF或M-CSF多肽/結(jié)合伙伴復(fù)合物，并將M-CSF或M-CSF多肽與結(jié)合伙伴化合物分離來(lái)達(dá)到鑒定的目的。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，還詳細(xì)描述了表征結(jié)合伙伴化合物的物理、生物、和/或化學(xué)特性的額外步驟。一方面，M-CSF或M-CSF多肽/結(jié)合伙伴復(fù)合物，可用M-CSF或M-CSF多肽或候選結(jié)合伙伴化合物的特異性抗體進(jìn)行分離。
在又一個(gè)實(shí)施例中，M-CSF或M-CSF多肽或候選的結(jié)合伙伴化合物含有便于其分離的標(biāo)記或標(biāo)簽，而本發(fā)明的鑒定結(jié)合伙伴化合物的方法則包括通過與標(biāo)記或標(biāo)簽的相互作用而分離M-CSF或M-CSF多肽/結(jié)合伙伴復(fù)合物這一步驟。這一類的典型標(biāo)簽是多聚組氨酸序列，通常含有6個(gè)左右的組氨酸殘基，這樣標(biāo)記的化合物可以通過鎳的螯合作用來(lái)分離化合物。其它的標(biāo)記和標(biāo)簽，如本領(lǐng)域熟知并常規(guī)使用的FLAG標(biāo)簽(Eastman Kodak，Rochester，NY)也包含在本發(fā)明中。
在體外試驗(yàn)的變化形式中，本發(fā)明提供一種方法，它含有以下步驟(a)使M-CSF或M-CSF多肽與一種或多種候選的結(jié)合伙伴化合物相接觸；(b)檢測(cè)候選化合物與M-CSF或M-CSF多肽的結(jié)合情況。在另一實(shí)施例中，候選的結(jié)合伙伴化合物被固定化，而檢測(cè)的是M-CSF或M-CSF多肽與它們的結(jié)合情況。固定化可以用本領(lǐng)域熟知的任何方法完成，包括與載體、珠、或?qū)游鰳渲矁r(jià)鍵合，以及利用非共價(jià)的高親和相互作用(如抗體結(jié)合或使用鏈霉親和素/生物素結(jié)合，其中固定化的化合物包含一個(gè)生物素組分)。結(jié)合的檢測(cè)可以采用(i)非固定化的化合物上的放射性標(biāo)記，(ii)非固定化化合物上的熒光標(biāo)簽，(iii)非固定化化合物的免疫特異性抗體，(iv)非固定化化合物上的標(biāo)記，該標(biāo)記能夠激發(fā)連在固定化化合物上的熒光載體，也可以采用本領(lǐng)域熟知并常規(guī)使用的其它方法。
調(diào)控(也就是，增強(qiáng)、減弱或阻礙)M-CSF或M-CSF多肽的活性或表達(dá)的試劑，例如抗體或有機(jī)/無(wú)機(jī)化合物，可以如下鑒定可以將假定的調(diào)控物與表達(dá)M-CSF或M-CSF多肽或多核苷酸的細(xì)胞一同培養(yǎng)，并確定假定調(diào)控物對(duì)M-CSF或M-CSF多肽或多核苷酸的活性或表達(dá)的作用。調(diào)控M-CSF或M-CSF多肽的化合物的選擇性可以通過比較其對(duì)M-CSF或M-CSF多肽的作用和它對(duì)其它相關(guān)化合物的作用而加以評(píng)估。具有選擇性的調(diào)控物可包括，例如，抗體以及特異地與M-CSF或M-CSF多肽或編碼M-CSF或M-CSF多肽的核酸相結(jié)合的其它蛋白質(zhì)、肽、或有機(jī)分子。M-CSF或M-CSF多肽活性的調(diào)控物，可以在治療由正常或異常的M-CSF或M-CSF多肽活性參與的疾病和生理情況中發(fā)揮作用。
本發(fā)明中鑒定調(diào)控物的方法包括上述任何鑒定結(jié)合伙伴化合物方法的變化形式，這些變化形式包括對(duì)于已經(jīng)鑒定的結(jié)合伙伴化合物，在候選的調(diào)控物存在及不存在的情況下實(shí)施結(jié)合試驗(yàn)。如果在候選調(diào)控物存在及不存在的情況下，M-CSF或M-CSF多肽與結(jié)合伙伴化合物的結(jié)合有所變化，則將該候選調(diào)控物鑒定為調(diào)控物。增強(qiáng)M-CSF或M-CSF多肽與其結(jié)合伙伴化合物之間結(jié)合的調(diào)控物稱為增強(qiáng)子或激活劑，而減弱M-CSF或M-CSF多肽與其結(jié)合伙伴化合物之間結(jié)合的調(diào)控物稱為抑制劑。
本發(fā)明還包括，鑒定與M-CSF或M-CSFR多肽相互作用或抑制其生物活性(也就是抑制酶活性、結(jié)合酶活性等)的化合物的高通量篩選(HTS)試驗(yàn)。HTS試驗(yàn)?zāi)軌蚋咝У睾Y選大量化合物。考慮將基于細(xì)胞的HTS系統(tǒng)用于探究M-CSF或M-CSFR和其結(jié)合伙伴之間的相互作用。設(shè)計(jì)的HTS試驗(yàn)，可用于鑒定具有所需特性的“優(yōu)先化合物”或“先導(dǎo)化合物”(“hits”or“l(fā)ead compound”，對(duì)于鑒定所得的化合物可以設(shè)計(jì)修飾來(lái)改善所需活性。對(duì)“優(yōu)先化合物”或“先導(dǎo)化合物”的化學(xué)修飾，一般基于“先導(dǎo)化合物”與M-CSF或M-CSFR多肽之間的可識(shí)別的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系。
本發(fā)明的另一方面，涉及鑒定與M-CSF或M-CSFR多肽或編碼M-CSF或M-CSFR多肽的核酸分子相結(jié)合的化合物的方法，該方法包括將化合物與M-CSF或M-CSFR多肽或者編碼M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相接觸，并確定該化合物是否與M-CSF或M-CSFR多肽或編碼M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相結(jié)合。可以用技術(shù)人員熟知的結(jié)合試驗(yàn)確定結(jié)合情況，包括但并不限于，凝膠移位分析、Western雜交印記、放射性標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、基于噬菌體的表達(dá)克隆、層析共分離、共沉淀、交聯(lián)、互作捕獲/雙雜交分析、Southwestern雜交印記分析、ELISA等等，這些方法描述于，例如，Current Protocols in MolecularBiology(1999)John Wiley&Sons，NY，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。要進(jìn)行篩選的化合物(可以包括懷疑能夠與M-CSF或M-CSFR多肽或編碼M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相結(jié)合的化合物)包括但并不限于，胞外、胞內(nèi)、生物或化學(xué)來(lái)源的物質(zhì)。本發(fā)明的方法還包括連有標(biāo)記物的配體(包括底物、銜接子或受體分子)，標(biāo)記物諸如放射性標(biāo)記(例如125I、35S、32P、33P、3H)，熒光標(biāo)簽、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶類標(biāo)記或免疫原性標(biāo)記。本發(fā)明范圍內(nèi)的調(diào)控物包括但并不限于，非肽類分子(如非肽模擬物)、非肽別構(gòu)劑、和肽。此類測(cè)試中所用的M-CSF或M-CSFR多肽或多聚核苷酸可以以游離形式存在于溶液中，附著于固相載體上，位于細(xì)胞表面或位于細(xì)胞內(nèi)或與細(xì)胞的一部分相結(jié)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以，例如，測(cè)定M-CSF或M-CSFR多肽與待測(cè)化合物之間復(fù)合物的形成情況?；蛘?，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以檢測(cè)由待測(cè)化合物引起的M-CSF或M-CSFR多肽與其底物形成復(fù)合物的減少情況。
本發(fā)明的另一方面，涉及能夠調(diào)控(也就是降低)M-CSF或M-CSFR多肽活性的化合物的鑒定方法，該方法包括使M-CSF或M-CSFR多肽與化合物相接觸，并且確定該化合物是否能夠調(diào)控M-CSF或M-CSFR多肽的活性。將待測(cè)化合物存在條件下的活性與沒有待測(cè)化合物存在條件下的活性相比較。如果含有待測(cè)化合物的樣品所具有的活性高于不加入待測(cè)化合物樣品的活性，那么該化合物就具有增強(qiáng)活性。類似地，如果含有待測(cè)化合物的樣品所具有的活性低于不加入待測(cè)化合物樣品的活性，那么該化合物就具有抑制活性。
本發(fā)明尤其適用于在任何一種藥物篩選技術(shù)中使用M-CSF或M-CSFR多肽來(lái)篩選化合物。待篩選的化合物(可含有懷疑能與M-CSF或M-CSFR多肽或編碼M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相結(jié)合的化合物)包括但并不限于，胞外的、胞內(nèi)的、生物和化學(xué)來(lái)源的化合物。在此試驗(yàn)中應(yīng)用的M-CSF或M-CSFR多肽或多聚核苷酸可以以游離形式存在于溶液中，附著于固相載體上，位于細(xì)胞表面或位于細(xì)胞內(nèi)或與細(xì)胞的一部分相結(jié)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以，例如，測(cè)定M-CSF或M-CSFR多肽與待測(cè)化合物之間復(fù)合物的形成情況?；蛘撸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可以檢測(cè)由待測(cè)化合物引起的M-CSF或M-CSFR多肽與其底物形成復(fù)合物的減少情況。
本發(fā)明的M-CSF或M-CSFR多肽活性的確定，可以采用如下方法，例如，檢測(cè)它們與化學(xué)合成的和天然存在的配體互相結(jié)合的能力?；蛘?，可以通過檢測(cè)M-CSF或M-CSFR多肽與銜接分子相結(jié)合的能力來(lái)測(cè)定它們的活性。M-CSF或M-CSFR多肽活性也可以通過檢測(cè)效應(yīng)分子的活性加以確定，這些效應(yīng)分子包括但并不限于，由M-CSF或M-CSFR激活的其它下游酶類。因此，M-CSF或M-CSFR多肽活性的調(diào)控物可以改變M-CSF或M-CSFR的功能，例如，M-CSF或M-CSFR多肽的結(jié)合特性。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例中，可以采用M-CSF或M-CSFR多肽與天然結(jié)合伙伴之間的結(jié)合試驗(yàn)，也可以用其它的本領(lǐng)域已知的M-CSF或M-CSFR多肽活性的結(jié)合或功能試驗(yàn)。本發(fā)明的生物學(xué)活性，包括但并不限于，與天然的或非天然的配體之間的結(jié)合活性，以及本領(lǐng)域已知的M-CSF或M-CSFR多肽的任何功能活性。M-CSF或M-CSFR多肽活性的非限制性實(shí)例包括底物蛋白的水解，以及其與底物、配體、銜接子(adaptor)和受體分子的結(jié)合活性。
本發(fā)明的調(diào)控物表現(xiàn)出各種化學(xué)結(jié)構(gòu)，通?？梢詺w為以下幾類天然的M-CSF或M-CSFR配體的非肽模擬物、M-CSF或M-CSFR的肽和非肽異構(gòu)效應(yīng)子、以及可以起到M-CSF或M-CSFR激活劑或抑制劑作用的肽(競(jìng)爭(zhēng)性的、無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性的、和非競(jìng)爭(zhēng)性的)(例如，抗體產(chǎn)物)。本發(fā)明并不限制合適的調(diào)控物的來(lái)源，調(diào)控物可以來(lái)自源于天然的物質(zhì)，如植物、動(dòng)物或礦物萃取物，或者來(lái)自非天然物質(zhì)，如小分子文庫(kù)，包括組合化學(xué)方法構(gòu)建的文庫(kù)以及肽文庫(kù)的產(chǎn)物。
其它方法也可用于酶活性的檢測(cè)，這些方法包括但并不限于，光度測(cè)定法、放射性測(cè)定法、HPLC、電化學(xué)等方法，這些方法描述于，例如酶試驗(yàn)實(shí)用方法，R.Eisenthal和M.J.Danson編(1992)牛津大學(xué)出版，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。
編碼M-CSF或M-CSFR多肽的eDNA可以用于藥物開發(fā)過程；每天能夠以高通量篩選方式(HTSs)檢測(cè)上千種未知化合物的試驗(yàn)已有詳盡的描述。文獻(xiàn)中有很多將放射性標(biāo)記的配體用于HTS結(jié)合試驗(yàn)，并以其發(fā)現(xiàn)藥物的實(shí)例(參見，Williams，Medicinal Research Reviews(1991)11，147-184；Sweetnam，等人，J.Natural Products(1993)56，441-455的綜述)。結(jié)合試驗(yàn)HTS中優(yōu)選固定化的M-CSF或M-CSFR，因?yàn)檫@樣會(huì)有更好的特異性(更高的相對(duì)純度)，并且會(huì)提供產(chǎn)生大量的M-CSF或M-CSFR材料的能力，還可以用于多種形式中(參見，Hodgson，Bio/Technology(1992)10973-980)；這些文獻(xiàn)均全文引入本文作為參考)。
已有多種異源系統(tǒng)可用于功能性地表達(dá)重組多肽，這些系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，這些系統(tǒng)包括細(xì)菌(Strosberg，等人，Trends inPharmacological Sciences(1992)1395-98)、酵母(Pausch，Trends inBiotechnology(1997)15487-494)、幾種昆蟲細(xì)胞(Vanden Broeck，Int.Rev.Cytology(1996)164189-268)、兩棲類細(xì)胞(Jayawickreme等人，CurrentOpinion in Biotechnology(1997)8629-634)和幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(CHO，HBK293，COS，等；參見Gerhardt，等人，Eur.J.Pharmacology(1997)3341-23)。這些例子并不排除使用其它可能的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，包括來(lái)自線蟲的細(xì)胞系(PCT申請(qǐng)WO 98/37177)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，調(diào)控M-CSF或M-CSFR多肽活性的化合物的篩選方法包括將待測(cè)化合物與M-CSF或M-CSFR多肽相接觸，并檢測(cè)化合物與M-CSF或M-CSFR多肽是否形成復(fù)合物。在這樣的試驗(yàn)中，配體通常是帶有標(biāo)記的。在進(jìn)行了合適的培養(yǎng)以后，將游離的配體從結(jié)合形式中分離出來(lái)，而游離的未形成復(fù)合物的標(biāo)記量，可作為特定化合物與M-CSF或M-CSFR多肽的結(jié)合能力的度量標(biāo)準(zhǔn)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，采用高通量的篩選方法篩選與M-CSF或M-CSFR多肽有合適的結(jié)合親合度的化合物。簡(jiǎn)單來(lái)說，在固相底物上合成了大量不同的小肽待測(cè)化合物。肽類待測(cè)化合物與M-CSF或M-CSFR多肽接觸并洗滌。然后，用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)結(jié)合的M-CSF或M-CSFR多肽。本發(fā)明中純化的多肽也可以直接包被于板上，并用于前述的藥物篩選技術(shù)。此外，非中和抗體也可以用來(lái)捕捉蛋白質(zhì)并將其固定于固相載體上。
通常，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，表達(dá)的M-CSF或M-CSFR多肽可以和用合適的放射性同位素標(biāo)記的底物、配體、銜接子或受體分子聯(lián)合應(yīng)用于HTS結(jié)合試驗(yàn)，這些同位素包括但并不限于，125I、3H、35S或32P。或者，底物、配體、銜接子或受體分子可以用熟知的方法以合適的熒光衍生物進(jìn)行標(biāo)記(Baindur，等人，Drug Dev.Res.，(1994)33373-398；Rogers，Drug DiscoveryToday(1997)2156-160)。固定的與M-CSF或M-CSFR特異結(jié)合的放射性配體，可以用幾種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中的某一種，并通過HTS分析加以檢測(cè)，包括過濾M-CSF或M-CSFR-配體復(fù)合物而將結(jié)合形式和非結(jié)合形式的配體加以分離(Williams，Med.Res.Rev.(1991)11，147-184；Sweetnam，等人，J.Natural Products(1993)56，441-455)。其它方法包括閃爍親近測(cè)定法(SPA)或FlashPlate形式，在該方法中不需要進(jìn)行這樣的分離(Nakayama，Cur.Opinion Drug Disc.Dev.(1998)185-91 Bosse，等人，J.Biomolecular Screening(1998)3285-292)。熒光配體的結(jié)合可以用多種方法加以檢測(cè)，包括熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)，結(jié)合配體的直接質(zhì)譜-光學(xué)-熒光測(cè)定(spectrophotofluorometric)分析，或熒光極化法(Rogers，Drug Discovery Today(1997)2，156-160；Hill，Cur.Opinion Drug Disc.Dev.(1998)1，92-97)。
本發(fā)明包括大量用于篩選和鑒定與M-CSF或M-CSFR結(jié)合的M-CSF或M-CSFR抑制劑的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，將M-CSF或M-CSFR固定化，并在候選調(diào)控物(如，抑制化合物)存在與不存在的條件下，檢測(cè)M-CSF或M-CSFR與結(jié)合伙伴之間相互作用。在另一實(shí)施例中，M-CSF或M-CSFR與結(jié)合伙伴的相互作用在溶液中加以檢測(cè)，同樣是在存在與不存在候選抑制化合物的條件下加以檢測(cè)。在以上兩種試驗(yàn)中，降低M-CSF或M-CSFR和其結(jié)合伙伴之間結(jié)合的化合物鑒定為抑制劑。另一種構(gòu)思的方法包括雙雜交試驗(yàn)的變化形式，其中蛋白/蛋白相互作用的抑制劑鑒定為能夠使轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中檢測(cè)到正信號(hào)的物質(zhì)，如1995年8月3日出版的PCT申請(qǐng)WO95/20652中所描述的。
本發(fā)明涉及的候選調(diào)控物，包括從潛在激活劑和潛在抑制劑文庫(kù)中選到的化合物。有很多用于鑒定小分子調(diào)控物的不同文庫(kù)，包括(1)化學(xué)文庫(kù)，(2)天然產(chǎn)物文庫(kù)，和(3)由隨機(jī)肽、寡核苷酸、或有機(jī)分子組成的組合文庫(kù)?；瘜W(xué)文庫(kù)包含隨機(jī)化學(xué)結(jié)構(gòu)物，其中的一些是已知化合物的類似物或是在其它藥物篩選中鑒定為“優(yōu)先化合物”或“先導(dǎo)化合物”的類似物，其中一些由天然物衍生而來(lái)，另一些則來(lái)自非定向的有機(jī)合成化學(xué)法。天然物文庫(kù)是微生物、動(dòng)物、植物或海洋生物的集合體，通過以下方法創(chuàng)造用于篩選的混合物(1)發(fā)酵并提取來(lái)自土壤、植物或海洋微生物的培養(yǎng)液。天然物文庫(kù)包括聚酮化合物、非核糖體肽，及其變異體(非天然存在形式)。參看Science 28263-68的綜述。組合文庫(kù)是由大量的肽、寡核苷酸、或有機(jī)化合物組成的混合物。這些文庫(kù)相對(duì)容易用傳統(tǒng)的自動(dòng)化合成方法、PCR、克隆或合適的合成方法進(jìn)行制備。尤為感興趣的是非肽組合文庫(kù)。其它感興趣的文庫(kù)包括肽文庫(kù)、蛋白質(zhì)文庫(kù)、模擬肽文庫(kù)、多平行合成集合文庫(kù)、重組文庫(kù)、和多肽文庫(kù)?？梢詤⒁奙yers，Curr.Opin.Biotechnol.8701-707(1997)中關(guān)于組合化學(xué)及其由此產(chǎn)生的文庫(kù)的綜述。使用本文所述的各種文庫(kù)鑒定調(diào)控物，可以對(duì)候選“優(yōu)先化合物”(或“先導(dǎo)化合物”)進(jìn)行修飾，從而使“先導(dǎo)化合物”的調(diào)控活性達(dá)到最佳能力。
還可以設(shè)計(jì)本發(fā)明范圍內(nèi)的其他候選抑制劑，包括可溶性形式的結(jié)合伙伴，以及這些結(jié)合伙伴的嵌合或融合蛋白。本文使用的“結(jié)合伙伴”廣泛地包括非肽調(diào)控物，以及肽調(diào)控物，包括抗體、抗體片段、和包含對(duì)M-CSF或M-CSFR具有免疫特異性抗體域的修飾化合物。
可用其他分析鑒定M-CSF或M-CSFR特異性配體，這些試驗(yàn)包括通過檢測(cè)受試配體與靶蛋白的直接結(jié)合作用來(lái)鑒定靶蛋白的配體，以及用離子噴霧質(zhì)譜/HPLC方法或其它的物理和分析法進(jìn)行親和超濾來(lái)鑒定靶蛋白的配體。或者，這種結(jié)合相互作用可以用酵母雙雜交系統(tǒng)間接鑒定，該方法描述于Fields等人，Nature，340245-246(1989)和Fields等人，Trends in Genetics，10286-292(1994)，這兩篇文獻(xiàn)作為參考引入本文。雙雜交系統(tǒng)是檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)或多肽之間相互作用的遺傳學(xué)方法。可以用來(lái)鑒定與已知蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì)，或者用來(lái)描繪對(duì)于相互作用起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域或殘基。已經(jīng)發(fā)展出該方法的變化形式用于克隆編碼DNA結(jié)合蛋白的基因，用來(lái)鑒定與蛋白質(zhì)結(jié)合的肽，以及用于藥物篩選。雙雜交系統(tǒng)利用了一對(duì)相互作用的蛋白將轉(zhuǎn)錄激活域帶到DNA結(jié)合域附近的能力，其中該激活域可與報(bào)告基因的上游激活序列(UAS)相結(jié)合，并且該方法通常在酵母中進(jìn)行。該試驗(yàn)要求構(gòu)建2個(gè)雜交基因(1)編碼與第一個(gè)蛋白質(zhì)相融合的DNA結(jié)合域的基因，和(2)編碼與第二個(gè)蛋白質(zhì)相融合的激活域的基因。DNA結(jié)合域?qū)⒌谝粋€(gè)雜交蛋白質(zhì)定向地引向報(bào)告基因的UAS；然而，由于大多數(shù)的蛋白缺乏激活域，這一DNA結(jié)合雜交蛋白并不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。第二個(gè)雜交蛋白質(zhì)盡管含有結(jié)合域，但由于其不與UAS結(jié)合，所以本身也不能激活報(bào)告基因的表達(dá)。然而，在兩個(gè)雜交蛋白均存在的情況下，第一個(gè)和第二個(gè)蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用將激活域拉到UAS處，激活了報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。例如，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)蛋白質(zhì)是M-CSF或M-CSFR(或其亞單位或片段)時(shí)，已知它能與另一種蛋白質(zhì)或核酸相互作用，那么這一試驗(yàn)可以用于檢測(cè)試劑對(duì)結(jié)合相互作用的干擾。在系統(tǒng)中加入不同的受試試劑，并且檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。存在抑制劑則使報(bào)告信號(hào)不能出現(xiàn)。
酵母雙雜交試驗(yàn)也可以用于鑒定與M-CSF或M-CSFR相結(jié)合的蛋白質(zhì)。在鑒定與M-CSF或M-CSFR(或其亞單位或片段)相結(jié)合的蛋白的試驗(yàn)中，可以運(yùn)用同時(shí)編碼M-CSF或M-CSFR(或其亞單位或片段)和UAS結(jié)合域(也就是第一個(gè)蛋白質(zhì))的融合多聚核苷酸。此外，構(gòu)建大量編碼激活域與另一個(gè)蛋白融合蛋白的雜交基因，并在試驗(yàn)中進(jìn)行篩選。通常，第二個(gè)蛋白質(zhì)是由總cDNA和基因組DNA融合文庫(kù)中的一個(gè)和多個(gè)成員所編碼的，每個(gè)第二個(gè)蛋白的編碼區(qū)都與激活域相融合。這一系統(tǒng)可以用于一系列蛋白質(zhì)，而且甚至無(wú)需知道第二個(gè)結(jié)合蛋白的種類或功能。該系統(tǒng)高度敏感并且能夠檢測(cè)到其它方法無(wú)法顯現(xiàn)出的相互作用；僅僅是暫時(shí)的相互作用就能引發(fā)轉(zhuǎn)錄從而產(chǎn)生穩(wěn)定的mRNA，此mRNA可以反復(fù)翻譯而產(chǎn)生報(bào)告蛋白。
其它試驗(yàn)也可以用于尋找與靶蛋白相結(jié)合的試劑。一種這樣的鑒定受試配體與靶蛋白之間結(jié)合作用的篩選方法描述于美國(guó)專利5,585,277中(該文獻(xiàn)作為參考引入本文)。該方法依據(jù)的原理是蛋白質(zhì)通常是以折疊和非折疊狀態(tài)的混合物的形式存在的，而且在兩種狀態(tài)間不斷變換。當(dāng)受試配體與折疊形式的靶蛋白相結(jié)合時(shí)(也就是當(dāng)受試配體是靶蛋白的配體時(shí))，與配體相結(jié)合的靶蛋白仍舊保持其折疊狀態(tài)。因此，當(dāng)存在與靶蛋白結(jié)合的受試配體時(shí)，折疊狀態(tài)的靶蛋白量會(huì)比不存在配體時(shí)的量多。配體與靶蛋白的結(jié)合可以用任何能夠區(qū)分靶蛋白的折疊和非折疊狀態(tài)的方法加以測(cè)定。在進(jìn)行該試驗(yàn)時(shí)，并不需要知道靶蛋白的功能。幾乎任何試劑都可以作為受試配體而用這種方法進(jìn)行檢測(cè)，包括但并不限于，金屬、多肽、蛋白質(zhì)、脂類、多糖、多核酸和有機(jī)小分子。
鑒定靶蛋白的配體的另一種方法描述于Wieboldt等人，Anal.Chem.，691683-1691(1997)(作為參考引入本文)。這一技術(shù)能同時(shí)篩選組合文庫(kù)中以溶液形式存在的20-30種試劑與靶蛋白的結(jié)合情況。結(jié)合于靶蛋白的試劑可用簡(jiǎn)單的洗膜步驟而與文庫(kù)中的其它組分分離開來(lái)。隨后，將保留于膜上的特異性選擇到的分子從靶蛋白中釋放出來(lái)，并用HPLC和氣動(dòng)輔助電噴霧(離子噴霧)離子化質(zhì)譜進(jìn)行分析。這一程序可選擇到與靶蛋白親和度最大的文庫(kù)組分，并且尤其適用于小分子文庫(kù)。
本發(fā)明的其它實(shí)施例包括使用競(jìng)爭(zhēng)性篩選試驗(yàn)，其中能與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的中和抗體，會(huì)與受試化合物競(jìng)爭(zhēng)性地與多肽結(jié)合。這樣，該抗體可用于檢測(cè)是否存在任何含有一個(gè)或多個(gè)M-CSF或M-CSFR分子抗原決定簇的肽段。放射性標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究描述于A.H.Lin等人Antimicrobial Agents andChemotherapy(1997)41卷，no.10，第2127-2131頁(yè)，其揭示的內(nèi)容全部引入本文作為參考。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽用作研究工具而鑒別、表征和純化相互作用的調(diào)節(jié)蛋白。用本領(lǐng)域已知的方法在本發(fā)明的多肽上引入合適的標(biāo)記，并用其捕捉相互作用的分子。例如，將分子與帶標(biāo)記的多肽一同培養(yǎng)，洗去未結(jié)合的多肽，然后定量檢測(cè)多肽復(fù)合物。用不同的多肽濃度得到的數(shù)據(jù)可用來(lái)計(jì)算多肽與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合情況、數(shù)目、和親和度。
標(biāo)記的多肽同樣可以作為試劑來(lái)純化與多肽相互作用的分子，包括但并不限于，抑制劑。在親和純化的一個(gè)實(shí)施例中，多肽與層析柱共價(jià)偶連。提取細(xì)胞和它們的膜，并使各種細(xì)胞的亞組分穿過層析柱，分子通過它們與多肽的親和力而結(jié)合于層析柱上。從柱上回收多肽復(fù)合物，解離并將回收的分子用于測(cè)序。然后，該氨基酸序列再用于鑒定捕獲的分子或用于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并的寡核苷酸，從合適的cDNA文庫(kù)中克隆對(duì)應(yīng)的基因。
或者，可以鑒定與M-CSF或M-CSFR配體表現(xiàn)出相似特性的化合物，但是這些化合物卻比人或動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性配體更小并表現(xiàn)出更長(zhǎng)的半衰期。在設(shè)計(jì)有機(jī)化合物時(shí)，根據(jù)本發(fā)明制得的分子用作“先導(dǎo)”化合物。為已知的藥物活性化合物設(shè)計(jì)模擬物的方法，是基于這些“先導(dǎo)”化合物而開發(fā)藥物的熟知的方法。模擬設(shè)計(jì)、合成和檢測(cè)，通?？梢杂脕?lái)避免對(duì)大量分子的目標(biāo)特性進(jìn)行隨機(jī)篩選。此外，對(duì)本發(fā)明的多肽所編碼的推定氨基酸序列分析所得到的數(shù)據(jù)，可以用來(lái)設(shè)計(jì)特異性更好因而藥效更高的新藥。
可以根據(jù)已有的信息，用計(jì)算機(jī)模擬來(lái)推斷本發(fā)明蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此，可以根據(jù)預(yù)測(cè)的M-CSF或M-CSFR的結(jié)構(gòu)來(lái)設(shè)計(jì)新穎的配體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是用本文揭示的M-CSF或M-CSFR核苷酸在其它的動(dòng)物中鑒定同源物。本文揭示的任何核苷酸序列、或其任何部分都可以用作例如探針，從而用于篩選數(shù)據(jù)庫(kù)或核酸文庫(kù)，例如，基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的篩選程序來(lái)鑒定同源物。因此，可以鑒定出與M-CSF或M-CSFR的序列至少具有50％的同源性，較佳地至少具有60％的同源性，更佳地至少具有70％的同源性，更佳地至少具有80％的同源性，更佳地至少具有90％的同源性，更佳地至少具有95％的同源性，最佳地至少具有100％的同源性的同源物。
聯(lián)合治療鑒定了一種以上在動(dòng)物模型中有效的M-CSF拮抗劑以后，可以將兩種或更多種的此類M-CSF拮抗劑混合使用而進(jìn)一步改善其對(duì)癌轉(zhuǎn)移和/或與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的療效。含有一種或多種M-CSF拮抗劑的組分可以施用于患者、或容易罹患癌轉(zhuǎn)移和/或與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的人或哺乳動(dòng)物。
盡管M-CSF拮抗劑治療可以用于癌癥的各個(gè)階段，然而抗體治療尤其適用于晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥。對(duì)沒有接受過化療的病人更推薦將抗體治療與化療或放療聯(lián)合使用，而接受過一種或更多種化療的病人則更適合應(yīng)用抗體治療。此外，抗體治療還能降低同時(shí)使用的化療的劑量，尤其適用于對(duì)化療劑的毒性沒有很好的耐受能力的病人。
本發(fā)明的方法包括施用單一的或聯(lián)合使用的抗M-CSF和抗M-CSFR抗體，或者是不同抗體的“雞尾酒混合物(cocktail)”。這樣的抗體雞尾酒可具有某些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兒械目贵w利用不同的效應(yīng)子機(jī)制，或者是將具有直接細(xì)胞毒性的抗體與依賴免疫效應(yīng)功能的抗體聯(lián)合使用。這樣的組合抗體可以顯現(xiàn)出協(xié)同的治療效果。此外，可以將M-CSF或M-CSFR抗體與其它治療劑和/或治療程序聯(lián)合使用，包括但并不限于，各種化學(xué)制劑、雄激素阻斷劑、和免疫調(diào)節(jié)劑(例如，IL-2，GM-CSF)、二磷酸鹽(bisphosphonat)制劑(例如，Aredia、Zometa、氯膦酸鹽(clodronate))、手術(shù)、放療、化療、激素治療(例如，它莫西芬、抗雄激素治療)、抗體治療(例如，RANKL/RANK中和抗體、PTHrP中和抗體、抗Her2抗體、VEGF中和抗體)、治療性蛋白治療(例如，可溶性的RANKL受體、OPG和PDGF和MMP抑制劑)、小分子藥物治療(例如，Src激酶抑制劑)、生長(zhǎng)因子受體激酶抑制劑、寡核苷酸治療(例如，反義的RANKL或RANK或PTHrP)、基因治療(例如，RANKL或RANK抑制劑)、肽治療(例如，RANKL突變蛋白)以及本文所述的那些蛋白質(zhì)、肽、化合物、和小分子。
癌癥的化療劑包括，不限于烷化劑，如卡鉑和順鉑；氮芥烷化劑；亞硝基脲烷化劑，如亞硝(基)脲氮芥(BCNU)；抗代謝劑，如氨甲蝶呤；嘌呤類似物抗代謝劑，巰(基)嘌呤；嘧啶類似物抗代謝劑，如5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱(gemcitabine)；激素類抗腫瘤制劑，如瑞林、亮丙瑞林和它莫西芬；天然抗腫瘤制劑，如阿地白介素(aldesleukin)、白介素-2、紫杉萜、依托泊甙(VP-16)、干擾素α、紫杉醇、和維甲酸(ATRA)；抗生素類天然抗腫瘤制劑，如博來(lái)霉素、放線菌素、阿霉素、和絲裂霉素；和長(zhǎng)春堿天然抗腫瘤制劑，如長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛；羥基脲；醋葡醛內(nèi)酯、阿霉素、異環(huán)磷酰胺、依諾他濱、環(huán)硫雄醇、阿柔比星、環(huán)胞苷、尼莫司汀、鹽酸丙卡巴肼、卡波醌、卡鉑、卡莫氟、色霉素A3、抗腫瘤多糖、抗腫瘤血小板因子、環(huán)磷酰胺、裂褶菌、阿糖胞苷、甲氮咪胺、巰嘌呤苷、三胺硫磷、替加氟、新制癌菌素、OK-432、博來(lái)霉素、福他隆(furtulon)、溴尿甘、二甲磺酸丁酯、磷酸己烯雌酚四鈉、培洛霉素、貝他定(烏苯美司)、干擾素β、美雄氨、二溴甘露醇、消旋苯丙氨酸氮芥、核纖層肽、香菇[多]糖、采絨革蓋菌提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(雌激素/氮芥(mechlorethamine))。
此外，其它的用作癌癥病人治療劑的試劑包括EPO、G-CSF、更昔洛韋；抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；疊氮胸苷(AZT)；白介素1至18，包括其突變物和類似物；干擾素或細(xì)胞因子，如干擾素α、β、和γ激素，如促黃體(生成)激素釋放激素(LHRH)及其類似物以及促性腺激素釋放激素(GnRH)；生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子同源因子(FGFHF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)；腫瘤壞死因子-α和β(TNF-α&β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1至7(BMP1-7)；生長(zhǎng)抑素(somatostatin)；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物岐化酶(SOD)；補(bǔ)體因子；抗血管生成因子；抗原物質(zhì)；和前體藥物。
施用與制劑本發(fā)明提供了化合物、含有化合物的藥物制劑、制備藥物制劑的方法、和用藥物制劑和化合物治療病人的方法。
這些組合物可以下列形式存在，例如，顆粒、粉末、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射劑、乳化劑、酏劑、懸浮劑或溶液。該組合物可以以各種施用途徑進(jìn)行給藥，例如，口服給藥、鼻部給藥、直腸給藥、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔膜內(nèi)注射。以下的劑型作為實(shí)例給出，而不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。
對(duì)于口服、面頰和舌下給藥，粉末、懸浮劑、顆粒、片劑、丸劑、膠囊、軟膠囊、和小膠囊和可以接受的固態(tài)劑型。其制備方法為，例如，混合本發(fā)明的一種或多種化合物，或藥學(xué)上可接受的鹽或其互變異構(gòu)體，至少添加一種添加劑，如淀粉或其它添加劑。合適的添加劑為蔗糖、乳糖、纖維素糖、甘露醇、麥芽糖醇、葡聚糖、淀粉、瓊脂、藻酸鹽、幾丁質(zhì)、殼聚糖、果膠、黃蓍膠、阿拉伯樹膠、明膠、膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯?；蛘?，口服劑型可以含有其它組分來(lái)輔助施藥，如惰性稀釋劑、或潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、或防腐劑如對(duì)羥基苯甲酸酯(paraben)或山梨酸、或抗氧化劑如抗壞血酸、維生素E或半胱氨酸，分解劑、粘合劑、增稠劑、緩沖液、甜味劑、調(diào)味劑或芳香劑。片劑和丸劑還可以進(jìn)一步用本領(lǐng)域已知的合適的包衣材料處理。
可以口服的液態(tài)劑型可以是藥學(xué)上可接受的乳化劑、糖漿、酏劑、懸浮劑和溶液，可以含有惰性的稀釋劑，如水。藥物劑型和藥劑可以用滅菌液體制備成液態(tài)懸浮劑或溶液的形式，可用的液體如，但并不限于，油、水、醇，及其組合物。藥學(xué)上可接受的合適的表面活性劑、懸浮劑、乳化劑也可以加入以口服或腸道外的方式給藥的藥劑中。
如上所述，懸浮劑可以含有油類。這些油包括但并不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄欖油。懸浮劑的制備也可以含有脂肪酸的酯類，如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、脂肪酸甘油酯、乙酰脂肪酸甘油酯。懸浮劑可以含有醇類，如，但并不限于乙醇、異丙醇、十六烷基醇、甘油和丙二醇。醚類，如，但并不限于，聚(乙烯醇)、石油類碳?xì)浠衔?如礦物油和石蠟油)；而且，水也可以用于懸浮劑。
對(duì)于鼻部給藥，藥物制劑和藥劑可以是含有合適的溶劑以及選擇性含有其它化合物(如，但并不限于，穩(wěn)定劑、抗微生物劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑和這些物質(zhì)的混合物)的噴霧或氣溶膠。氣溶膠制劑的推進(jìn)劑可以含有壓縮空氣、氮?dú)?、二氧化碳、或低沸點(diǎn)的碳?xì)浠衔锶軇?br> 可注射的劑型通常包括水相懸浮制劑或油相懸浮制劑，可以用合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑進(jìn)行制備?？勺⑸鋭┬涂梢允侨芤合嗟幕?yàn)閼腋⌒问降模萌軇┗蛳♂寗┻M(jìn)行制備。可接受的溶劑或載體包括無(wú)菌水、Ringer′s溶液、或等滲的水相鹽溶液?；蛘?，可以用無(wú)菌油類作為溶劑或懸浮劑。優(yōu)選地，油或脂肪酸是非揮發(fā)性的，包括天然的或合成的油類、脂肪酸、單、雙或三脂肪酸甘油酯。
用于注射的藥物制劑和/或藥劑可以是能用上述的合適溶液復(fù)原的粉末。這樣的例子包括但并不限于，冷凍干燥、旋轉(zhuǎn)干燥或噴霧干燥的粉末、無(wú)定形粉末、顆粒、沉淀物或粒子。用于注射的制劑可以選擇性地含有穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑和這些制劑的混合物。
對(duì)于直腸給藥，藥物制劑或藥劑可以是栓劑、軟膏劑、灌腸劑、片劑或乳膏劑的形式，使化合物在小腸、乙狀結(jié)腸和/或直腸中釋放。用本發(fā)明的一種或多種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或異構(gòu)體以及可接受的載體(例如，可可脂或聚乙二醇，其在通常的儲(chǔ)存溫度下以固相形式存在，而在體內(nèi)適合藥物釋放的溫度下(如直腸中)則以液相存在)來(lái)制備直腸栓劑。可以將油類用于軟膠形式和栓劑的制備。水、鹽水、水相葡萄糖和相關(guān)的糖溶液、以及甘油可以用來(lái)制備懸浮制劑，懸浮制劑還可以含有懸浮劑，如果膠、卡波姆、甲基纖維素、羥丙纖維素或羧甲基纖維素，以及緩沖劑和防腐劑。
除了上述的典型劑型，藥學(xué)上可接受的賦形劑和載體基本上是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，因此也包括在本發(fā)明中。這些賦形劑和載體描述于，例如，“Remingtons Pharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)，作為參考引入本文。
本發(fā)明的藥劑可以如下所述設(shè)計(jì)為短時(shí)作用、快速釋放、長(zhǎng)時(shí)作用和持續(xù)釋放的。因此，藥物制劑也可以制成可控釋放或緩慢釋放的形式。
本組合物還可以含有，例如，微膠粒或脂質(zhì)體，或其它膠囊形式，也可以施用長(zhǎng)時(shí)間釋放的形式而施用達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間貯存和/或遞送的效果。因此，藥物制劑和藥劑可以壓縮至丸或筒中并作為緩釋注射或作為植入物(如支架)進(jìn)行肌肉或皮下植入。這種植入物可以采用已知的惰性材料，如聚硅酮和生物可降解的聚合物。
可以根據(jù)病情、年齡、體重、總體健康情況、性別、和對(duì)象的飲食情況、劑量間隔、施用途徑、排泄率和藥物組合等調(diào)整特定的劑量。任何含有有效劑量的上述劑型都屬于常規(guī)實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)，因此也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，含有M-CSF拮抗劑的組合物可以用不經(jīng)過胃腸道的、局部的(topically)、口服的或病灶局部(locally)的給藥方式用以治療。優(yōu)選地，組合物用口服或不經(jīng)過胃腸道的方式給藥，也就是靜脈、腹腔膜、皮內(nèi)或肌肉注射。因此，本發(fā)明提供的方法采用組合物的方式予以給藥，該組合物含有一種或多種M-CSF拮抗劑，并使用藥學(xué)上可接受的載體，優(yōu)選的是含水載體?？梢允褂靡幌盗械暮d體，例如，水、水緩沖液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸溶液等等，還可以含有其它的蛋白質(zhì)以提高穩(wěn)定性，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，這些蛋白可以進(jìn)行溫和的化學(xué)修飾等。
通常，制備的用于治療癌癥轉(zhuǎn)移或與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的M-CSF拮抗劑基本上不含有其它天然存在的免疫球蛋白或其它生物分子。優(yōu)選的M-CSF拮抗劑還在施用于罹患或容易罹患癌癥轉(zhuǎn)移和/或與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的哺乳動(dòng)物時(shí)表現(xiàn)出最低的毒性。
本發(fā)明的組合物可以用傳統(tǒng)的、熟知的消毒技術(shù)進(jìn)行消毒。得到的溶液可以包裝以供使用或在無(wú)菌的條件下過濾并冷凍干燥，施用前再將冷凍干燥的藥品與無(wú)菌溶液混合。組合物可以含有藥學(xué)上可接受的適用于生理?xiàng)l件所需的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖試劑、滲透性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和穩(wěn)定劑(例如1.20％的麥芽糖等)。
本發(fā)明的M-CSF拮抗劑還可以通過脂質(zhì)體施用。脂質(zhì)體包括乳化劑、泡沫、微膠粒、不可溶的單層磷脂分散體、薄片層等等，這些都可以作為載體而將M-CSF拮抗劑靶向特定的組織以及延長(zhǎng)組合物的半衰期?？色@得各種制備脂質(zhì)體的方法，如美國(guó)專利4,837,028和5,019,369等所述，這些專利作為參考引入本文。
這些組合物中M-CSF拮抗劑的濃度變化范圍很寬，也就是其質(zhì)量濃度從低于約10％，通常至少約為25％，至高達(dá)約75％或90％，而且根據(jù)選用的特殊施用模式，主要通過液體的體積、粘度等來(lái)進(jìn)行選擇。制備可口服、局部和腸胃外給藥的化合物的實(shí)際方法，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的或顯而易見的，例如Remington′s Pharmaceutical Science，第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)，作為參考引入本文。
對(duì)本發(fā)明化合物治療癌癥轉(zhuǎn)移或/與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的有效劑量的確定可以用標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)方法來(lái)完成，這是本領(lǐng)域所熟知的。例如，可以采用確定血清阻礙M-CSF引發(fā)的鼠單核細(xì)胞(CD11b+細(xì)胞，CD11細(xì)胞的亞群，表達(dá)高水平的M-CSF受體)的增殖和存活的試驗(yàn)而對(duì)施用了一定劑量的M-CSF拮抗劑的對(duì)象進(jìn)行體內(nèi)血清中和活性的評(píng)估。
施用于已經(jīng)患有或易患癌癥轉(zhuǎn)移或/與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的哺乳動(dòng)物的本發(fā)明組合物，其劑量要足以預(yù)防或至少部分抑制癌癥轉(zhuǎn)移或/與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的發(fā)展。足夠達(dá)到這一效果的劑量定義為“治療有效劑量”。M-CSF拮抗劑的有效劑量可根據(jù)疾病的嚴(yán)重性和受治病人的體重和總體狀況而有所變化，但是通常在約1.0μg/kg至約100mg/kg體重之間，更普遍使用的劑量為每次施用約10μg/kg體重至約10mg/kg體重之間。根據(jù)藥物對(duì)疾病的反應(yīng)和病人對(duì)治療的耐受情況，可以根據(jù)需要每日、每周或以更低的頻率進(jìn)行施藥?？稍谝欢屋^長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)施用維持劑量，而劑量也可根據(jù)需要調(diào)整。
組合物可以單獨(dú)或復(fù)合施用，而主治醫(yī)師可以選擇其劑量水平及施用方式。在任何情況下，制劑所提供的M-CSF拮抗劑應(yīng)當(dāng)足以有效的預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移或/與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失或?qū)⑵鋰?yán)重性降至最低。本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)施用或作為輔助治療與本領(lǐng)域已知的其它療法聯(lián)合使用來(lái)治療癌癥轉(zhuǎn)移或/與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失。
II免疫療法對(duì)治療癌癥有效的抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體包括能夠?qū)δ[瘤發(fā)動(dòng)有效免疫應(yīng)答的抗體以及具有直接細(xì)胞毒性的抗體。在這方面，抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體或者通過補(bǔ)體介導(dǎo)的機(jī)制或者通過依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)機(jī)制而引起腫瘤細(xì)胞的裂解，這兩個(gè)機(jī)制都要求免疫球蛋白分子完整Fc片段與效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體區(qū)域或與補(bǔ)體蛋白相互作用。此外，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮直接生物學(xué)效應(yīng)的抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體也可以用于本發(fā)明的操作中。這種直接細(xì)胞毒性的抗體發(fā)揮作用的潛在機(jī)制包括抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)控細(xì)胞分化，調(diào)控腫瘤血管生成因子的分布型，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。特定的抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體發(fā)揮其抗腫瘤效果的機(jī)制可以用任何設(shè)計(jì)用來(lái)確定ADCC、ADMMC、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解等的方法加以評(píng)估，這在本領(lǐng)域中是普遍知曉的。
在一個(gè)實(shí)施例中，所實(shí)施的免疫療法使用對(duì)膜結(jié)合形式的M-CSF(M-CSFα)比分泌性的M-CSF具有更高親和度的抗體。例如，所制備的抗體可以特異地與M-CSFα的切割位點(diǎn)或其鄰近區(qū)域結(jié)合，或與M-CSFα的膜鄰近部分結(jié)合。這樣的抗體同樣有利于抑制可溶性的M-CSFα活性部分的切割與釋放。
抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體可以以它們的“裸露”形式或非偶聯(lián)形式施用，或者可以將治療制劑偶聯(lián)其上。在一個(gè)實(shí)施例中，抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體作為輻射敏化劑使用。該實(shí)施例中，抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體偶聯(lián)于輻射敏化劑上。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“輻射敏化劑”定義為以治療有效劑量施用于動(dòng)物的分子(優(yōu)選低分子量的分子)，用于提高細(xì)胞對(duì)電磁輻射的敏感度和/或改善電磁輻射治療疾病的療效。能用電磁輻射治療的疾病包括腫瘤疾病，良性和惡性的腫瘤，以及癌細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“電磁輻射”和“輻射”包括但并不限于，波長(zhǎng)在10-20至100米之間的輻射。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例采用的電磁輻射伽瑪輻射(10-20至10-13米)，X-射線輻射(10-12至10-9米)，紫外光(10nm至400nm)，可見光(400nm至700nm)，紅外輻射(700nm至1.0mm)，和微波輻射(1mm至30cm)。
已知輻射敏化劑能夠提高癌細(xì)胞對(duì)電磁輻射毒性效果的敏感性。目前，很多癌癥治療方案都利用能被X-射線電磁輻射所激發(fā)的輻射敏化劑。例如，X-射線所激發(fā)的輻射敏化劑包括，但并不限于以下幾種甲硝噠唑，米索硝唑，脫甲基米索硝唑，哌莫硝唑，依他硝唑，尼莫唑，絲裂霉素C，RSU 1069，SR 4233，EO9，RB 6145，煙酰胺，5-溴脫氧尿嘧啶(BUdR)，5-碘脫氧尿嘧啶(IUdR)，溴脫氧胞嘧啶，氟脫氧尿嘧啶(FUdR)，羥基脲，順鉑，以及它們的治療有效的類似物和衍生物。
癌癥的光動(dòng)力治療(PDT)將可見光用作敏化劑的輻射激活因子。光動(dòng)力輻射敏化劑的例子包括(但并不限于)下列物質(zhì)血卟啉衍生物、光敏素(r)[Photofrin(r)]、苯卟啉衍生物、Npe6、本卟啉錫(SnET2)、脫鎂葉綠甲酯酸-a(Pheoborbide-a)、菌葉綠素a(bacteriochlorophyll-a)、萘青色素(naphthalocyanines)、酞青(phthalocyanines)、酞箐鋅、以及它們的治療上有效的類似物和衍生物。
本發(fā)明的一種方法的操作中所使用的抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體可以制成含有適合所需給藥方法載體的藥物組合物。合適的載體包括任何在與抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體組合使用時(shí)仍能保持抗體的抗腫瘤功能并且不與對(duì)象的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的材料。實(shí)例包括但并不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，如無(wú)菌磷酸緩沖液、抑菌水等。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了上面所述的帶有可檢測(cè)標(biāo)記形式的抗體。可以使用放射性同位素標(biāo)記，親和標(biāo)記(如生物素、親和素等)，酶標(biāo)記(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)，熒光標(biāo)記(如FITC或羅丹明等)，順磁原子等來(lái)為抗體加上可檢測(cè)的標(biāo)記。這樣標(biāo)記的方式是本領(lǐng)域所熟知的；例如，參見(Sternberger，L.A.等人，J.Histochem.Cytochem.18315(1970)；Bayer，E.A.等人，Meth.Enzym.62308(1979)；Engval，E.等人，Immunol.109129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13215(1976))。
本發(fā)明考慮使用“裸露”的抗M-CSF抗體或抗M-CSFR抗體，以及使用免疫偶聯(lián)物。免疫偶聯(lián)物的生產(chǎn)描述于美國(guó)專利6,306,393中。免疫偶聯(lián)物可通過將治療劑直接偶聯(lián)于抗體組分而制備。通用技術(shù)描述于Shih等人，Int.J.Cancer41832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 461101-1106(1990)；和Shih等人，美國(guó)專利5,057,313。常用的方法包括將含有氧化的碳水化合物組分的抗體組分與載體聚合物(至少含有一個(gè)游離的胺官能團(tuán)，并且加載了很多藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或其它的治療制劑)反應(yīng)。該反應(yīng)會(huì)引入一個(gè)最初的Schiff堿(亞胺)連接，Schiff堿可以還原成仲胺而形成最終偶聯(lián)加以穩(wěn)定。
優(yōu)選的載體聚合物是至少含有50個(gè)氨基酸殘基的氨基葡聚糖或多肽，盡管也可以使用其它本質(zhì)上等價(jià)的聚合物載體。優(yōu)選地，最終的免疫偶聯(lián)物可以溶解于水溶液中，如哺乳動(dòng)物的血清，這樣便于施用以及便于在治療中有效的靶向。因此，載體聚合物的溶解功能將會(huì)增強(qiáng)最終的免疫偶聯(lián)物的血清溶解度。尤其優(yōu)選氨基葡聚糖。
用氨基葡聚糖載體制備免疫偶聯(lián)物的程序通常是從葡聚糖聚合物開始，最好是平均分子質(zhì)量在約10,000-100,000之間的葡聚糖。葡聚糖與氧化劑反應(yīng)從而影響其碳水化合物環(huán)中的一部分，進(jìn)行可調(diào)控的氧化而產(chǎn)生醛基，根據(jù)常規(guī)程序，氧化可以方便地用糖酵解化學(xué)試劑來(lái)完成，如NaIO4。
然后，氧化的葡聚糖再于多胺反應(yīng)(優(yōu)選二胺，更優(yōu)地為單羥基或多羥基二胺)。合適的胺包括乙烯二胺，丙二胺，或其它的諸如聚亞甲基二胺，二亞乙基三胺或像多胺，1，3-二胺-2-羥基丙烷，或其它的像羥基二胺或多胺，等等。相對(duì)于葡聚糖的醛基，所使用的胺要過量，這樣就能保證醛基官能團(tuán)完全轉(zhuǎn)變成Schiff堿官能團(tuán)。
使用NaBH4，NaBH3，CN等還原劑來(lái)使產(chǎn)生的Schiff堿中間物還原并穩(wěn)定?？梢詫⑺玫募雍衔锿ㄟ^傳統(tǒng)的大小層析柱來(lái)除去交聯(lián)的葡聚糖而得到純化。
也可以使用其它傳統(tǒng)的對(duì)葡聚糖引入胺官能團(tuán)制備衍生物的方法，例如，與溴化氰反應(yīng)后再與二胺反應(yīng)。
氨基葡聚糖再與要加載的特殊藥物的衍生物、毒素、鰲合劑、硼附加物(addend)或其他治療劑反應(yīng)，它們?yōu)榧せ钚问?，?yōu)選地是傳統(tǒng)方法制備的羧基激活衍生物，例如，使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或其水溶性的變體來(lái)形成中間加成物。
或者，可以將如商路抗病毒抗體或蓖麻毒素的A鏈等多肽毒素藕合到氨基葡聚糖上，采用的方法為戊二醛縮合或用蛋白質(zhì)上的激活羧基官能團(tuán)與氨基葡聚糖上的胺反應(yīng)。
用于放射性金屬或核磁共振增強(qiáng)劑的螯合劑在本領(lǐng)域是熟知的。典型的有乙二胺四乙酸(EDTA)和五乙酸三鈉鈣(DTPA)的衍生物。這些螯合劑通常在其側(cè)鏈上含有能將螯合劑連接到載體上的基團(tuán)。這樣的基團(tuán)包括，例如，苯甲基異硫氰酸鹽，DTPA或EDTA可以通過它藕合到載體的胺基團(tuán)上?；蛘?，螯合劑上的羧基或氨基可以用活化的方式藕合到載體上，或者先制備其衍生物再進(jìn)行藕合，這些技術(shù)都是熟知的方法。
硼附加物，如碳硼烷，可以用傳統(tǒng)的方法連接到抗體組分上。例如，如本領(lǐng)域中熟知的，碳硼烷可以用懸掛的側(cè)鏈上的羧基官能團(tuán)進(jìn)行制備。將這樣的碳硼烷連接到載體上，例如，氨基葡聚糖，可以通過碳硼烷的羧基基團(tuán)的活化并與載體上的胺縮合而完成，以此產(chǎn)生中間偶聯(lián)物。而后，這樣的中間偶聯(lián)物再連接到抗體組分上從而產(chǎn)生有療效的免疫偶聯(lián)物，如下所述。
多肽載體可以替代氨基葡聚糖使用，但是多肽載體的鏈中至少應(yīng)當(dāng)含有50個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地含有100-5000個(gè)氨基酸殘基。這些氨基酸中至少應(yīng)當(dāng)有一些為賴氨酸殘基或谷氨酸或天冬氨酸殘基。賴氨酸殘基上懸掛的胺和谷氨酸以及天冬氨酸殘基上懸掛的羧酸鹽便于連接到藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼附加物或其它的治療制劑上。合適的多肽載體的實(shí)例包括多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、它們的共聚物，以及這些氨基酸和其它氨基酸(例如，絲氨酸)的混合聚合物，而使得到的加載載體和免疫偶聯(lián)物具有所需的溶解特性。
中間偶聯(lián)物與抗體組分的偶聯(lián)是通過氧化抗體組分的碳水化合物部分并將所得的醛(或酮)羰基與加載了藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼附加物或其它的治療制劑后仍殘留在載體上的胺基團(tuán)反應(yīng)而獲得的?；蛘撸梢栽诩虞d了治療制劑后，再往中間偶聯(lián)物上引入胺基團(tuán)，然后通過氧化的抗體組分與引入的胺基團(tuán)的反應(yīng)而得到中間偶聯(lián)物。氧化可以很方便的用化學(xué)方法，例如NaIO4或其它糖酵解試劑實(shí)現(xiàn)，或者用酶的方法，例如神經(jīng)酰胺酶和半乳糖氧化酶。在使用氨基葡聚糖作為載體的情況中，并不是所用的氨基葡聚糖的胺都典型地用于加載治療制劑。氨基葡聚糖中剩余的胺與氧化的抗體組分縮合而形成Schiff堿加成物，然后再通過還原而穩(wěn)定，通常使用硼氫化物還原劑進(jìn)行還原。
類似的步驟也用于產(chǎn)生其它的根據(jù)本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物。加載的多肽載體優(yōu)選地含有剩余的游離賴氨酸殘基，與抗體組分的氧化碳水化合物部分進(jìn)行縮合。
多肽載體上的羧基可以，如果需要，用例如DCC激活并與過量的二胺反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成胺。
最終的免疫偶聯(lián)物用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純化，如在Sephacryl S-300上進(jìn)行尺寸層析或用一個(gè)或多個(gè)CD84Hy抗原表位進(jìn)行親和層析。
或者，可以直接將抗體組分與治療制劑進(jìn)行偶聯(lián)而制備免疫偶聯(lián)物。常用的步驟與間接偶聯(lián)方法類似，除了此處的治療制劑是直接連接到氧化的抗體組分上的。
可以理解的是其它治療制劑可以取代本文所述的螯合劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不使用不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)的前提下設(shè)計(jì)出偶聯(lián)方法。
用于進(jìn)一步說明，治療制劑可以通過形成二硫鍵而連接到還原的抗體組分鉸鏈區(qū)上。例如，可以在破傷風(fēng)類毒素多肽上構(gòu)建單一的半胱氨酸殘基，用來(lái)將肽連接到抗體組分上?；蛘?，可以用異雙功能交聯(lián)劑(如N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP))將這樣的肽連接到抗體組分上。Yu等人，Int.J.Cancer56244(1994)。這樣的偶聯(lián)所用的通用技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Wong，蛋白偶聯(lián)和交聯(lián)化學(xué)(CRC出版1991)；Upeslacis等人，“化學(xué)方法修飾抗體，”在單克隆抗體中原理和應(yīng)用，Birch等人(eds.)，187-230頁(yè)(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“合成肽衍生抗體的生產(chǎn)及表征，”在單克隆抗體中生產(chǎn)、工程和臨床應(yīng)用，Ritter等人(eds.)，60-84頁(yè)(Cambridge University出版1995)。
如上所述，抗體Fc區(qū)域的碳水化合物組分可以用來(lái)偶聯(lián)治療制劑。然而，如果把抗體片段用作免疫偶聯(lián)物的抗體組分，那么Fc片段會(huì)缺失。然而，可以將碳水化合物組分引入抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)。參見，例如，Leung等人，J.Immunol.1545919(1995)；Hansen等人，美國(guó)專利5,443,953。工程處理過的碳水化合物組分再用于連接治療制劑。
此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以知道很多偶聯(lián)方法的變化形式。例如，碳水化合物組分可以用來(lái)連接聚乙二醇，從而延長(zhǎng)完整抗體、或其結(jié)合片段在血液、淋巴液或其它細(xì)胞外液中的半衰期。而且，可以通過將治療制劑連接到碳水化合物組分并連接到游離的巰基基團(tuán)上而構(gòu)建“二價(jià)的免疫偶聯(lián)物”。這樣的游離巰基基團(tuán)可以定位于抗體組分的鉸鏈區(qū)。
抗M-CSF和抗M-CSFR抗體融合蛋白本發(fā)明包括含一個(gè)或多個(gè)抗M-CSF和抗M-CSFR抗體組分以及免疫調(diào)節(jié)劑或毒素組分的融合蛋白的用途。制備抗體融合蛋白的方法是本領(lǐng)域所熟知的。參見，例如美國(guó)專利6,306,393。含有白介素-2的抗體融合蛋白描述于Boleti等人，Ann.Oncol.6945(1995)，Nicolet等人，Cancer Gene Ther.2161(1995)，Becker等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 937826(1996)，Hank et at，Clin.CancerRes.21951(1996)，以及Hu等人，Cancer Res.564998(1996)。此外，Yang等人，人抗體雜交瘤6129(1995)描述了含有F(ab’)2片段和腫瘤壞死因子α組分的融合蛋白。
制備抗體-毒素融合蛋白(其中，重組分子含有一個(gè)或多個(gè)抗體組分和一個(gè)毒素或化療劑)的方法同樣也是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如，抗體-假單胞菌外毒素A融合蛋白描述于Chaudhary等人，Nature 339394(1989)，Brinkmann等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 888616(1991)，Batra等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 895867(1992)，F(xiàn)riedman等人，J.Immunol..1503054(1993)，Wels等人，Int.J.Can.60137(1995)，F(xiàn)ominaya等人，J.Biol.Chem.27110560(1996)，Kuan等人，Biochemistry 352872(1996)，以及Schmidt等人，Int.J.Can.65538(1996).含有白喉毒素組分的抗體-毒素融合蛋白描述于Kreitman等人，Leukemia 7553(1993)，Nicholls等人，J.Biol.Chem.2685302(1993)，Thompson等人，J.Biol.Chem.27028037(1995)，以及Vallera等人，Blood 882342(1996)。Deonarain等人，TumorTargeting 1177(1995)描述了含有RNA酶組分的抗體-毒素融合蛋白，而Linardou等人，Cell Biophys.24-25243(1994)生產(chǎn)了含有DNA酶I組分的抗體-毒素融合蛋白。Gelonin作為Wang等人，209屆ACS國(guó)家會(huì)議的摘要，Anaheim，Calif，Apr.2-6，1995，Part 1，BIOT005制備的抗體-毒素融合蛋白中的毒素。作為另一個(gè)實(shí)例，Dohlsten等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA918945(1994)，報(bào)道了含有葡萄球菌內(nèi)毒素A的抗體-毒素融合蛋白。
適用于制備這樣的偶聯(lián)物的代表性的毒素是篦麻毒素、相思豆毒蛋白，核糖核酸酶，DNase I，葡萄球菌內(nèi)毒素A，商陸抗病毒蛋白、白樹因(gelonin)，白喉毒素，假單胞菌外毒素，和假單胞菌內(nèi)毒素。參見例如，Pastan等人，Cell47641(1986)，和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians4443(1994)。其它合適的毒素是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的。
本發(fā)明由以下實(shí)例加以說明，而這些實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1這一實(shí)施例表明，高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞系高水平地表達(dá)M-CSF。使用微陣列，將高轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞系MDA231的M-CSF基因表達(dá)量，與細(xì)胞系MCF7和細(xì)胞系ZR751的M-CSF基因表達(dá)量相比較。結(jié)果是MDA231中M-CSF的蛋白水平相對(duì)MCF7中的蛋白表達(dá)水平增加6.9倍，而與ZR751相比MDA231的基因表達(dá)水平增加5.2倍。
實(shí)施例2這一實(shí)施例表明，在體外的破骨細(xì)胞形成試驗(yàn)中，純化的M-CSF可以用來(lái)自轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系MDA231的條件培養(yǎng)基來(lái)替換，但不能用來(lái)自細(xì)胞系MCF7的培養(yǎng)基替換(圖3)。
條件培養(yǎng)基(CM)的生產(chǎn)將MDA231或MCF7細(xì)胞接種到8毫升含有1×ITS(BD Bioscicences，Lexington，KY)的50％DMEM/50％HAMs F12培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度為1×106/10cm培養(yǎng)皿，這是補(bǔ)充有胰島素、人運(yùn)鐵蛋白和亞硒酸的補(bǔ)充培養(yǎng)基。在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)基并以1500RPM的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，從而除去任何懸浮的細(xì)胞。收集上清液，用0.2nm孔徑的濾膜過濾，用作CM。
破骨細(xì)胞試驗(yàn)將骨髓CD34+細(xì)胞接種于100μl含有10％FCS、1×Pen/Strep和1×兩性霉素B去氧膽酸鈉的αMEM中，細(xì)胞密度為15000細(xì)胞/96孔。第二天，從每孔中移去50μl培養(yǎng)基并補(bǔ)入25μlαMEM培養(yǎng)基和75μl條件培養(yǎng)基或含有ITS的50％DMEM/50％HAMs F12。每孔中加入RANKL使其終濃度達(dá)到100ng/ml，在合適的孔中加入30ng/ml的M-CSF。在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)11天。在這段時(shí)間內(nèi)，6天后再加入新鮮的RANKL。11天后，固定細(xì)胞并用Sigma產(chǎn)的白細(xì)胞酸性磷酸酶試劑盒對(duì)抗酒石酸酸性磷酸酶進(jìn)行染色。
結(jié)果如圖3所示，在體外的破骨細(xì)胞形成試驗(yàn)中，純化的M-CSF可以用來(lái)自轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系MDA231的條件培養(yǎng)基來(lái)替換，但不能用來(lái)自細(xì)胞系MCF7的培養(yǎng)基替換。
實(shí)施例3該實(shí)施例表明，由MDA231條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞可以用抗M-CSF的抗體中和(圖4)。
如實(shí)施例2中所述的方法接種骨髓CD34+細(xì)胞。第二天，每孔中移去50μl培養(yǎng)基。每孔加入25μl的6×抗體5H4或αMEM培養(yǎng)基，再加入75μl的CM或含有1×ITS的50％DMEM/50％HAMs F12或αMEM培養(yǎng)基。在所有的孔中加入100ng/ml的RANKL，而在一半的孔中加入30ng/ml的M-CSF。在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)11天。在這段時(shí)間內(nèi)，6天后再加入新鮮的RANKL。11天后，固定細(xì)胞并用Sigma產(chǎn)的白細(xì)胞酸性磷酸酶試劑盒對(duì)抗酒石酸酸性磷酸酶進(jìn)行染色。
如圖4所示，由MDA231條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞可以用抗M-CSF的抗體中和。
實(shí)施例4該實(shí)施例顯示，單克隆抗體5H4(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)HB10027)和其它抗人M-CSF的抗體具有中和活性。
為了在小鼠M NFS 60細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)CRL-1838，可購(gòu)自ATCC(Rockville，MD，USA)，該細(xì)胞來(lái)源于用Cas-Br-MuLV野生小鼠親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的粒細(xì)胞白血病，對(duì)白介素3和M-CSF都有反應(yīng)，并且還含有因逆轉(zhuǎn)錄病毒整合而造成的截短的c-myb原癌基因)上測(cè)定對(duì)抗人M-CSF活性抗體的中和能力，先將重組的人CSF-1(以終濃度10ng/ml)與不同濃度的抗體一起在37℃，5％CO2條件的培育箱中培養(yǎng)1小時(shí)。此后，將化合物加到培養(yǎng)在96孔微量滴定板中的M NFS 60細(xì)胞培養(yǎng)物中。每孔的總試驗(yàn)體積為100μl，含有10ng/ml的rhM-CSF和圖5中所示的抗體濃度，其細(xì)胞密度為5000細(xì)胞/孔。在37℃的CO2的培育箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，用CellTiter Glo Kit(Promega)測(cè)定細(xì)胞增殖。所有產(chǎn)生的抗體都是抗人M-CSF的抗體。Anogen是指Anogen產(chǎn)品目錄#MO C40048 A克隆116；Antigenix是指Antigenix America公司產(chǎn)品目錄#MC600520克隆M16；以及R&D是指R&D Systems產(chǎn)品目錄#Mab216。
如圖5所示，相對(duì)于Anogen和Antigenix，細(xì)胞增殖受抗體5H4處理的影響最大。
實(shí)施例5這一實(shí)施例表明，抗M-CSF抗體在預(yù)防與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的嚴(yán)重溶骨性疾病方面十分有效。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。為了評(píng)估M-CSF抗體作為治療骨質(zhì)溶解的治療制劑的有效性，將高度轉(zhuǎn)移性的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-231(3×105)注入雌性裸鼠的脛骨骨髓腔內(nèi)。小鼠的年齡是4-7周齡，平均體重約為20g。對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)注(chipped)以便鑒別，并且在為時(shí)8周的研究開始前至少經(jīng)歷7天的適應(yīng)期。
小鼠總共接受1.5mpk劑量的丁丙諾啡(每只小鼠0.03mg)，在脛骨內(nèi)注射前的30分鐘注射入兩側(cè)皮下。用吸入異氟醚的方式對(duì)小鼠實(shí)施麻醉，并用70％的乙醇清洗右后腿。將懸浮于10μl鹽水中的腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231-luc，3×105)用50或100μl的微量注射器注入右側(cè)脛骨的骨髓腔中。
作為抗體治療，如下選擇各組1.小鼠IgG1同種型對(duì)照2.5H4小鼠IgG1抗人M-CSF3.大鼠單克隆對(duì)照(TBD)4.5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF5.5H4+5A1(雙重治療)6.小鼠+大鼠同種型對(duì)照(雙重對(duì)照)(沒有PBS對(duì)照組)劑量。抗體治療開始于腫瘤細(xì)胞注射后的第二天。對(duì)于小鼠IgG1同種型對(duì)照、5H4小鼠IgG1抗人M-CSF、大鼠單克隆對(duì)照、和5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF(Lokeshwar，B.L.，Lin，H.S.，J Immunol.，15；141(2)483-8(1988))，每周施用1次10mg/kg的抗體。對(duì)于聯(lián)合治療組(5H4+5A1，小鼠+大鼠同種型對(duì)照)，每周一次分開注射10mg/kg個(gè)體(也就是未混合)的抗體，這樣這些治療組的小鼠每周接受2次注射。
所提供的藥劑溶劑是稀釋前的濃度(＝2mg/ml)，這樣IP注入100μl將可以滿足施用于20g小鼠的目標(biāo)劑量(＝200μg)。根據(jù)體重調(diào)整，注射的體積依體重的不同每克體重增加或減少5μl。例如，一只23g的小鼠接受115μl，而18g的小鼠則接受90μl。
測(cè)定。要評(píng)估各治療組之間骨質(zhì)溶解的嚴(yán)重程度，每只小鼠在注入腫瘤細(xì)胞后的一天接受基線Faxitron成像。研究最后(8周后)，再接受Faxitron成像。由于腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)熒光素酶，用Xenogen系統(tǒng)同步測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)。
結(jié)果。如圖6所示，在接受5A1+5H4抗體聯(lián)合治療的組中，平均溶骨值≥2.5個(gè)動(dòng)物個(gè)體數(shù)最少。溶骨性骨損壞是以0-4的評(píng)分等級(jí)進(jìn)行評(píng)估的，0相當(dāng)于沒有骨損壞，1-2相當(dāng)于有一些骨損壞，而2.25及更大的數(shù)值則表示有嚴(yán)重的骨損壞。數(shù)據(jù)表明，小鼠(也就是宿主)表達(dá)的M-CSF比腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的M-CSF對(duì)骨質(zhì)溶解有更大的影響(將5H4同5A1單獨(dú)及聯(lián)合施用相比較)。
實(shí)施例6基本上重復(fù)以上實(shí)施例5中所述的研究，除了在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中有一個(gè)區(qū)別。在本研究中，抗體治療并不是從腫瘤接種后的2周才開始的。腫瘤接種后的1天，取后腿的放射顯影圖以獲得基線圖像以及檢測(cè)由注射引起的骨折。進(jìn)一步，在腫瘤接種后的14天，用Xenogen IVIS系統(tǒng)對(duì)小鼠成像，來(lái)計(jì)量腫瘤細(xì)胞發(fā)出的熒光光子。
選擇60只脛骨光子信號(hào)強(qiáng)度類似的小鼠。本研究排除具有胸部信號(hào)(人工肺癌轉(zhuǎn)移病灶)的小鼠。將選擇的小鼠隨機(jī)分成6個(gè)治療組，并且如實(shí)施例5中所述的方法施用抗體治療。在整個(gè)研究過程中，每周一次連續(xù)地監(jiān)測(cè)光子發(fā)射情況。從治療接種后的第5周起，每周還獲取放射顯影圖來(lái)評(píng)估骨中的腫瘤生長(zhǎng)。
如圖7所示，在接受5A1+5H4抗體聯(lián)合治療的組中，平均溶骨值≥2.5個(gè)動(dòng)物個(gè)體數(shù)最少。溶骨性骨損壞是以0-4的評(píng)分等級(jí)進(jìn)行評(píng)估的，0相當(dāng)于沒有骨損壞，1-2相當(dāng)于有一些骨損壞，而2.25及更大的數(shù)值則表示有嚴(yán)重的骨損壞。數(shù)據(jù)表明，小鼠(也就是宿主)表達(dá)的M-CSF比腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的M-CSF對(duì)骨質(zhì)溶解有更大的影響(將單獨(dú)施用5H4同單獨(dú)施用5A1及聯(lián)合施用相比較)。
實(shí)施例7該實(shí)施例展示，在皮下注射SW620的模型中評(píng)估抗M-CSF單克隆抗體的抗癌活性的步驟。以上的實(shí)施例5和6表明，抗M-CSF單克隆抗體治療顯著地抑制骨髓中的腫瘤生長(zhǎng)。本研究的目的是評(píng)估抗體是否同樣能夠抑制軟組織中的腫瘤生長(zhǎng)。
本研究采用10周齡、平均體重約20g的雌性nu/nu小鼠。小鼠在研究開始前至少經(jīng)歷7天的適應(yīng)期。在第0天，在裸鼠的右側(cè)皮下注入SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞，每只小鼠注射5×106細(xì)胞每100μl。在腫瘤體積達(dá)到100-200mm3時(shí)(通常在腫瘤接種后的1周)，將小鼠隨機(jī)地分為5組，每組10只小鼠，如下1)PBS2)5H43)5A14)mIgG1+rIgG1同種型Ab對(duì)照5)5A1+5H4用指定的抗體以10mpk每周一次的劑量，持續(xù)4周給小鼠實(shí)施腹膜內(nèi)注射。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到2000mm3時(shí)，研究即停止?；蛘?，在下面這些情況出現(xiàn)時(shí)，動(dòng)物也會(huì)被實(shí)施安樂死腫瘤表面潰瘍面積大于總表面積的30％，顯著的體重降低(＞20％)，脫水，和垂死。從所有的小鼠身上收集全血并且分析單核細(xì)胞群，作為潛在的替代標(biāo)記。用2-D分析來(lái)測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)/體積。腫瘤寬度及長(zhǎng)度的測(cè)定則用于腫瘤體積的計(jì)算。預(yù)計(jì)因上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致抑制軟組織中的腫瘤的生長(zhǎng)。
實(shí)施例8以下實(shí)施例展示了，對(duì)聯(lián)合治療在治療和預(yù)防與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的嚴(yán)重溶骨性疾病中作用的評(píng)估程序。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)?；旧现貜?fù)以上實(shí)施例5中所述的研究，除了在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中有以下區(qū)別。除了以下列出的抗體或抗體聯(lián)合治療組以外，動(dòng)物還將接受以下額外治療中的一種1.二磷酸鹽(例如，Aredia；Zometa；氯膦酸鹽)2.手術(shù)3.放射性治療4.化療5.激素治療(例如，它莫西芬；抗雄激素治療)6.抗體治療(例如，RNAKL/RANK中和抗體；PTHrP中和抗體)7.治療性蛋白質(zhì)治療(例如，可溶性RANKL受體；OPG，和PDGF，以及MMP抑制劑)8.小分子藥物治療(例如，Src-激酶抑制劑)9.寡核苷酸治療(例如，RANKL或RANK或PTHrP反義鏈)10.基因治療(例如，RANKL或RANK抑制劑)11.肽治療(例如，RANKL突變蛋白)治療組如下。以上的額外治療在下面表示為“加上治療X”1.只有PBS2.只有治療X3.大鼠IgG1同種型對(duì)照4.小鼠IgG1同種型對(duì)照5.只有5H4抗人M-CSF6.只有5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF7.大鼠IgG1和小鼠IgG1同種型對(duì)照聯(lián)合治療8.5H4和5A1聯(lián)合治療
9.大鼠IgG1同種型對(duì)照加上治療X10.小鼠IgG1同種型對(duì)照加上治療X11.5H4抗人M-CSF加上治療X12.5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF加上治療X13.大鼠IgG1和小鼠IgG1同種型對(duì)照聯(lián)合治療加上治療X14.5H4和5A1聯(lián)合治療加上治療X劑量每種抗體以0.1-30mg/kg的劑量施用給每個(gè)動(dòng)物。優(yōu)選的劑量為10mg/kg。施用途徑可以是IV、IP、SC。優(yōu)選的途徑為腹膜內(nèi)(IP)。治療開始于注射腫瘤細(xì)胞后的第二天，如實(shí)施例5中所述，見上。
檢測(cè)。為了評(píng)估各治療組之間骨質(zhì)溶解的嚴(yán)重程度，每只小鼠在注入腫瘤細(xì)胞后的一天接受基線Faxitron成像。研究最后(8周后)，再接受Faxitron成像。由于腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)熒光素酶，用Xenogen系統(tǒng)可同步測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)。與單獨(dú)實(shí)施抗體治療相比，預(yù)計(jì)將聯(lián)合治療用于治療和預(yù)防與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的嚴(yán)重溶骨性疾病會(huì)改善療效。
實(shí)施例9以下的實(shí)施例提供了，用熒光激發(fā)細(xì)胞分選法來(lái)評(píng)估M-CSF特異性抗體與例如乳腺癌細(xì)胞(細(xì)胞系MDA 231)或多發(fā)性骨髓瘤癌細(xì)胞(細(xì)胞系A(chǔ)RH 77)之間結(jié)合能力的方案。
首先，用PBS(無(wú)Ca2+、Mg2+)洗滌細(xì)胞2次。在每個(gè)10cm的培養(yǎng)皿中加入2ml的3mM EDTA，然后把培養(yǎng)皿在37℃的條件下培養(yǎng)2-3分鐘，直到細(xì)胞變圓并開始脫離培養(yǎng)皿。然后，加入10ml緩沖液A(PBS+5％FBS)，并混合。此時(shí)，沉淀細(xì)胞并將細(xì)胞重新懸浮于PBS+5％FBS中，約5×106細(xì)胞/ml，再將細(xì)胞接種于小管中，100微升/樣品。
此時(shí)，加入0.1-1.0μg/ml的原始抗體(按所示濃度使用M-CSF抗體或?qū)φ湛贵w)。如果需要，以5％的FBS/PBS進(jìn)行稀釋。然后，將混合物在4℃條件下培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)以后，用400g離心5分鐘，洗滌細(xì)胞3次，并且重新懸浮于PBS中。
用1％的BSA/PBS稀釋FITC或PE標(biāo)記的抗IgG抗體(0.25μg/樣品)至最佳稀釋度，然后將細(xì)胞重新懸浮于此溶液中，4℃培養(yǎng)30分鐘。接著，如上所述將細(xì)胞洗滌3次。洗滌后，用0.5ml/樣品PI-PBS將細(xì)胞重新懸浮(如果需要區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞)。也可以固定細(xì)胞留作以后分選之用(如果用0.1％的甲醛固定，細(xì)胞可以持續(xù)約3天)。然后，采用標(biāo)準(zhǔn)步驟使用熒光激發(fā)FACS分析細(xì)胞。
如圖8A和8B所示，M-CSF特異性抗體在一系列所示的抗體濃度下，與乳腺癌細(xì)胞系MDA 231或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RH77發(fā)生結(jié)合。
實(shí)施例10以下的實(shí)施例表明，M-CSF普遍存在于很多的癌細(xì)胞表面。用M-CSF特異性抗體對(duì)M-CSF進(jìn)行免疫組化染色，操作如下。
首先，將載玻片在55-60℃的烤箱中加熱1小時(shí)，并且冷卻2-3分鐘。采用以下的脫蠟和再水化(re-hydration)參數(shù)a二甲苯 3×5分鐘b100％醇試劑 2×5分鐘c95％醇試劑 2×4分鐘d75％醇試劑 2×3分鐘e50％醇試劑 1×3分鐘g去離子水 2-3次快速漂洗在過氧化封閉步驟之前，用1×Biogenex Citra Plus制備抗原檢索玻片(retrieval)。該溶液首先用微波爐最高火力煮沸。一旦溶液沸騰，立即將微波爐火力調(diào)至2檔，加熱13分鐘，放涼后再使用。過氧化封閉步驟如下進(jìn)行。將載玻片浸入3％的H2O2中(將25ml的30％溶液稀釋于250ml去離子水中)，并在室溫下放置10分鐘。然后用去離子水漂洗載玻片2次，并用1×PBS洗滌2×2分鐘。
親和素/生物素封閉步驟如下進(jìn)行。將載玻片放平于金屬支架上。在組織周圍使用藍(lán)色的PAP筆(疏水玻片標(biāo)記)。然后，加入2滴Zymed親和素(試劑A)-足夠覆蓋組織，再將載玻片于室溫下孵育10分鐘。孵育后，用以下方法洗滌載玻片1×PBS中洗滌2×3分鐘2滴Zymed生物素(試劑B)，室溫下10分鐘1×PBS中洗滌2×3分鐘蛋白質(zhì)封閉步驟操作如下。首先，加入第二抗體物質(zhì)的10％血清(至2％的終濃度)。然后用去離子水將BioGenex Power Block稀釋至1×。載玻片的支架浸Power Block中，室溫下8分鐘，然后用1×PBS將載玻片漂洗2次。
為了加入原始抗體，將載玻片平放于金屬支架上。加入抗體覆蓋每個(gè)區(qū)域(～350μl)，用移液管尖鋪開抗體(如果需要)，但不要刮到組織。然后在室溫下孵育載玻片1小時(shí)。孵育后，用1×PBS洗滌載玻片3次，每次3-5分鐘。此時(shí)，將BioGenex Multi-Link加到區(qū)域上，并在室溫下孵育10-11分鐘。然后，洗滌載玻片，每次3分鐘。
對(duì)區(qū)域施用BioGenex HRP標(biāo)記物，然后在室溫下孵育10-11分鐘，并用1×PBS洗滌載玻片3×3分鐘。隨后，在切片上加入BioGenex H2O2底物(每2.5mlH2O2加入1滴AEC)，并在室溫下孵育10分鐘。然后，切片用去離子水漂洗幾次。復(fù)染色步驟如下進(jìn)行。在室溫下用蘇木精對(duì)切片染色1分鐘。然后，用H2O漂洗切片2次，再在1×PBS中孵育1分鐘。然后用H2O充分漂洗切片以除去PBS。在切片上加1滴BioGenex Super Mount，并在室溫下空氣干燥過夜，以此對(duì)其進(jìn)行封固。
如圖9所示，M-CSF廣泛存在于很多腫瘤細(xì)胞的表面。所示腫瘤細(xì)胞類型的切片如下記分0無(wú)染色1染色與背景類似2陽(yáng)性，但是染色弱3陽(yáng)性，并且顯著染色4陽(yáng)性，并且強(qiáng)染色在本說明書和/或申請(qǐng)數(shù)據(jù)表中提及的所有上述美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)出版物、美國(guó)專利申請(qǐng)、國(guó)外專利、國(guó)外專利申請(qǐng)和非專利出版物，都全文引入本文作為參考。
從上述描述中，應(yīng)理解到，盡管出于闡述目的描述了本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下進(jìn)行各種改動(dòng)。因此，本發(fā)明除了受到所附權(quán)利要求的限制之外，并不受實(shí)施例的限制。
序列表<110>齊默爾曼，等人(Zimmerman et al.)<120>防止和治療癌轉(zhuǎn)移以及與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨質(zhì)損失的方法<130>27527/39636A<150>US 60/426,781<151>2002-11-15<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1855<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(190)..(960)<220>
<221>sig_peptide<222>(190)..(285)<220>
<221>mat_peptide<222>(286)..(957)<400>1gagggctggc cagtgaggct cggcccgggg aaagtgaaag tttgcctggg tcctctcggc60gccagagccg ctctccgcat cccaggacag cggtgcggcc ctcggccggg gcgcccactc120cgcagcagcc agcgagcgag cgagcgagcg agggcggccg acgcgcccgg ccgggaccca180gctgcccgt atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc tgc cct ccc acg aca231Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr1 5 10tgg ctg ggc tcc ctg ctg ttg ttg gtc tgt ctc ctg gcg agc agg agt 279Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser15 20 25 30atc acc gag gag gtg tcg gag tac tgt agc cac atg att ggg agt gga 327Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly35 40 45cac ctg cag tct ctg cag cgg ctg att gac agt cag atg gag acc tcg 375His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser50 55 60tgc caa att aca ttt gag ttt gta gac cag gaa cag ttg aaa gat cca 423Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro65 70 75gtg tgc tac ctt aag aag gca ttt ctc ctg gta caa gac ata atg gag 471Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu80 85 90
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Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn275 280 285Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val290 295 300Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly305 310 315 320Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu325 330 335Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala340 345 350Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly His Glu Arg Gln355 360 365Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln LeuG ln Glu Ser Val Phe His Leu370 375 380Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu385 390 395 400Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp405 410 415Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg420 425 430Gln Val Glu Leu Pro Val435<210>7<211>3985<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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<220>
<221>misc_feature<222>(917)..(1177)<223>免疫球蛋白<220>
<221>misc_feature<222>(2516)..(3022)<223>酪氨酸激酶，催化域<400>7gaagggcaga cagagtgtcc aaaagcgtga gagcacgaag tgaggagaag gtggagaaga60gagaagagga agaggaagag gaagagagga agcggaggga actgcggcca ggctaaaagg120ggaagaagag gatcagccca aggaggagga agaggaaaac aagacaaaca gccagtgcag180aggagaggaa cgtgtgtcca gtgtcccgat ccctgcggag ctagtagctg agagctctgt240gccctgggca ccttgcagcc ctgcacctgc ctgccacttc cccaccgagg cc atg ggc298Met Gly1cca gga gtt ctg ctg ctc ctg ctg gtg gcc aca gct tgg cat ggt cag 346Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His Gly Gln5 10 15gga atc cca gtg ata gag ccc agt gtc cct gag ctg gtc gtg aag cca 394Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro20 25 30gga gca acg gtg acc ttg cga tgt gtg ggc aat ggc agc gtg gaa tgg 442Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp35 40 45 50gat ggc ccc cca tca cct cac tgg acc ctg tac tct gat ggc tcc agc 490Aap Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser55 60 65agc atc ctc agc acc aac aac gct acc ttc caa aac acg ggg acc tat 538Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr70 75 80cgc tgc act gag cct gga gac ccc ctg gga ggc agc gcc gcc atc cac 586Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His85 90 95ctc tat gtc aaa gac cct gcc cgg ccc tgg aac gtg cta gca cag gag 634Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu100 105 110gtg gtc gtg ttc gag gac cag gac gca cta ctg ccc tgt ctg ctc aca 682Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr115 120 125 130gac ccg gtg ctg gaa gca ggc gtc tcg ctg gtg cgt gtg cgt ggc cgg 730Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg135 140 145
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Glu Trp Asp Gly Pro Prp Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly50 55 60Ser Ser Ser Ile Ler Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly65 70 75 80Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala85 90 95Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala100 105 110Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu115 120 125Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg130 135 140Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His145 150 155 160Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln165 170 175Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg180 185 190Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val195 200 205Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys210 215 220Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn225 230 235 240Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg245 250 255Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His260 265 270Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser275 280 285Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser290 295 300
Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn305 310 315 320Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp325 330 335Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala340 345 350Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu355 360 365Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg370 375 380Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr385 390 395 400Pro Pro Glu Cal Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr405 410 415Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu420 425 430Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln435 440 445Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His450 455 460Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn465 470 475 480Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp485 490 495Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu500 505 510Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu515 520 525Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro530 535 540Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser545 550 555 560
Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu565 570 575Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala580 585 590Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp595 600 605Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala610 615 620Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu625 630 635 640Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly645 650 655Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu660 665 670Ash Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser675 680 685Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu690 695 700Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val705 710 715 720Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser725 730 735Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu740 745 750Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe755 760 765Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val770 775 780Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala785 790 795 800Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg805 810 815
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權(quán)利要求
1.一種防止骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，該方法包括給患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑，從而防止與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。
2.一種治療患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象方法，其特征在于，該方法包括給該對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑，從而降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的對(duì)象為哺乳動(dòng)物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物為人。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組a)包含抗-M-CSF抗體的多肽；b)包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；c)包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或d)包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑為抗-M-CSF抗體。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑為包含抗-M-CSFR抗體的多肽。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑為包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑為包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
12.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該抗體所結(jié)合的抗原表位和單克隆抗體5H4(ATCC保藏號(hào)HB10027)所結(jié)合的抗原表位相同。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)移性癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、血細(xì)胞癌包括白血病和淋巴瘤；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。
15.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，M-CSF拮抗劑是一種抗體，其施藥量在約0.01mg/kg和約100mg/kg之間。
16.一種用于治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象的、與M-CSF相結(jié)合的非鼠源性抗體，其特征在于，所述的抗體有效地降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重性。
17.一種非鼠源性單克隆抗體，其特征在于，它特異結(jié)合的M-CSF的抗原表位與單克隆抗體5H4所結(jié)合的抗原表位相同。
18.一種非鼠源性單克隆抗體，其特征在于，它與單克隆抗體5H4競(jìng)爭(zhēng)性地與M-CSF相結(jié)合，結(jié)合率高于75％。
19.一種用于治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象的、與M-CSFR相結(jié)合的非鼠源性抗體，其特征在于，所述的抗體有效地降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重性。
20.如權(quán)利要求16所述的抗體，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
21.如權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于，該抗體對(duì)M-CSF具有特異性。
22.如權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于，該抗體對(duì)M-CSFR具有特異性。
23.如權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于，所述的抗體是完全的人抗體。
24.如權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于，所述的抗體是人源化抗體。
25.一種分泌出權(quán)利要求23所述抗體的雜交瘤細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于，癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、血細(xì)胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。
27.一種藥物組合物，其特征在于，它包含權(quán)利要求17到26中任一種抗體，和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
28.一種篩選M-CSF拮抗劑的方法，其特征在于，它包括以下步驟a)使轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基、破骨細(xì)胞和候選拮抗劑相接觸；b)檢測(cè)破骨細(xì)胞的生成、增殖和/或分化；和c)如果檢測(cè)到破骨細(xì)胞的生成、增殖和/或分化有所減少，那么所述的候選拮抗劑就被確定為M-CSF拮抗劑。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基包括腫瘤細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述的接觸步驟(a)在體內(nèi)進(jìn)行，所述的檢測(cè)步驟(b)包括檢測(cè)骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的大小和/或數(shù)目，并且如果檢測(cè)到骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的大小和/或數(shù)目有所降低，那么所述的候選拮抗劑則被確定為M-CSF拮抗劑。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟確定所述的候選拮抗劑是否與M-CSF相結(jié)合。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟確定所述的候選拮抗劑是否抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。
33.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述的候選拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組a)包含抗-M-CSF抗體的多肽；b)包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；c)包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；d)包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；e)肽；或f)小分子。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候選拮抗劑是M-CSF的突變蛋白。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候選拮抗劑是M-CSFR的突變蛋白。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候選拮抗劑是抗-M-CSF抗體。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候選拮抗劑是抗-M-CSFR抗體。
38.一種確定可以防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的M-CSF拮抗劑的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)檢測(cè)候選拮抗劑與M-CSF的結(jié)合；和(b)測(cè)定所述候選拮抗劑在體外或體內(nèi)防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的能力。
39.一種確定可以防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的M-CSF拮抗劑的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)檢測(cè)候選拮抗劑與M-CSFR的結(jié)合；和(b)測(cè)定所述候選拮抗劑在體外或體內(nèi)防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的能力。
40.一種確定可以防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的M-CSF拮抗劑的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)確定能夠抑制M-CSF和M-CSFR之間相互作用的候選拮抗劑；和(b)測(cè)定所述候選拮抗劑在體外或體內(nèi)防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的能力。
41.一種防止骨質(zhì)轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)的方法，該方法包括，給患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑和治療劑，從而防止與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失并防止腫瘤生長(zhǎng)。
42.一種治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象的方法，該方法包括，給所述對(duì)象施用治療有效量的M-CSF拮抗劑和治療劑，從而降低與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度并抑制腫瘤生長(zhǎng)。
43.如權(quán)利要求41或42所述的方法，其特征在于，所述的對(duì)象為哺乳動(dòng)物。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物為人。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述的拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述的拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組a)包含抗-M-CSF抗體的多肽；b)包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；c)包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；和d)包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
49.如權(quán)利要求41或42所述的方法，其特征在于，治療劑是二磷酸鹽。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述的二磷酸鹽是卓樂膦酸鹽、帕米膦酸鹽、氯膦酸鹽、依替膦酸鹽、替魯膦酸鹽、阿倫膦酸鹽或伊班膦酸鹽。
51.如權(quán)利要求41或42所述的方法，其特征在于，治療劑是化療劑。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，對(duì)象不接受二磷酸鹽治療。
53.如權(quán)利要求41或42所述的方法，其特征在于，M-CSF拮抗劑能有效地降低要達(dá)到一定治療效果所需的治療劑的劑量。
54.如權(quán)利要求41或42的方法，其特征在于，還包括以下步驟施用非M-CSF型集落刺激因子，例如G-CSF。
55.一種包含M-CSF拮抗劑和癌癥治療劑的藥物組合物。
56.一種包裝、藥瓶或容器，其特征在于，它包括含有M-CSF拮抗劑的藥物以及使用說明，該使用說明是所述藥物應(yīng)當(dāng)與手術(shù)或放療聯(lián)合使用。
57.一種防止或治療向骨轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟給對(duì)象施用M-CSF拮抗劑并用手術(shù)或放療治療所述對(duì)象。
58.一種靶向在細(xì)胞表面上表達(dá)膜結(jié)合M-CSF的腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括步驟施用一種特異結(jié)合于所述的膜結(jié)合M-CSF的胞外部分的抗體。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述的抗體偶聯(lián)于放射性核素或其它毒素上。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
61.一種治療患有癌癥的對(duì)象的方法，其中組成所述癌癥的細(xì)胞不分泌M-CSF，其特征在于，該方法包括以下步驟施用M-CSF拮抗劑。
62.一種防止骨轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，該方法包括給患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用一定劑量的M-CSF拮抗劑，使之有效地中和所述對(duì)象的細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF，所述的劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF的劑量。
63.一種治療患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象的方法，其特征在于，該方法包括給患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象施用一定劑量的M-CSF拮抗劑，使之有效地中和所述對(duì)象的細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF，該劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF的劑量。
64.如權(quán)利要求16-25中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，用于藥物。
65.一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以防止患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。
66.一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以防止患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象發(fā)生與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。
67.一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以治療患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象。
68.一種M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以降低患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象中所發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。
69.如權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
70.如權(quán)利要求69所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是人。
71.如權(quán)利要求70所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。
72.如權(quán)利要求71所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。
73.如權(quán)利要求71所述的用途，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組a)包含抗-M-CSF抗體的多肽；b)包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；c)包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或d)包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
74.如權(quán)利要求73所述的用途，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
75.如權(quán)利要求74所述的用途，其特征在于，所述的抗體對(duì)M-CSF具有特異性。
76.如權(quán)利要求75所述的用途，其特征在于，所述的抗體是抗體5H4。
77.如權(quán)利要求74所述的用途，其特征在于，所述的抗體對(duì)M-CSFR具有特異性。
78.如權(quán)利要求73所述的抗體，其特征在于，癌癥是乳房癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、血細(xì)胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；頭部和頸部癌癥；胃腸道癌癥，包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。
79.如權(quán)利要求65-68中任一所述的用途，其特征在于，M-CSF拮抗劑是一種抗體，該抗體的施用劑量在約0.01mg/kg和100mg/kg之間。
80.一種權(quán)利要求16-25中任一所述的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用以治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象。
81.一種權(quán)利要求16-25中任一所述的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用以降低患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象中所發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度。
82.M-CSF拮抗劑和一種治療劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以防止發(fā)生在患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象身上的骨轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)。
83.M-CSF拮抗劑和一種治療劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以防止發(fā)生在患有轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象身上的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。
84.M-CSF拮抗劑和一種治療劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以治療轉(zhuǎn)移性癌癥。
85.M-CSF拮抗劑和一種治療劑在制備藥物中的用途，所述藥物用以降低在患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象身上所發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度以及抑制腫瘤生長(zhǎng)。
86.一種產(chǎn)品，其特征在于，它包含M-CSF拮抗劑和一種治療劑，作為組合制劑而同時(shí)、分別或依次應(yīng)用于癌癥的治療。
87.M-CSF拮抗劑在制備藥物中的用途，其中所述藥物用以防止和治療骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥，所述藥物與一種癌癥治療劑同時(shí)、分別或依次地施用。
88.一種癌癥治療劑在制備藥物中的用途，其中所述藥物用以防止和治療骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥，所述藥物與M-CSF拮抗劑同時(shí)、分別或依次地施用。
89.一種包裝、藥瓶或容器，其特征在于，它包括含有M-CSF拮抗劑的藥物以及使用說明，所述使用說明是藥物應(yīng)當(dāng)與手術(shù)或放療聯(lián)合使用。
90.如權(quán)利要求82-85中任一所述的用途，其特征在于，所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
91.如權(quán)利要求86所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是人。
92.如權(quán)利要求90所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑抑制M-CSF和其受體M-CSFR之間的相互作用。
93.如權(quán)利要求82-85任一所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑抑制由腫瘤細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞的增殖和/或分化。
94.如權(quán)利要求92所述的用途，其特征在于，所述的M-CSF拮抗劑選自下列各項(xiàng)所構(gòu)成的組a)包含抗-M-CSF抗體的多肽；b)包含其抗-M-CSFR抗體的多肽；c)包含M-CSF突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或d)包含M-CSFR突變蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
95.如權(quán)利要求94所述的用途，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
96.如權(quán)利要求82-85任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，治療劑是二磷酸鹽。
97.如權(quán)利要求96所述的用途，其特征在于，所述的二磷酸鹽是卓樂膦酸鹽、帕米膦酸鹽、氯膦酸鹽、依替膦酸鹽、替魯膦酸鹽、阿倫膦酸鹽或伊班膦酸鹽。
98.如權(quán)利要求82-85任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，治療劑是化療劑。
99.如權(quán)利要求51所述的用途，其特征在于，對(duì)象不接受二磷酸鹽治療。
100.M-CSF拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備藥物，所述藥物用于降低施用于對(duì)象的、用以治療或防止骨轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)的治療劑的劑量。
101.M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用以防止在患有轉(zhuǎn)移性癌癥對(duì)象身上發(fā)生的骨轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)。
102.M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用以防止在患有轉(zhuǎn)移性癌癥對(duì)象身上發(fā)生的與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失。
103.M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用以治療轉(zhuǎn)移性癌癥。
104.M-CSF拮抗劑、治療劑、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用以在患有轉(zhuǎn)移性癌癥對(duì)象身上降低與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)損失的嚴(yán)重程度以及用以抑制腫瘤生長(zhǎng)。
105.如權(quán)利要求101-103中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，非M-CSF型集落刺激因子是G-CSF。
106.一種抗體的用途，其中該抗體特異結(jié)合于膜結(jié)合M-CSF的胞外部分，其特征在于，所述抗體用于制備藥物，所述藥物用以靶向在細(xì)胞表面上表達(dá)膜結(jié)合M-CSF的腫瘤細(xì)胞。
107.一種抗體的用途，其中該抗體(a)特異結(jié)合于膜結(jié)合M-CSF的胞外部分，并且(b)偶聯(lián)于放射性核素或其它毒素上，其特征在于，所述抗體用于制備治療癌癥的藥物。
108.如權(quán)利要求107所述的用途，其特征在于，所述的抗體選自下列各項(xiàng)構(gòu)成的組a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；c)人源化抗體；c)人抗體；e)嵌合抗體；f)Fab、F(ab’)2或Fv抗體片段；和g)a)至f)中任一個(gè)的突變蛋白。
109.非鼠源性抗-M-CSF抗體在制備癌癥治療藥物中的用途。
110.如權(quán)利要求109所述的用途，其特征在于，組成所述癌癥的細(xì)胞不分泌M-CSF。
111.一定劑量的M-CSF拮抗劑的用途，其中所述的劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量，其特征在于，用于制備防止骨轉(zhuǎn)移的藥物。
112.一定劑量的M-CSF拮抗劑的用途，其中所述的劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用于中和對(duì)象的細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF。
113.一定劑量的M-CSF拮抗劑的用途，其中所述的劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用于治療患有骨轉(zhuǎn)移性的轉(zhuǎn)移性癌癥的對(duì)象。
114.一定劑量的M-CSF拮抗劑的用途，其中所述的劑量大于有效中和癌細(xì)胞所產(chǎn)生的M-CSF劑量，其特征在于，用于制備藥物，該藥物用于治療癌癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了M－CSF拮抗劑，含有M－CSF拮抗劑的藥物組合物，含有藥物組合物的試劑盒，預(yù)防和治療患有轉(zhuǎn)移性癌癥的病人中的骨質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法，篩選M－CSF拮抗劑的方法，以及M－CSF拮抗劑在藥物中的用途和M－CSF拮抗劑在制備防止和治療骨質(zhì)轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1787837SQ200380108828
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者D·L·齊默爾曼, G·哈羅, C·劉, K·科特斯, W·M·卡瓦諾, L·龍 申請(qǐng)人:希龍公司