專利名稱：特異于胰腺胰島β細(xì)胞的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異表達(dá)于胰腺胰島β細(xì)胞的被稱為ZnT-8的蛋白質(zhì)，涉及編碼上述的與胰島素成熟及外排相關(guān)的蛋白質(zhì)的多核苷酸，并涉及它的應(yīng)用，特別是在分選及研究β細(xì)胞和篩選治療糖尿病和高胰島素血癥的藥物上的應(yīng)用。
糖尿病是最常見的疾病之一，它影響了工業(yè)化國家的5％人口并且其發(fā)生率在全球所有國家都在持續(xù)增加(預(yù)計，到2025年將有3億糖尿病患者，包括法國的240萬患者)。在各種形式的糖尿病中，I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病影響著將近500,000到一百萬美國人和150,000法國人，及0.2到0.4％人口。特征性的癥狀包括高水平的血糖和尿糖、嚴(yán)重的利尿、強(qiáng)烈的饑餓感和乏渴感、以及體重減輕。
非胰島素依賴性II型糖尿病(NIDD)也被稱作為“肥胖性”糖尿病或晚期起病糖尿病，常發(fā)生于約50歲左右人群。通過飲食、服用口服藥物的方式治療，在疾病進(jìn)展多年后用胰島素治療。目前，有兩百萬法國人正在接受抗糖尿病藥物和/或胰島素的治療。
盡管通用胰島素注射及控制糖的攝入可以控制糖尿病，但是目前與該疾病相關(guān)的并發(fā)癥需要新的預(yù)防、治療和診斷糖尿病的方法。
胰腺包括兩種在形態(tài)和生理上都有所不同的結(jié)構(gòu)-外分泌胰腺，它產(chǎn)生參與消化的酶(淀粉酶、脂肪酶等)以及碳酸氫鈉。
-內(nèi)分泌胰腺，它產(chǎn)生參與控制血糖的激素(胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽)。
內(nèi)分泌胰腺的細(xì)胞被組合成為以小島形式(朗格漢氏島或胰島)分散于胰腺中的微器官。每個胰島由4種細(xì)胞類型所組成α細(xì)胞、β細(xì)胞、δ細(xì)胞和PP細(xì)胞。α細(xì)胞位于島的周邊并分泌胰高血糖素。β細(xì)胞位于島的中央且是唯一能應(yīng)答于葡萄糖并分泌胰島素的細(xì)胞。δ細(xì)胞位于島的周邊并分泌生長抑素。PP細(xì)胞的功能還有爭議(合成胰多肽)。
研究β細(xì)胞的細(xì)胞模型的缺乏以及適用于該細(xì)胞類型的可靠和有效的細(xì)胞分選方法的缺乏都妨礙了對其功能的研究，并因此妨礙了治療I型和II型糖尿病的新方法的發(fā)展。
在對糖尿病的治療中，除規(guī)律給予胰島素外，用于生理地控制高血糖并將糖尿病患者的高血糖正?；姆椒ㄖ皇腔謴?fù)細(xì)胞的體內(nèi)胰島素分泌。在這個方面，已經(jīng)提出了一些方法-獲得動物的產(chǎn)胰島素細(xì)胞進(jìn)行異種移植；-體外將分離到的干細(xì)胞分化為分泌胰島素的細(xì)胞，再移植，以克服免疫的問題及避免患者免疫抑制治療的需要。但是，通過分化干細(xì)胞廉價地生產(chǎn)大量產(chǎn)胰島素細(xì)胞要求特別適用于分型并純化所分化的細(xì)胞的新的生物分子工具；-胰島移植；近期許多研究的主題都是制備用于治療目的的胰島或β細(xì)胞。移植的第一步是從已經(jīng)被宣布為腦死亡的供體中取出胰腺。胰島的分離從用膠原酶溶液酶消化胰腺開始。不是所有的移植都要求純化所消化的胰島。但是，現(xiàn)在絕大多數(shù)研究者都認(rèn)為純化胰島對于同種異體移植是必需的[2]。然后，通過門靜脈內(nèi)注射移植入有效量(最小3000IEQ/kg)的胰島(IEQ胰島等效量)。
但是，分離胰島或β細(xì)胞需要用于選擇及鑒定β細(xì)胞的特殊及可靠的方法。
以往的研究已經(jīng)嘗試發(fā)展用于標(biāo)記β細(xì)胞的方法。所提出的方法包括-用GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))標(biāo)記，它可熒光標(biāo)記細(xì)胞。這種技術(shù)的主要缺點(diǎn)是需要將外源基因或轉(zhuǎn)基因引入到細(xì)胞內(nèi)，更甚者是需使用病毒載體(腺病毒)[1]；-基于β細(xì)胞的大量的自體熒光的技術(shù)[2]。但是，這個技術(shù)缺乏對細(xì)胞類型的特異性。
-將細(xì)胞與鋅特異性熒光素(Newport Green[3]或雙硫腙[3])孵育。這個技術(shù)基于β細(xì)胞內(nèi)大量的鋅含量。鋅是胰島素分泌顆粒的一種主要成分，另外它在控制胰島素的分泌上發(fā)揮著作用[5]。但是，這些技術(shù)有著許多缺點(diǎn)使用化學(xué)品、對β細(xì)胞的毒性危險、缺乏對細(xì)胞類型的特異性。另外，雙硫腙有著快速光降解的問題[6]；-通過用T細(xì)胞克隆(WO 91/17186)對β細(xì)胞所表達(dá)的抗原的識別來間接驗(yàn)證。對該抗原的最初研究沒有提供肽序列特征的結(jié)果，也沒有提供對β細(xì)胞以及胰島和胰腺或生物體的其他細(xì)胞類型的選擇性的結(jié)果。相同作者的更新研究顯示該抗原有著更廣泛的分布，因此該抗原是非特異于β細(xì)胞的抗原[7]。
因此，缺乏針對胰腺胰島β細(xì)胞的特異及可靠的標(biāo)記物。
本發(fā)明的一個目的是提供一種這樣的標(biāo)記物。
胰島蓄積了大量的鋅，因此為了在分泌囊泡中蓄積鋅就需要非常有效及非常特異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8]。應(yīng)答于外界刺激例如葡萄糖濃度的增高，通過細(xì)胞外排作用將胰β細(xì)胞所生成并儲存的胰島素釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中。葡萄糖的增高引起ATP/ADP比的改變、鉀通道的關(guān)閉和鈣通道的開放，這就引起細(xì)胞外排胰島素[9]。
已知在有鋅時，胰島素與鋅分別地按4∶1和6∶2的胰島素∶鋅比例結(jié)合形成四聚體和六聚體。胰島素以由與按每個六聚體與2個鋅原子結(jié)合的六聚體所構(gòu)成的固態(tài)形式被儲存于分泌囊泡中。囊泡含有比形成胰島素-鋅六聚體所必需量的1到1.5倍過量的鋅。在外排胰島素期間，富含胰島素的囊泡與β細(xì)胞的細(xì)胞膜融合并將胰島素及鋅釋放到循環(huán)中。所釋放的鋅作用于鉀通道的負(fù)反饋環(huán)，造成鉀通道的活化及細(xì)胞外排的終止。
在哺乳動物細(xì)胞中，已經(jīng)克隆并描述了7種具有鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的同源蛋白質(zhì)，稱作為ZnT-1、-2、-3、-4、-5、-6和-7。對這些蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析使得確定出一個由6個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個富含組氨酸的細(xì)胞內(nèi)環(huán)所構(gòu)成的共同結(jié)構(gòu)單位成為可能。ZnT-1是一種定位于細(xì)胞膜上的遍在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它保證鋅流到細(xì)胞外[11]。ZnT-2容許細(xì)胞耐受培養(yǎng)基中的過量的鋅，從而通過將鋅定位于酸性的細(xì)胞漿內(nèi)囊泡中獲得對鋅的耐受性，因此保證鋅在細(xì)胞內(nèi)遠(yuǎn)高出正常水平的蓄積[12]。已經(jīng)克隆出人的ZnT-3和ZnT-4，它們具有與ZnT-2相似的功能。ZnT-3特異于某些組織，被強(qiáng)烈地表達(dá)于腦部、富含鋅的突觸囊泡膜、海馬的苔狀纖維以及睪丸中。ZnT-4被遍在地表達(dá)，但是高水平的表達(dá)見于腦部和上皮細(xì)胞中。這個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在哺乳動物的上皮中是重要的，它參與控制母乳中的鋅含量。ZnT-5和ZnT-6也是定位于高爾基體的遍在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ZnT-7是一種特異地定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的遍在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
先前研究提出了一種搜索參與胰腺β細(xì)胞的鋅代謝的基因的方法。這些研究沒有證實(shí)一種特異的蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]。
本發(fā)明者已經(jīng)分離出一個1110個堿基對的多核苷酸(SEQ IDNO.1)，它代表相應(yīng)于在胰島中特異表達(dá)的，以及更特異地是在分泌胰島素的細(xì)胞或β細(xì)胞中特異表達(dá)mRNA的cDNA。
本發(fā)明的多核苷酸編碼被稱為ZnT-8(SEQ ID NO.2)的蛋白質(zhì)，這是一種369個氨基酸的蛋白質(zhì)，所估計的分子量為40.8KDa，具有與ZnT家族蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)同源的一級結(jié)構(gòu)。編碼所述蛋白質(zhì)的基因被稱為ZnT-8。
對完整的ZnT-8蛋白質(zhì)的跨膜電位的研究顯示它具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域(第74-95、107-126、141-163、177-196、216-240和246-267位氨基酸)及定位于胞漿內(nèi)的N和C末端。這個研究也顯示該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)具有3個細(xì)胞外氨基酸環(huán)(第96-106、164-176和241-245位氨基酸)。
另外，ZnT-8蛋白質(zhì)在胰島素分泌囊泡及在細(xì)胞膜上的定位說明它參與了鋅在含胰島素囊泡內(nèi)的蓄積，因此它在胰腺胰島β細(xì)胞內(nèi)的胰島素的成熟及外排上發(fā)揮著作用。
ZnT-8蛋白質(zhì)及相應(yīng)的多核苷酸第一次被用作為胰腺胰島β細(xì)胞的特異的和可靠的標(biāo)記物；這種標(biāo)記物的用途具體的如下所述-細(xì)胞分選該標(biāo)記物使得肉眼可見地選擇性分選及檢測β細(xì)胞成為可能，它不需要化學(xué)地或生物地修飾所述的細(xì)胞，特異地是用針對所述蛋白質(zhì)的抗體。
-體外研究模型該標(biāo)記物可被用于體外研究(i)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZnT-8)在模型細(xì)胞系(例如INS-1小鼠胰島素瘤細(xì)胞系)中的過表達(dá)及對應(yīng)答于葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響；(ii)細(xì)胞對氧化應(yīng)激條件或者低或高鋅濃度所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)的敏感性；以及(iii)應(yīng)答于各種外源性刺激(生長因子、胰腺提取物)，干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的過程。
-篩選藥物該標(biāo)記物也代表一種用于篩選能介導(dǎo)ZnT-8基因表達(dá)和/或ZnT-8蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的有用的藥理學(xué)靶點(diǎn)，該物質(zhì)有可能被用于糖尿病和高胰島素血癥的治療。
-糖尿病的診斷多核苷酸也可被便利地用于在高危家族中早期診斷糖尿病，具體地是它使得檢測ZnT-8基因中的可見突變以及減少或甚至減免通常所進(jìn)行的檢查成為可能。
因此，本發(fā)明的一個主題是作為胰腺胰島β細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的至少一種分離的多核苷酸或相應(yīng)蛋白質(zhì)的用途，這些多核苷酸選自-包括或具有以下序列之一的多核苷酸(a)序列SEQ ID NO.1；(b)序列SEQ ID NO.1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，優(yōu)選的是20個核苷酸，甚至更優(yōu)選的是25到30個核苷酸的片段；(c)一種在最佳比對后，與(a)或(b)中所定義的序列之一具有至少80％相同性百分比的序列；以及(d)一種與(a)、(b)或(c)中所定義的序列之一互補(bǔ)的有義或反義序列；以及-由上述(a)、(b)、(c)或(d)中所定義的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)，包括或具有以下序列之一(e)序列SEQ ID NO.2；(f)序列SEQ IDNO.2的至少15個連續(xù)氨基酸的片段；(g)一種在最佳比對后，與(e)或(f)中所定義的序列之一具有至少60％相同性百分比或至少65％相似性的序列，優(yōu)選具有80％相同性或至少90％相似性，或甚至更優(yōu)選具有90％相同性或至少95％相似性。
本發(fā)明包含ZnT-8蛋白質(zhì)以及如上述所定義的相應(yīng)的多核苷酸的用途。
可以從胰島細(xì)胞或細(xì)胞的DNA文庫中，特異地從胰腺細(xì)胞的DNA文庫中，極特異地從人胰腺細(xì)胞的DNA文庫中分離到如上定義的多核苷酸。優(yōu)選地，所用的細(xì)胞是胰島細(xì)胞。
通過在的總DNA上所進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，通過在胰腺胰島β細(xì)胞的總RNA上所進(jìn)行的RT-PCR，或通過化學(xué)合成也可以得到如上定義的多核苷酸。
為了本發(fā)明的目的，采用了以下的定義。
名詞“多核苷酸”的意思是修飾或未修飾核苷酸的一個精確系列，可能包括非天然核苷酸。因此，這個名詞覆蓋了任何編碼ZnT-8蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的一個片段的序列(基因組DNA、mRNA、cDNA)，也覆蓋了對應(yīng)的有義或反義寡核苷酸以及對應(yīng)的小干擾RNA(siRNA)。
“在最佳比對后與參照序列具有某一相同性百分比的核酸或蛋白質(zhì)”用于表示與參照序列比較具有某些改變的核酸或蛋白質(zhì)，例如具體為缺失、截斷、延伸、嵌合融合和/或取代，具體的是點(diǎn)取代，以及在最佳比對后表現(xiàn)為與參照核苷酸或氨基酸序列具有至少80％相同性的核苷酸序列或至少65％相同性的氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)。
兩個序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)之間的“相同性百分比”用于表示在最佳比對后所得到的兩個所對比的序列之間的同一的核苷酸或氨基酸殘基的百分比，這個百分比是純粹統(tǒng)計上的百分比，以及兩個序列之間的差異是隨機(jī)分布的且分布于序列的全長內(nèi)。
名詞“最優(yōu)比對”或“最佳比對”用于表示通過下文所述的比對所確定的相同性百分比是最高的。按慣例進(jìn)行兩個核苷酸或氨基酸序列之間的比較在將這些序列最佳比對之后比較這些序列，通過片段或通過“比較窗”進(jìn)行比較以辨別并比較序列的局部區(qū)域的相似性。具體地用以下算法的其中一種可以進(jìn)行比較序列的最佳比對Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988)的相同性搜索方法、使用這些算法的計算機(jī)程序(威斯康辛遺傳軟件包(遺傳計算機(jī)組，575 Science Dr.，Madison，WI)或因特網(wǎng)服務(wù)器中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLASTN、BLASTX、TBLASTX、FASTA和TFASTA，特別是那些國立生物技術(shù)信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)、EMBL(http//www.embl.org)和Ensenmbl項(xiàng)目(http//www.ensembl.org)的服務(wù)器)。
為了得到最佳比對，優(yōu)選地用BLOSUM 62矩陣使用BLAST程序。也可以將PAM或PAM250矩陣作為一種用于核苷酸序列的相同性矩陣。
為了得到“特異性雜交”，優(yōu)選地使用高嚴(yán)格性的雜交條件，即所選定的溫度條件和離子強(qiáng)度條件使得它們?nèi)菰S進(jìn)行所要求的互補(bǔ)的多核苷酸之間的特異的及選擇性的雜交。
經(jīng)舉例說明的方法，為了定義上述的多核苷酸的目的，在雜交步驟中的高嚴(yán)格性的條件優(yōu)選地是如下的條件分兩步進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交(1)在42℃含有5×SSC(1×SSC相應(yīng)于0.15MNaCl+0.015M檸檬酸鈉溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、10×Denhardt、5％硫酸右旋糖酐和1％鮭精DNA的磷酸緩沖液中預(yù)雜交3個小時；(2)在一個依賴于探針長度的溫度下雜交20個小時(即，對于比100個核苷酸更長的探針的溫度為42℃)，緊接著是在20℃2×SSC+2％SDS中洗滌20分鐘兩次，在20℃0.1×SSC+0.1％SDS中洗滌1次。對于比100個核苷酸更長的探針，則在60℃0.1×SSC+0.1％SDS中進(jìn)行末次洗滌60分鐘。對于更長或更短的探針，本領(lǐng)域人員可以調(diào)整上述的針對所定義長度的探針的高嚴(yán)格性的雜交條件。
“合適的技術(shù)或方法”在此用于指的是本領(lǐng)域人員所常用的及許多著作所闡述的熟知技術(shù)或方法，例如在名為分子克隆的著作(LaboratoryManual(Sambrook J，Russell DW.(2000)Cold Spring Harbor LaboratoryPress)[13])中所闡述的。
在最佳比對后，c)中所定義的多核苷酸與a)或b)中所定義的序列之一具有至少80％的相同性百分比，優(yōu)選具有90％，更優(yōu)選具有95％，甚至更優(yōu)選具有98％。c)中所定義的多核苷酸包括序列SEQ ID NO.1的變體的多核苷酸，即相應(yīng)于等位基因變體的所有多核苷酸，即相應(yīng)于序列SEQ ID NO.1的單一變異的多核苷酸。這些天然的變異序列相應(yīng)于哺乳動物特別是人所具有的多態(tài)性，以及特別地相應(yīng)于能導(dǎo)致病變出現(xiàn)的多態(tài)性，例如胰島內(nèi)的細(xì)胞死亡和糖尿病。
“變異多核苷酸”也用于表示任何其mRNA將序列SEQ ID NO.1的多核苷酸作為其互補(bǔ)DNA的基因組序列的剪切位點(diǎn)的突變或變異所形成的RNA或cDNA。
當(dāng)排列兩個序列使得能得到兩者之間的最大對應(yīng)性時，根據(jù)同一氨基酸殘基或保守取代而不同的氨基酸殘基的百分比評價蛋白質(zhì)與參照蛋白質(zhì)的相似性。為了本發(fā)明的目的，名詞“保守取代”用于表示用一種具有相似化學(xué)特性(大小、電荷或極性)的氨基酸對另一種氨基酸的取代，這種取代通常不改變蛋白質(zhì)的功能特性。
當(dāng)一種蛋白質(zhì)序列可以包括最多到每100個參照序列的氨基酸的100-X個非保守改變時，在本發(fā)明中該蛋白質(zhì)被定義為有著與參照序列具有至少X％相似性的氨基酸序列。為了本發(fā)明的目的，名詞“非保守改變”包括對參照序列中的氨基酸的刪除、非保守取代、或連續(xù)的或分散的插入。
(g)中所定義的蛋白質(zhì)包括為序列SEQ ID NO.2的變體的蛋白質(zhì)，即由上述所定義的變異多核苷酸所編碼的變異蛋白質(zhì)，具體的是其氨基酸序列相對于序列SEQ ID NO.2具有至少一個突變的蛋白質(zhì)，這些突變具體的是至少一個氨基酸殘基的截斷、缺失、取代和/或添加。
優(yōu)選地，變異蛋白質(zhì)具有與糖尿病或高胰島素血癥相關(guān)的突變。
根據(jù)本發(fā)明的用途的一個有利的實(shí)施方案，如(c)中所定義的所述分離的多核苷酸是序列SEQ ID NO.1的一種變體，它包括一個造成序列SEQ ID NO.1所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變的突變。
根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個有利的實(shí)施方案，如(b)或(d)中所定義的所述分離的多核苷酸選自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物對以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物對。
根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個有利的實(shí)施方案，通過利用上面所定義的引物對的擴(kuò)增可獲得所述分離的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個有利的實(shí)施方案，(d)中所定義的所述多核苷酸是小干擾RNA(siRNA)，通過其與所述多核苷酸的相應(yīng)的mRNA相互作用可引起mRNA降解。
根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個有利的實(shí)施方案，如(g)中所定義的所述蛋白質(zhì)是SEQ ID NO.2的變體，它具有與糖尿病或高胰島素血癥相關(guān)的突變。
根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個有利的實(shí)施方案，(f)中所定義的所述片段具有一個選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10的序列。
本發(fā)明的一個主題也是一個如上面所定義的多核苷酸，除了-NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為No.AX526723、No.AX526725和No.AX526727的序列中所包括的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；-在基因庫數(shù)據(jù)庫中的編號為BM565129、BM310003、BM875526、BG655918、BQ417284、BQ267316、BU072134、BQ267526、BQ270198、BU581447、BU070173、BQ631692和BU949895的EST，以及NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為AX526723、AX526725和AX526727的序列。
本發(fā)明的片段可以被特異地作為用于檢測/擴(kuò)增相應(yīng)于其他生物體的本發(fā)明的多核苷酸的多核苷酸(RNA或基因組DNA)的探針或引物。
優(yōu)選地，可以使用的本發(fā)明的引物對是那些相應(yīng)于序列SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4以及序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所定義的引物對。
本發(fā)明的一個主題也是可以通過利用如上面所定義的引物進(jìn)行擴(kuò)增而得到的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的一個有利的實(shí)施方案，它是一種相應(yīng)于如上面所定義的多核苷酸的小干擾RNA，在長度上少于30個核苷酸，優(yōu)選的長度為20和23個核苷酸之間，通過其與所述多核苷酸的相應(yīng)的mRNA相互作用可引起它們降解。通過本領(lǐng)域人員所熟知的任何方法可以得到這些siRNA，例如通過化學(xué)合成或通過載體的表達(dá)。
發(fā)明包括相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的有義寡核苷酸，通過其與在調(diào)控本發(fā)明的所述多核苷酸的表達(dá)中所涉及的蛋白質(zhì)的相互作用將誘導(dǎo)該表達(dá)的抑制或活化。
為了得到可檢測的和/或可定量的信號，利用本領(lǐng)域人員所熟知的方法可以用放射性或非放射性化合物直接或間接地標(biāo)記本發(fā)明的探針和引物。
用放射性元素或用非放射性分子實(shí)現(xiàn)對本發(fā)明的引物或探針的標(biāo)記。在所用的放射性同位素中，所提及的包括32P、33P、35S、3H或125I。非放射性構(gòu)件選自例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或異羥基洋地黃毒甙元的配體、半抗原、染料和例如放射性發(fā)光物、化學(xué)發(fā)光物、生物發(fā)光物、熒光劑或磷光劑的發(fā)光物。
因此，在使用引物或探針的方法特別是PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)(U.S.NO.4,683,202)中可以將本發(fā)明的多核苷酸用作為引物和/或探針。其他用于擴(kuò)增靶核酸的技術(shù)可以被用作為對PCR的一種替換方法。目前存在用于這種擴(kuò)增的大量方法，例如SDA(鏈取代擴(kuò)增)技術(shù)、TAS(基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增體系)技術(shù)、3SR(自動維持序列擴(kuò)增)技術(shù)、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)技術(shù)、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)技術(shù)、LCR(連接酶鏈反應(yīng))技術(shù)、PCR(修補(bǔ)鏈反應(yīng))技術(shù)、CPR(循環(huán)探針反應(yīng))技術(shù)、和Q-β-復(fù)制酶擴(kuò)增技術(shù)。也提到了PCR-SSCP，這使得檢測點(diǎn)突變成為可能。
當(dāng)然本領(lǐng)域人員非常知道這些技術(shù)。
作為探針或作為引物，本發(fā)明的各種多核苷酸使得或確定生物學(xué)樣品中的所對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄譜或這種轉(zhuǎn)錄譜的任何可能的改變，或證實(shí)所對應(yīng)的基因、該基因的等位基因變體或所述基因內(nèi)的至少一個外顯子的一個或多個核苷酸的突變(插入、缺失或取代)所造成的該基因的任何可能的功能性改變(造成所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性的根本改變)成為可能。這些突變具體地包括在相應(yīng)于定位于對蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性至關(guān)重要的區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基的密碼子的缺失、插入或非保守取代。
因此，本發(fā)明的一個主題是一種用于確定生物學(xué)樣品中的相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因的轉(zhuǎn)錄譜或所述的轉(zhuǎn)錄譜的改變的方法，包括第一步，從生物學(xué)樣品中得到總RNA，第二步，在適合于RNA和探針之間雜交的條件下，將所述RNA與包括本發(fā)明的多核苷酸的標(biāo)記探針相接觸，以及第三步，用任何合適的方式顯示所形成的雜合體。
根據(jù)所述方法的一個實(shí)施方案中，第二步可以是一個利用上面所述的一對引物所實(shí)施的逆轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴(kuò)增的步驟，以及第三步可以是用任何合適的方式顯示所形成的擴(kuò)增的核酸的步驟。
用于確定基因的轉(zhuǎn)錄譜的所述的方法也包括一個由通過與預(yù)先選定的對照樣品比較評價基因的轉(zhuǎn)錄水平，以及任選地研究其與可檢測的表型例如前胰島素轉(zhuǎn)化為成熟胰島素的量、細(xì)胞的胰島素含量、應(yīng)答于葡萄糖的刺激所分泌的胰島素的量、細(xì)胞內(nèi)或囊泡內(nèi)的鋅濃度、或細(xì)胞表面上所表達(dá)的蛋白質(zhì)(基因產(chǎn)物)的量的相關(guān)性所構(gòu)成的步驟。例如所述的對照樣品可以包括一個在相同的條件下可應(yīng)用所述的用于確定基因的轉(zhuǎn)錄譜的方法的具有相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因的正?；蚋淖儽磉_(dá)的生物學(xué)樣品。
本發(fā)明的一個主題也是一種用于確定生物學(xué)樣品中的相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因或所述基因的等位基因變體或該基因的功能性改變的方法，包括第一步，用任何合適的方式從生物學(xué)樣品中得到DNA，第二步，在適合于DNA和探針之間的特異性雜交的條件下將所述DNA與包括本發(fā)明的多核苷酸的標(biāo)記探針相接觸，以及第三步，用任何合適的方式顯示所形成的雜合體。
根據(jù)所述方法的一個有利的實(shí)施方案，第二步可以是用如上所述的一對引物實(shí)施的一個擴(kuò)增步驟，以及第三步可以是一個用任何合適的方式顯示所形成的擴(kuò)增的核酸的步驟。本發(fā)明可以任選地包括第四步，分離并測序所證實(shí)的核酸。
后一方法也可以使得分離相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因的等位基因成為可能，它們與可檢測的表型例如餐后血糖的變化、是否存在胰島素的分泌、應(yīng)答于葡萄糖刺激的循環(huán)葡萄糖的水平或所分泌的胰島素的量相關(guān)，以及通常與I型或II型糖尿病類型的病理或與鋅代謝異常相關(guān)。在胰島素釋放期間所分泌的鋅作用于鉀通道，該通道通過鈣通道引起這種外排作用。因此，這是一種反饋環(huán)[14]。本發(fā)明的多肽涉及于鋅在含有胰島素的囊泡中的蓄積，以及在外排期間它也被發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞膜上。因此蛋白質(zhì)的突變體可以改變囊泡中所含有的鋅的量或鋅在細(xì)胞周邊的濃聚，并因此改變了鉀通道的開放狀態(tài)，依賴于突變體的作用造成了胰島素分泌的減少或增加(I型糖尿病或高胰島素血癥)。在這個特殊的方法中，生物學(xué)樣品將是來源于表達(dá)所述的可檢測表型的個體的樣品。
這些方法，特別是那些基于尋找基因內(nèi)的突變的方法可以容許預(yù)先證實(shí)對糖尿病的易感性，或診斷糖尿病或任何與糖尿病相關(guān)的病變，或?qū)固悄虿≈委煹姆肿踊騽┝康膫€體適應(yīng)性。
本發(fā)明的一個主題也是一種進(jìn)行上述方法的試劑盒，包括a)至少一種本發(fā)明的探針或引物對；b)進(jìn)行所述的探針和/或所述的引物與所測試的生物學(xué)樣品的核酸之間的雜交反應(yīng)所需的試劑；c)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑；d)檢測和/或測定所述的探針和生物學(xué)樣品的核酸所形成的雜合體、或所形成的擴(kuò)增的核酸所需的試劑。
這樣的試劑盒也可以包括用于確保所得到的結(jié)果的質(zhì)量的陽性或陰性對照。它們也可以包括制備生物學(xué)樣品的核酸所需的試劑。
本發(fā)明的另一個主題是一個DNA芯片，包括至少一個本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明的仍另一個主題是如上面所定義的多核苷酸用于制備DNA芯片的用途。本領(lǐng)域人員根據(jù)所選自的支持物能選自用于生產(chǎn)這樣一種芯片的合適的制備技術(shù)，例如通過將寡核苷酸沉淀到玻璃或尼龍支持物上，或經(jīng)化學(xué)或電化學(xué)地植入寡核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸在體外可被用作為研究以下方面的工具a)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZnT-8)在模型細(xì)胞系(例如INS-1胰島素瘤細(xì)胞系)中的過表達(dá)以及對應(yīng)答于葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響；b)細(xì)胞對氧化應(yīng)激條件或者低或高鋅濃度條件所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)的敏感性；c)干細(xì)胞應(yīng)答于各種外來刺激(生長因子、胰腺提取物)分化為胰島素分泌細(xì)胞的過程。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。
為了本發(fā)明的目的，名詞“蛋白質(zhì)”用于表示一個精確的修飾或非修飾氨基酸系列，可能包括非天然氨基酸。
或從β細(xì)胞，或通過化學(xué)合成，或通過重組DNA技術(shù)，具體地是利用包括含有如上所定義的多核苷酸的插入物的表達(dá)載體的重組DNA技術(shù)都能得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及如上所定義的多核苷酸用于生產(chǎn)如上所定義的ZnT-8蛋白質(zhì)的用途。
當(dāng)通過化學(xué)合成得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，可以通過多種已知的肽合成途徑的任何一種途徑得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如使用固相的技術(shù)或使用部分固相的技術(shù)、通過片段濃縮或通過溶液中的傳統(tǒng)合成方法。對于這種情況，可以改變蛋白質(zhì)的序列以改進(jìn)它的可溶性，特別是在水溶劑中的可溶性。本領(lǐng)域人員已知這些改變，例如疏水性區(qū)域的缺失或用親水性氨基酸取代疏水性氨基酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是一種包括或具有序列SEQ ID NO.2的蛋白質(zhì)(相應(yīng)于ZnT-8基因所編碼的蛋白質(zhì))。
本發(fā)明的一個主題也是如上所定義的蛋白質(zhì)的一個片段，其特征在于其選自由序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所組成的組。
本發(fā)明的另一個主題是一種蛋白質(zhì)芯片，它包括如上所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
本發(fā)明的仍另一個主題是如上所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于制備蛋白質(zhì)芯片的用途。與DNA芯片一樣，本領(lǐng)域人員根據(jù)所選定的支持物能選擇用于制備這樣的芯片的合適的制備技術(shù)。
如上所定義的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或蛋白質(zhì)芯片可被用于檢測在個體血清中所存在的針對所述蛋白質(zhì)的抗體。
本發(fā)明也涉及如上所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于免疫化學(xué)和免疫酶學(xué)方法測試的用途，以及用于搜索針對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的自身抗體的用途。
本發(fā)明的一個主題也是克隆和/或表達(dá)被插入本發(fā)明的多核苷酸的載體。
這樣的載體可以包括表達(dá)及任選地分泌宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)所需的元件。
所述的載體優(yōu)選地包括一個啟動子、翻譯起始和終止信號、以及用于轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)控區(qū)。它們被穩(wěn)定地保留于細(xì)胞內(nèi)應(yīng)當(dāng)是可能的，并且它們可以任選地包括編碼特異于分泌所翻譯蛋白質(zhì)的特殊信號，例如強(qiáng)的遍在的啟動子，或一種選擇性地存在于特殊細(xì)胞和/或組織類型例如胰腺的啟動子。根據(jù)所用的細(xì)胞宿主，選擇這些不同的控制序列。
本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到在所選宿主內(nèi)自主復(fù)制的載體或整合到所選宿主中的載體。
在自主復(fù)制的體系中，根據(jù)宿主細(xì)胞，優(yōu)選地使用質(zhì)?；虿《绢愋偷捏w系。病毒載體具體地可以是腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、痘病毒或皰疹病毒。那些本領(lǐng)域人員知道可被用于每一種如此體系的技術(shù)。
當(dāng)需要序列被整合于宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)時，例如使用質(zhì)?；虿《绢愋偷捏w系是可能的，這些病毒是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺伴隨病毒(AAV)。
在非病毒載體中，優(yōu)先使用的載體是裸多核苷酸例如裸DNA或RNA，細(xì)菌人工染色體(BAC)、用于酵母內(nèi)表達(dá)的酵母人工染色體(YAC)、用于小鼠細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的小鼠人工染色體(MAC)以及優(yōu)選地用于人細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的人人工染色體(HAC)。
根據(jù)本領(lǐng)域人員常用的方法制備這些載體，以及用標(biāo)準(zhǔn)方法可以將所形成的重組載體引入到合適的宿主中，例如脂轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、熱休克法、化學(xué)膜透化后的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合。
本發(fā)明的一個主題也是經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞，具體的是原核和真核細(xì)胞，其中至少一種本發(fā)明的多核苷酸或至少一種本發(fā)明的載體已經(jīng)被引入到細(xì)胞中。
在可以被用于本發(fā)明的目的的細(xì)胞中，所提及的細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、動物細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞或植物細(xì)胞。所提及的細(xì)胞也可以包括方法可以實(shí)施于其上的昆蟲細(xì)胞，例如方法可以使用桿狀病毒。
本發(fā)明的一個主題也是非人的轉(zhuǎn)基因生物體，例如轉(zhuǎn)基因動物或植物，其中所有的或一部分細(xì)胞含有游離或整合形式的本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體。
優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明，非人的轉(zhuǎn)基因生物體是那些攜帶由含有無功能的或具有一個突變的本發(fā)明的多核苷酸的細(xì)胞的生物體。
根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因動物優(yōu)選地是哺乳動物，更優(yōu)選地是嚙齒類動物，具體的是小鼠、鼠或兔，以及豬科(Suidae)，具體的是豬。
用本領(lǐng)域人員已知的任何常用方法可以獲得轉(zhuǎn)基因動物，例如通過胚胎干細(xì)胞的同源重組、將這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎內(nèi)、選擇生殖系中被影響的嵌合體以及上述的嵌合體的生長。
因此本發(fā)明的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物或植物可以表達(dá)或過表達(dá)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因或它們的同源基因，或表達(dá)所述的已經(jīng)引入一個突變的基因。
例如可以將轉(zhuǎn)基因動物用作為用于研究糖尿病病因的模型。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體可以被用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)可以純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，可以單獨(dú)或聯(lián)合地用方法從細(xì)胞裂解液和提取物中、或從培養(yǎng)基上清液中純化出蛋白質(zhì)，這些方法例如分餾法、層析法、利用特異的單克隆或多克隆抗體的免疫親和技術(shù)等。優(yōu)選地，根據(jù)一個方法純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，這個方法包括第一步，用離心分離出膜蛋白質(zhì)，隨后是第二步，用T.C.Thomas，M.G.McNamee，(Purification of membrane proteins.Section IX，pp 499-520，in Methods in Enzymology，Guide to ProteinPurification，edited by M.P.Deutscher，vol.182，Academic Press，New York，1990)所描述的免疫親和法純化。
本發(fā)明的一個主題也是用于制備重組ZnT-8蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其包括在容許表達(dá)所述蛋白質(zhì)以及純化所述的重組蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)修飾的細(xì)胞特別是哺乳動物細(xì)胞，或來源于本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因生物體的細(xì)胞。
本發(fā)明的一個主題也是一種蛋白質(zhì)，其特征在于可以用任何一種上述的制備方法得到的蛋白質(zhì)。
如上所示所得到的蛋白質(zhì)可以是糖基化和非糖基化形式，以及可以或可以不具有天然蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明者通過研究跨膜電位的方法也已經(jīng)能夠顯示出本發(fā)明的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)具有3個細(xì)胞外氨基酸環(huán)(第96-106位、164-176位和241-245位氨基酸)，可以制成針對于此的單克隆或多克隆抗體。
因此本發(fā)明的一個主題也是單克隆或多克隆抗體，其特征在于其們能特異地識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，抗體特異地識別序列SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)、它的片段、或如上所定義的所述蛋白質(zhì)的變體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體特異地識別相應(yīng)于SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.10(PEP1、PEP2和PEP4)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞外環(huán)，和/或相應(yīng)于SEQ ID NO.9(PEP3)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。
例如本發(fā)明的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或Fab或F(ab’)2片段。為了得到可檢測的和/或可定量的信號，它們也可以是免疫交聯(lián)物或標(biāo)記抗體的形式。
可以直接從人血清或用本發(fā)明的蛋白質(zhì)接種的動物血清中得到所述的抗體，本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異地是那些由基因重組或肽合成所生成的蛋白質(zhì)。
根據(jù)常用的方法可以得到特異的多克隆抗體。根據(jù)傳統(tǒng)的雜交瘤培養(yǎng)方法可以得到特異的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個主題是一種包括至少一種本發(fā)明的抗體的蛋白質(zhì)芯片。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的抗體用于制備包括所述抗體的蛋白質(zhì)芯片的用途。本領(lǐng)域人員能根據(jù)所選自的支持物選擇用于生產(chǎn)這樣的芯片的合適的制備技術(shù)。
本發(fā)明的一個主題也是本發(fā)明的抗體或抗體芯片用于檢測和/或純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)的用途，優(yōu)選地是所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)環(huán)，優(yōu)選地是相應(yīng)于SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.10的序列。
總而言之，可以在任何必須能觀察到本發(fā)明的正?；蛲蛔兊鞍踪|(zhì)表達(dá)的狀態(tài)下有利地應(yīng)用本發(fā)明的抗體。
具體地，單克隆抗體可以被用于檢測生物學(xué)樣品中的這些蛋白質(zhì)。因此，它們構(gòu)成了一組對特異組織切片中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)分析的方法，具體的是對SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)或它的一種變體。一般地，對于這些分析，所用的抗體可被例如金標(biāo)記方法用免疫熒光化合物所標(biāo)記以成為可檢測的抗體，或酶免疫交聯(lián)物的形式。
具體地它們使得驗(yàn)證這些蛋白質(zhì)在生物學(xué)組織或樣品中的異常表達(dá)成為可能。
本發(fā)明的一個主題也是一種用于檢測生物學(xué)樣品中的ZnT-8蛋白質(zhì)的方法，包括第一步，將生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗體接觸，以及第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證所形成的抗原-抗體復(fù)合物。
本發(fā)明的一個主題也是一種用于進(jìn)行上述方法的試劑盒，包括a)至少一種本發(fā)明的單克隆或多克隆抗體；b)檢測在免疫反應(yīng)期間所形成的抗原-抗體復(fù)合物的試劑；根據(jù)本發(fā)明的一個特殊的實(shí)施方案，試劑盒可以任選地包括用于構(gòu)成容許免疫反應(yīng)的媒介的試劑。
利用人或動物的胰腺，具體的是小鼠、鼠、兔和豬的胰腺，本發(fā)明的抗體也被用于檢測和/或分選胰島，優(yōu)選地是β細(xì)胞。對于分離的細(xì)胞，可以用流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行這樣的分選。對于島，將它們標(biāo)記將改善目前的分離方法用Ficoll、euro-Ficoll或Ficoll-乏影葡胺鈉通過密度梯度的分離，或一種優(yōu)選的方法，它是一種細(xì)胞分離器上的白蛋白質(zhì)梯度。
因此，本發(fā)明的一個主題是一種用于分選胰島β細(xì)胞的方法，包括第一步，將可能含有這些島和/或細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸，第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證抗體所標(biāo)記的細(xì)胞，以及第三步，用任何合適的方式分離所標(biāo)記的細(xì)胞。
本發(fā)明的抗體也可以用于監(jiān)測干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞的過程，這些細(xì)胞特異地是人或動物細(xì)胞，并且也可被用于分選這些在分化后表達(dá)ZnT-8蛋白質(zhì)，具體的是序列SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的一個主題是一種用于監(jiān)測干細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞或分化為β細(xì)胞的過程的方法，包括第一步，將可能含有所述的正在進(jìn)行分化的干細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸，第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證抗體所標(biāo)記的細(xì)胞，以及第三步，用任何合適的方式識別所標(biāo)記的抗體。
所述的方法也可以包括附加步驟包括用任何合適的方式分離所標(biāo)記的細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片可被用于篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與本發(fā)明的多核苷酸相互作用和/或調(diào)控所述多核苷酸的表達(dá)的化學(xué)或生物化學(xué)化合物。
因此，本發(fā)明的一個主題是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與本發(fā)明的多核苷酸相互作用的化學(xué)或生物化學(xué)化合物的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、非人類轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片接觸，以及第二步，檢測在候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、非人類轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片之間所形成的復(fù)合物。
本發(fā)明的一個主題也是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地調(diào)控本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、非人類轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片接觸，以及第二步，用任何合適的方式測定所述多核苷酸的表達(dá)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片可被用于篩選在體外或體內(nèi)能直接或間接地與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相互作用，和/或能調(diào)控所述蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的化學(xué)或生物化學(xué)化合物。
因此，本發(fā)明的一個主題是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)或生物化學(xué)化合物的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、非人類轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片接觸，以及第二步，檢測在候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、非人類轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片之間所形成的復(fù)合物。
本發(fā)明的一個主題也是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地調(diào)控本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、非人類轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片接觸，以及第二步，用任何合適的方式測定所述蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性。
本發(fā)明的一個主題也是用作藥物的本發(fā)明的多核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體、載體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體、載體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞可被用于制備用于預(yù)防和/或治療糖尿病(特別是與存在至少一種相應(yīng)于SEQ ID NO.1的基因的突變、和/或相應(yīng)于SEQ ID NO.2的蛋白質(zhì)的異常表達(dá))，或用于預(yù)防和/或治療高胰島素血癥(當(dāng)觀察到胰島素基因的異常的表達(dá)、成熟或分泌)，或用于調(diào)節(jié)β細(xì)胞內(nèi)的和/或待被修飾以用于分泌胰島素的細(xì)胞內(nèi)的胰島素的成熟和分泌，或用于調(diào)節(jié)β細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象的藥物。
異常表達(dá)的意思是過表達(dá)、表達(dá)低下或表達(dá)突變蛋白質(zhì)。異常成熟的意思是前胰島素不能被蛋白質(zhì)裂解或不能被蛋白質(zhì)充分地裂解為胰島素，或胰島素和鋅在細(xì)胞內(nèi)分泌囊泡內(nèi)不能共結(jié)晶、不充分共結(jié)晶或過多共結(jié)晶。
本發(fā)明的一個主題也是本發(fā)明的蛋白質(zhì)或抗體的多核苷酸用于確定編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因的等位基因變異性、突變、缺失、雜合性的喪失或任何遺傳學(xué)異常。通過分析本發(fā)明的核酸和序列(基因組DNA、RNA或cDNA)以及本發(fā)明的抗體使得直接檢測序列ZnT-8基因中的突變成為可能。特別地，識別具有突變的抗原決定簇的本發(fā)明的抗體的用途使得區(qū)別“正?！钡鞍踪|(zhì)與“與病變相關(guān)的”蛋白質(zhì)成為可能。
本領(lǐng)域人員也知道如何進(jìn)行研究基因表達(dá)的變化的技術(shù)，例如通過具體地用Northern印跡或用本發(fā)明的探針或引物的RT-PCR對mRNA的分析，或通過具體地用利用本發(fā)明的抗體的Western印跡對所表達(dá)的蛋白質(zhì)的分析。
除了上述的內(nèi)容外，本發(fā)明也包括其他在下面的描述中所出現(xiàn)的內(nèi)容，描述指的是進(jìn)行本發(fā)明的實(shí)施例以及附圖，其中-

圖1顯示了通過對編碼ZnT-8蛋白質(zhì)(A)的mRNA的組織表達(dá)的RT-PCR分析，通過比較遍在的肌動蛋白質(zhì)mRNA(B)的表達(dá)。1腦；2心臟；3腎臟；4脾臟；5肝臟；6結(jié)腸；7肺；8小腸；9肌肉；10胃；11睪丸；12胎盤；13唾液腺；14甲狀腺；15腎上腺；16胰腺；17卵巢；18子宮；19前列腺；20皮膚；21白細(xì)胞；22骨髓；23胎腦；24胎肝。只在胰腺(第16列)中檢測了所述mRNA的表達(dá)。
-圖2顯示了對在鼠胰島素瘤細(xì)胞INS-1(第1列)、胎兒(第2列)和成人(第3列)胰島中的編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的mRNA的表達(dá)的分析，通過與上皮細(xì)胞系(Hela細(xì)胞系)的比較。在鼠胰島素瘤細(xì)胞系和成人及胎兒胰島中檢測到了mRNA，而在上皮細(xì)胞(Hela細(xì)胞系)中沒有檢測到任何轉(zhuǎn)錄。將肌動蛋白質(zhì)mRNA用作為對照。
-圖3顯示了對ZnT-8-GFP融合蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞(Hela細(xì)胞系)中的定位的熒光顯微鏡分析。熒光被定位于細(xì)胞漿的囊泡內(nèi)，以及也被定位于細(xì)胞膜上。
-圖4顯示了對ZnT-8-GFP融合蛋白質(zhì)在被轉(zhuǎn)化的鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1細(xì)胞系)中的定位的熒光顯微鏡分析。熒光被定位于分泌囊泡中，說明ZnT-8在胰島素的成熟與外排中的作用。
下面的實(shí)施例只是用于舉例說明本發(fā)明，并不是以任何方式來限制本發(fā)明。
實(shí)施例1克隆編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的cDNA利用可獲得的人基因組序列通過搜索與ZnT家族的基因同源的基因，用生物信息學(xué)確定出被稱為ZnT-8基因的編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的基因。對基因組序列的分析使得定位和確定ZnT-8基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)成為可能。
利用從ZnT-8基因的序列中所確定出的引物對(SEQ ID NO.55’-ACTCTAGAATGGAGTTTCTTGAAAGAACGTA和SEQ ID NO.65’-AATCTAGAGTCACAGGGGTCTTCACAGA)用RT-PCR從根據(jù)在T.Kenmochi等(Pancreas，2000，20，2，184-90)中所給出的技術(shù)所制備的人胰島的mRNA中擴(kuò)增出編碼ZnT-8的cDNA。
更詳細(xì)地，根據(jù)產(chǎn)品說明書，用RNA提取試劑盒(Roche)從胰島中提取出總RNA。然后通過測定在250nm下的吸光度檢測所得到的RNA，并將其保存在-80℃。
根據(jù)產(chǎn)品說明書，用Titan單管RT-PCR試劑盒(Roche)和引物對SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6進(jìn)行擴(kuò)增。在52℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，然后通過30個循環(huán)(94℃30s，53℃30s，72℃1分鐘)及在72℃最后延伸5分鐘的方式擴(kuò)增所合成的cDNA。在存在溴化乙錠時用瓊脂糖凝膠電泳(1.5％)分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)產(chǎn)品說明書用核酸純化試劑盒(QIAGEN)純化包括具有序列SEQ ID NO.1的cDNA序列的1123堿基對的擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例2對編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的mRNA的組織表達(dá)的分析利用下面的引物SEQ ID NO.35’-GAT GCT GCC CAC CTC TTAATT GAC和SEQ ID NO.45’-TCA TCT TTT CCA TCC TGG TCTTGG，用PCR分析編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的mRNA在從各種人組織中制備得到的商業(yè)化cDNA中的表達(dá)。引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)選自兩個不同的外顯子，以編碼擴(kuò)增基因組序列。所測試的組織為1腦；2心臟；3腎臟；4脾臟；5肝臟；6結(jié)腸；7肺；8小腸；9肌肉；10胃；11睪丸；12胎盤；13唾液腺；14甲狀腺；15腎上腺；16胰腺；17卵巢；18子宮；19前列腺；20皮膚；21白細(xì)胞；22骨髓；23胎腦；24胎肝。
更詳細(xì)地，將2μl cDNA與2種特異引物(1μM終濃度)和常用的PCR混和物(1單位Taq DNA聚合酶、含有1.5mM鎂、10mM dNTP的緩沖液)混和。通過30個循環(huán)(94℃30s，53℃230s，72℃1分鐘)及在72℃最后延伸5分鐘的方式進(jìn)行擴(kuò)增。然后在存在溴化乙錠時用瓊脂糖凝膠電泳(1.5％)分析產(chǎn)物。
在圖1中所給出的結(jié)果顯示，通過與用作為對照的肌動蛋白質(zhì)信使(圖1B)的比較，相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的mRNA只在胰腺細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖1A的第16列)，而在其他所分析的23種組織的細(xì)胞內(nèi)都沒有表達(dá)(圖1A的第1到15列及17到24列)。
實(shí)施例3相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的mRNA在胎兒和成人胰腺細(xì)胞內(nèi)及在鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-1)內(nèi)的表達(dá)利用來自各種人組織的RNA胎兒和成人胰島、鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-1，Asfari M.et al.，Endocrinology，1992，130，1，167-78)，用RT-PCR進(jìn)行對編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的mRNA表達(dá)的分析，通過與用作為對照的人上皮細(xì)胞系(Hela)的比較。用磷酸緩沖液(PBS)將106個細(xì)胞洗滌兩次，然后在2000g下離心3分鐘。如在實(shí)施例1中所描述的提取總RNA，并將RNA濃度調(diào)整為1ng/μl(ZnT-8)或1pg/μl(β-激動蛋白質(zhì)對照)。如在實(shí)施例2中所描述的，擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，然后分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
在圖2中所給出的結(jié)果顯示編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的mRNA被表達(dá)于胎兒和成人胰島的細(xì)胞內(nèi)以及鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-1)內(nèi)，但在上皮細(xì)胞系(Hela細(xì)胞系)內(nèi)沒有表達(dá)。
實(shí)施例4ZnT-8/GFP融合蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)是相應(yīng)于SEQ ID NO.1(ZnT-8)的cDNA所編碼的人蛋白質(zhì)。用XbaI限制性內(nèi)切酶消化實(shí)施例1中所得到的1123堿基對的PCR產(chǎn)物，然后將其克隆到載體pcDNA3.1-CT-GFP(Invitrogen)中以得到經(jīng)測序證實(shí)的被稱為pZnT-8-GFP的載體。
將載體pZnT-8-GFP短暫地轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞系(Hela)內(nèi)并將其穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-1)內(nèi)。
將Hela上皮細(xì)胞(ATCC編號CCL-2)培養(yǎng)于加有5％去補(bǔ)體的小牛血清和2mM谷氨酰胺的Opti-MEM培養(yǎng)基中(Modified Eagle’s Medium，Life Technologies)。然后將細(xì)胞在37℃孵育于富含5％CO2的濕化大氣中。
將INS-1細(xì)胞培養(yǎng)于加有胎牛血清(10％)、2-巰基乙-1-醇(50μM)、丙酮酸鈉(1mM)、HEPES(10mM)、L-谷氨酰胺(2mM)、100U/ml青霉素和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI(Life Technologies)。
根據(jù)產(chǎn)品說明書利用Exgen500(Euromedex)用載體pZnT-8-GFP(每106個細(xì)胞1μg DNA)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于35mm Petri培養(yǎng)皿中的細(xì)胞。在用載體ZnT-8-GFP轉(zhuǎn)染后，在加有400μg/ml G418的前述的同一培養(yǎng)基中選擇并克隆INS-1，然后用以下參數(shù)激發(fā)波長450-490nm；發(fā)射波長530nm，在倒置熒光顯微鏡(Axipvert，Zeiss)下觀察克隆的熒光。
在轉(zhuǎn)染48個小時后，通過如上面所說明的對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的INS-1細(xì)胞克隆的熒光觀察分析ZnT-8-GFP融合蛋白質(zhì)在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
在圖3中所給出的結(jié)果(Hela細(xì)胞系)顯示ZnT-8蛋白質(zhì)被定位于細(xì)胞漿內(nèi)囊泡中及定位于細(xì)胞膜上，該定位證實(shí)ZnT-8蛋白質(zhì)具有細(xì)胞外分泌途徑并且位于細(xì)胞的表面。
在圖4中所給出的結(jié)果(INS-1細(xì)胞系)顯示ZnT-8蛋白質(zhì)被定位于胰島素分泌囊泡中；該定位說明ZnT-8參與了胰島素的成熟；另外，因?yàn)樵撛囼?yàn)是在基礎(chǔ)水平(無葡萄糖的刺激)下進(jìn)行的，因此在用葡萄糖刺激后，在胰島素外排期間，蛋白質(zhì)也將存在于細(xì)胞膜上。
實(shí)施例5對ZnT-8蛋白質(zhì)序列的分析用TMpred(http//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)和SOSUI(http//sosui.proteome.bio.tuat-ac.jp/sosuimenu0.html)進(jìn)行對ZnT-8一級序列的分析以及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。
完整的ZnT-8蛋白質(zhì)具有6個預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域(第74-95、107-126、141-163、177-196、216-240和246-267位氨基酸)，N和C末端位于胞漿內(nèi)。
實(shí)施例6針對ZnT-8的細(xì)胞外環(huán)(PEP1、PEP2和PEP4)及針對細(xì)胞內(nèi)環(huán)(PEP3)的多克隆抗體的制備根據(jù)Merrifield等(J.Am.Chem.Soc.，1964，852149-)(1946)最先描述的方法固相合成相應(yīng)于具有序列SEQ ID NO.7PEP1HIAGSLAVVTDAAHLL；SEQ ID NO.8PEP2CERLLYPDYQIQATV；SEQ ID NO.9PEP3CLGHNHKEVQANASVR；和SEQ ID NO.10PEP4YFKPEYKIADPIC的抗原決定簇的肽，將其純化并綴合于一種載體蛋白質(zhì)(例如白蛋白質(zhì))上。根據(jù)以下的接種方案將綴合的肽注射到兔內(nèi)D0首次接種；D14第二次接種；D28第三次接種；D38鑒定特異性；D56第四次接種；D66和D80回收血清。直接使用或用酸性介質(zhì)洗脫在蛋白質(zhì)A柱上純化后使用血清。利用Eurogentec SA，Belgium公司的用戶說明以及要求進(jìn)行這些操作。
實(shí)施例7對在實(shí)施例6中得到的抗體的熒光標(biāo)記通過親和層析法在蛋白質(zhì)G柱(Pharmacia)上純化抗體。將5ml血清轉(zhuǎn)入到用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)平衡的柱(1ml)中，然后用同20ml同一緩沖液洗滌以洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后用0.1M甘氨酸-HCl溶液(pH2.5)分離抗體，然后用40μl 2M Tris-HCl緩沖液(pH10.0)中和。
將2mg抗體稀釋于1ml磷酸緩沖液(pH8.0)中。即時制備NHS-FITC(SIGMA；1mg/ml DMSO)溶液。將75μl NHS-FITC溶液與抗體溶液混和，然后將混和物在室溫下孵育45分鐘。按以下的方式在PD10柱(PHARMACIA)中純化所標(biāo)記的抗體用30ml PBS洗滌柱，裝入1ml需純化的標(biāo)記抗體的溶液以及5ml PBS，最后收集2ml純化物，保存含有標(biāo)記抗體的第二部分純化物。
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<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys1 5 10 15Met His Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val20 25 30Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly35 40 45Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala50 55 60Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile65 70 75 80Cys Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly85 90 95Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr100 105 110Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro115 120 125Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala130 135 140Leu Leu Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr165 170 175Val Met Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu180 185 190Thr Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val195 200 205Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp210 215 220Leu Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe225 230 235 240
Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser245 250 255Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile260 265 270Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys275 280 285Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His290 295 300Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala305 310 315 320Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys325 330 335Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu340 345 350Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys355 360 365Asp<210>3<211>24<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer<400>3gatgctgccc acctcttaat tgac24<210>4<211>24<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer
<400>4tcatcttttc catcctggtc ttgg24<210>5<211>31<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer<400>5actctagaat ggagtttctt gaaagaacgt a31<210>6<211>28<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer<400>6aatctagagt cacaggggtc ttcacaga28<210>7<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7His Ile Ala Gly Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu1 5 10 15<210>8<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr Val1 5 10 15<210>9
<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg1 5 10 15<210>10<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Tyr Phe Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.至少一種分離的多核苷酸或相應(yīng)的蛋白質(zhì)作為胰腺胰島β細(xì)胞的特異性標(biāo)記的用途，所述多核苷酸或相應(yīng)的蛋白質(zhì)選自-包括或具有以下序列之一的多核苷酸(a)序列SEQ ID NO.1，(b)序列SEQ ID NO.1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，(c)在最佳比對后，與(a)或(b)中所定義的序列之一具有至少80％相同性百分比的序列，以及(d)與(a)、(b)或(c)中所定義的序列之一互補(bǔ)的有義或反義序列；和-由上述(a)、(b)、(c)或(d)中所定義的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)，包括或具有以下序列之一(e)序列SEQ ID NO.2，(f)序列SEQ IDNO.2的至少15個連續(xù)氨基酸的片段，(g)在最佳比對后，與(e)或(f)中所定義的序列之一具有至少60％相同性或至少65％相似性百分比的序列，優(yōu)選地具有80％相同性或至少90％相似性，或甚至更優(yōu)選地具有90％相同性或至少95％相似性。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于(c)中所定義的所述分離的多核苷酸是序列SEQ ID NO.1的一種變體，其包括一種突變，所述突變造成由序列SEQ ID NO.1所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變。
3.權(quán)利要求1的用途，其特征在于(b)或(d)中所定義的所述分離的多核苷酸選自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物對以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物對。
4.權(quán)利要求1的用途，其特征在于可利用如權(quán)利要求3中所定義的引物對通過擴(kuò)增得到所述分離的多核苷酸。
5.權(quán)利要求1的用途，其特征在于(d)中所定義的所述多核苷酸是一種小干擾RNA(siRNA)，其通過與所述多核苷酸的相應(yīng)的mRNA相互作用而引起所述mRNA降解。
6.權(quán)利要求1的用途，其特征在于(g)中所定義的所述蛋白質(zhì)是序列SEQ ID NO.2的一種變體，其具有一種與糖尿病或與高胰島素血癥相關(guān)的突變。
7.權(quán)利要求1的用途，其特征在于(f)中所定義的所述片段具有選自序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的序列。
8.一種如權(quán)利要求1中所定義的分離的多核苷酸，其特征在于包括或具有一種序列，所述序列選自(a)序列SEQ ID NO.1，(b)序列SEQ ID NO.1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，但不包括NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為No.AX526723、No.AX526725和No.AX526727的序列中所包含的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，(c)在最佳比對后，與(a)或(b)中所定義的序列之一具有至少80％相同性百分比的一種序列，以及(d)一種與(a)、(b)、(c)或(d)中所定義的序列之一互補(bǔ)的有義或反義序列，但不包括GenBank數(shù)據(jù)庫中的編號為BM565129、BM310003、BM875526、BG655918、BQ417284、BQ267316、BU072134、BQ267526、BQ270198、BU581447、BU070173、BQ631692和BU949895的EST以及NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為AX526723、AX526725和AX526727的序列。
9.一種用于測定、鑒定或檢測相應(yīng)于如權(quán)利要求1中所定義的多核苷酸的核酸的探針，其特征在于其由權(quán)利要求8的多核苷酸組成。
10.用于擴(kuò)增相應(yīng)于如權(quán)利要求1中所定義的多核苷酸的核酸的一對引物，其特征在于其選自如權(quán)利要求3中所定義的引物對。
11.一種利用權(quán)利要求10的引物通過擴(kuò)增所得到的多核苷酸。
12.權(quán)利要求8或權(quán)利要求11的多核苷酸，其特征在于其是一種相應(yīng)于如權(quán)利要求1中所定義的多核苷酸的小干擾RNA，其通過與所述多核苷酸的相應(yīng)的mRNA相互作用而引起所述mRNA降解。
13.一種用于確定生物學(xué)樣品中的相應(yīng)于權(quán)利要求8或權(quán)利要求11的多核苷酸的基因的轉(zhuǎn)錄譜或所述的轉(zhuǎn)錄譜的變化的方法，包括第一步，用任何合適的方式從生物學(xué)樣品中得到RNA，第二步，在適合于RNA和探針之間雜交的條件下，將所述RNA與一種由權(quán)利要求8、9或11中任一項(xiàng)的多核苷酸所組成的標(biāo)記探針相接觸，以及第三步，用任何合適的方式顯示所形成的雜合體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中第二步是一個逆轉(zhuǎn)錄和/或用權(quán)利要求10的一對引物擴(kuò)增所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟，以及第三步是一個用任何合適的方式顯示所擴(kuò)增的核酸的步驟。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其特征在于還包括一個通過與預(yù)先選定的對照進(jìn)行比較而評價基因的轉(zhuǎn)錄水平的步驟。
16.一種用于驗(yàn)證生物學(xué)樣品中的相應(yīng)于權(quán)利要求8或權(quán)利要求11的多核苷酸的基因或所述基因的等位基因變體或該基因的功能變化的方法，包括第一步，用任何合適的方式從生物學(xué)樣品中得到DNA，第二步，在適合于DNA和探針之間的雜交的條件下將所述DNA與由權(quán)利要求8、9或11中任一項(xiàng)的多核苷酸所組成的標(biāo)記探針相接觸，以及第三步，用任何合適的方式顯示所形成的雜合體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中第二步是一個用權(quán)利要求10的一對引物所進(jìn)行的擴(kuò)增步驟，以及第三步是一個用任何合適的方式顯示所形成的擴(kuò)增的核酸的步驟。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其特征在于還包括一個分離及測序所驗(yàn)證的核酸的步驟。
19.一種用于進(jìn)行權(quán)利要求13到18中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，包括(a)至少一種權(quán)利要求9的探針和/或一對權(quán)利要求10的引物；(b)進(jìn)行所述的探針和/或所述的引物與生物學(xué)樣品的核酸之間的雜交反應(yīng)所需的試劑；(c)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑；和(d)測定或檢測所述探針與生物學(xué)樣品的核酸之間所形成的雜合體、或所形成的擴(kuò)增的核酸所需的試劑。
20.DNA芯片，包括至少一種權(quán)利要求8或權(quán)利要求11的多核苷酸。
21.權(quán)利要求8或權(quán)利要求11的多核苷酸用于制備DNA芯片的用途。
22.權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸作為工具在體外用于以下研究中的用途a)由權(quán)利要求8或權(quán)利要求11的多核苷酸所編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在模型細(xì)胞系中的過表達(dá)以及對應(yīng)答于葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響；b)細(xì)胞對氧化應(yīng)激或者低或高鋅濃度條件所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)的敏感性；c)干細(xì)胞應(yīng)答于各種外來刺激而分化為胰島素分泌細(xì)胞的步驟。
23.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于其是由權(quán)利要求8或11的多核苷酸所編碼。
24.權(quán)利要求23的蛋白質(zhì)，其特征在于其包括或具有序列SEQ IDNO.2。
25.權(quán)利要求24的蛋白質(zhì)的片段，其特征在于其選自SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
26.一種蛋白質(zhì)芯片，包括權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的至少一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
27.權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于制備蛋白質(zhì)芯片的用途。
28.權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或權(quán)利要求26的蛋白質(zhì)芯片用于測定個體血清中是否存在針對所述蛋白質(zhì)的抗體的用途。
29.權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)用于通過免疫化學(xué)或免疫酶學(xué)方法測定或搜索針對所述蛋白質(zhì)的自身抗體的用途。
30.一種克隆載體和/或表達(dá)載體，其特征在于其包括一種由權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸所組成的插入物。
31.一種經(jīng)權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求30的載體修飾的細(xì)胞。
32.一種非人類轉(zhuǎn)基因生物體，其特征在于其所有細(xì)胞或一些細(xì)胞包含游離或整合形式的權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求30的載體。
33.權(quán)利要求31的修飾細(xì)胞或權(quán)利要求32的非人類轉(zhuǎn)基因生物體用于生產(chǎn)權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的用途。
34.一種制備權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的方法，其特征在于其包括在容許所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求31的修飾的細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞，或如權(quán)利要求32中所定義的非人類轉(zhuǎn)基因生物體的細(xì)胞，并純化所述的重組蛋白質(zhì)。
35.一種單克隆或多克隆抗體，其特征在于其能特異地識別權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
36.一種蛋白質(zhì)芯片，包括至少一種權(quán)利要求35的抗體。
37.權(quán)利要求35的抗體在制備蛋白質(zhì)芯片中的用途。
38.權(quán)利要求35的抗體或權(quán)利要求36的芯片用于測定和/或純化權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的用途。
39.一種用于測定生物學(xué)樣品中的權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的方法，包括第一步，將生物學(xué)樣品與權(quán)利要求35的抗體相接觸，以及第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證所形成的抗原-抗體復(fù)合物。
40.一種用于進(jìn)行權(quán)利要求39的方法的試劑盒，包括a)一種權(quán)利要求35的單克隆或多克隆抗體；b)用于檢測免疫反應(yīng)期間所生成的抗原-抗體復(fù)合物的試劑。
41.權(quán)利要求35的抗體用于測定和/或分選胰島或β細(xì)胞的用途。
42.權(quán)利要求35的抗體用于分析干細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞、優(yōu)選地分化為β細(xì)胞的用途。
43.一種選擇胰島的β細(xì)胞的方法，包括第一步，將可能含有這些島和/或細(xì)胞的生物學(xué)樣品與權(quán)利要求35的抗體相接觸，第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證標(biāo)記了抗體的細(xì)胞，以及第三步，用任何合適的方式分離所標(biāo)記的細(xì)胞。
44.一種用于分析干細(xì)胞分化成胰島細(xì)胞或分化成β細(xì)胞的方法，包括第一步，將可能含有正在分化的所述干細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與權(quán)利要求35的抗體相接觸，第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證標(biāo)記了抗體的細(xì)胞，以及第三步，用任何合適的方式觀察所標(biāo)記的細(xì)胞。
45.權(quán)利要求44的方法，還包括一個用任何合適的方式分離所標(biāo)記的細(xì)胞的附加步驟。
46.一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與權(quán)利要求8或11的多核苷酸相互作用的化學(xué)或生物化學(xué)化合物的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與權(quán)利要求8或11的多核苷酸或權(quán)利要求31的細(xì)胞或權(quán)利要求32的非人類轉(zhuǎn)基因生物體或權(quán)利要求20的DNA芯片相接觸，以及第二步，測定候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與所述的多核苷酸或細(xì)胞或非人類轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片之間所形成的復(fù)合物。
47.一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地調(diào)控權(quán)利要求8或11的多核苷酸的表達(dá)的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與權(quán)利要求8或11的多核苷酸或權(quán)利要求31的細(xì)胞或權(quán)利要求32的非人類轉(zhuǎn)基因生物體或權(quán)利要求20的DNA芯片相接觸，以及第二步，用任何合適的方式測定權(quán)利要求8或11的多核苷酸的表達(dá)。
48.一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段相互作用的化學(xué)或生物化學(xué)化合物的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或權(quán)利要求31的細(xì)胞或權(quán)利要求32的非人類轉(zhuǎn)基因生物體或權(quán)利要求36的蛋白質(zhì)芯片相接觸，以及第二步，測定候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與所述的蛋白質(zhì)或細(xì)胞或非人類轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片之間所形成的復(fù)合物。
49.一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地調(diào)控權(quán)利要求23或24的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或權(quán)利要求31的細(xì)胞或權(quán)利要求32的非人類轉(zhuǎn)基因生物體或權(quán)利要求36的蛋白質(zhì)芯片相接觸，以及第二步，用任何合適的方式測定所述蛋白質(zhì)表達(dá)和/或活性。
50.一種藥物，包括選自權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段、權(quán)利要求35的抗體、權(quán)利要求30的載體和權(quán)利要求31的修飾的細(xì)胞中的一種產(chǎn)品。
51.選自權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段、權(quán)利要求35的抗體、權(quán)利要求30的載體和權(quán)利要求31的修飾的細(xì)胞中的一種產(chǎn)品在制備藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防和/或治療糖尿病、特別是與存在至少一種相應(yīng)于SEQ ID NO.1的基因的突變相關(guān)的和/或與相應(yīng)于SEQ ID NO.2的蛋白質(zhì)的異常表達(dá)相關(guān)的糖尿病，或當(dāng)觀察到胰島素基因有異常的表達(dá)、成熟或分泌時用于預(yù)防和/或治療高胰島素血癥，或用于調(diào)節(jié)β細(xì)胞內(nèi)的或待被修飾以用于胰島素分泌的細(xì)胞內(nèi)的胰島素的成熟和/或分泌，或用于調(diào)節(jié)β細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。
52.選自權(quán)利要求8、11或12中任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段和權(quán)利要求35的抗體中的一種產(chǎn)品用于確定編碼所述蛋白質(zhì)的基因的等位基因變異性、突變、缺失、雜合性的喪失或任何異常的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性表達(dá)于胰腺胰島β細(xì)胞的ZnT－8蛋白，涉及編碼上述的與胰島素成熟及外排相關(guān)的蛋白質(zhì)的多核苷酸，并涉及它們的應(yīng)用，例如在分選及研究β細(xì)胞和篩選治療糖尿病和高胰島素血癥的藥物上的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/705GK1738900SQ200380108886
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月18日
發(fā)明者米歇爾·塞夫, 阿蘭·法維耶 申請人:原子能委員會, 約瑟夫·傅里葉大學(xué)