專利名稱：吡唑化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有HSP90抑制活性的取代的吡唑、該類化合物在醫(yī)學(xué)中的用途，所述的醫(yī)學(xué)涉及對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病如癌，本發(fā)明還涉及包含該類化合物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
分子伴侶維持蛋白的適宜折疊和構(gòu)象，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡中至關(guān)重要。已經(jīng)表明它們?cè)谡{(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中都很重要(Jolly和Morimoto，2000；Smith等，1998；Smith，2001)。
熱激蛋白(HSP)細(xì)胞與許多環(huán)境應(yīng)激(包括熱激、醇、重金屬和氧化應(yīng)激)的接觸導(dǎo)致許多通常被稱為熱激蛋白(HSP)的伴侶蛋白的細(xì)胞累積。HSP的誘導(dǎo)保護(hù)細(xì)胞不被最初的應(yīng)激損害，增強(qiáng)恢復(fù)并維持應(yīng)激耐受狀態(tài)。但是，還已經(jīng)清楚的是某些HSP也可能通過(guò)調(diào)節(jié)一系列重要細(xì)胞蛋白的正確折疊、降解、定位和功能而在正常的無(wú)應(yīng)激條件下發(fā)揮主要的分子伴侶作用。
存在許多HSP的多基因家族，各個(gè)基因產(chǎn)物在細(xì)胞表達(dá)、功能和定位中方面不同。它們按照分子量進(jìn)行分類，例如HSP70、HSP90和HSP27。
作為蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊的結(jié)果人類可獲得多種疾病(在Tytell等，2001；Smith等，1998中有綜述)。因此，證明發(fā)展干擾分子伴侶機(jī)器的療法可能是有益的。在一些情況(例如阿爾茨海默病、朊病毒病和亨廷頓舞蹈病)中，錯(cuò)折疊的蛋白可造成導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病的蛋白聚集。另外，錯(cuò)折疊的蛋白還可導(dǎo)致野生型蛋白功能喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞中分子和生理學(xué)功能失控。
HSP還與癌癥有關(guān)。例如，有HSP差異表達(dá)的證據(jù)，HSP的差異表達(dá)可能與腫瘤惡化有關(guān)(Martin等，2000；Conroy等，1996；Kawanishi等，1999；Jameel等，1992；Hoang等，2000；Lebeau等，1991)。由于多種關(guān)鍵致癌途徑中涉及HSP90且發(fā)現(xiàn)某些具有抗癌活性的天然產(chǎn)物靶向于這種分子伴侶，已經(jīng)形成了引人注意的新觀念，即抑制HSP功能在癌癥的治療中可能是有用的。第一種分子伴侶抑制劑目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
A)HSP90HSP90占總細(xì)胞蛋白的約1-2％，通常以與許多其它蛋白之一締合的二聚體形式存在于細(xì)胞中(參見例如Pratt，1997)。其是細(xì)胞生存力所必需的并且表現(xiàn)出雙重伴侶蛋白功能(Young等，2001)。其通過(guò)在許多蛋白的天然構(gòu)象被各種環(huán)境應(yīng)激如熱激改變后與其相互作用、確保足夠的蛋白折疊并預(yù)防非特異性聚集而在細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Smith等，1998)。此外，最近的結(jié)果表明HSP90還可能在對(duì)抗突變作用的緩沖中發(fā)揮作用，推測(cè)該作用可能是由于校正突變型蛋白的不適宜的折疊而產(chǎn)生的(Rutherford和Lindquist，1998)。但是，HSP90還具有重要的調(diào)控作用。在正常的生理學(xué)條件下，HSP90與其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)同系物GRP94一起在細(xì)胞中發(fā)揮管家作用，維持多種關(guān)鍵客戶蛋白(client protein)的構(gòu)象穩(wěn)定性和成熟。這些可以被細(xì)分為三組(a)甾類激素受體，(b)Ser/Thr或酪氨酸激酶(例如ERBB2、RAF-1、CDK4和LCK)，和(c)表面上不相關(guān)的蛋白的集合，所述的表面上不相關(guān)的蛋白例如端粒酶hTERT的突變體p53和催化亞基。所有這些蛋白均在細(xì)胞的許多生理學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。不斷有新的HSP90客戶蛋白被鑒定。
人體內(nèi)高度保守的HSP90家族由四種基因組成，即胞質(zhì)HSP90α和HSP90β同工型(Hickey等，1989)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的GRP94(Argon等，1999)和線粒體基質(zhì)中的HSP75/TRAP1(Felts等，2000)。認(rèn)為所有的該族成員均具有相似的作用方式，但是與不同的客戶蛋白結(jié)合，這取決于它們?cè)诩?xì)胞中的定位。例如，已知ERBB2是GRP94的特異性客戶蛋白(Argon等，1999)，并且已經(jīng)證明1型腫瘤壞死因子受體(TNFR1)和RB均是TRAP1的客戶蛋白(Song等，1995；Chen等，1996)。
HSP90參與一系列與許多客戶蛋白和調(diào)節(jié)蛋白的復(fù)雜相互作用(Smith，2001)。雖然精確的分子細(xì)節(jié)仍然有待說(shuō)明，但是最近幾年進(jìn)行的生物化學(xué)和X-射線結(jié)晶學(xué)研究(Prodromou等，1997；Stebbins等，1997)已經(jīng)為獲悉HSP90的伴侶蛋白功能提供了越來(lái)越詳細(xì)的資料。
在對(duì)這一問(wèn)題的早期爭(zhēng)論后，現(xiàn)已清楚的是HSP90是一種ATP-依賴性分子伴侶(Prodromou等，1997)，核苷酸結(jié)合域的二聚作用對(duì)于ATP水解而言是必需的，而ATP水解又是伴侶蛋白功能所必需的(Prodromou等，2000a)。ATP的結(jié)合導(dǎo)致形成一種其中N末端結(jié)構(gòu)域彼此較緊密地接觸的環(huán)形二聚體結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生了被稱為‘夾子機(jī)理(clamp mechanism)’的構(gòu)象轉(zhuǎn)換(Prodromou和Pearl，2000b)。
已知的HSP90抑制劑所發(fā)現(xiàn)的第一類HSP90抑制劑是苯醌安沙霉素類，其包括化合物除莠霉素(herbimycin)A和格爾德霉素。已經(jīng)證明它們可逆轉(zhuǎn)被v-Src致癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞的惡性表型(Uehara等，1985)，并隨后在體外(Schulte等，1998)和體內(nèi)動(dòng)物模型中(Supko等，1995)表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性。
免疫沉淀法和親和力基質(zhì)研究已經(jīng)表明格爾德霉素的主要作用機(jī)理涉及與HSP90的結(jié)合(Whitesell等，1994；Schulte和Neckers，1998)。此外，X-射線結(jié)晶學(xué)研究已經(jīng)表明格爾德霉素競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合部位并抑制HSP90的固有腺苷三磷酸酶活性(Prodromou等，1997；Panaretou等，1998)。而這轉(zhuǎn)而又可預(yù)防能陪伴客戶蛋白的成熟多聚HSP90復(fù)合體的形成。因此，客戶蛋白靶向于通過(guò)泛素蛋白酶體途徑的降解。17-烯丙基氨基，17-去甲氧基格爾德霉素(17AAG)保留了HSP90的抑制性，在細(xì)胞培養(yǎng)和異種移植物模型中導(dǎo)致客戶蛋白消耗和抗腫瘤活性(Schulte等，1998；Kelland等，1999)，但是其肝毒性顯著低于格爾德霉素(Page等，1997)。目前正在進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)以對(duì)17AAG進(jìn)行評(píng)價(jià)。
根赤殼菌素是一種已證明可逆轉(zhuǎn)v-Src和v-Ha-Ras轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞的惡性表型的大環(huán)抗生素(Kwon等，1992；Zhao等，1995)。已經(jīng)證明由于HSP90抑制其可降解許多信號(hào)蛋白(Senate等，1998)。X-射線結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)證實(shí)根赤殼菌素還與HSP90的N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并抑制固有腺苷三磷酸酶活性(Roe等，1998)。由于該化合物不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，根赤殼菌素在體內(nèi)缺乏抗腫瘤活性。
已知香豆素抗生素可以在與HSP90的ATP結(jié)合部位同源的ATP結(jié)合部位與細(xì)菌DNA回旋酶結(jié)合。已經(jīng)證明香豆素、新生霉素與HSP90的羧基末端結(jié)合，即在與苯醌安沙霉素類和根赤殼菌素所占據(jù)的位置不同的位置上進(jìn)行結(jié)合，苯醌安沙霉素類和根赤殼菌素在N-末端上進(jìn)行結(jié)合(Marcu等，2000b)。但是，這也導(dǎo)致HSP90功能的抑制和許多HSP90-陪伴的信號(hào)蛋白的降解(Marcu等，2000a)。格爾德霉素不能在新生霉素之后結(jié)合HSP90；這表明在N和C末端之間一定存在一些相互作用，這與兩個(gè)部位對(duì)于HSP90伴侶蛋白性質(zhì)均很重要的觀點(diǎn)相一致。
已經(jīng)表明一種以嘌呤為基礎(chǔ)的HSP90抑制劑——PU3使得包括erb-B2在內(nèi)的信號(hào)分子降解并造成乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停止和分化(Chiosis等，2001)。
作為治療靶標(biāo)的HSP90由于HSP90涉及調(diào)解許多在驅(qū)動(dòng)腫瘤表型中十分重要的信號(hào)途徑且發(fā)現(xiàn)某些生物活性天然產(chǎn)物通過(guò)HSP90活性發(fā)揮其作用，因此目前估計(jì)分子伴侶HSP90是抗癌藥物研發(fā)的一種新靶標(biāo)(Neckers等，1999)。
格爾德霉素、17AAG和根赤殼菌素的主要作用機(jī)理涉及在位于HSP90N-末端結(jié)構(gòu)域中的ATP結(jié)合部位與該蛋白結(jié)合，從而抑制HSP90固有的腺苷三磷酸酶活性(參見例如Prodromou等，1997；Stebbins等，1997；Panaretou等，1998)。
HSP90腺苷三磷酸酶活性的抑制可防止輔-伴侶蛋白的募集并促進(jìn)一類HSP90雜絡(luò)物的形成，通過(guò)該形成，這些客戶蛋白靶向于通過(guò)泛素蛋白酶體途徑的降解(參見例如Neckers等，1999；Kelland等，1999)。
用HSP90抑制劑進(jìn)行治療導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡(一些在癌癥中十分重要的過(guò)程)中所涉及的重要蛋白的選擇性降解。
已經(jīng)表明HSP90功能的抑制導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡(一些十分重要的且在癌癥中經(jīng)常失控的過(guò)程)中所涉及的重要信號(hào)蛋白的選擇性降解(參見例如Hostein等，2001)。研制用于臨床的針對(duì)該靶標(biāo)的藥物的一個(gè)引人注意的原理是通過(guò)同時(shí)消耗與轉(zhuǎn)化表型有關(guān)的蛋白可以獲得強(qiáng)效抗腫瘤作用并獲得相對(duì)于正常細(xì)胞而言的對(duì)抗癌癥的治療益處。認(rèn)為HSP90抑制的這些下游事件與HSP90抑制劑在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中的抗腫瘤活性有關(guān)(參見例如Schulte等，1998；Kelland等，1999)。
發(fā)明概述本發(fā)明使得可以獲得一類新的取代的吡唑化合物，其是HSP90抑制劑，抑制癌細(xì)胞增殖。一個(gè)環(huán)碳原子上的芳族取代和毗鄰環(huán)碳原子上的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)取代是表征本發(fā)明化合物特征的主要要素。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了式(IA)或(IB)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物 其中Ar是芳基、芳基(C1-C6烷基)、雜芳基或雜芳基(C1-C6烷基)，其中的任何一個(gè)均任選地在其芳基或雜芳基部分上被取代，R1是氫或任選取代的C1-C6烷基；R2是氫、任選取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基或C1-C6炔基；或者羧基、甲酰胺或羧酸酯基團(tuán)；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2和AlK3是任選取代的C1-C3烷基，
Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
本發(fā)明化合物的一個(gè)子集由以上所定義的式(IA)或(IB)的化合物組成，其中Ar是任選取代的芳基或雜芳基；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2是任選取代的C1-C3烷基，p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
當(dāng)化合物IA和IB中的R1是氫時(shí)，化合物IA和IB是相同化合物的互變異構(gòu)形式。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“羧基”是指式-COOH的基團(tuán)；術(shù)語(yǔ)“羧酸酯基團(tuán)”是指式-COOR的基團(tuán)，其中R是實(shí)際上或理論上衍生自羥基化合物ROH的基團(tuán)；且術(shù)語(yǔ)“甲酰胺基團(tuán)”是指式-CONRaRb的基團(tuán)，其中-NRaRb是實(shí)際上或理論上衍生自氨或胺HNRaRb的伯或仲(包括環(huán)狀)氨基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“(C1-C6)烷基”是指具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，包括例如甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、異丁基、仲-丁基、叔-丁基、正-戊基和正-己基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“(C1-C6)鏈烯基”是指具有2至6個(gè)碳原子且含有至少一個(gè)E或Z構(gòu)型的雙鍵的直鏈或支鏈鏈烯基，包括例如乙烯基和烯丙基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“(C1-C6)炔基”是指具有2至6個(gè)碳原子且含有至少一個(gè)三鍵的直鏈或支鏈炔基，包括例如乙炔基和丙-2-炔基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指具有3-8個(gè)碳原子的飽和碳環(huán)基，包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烯基”是指具有3-8個(gè)碳原子且含有至少一個(gè)雙鍵的碳環(huán)基，包括例如環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基和環(huán)辛烯基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“芳基”是指單-、二-或三-環(huán)的碳環(huán)芳族基團(tuán)。該類基團(tuán)的實(shí)例有苯基、聯(lián)苯基和萘基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”是指其環(huán)原子均是碳的環(huán)狀環(huán)或環(huán)體系，包括單環(huán)芳基、環(huán)烷基和環(huán)烯基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指含有一個(gè)或多個(gè)選自S、N和O的雜原子的單-、二-或三-環(huán)的芳族基團(tuán)。該類基團(tuán)的實(shí)例有噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、異噻唑基、苯并異噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、異噁唑基、苯并異噁唑基、異噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基和吲唑基。
本文中所用的未限定的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”或“雜環(huán)”包括以上所定義的“雜芳基”，并且特別意指含有一個(gè)或多個(gè)選自S、N和O的雜原子的單-、二-或三-環(huán)的芳族或非芳族基團(tuán)，包括由含有一個(gè)或多個(gè)與另外的該類基團(tuán)或單環(huán)碳環(huán)基共價(jià)連接的該類雜原子的單環(huán)芳族或非芳族基團(tuán)所組成的基團(tuán)。該類基團(tuán)的實(shí)例有吡咯基、呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、嗎啉基、哌嗪基、吲哚基、嗎啉基、苯并呋喃基、吡喃基、異噁唑基、苯并咪唑基、亞甲二氧基苯基、亞乙二氧基苯基、馬來(lái)酰亞胺基和琥珀酰亞胺基。
除非在其出現(xiàn)的上下文中進(jìn)行特別說(shuō)明，否則本文中用于任何部分的術(shù)語(yǔ)“取代的”意指被至多4個(gè)取代基取代，所述的取代基各自可以獨(dú)立地是例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羥基、羥基(C1-C6)烷基、巰基、巰基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、鹵素(包括氟和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈(-CN)、氧、苯基、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-CONHNH2、-CONHNHRA、-CONHNRARB、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或-NRACONRARB，其中RA和RB獨(dú)立地是(C1-C6)烷基。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“鹽”包括堿加成鹽、酸加成鹽和季鹽。本發(fā)明的酸性化合物可以與堿形成包括可藥用鹽或可獸用鹽在內(nèi)的鹽，所述的堿如堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈉和氫氧化鉀；堿土金屬氫氧化物例如氫氧化鈣、氫氧化鋇和氫氧化鎂；有機(jī)堿例如N-乙基哌啶、二芐胺等。為堿性的那些化合物(I)可以與無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸形成包括可藥用鹽或可獸用鹽在內(nèi)的鹽，所述的無(wú)機(jī)酸例如氫鹵酸如鹽酸或氫溴酸、硫酸、硝酸或磷酸等，所述的有機(jī)酸例如乙酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、水楊酸、檸檬酸、甲磺酸和對(duì)-甲苯磺酸等。
因?yàn)榇嬖诓粚?duì)稱碳原子，所以本發(fā)明的一些化合物含有一個(gè)或多個(gè)實(shí)際或可能的手性中心。存在多個(gè)不對(duì)稱碳原子使得在各個(gè)手性中心上有許多具有R或S立體化學(xué)的非對(duì)映異構(gòu)體。本發(fā)明包括所有該類非對(duì)映異構(gòu)體及其混合物。
在本發(fā)明的化合物中Ar優(yōu)選是2-羥基苯基，更優(yōu)選是2，4-二羥基苯基，其可任選地進(jìn)一步被取代，例如可以在5-位上被取代。任選的取代基包括例如氯或溴、任選取代的苯基或C1-C6烷基，和在其苯環(huán)上任選地被取代的苯乙基。
R1和R2可以是例如氫、甲基、乙基、正-或異-丙基或羥基乙基。對(duì)于R1，優(yōu)選氫，對(duì)于R2，優(yōu)選氫或甲基；
環(huán)A可以是例如式(IIA)或(IIB)的環(huán) 其中X表示CH或N，且Y表示CH、O、S或NH，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2和Alk3是任選取代的C1-C3烷基，Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRASO2-或-NRA-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
當(dāng)任選取代的環(huán)A是式(IIA)時(shí)，X優(yōu)選是N且Y是NH或CH，更優(yōu)選X是N且Y是其中RA是式-(Alk1)-Q的基團(tuán)的-NRA-，其中Alk1是C1-C3亞烷基。例如在該類情況中，RA可以是任選取代的芐基且Q可以是任選取代的苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基或嗎啉基。
或者，當(dāng)任選取代的環(huán)A是式(IIA)時(shí)，X可以是且Y可以是-NRA-，其中RA是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)。在許多該類情況中的一種中，p是1且m各自是1，Cyc是亞苯基。
當(dāng)任選取代的環(huán)A是式(IIA)時(shí)，X是N且Y是-NRA-，在本文實(shí)施例的化合物中可發(fā)現(xiàn)取代基RA的具體實(shí)例。
目前優(yōu)選類型的本發(fā)明的化合物包括式(IC)或(ID)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物
其中R是氫、任選的取代基或在苯環(huán)上任選地被取代的苯乙基，且R2、m、r、s、Alk3、Z和Alk2的定義如上所述。在該類化合物中，R2可以是氫，R可以是例如氯、溴或在苯環(huán)上任選地被取代的苯乙基，且n可以是0，r可以是1，Z可以是-C(＝O)NH-。
本發(fā)明的具體化合物包括本文中實(shí)施例的那些化合物。
本發(fā)明的化合物可以用與本文實(shí)施例中所用的方法相似的方法制備，一般而言可以通過(guò)以下方法獲得使式(IIA)的化合物與式(IIB)的化合物反應(yīng)， 形成式(IIC)的中間體化合物，
然后使其與肼H2N-NHR1反應(yīng)，形成兩種吡唑化合物(1A)和(IB)的混合物，然后將其進(jìn)行分離。當(dāng)然，在以上的反應(yīng)過(guò)程中可以酌情保護(hù)Ar、環(huán)A和取代基R1和R2中任何可能的活性基團(tuán)并隨后除去保護(hù)基。
式(HA)的化合物可以通過(guò)用環(huán)A的陰離子對(duì)式(III)化合物的溴進(jìn)行親核置換來(lái)制備 本發(fā)明的一些化合物可以通過(guò)將以上的通法方法所制得的本發(fā)明的其它化合物進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)獲得。
本發(fā)明的化合物是HSP90的抑制劑，因此可用于治療對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病如癌癥；病毒性疾病如丙型肝炎(HCV)(Waxman，2002)；免疫抑制如移植中的免疫抑制(Bijlmakers，2000和Yorgin，2000)；抗炎疾病(Bucci，2000)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、MS、I型糖尿病、狼瘡、銀屑病和炎癥性腸??；囊性纖維化(Fuller，2000)；與血管生成有關(guān)的疾病(Hur，2002和Kurebayashi，2001)糖尿病性視網(wǎng)膜病變、血管瘤、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥和腫瘤血管生成。本發(fā)明的Hsp90抑制劑還可以保護(hù)正常細(xì)胞不受化療誘導(dǎo)的毒性的影響并且可用于其中不能發(fā)生細(xì)胞凋亡是根本因素的疾病。該類Hsp90抑制劑還可用于其中細(xì)胞應(yīng)激或熱激蛋白響應(yīng)的誘導(dǎo)可能有益的疾病，例如防止由于心臟(Hutter，1996和Trost，1998)和腦(Plumier，1997和Rajder，2000)中Hsp70升高而引起的低氧-局部缺血損傷。Hsp90抑制劑還可用于其中蛋白錯(cuò)折疊或聚集是主要起因的疾病，例如瘙癢病/CJD、亨廷頓舞蹈病和阿爾茨海默病(Sittler，2001；Trazelt，1995和Winklhofer，2001)。
因此，本發(fā)明還提供了(i)治療哺乳動(dòng)物、特別是人的對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病或病癥的方法，該方法包括對(duì)所述的哺乳動(dòng)物施用有效量的以上式(IA)或(IB)的化合物；和
(ii)用于人或獸醫(yī)學(xué)、特別是用于治療對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病或病癥的以上式(IA)或(IB)的化合物；和(iii)以上式(IA)或(IB)的化合物在制備用于控制(其意指治療或預(yù)防)對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病或病癥的藥物中的用途。
應(yīng)當(dāng)理解的是，用于任何特定患者的特定劑量水平將取決于多種因素，包括所用的具體化合物的活性、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用時(shí)間、使用途徑、排泄速率、藥物組合和所治療的具體疾病的致病機(jī)理和嚴(yán)重程度。一般而言，口服施用制劑的適宜劑量通常為0.1至3000mg，每天一次、兩次或三次施用，或者通過(guò)輸入或其它途徑給予相等的日劑量。但是，如本領(lǐng)域常規(guī)所做的那樣，最佳劑量水平和給藥頻率將通過(guò)臨床試驗(yàn)來(lái)確定。
本發(fā)明所涉及的化合物可以被制備用于通過(guò)任何與其藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)相一致的途徑進(jìn)行施用?？诜┯玫慕M合物可以是片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、錠劑、液體或凝膠制劑形式，如口服、局部或無(wú)菌的胃腸外溶液劑或混懸劑形式。用于口服施用的片劑和膠囊劑可以是單位劑量形式，可以含有常規(guī)的賦形劑如粘合劑例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、西黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；壓片潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；崩解劑例如馬鈴薯淀粉或可接受的濕潤(rùn)劑如十二烷基硫酸鈉?？梢愿鶕?jù)常規(guī)藥學(xué)實(shí)踐中眾所周知的方法對(duì)片劑進(jìn)行包衣。口服液體制劑可以是例如水性或油性混懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑形式，或者可以是使用前用水或其它適宜基質(zhì)重構(gòu)的干產(chǎn)品形式。適宜的液體制劑可以含有常規(guī)添加劑如混懸劑例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、葡萄糖糖漿、明膠氫化食用脂肪；乳化劑例如卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯或阿拉伯膠；非水性基質(zhì)(其可包括食用油)例如杏仁油、分餾椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇；防腐劑例如對(duì)-羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸，并且如果需要，還可以含有常規(guī)的矯味劑或著色劑。
對(duì)于局部應(yīng)用于皮膚而言，可以將藥物制備成乳膏劑、洗劑或軟膏劑?？捎糜谒鏊幬锏娜楦嗷蜍浉嘀苿┦潜绢I(lǐng)域中眾所周知的常規(guī)制劑，例如在藥劑學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書如英國(guó)藥典中有描述。
所述活性成分還可以在無(wú)菌介質(zhì)中被胃腸外施用。根據(jù)所用的基質(zhì)和濃度，可以將藥物混懸或溶解在基質(zhì)中。有利地，可以將輔劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑溶解在基質(zhì)中。
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體化合物的制備和活性進(jìn)行了舉例說(shuō)明。
實(shí)施例14-[3-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯，和實(shí)施例24-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚 實(shí)施例1 實(shí)施例2流程

圖1哌嗪子基(piperazino)吡唑的合成。

步驟11-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-乙酮 在氮?dú)夥障?，將乙?17.5mL)滴加至4-氯間苯二酚(42.5g，0.293mmol)在三氟化硼醚合物(200mL)中的混懸液中。將該反應(yīng)混合物在90℃下加熱3.5小時(shí)，然后使之冷卻至室溫。在冷卻約1小時(shí)后形成固體。將該混合物傾入700ml 10％w/v乙酸鈉水溶液中。將該混合物劇烈攪拌2.5小時(shí)。將所形成的淺棕色固體濾出、用水洗滌并風(fēng)干過(guò)夜，得到1-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-乙酮(31.6g，58％)。LCMS[M-H]+185。
步驟21-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基-乙酮 將芐基溴(30mL)加至1-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-乙酮(20g，0.107mole)和碳酸鉀(37g，2.5當(dāng)量)在乙腈(350mL)中的混合物中。將該混合物在回流下加熱6小時(shí)，然后使之冷卻并將其攪拌過(guò)夜。將該混合物過(guò)濾并用二氯甲烷(3×100mL)洗滌固體。將合并的有機(jī)萃取物真空蒸發(fā)，剩余淡黃色固體，將其用己烷(350mL)/乙酸乙酯(15mL)的混合物研磨并過(guò)濾，得到灰白色固體，1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-乙酮(35.4g，90％)。1H NMR(400MHz)與結(jié)構(gòu)一致。
步驟31-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-溴-乙酮
將苯基三甲基三溴化銨(7.5g，0.02mol)逐份加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-乙酮(7.09g，0.019mol)在四氫呋喃(100ml)中的溶液中并將該混合物攪拌2小時(shí)。將該混合物在水(100ml)和乙醚(2×50ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到米黃色固體。用甲苯(100ml)結(jié)晶，得到白色固體形式的1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-溴-乙酮(4.5g)。
LC保留時(shí)間為2.97分鐘，非離子(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟44-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯 將碳酸銫(2.95g，9mmol)分三份加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-溴-乙酮(4.4g，9mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.74g，9mmol)在二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中。將該混懸液攪拌2小時(shí)，然后將其在水(200ml)和乙酸乙酯(3×50ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用水(100ml)洗滌，用硫酸鎂干燥并濃縮，得到黃色油狀物形式的4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4g)。
LC保留時(shí)間為2.53分鐘[M+H]+551.5(運(yùn)行時(shí)間3.75分鐘)步驟54-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
將4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2g，3.6mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(4ml)中的溶液在回流下加熱3小時(shí)。向其中再加入一定量二甲基甲酰胺二甲基縮醛(15ml)，并將該混合物在回流下加熱4小時(shí)。將該混合物分配到7個(gè)微波容器中。向每個(gè)微波容器中加入乙醇(1ml)和水合肼(1ml)，并將其各自在120℃下加熱5分鐘。將所有容器的內(nèi)含物合并并將其在水(50ml)和二氯甲烷(3×30ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相濃縮并在bond elute柱(20g)上進(jìn)行純化，用己烷、然后用己烷∶乙醚4∶1、然后1∶1、然后1∶2、然后1∶4進(jìn)行洗脫，得到白色固體形式的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(620mg)。
LC保留時(shí)間為2.98分鐘[M+H]+575.5(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟64-[3-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(實(shí)施例1)將4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(230mg，0.4mmol)在乙酸乙酯(15ml)中的溶液用10％披鈀炭氫化1.5小時(shí)。將該混懸液用硅藻土過(guò)濾，用二氯甲烷∶乙醇(1∶1)洗滌。濃縮濾液，得到白色固體形式的4-[3-(5-氯-2，4-二羥基苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(實(shí)施例1)(72mg)。
LC保留時(shí)間為2.24分鐘[M+H]+395.3(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟74-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(實(shí)施例2)方法A將4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(25mg，0.06mmol)和濃鹽酸(1ml)的混合物在微波中于80℃下加熱5分鐘。將該混合物蒸發(fā)至干，與甲苯一起共沸，得到4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(10mg)(實(shí)施例2)。
LC保留時(shí)間為1.37分鐘[M+H]+295.2(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)方法B在0℃下，將三氯化硼(1M在二氯甲烷中的溶液；8ml，8mmol)滴加至4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.5g，2.6mmol)在二氯甲烷(15ml)中的溶液中。將所得的混合物在室溫下攪拌1小時(shí)、然后用飽和碳酸氫鈉溶液堿化。將該混懸液真空濃縮，與甲苯一起共沸，直至殘余物變干。將殘余物用二氯甲烷∶乙醇(1∶1；15ml)研磨并過(guò)濾。將濾液在bond elute柱(20g)上純化，用二氯甲烷∶乙醇∶氨，50∶8∶1、然后20∶8∶1洗脫，得到淡黃色固體形式的4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(400mg)(實(shí)施例2)。
LC保留時(shí)間為1.37分鐘[M+H]+295.2(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)實(shí)施例1的化合物在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘B’，實(shí)施例2的化合物具有活性‘A’。
下表中的化合物如流程圖1所述用相應(yīng)的胺制得并且用HPLC純化。“Hsp90 IC50”欄中的輸入項(xiàng)是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中所得的結(jié)果。

實(shí)施例54-氯-6-[4-(4-呋喃-2-基甲基-哌嗪-1-基)-1H-吡唑-3-基]-苯-1，3-二酚 該化合物用流程圖2中所概括的途徑制得流程圖2哌嗪的還原性氨基化。
將三乙酰氧基硼氫化鈉(150mg，0.7mmol)以一份的形式加至4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(43mg，0.146mmol)、糠醛(0.025ml，0.3mmol)、乙酸(0.5ml)和二氯甲烷(1ml)的混合物中。在氮?dú)庀略贁嚢?小時(shí)，將反應(yīng)混合物在水(10ml)和二氯甲烷(3×10ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥，濃縮并在bond elute柱(5g)上純化，用二氯甲烷∶乙醇∶氨(100∶8∶1)洗脫，得到白色固體形式的4-氯-6-[4-(4-呋喃-2-基甲基-哌嗪-1-基)-1H-吡唑-3-基]-苯-1，3-二酚(10mg)。
LC保留時(shí)間為1.68分鐘[M+H]+375.3(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)實(shí)施例5的化合物在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘B’。
實(shí)施例6和7的化合物也根據(jù)流程圖2分別用乙醛和3-吡啶基甲醛制備。“Hsp90 IC50”欄中的輸入項(xiàng)是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中所得的結(jié)果。
實(shí)施例8 實(shí)施例8的化合物如以下2個(gè)流程圖中所述進(jìn)行制備流程圖3哌嗪乙酸乙酯的合成。
步驟14-乙氧基羰基甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
將哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.62g，14mmol)、碳酸銫(5g，15mmol)和溴乙酸乙酯(1.56ml，14mmol)在室溫下攪拌1小時(shí)。將該混合物在水(200ml)和乙醚(2×100ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到黃色油狀物，將其結(jié)晶，得到淡黃色固體形式的4-乙氧基羰基甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.6g)。
1H N.M.R(CDCl3)δ＝1.24(3H，t，J＝7.1Hz)，1.43(9H，s)，2.49(4H，t，J＝5Hz)，3.20(2H，s)，3.44(4H，t，J＝4.8Hz)，4.16(2H，q，J＝7.1Hz)。
步驟2哌嗪-1-基-乙酸乙酯 將4-乙氧基羰基甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯在90％三氟乙酸(5ml)中的溶液攪拌3小時(shí)。將該混合物用飽和碳酸氫鈉溶液堿化并濃縮。將殘余物用乙酸乙酯(30ml)研磨并過(guò)濾。濃縮濾液，得到黃色油狀物形式的哌嗪-1-基-乙酸乙酯(約1.5g)。
1H N.M.R(CDCl3)δ＝1.18(3H，t，J＝7.1Hz)，2.40(4H，t，J＝4.1Hz)，2.70(4H，t，J＝4.5Hz)，3.13(2H，s)，3.45(1H，br s)，4.01(2H，q，J＝7.1Hz)。
流程圖4酰肼的合成
步驟3{4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯 如流程圖1所述用哌嗪-1-基-乙酸乙酯制備該化合物。
LC保留時(shí)間為2.32分鐘[M+H]+537.5(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟4{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯和{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼 將{4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯(1.5g，2.80mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(4ml)中的溶液在微波中于140℃下加熱30分鐘。將該溶液分成兩份，將每份與水合肼(0.1ml)和乙醇(2ml)混合并在微波中于100℃下加熱5分鐘。將合并的混合物濃縮并在bondelute柱上純化，得到{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯(230mg)和{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼(150mg)。
步驟5{4-[3-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼(實(shí)施例8) 與實(shí)施例2，步驟7，方法A類似，由{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼制備該化合物。
LC保留時(shí)間為1.40分鐘[M+H]+367.3(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)實(shí)施例8的化合物在腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘B’。
實(shí)施例94-氯-6-{4-[4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚流程圖5哌嗪的烷基化 將4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(43mg，0.146mmol)、碳酸銫(48mg，0.146mmol)、2-溴乙醇(0.025ml，0.35mmol)和二甲基甲酰胺(1ml)的混合物在室溫下攪拌3天。將該混合物蒸發(fā)至干并將其施加到bondelute柱(5g)上，用二氯甲烷∶甲醇(49∶1)、然后用二氯甲烷、然后用二氯甲烷∶乙醇∶氨(50∶8∶1，然后20∶8∶1)洗脫，得到白色固體形式的4-氯-6-{4-[4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚(10mg)。
LC保留時(shí)間為1.36分鐘[M+H]+339.3(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)實(shí)施例9的化合物在腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘B’。
實(shí)施例10至48通過(guò)流程圖5中所概述的方法用適宜的烷基化劑、酰化劑或磺?；瘎┲苽?。“Hsp90 IC50”欄中的輸入項(xiàng)是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中所得的結(jié)果，或者，在用星號(hào)標(biāo)明的情況中，是在以下所述的熒光偏振(FP)試驗(yàn)中所得的結(jié)果

步驟22’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮將苯基三甲基三溴化銨(1.55g，4.13mmol)加至2’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮(1.01g，4.13mmol)在THF(10ml)中的溶液中，將該混合物在室溫下攪拌45分鐘，在此期間，有機(jī)溶液褪色并形成白色沉淀。Tlc分析(9∶1己烷∶EtOAc)表明反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行完全。將混合物傾入水(20ml)中并用乙醚(2×50mL)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到無(wú)色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮粗品，將其不經(jīng)純化直接用于下一步。Rf0.47(9∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.4和6.9Hz)，7.45-7.40(5H，m)，6.77-6.74(2H，m)，5.15(2H，s)，4.47(2H，s)；LCMS保留時(shí)間2.75分鐘，M+H+323.3/325.3。
步驟32’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮將1-(叔丁氧羰基)哌嗪(808mg，4.34mmol)加至2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮(約4.13mmol)和碳酸鉀(856mg，6.20mmol)在DMF中的混合物中并將其在室溫下攪拌18小時(shí)。在真空下除去溶劑，將殘余物用乙酸乙酯(150ml)吸收并用水(100ml)和鹽水(100ml)洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗品用快速色譜法純化，用9∶1己烷∶EtOAc、然后用1∶1己烷∶EtOAc洗脫，得到黃色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮純品(1.42g，2步的收率為80％)；Rf0.00(9∶1己烷∶EtOAc)，0.50(1∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.3和6.9Hz)，7.48-7.44(5H，m)，6.81-6.77(2H，m)，5.17(2H，s)，3.79(2H，s)，3.51-3.47(4H，m)，2.44-2.41(4H，m)，1.50(9H，s)；LCMS保留時(shí)間2.10分鐘，M+H+429.4。
步驟43-[4-氟-2-(芐氧基)苯基]-4-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑?qū)?’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮(270mg，0.63mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(1.5ml)中的溶液在密封的微波管中于200℃下加熱15分鐘。形成白色沉淀。將該混合物在真空下蒸發(fā)至干，得到4-[1-(2-芐氧基-4-氟-苯甲?；?-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯粗品。向其中加入乙醇(2mL)和水合肼(2.0ml)并將混合物在密封的微波管中于120℃下加熱30分鐘。將該粗品混合物裝載在干燥的預(yù)填充的二氧化硅柱上并將其干燥過(guò)夜。用2∶1己烷∶EtOAc洗脫產(chǎn)物，得到黃色膠狀物形式的4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(95mg，33％)；LCMS保留時(shí)間2.75分鐘，M+H+453.4。
步驟53-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑?qū)⑷然?1.0M在DCM中；0.829ml，0.829mmol)加至4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75mg，0.166mmol)在DCM(7.5ml)中的溶液中。形成棕色沉淀。將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后將其傾入碳酸氫鈉飽和水溶液(50ml)中并用DCM(3×50ml)萃取。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將該產(chǎn)物用制備HPLC純化，得到灰白色固體形式的3-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑(13mg，30％)；δH(MeOH-d4)7.96(1H，br s)，7.72(1H，s)，6.71-6.64(2H，m)，3.36-3.33(4H，m)，3.13-3.10(4H，m)，2.65(1H，s)；LCMS保留時(shí)間1.46分鐘，M+H+263.2。
該實(shí)施例52的化合物在Hsp90腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘B’。
實(shí)施例533-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑
試劑和條件a.AcCl，吡啶，DCM，96％；b.AlCl3，180℃，73％；c.BnBr，Cs2CO3，DMF，53％；d.PhNMe3Br3，THF，EE 95％或EE’100％；e.(EtO)2PH.Et3N，THF，＞100％(不純)；f.Cbz-哌嗪，DMF，K2CO3，50％；g.DMFDMA，THF；h.加入NH2NH2·xH2O，MeOH，98％；i.H2，Pd/C，MeOH，41％。
步驟1乙酸3-乙酰氨基苯酯將吡啶(46.32ml，45.30g，572mmol)加至攪拌著的3-氨基苯酚(25.0g，229mmol)在DCM(200ml)中的混懸液中并將該混合物冷卻至0℃。在2.5小時(shí)期間，由均壓滴液漏斗向該混合物中滴加乙酰氯(14.45ml，15.95g，203.21mmol)在DCM(100ml)中的溶液(警告放熱)并將該混合物在0℃下再攪拌1小時(shí)。將混合物傾入HCl(1.0M在H2O中；350ml)中并分離各層。將水層用另外的DCM(150ml)萃取，將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗產(chǎn)物在40℃、150mbar下再干燥18小時(shí)，得到白色固體形式的乙酸3-乙酰氨基苯酯(42.5g，96％)；δH(CDCl3)7.83(1H，br s)，7.45(1H，t，J＝2.0Hz)，7.23(1H，t，J＝8.1Hz)，7.14-7.11(1H，m)，6.78-6.76(1H，m)，2.28(3H，s)，2.06(3H，s)；LCMS保留時(shí)間1.76分鐘，M+H+194.2。
步驟24’-乙酰氨基-2’-羥基苯乙酮用研棒和研缽將乙酸3-乙酰氨基苯酯(10.47g，54.19mmol)研磨成細(xì)粉，然后將其在裝配有與供氮設(shè)備相連的起泡器的250ml圓底燒瓶中與AlCl3(14.45g，108.40mmol)混合。將該混合物小心加熱至熔化(75℃)，隨后發(fā)生劇烈反應(yīng)(85℃)(警告反應(yīng)劇烈放熱并產(chǎn)生氣體。注意這些過(guò)程出現(xiàn)的溫度表現(xiàn)出一些變化一所述的溫度是觀察到的最低溫度，對(duì)于各過(guò)程而言最高溫度是約較其高30℃)。將該混合物冷卻至室溫并用刮刀將棕色固體破碎成粉末。然后，將混合物在180℃下加熱4.25小時(shí)并冷卻至室溫。用刮刀將固體物質(zhì)破碎，并向其中加入冰-水(100ml)。將混合物劇烈攪拌過(guò)夜并通過(guò)過(guò)濾取出純產(chǎn)物。將產(chǎn)物在減壓下干燥(45℃，100mbar)18小時(shí)，得到灰白色粉末形式的N-(4-乙酰基-3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.66g，73％)；δH(DMSO-d6)12.32(1H，s)，10.28(1H，s)，7.83(1H，d，J＝8.8Hz)，7.35(1H，d，J＝2.0Hz)，7.05(1H，dd，J＝8.8，2.0Hz)，2.56(3H，s)，2.07(3H，s)；LCMS保留時(shí)間1.87分鐘，M+H 194.2。
步驟3N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺在室溫下，于5分鐘期間，將芐基溴(4.84ml，6.97g，40.76mmol)滴加至N-(4-乙酰基-3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.50g，38.82mmol)和Cs2CO3(25.30g，77.64mmol)在DMF(175ml)中的混合物中。攪拌18小時(shí)后，在真空下除去溶劑，將殘余物與水(200ml)和DCM(200ml)一起劇烈攪拌至溶解完全。分離各層，再用DCM(2×200ml)萃取水層。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將殘余物用PhMe(150ml)吸收并將其蒸發(fā)至干，于是開始形成結(jié)晶。將混合物重新混懸于PhMe(100ml)中并將其與活性炭(5g)一起回流1小時(shí)。將該熱溶液過(guò)濾并使之冷卻。通過(guò)過(guò)濾收集產(chǎn)物，得到無(wú)色晶體形式的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(5.79g，53％)；δH(CDCl3)7.83(1H，m)，7.76(1H，d，J＝8.5Hz)，7.58(1H，brs)，7.45-7.32(6H，m)，6.74(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.15(2H，s)，2.56(3H，s)，2.19(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.33分鐘，M+H+284.3。
步驟4N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺將苯基三甲基三溴化銨(102mg，0.272mmol)加至N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(35mg，0.124mmol)在THF(3.5ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時(shí)。將該混合物在水(25ml)和EtOAc(25ml)之間進(jìn)行分配，分離各層并將有機(jī)層干燥(MgSO4)。在真空下除去溶劑，得到淡棕色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺粗品(54mg，100％)；δH(CDCl3)7.92(1H，br s)，7.85(1H，d，J＝8.5Hz)，7.55(1H，br s)，7.50-7.35(5H，m)，7.09(1H，s)，6.78(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.20(2H，s)，2.21(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.65分鐘，M+H+440.1/442.1/444.1。將該混合物以粗品形式用于下一步。
步驟5N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺方法A將苯基三甲基三溴化銨(241mg，0.641mmol)加至攪拌著的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(165mg，0.582mmol)在THF(16ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時(shí)。將該反應(yīng)混合物傾入水(50ml)中并用乙醚(2×50ml)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到灰白色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(200mg，95％)粗品；δH(CDCl3)7.98(1H，br s)，7.92(1H，brs)，7.81(1H，d，J＝8.5Hz)，7.49-7.32(5H，m)，6.82(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.16(2H，s)，4.50(2H，s)，2.20(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.52分鐘，M+H+362.2/364.2。雖然該粗品物質(zhì)被少量其實(shí)原料和相應(yīng)的二溴-化合物污染，但是其純度足以用于步驟6。
方法B在室溫下，將亞磷酸二乙酯(12.6μL，13.5mg，97.6μmol)和三乙胺(13.6μL，9.9mg，97.6μmol)在THF(0.1ml)中的溶液加至攪拌著的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(41mg，92.9μmol)在THF(1.5ml)中的溶液中，將該反應(yīng)攪拌2小時(shí)。將混合物傾入EtOAc(20ml)中并用水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺(40mg，＞100％)，通過(guò)NMR發(fā)現(xiàn)其被亞磷酸二乙酯衍生的污染物所污染。該物質(zhì)可不經(jīng)進(jìn)一步純化成功地用于
*在FP試驗(yàn)中進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施例494-氯-6-(5-甲基-4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚 步驟14-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯 將對(duì)甲苯磺酰氯(180mg，0.95mmol)加至攪拌著的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(500mg，0.9mmol)在二氯甲烷(10ml)和吡啶(0.9mmol)中的溶液中。繼續(xù)攪拌18小時(shí)，然后將該溶液在水(20ml)和乙酸乙酯(2×20ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥并真空濃縮，得到黃色油狀物。在二氧化硅(20g)上純化，用己烷、然后用己烷∶乙醚1∶1、然后用乙醚進(jìn)行洗脫，得到4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1-(甲苯-4-磺酰基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(490mg，77％)。
LC保留時(shí)間為3.22分鐘[M]+729.6(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟24-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-甲基-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮?dú)夥障?，將正丁基?1.6M，在己烷中；0.25ml，0.4mmol)滴加至攪拌著的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1-(甲苯-4-磺酰基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(240mg，0.33mmol)在四氫呋喃(2ml)中的冷(-78℃)溶液中。將該混合物在-78℃下攪拌10分鐘，然后向其中加入碘甲烷(40μL；0.64mmol)。將反應(yīng)混合物升溫至室溫，然后在水(20ml)和乙酸乙酯(2×20ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥，然后真空濃縮，在二氧化硅柱(200mg)上純化，用己烷、然后用己烷∶乙醚1∶1、然后用乙醚洗脫，得到4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-甲基-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(70mg；29％)。
LC保留時(shí)間為3.26分鐘[M]+743.6(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)用實(shí)施例1的方法B得到終產(chǎn)物，其在Hsp90 FP試驗(yàn)中具有活性‘A’。
實(shí)施例504-氯-6-(5-羥甲基-4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚 步驟14-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-羥甲基-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮?dú)夥?、室溫下，將氫化鋁鋰溶液(1M，在乙醚中，0.3ml，0.3mmol)滴加至攪拌著的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-異丁氧基羰基-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(90mg，0.11mmol)[在前面的實(shí)施例中用鋰化化學(xué)制得]在無(wú)水乙醚(2ml)中的溶液中。將該混懸液攪拌2小時(shí)，然后向其中加入氫氧化鈉溶液(1M，3滴)，然后加入甲醇(0.5ml)。將該混合物在水(30ml)和乙酸乙酯(2×20ml)之間進(jìn)行分配，將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥，然后真空濃縮，得到4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-羥甲基-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(58mg，88％)。
LC保留時(shí)間為2.87分鐘[M]+605.6(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟2用實(shí)施例1的方法B獲得終產(chǎn)物。
該化合物在Hsp90 FP試驗(yàn)中具有活性‘A’。
實(shí)施例515-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-4-哌嗪-1-基-2H-吡唑-3-甲酸乙基酰胺 根據(jù)實(shí)施例52和53中的鋰化化學(xué)制備該化合物，但是用異氰酸乙酯猝滅反應(yīng)。該實(shí)施例54的化合物在Hsp90腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘A’。
實(shí)施例523-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑 試劑和條件a.BnBr，K2CO3，DME，室溫，18小時(shí)，97％；b.PhNMe3Br3，THF，室溫，45分鐘；c.tBoc-哌嗪，K2CO3，DMF，80％(2步)；d.DMFDMA，μ-波200℃，15分鐘；e.NH2NH2·H2O，EtOH，μ-波，120℃，30分鐘，33％(2步)；f.BCl3，DCM，30％。
步驟12’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮將碳酸鉀(4.02g，29.10mmol)加至4’-氟-2’-羥基苯乙酮(2.0ml，2.56g，16.60mmol)在DMF(15mL)中的溶液中。在室溫下，于5分鐘期間，向其中滴加芐基溴(2.07ml，2.98g，17.50mmol)，并將該混合物攪拌18小時(shí)。將混合物傾入鹽酸(1.0M在H2O中；200ml)中并用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。將合并的有機(jī)萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。在用己烷研磨后，得到白色粉末形式的2’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮(3.94g，97％)。Rf0.44(9∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.82(1H，dd，J＝8.6和7.0Hz)，7.43-7.38(5H，m)，6.75-6.69(2H，m)，5.13(2H，s)，2.56(3H，d，J＝3.2Hz)；LCMS保留時(shí)間2.68分鐘，M+H+245.1。
步驟22’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮將苯基三甲基三溴化銨(1.55g，4.13mmol)加至2’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮(1.01g，4.13mmol)在THF(10ml)中的溶液中，將該混合物在室溫下攪拌45分鐘，在此期間，有機(jī)溶液褪色并形成白色沉淀。Tlc分析(9∶1己烷∶EtOAc)表明反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行完全。將混合物傾入水(20ml)中并用乙醚(2×50mL)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到無(wú)色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮粗品，將其不經(jīng)純化直接用于下一步。Rf0.47(9∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.4和6.9Hz)，7.45-7.40(5H，m)，6.77-6.74(2H，m)，5.15(2H，s)，4.47(2H，s)；LCMS保留時(shí)間2.75分鐘，M+H+323.3/325.3。
步驟32’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮將1-(叔丁氧羰基)哌嗪(808mg，4.34mmol)加至2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮(約4.13mmol)和碳酸鉀(856mg，6.20mmol)在DMF中的混合物中并將其在室溫下攪拌18小時(shí)。在真空下除去溶劑，將殘余物用乙酸乙酯(150ml)吸收并用水(100ml)和鹽水(100ml)洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗品用快速色譜法純化，用9∶1己烷∶EtOAc、然后用1∶1己烷∶EtOAc洗脫，得到黃色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮純品(1.42g，2步的收率為80％)；Rf0.00(9∶1己烷∶EtOAc)，0.50(1∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.3和6.9Hz)，7.48-7.44(5H，m)，6.81-6.77(2H，m)，5.17(2H，s)，3.79(2H，s)，3.51-3.47(4H，m)，2.44-2.41(4H，m)，1.50(9H，s)；LCMS保留時(shí)間2.10分鐘，M+H+429.4。
步驟43-[4-氟-2-(芐氧基)苯基]-4-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑?qū)?’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮(270mg，0.63mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(1.5ml)中的溶液在密封的微波管中于200℃下加熱15分鐘。形成白色沉淀。將該混合物在真空下蒸發(fā)至干，得到4-[1-(2-芐氧基-4-氟-苯甲酰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯粗品。向其中加入乙醇(2mL)和水合肼(2.0ml)并將混合物在密封的微波管中于120℃下加熱30分鐘。將該粗品混合物裝載在干燥的預(yù)填充的二氧化硅柱上并將其干燥過(guò)夜。用2∶1己烷∶EtOAc洗脫產(chǎn)物，得到黃色膠狀物形式的4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(95mg，33％)；LCMS保留時(shí)間2.75分鐘，M+H+453.4。
步驟53-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑?qū)⑷然?1.0M在DCM中；0.829ml，0.829mmol)加至4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75mg，0.166mmol)在DCM(7.5ml)中的溶液中。形成棕色沉淀。將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后將其傾入碳酸氫鈉飽和水溶液(50ml)中并用DCM(3×50ml)萃取。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將該產(chǎn)物用制備HPLC純化，得到灰白色固體形式的3-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑(13mg，30％)；δH(MeOH-d4)7.96(1H，br s)，7.72(1H，s)，6.71-6.64(2H，m)，3.36-3.33(4H，m)，3.13-3.10(4H，m)，2.65(1H，s)；LCMS保留時(shí)間1.46分鐘，M+H+263.2。
該實(shí)施例52的化合物在Hsp90腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中具有活性‘B’。
實(shí)施例533-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑
試劑和條件a.AcCl，吡啶，DCM，96％；b.AlCl3，180℃，73％；c.BnBr，Cs2CO3，DMF，53％；d.PhNMe3Br3，THF，EE 95％或EE’100％；e.(EtO)2PH.Et3N，THF，＞100％(不純)；f.Cbz-哌嗪，DMF，K2CO3，50％；g.DMFDMA，THF；h.加入NH2NH2·xH2O，MeOH，98％；i.H2，Pd/C，MeOH，41％。
步驟1乙酸3-乙酰氨基苯酯將吡啶(46.32ml，45.30g，572mmol)加至攪拌著的3-氨基苯酚(25.0g，229mmol)在DCM(200ml)中的混懸液中并將該混合物冷卻至0℃。在2.5小時(shí)期間，由均壓滴液漏斗向該混合物中滴加乙酰氯(14.45ml，15.95g，203.21mmol)在DCM(100ml)中的溶液(警告放熱)并將該混合物在0℃下再攪拌1小時(shí)。將混合物傾入HCl(1.0M在H2O中；350ml)中并分離各層。將水層用另外的DCM(150ml)萃取，將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗產(chǎn)物在40℃、150mbar下再干燥18小時(shí)，得到白色固體形式的乙酸3-乙酰氨基苯酯(42.5g，96％)；δH(CDCl3)7.83(1H，br s)，7.45(1H，t，J＝2.0Hz)，7.23(1H，t，J＝8.1Hz)，7.14-7.11(1H，m)，6.78-6.76(1H，m)，2.28(3H，s)，2.06(3H，s)；LCMS保留時(shí)間1.76分鐘，M+H+194.2。
步驟24’-乙酰氨基-2’-羥基苯乙酮用研棒和研缽將乙酸3-乙酰氨基苯酯(10.47g，54.19mmol)研磨成細(xì)粉，然后將其在裝配有與供氮設(shè)備相連的起泡器的250ml圓底燒瓶中與AlCl3(14.45g，108.40mmol)混合。將該混合物小心加熱至熔化(75℃)，隨后發(fā)生劇烈反應(yīng)(85℃)(警告反應(yīng)劇烈放熱并產(chǎn)生氣體。注意這些過(guò)程出現(xiàn)的溫度表現(xiàn)出一些變化—所述的溫度是觀察到的最低溫度，對(duì)于各過(guò)程而言最高溫度是約較其高30℃)。將該混合物冷卻至室溫并用刮刀將棕色固體破碎成粉末。然后，將混合物在180℃下加熱4.25小時(shí)并冷卻至室溫。用刮刀將固體物質(zhì)破碎，并向其中加入冰-水(100ml)。將混合物劇烈攪拌過(guò)夜并通過(guò)過(guò)濾取出純產(chǎn)物。將產(chǎn)物在減壓下干燥(45℃，100mbar)18小時(shí)，得到灰白色粉末形式的N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.66g，73％)；δH(DMSO-d6)12.32(1H，s)，10.28(1H，s)，7.83(1H，d，J＝8.8Hz)，7.35(1H，d，J＝2.0Hz)，7.05(1H，dd，J＝8.8，2.0Hz)，2.56(3H，s)，2.07(3H，s)；LCMS保留時(shí)間1.87分鐘，M+H 194.2。
步驟3N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺在室溫下，于5分鐘期間，將芐基溴(4.84ml，6.97g，40.76mmol)滴加至N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.50g，38.82mmol)和Cs2CO3(25.30g，77.64mmol)在DMF(175ml)中的混合物中。攪拌18小時(shí)后，在真空下除去溶劑，將殘余物與水(200ml)和DCM(200ml)一起劇烈攪拌至溶解完全。分離各層，再用DCM(2×200ml)萃取水層。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將殘余物用PhMe(150ml)吸收并將其蒸發(fā)至干，于是開始形成結(jié)晶。將混合物重新混懸于PhMe(100ml)中并將其與活性炭(5g)一起回流1小時(shí)。將該熱溶液過(guò)濾并使之冷卻。通過(guò)過(guò)濾收集產(chǎn)物，得到無(wú)色晶體形式的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(5.79g，53％)；δH(CDCl3)7.83(1H，m)，7.76(1H，d，J＝8.5Hz)，7.58(1H，br s)，7.45-7.32(6H，m)，6.74(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.15(2H，s)，2.56(3H，s)，2.19(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.33分鐘，M+H+284.3。
步驟4N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺將苯基三甲基三溴化銨(102mg，0.272mmol)加至N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(35mg，0.124mmol)在THF(3.5ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時(shí)。將該混合物在水(25ml)和EtOAc(25ml)之間進(jìn)行分配，分離各層并將有機(jī)層干燥(MgSO4)。在真空下除去溶劑，得到淡棕色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺粗品(54mg，100％)；δH(CDCl3)7.92(1H，br s)，7.85(1H，d，J＝8.5Hz)，7.55(1H，br s)，7.50-7.35(5H，m)，7.09(1H，s)，6.78(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.20(2H，s)，2.21(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.65分鐘，M+H+440.1/442.1/444.1。將該混合物以粗品形式用于下一步。
步驟5N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺方法A將苯基三甲基三溴化銨(241mg，0.641mmol)加至攪拌著的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(165mg，0.582mmol)在THF(16ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時(shí)。將該反應(yīng)混合物傾入水(50ml)中并用乙醚(2×50ml)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到灰白色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(200mg，95％)粗品；δH(CDCl3)7.98(1H，br s)，7.92(1H，br s)，7.81(1H，d，J＝8.5Hz)，7.49-7.32(5H，m)，6.82(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.16(2H，s)，4.50(2H，s)，2.20(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.52分鐘，M+H+362.2/364.2。雖然該粗品物質(zhì)被少量其實(shí)原料和相應(yīng)的二溴-化合物污染，但是其純度足以用于步驟6。
方法B在室溫下，將亞磷酸二乙酯(12.6μL，13.5mg，97.6μmol)和三乙胺(13.6μL，9.9mg，97.6μmol)在THF(0.1ml)中的溶液加至攪拌著的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(41mg，92.9μmol)在THF(1.5ml)中的溶液中，將該反應(yīng)攪拌2小時(shí)。將混合物傾入EtOAc(20ml)中并用水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(40mg，＞100％)，通過(guò)NMR發(fā)現(xiàn)其被亞磷酸二乙酯衍生的污染物所污染。該物質(zhì)可不經(jīng)進(jìn)一步純化成功地用于以下的步驟。所有分析數(shù)據(jù)如以上所報(bào)告。
步驟64’-乙酰氨基-2’-芐氧基-2-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]苯乙酮將1-(芐氧羰基)哌嗪(117μL，134mg，0.607mmol)加至N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺(200mg，0.552mmol)和碳酸鉀(115mg，0.828mmol)在DMF(5ml)中的混合物中并將其在室溫下攪拌18小時(shí)。在真空下除去溶劑，并用鹽水(25ml)吸收。用DCM(3×25ml)萃取水相并將合并的有機(jī)物干燥(MgSO4)。在真空下除去溶劑，將產(chǎn)物用制備HPLC純化，得到灰白色固體形式的4’-乙酰氨基-2’-芐氧基-2-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]苯乙酮純品(114mg，41％，50％rec.)；δH(CDCl3)8.23(1H，br s)，7.81(1H，d，J＝8.6Hz)，7.77-7.76(1H，m)，7.53-7.51(2H，m)，7.42-7.28(8H，m)，7.08(1H，dd，J＝8.6，1.8Hz)，5.20(2H，s)，5.12(2H，s)，4.00(2H，s)，3.59-3.48(4H，m)，2.65-2.60(4H，m)，2.14(3H，s)；LCMS保留時(shí)間2.07分鐘，M+H+502.5，以及回收的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(35mg)。
步驟73-[4-乙酰氨基-2-芐氧基苯基]-4-[4-(芐氧羰基)-哌嗪-1-基]-1H-吡唑?qū)?’-乙酰氨基-2’-芐氧基-2-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]苯乙酮(68mg，135.6μmol)和二甲基甲酰胺二甲基縮醛(90μL，81mg，677.9μmol)在干燥THF(0.5ml)中的溶液密封在微波管中并在120℃下加熱65分鐘。向其中加入另外的在THF(0.5ml)中的二甲基甲酰胺二甲基縮醛(90μL，81mg，677.9μmol)并將該管在120℃下再加熱40分鐘。
向所得的4-[1-(4-乙?；被?2-芐氧基-苯甲酰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸芐酯粗品溶液中加入水合肼(0.75ml)和MeOH(0.75ml)以便使混合物為單相，將該混合物在室溫下攪拌3天。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物傾入50％飽和鹽水(100ml)中。將產(chǎn)物用EtOAc(3×100ml)萃取，將合并的有機(jī)物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到黃色膠狀物形式的3-[4-乙酰氨基-2-芐氧基苯基]-4-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑粗品(70mg，98％)；LCMS保留時(shí)間2.48分鐘，M+H+526.5。
步驟83-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑?qū)?-[4-乙酰氨基-2-芐氧基苯基]-4-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑(70mg，133.2μmol)在MeOH(7ml)中的溶液脫氣(3×真空/氮)并向其中加入鈀(10％在碳上；10mg，催化劑)。將反應(yīng)混合物再次脫氣(3×真空/氮)并用一種氫氣(3×真空/氫)代替該氣氛。將混合物在室溫下振搖18小時(shí)。通過(guò)用硅藻土小墊過(guò)濾濾出催化劑并將其用另外的MeOH(15ml)洗滌。在真空下除去溶劑，得到粗品，將其用制備HPLC純化，得到白色固體形式的3-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑(16.3mg，41％)；δHMeOH-d4)8.47(1H，s)，7.80(1H，br s)，7.68(1H，s)，7.26(1H，s)，7.11(1H，dd，J＝8.5，2.1Hz)，3.34-3.29(4H，m)，3.11-3.07(4H，m)，2.12(3H，s)；LCMS保留時(shí)間1.26分鐘，M+H+302.3。
該實(shí)施例53的化合物在Hsp90 FP結(jié)合試驗(yàn)中具有活性‘B’。
實(shí)施例543-甲基-5-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-6-酚
步驟1N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺將乙酸3-乙?；被?苯酯(5.0g，25.9mmol)研磨成細(xì)粉，然后將其在一個(gè)圓底燒瓶中與AlCl3(6.9g，52.3mmol)混合。用氮?dú)獬湟绾螅瑢考訜嶂?5℃并將其保持在這一溫度下直至反應(yīng)已經(jīng)發(fā)煙完全。使該反應(yīng)冷卻至室溫并將棕色固體破碎成粉末。然后，將反應(yīng)重新加熱至180℃。4小時(shí)后，將反應(yīng)冷卻至室溫并將其破碎成粉末。向其中加入冰水(100ml)并將反應(yīng)攪拌過(guò)夜。將產(chǎn)物濾出，用水洗滌并干燥，得到棕色固體(2.57g，51.4％)。LC/MS保留時(shí)間＝1.864分鐘。194(MH+)。
步驟2N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺將N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(2.57g，13.3mmol)混懸在DMF(60ml)中，然后依次加入Cs2CO3(8.70g，26.7mmol)和芐基溴(1.7ml，14mmol)。將該反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。在真空下除去溶劑并將油性殘余物在DCM/H2O(1∶1)中進(jìn)行攪拌。將有機(jī)物用水洗滌、干燥(Na2SO4)并用柱色譜法純化，用己烷至1∶1己烷/EtOAc梯度洗脫，得到膏狀固體形式的芐酯(1.25g，33％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.307分鐘。284(MH+)。
步驟3N-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-乙酰胺將N-溴琥珀酰亞胺(0.756g，4.27mmol)逐份加至N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(1.2g，4.24mmol)在DMF(24ml)中的溶液中并將該反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。將該反應(yīng)混合物用DCM稀釋，用水洗滌并用MgSO4干燥，得到白色固體(1.03g，67％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.609分鐘。362/364(MH+)。
步驟4N-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-N-烯丙基-乙酰胺向在氮?dú)庀碌腘-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-乙酰胺(1.03g，2.85mmol)在無(wú)水THF(20ml)中的溶液冷卻至-78℃，然后向其中滴加LDA(2.1ml，2M溶液，4.3mmol)。將該反應(yīng)在-78℃下繼續(xù)攪拌1小時(shí)，然后用烯丙基溴(0.44ml，2.85mmol)猝滅。使反應(yīng)升溫至室溫并將其繼續(xù)攪拌過(guò)夜。將該溶液在EtOAc和水之間進(jìn)行分配。收集將有機(jī)物并用水、鹽水洗滌，然后干燥(MgSO4)。用柱色譜法進(jìn)行純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到白色固體(0.662g，58％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.703分鐘。402/404(MH+)。
步驟51-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-乙酮將N-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-N-烯丙基-乙酰胺(0.662g，1.65mmol)、P(鄰-甲苯基)3(0.028g，0.092mmol)和三乙胺(0.34ml，2.24mmol)在MeCN(15ml)中的溶液用氮?dú)獬湟?，然后向其中加入Pd(OAc)2(0.005g)。將該反應(yīng)在150℃下微波處理500秒。將該粗品混合物用EtOAc稀釋，用水洗滌并用MgSO4干燥。用柱色譜法進(jìn)行純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到(0.283g，54％)膏狀固體。LC/MS保留時(shí)間＝2.742分鐘。322(MH+)，344(MNa+)，280(MH+-Ac)。
步驟61-(1-乙酰基-6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2，2-二溴-乙酮向1-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-乙酮(0.283g，0.88mmol)在無(wú)水THF(6ml)中的溶液中加入PhNMe3Br3(0.497g，2.3mmol)。將該反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)。將該溶液用水稀釋，將有機(jī)物用Et2O萃取并用MgSO4干燥，得到粗產(chǎn)物(0.420g，＞90％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.900分鐘。478/480(MH+)。
步驟71-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-溴-乙酮將粗產(chǎn)物1-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2，2二溴-乙酮(0.42g，0.88mmol)混懸在THF(4ml)中，然后向其中加入三乙胺(0.12ml，0.89mmol)和(EtO)2P(O)H(0.137ml，0.88mmol)。將其在室溫下攪拌過(guò)夜后，將該反應(yīng)用EtOAc稀釋，用H2O、鹽水洗滌并用MgSO4干燥。在真空下除去溶劑并將粗產(chǎn)物用柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到所述產(chǎn)物(0.039g，11％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.830分鐘。400/402(MH+)。
步驟84-[2-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸芐酯將化合物1-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-溴-乙酮(0.039g，0.1mmol)、K2CO3(0.019g，0.14mmol)和Cbz-哌啶(0.026ml，0.1mmol)在DMF(2ml)中于室溫下攪拌5小時(shí)。在真空下除去溶劑，將殘余物重新溶解在DCM中，用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥。用柱色譜法進(jìn)行純化，用己烷/EtOAc(3∶2)洗脫，得到所述產(chǎn)物(0.008g，17％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.236分鐘。498(MH+)。
步驟94-[1-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-羰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸芐酯將4-[2-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸芐酯(0.661g，1.33mmol)在DMFDMA(5ml)中的溶液在100℃下加熱過(guò)夜。在真空下除去溶劑，將粗產(chǎn)物用柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到所述產(chǎn)物(0.158g，22％)。LC/MS保留時(shí)間＝5.33分鐘。553(MH+)。
步驟104-[3-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸芐酯將4-[1-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-羰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸芐酯(0.158g，0.29mmol)和肼(0.75ml，15.5mmol)在EtOH中的溶液回流1小時(shí)，之后該反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行完全。在真空下除去溶劑，將產(chǎn)物用柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到灰白色固體(0.0445g，30％)。LC/MS保留時(shí)間＝2.713分鐘。522(MH+)。
步驟113-甲基-5-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-6-酚將4-[3-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸芐酯(0.022g，0.042mmol)在MeOH(2ml)中的溶液除氣并用氮?dú)獬湟?。向該溶液中加?0％Pd/C(10mg)，將該混懸液除氣并用氫氣充溢。將反應(yīng)在室溫、氫氣氛下振搖過(guò)夜。將反應(yīng)用硅藻土過(guò)濾并在真空下除去溶劑。將終產(chǎn)物用HCI/Et2O鹽化并用乙醚研磨，得到淡棕色固體(0.0046g，33％)。LC/MS1.495分鐘。298(MH+)。
該實(shí)施例54的化合物在Hsp90 FP結(jié)合試驗(yàn)中具有活性‘B’。
以下實(shí)施例55-64的含有被溴取代的間苯二酚環(huán)的化合物用類似于流程圖1的方法通過(guò)實(shí)施例1步驟3的中間體的溴代類似物制備。該溴代中間體根據(jù)以下的流程圖6制備流程圖6 步驟11-(2，4-二-芐氧基苯基)-乙酮 將芐基溴(35.6ml，0.3mol)加至2，4-二羥基苯乙酮(15g，0.1mol)和碳酸鉀(41.4g，0.3mol)在乙腈(150ml)中的混懸液中并將該混合物攪拌過(guò)夜。濃縮至干后，將殘余物重新混懸在二氯甲烷(100ml)中并用水(100ml)洗滌。將有機(jī)相用硫酸鎂干燥并濃縮。用己烷研磨，過(guò)濾并真空干燥，得到白色粉末形式的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-乙酮(26g)。
LC保留時(shí)間為2.83分鐘，[M+H]+333.3(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)
步驟21-(2，4-二-芐氧基苯基)-2-溴-乙酮 將苯基三甲基三溴化銨(5.6g，0.015mol)逐份加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-乙酮(5.0g，0.015mol)在四氫呋喃(50ml)中的溶液中并將該混合物攪拌2小時(shí)。將該混合物在水(50ml)和乙醚(2×50ml)之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到米黃色固體形式的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-2-溴-乙酮，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。
LC保留時(shí)間為2.89分鐘，[M+H]+411.2和413.2(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟31-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-2-溴-乙酮 將N-溴琥珀酰亞胺(2.67g，0.015mol)加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-2-溴-乙酮粗品(約6.16g，0.015mol)在二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液中并將該混合物攪拌18小時(shí)。將該混合物濃縮至干，溶解在二氯甲烷(50ml)中并進(jìn)行洗滌(2×50ml)。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到白色固體形式的1-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-2-溴-乙酮，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。
LC保留時(shí)間為2.99分鐘，[M+Na]+511.2，513.2和515.2(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)
在下表的實(shí)施例中，“Hsp90 IC50”欄中的輸入項(xiàng)是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中所得的結(jié)果
用實(shí)施例55的化合物作為中間體制備了以下實(shí)施例65-76的化合物。例如，實(shí)施例70的化合物如下制備，并且類似地制備了另外的實(shí)施例65-69和71-76的化合物
步驟1將溴代中間體偶聯(lián)以形成苯乙烯基中間體將4-溴-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(實(shí)施例58)(1當(dāng)量)、4-氟苯乙烯(3當(dāng)量)和N，N-二異丙基乙基胺(3當(dāng)量)在正丁醇(每當(dāng)量50ml)中的混合物脫氣(3×氮/真空)。向其中加入二氯二(三-鄰甲苯基膦基)鈀(II)(2mol％)并將該混合物在回流下加熱15小時(shí)。將混合物用小二氧化硅柱過(guò)濾并用二氯甲烷洗滌二氧化硅。
步驟2還原成苯乙基化合物在2小時(shí)期間，將乙酸鈉溶液(1.0M在H2O中，3當(dāng)量)滴加至回流的烯(1當(dāng)量)和對(duì)甲苯磺酰肼(3當(dāng)量)在1，2-DME中的溶液中，并將其繼續(xù)回流20小時(shí)。將該混合物冷卻，傾入水中并用二氯甲烷萃取。將合并的有機(jī)萃取物干燥(MgSO4)并真空濃縮。將粗產(chǎn)物用快速色譜法純化。



實(shí)施例774-溴-6-{4-[4-(4-甲磺?；?芐基氨基)-哌啶-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚
步驟18-[3-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-1H-吡唑-4-基]-1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸烷 將1-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-2-溴-乙酮(根據(jù)以上的流程圖6制得)(15.56g，31.74mmol)溶解在二甲基甲酰胺(20ml)中。向其中加入1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸烷(4.55g，31.74mmol)和三乙胺(4.42ml，31.74mmol)并將該反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)。在減壓下除去溶劑。將殘余物用二甲基甲酰胺二甲基縮醛(60ml，452mmol)吸收并在110℃下攪拌16小時(shí)。將該反應(yīng)冷卻至室溫并真空濃縮，得到棕色油狀物。將其溶解在乙醇(100mol)和水合肼(23.8g，476mmol)中并回流16小時(shí)。將該反應(yīng)冷卻至室溫，蒸發(fā)至干并將其用二氧化硅快速色譜法純化。用乙酸乙酯/己烷(1∶1)洗脫產(chǎn)物，將合并的級(jí)分蒸發(fā)并將殘余物用乙醚研磨，得到灰白色固體(6.31g)。
LC保留時(shí)間為2.79分鐘[M+H]+576.4和578.4(溴裂解模式)(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟21-[3-(5-溴-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌啶-4-酮 將8-[3-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-1H-吡唑-4-基]-1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸烷(6.55g，11.4mmol)溶解在二氯甲烷(70ml)中并將其冷卻至0℃。向其中滴加三氯化硼(1M，在二氯甲烷中，57ml，57mmol)。將反應(yīng)升溫至室溫并攪拌30分鐘。然后將其在0℃下用水(50ml)猝滅，升溫至室溫并攪拌3天。用飽和碳酸氫鈉水溶液將反應(yīng)中和至pH＝7，將該淺棕色沉淀濾出，用水洗滌，然后在真空干燥箱中干燥(2.25g)。
LC保留時(shí)間為1.89分鐘[M+H]+352.4和354.2(溴裂解模式)(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)步驟34-溴-6-{4-[4-(4-甲磺?；?芐基氨基)-哌啶-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚 將1-[3-(5-溴-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌啶-4-酮(0.1g，0.284mmol)溶解在甲醇(3ml)中。向其中加入三乙胺(0.044ml，0.312mmol)和4-甲磺?；?芐胺鹽酸鹽(0.069g，0.312mmol)并將該反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)。加入過(guò)量的硼氫化鈉并當(dāng)嘶嘶聲停止時(shí)在真空下除去溶劑。將殘余物用二氧化硅快速色譜法純化。用甲醇/二氯甲烷(1∶9)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行洗脫。必需用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化。得到白色固體，收率為0.036g。
LC保留時(shí)間為1.68分鐘[M+H]+521.3和523.3(溴裂解模式)(運(yùn)行時(shí)間為3.75分鐘)實(shí)施例78-88的化合物與實(shí)施例80的化合物類似通過(guò)步驟5中的適宜胺與步驟4中的中間體反應(yīng)來(lái)制備?！癏sp90 IC50”欄中的輸入項(xiàng)也是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗(yàn)中所得的結(jié)果



生物學(xué)結(jié)果可以用酵母HSP90作為模型系統(tǒng)來(lái)測(cè)量HSP90的固有腺苷三磷酸酶活性。該試驗(yàn)以使用用于測(cè)量無(wú)機(jī)磷酸鹽的孔雀綠為基礎(chǔ)，用于對(duì)本文實(shí)施例的化合物的HSP90抑制活性進(jìn)行試驗(yàn)。
孔雀綠腺苷三磷酸酶試驗(yàn)材料化學(xué)物質(zhì)是市售可得的最高純度并且所有的水性溶液均用分析純的水制備。因?yàn)樾枰獙o(wú)機(jī)磷酸鹽的污染最小化，所以對(duì)該試驗(yàn)中所用的溶液和裝置應(yīng)當(dāng)采取預(yù)防措施。在使用前，用重蒸餾水或去離子水對(duì)玻璃器皿和pH計(jì)進(jìn)行清洗，在可能的情況下，應(yīng)當(dāng)使用塑料器皿。所有的操作均應(yīng)當(dāng)戴手套。
(1)Greiner 384-孔(Greiner 781101)或Costar 384-孔平底聚苯乙烯多孔板(VWR)。
(2)(a)100mM Tris-HCl，pH7.4，(b)150mM KCl，(c)6mM MgCl2的試驗(yàn)緩沖液。在室溫下貯存。
(3)0.0812％(w/v)孔雀綠(M 9636，Sigma Aldrich Ltd.，Poole，UK)。在室溫下貯存。
(4)2.32％(w/v)在沸水中的聚乙烯醇USP(P 1097，Sigma Aldrich Ltd，Poole，UK)(參見注釋1)，使之冷卻并在室溫下貯存。
(5)5.72％(w/v)在6M鹽酸中的鉬酸銨。在室溫下貯存。
(6)34％(w/v)檸檬酸鈉。在室溫下貯存。
(7)100mM ATP，二鈉鹽，特殊品質(zhì)(47699，Sigma Aldrich)。在-20℃下貯存。
(8)表達(dá)酵母HSP90蛋白的大腸桿菌，純度＞95％(參見例如Panaretou等，1998)，在-80℃下以50μL等分試樣貯存。
方法1.用分析純的水將供試化合物稀釋至500μM(DMSO濃度將為2.5％)。將2.5μl這些化合物直接從子板中轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)板中，得到100μM的最終試驗(yàn)濃度。為了獲得12個(gè)點(diǎn)的IC50值，進(jìn)行1∶2連續(xù)稀釋以得到從100μM至97.6nM的一系列(2.5％DMSO)的試驗(yàn)濃度，將2.5μl各濃度的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)板中。試驗(yàn)板中的第1行不包含化合物，用作陰性對(duì)照。還用不含化合物的另一列作為背景。
2.通過(guò)用試驗(yàn)緩沖液將100mM貯備液稀釋至925μM來(lái)制備ATP，并且將5μl稀釋的ATP的等分試樣加至包括對(duì)照在內(nèi)的各孔中(最終試驗(yàn)濃度為370μM)。
3.向背景列中加入5μl緩沖液。
4.用試驗(yàn)緩沖液將酶制品稀釋至1.05μM，并向各化合物孔中和向陰性對(duì)照行中加入5μl等分試樣。
5.將試劑聚集到孔的底部，用板封閉蓋(plate seal)覆蓋該板并將其在37℃下溫育過(guò)夜。
6.早上的第一件事是制備孔雀綠試劑。加入2份孔雀綠溶液、1份聚乙烯醇溶液、1份鉬酸銨溶液和2份分析純的水。
7.反轉(zhuǎn)以進(jìn)行混合，然后將其放置約1小時(shí)直至顏色從棕色變成金黃色。
8.向每個(gè)孔中加入40μl孔雀綠試劑，將其放置5分鐘以使顏色變化。
9.向每個(gè)孔中加入5μl檸檬酸鈉試劑(參見注釋2)。
10.用板封閉蓋將其再次覆蓋，并在板振蕩器上振搖至少15分鐘。
11.用合適的讀板器(例如Victor，Perkin Elmer Life Sciences，MiltonKeynes，UK)在620nM下測(cè)量吸光度。在這些條件下，對(duì)照的吸光度為0.9至1.4，背景的吸光度為0.2-0.35，得到信噪比為～12。由用這些條件所獲得的數(shù)據(jù)算出的Z′因子為0.6至0.9。
注釋(1)將聚乙烯醇溶解在沸水中有一定的困難，需要攪拌2-3小時(shí)。
(2)加入孔雀綠試劑和檸檬酸鈉之間的時(shí)間間隔應(yīng)盡可能短以降低ATP的非酶促水解。加入檸檬酸鈉后，顏色在室溫下穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)。
(3)可以用Biomek FX Robot(Beckman Coulter)將化合物加至試驗(yàn)板中?？梢苑奖愕赜肕ultidrop 384分液器(Thermo Labsystems，Basingstoke，UK)將試劑加至板中。
(4)對(duì)于時(shí)間、蛋白和底物濃度將試驗(yàn)條件最優(yōu)化以便在保留信噪比差別的同時(shí)獲得最小的蛋白濃度。
(5)用以下方程來(lái)計(jì)算信噪比(S/N)(S-B)/√(S的SD)2+(B的SD)2(6)為了測(cè)定HSP90的特定活性，制備一定濃度范圍的無(wú)機(jī)磷酸鹽(0-10μM)并如上所述在620nm下測(cè)量吸光度。由所得的校正曲線來(lái)計(jì)算特定活性。
將以上試驗(yàn)中所試驗(yàn)的化合物歸入兩種活性范圍中的一種，即A＝＜50μM；B＝＞50μM，這些歸類如以上所報(bào)告。
熒光偏振試驗(yàn)熒光偏振{也稱為熒光各向異性}測(cè)量溶液中熒光旋轉(zhuǎn)種類，分子越大，熒光發(fā)射越偏振。當(dāng)用偏振光對(duì)熒光團(tuán)進(jìn)行激發(fā)時(shí)，所發(fā)射的光也被偏振。分子大小與熒光發(fā)射的偏振成比例。
熒光素-標(biāo)記的探針-RBT0045864-FAM- 與HSP90結(jié)合{全長(zhǎng)人、全長(zhǎng)酵母或N-末端結(jié)構(gòu)域HSP90}，對(duì)各向異性{該探針蛋白復(fù)合物的旋轉(zhuǎn)}進(jìn)行測(cè)量。
向試驗(yàn)板中加入供試化合物，使其平衡并再次對(duì)各向異性進(jìn)行測(cè)量。各向異性的任何變化是由于化合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HSP90從而釋放出探針釋而產(chǎn)生的。
材料化學(xué)物質(zhì)是市售可得的最高純度，所有水性溶液均用分析純的水制備。
1)Costar 96-孔黑色試驗(yàn)板#39152)(a)100mM Tris pH7.4；(b)20mM KCl；(c)6mM MgCl2的試驗(yàn)緩沖液。在室溫下貯存。
3)BSA(牛血清白蛋白)10mg/ml(New England Biolabs #B9001S)。
4)20mM在100％DMSO中的探針貯備液濃度。在室溫下、黑暗中貯存。工作濃度為用分析純的水稀釋的200nM并在4℃下貯存。最終試驗(yàn)濃度為80nM。
5)表達(dá)人全長(zhǎng)HSP90蛋白的大腸桿菌，純度＞95％(參見例如Panaretou等，1998)并在-80℃下以50μL等分試樣貯存。
方案1)將100μl 1×緩沖液加至孔11A和12A中(＝FP BLNK)2)制備試驗(yàn)混合物-將所有試劑均置于冰上，因?yàn)樵撎结樖枪饷粜缘模越o盛冰的桶上加蓋。
i.終濃度n·1×Hsp90 FP緩沖液 10ml 1×·BSA 10mg/ml(NEB) 5.0μl5μg/ml·探針200μM 4.0μl80nM·人全長(zhǎng)Hsp906.25μl200nM3)向所有其它孔中加入100μl試驗(yàn)混合物等分試樣4)將板封閉并置于室溫、黑暗下20分鐘以使化合物稀釋板-1×3稀釋系列平衡1)在透明的96-孔v-底板-{#VWR 007/008/257}中，向孔B1至H11中加入10μl 100％DMSO2)向孔A1至A11中加入17.5μl 100％DMSO3)向A1中加入2.5μl化合物。由此得到2.5mM{50×}貯備化合物—約化合物20mM。
4)對(duì)孔A2至A10重復(fù)進(jìn)行所述操作。在第11和12行中進(jìn)行對(duì)照操作。
5)將5μl從列A轉(zhuǎn)移到列B中—不包括第12行。將孔進(jìn)行混合。
6)將5μl從列B轉(zhuǎn)移到列C中。將孔進(jìn)行混合。
7)對(duì)列G重復(fù)進(jìn)行所述操作。
8)不向列H中加入任何化合物—這是第0列。
9)這產(chǎn)生了從50μM至0.07μM的1×3個(gè)稀釋系列。
10)在孔B12中制備20μl100μM的標(biāo)準(zhǔn)化合物。
11)在第一次溫育后，在FusionTMa-FP讀板器(Packard BioScience，Pangbourne，Berkshire，UK)上對(duì)試驗(yàn)板進(jìn)行讀數(shù)。
12)在第一次讀數(shù)后，向第1至10行的各孔中加入2μl稀釋的化合物。在第11行中{提供標(biāo)準(zhǔn)曲線}僅向B11-H11中加入化合物。向孔B12-H12{是陽(yáng)性對(duì)照}中加入2μl 100mM的標(biāo)準(zhǔn)化合物。
13)由零對(duì)照和陽(yáng)性孔計(jì)算Z’因子。通常得到0.7-0.9的值。
以上試驗(yàn)中所試驗(yàn)的化合物被歸入兩種活性范圍中的一種，即A＝＜10μM；B＝＞10μM，這些歸類如以上所報(bào)告。
還用生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)對(duì)候選的HSP90抑制劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)用Sulforhodamine B (SRB)試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性計(jì)算50％抑制濃度(IC50)。
第1天1)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞數(shù)。
2)用8道多頭移液器(multipipettor)向96-孔微量滴定板的各孔中加入160μl細(xì)胞混懸液(3600個(gè)細(xì)胞/孔或2×104個(gè)細(xì)胞/ml)。
3)將其于37℃下在CO2培養(yǎng)箱中溫育過(guò)夜。
第2天4)制備藥物貯備液，用介質(zhì)將每種藥物進(jìn)行連續(xù)稀釋，得到各孔中的終濃度。
5)用多頭移液器將40μl藥物(5×終濃度)一式四份地加至孔中。
6)對(duì)照孔位于96孔板的任何一側(cè)，向其中加入40μl介質(zhì)。
7)將板在CO2培養(yǎng)箱中溫育4天(48小時(shí))。
第6天8)將介質(zhì)倒入洗滌池中并將板緩慢浸入10％冰冷的三氯乙酸(TCA)中。在冰上放置約30分鐘。
9)通過(guò)將板浸入自來(lái)水浴中并將其翻轉(zhuǎn)將板用自來(lái)水洗滌3次。
10)將其在培養(yǎng)箱中干燥。
11)向96孔板的各孔中加入100μl 0.4％在1％乙酸中的SRB，(除最后一列(右手)外，其是0％對(duì)照，即沒有藥物，沒有染料。第一列將是不含藥物但含染料的100％對(duì)照)。放置15分鐘。
12)用1％乙酸洗滌4次，洗掉沒有結(jié)合的SRB染料。
13)將板在培養(yǎng)箱中干燥。
14)用100μl 10mM Tris堿使SRB溶解并將板在板振蕩器上放置5分鐘。
15)用讀板器在540nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算一式四份的孔的平均吸光度并將其表示為未進(jìn)行處理的對(duì)照孔的值的百分比。
16)用％吸光度值對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，確定IC50。
作為舉例說(shuō)明，實(shí)施例2的化合物在SRB生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中產(chǎn)生位于‘A’范圍(＜50μM)內(nèi)的IC50。
參考文獻(xiàn)為了對(duì)本發(fā)明和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)進(jìn)行更充分地描述和公開，在以上引用了許多公開物。在以下給出了這些參考文獻(xiàn)的全部引證。在此將這些參考文獻(xiàn)各自全文引入本公開內(nèi)容作為參考。
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權(quán)利要求
1.式(IA)或(IB)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物 其中Ar是芳基、芳基(C1-C6烷基)、雜芳基或雜芳基(C1-C6烷基)，其中的任何一個(gè)均任選地在其芳基或雜芳基部分上被取代，R1是氫或任選取代的C1-C6烷基；R2是氫、任選取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基或C1-C6炔基；或者羧基、甲酰胺或羧酸酯基團(tuán)；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2和Alk3是任選取代的C1-C3烷基，Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中Ar是任選取代的芳基或雜芳基；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2是任選取代的C1-C3烷基，p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的化合物，其中Ar是任選地被進(jìn)一步取代的2-羥基苯基。
4.權(quán)利要求3所述的化合物，其中Ar是在5-位上任選地被進(jìn)一步取代的2，4-二羥基苯基。
5.權(quán)利要求4所述的化合物，其中Ar是在5-位上被氯或溴進(jìn)一步取代的2，4-二羥基苯基。
6.權(quán)利要求4所述的化合物，其中Ar是在5-位上被任選取代的苯基或C1-C6烷基進(jìn)一步取代的2，4-二羥基苯基。
7.權(quán)利要求1所述的化合物，其中Ar是在5-位上被苯乙基進(jìn)一步取代的2，4-二羥基苯基，所述的苯乙基任選地在其苯環(huán)上被取代。
8.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中R1和R2獨(dú)立地是氫、甲基、乙基、正-或異-丙基、羥基乙基或芐基。
9.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的化合物，其中R1和R2各自是氫。
10.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中環(huán)A是式(IIA)或(IIB)的環(huán) 其中X表示CH或N，且Y表示CH、O、S或NH，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2和Alk3是任選取代的C1-C3烷基，Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRASO2-或-NRA-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
11.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中環(huán)A是式(IIA)或(IIB)的環(huán) 其中X表示CH或N，且Y表示CH、O、S或NH，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)，其中Alk1、Alk2是任選取代的C1-C3烷基，p、r和s獨(dú)立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRASO2-或-NRA-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述的任選取代的環(huán)A是式(IIA)的環(huán)，其中X是N且Y是NH或CH。
13.權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述的任選取代的環(huán)A是式(IIA)的環(huán)，X是N，且Y是-NRA-，其中RA是式-(Alk1)-Q的基團(tuán)，其中Alk1是C1-C3亞烷基且Q是任選取代的苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基或嗎啉基。
14.權(quán)利要求13所述的化合物，其中RA是任選取代的芐基。
15.權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述的任選取代的環(huán)A是式(IIA)的環(huán)，X是N且Y是-NRA-，其中RA是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團(tuán)。
16.權(quán)利要求15所述的化合物，其中p是1且m各自是1，Cyc是亞苯基。
17.式(IC)或(ID)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物 其中R是氫、任選的取代基或任選地在苯環(huán)上被取代的苯乙基，且R2、m、r、s、Alk3、Z和Alk2的定義如權(quán)利要求1中所述。
18.權(quán)利要求17所述的化合物，其中R2是氫。
19.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的化合物，其中R是氯、溴或任選地在苯環(huán)上被取代的苯乙基。
20.權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的化合物，其中是0，r是1，且Z是-C(＝O)NH-。
21.在本文中被具體地命名或公開的或者是本文實(shí)施例的主題的權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的化合物。
22.治療哺乳動(dòng)物、特別是人的對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病或病癥的方法，該方法包括對(duì)所述的哺乳動(dòng)物施用有效量的以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物。
23.用于人或獸醫(yī)學(xué)的權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的化合物。
24.用于治療對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病或病癥的權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的化合物。
25.權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的化合物在制備藥物中的用途，所述的藥物用于控制對(duì)抑制HSP90活性有響應(yīng)的疾病或病癥。
26.權(quán)利要求22所述的方法、用于權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的用途的化合物或權(quán)利要求25所述的用途，其中所述的疾病或病癥是癌。
27.權(quán)利要求22所述的方法、用于權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的用途的化合物或權(quán)利要求25所述的用途，其中所述的疾病或病癥是病毒性疾病、移植物排斥反應(yīng)、炎性疾病、哮喘、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、狼瘡、銀屑病、炎癥性腸病、囊性纖維化、與血管生成有關(guān)的疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、血管瘤或子宮內(nèi)膜異位癥。
全文摘要
式(IA)或(IB)的化合物或其鹽、N－氧化物、水合物或溶劑合物是HSP90的抑制劑，在對(duì)HSP90抑制有響應(yīng)的疾病如癌的治療中有價(jià)值。在各式中，Ar是芳基、芳基(C
文檔編號(hào)C07D409/12GK1738804SQ200380108919
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者M·C·貝斯威克, M·J·德萊斯代爾, B·W·迪莫克, E·麥克唐納 申請(qǐng)人:劍橋弗納里斯有限公司, 癌癥研究技術(shù)有限公司, 癌癥研究所