專利名稱：神經(jīng)纖毛蛋白－1抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干擾神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1)在血管生成范圍內(nèi)功能的分子和癌癥的治療。提供了分子、多肽、抗體、組合物和方法，用于減輕、抑制或治療血管生成、血管進(jìn)入腫瘤的入侵，和/或特定腫瘤細(xì)胞的入侵或轉(zhuǎn)移潛能。此外，提供了鑒定干擾神經(jīng)纖毛蛋白-1功能性分子的方法。此外，提供了方法，可以測定自然生成腫瘤細(xì)胞對其侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能是否取決于神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤脫落細(xì)胞，其轉(zhuǎn)移至新組織并形成繼發(fā)瘤。產(chǎn)生繼發(fā)瘤的過程稱為轉(zhuǎn)移并且是復(fù)雜的過程，其中腫瘤細(xì)胞移生的部位遠(yuǎn)離原發(fā)瘤。最近，研究已經(jīng)集中于鑒定轉(zhuǎn)移中涉及的特定蛋白質(zhì)，其可以用作更好的診斷或改良治療策略的基礎(chǔ)。已經(jīng)提出轉(zhuǎn)移的過程中涉及介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的細(xì)胞粘附分子(CAM)。正常細(xì)胞中的細(xì)胞粘附包括無數(shù)細(xì)胞表面蛋白之間的相互作用。已知粘附性相互作用包括細(xì)胞周圍物質(zhì)(例如，胞外基質(zhì)分子，例如纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白)和胞外粘附受體之間的相互作用。還變得明白的是細(xì)胞粘附分子實現(xiàn)更多的復(fù)雜功能，其導(dǎo)致細(xì)胞獲得增殖并入侵宿主組織的能力。
Liotta(1986)Cancer Res.46，1-7已經(jīng)提出轉(zhuǎn)移過程的三步假說第一步，通過細(xì)胞表面受體腫瘤細(xì)胞粘附。接著，固定的腫瘤細(xì)胞分泌水解酶或誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌酶，其可以局部降解基質(zhì)?；|(zhì)水解大多發(fā)生在接近腫瘤細(xì)胞表面的高度局部化區(qū)域內(nèi)。第三步，腫瘤細(xì)胞移動進(jìn)通過蛋白水解改變的基質(zhì)區(qū)域內(nèi)。因此，基質(zhì)的入侵不僅僅是由于被動的生長壓而且需要活性生化機(jī)制。周圍正常組織的降解是惡性腫瘤侵襲力的重要特征。
腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移還可以描述為未分化細(xì)胞的生長，該細(xì)胞分裂快并三維擴(kuò)張來生成新組織塊。該團(tuán)塊中的細(xì)胞需要氧和營養(yǎng)。隨著腫瘤生長，其中的許多細(xì)胞離最近的血管太遠(yuǎn)以致不能維持足夠的氧濃度。當(dāng)氧水平降低(稱為低氧的情況)，激活了特定基因。這些基因之一，低氧可誘導(dǎo)因子1(HIF-1)反過來結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因并幫助激活VEGF基因表達(dá)。除了低氧，其它因素可以激活腫瘤細(xì)胞中的VEGF表達(dá)。例如，特定激素或生長因子已經(jīng)顯示可以激活VEGF表達(dá)，且一些研究提出特定癌基因的激活或特定腫瘤抑制基因的失活也可以導(dǎo)致VEGF基因表達(dá)。
腫瘤細(xì)胞分泌VEGF蛋白并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體。這些細(xì)胞開始形成進(jìn)入腫瘤的新血管，提供了支持腫瘤生長的氧和營養(yǎng)供給。
來自先前存在的脈管系統(tǒng)的新脈管生長過程稱為血管生成并通常發(fā)生在所有組織發(fā)展的過程中。
此外，在此將血管生成理解為新血管的萌發(fā)，其依賴于內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。其發(fā)生在發(fā)育和生長中的特定時間，例如在胚胎發(fā)育或創(chuàng)傷愈合的過程中。(Folkman等(1987)Science235，442-447，F(xiàn)olkman(1991)J.Natl.Cancer Inst.82，4-6)。
此外，已經(jīng)顯示依賴新血管生長的疾病的發(fā)病機(jī)理涉及血管生成，其中最相關(guān)的是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移瘤的生長(Hanahan等(1996)Cell86，353-364)。
認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是生理性和病理性血管生成的主要調(diào)節(jié)劑，通過內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體作用并介導(dǎo)血管生成的信號((Dvorak等(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.237，97-132，Neufeld等(1999)FASEB J.13，9-22)。
血管生成基本上依賴于血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長并形成新血管。該蛋白質(zhì)家族由六個成員(VEGF A-E和PIGF)組成，其中對于血管生成VEGF-A是最重要的。存在七個已知的VEGF-A剪接變體，其中六個是促-血管生成的(pro-angiogenic)。從含有九個外顯子單基因的可變剪接產(chǎn)生VEGF異構(gòu)體(Ferrara，等，Endocr.Rev.，1318-32(1992)；Tischer等，J.Biol.Chem.，80611947-11954(1991)；Ferrara，等，Trends Cardio Med.，3244-250(1993)；Polterak等，J.Biol.Chem.，27271517158(1997))。人VEGF異構(gòu)體由121、145、165、189，和206個氨基酸單體組成，每個都能夠形成同型二聚體(Polterak等，J Biol.Chem，2727151-7158(1997)；Houck等，Mol.Endocrinol.，81806-1814(1991))。VEGF121和VEGF165異構(gòu)體的最豐富。
如前所述，VEGF特異刺激VEGF受體并因此誘發(fā)VEGF受體酪氨酸激酶、KDR/F 1k-1和/或Flt-1，其主要通過內(nèi)皮細(xì)胞(EC)來表達(dá)(Terman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1871579-1586(1992)；Shibuya等，Oncogene，5519-524(1990)；De Vries等，Science，265989-991(I 992)；Gitay-Goran等，J.Biol.Chem.，2876003-6096(1992)；Jakernan等，J Clin.Inves t.，89244-253(1992))。
VEGF活性如促有絲分裂活性、趨化性，和形態(tài)學(xué)改變的誘導(dǎo)是通過KDR/Flk-1而不是Flt-1介導(dǎo)的，盡管兩個受體都通過結(jié)合VEGF進(jìn)行磷酸化(Mlllauer等，Cell，72835-846(1993)；Waltenberger等，J Biol.Chem.，26926988-26995(1994)；Seetharam等，Oncogene，10135-147(1995)；Yoshida等，Growth Factors，7131-138(1996))。最近，Soker等鑒定出了新的VEGF受體，其在EC和各種腫瘤衍生的細(xì)胞系如乳腺癌衍生的MDA-MB-231(231)細(xì)胞上表達(dá)(Soker等，J.Biol.Chem.，2715761-5767(1996))。
該受體需要VEGF異構(gòu)來包含外顯子7編碼的部分。例如，盡管VEGF121和VEGF165都結(jié)合KDR/Flk-I和Flt-1，只有VEGF165結(jié)合新受體。
因此，似乎新受體是異構(gòu)特異性受體。已經(jīng)命名為VEGF165受體(VEGF165R)。其還結(jié)合189和206異構(gòu)體。VEGF165R具有約130kDa的分子量，其以約2×10-10M的Kd結(jié)合VEGF165，相比較KDR/Flk-1約為5×10-12M。結(jié)構(gòu)功能分析中，其直接顯示了VEGF165通過其外顯子7編碼的結(jié)構(gòu)域和VEGF165R結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域在VEGF121中不存在(Soker等，J Biol.Chem.，27157615767(1996))。
通過分離VEGF165R相關(guān)的DNA，發(fā)現(xiàn)這個新的VEGF受體結(jié)構(gòu)上和Flt-1或KDR/Flk-1無關(guān)，且不僅通過內(nèi)皮細(xì)胞而且通過非內(nèi)皮細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞來表達(dá)。
此外，在確定VEGF165R的功能中，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)將該受體鑒定為神經(jīng)細(xì)胞指導(dǎo)的細(xì)胞表面介質(zhì)并稱為神經(jīng)纖毛蛋白(Kolodkin等，Cell 90753-762(1997))。
神經(jīng)纖毛蛋白-1是具有約130kDa分子量的跨膜糖蛋白。神經(jīng)纖毛蛋白-1是多功能蛋白。Fujisawa等在(1998)Cur.Opin.Neurobiol.8,587-592中描述了神經(jīng)纖毛蛋白-1作為神經(jīng)指導(dǎo)介質(zhì)Semaphorin/collapsin家族的受體。此外，內(nèi)皮細(xì)胞中神經(jīng)纖毛蛋白-1的表達(dá)增強(qiáng)了VEGF165和VEGFR-2的結(jié)合以及VEGF165-誘導(dǎo)的趨化性。根據(jù)Gagnon等和WO99/29729，神經(jīng)纖毛蛋白-1作為提高VEGFR-2活性的共同受體(Gagnon等(2000)PNAS 97，2573-2578)。
神經(jīng)纖毛蛋白-1也在外皮層來源的特定腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，如源自前列腺和乳腺癌以及源自黑素瘤的細(xì)胞。在用乳腺癌細(xì)胞的實驗中，以劑量依賴方式VEGF165刺激了乳腺癌細(xì)胞游動性(WO99/29729)。比較了兩種類型的大鼠前列腺癌細(xì)胞，AT2.1細(xì)胞和AT 3.1細(xì)胞，顯示了高移動的AT 3.1細(xì)胞比較少移動的AT2.1細(xì)胞表達(dá)更多的神經(jīng)纖毛蛋白-1。當(dāng)細(xì)胞用神經(jīng)纖毛蛋白-1cDNA轉(zhuǎn)染來過表達(dá)神經(jīng)纖毛蛋白-1時，collapsin-1，神經(jīng)纖毛蛋白-1的配體，抑制PAE細(xì)胞(豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞)的基礎(chǔ)移動。所有這些由WO99/29729的作者來解釋，其提出了神經(jīng)纖毛蛋白-1的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的移動表型有關(guān)。然而，基于已經(jīng)過表達(dá)的研究給蛋白質(zhì)分配生理作用是危險的和推測的，科學(xué)中的承認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)是小心翼翼地解釋過表達(dá)研究的結(jié)果。
如WO99/29729以及Soker等在Cell(1998)92，735-745中所述的，神經(jīng)纖毛蛋白-1可以作為VEGFR-2的共同受體用于VEGF165來介導(dǎo)該調(diào)節(jié)劑對生理性和病理性血管生成的作用。VEGFR-2只在內(nèi)皮和造血前體、內(nèi)皮細(xì)胞、新生造血干細(xì)胞和臍帶間質(zhì)中表達(dá)(綜述參見Robinson和Stringer J.Cell Sci.(2001)114，853-865)。如果神經(jīng)纖毛蛋白-1的癌癥相關(guān)功能取決于其在VEGF信號中的作用，如WO99/29729中所建議的，那么該神經(jīng)纖毛蛋白-1的癌癥相關(guān)功能只和存在VEGF時-起表達(dá)神經(jīng)纖毛蛋白-1和VEGFR-2的組織相關(guān)。然而，VEGFR-2的表達(dá)限制于特定組織。因此不清楚是否神經(jīng)纖毛蛋白-1在那些不表達(dá)VEGFR-2的組織中起任何癌癥相關(guān)作用。WO99/29729的作者顯示了VEGF165以劑量依賴方式刺激了231乳腺癌細(xì)胞移動性。他們假設(shè)不表達(dá)VEGF受體KDR或Flt-1的腫瘤細(xì)胞通過神經(jīng)纖毛蛋白-1對VEGF165起反應(yīng)。
蛋白質(zhì)生理作用的確定是決定是否干擾該蛋白功能是或不是治療疾病的可能途徑的先決條件。必須注意的是生理環(huán)境，即例如在患者自然生成腫瘤細(xì)胞中，神經(jīng)纖毛蛋白-1與其他可以調(diào)節(jié)和改變神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的蛋白質(zhì)-起過表達(dá)。神經(jīng)纖毛蛋白-1和決定其生理作用的相互作用的蛋白質(zhì)之間是功能相互作用。
因此，本發(fā)明的目的是鑒定并進(jìn)-步提供結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1和調(diào)節(jié)神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子，并因此可以用于進(jìn)-步表征神經(jīng)纖毛蛋白-1功能，還可以用于主動干擾和調(diào)節(jié)如在醫(yī)療或治療中的神經(jīng)纖毛蛋白-1功能。
發(fā)明概述在可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成以及腫瘤細(xì)胞侵襲和/或粘附的分子的無偏見篩選中，已經(jīng)令人驚訝地將結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外結(jié)構(gòu)域的多肽，尤其是抗體片段鑒定為這樣的抑制劑。
本發(fā)明涉及神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)合劑，例如，多肽、抗體、抗體片段、單鏈抗體(scFv)或生物綴合物，其可以特異性地和神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能。
進(jìn)-步的實施方案中，神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)合劑(NPB)通過另外的特征來表征，既它們能夠調(diào)節(jié)或抑制神經(jīng)纖毛蛋白相關(guān)功能，但是不干擾或抑制VEGF/神經(jīng)纖毛蛋白-1的相互作用。
本發(fā)明的NPB可以選自序列SEQ ID No1，2，5至38。
此外，如果需要，本發(fā)明的NPB可以用可檢測基團(tuán)標(biāo)記。
本發(fā)明進(jìn)-步涉及藥物組合物，包括NPB或含有本發(fā)明NPB的生物綴合物。
本發(fā)明進(jìn)-步的實施方案涉及編碼本發(fā)明NPB的核酸分子，以及包括該核酸的載體和含有該載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)-步實施方案中涉及NPB作為抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子在制備用于治療或預(yù)防如中胚層來源的自然生成癌細(xì)胞侵襲和/或轉(zhuǎn)移的藥物中的用途；其中所述癌細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能依賴于神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能。
本發(fā)明進(jìn)-步實施方案中涉及治療或預(yù)防患者中侵襲和/或轉(zhuǎn)移的方法，其中所述癌細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能依賴于神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能。
仍然本發(fā)明進(jìn)-步實施方案中涉及本發(fā)明NPB作為藥物或本發(fā)明NPB在制備用于治療或預(yù)防神經(jīng)纖毛蛋白-1依賴性血管生成和尤其和腫瘤相關(guān)的非生理性血管生長的藥物中的用途，其中所述NPB不干擾或抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1和VEGF165之間的相互作用。
本發(fā)明進(jìn)-步實施方案中涉及自然生成癌細(xì)胞的侵襲力和/或粘附力與神經(jīng)纖毛蛋白-1功能性相關(guān)性的測定方法。
本發(fā)明進(jìn)-步實施方案中，涉及用于抑制自然生成癌細(xì)胞侵襲力和/或粘著力的配體的鑒定方法，尤其是鑒定結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外結(jié)構(gòu)域的這樣的配體。
仍然本發(fā)明進(jìn)-步實施方案中，涉及用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的配體的鑒定方法，尤其是鑒定結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外結(jié)構(gòu)域的這樣的配體。
發(fā)明詳述現(xiàn)在本發(fā)明顯示通過使用本發(fā)明分子可以抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1依賴性血管生成、侵襲和/或粘附。令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用VEGF165刺激HT1080細(xì)胞(人肉瘤細(xì)胞系)沒有影響細(xì)胞的侵襲力。腫瘤細(xì)胞(例如，HT1080細(xì)胞)的侵襲力只在FCS存在下可以受到刺激，而HUVEC細(xì)胞(初級人臍靜脈上皮細(xì)胞)的移動能力才真正地受到VEGF165的刺激。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明數(shù)種分子抑制HUVEC細(xì)胞的管形成(tubeformation)，用于研究血管生成的試驗。本發(fā)明第-次顯示了-些抑制血管生成的神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)合劑(NPB)沒有干擾或抑制NP-1/VEGF165的相互作用。結(jié)果進(jìn)-步表明這些NPB結(jié)合與VEGF165不同的NP-1表位。
結(jié)果表明神經(jīng)纖毛蛋白-1作為轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞侵襲和/或粘附的活性介質(zhì)，而且具有血管生成的功能作用，其中NPB不干擾或抑制NP-1/VEGF165的相互作用。這第-次公開了發(fā)展抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物的可能性，尤其是目前癌癥治療很難治愈的轉(zhuǎn)移性肉瘤，其中轉(zhuǎn)移潛能取決于血管生成、侵襲和/或粘附的神經(jīng)纖毛蛋白-1依賴性影響。
為了更全面地理解本發(fā)明在此所述的，提供了以下的詳述和定義。如在此所用的，將使用以下定義，除非另外指出。
如在此所用的“多肽”是含有多于10，優(yōu)選多于20，最優(yōu)選多于30，且少于10000，更優(yōu)選少于2500，最優(yōu)選少于1000個氨基酸的分子。還包括了具有基本氨基酸序列同-性的多肽和含有低百分比修飾或非天然氨基酸的多肽。
本發(fā)明表述中術(shù)語多肽通常還涵蓋術(shù)語抗體、抗體片段或單鏈抗體(scFv)。
如在此所用的術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”指的是任何免疫結(jié)合劑，包括多克隆和單克隆抗體。根據(jù)重鏈中恒定區(qū)的類型，將抗體分配于五個主要類別之-IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些中的數(shù)個進(jìn)一步分成亞類或同種型如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)各自稱為α、δ、ε、γ、μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。
抗體還可以選自修飾的免疫球蛋白，例如化學(xué)或重組制得的抗體、CDR(互補(bǔ)決定區(qū))嫁接的(grafted)抗體或人源化抗體、定點誘變抗體，這些抗體在其CDR區(qū)尤其是在其CDR3區(qū)顯示和本發(fā)明相應(yīng)抗體片段基本氨基酸序列同一性，并保持和相應(yīng)抗體片段對結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1基本上相同的親和性。
抗體的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))是這些分子決定其特異性并和特異性配體接觸的部分。CDR是分子最易變的部分并導(dǎo)致這些分子多樣性。它們在人IgG中結(jié)構(gòu)上限定為，如輕鏈的氨基酸24至41(CDR-L1)，50至57(CDR-L2)和90至101(CDR-L3)和重鏈的氨基酸26至38(CDR-H1)，51至70(CDR-L2)和100至125(CDR-H3)(參見Kabat等，(1987)第4版US Department of Health and Human Services，PublicHealth Service，NIH，Bethesda)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過將所述抗體片段與所述人I gG比對例如使用可以″Blast″的NCBI程序可以容易地確定抗體片段的CDR區(qū)，并因此相互比對兩個序列，鑒定出對應(yīng)于人IgG CDR的抗體片段的氨基酸。
如在此所用的基本氨基酸序列同一性意思是兩個比對的氨基酸序列尤其是比對的CDR至少70％，優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％，更優(yōu)選全部但是除了5個，仍然更優(yōu)選全部但是除了3個，更優(yōu)選全部但是除了1個氨基酸是相同的。
術(shù)語“抗體片段”用來指抗體的任何片段如具有抗原結(jié)合區(qū)的分子，且該術(shù)語包括抗體片段如scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、FV、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、二體，等等。制備和使用各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見Kabat等(1991)J.Immunol.147，1709-19)，在此特意引入作為參考。
“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單多肽鏈中。通常，scFv多肽進(jìn)一步包括VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，能夠使scFv形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。
“Fv”片段是保留完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。
“dsFv”是二硫化物穩(wěn)定的Fv。
“Fab”片段，是抗原結(jié)合片段，含有完整的輕鏈并和重鏈結(jié)構(gòu)域的VH和CH1配對。
“Fab-片段，是還原的F(ab′)2片段。
“F(ab′)2”片段，是含有由鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段。
“單鏈結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)”是具有源自抗體結(jié)構(gòu)的一個結(jié)構(gòu)域的一個(而非兩個)蛋白鏈的抗體。DAB開拓了該發(fā)現(xiàn)，對于一些抗體，抗體分子的一半結(jié)合其靶抗原幾乎象整個分子一樣(Davies等(1996)Protein Eng.9531-537)。
“二體”是二價或雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域是在單多肽鏈上表達(dá)，但是使用的接頭太短以致不能在相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，因此迫使結(jié)構(gòu)域和另-鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并形成兩個抗原結(jié)合位點(Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6444-6448)。
術(shù)語“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”分別指的是可檢測的標(biāo)記或引入該標(biāo)記，例如通過引入熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或放射標(biāo)記的氨基酸或?qū)晒鈭F(tuán)、發(fā)色團(tuán)或放射標(biāo)記連接至多肽或連接通過標(biāo)記的第二分子可檢測的部分，該第二分子含有通過光學(xué)或比色方法可檢測的熒光標(biāo)記或酶活性。這樣的兩步檢測系統(tǒng)的實例是公知的生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)。標(biāo)記多肽和糖蛋白的各種方法是本領(lǐng)域公知的并可以使用(例如參見Lobl等，(1988)Anal.Biochem.，170，502-511)。
“表位”包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或抗體片段的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位的決定簇通常由分子化學(xué)活性表面基團(tuán)構(gòu)成如暴露的氨基酸、氨基糖，或其它碳水化合物側(cè)鏈，并通常具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異性電荷特征。
如在此所用的“自然生成癌細(xì)胞”是未在實驗室中進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它遺傳改造的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞不包括例如載體的人造DNA序列，或只在其它種發(fā)現(xiàn)但是通常不存在于衍生自然生成癌細(xì)胞的物種中的DNA序列。然而，如果由于在衍生自然生成癌細(xì)胞個體中發(fā)生的突變和選擇過程和/或在自然生成癌細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)過程中已經(jīng)出現(xiàn)了那些序列，自然生成癌細(xì)胞可以包括通常不在衍生其的種中發(fā)現(xiàn)的序列。
如在此所用的所選擇的癌細(xì)胞類型由源自例如中胚層的腫瘤細(xì)胞組成，優(yōu)選源自軟組織和肉瘤、纖維瘤、粘液瘤、脂肪瘤、肌瘤、復(fù)合的和基質(zhì)瘤、滑液樣瘤、間皮瘤、淋巴管瘤、骨和軟骨肉瘤、巨細(xì)胞瘤、混雜骨腫瘤、牙源性腫瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、漿細(xì)胞腫瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、免疫增生疾病和白血病，尤其是源自軟組織和肉瘤、纖維瘤、粘液瘤、脂肪瘤、肌瘤、復(fù)合的和基質(zhì)瘤、滑液樣瘤、間皮瘤、淋巴管瘤、骨和軟骨肉瘤、巨細(xì)胞瘤、混雜骨腫瘤、牙源性腫瘤的腫瘤細(xì)胞，尤其是源自肉瘤的腫瘤細(xì)胞，尤其是源自骨肉瘤或軟組織肉瘤。瘤還可以源自腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、胃、腸下部、結(jié)腸、肝、腎、前列腺和胰腺。
一實施方案中，肉瘤可以是所有肉瘤除了血管瘤(angioma，haemangioma)。
如在此所用的“治療轉(zhuǎn)移性腫瘤”或“治療微小轉(zhuǎn)移”意思是通過作為單個藥物或和其他藥物組合的本發(fā)明分子穩(wěn)定、預(yù)防、延遲，或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定的疾病或“沒改變”(NC)是對疾病過程的描述，至少4周內(nèi)轉(zhuǎn)移沒有改變或減輕低于50％或增加低于25％。例如，預(yù)防是在治療開始后沒有檢測到新轉(zhuǎn)移。和未治療患者相比較這可以導(dǎo)致治療患者兩至三倍中值和/或％年存活率。延遲表示至少8周、3個月、6個月或甚至-年的時間段內(nèi)，在治療開始后沒有檢測到新的轉(zhuǎn)移。抑制意思為用本發(fā)明分子治療的組中新轉(zhuǎn)移的平均大小或總數(shù)是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％低于未治療組。腫瘤學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過用于測定轉(zhuǎn)移的常規(guī)接受的實踐和診斷程序來測定轉(zhuǎn)移的數(shù)量、大小和發(fā)病率，例如Harrisons Principles ofInternal Medicine 15thed 2001 Mc Graw Hill中略述的。
在此所用的“轉(zhuǎn)移性腫瘤”包括在初識部位能夠轉(zhuǎn)移的腫瘤和在繼發(fā)部位轉(zhuǎn)移的腫瘤。這樣的轉(zhuǎn)移性腫瘤可以是任何器官或組織來源的，如腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、胃、腸下部、肝、腎或前列腺等，尤其是中胚層來源的組織如骨、脾、甲狀腺、內(nèi)皮、卵巢，或淋巴組織。
微小轉(zhuǎn)移是大小小于2mm的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，通常只能通過組織學(xué)方法來測定。
在此所用的“血管生成”指的是內(nèi)皮細(xì)胞形成管并最終形成完善血管的能力。細(xì)胞的血管生成潛能或換句話說血管生成的抑制可以如實施例16中所述的所謂管形成試驗中進(jìn)行測定。可以通過細(xì)胞形成或未形成閉合多邊形的能力和細(xì)胞聚集的狀態(tài)來觀察和測量血管生成的抑制。如實施例16和

圖14中證明的，細(xì)胞顯著的聚集的和閉合多邊形形成的缺失與內(nèi)皮細(xì)胞的管形成密切相關(guān)。
在此所用的“侵襲力”是細(xì)胞遷移通過其他細(xì)胞層或遷移通過胞外基質(zhì)的能力。可以通過實施例8或?qū)嵤├?中所述的Matrigel試驗來測定侵襲力。以特定培養(yǎng)階段過程中到達(dá)濾器下表面的細(xì)胞來測定侵襲。如實施例8或?qū)嵤├?的侵襲試驗中，當(dāng)6小時至12小時內(nèi)多于40％的細(xì)胞到達(dá)濾器的另-側(cè)并形成集落時，將自然生成癌細(xì)胞定義為侵襲性的。而對照細(xì)胞在相同時間段內(nèi)僅形成5％集落，并定義為非侵襲性的。
在此所用的“粘附力”是從細(xì)胞生長基質(zhì)中除去重懸浮成單細(xì)胞溶液(不直接接觸溶液的其他細(xì)胞)，并再放置于可能粘附的基質(zhì)上后細(xì)胞再粘附的能力。如實施例11或?qū)嵤├?2所述的試驗中，如果在30-120分鐘時間內(nèi)多于40％的細(xì)胞粘附，將細(xì)胞定義為粘附的。而在相同時間段內(nèi)只有5％對照細(xì)胞粘附。
如在此所用的轉(zhuǎn)移潛能是腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)離衍生腫瘤細(xì)胞的原發(fā)腫瘤部位形成新腫瘤的能力(轉(zhuǎn)移)。通過如將1×106個細(xì)胞注射入無胸腺裸鼠的側(cè)尾靜脈并在如注射2個月后檢測肺中腫瘤結(jié)數(shù)量來測定轉(zhuǎn)移潛能，如描述于Huang等(1996)Oncogene 13，2339-2347第2346頁的“腫瘤細(xì)胞注射”部分，或Radinsky等(1994)Oncogene91877-1883第1882頁的“動物和腫瘤產(chǎn)生”和“鈣化基質(zhì)的組織化學(xué)分析”部分。將該試驗中在肺中產(chǎn)生多于3，優(yōu)選多于8，更優(yōu)選多于20個腫瘤結(jié)的細(xì)胞系認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性的。
治療有效量是消除或減緩患者腫瘤負(fù)擔(dān)，或預(yù)防、延遲或抑制轉(zhuǎn)移的量。劑量取決于許多參數(shù)，包括腫瘤性質(zhì)、患者病史、患者條件、和細(xì)胞毒性劑共同使用的可能，以及給藥的方法。給藥的方法包括注射(例如非腸道的、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)，等等)，為此提供了無毒性藥物學(xué)上可接受載體中的抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子。通常，選擇合適的載體和稀釋劑，使得不會顯著削弱結(jié)合劑的生物活性(例如，結(jié)合特異性、親和性或穩(wěn)定性)，如水、鹽水、林格(Ringer′s)溶液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、不揮發(fā)油、油酸乙酯，或脂質(zhì)體?？山邮茌d體包括生物相容、惰性或生物可吸收鹽，緩沖劑，寡或多糖，聚合物，粘彈性化合物如透明質(zhì)酸，粘度改良劑、防腐劑，等等。此外，藥物組合物或制劑還可以包括其他載體、助劑，或無毒性、非治療、非致免疫的穩(wěn)定劑等等。通常劑量為約0.01至約20mg/kg，或優(yōu)選約1至約10mg/kg。
根據(jù)腫瘤類型、患者條件、其他健康問題，和各種因素，可以結(jié)合化療、外科手術(shù)，和放療使用抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能分子的治療方法。抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子還可以用作治療組合物中的單個有效藥物。
“抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子”是引起神經(jīng)纖毛蛋白-1生物活性抑制的分子。可以通過測量-個或多個神經(jīng)纖毛蛋白-1生物活性的指標(biāo)來測定該神經(jīng)纖毛蛋白-1生物活性的抑制，這些指標(biāo)如神經(jīng)纖毛蛋白-1依賴性血管生成、神經(jīng)纖毛蛋白-1依賴性侵襲力或神經(jīng)纖毛蛋白-1依賴性粘附?？梢酝ㄟ^-個或多個體外或體內(nèi)試驗來測定這些神經(jīng)纖毛蛋白-1生物活性指標(biāo)(參見，實施例8或9和實施例11或12，或?qū)嵤├?6)。優(yōu)選，分子抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1活性的能力可以通過侵襲性人肉瘤細(xì)胞尤其是實施例8和9或?qū)嵤├?1和12或19中所用細(xì)胞的神經(jīng)纖毛蛋白-1誘導(dǎo)侵襲力或粘附的抑制來測定。優(yōu)選，分子抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1活性的能力通過HUVEC細(xì)胞神經(jīng)纖毛蛋白-1誘導(dǎo)血管生成的抑制來測定，尤其是如實施例16中所述的。
本發(fā)明的“抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子”不是蛋白功能的常規(guī)抑制劑分子，如蛋白酶，如去污劑如尿素或鹽酸胍，如重金屬原子或如與生物分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖)共價和非特異性反應(yīng)的小分子(例如，醛或異氰酸鹽)。抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子通過其在特定濃度抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的能力來表征，在該濃度其不抑制胰島素受體(例如，在抗-磷酸酪氨酸Western印跡試驗中測定，參見例如B.Cariou等(2002)J Biol Chem.，277，4845-52)和乙酰膽堿受體(例如通過測量Ca流入量來測定，參見M.Montiel等(2001)Biochem Pharmacol.63，337-42.)和B-CAM細(xì)胞表面糖蛋白(例如，通過測定血紅蛋白A紅細(xì)胞(AA RBC)和固定化層粘連蛋白的結(jié)合，如Udani等(1998)J.Clin.Invest.101，2550-2558第2551頁的“flowchamber assay(流動室試驗)”部分中所述的)的功能。在相同濃度只抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能而沒有顯著影響提及的其他三個受體功能的分子是本專利中所用的抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子。當(dāng)和用相同實驗條件但是沒有使用本發(fā)明分子的負(fù)對照相比較時，抑制應(yīng)該理解為至少15％，優(yōu)選20％，更優(yōu)選25％、30％、40％、50％或甚至60％的功能降低，功能如通過上述侵襲和/或粘附試驗中的神經(jīng)纖毛蛋白-1功能所定義的。如果本發(fā)明分子影響的其他三個受體的功能降低低于10％，更優(yōu)選低于5％，將分子定義為沒有顯著影響該其它三個受體的功能。
此外，在本發(fā)明分子抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1基因表達(dá)的情況中，在針對存在的β微管蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化的定量Western印跡中測量時，這樣的分子降低了神經(jīng)纖毛蛋白-1表達(dá)高于50％，優(yōu)選高于80％，更優(yōu)選高于90％，最優(yōu)選高于95％，當(dāng)實驗中存在的濃度為10nM至100μM，優(yōu)選約1μM時，其中將神經(jīng)纖毛蛋白-1量和兩個其它相同樣品進(jìn)行比較，其中本發(fā)明分子的一個樣品可以抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1表達(dá)。相同實驗中，本發(fā)明分子降低每個細(xì)胞存在的β微管蛋白量不高于20％，且所述分子降低胰島素和B-CAM細(xì)胞表面糖蛋白的相對水平不高于20％。
此外，本發(fā)明多肽尤其是本發(fā)明抗體或抗體片段的情況中，當(dāng)所述抗體片段以1nm至50μM濃度，優(yōu)選約20μM濃度存在時，如果降低了實施例8或9或?qū)嵤├?1或12實驗中自然入侵癌細(xì)胞的侵襲力和/或粘附力高于15％，優(yōu)選高于20％，更優(yōu)選25％、30％、40％、50％或甚至60％如上定義神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的降低，認(rèn)為本發(fā)明多肽抑制了神經(jīng)纖毛蛋白-1的生物功能。
此外，本發(fā)明小化學(xué)化合物的情況中，當(dāng)以10nm至100μM濃度，優(yōu)選約1μM濃度存在，如果降低了實施例8或9和實施例11或12實驗中自然侵襲性癌細(xì)胞的侵襲力和/或粘附力高于15％，優(yōu)選高于20％，更優(yōu)選25％、30％、40％、50％或甚至60％如上定義神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的降低，而沒有影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞循環(huán)進(jìn)展(通過碘化丙錠染色和FACS分析來分析細(xì)胞群體的DNA含量而測定)，且沒有增加顯示凋亡信號的培養(yǎng)細(xì)胞百分比(通過測量顯示DNA片段化的細(xì)胞百分比來測定，例如通過所謂的隧道試驗(tunnel assay))，認(rèn)為所述化合物抑制了神經(jīng)纖毛蛋白-1的生物功能。如本發(fā)明中所用的小化學(xué)化合物是具有約50Da至10000Da分子量的分子，優(yōu)選100Da至4000Da，更優(yōu)選150Da至2000Da，或其生理學(xué)上可接受的鹽。
如在此所用的“鑒定”意思是從包括相關(guān)的但具有些微不同特征的非同一生物分子的混合物中鑒定出具有所需特征的生物分子。
如在此所用的“配體”是通過可擴(kuò)增配體-展示單元(ligand-displaying unit)可顯示的分子。配體是ALDU的一部分，通過其ALDU可以和靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選是如上定義的多肽、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸，含有多于20個堿基單位但少于10,000優(yōu)選少于1,000個堿基單位的寡核苷酸。配體可以和抗原的胞外域結(jié)合。該結(jié)合具有特異性，即配體以高親和性和一個抗原結(jié)合但是以較低的親和性和中度相關(guān)的抗原結(jié)合，例如10或50或200倍低的親和性。中度相關(guān)抗原是胞外域具有達(dá)30％氨基酸同一性的抗原。
如在此提及的“和神經(jīng)纖毛蛋白-1特異性結(jié)合”的配體可以是實施例2和3中所給緩沖條件下和神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合的配體。例如使用通常所說的BIACORE系統(tǒng)可以測量配體和神經(jīng)纖毛蛋白-1之間的解離常數(shù)(參見，例如，F(xiàn)ivash等Curr OpinBiotechnol.(1998)9，97-101)，然后可以將“結(jié)合特異性”理解為意思是配體和神經(jīng)纖毛蛋白-1之間的解離常數(shù)低于10μM，優(yōu)選低于1μM，更優(yōu)選低于500、400、300、200、100、50、20nM，最優(yōu)選為0.1nM至20nM，如果在標(biāo)準(zhǔn)條件下測得，例如20℃，大氣壓和合適緩沖液中，如20mM Tris、100mM NaCl、0.1mM EDTA，且總pH為7.0。此外，分子不和神經(jīng)纖毛蛋白-2結(jié)合，其是神經(jīng)纖毛蛋白家族的另一成員，并和神經(jīng)纖毛蛋白-1具有47％的同源性。因此，配體和神經(jīng)纖毛蛋白-2之間的解離常數(shù)高于100μM，優(yōu)選高于1mM，或者比配體和神經(jīng)纖毛蛋白-1之間的解離常數(shù)差(高)至少50倍，優(yōu)選至少200倍，1000倍或5000倍。
在此所用的術(shù)語“至少一個”意思是“一個或多于一個”，尤其是一個、兩個、三個、四個和五個。
本發(fā)明涉及多肽、抗體、抗體片段或單鏈抗體，其可以特異性地結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的胞外域并抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1在血管生成、入侵和/或轉(zhuǎn)移中的功能。這樣的多肽、抗體、抗體片段或單鏈抗體在本發(fā)明范圍內(nèi)通常理解為或歸納為術(shù)語“神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)合劑(NPB)”。那些NPB包括選自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或SEQ ID No.5至SEQID No.38的序列。
優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽是抗體片段，尤其是scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體，更優(yōu)選scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體，仍然更優(yōu)選是scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體，更優(yōu)選是scFv。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明多肽是抗體，一優(yōu)選實施方案中，抗體源自scFv抗體片段，另一優(yōu)選實施方案中，是多克隆或單克隆抗體，尤其是人單克隆抗體。
抗人神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合抗體可以選自修飾的免疫球蛋白，例如化學(xué)或重組制得的抗體或人源化抗體，定點誘變抗體，這些抗體在其CDR區(qū)域，尤其是其CDR3區(qū)域顯示和本發(fā)明相應(yīng)抗體片段基本氨基酸序列同一性，并保持和相應(yīng)抗體片段對結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1基本上相同的親和性。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明多肽是人抗體，選自IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，尤其是IgG和IgM，更優(yōu)選IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4。
另一優(yōu)選實施方案中，抗體或抗體片段的CDR3區(qū)域和圖10中所示CDR3區(qū)域之一相同。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽，尤其是本發(fā)明的抗體片段或抗體用可檢測標(biāo)記來標(biāo)記。尤其是，可檢測標(biāo)記的實例是放射性同位素、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、酶或放射性同位素。例如，可檢測標(biāo)記可以選自該組。
另一實施方案中，本發(fā)明多肽可以是分別共價或非共價綴合和/或偶聯(lián)于另一蛋白質(zhì)、固體基質(zhì)(例如，珠子)、進(jìn)一步提高對靶細(xì)胞毒性的細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞生長抑制劑、前體藥物、或能夠改變細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)纖毛蛋白-1或募集免疫細(xì)胞的效應(yīng)分子，和自身形成多體。所有這些綴合物是本發(fā)明的“生物綴合物”。
細(xì)胞毒性劑的實例包括，但不限制于，道諾紅菌素、紫杉醇、阿霉素、氨甲喋呤、5FU、長春滅瘟堿(vinblastin)、放線菌素D、鬼臼亞乙苷、順鉑、阿霉素、染料木黃酮(genistein)、andribosome抑制劑(例如，trichosantin)，或各種細(xì)菌毒素(例如，假單孢菌外毒素；金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A)。
使用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制得含有本發(fā)明多肽尤其是本發(fā)明抗體片段或抗體的帶有所述細(xì)胞毒性部分的生物綴合物。這樣試劑的一些實例是N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫)-丙酸(SPDP)，亞氨酸酯的雙功能衍生物如二甲基己二酰亞胺 HCl，活性酯如二琥珀酰亞胺辛二酸，醛如戊二醛，二疊氮化合物如二-(R-疊氮苯甲酰)己二胺、二重氮衍生物如二-(R-重氮苯甲酰)乙二胺、二異氰酸鹽如甲苯2，6-二異氰酸酯，和二活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝苯。用于生產(chǎn)生物綴合物的方法詳細(xì)描述于March′s Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure，第5版，Wiley-Interscience；或Bioconjugate Techniques，Ed.GregHermanson，Academic Press。
可以通過使用本發(fā)明的生物綴合物或多肽尤其是本發(fā)明抗體或抗體片段來檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)的神經(jīng)纖毛蛋白-1抗原的表達(dá)。從受試者取樣，例如從懷疑帶有轉(zhuǎn)移性腫瘤的組織中取得活檢樣本。通常，在進(jìn)行試驗前處理樣品?？梢允褂玫脑囼灠‥LISA、RIA、EIA、Western印跡分析、免疫組織染色等等。根據(jù)所用的試驗，可以通過酶、熒光團(tuán)或放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體(參見，例如，Coligan等(1994)Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons Inc.，NewYork，New York；和Frye等(1987)Oncogene 4，1153-1157)因此，本發(fā)明一實施方案涉及至少一種本發(fā)明多肽和/或至少一種本發(fā)明標(biāo)記的多肽和/或至少一種本發(fā)明的生物綴合物用于檢測神經(jīng)纖毛蛋白-1的用途。例如，本發(fā)明一種多肽或本發(fā)明一種標(biāo)記的多肽或本發(fā)明一種生物綴合物可以用于檢測神經(jīng)纖毛蛋白-1，或一種標(biāo)記的多肽和一種生物綴合物或兩種或三種多肽或兩種標(biāo)記的多肽一起使用。
另一實施方案中，本發(fā)明包括診斷試劑盒。這樣的試劑盒包括至少一種本發(fā)明生物綴合物和/或至少一種本發(fā)明的標(biāo)記多肽和/或至少一種本發(fā)明多肽，尤其是本發(fā)明的抗體片段或抗體，或這些的標(biāo)記形式，且另外由進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)競爭或三明治試驗需要的試劑和材料組成。所述試劑盒可以用于檢測生物樣品尤其是特定癌細(xì)胞類型的侵襲潛能。通常試劑盒進(jìn)一步包括容器。
通過使用本發(fā)明的多肽，尤其是本發(fā)明的抗體片段或抗體，進(jìn)一步可能的是生產(chǎn)抗獨特型抗體，其可以用于篩選抗體來鑒定抗體是否和本發(fā)明的人單克隆抗體具有相同的結(jié)合特異性，且還可以用于自動免疫(Herlyn等(1986)Science，232，100)?？梢允褂霉碾s交瘤技術(shù)制得這樣的抗獨特型抗體(Kohler等(1975)Nature，256495)?？躬毺匦涂贵w是抗體，其識別目的抗體上存在的獨特決定簇。這些決定簇位于抗體的高變區(qū)。在該區(qū)域，其結(jié)合所給的表位，并因此造成抗體的特異性?？梢杂媚康亩嚯挠绕涫强贵w片段或抗體免疫動物而制得抗獨特型抗體。免疫動物將識別并響應(yīng)免疫抗體的獨特型決定簇并產(chǎn)生這些獨特型決定簇的抗體。通過使用抗獨特型抗體，可能鑒定表達(dá)具有相同表位特異性的單克隆抗體的其他雜交瘤。
還可能使用抗獨特型技術(shù)來生產(chǎn)模擬表位的單克隆抗體。例如，制得第一個單克隆抗體的抗獨特型單克隆抗體將在高變區(qū)具有結(jié)合域，其是通過第一個抗體結(jié)合的表位的“像”。因此，抗獨特型單克隆抗體可以用于免疫，因為抗獨特型單克隆抗體結(jié)合域可以有效地作為抗原。
另一實施方案中，當(dāng)在侵襲和/或粘附試驗中測試時，本發(fā)明修飾的多肽或生物綴合物，結(jié)合人神經(jīng)纖毛蛋白-1并降低了15-70％的侵襲性人肉瘤細(xì)胞的侵襲力和/或粘著力，或優(yōu)選15-30％，20-40％或甚至至少50％(參見實施例8或9和實施例11或12)。
另一實施方案中，本發(fā)明的抗體片段特異性地識別神經(jīng)纖毛蛋白-1的一個或多個表位，或神經(jīng)纖毛蛋白-1保守變體的表位，或神經(jīng)纖毛蛋白-1的肽片段。
另一實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分子，尤其是選自本發(fā)明的小化學(xué)化合物、抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1基因表達(dá)的分子、本發(fā)明的生物綴合物或多肽，更優(yōu)選本發(fā)明的抗體片段或抗體作為藥物的用途。
另一實施方案中，本發(fā)明涉及藥物組合物，包括有效量的至少一種尤其是一種本發(fā)明的分子，尤其是至少一種本發(fā)明的生物綴合物或至少一種抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1基因表達(dá)的分子，更優(yōu)選其中分子是本發(fā)明的抗體片段或抗體，和藥物學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑結(jié)合。
藥物組合物可以用于治療人神經(jīng)纖毛蛋白-1過表達(dá)或異常表達(dá)相關(guān)的疾病，尤其是治療轉(zhuǎn)移性腫瘤，尤其是源自第10頁癌細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)移性腫瘤。
本發(fā)明藥物組合物進(jìn)一步可以用于治療腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤，其中包含的NPB抑制血管生成和給腫瘤提供營養(yǎng)的血管長大，并因此使腫瘤餓死。
本發(fā)明另一實施方案中，提供的藥物組合物包括藥物學(xué)上可接受的載體和治療有效量的至少一種抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子，尤其是可以結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外域的分子，更優(yōu)選其中分子是本發(fā)明的小化學(xué)化合物或修飾多肽或生物綴合物，仍然更優(yōu)選為其中分子是本發(fā)明的修飾scFv或源自本發(fā)明這樣的scFv的修飾抗體。
另一實施方案中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防患者腫瘤或轉(zhuǎn)移的方法，包括給藥藥物學(xué)上可接受組合物中有效量的抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子，來治療即抑制、延遲或防止神經(jīng)纖毛蛋白-1相關(guān)侵襲和/或粘附的轉(zhuǎn)移。抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子尤其是可以結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外域的分子，其可以通過如下所述的鑒定特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外域的配體的方法來鑒定，更優(yōu)選其中分子是本發(fā)明的小化學(xué)化合物或抗體或抗體片段或修飾的多肽或本發(fā)明的生物綴合物，仍然更優(yōu)選其中分子是本發(fā)明的修飾scFv或源自本發(fā)明這樣的scFv的修飾抗體。該治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移的方法可以有效地降低或抑制源自中胚層細(xì)胞的癌細(xì)胞的侵襲和/或粘附，尤其是源自肉瘤的癌細(xì)胞，尤其是源自骨和/或軟組織肉瘤的癌細(xì)胞。癌細(xì)胞可以選自描述于第10頁的癌細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(Skerra等(1993)，Curr.Opin.Immunol.5,256-62；Chadd等(2001)，Curr.Opin.Biotechnol.12，188-94)。
例如，可以分離編碼本發(fā)明多肽尤其是抗體片段或抗體的核酸序列(例如，編碼圖10的抗體片段或其抗體的基因)并克隆至一個或多個多核苷酸表達(dá)載體中，并將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主細(xì)胞系中用于本發(fā)明重組多肽表達(dá)。編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)提供了多肽增加的產(chǎn)量，還可以通過引入氨基酸替換、缺失、添加和其他修飾來進(jìn)行多肽的修飾，例如在本發(fā)明抗體片段或抗體的可變和恒定區(qū)人源化修飾(Rapley(1995)Mol.Biotechnol.3139-154)而結(jié)合特異性或神經(jīng)纖毛蛋白-1的阻斷功能沒有關(guān)鍵性的缺失(Skerra等(1993)Curr.Opin.Immunol.5，256-262)。
因此本發(fā)明涉及上述分離的核酸分子，編碼任一本發(fā)明多肽，尤其是本發(fā)明的抗體片段，更優(yōu)選是本發(fā)明的scFv、dsFv、FV、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體，仍然更優(yōu)選為本發(fā)明的scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體或源自本發(fā)明這樣scFv的抗體，更優(yōu)選為本發(fā)明的scFv或源自本發(fā)明這樣scFv的抗體。
優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及編碼NBP的核酸分子，包括選自SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，或SEQ ID No.5至SEQ ID No.38的序列。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸的載體。具體地，該載體是質(zhì)粒、噬菌?；蛘沉！?br> 例如，可以以合適的方式將本發(fā)明的核酸分子克隆進(jìn)原核或真核表達(dá)載體中(Sambrook等“Molecular cloninga laboratory manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。這樣的表達(dá)載體包括至少一個啟動子，至少一個用于翻譯啟始的信號，至少一個本發(fā)明的核酸序列，在原核表達(dá)載體的情況中，用于終止翻譯的信號，而在真核表達(dá)載體的情況中，優(yōu)選另外的用于終止轉(zhuǎn)錄和用于聚腺苷酸化的信號。
原核表達(dá)載體的實例是，用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)的，例如基于通過T7RNA聚合酶識別的啟動子的表達(dá)載體，如描述于US4,952,496，對于真核表達(dá)載體用于在啤酒酵母(Saccharomuces serevisiae)中表達(dá)的，例如載體p426Met25或526GALl(Mummberg等(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的，例如，桿狀病毒載體，如描述于EP-B1-0127839或EP-B1-0549721，和用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的，例如載體Rc/CMV和Rc/RSV或SV40載體，其是公知的且可以購得。
用于制備這些表達(dá)載體的分子生物學(xué)方法以及轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法和培養(yǎng)這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及從所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生產(chǎn)和獲得本發(fā)明多肽的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及宿主細(xì)胞，包括本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的載體，尤其是其中宿主細(xì)胞是微生物如酵母或其他真菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或其他細(xì)菌。宿主細(xì)胞還可以是較高等的真核來源的，如昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選病毒感染的昆蟲細(xì)胞，更優(yōu)選為桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，或如哺乳動物細(xì)胞如HeLa、COS、MDCK293-EBNA1、NSO或雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽尤其是本發(fā)明抗體片段的方法，包括培養(yǎng)微生物，該微生物用含有編碼本發(fā)明多肽尤其是本發(fā)明抗體片段的DNA的重組載體轉(zhuǎn)化，并從培養(yǎng)基中收集所述的本發(fā)明多肽，尤其是本發(fā)明的抗體片段或含有其的融合蛋白。
本發(fā)明顯示了阻斷神經(jīng)纖毛蛋白-1功能可以抑制源自第10頁癌細(xì)胞類型的特定癌細(xì)胞的侵襲力和/或粘附力，尤其是抑制例如源自人肉瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和間皮瘤的癌細(xì)胞，更優(yōu)選為人肉瘤細(xì)胞的侵襲力和/或粘附力。
因此本發(fā)明的一實施方案是至少一種尤其是一種抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子在制造用于治療或預(yù)防自然生成癌細(xì)胞入侵和/或轉(zhuǎn)移的藥物中的用途，其中所述癌細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能依賴于神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能，尤其是這樣的腫瘤細(xì)胞，其源自中胚層細(xì)胞或源自第10頁癌細(xì)胞類型的癌細(xì)胞。
另一優(yōu)選實施方案中，抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子抑制了表達(dá)的神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能。本文中將表達(dá)的神經(jīng)纖毛蛋白-1理解為在任何治療開始之前已經(jīng)存在于自然生成癌細(xì)胞上的神經(jīng)纖毛蛋白-1蛋白。
這些分子尤其是和神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外域結(jié)合的分子。
神經(jīng)纖毛蛋白-1的胞外部分定義為神經(jīng)纖毛蛋白-1蛋白在細(xì)胞膜外的部分，由五個結(jié)構(gòu)域a1、a2、b1、b2和c構(gòu)成。細(xì)胞粘著特別涉及的是結(jié)構(gòu)域b1和b2?？梢哉J(rèn)知到神經(jīng)纖毛蛋白-1是糖蛋白，因此不僅僅是提及的氨基酸，而且它們上面的糖修飾也認(rèn)為是神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外部分的一部分。
更優(yōu)選，該分子選自小化學(xué)化合物、抗神經(jīng)纖毛蛋白-1的抗體、抗神經(jīng)纖毛蛋白-1的抗體片段、本發(fā)明多肽、本發(fā)明抗獨特型抗體和/或本發(fā)明的生物綴合物，尤其是其中分子是本發(fā)明多肽和/或本發(fā)明生物綴合物。
另一優(yōu)選實施方案中，依賴于神經(jīng)纖毛蛋白-1功能血管生成、侵襲力、粘著力和/或轉(zhuǎn)移潛能的自然生成癌可以是任何癌，其中癌細(xì)胞是源自下列癌的細(xì)胞腺癌、肉瘤、霍奇金疾病、高和低惡性的非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、頭部惡性腫瘤、頭部和頸部腫瘤、甲狀腺癌、間皮瘤、白血病、食道癌、胃和胰腺癌、原發(fā)性肝癌、膽管和膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、基底細(xì)胞癌、惡性黑素瘤、骨肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤、尤因癌、軟組織肉瘤、卡波西肉瘤、腎胚細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎癌、睪丸癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢惡性腫瘤、子宮頸子宮內(nèi)膜癌、腎上腺癌，尤其是選自惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤(骨膜外骨肉瘤、骨膜骨肉瘤、小細(xì)胞骨肉瘤)、軟骨肉瘤、尤因肉瘤、骨巨細(xì)胞腫瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、間皮瘤、淋巴管肉瘤、粘液肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、脊索瘤、卡波西肉瘤和淋巴管內(nèi)皮肉瘤。
本發(fā)明還涉及神經(jīng)纖毛蛋白-1抗原作為可以成為藥物(druggable)的靶標(biāo)。本發(fā)明的另一方面涉及具有高中和能力的結(jié)合人神經(jīng)纖毛蛋白-1的抗體片段。
本發(fā)明另一實施方案中，至少一種本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的生物綴合物用于鑒定特異性結(jié)合人神經(jīng)纖毛蛋白-1的另外的分子，尤其在篩選試驗中。這些方法需要在推定的競爭測試結(jié)合劑存在下將參照抗神經(jīng)纖毛蛋白-1抗體片段和含有神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)物質(zhì)(target species)接觸。在不存在測試結(jié)合劑存在的情況下，在適于參照抗體片段和目標(biāo)物質(zhì)之間復(fù)合體形成的條件下進(jìn)行該接觸步驟。在測試結(jié)合劑存在下檢測參照抗體片段和目標(biāo)物質(zhì)之間的復(fù)合體形成，作為測試結(jié)合劑和神經(jīng)纖毛蛋白-1特異性結(jié)合活性的指示劑。該篩選方法用于例如其它抗體文庫或抗體片段文庫、反以寡核苷酸文庫或肽和小分子文庫的高通量篩選來鑒定和表征另外的“特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”。通過試驗來測定競爭，其中抗體片段，或其它測試結(jié)合劑基本上抑制參照抗體和含有神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合。例如在存在和不存在推定競爭者的情況下，可以通過測量參照抗體片段和含有神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合來測定，推定競爭者即為在適于復(fù)合體形成的條件下“特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”。多種類型的競爭性結(jié)合試驗是已知的且在本發(fā)明中可按常規(guī)實行，如描述于美國專利No.4,376,110。通常，這樣的試驗涉及使用含有神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)物質(zhì)(例如，純化的神經(jīng)纖毛蛋白-1或表達(dá)神經(jīng)纖毛蛋白-1抗原的細(xì)胞系)、未標(biāo)記的“特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”，和標(biāo)記的參照抗體片段或其它結(jié)合劑。通過測定在“特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”存在下結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)記量來測定競爭性抑制。通?！疤禺愋越Y(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”是過量存在的。通過這些競爭試驗鑒定的“特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”(“競爭性結(jié)合劑”)包括抗體、抗體片段、肽、反義寡核苷酸、小分子和結(jié)合參照抗體片段結(jié)合的表位或結(jié)合位點的其它結(jié)合劑，以及結(jié)合足夠接近參照抗體片段結(jié)合的表位的表位或結(jié)合位點的“特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的分子”。優(yōu)選，當(dāng)過量存在時，本發(fā)明的競爭性結(jié)合劑抑制參照抗體片段和所選擇目標(biāo)物質(zhì)的特異性結(jié)合至少10％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少75％-90％或更高。
除了本發(fā)明的多肽，尤其是本發(fā)明的修飾抗體片段或修飾抗體，可以使用能夠特異性靶向人神經(jīng)纖毛蛋白-1的天然或人工配體、肽、反義，或其它小分子?；诒景l(fā)明，可以將藥物設(shè)計成結(jié)合或相互作用并抑制人神經(jīng)纖毛蛋白-1。在這方面，可以利用合理的藥物設(shè)計技術(shù)如X-射線結(jié)晶學(xué)、計算機(jī)輔助(或幫助的)分子建模(CAMM)、定量或定性結(jié)構(gòu)活性相關(guān)(QSAR)，和相似技術(shù)來聚焦藥物發(fā)現(xiàn)效果。合理設(shè)計可以預(yù)測可以和蛋白質(zhì)或其特定部分相互作用的分子?？梢曰瘜W(xué)合成和/或在生物系統(tǒng)中表達(dá)這樣的分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法通過合成有機(jī)化合物可以制得小分子?？梢院铣啥喾N肽、準(zhǔn)肽(semi-Peptidic)化合物或非肽，和有機(jī)化合物然后篩選以便發(fā)現(xiàn)以高中和能力結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的化合物。尤其是抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1相關(guān)侵襲的化合物。通常參見Scott和Smith，“Searching forPeptide Ligands with an Epi tope Library”，Science(1990)，249，386-90和Devlin等，“Random Peptide LibrariesA Source ofSpecific Protein Binding Molecules”，Science，(1990)，249，40407。
本發(fā)明還提供了使用修飾的抗體或修飾的抗體片段抑制人神經(jīng)纖毛蛋白-1活性或檢測癌細(xì)胞優(yōu)選肉瘤細(xì)胞中人神經(jīng)纖毛蛋白-1的方法，體外或體內(nèi)的方法。優(yōu)選實施方案中，用一種或多種修飾的抗體片段處理表達(dá)抗原的細(xì)胞導(dǎo)致或引起人癌細(xì)胞尤其是人肉瘤細(xì)胞入侵或粘著能力的降低或抑制。
腫瘤細(xì)胞進(jìn)入組織的遷移是轉(zhuǎn)移中重要的步驟?？梢栽诳鐑?nèi)皮(transendothelial)的模型中研究粘附和侵襲的過程(參見Woodward等(2002)Invest Ophthalmol Vis Sci 43，1708-14和Vachula等(1992)Invasion Metastasis 12，66-81)。跨內(nèi)皮模型提供了有用的離體如體外的系統(tǒng)用于侵襲過程中細(xì)胞相互作用的研究。
因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了離體如體外的方法來檢測自然生成侵襲性癌細(xì)胞侵襲力和神經(jīng)纖毛蛋白-1功能性的相關(guān)性。該方法包括步驟a.將細(xì)胞和抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子接觸；b.在適于所述癌細(xì)胞生長的條件下，將癌細(xì)胞和膠狀基質(zhì)接觸；和c.測定所述癌細(xì)胞通過形成凝膠的基質(zhì)的遷移。
在此所用的術(shù)語“膠狀基質(zhì)”理解為具有至少90％水含量的半固體物質(zhì)，其可以培養(yǎng)接觸基質(zhì)的癌細(xì)胞并使侵襲性癌細(xì)胞通過所述“膠狀基質(zhì)”平板移動0.1mm至1mm，優(yōu)選0.3mm厚度，但是非侵襲性細(xì)胞沒有移動。這樣的“膠狀基質(zhì)”實例是類似蛋白質(zhì)和碳水化合物組合中胞外基質(zhì)的物質(zhì)，尤其是可購得的“Matrigel”。具體而言，“膠狀基質(zhì)”包括一種選自以下的蛋白質(zhì)IV型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白。更具體地膠狀基質(zhì)包括蛋白質(zhì)IV型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白。更優(yōu)選膠狀基質(zhì)包括蛋白質(zhì)IV型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白(entactin)、觸覺蛋白(nidogen)和類肝素硫酸鹽糖蛋白或IV型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、觸覺蛋白、巢蛋白，和玻連蛋白。
優(yōu)選實施方案中，步驟a)中的干擾分子是和神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外表位特異性結(jié)合的多肽，尤其是本發(fā)明的修飾多肽，更具體為本發(fā)明的修飾的抗體或修飾的抗體片段，仍然更具體為修飾的抗體片段，更具體為修飾的scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體，尤其是修飾的scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體和二體，更優(yōu)選為修飾的scFv。
因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了離體如體外的方法來測定自然生成侵襲性癌細(xì)胞粘附力和神經(jīng)纖毛蛋白-1功能性的相關(guān)性。該方法包括步驟a.將細(xì)胞和抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子接觸；b.在適于所述癌細(xì)胞生長的條件下，將癌細(xì)胞和ECM蛋白層接觸；和c.測定所述癌細(xì)胞和ECM蛋白層的粘著。
在此所用的術(shù)語“ECM蛋白層”理解為蛋白質(zhì)溶液的半干層，其可以培養(yǎng)和層接觸的癌細(xì)胞并使侵襲性癌細(xì)胞和所述層粘附。所述“ECM蛋白層”的厚度為0.1mm至1mm，優(yōu)選0.3mm厚?！癊CM蛋白質(zhì)”的實例是胞外基質(zhì)的物質(zhì)。具體地，“ECM蛋白質(zhì)”選自膠原、巢蛋白、觸覺蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。更具體地，ECM蛋白質(zhì)選自I型膠原S、IV型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白。
優(yōu)選實施方案中，步驟a)中的干擾分子是和神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外表位特異性結(jié)合的多肽，尤其是本發(fā)明的修飾的多肽，更具體為本發(fā)明的修飾的抗體或修飾的抗體片段，仍然更具體為修飾的抗體片段，更具體為修飾的scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或二體，尤其是修飾的scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體和二體，更優(yōu)選為修飾的scFv。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定特異性結(jié)合NP-1胞外區(qū)域的配體的方法，通過篩選原初(naive)或免疫文庫，優(yōu)選噬菌體展示文庫，其中所述配體能夠干擾神經(jīng)纖毛蛋白-1功能性，尤其是其中所述配體能夠抑制血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞管形成，和/或腫瘤細(xì)胞侵襲或粘附。所述方法包括步驟a)將癌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞和配體噬菌體文庫接觸；b)分離所述細(xì)胞；c)除去未和所述細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體，例如在所述細(xì)胞不裂解的條件下，通過用緩沖的去污劑溶液洗滌所述細(xì)胞；d)洗脫和所述細(xì)胞結(jié)合的噬菌體；和e)測定所述洗脫噬菌體表示的配體的特性f)測試生化或生物試驗中配體干擾NP-1功能的能力。
例如如果配體是抗體或抗體片段，可以將編碼配體的DNA測序，或在編好網(wǎng)格或編號噬菌體的商業(yè)配體文庫的情況下，通過測定噬菌體的網(wǎng)格位置或編號，來測定表示步驟e)中獲得配體的噬菌體的特性。然后網(wǎng)格位置或編號可以顯示噬菌體表示的配體的特性。
步驟d)之后，將結(jié)合NP-1的噬菌體富集成噬菌體集合。那些結(jié)合NP-1的噬菌體最終可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法來鑒定?？梢詫⑹删w分離形成單個克隆，可以用標(biāo)記的NP-1蛋白質(zhì)，或NP-1蛋白質(zhì)的標(biāo)記部分如NP-1胞外域的至少七個氨基酸長度的肽來探查噬菌體克隆。結(jié)合這樣探針的克隆鑒定為NP-1結(jié)合劑。還可以在純化的NP-1蛋白質(zhì)或重組NP-1上將噬菌體親和性純化。
或者，如果配體是例如抗體或抗體片段，編碼抗體或抗體片段的開放閱讀框可以從整個富集的集合中再克隆進(jìn)表達(dá)載體中，然后抗體或抗體片段可以在另一宿主細(xì)胞的克隆中表達(dá)，因此可以鑒定載有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞克隆，表達(dá)載體含有編碼特異性結(jié)合NP-1的抗體或抗體片段的核酸，例如通過上述鑒定相關(guān)噬菌體菌落的方法，通過實施例2和3的方法，或通過重組NP-1上的親和純化。
該方法特別的優(yōu)勢是獲得NP-1胞外域可接近部分的特異性配體，因為起始選擇步驟是在完整細(xì)胞上進(jìn)行的，其存在結(jié)合噬菌體的NP-1胞外域可接近部分。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，該方法包括篩選重組NP-1蛋白質(zhì)的另外步驟。該方法在實施例3.2中將得到更具體描述。
該方法包括替代步驟e)的更多的步驟e)將重組NP-1和分離的噬菌體接觸；f)用緩沖的去污劑和/或高鹽溶液洗滌所述的NP-1；和g)洗脫和NP-1結(jié)合的噬菌體；和h)測定所述洗脫的噬菌體表示的配體的特性。
特定實施方案中，在噬菌體上表達(dá)的配體包括抗體或抗體片段，選自scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)和二體，更具體選自scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體和二體，仍然更具體選自scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體和二體，更優(yōu)選為scFv。
步驟c)和f)中所用的“去污劑”是去污劑溶液，優(yōu)選緩沖的，可以是0.001-0.5％濃度，優(yōu)選0.01-0.1％的吐溫。步驟f)中所用的“高鹽”是高鹽溶液，優(yōu)選緩沖的，且具有10mM-1M的離子強(qiáng)度，優(yōu)選20-500mM，更優(yōu)選50-350mM，更優(yōu)選80-250mM。通常可用的陰離子是，例如氯化物、檸檬酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽或硼酸鹽。通?？捎玫年栯x子是，例如鈉、鉀、鋰、鈣和鎂。
上述段落中的緩沖溶液通常具有7-8的pH。例如，DMEM或PBS，具體含有1-20％，更具體5-15％，更優(yōu)選約10％的FCS，可以用作緩沖液。
通過200至300g溫和離心3至20分鐘優(yōu)選5至10分鐘來獲得結(jié)合噬菌體的細(xì)胞的分離。用2-100mM，優(yōu)選4-50mM，更優(yōu)選5-20mM，更優(yōu)選約10mM的甘氨酸洗滌來獲得結(jié)合細(xì)胞和固定化NP-1的結(jié)合噬菌體的洗脫，甘氨酸的pH為0至2.5，優(yōu)選1至2.5，更優(yōu)選1.5至2.5。
可以在體內(nèi)或在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中如上所述測定這些配體尤其是這些抗體或抗體片段的NP-1干擾或抑制功能性。細(xì)胞培養(yǎng)實驗包括測定本發(fā)明配體抑制效果的試驗，如實施例8和9或19或?qū)嵤├?1和12中所述的侵襲或粘附試驗，或如實施例16中所述的內(nèi)皮細(xì)胞的管形成試驗。不同試驗的結(jié)果提供于圖中。
該方法有利地結(jié)合基于和細(xì)胞表面結(jié)合的篩選步驟以及基于功能試驗的篩選步驟，其鑒定了具有干擾或抑制NP-1功能能力的配體。
優(yōu)選實施方案中，配體能夠抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1的生物功能。例如，神經(jīng)纖毛蛋白-1的生物功能可以是侵襲、粘附，或血管生成。粘附和侵襲之前已經(jīng)解釋為粘著力和侵襲力。
侵襲試驗測量細(xì)胞的侵襲力。侵襲試驗是如本申請實施例8和9中進(jìn)行的試驗。
粘附實驗測量靶物質(zhì)，如細(xì)胞對其它物質(zhì)的粘附力，如另一細(xì)胞、病毒或復(fù)合生物混合物等，如衍生自細(xì)胞(如基底層)的載體群。粘附實驗的實例如本申請的實施例11和12所示。
“血管生成”是一個過程，其中細(xì)胞在它們的鄰近誘導(dǎo)血管形成。血管生成伴隨惡性組織的生長，且因此是惡性細(xì)胞的性質(zhì)。也就是說惡性細(xì)胞具有誘導(dǎo)血管生成的特性。血管生成試驗測定了細(xì)胞誘導(dǎo)血管形成的能力，通常伴隨惡性組織的生長的過程。血管生成試驗描述于Kanda等(2002)J.Natl.Cancer Inst.94，1311-9。血管生成試驗的實例是本申請實施例16給出的通常所說的管形成試驗。
另一優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外域的配體的鑒定方法還包括將鑒定的配體混入治療、預(yù)防或診斷組合物中。這可以例如通過將鑒定的配體和本領(lǐng)域公知的藥物學(xué)上可接受載體混合，其中配體是以治療有效量存在的。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)藥物組合物的方法，包括特異性結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白-1的配體的鑒定方法和進(jìn)一步將鑒定的配體或其修飾的或標(biāo)記的形式和本領(lǐng)域公知的藥物學(xué)上可接受載體混合的步驟。修飾的配體是帶有共價修飾的配體。修飾配體的實例是標(biāo)記的配體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有優(yōu)勢的方法組合，其使得之前鑒定的配體活性功能提高。對于鑒定干擾了NP-1功能性的配體的這個方法，結(jié)合CALI(發(fā)色團(tuán)輔助激光滅活)方法。
CALI的原理是基于光化學(xué)反應(yīng)的局部啟動，該反應(yīng)導(dǎo)致生成短期活性反應(yīng)物(species)，其依次選擇性地修飾靶分子并導(dǎo)致其功能失活。高特異性但非抑制性配體(例如，抗體、抗體片段、小分子)用合適的發(fā)色團(tuán)(例如孔雀綠、熒光素、亞甲基藍(lán)、曙紅)標(biāo)記。靶分子(例如蛋白質(zhì))和配體之間的復(fù)合體形成后，用合適波長的激光照射復(fù)合體來激發(fā)發(fā)色團(tuán)。該激發(fā)觸發(fā)了光化學(xué)反應(yīng)生成短期活性反應(yīng)物(species)(例如羥基或高活性氧物質(zhì))。這些活性物質(zhì)在其生成位點周圍的小范圍內(nèi)修飾了蛋白質(zhì)?；钚晕镔|(zhì)可以移動的距離是非常短的，由于其壽命短。因此，在接近配體結(jié)合位點發(fā)生蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的修飾。破壞效果限定在15-40范圍內(nèi)，其比細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)之間的平均距離小得多，其是約80(假設(shè)平均胞液蛋白質(zhì)濃度為300mg/ml和平均蛋白質(zhì)大小為50kDa)，確保該過程的高空間分辨率。該原理顯示于圖13中。作為實例，抗所給蛋白質(zhì)的修飾的抗體通常在CALI之后可以選擇性地抑制特定蛋白質(zhì)的功能，即使該抗體在沒用CALI時沒有顯示抑制功能。如果其中配體的結(jié)合位點接近或在蛋白質(zhì)重要功能結(jié)構(gòu)域之內(nèi)，這些誘導(dǎo)的修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)永久失活。在合適的讀出試驗中測定蛋白質(zhì)的功能失活并在相關(guān)生理功能如細(xì)胞侵襲、細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號或細(xì)胞凋亡的情況下評價。
使用CALI的蛋白質(zhì)失活顯示出對相應(yīng)蛋白質(zhì)的高度特異性。linden等顯示了β-半乳糖苷酶可以用孔雀綠標(biāo)記的抗-β-半乳糖苷酶抗體有效地失活，甚至在同一溶液中存在堿性磷酸酶時。激光照射10分鐘后β-半乳糖苷酶失活95％，而堿根本沒受影響(Linden等(1992)Biophys.J.61，956-962)。Jay還證明了結(jié)合蛋白質(zhì)的單個表位的染料標(biāo)記的抗體足夠失活乙酰膽堿酯酶(Jay(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5454-58)。
Henning等描述了CALI成功地用于蛋白質(zhì)的多種陣列(Henning等Innovations in Pharmaceutical Technology(2002)62-72)。這些蛋白質(zhì)包括膜蛋白質(zhì)(例如T細(xì)胞受體的α-、β-、ε-鏈，β1整聯(lián)蛋白，ephrin A5或FAS受體)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如calicineurin、親環(huán)蛋白A或PKC)，細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)(例如肌動蛋白、埃茲蛋白或驅(qū)動蛋白)或轉(zhuǎn)錄因子。Henning等進(jìn)一步描述了CALI可以用于鑒定作為藥物目標(biāo)的新蛋白質(zhì)，同時說明它們在目的生物范圍內(nèi)的功能(Henning等(2002)Current Drug Discovery May，17-19)。
CALI數(shù)個應(yīng)用的實例顯示CALI能將特異性但非抑制性配體轉(zhuǎn)化成阻斷試劑。因此，這些配體可以用于調(diào)節(jié)抑制性配體的作用。CALI還可以用于進(jìn)一步提高自身已經(jīng)具有抑制效果的配體的抑制效果。實施例9和實施例12是分別將CALI引入侵襲和粘附試驗中的實例。
本發(fā)明另一實施方案中，配體可以是修飾的。
配體的化學(xué)修飾可以是添加發(fā)色團(tuán)。發(fā)色團(tuán)是具有高光學(xué)活性分子的一部分，由于和光相互作用的移動電子。發(fā)色團(tuán)的一些實例是例如熒光素衍生物、羅丹明衍生物、香豆素衍生物、卟啉衍生物、酞菁衍生物、naphtha locyanines衍生物、曙紅衍生物、三苯甲烷衍生物或吖啶衍生物。可用于化學(xué)修飾生物分子的發(fā)色團(tuán)目錄公開于TheSigma Aldrich Handbooks of Stains and Dyes，F(xiàn).J.Green編輯(1990)ISBN No.0-941633-22-5。
鑒定根據(jù)本發(fā)明配體的方法進(jìn)一步包括至少一個測試配體的另外步驟，例如，其中測試是基于配體的生化或生物特性。這樣另外的測試步驟可以包括選自流式細(xì)胞測量術(shù)、ELISA、免疫沉淀、結(jié)合試驗、免疫組織化學(xué)實驗、親和性研究、免疫印跡和蛋白質(zhì)陣列的方法。通過配體大小、形狀、密度、電荷密度、疏水性，或結(jié)合特異性可以測定生化特性。配體的生化特性形成上述方法的適用性基礎(chǔ)。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明鑒定配體的方法可以進(jìn)一步包括消減(substractive)選擇步驟。消減選擇步驟是除去具有不期望特性的配體的步驟。例如通過除去能夠結(jié)合對照細(xì)胞的配體來實現(xiàn)消減選擇步驟，如果結(jié)合對照細(xì)胞的特性是不期望的。通過實施例，如果想要選擇對癌細(xì)胞特異性的配體，可以首先選擇那些結(jié)合癌細(xì)胞的配體，洗脫結(jié)合的配體，例如噬菌體，然后除去那些能夠結(jié)合非癌細(xì)胞的配體，通過例如將非癌細(xì)胞和洗脫的配體集合接觸并除去那些結(jié)合非癌細(xì)胞的配體。然后保留于上清液中的配體是對癌細(xì)胞的特異性配體，然后可以根據(jù)本發(fā)明鑒定配體的方法用于功能篩選試驗。
可以在體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，如上所述測定鑒定的NP-1結(jié)合配體或抗體片段尤其是scFv的神經(jīng)纖毛蛋白-1抑制活性。
細(xì)胞培養(yǎng)試驗包括測定本發(fā)明抗體片段抑制血管生成、侵襲或粘附效果的試驗，如實施例16，8或9和實施例11或12中所述的。血管生成試驗的結(jié)果提供于圖14中。侵襲試驗的結(jié)果提供于圖2中。粘附試驗的結(jié)果提供于圖3和4中。
本發(fā)明這部分特別描述了神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合劑(NPB)，其特別調(diào)節(jié)神經(jīng)纖毛蛋白-1(NP-1)功能，但不限制于本文中的血管生成。如上所述，神經(jīng)纖毛蛋白-1(NP-1)作為VEGF的共同激活劑是已知的，VEGF是誘導(dǎo)血管生長必需的和強(qiáng)激活劑。因此本發(fā)明目的是提供干擾NP-1/VEGF相互作用的NPB，因此來調(diào)節(jié)或抑制NP-1功能。
本發(fā)明的NPB優(yōu)選為多肽、抗體、抗體片段或生物綴合物，更優(yōu)選為單鏈抗體(scFv)或相應(yīng)的IgG，其通過將scFv特異性DNA序列克隆進(jìn)IgG表達(dá)載體而制得。根據(jù)進(jìn)一步的實施方案，用如上所述的可檢測標(biāo)記來標(biāo)記這些NPB。
本發(fā)明的NPB優(yōu)選結(jié)合NP-1的胞外表位，不排除對NP-2或NP家族其它成員的交叉反應(yīng)性。
本發(fā)明的NPB結(jié)合NP-1的各種胞外表位。一實施方案中，NPB結(jié)合VEGF也結(jié)合的表位，因此涉及血管生成的誘導(dǎo)。這樣的NPB具有阻斷和抑制VEGF/NP-1相互作用的能力。因此其進(jìn)一步具有干擾或抑制VEGF依賴性誘導(dǎo)血管生成的能力。這樣的NPB用作藥物特別有用并用于治療血管生成。
進(jìn)一步已知VEGF的各種剪接變體也結(jié)合NP-1的稍有不同的表位。本發(fā)明還提供了結(jié)合這些不同表位的NPB。這樣的NPB具有阻斷和抑制VEGF剪接變體和NP-1相互作用的能力。因此，它們還具有干擾或抑制VEGF依賴性誘導(dǎo)血管生成的能力。這樣的NPB用作藥物特別有用并用于治療血管生成。
本發(fā)明還鑒定和表征了不結(jié)合任何已知VEGF結(jié)合的表位的NPB，但是其仍然改變或抑制了血管生成，該事實是意外的、令人驚奇的和新的。優(yōu)選實施方案中提供了調(diào)節(jié)和抑制NP-1功能但不干擾VEGF/NP-1相互作用的NPB。它們具有干擾或抑制誘導(dǎo)血管生成的能力并特別用作藥物并用于治療血管生成。
為了表征本發(fā)明的NPB，在通常所說的管形成試驗中測試所述NPB。這樣的試驗中，用各種NPB培養(yǎng)正常表達(dá)NP-1的內(nèi)皮細(xì)胞，然后分析在管形成或細(xì)胞聚集中這種結(jié)合的作用(參見實施例16，以及圖14和15)。
平行地在生化VEGF/NP-1相互作用試驗中測試這些NPB(參見實施例17)。為此使用了競爭性ELISA，其中定性并定量測定了VEGF和各種NPB之間的結(jié)合。
通過進(jìn)一步的優(yōu)選實施方案提供了不同試驗中鑒定的NPB。因此，一實施方案提供了NPB，尤其是抑制管形成的scFv和相應(yīng)的IgG。根據(jù)該實施方案尤其優(yōu)選scFv7、8、11、12、13、15、18、21、23、25、26、27、28、29、31、33和36以及相應(yīng)的IgG。
尤其令人感興趣和驚訝的是，盡管本發(fā)明所有的NPB顯示了對管形成的強(qiáng)烈抑制作用，但不是全部和VEGF結(jié)合的表位結(jié)合或交叉反應(yīng)。這明確地顯示于實施例17的競爭性ELISA中，其中測試了本發(fā)明不同NPB抑制NP-1和VEGF相互作用和/或結(jié)合的能力。
數(shù)種NPB明顯地干擾和防止了NP-1/VEGF的相互作用。這些結(jié)合劑的大部分顯示了對管形成的強(qiáng)烈抑制作用。該實施方案的優(yōu)選實例是scFv8或相應(yīng)的IgG。根據(jù)進(jìn)一步的實施方案，這樣的NPB對醫(yī)療是高度有用的，尤其是治療或預(yù)防腫瘤相關(guān)的和轉(zhuǎn)移相關(guān)的血管生成。因此，進(jìn)一步的實施方案提供了組合物和制劑，包括這樣的NPB作為藥物或用于治療NP-1依賴性血管生成，最優(yōu)選腫瘤相關(guān)的血管生成。
根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明提供了不干擾或防止NP-1/VEGF相互作用但是仍然抑制管形成的NPB。該實施方案的優(yōu)選實例是scFv13或相應(yīng)的IgG。另外優(yōu)選和scFv13結(jié)合相同的表位的NPB。還優(yōu)選不和VEGF165相同表位結(jié)合的NPB。如實施例18中所述的試驗特別用于鑒定進(jìn)一步和scFv13相同表位或VEGF165不同表位結(jié)合的NPB。
以下提供的實施例，包括進(jìn)行的實驗和獲得的結(jié)果，僅用于說明的目的而不認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。
附圖描述圖1顯示了染色的HT1080細(xì)胞通過8μm Matrigel涂覆濾器的侵襲。在37℃培養(yǎng)六小時后定量熒光。數(shù)據(jù)表示為n＝3孔的平均+/-SD。
圖2顯示了scFv1對HT1080細(xì)胞侵襲的抑制作用。在趨化性試驗中用Matrigel涂覆的細(xì)胞移動室測定侵襲。激光照射(用CALI，灰色條)和無激光照射(沒用CALI，深灰色條)后測定侵襲。不存在任何抑制分子下HT1080細(xì)胞的侵襲用作對照(左邊兩條)。
圖2a顯示了VEGF對HT1080細(xì)胞侵襲力的影響。在趨化性試驗中用Matrigel涂覆的細(xì)胞移動室測定侵襲。僅用FCS刺激了細(xì)胞侵襲(從左第一和第四條)。用重組YEGF預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞時未見侵襲有顯著增加(從左第二條)。加入抗人VEGF抗體(aVEGF)沒有影響該結(jié)果(從左第三條)。BSA作為化學(xué)引誘劑沒有刺激侵襲(從左第五條)。將重組VEGF加入化學(xué)引誘劑BSA沒有刺激侵襲(從左第六條)。加入抗人VEGF抗體(aVEGF)對該結(jié)果也沒有影響(從左第七條)。
圖3顯示了scFv1和scFv2對HT1080細(xì)胞粘附的抑制效果。激光照射(用CALI，灰色條)和無激光照射(沒用CALI，深灰色條)后測定和I型膠原S的粘附。不存在任何抑制分子下HT1080細(xì)胞對I型膠原S的粘附用作對照(左邊兩條)。
圖4顯示了scFv1和scFv2對HT1080細(xì)胞對不同基質(zhì)蛋白質(zhì)粘附的抑制效果。不存在任何抑制分子下HT1080細(xì)胞和不同基質(zhì)蛋白質(zhì)的粘附用作對照(左邊的條)。
圖5顯示了使用不同細(xì)胞系(粗線)scFv1和scFv2的FACS分析結(jié)果，HS-27細(xì)胞(虛線)用作對照。
圖6顯示了免疫沉淀實驗的結(jié)果。用HT1080細(xì)胞測試scFv1，和作為對照的HS-27細(xì)胞相比較。通過SDS-PAGE分離免疫復(fù)合體并銀染。130kDa的條帶鑒定為神經(jīng)纖毛蛋白-1。
圖7a和7b顯示了scFv展示載體pXP10的載體圖譜和序列。
圖8a和8b顯示了scFv表達(dá)載體pXP14的載體圖譜和序列。
圖9顯示了小鼠文庫構(gòu)建引物的序列。
圖10顯示了scFv1至scFv36的氨基酸序列。每個序列中CDR3用下劃線標(biāo)記。顯示了對應(yīng)的SEQ ID。
圖11顯示了編碼多肽scFv1至scFv36的核苷酸序列。
圖12顯示了從用scFv1免疫沉淀的約130kDa大小條帶獲得的肽混合物的MALDI-MS譜。兩個胰蛋白酶自動消化波峰，表示為T，用于內(nèi)部校準(zhǔn)?？偣?7個和神經(jīng)纖毛蛋白-1相匹配的波峰，用星號標(biāo)記(SwissProt，014786)，質(zhì)量偏差小于10ppm。相匹配的肽占蛋白質(zhì)的22％(206/923個殘基)。
圖13顯示了發(fā)色團(tuán)輔助激光失活(CALI)的原理。
圖14顯示了管形成試驗的結(jié)果。通過光學(xué)顯微鏡測定管形成的程度，并基于細(xì)胞構(gòu)建閉合多邊形的能力、多邊形的數(shù)量和面積、分支點的數(shù)量和細(xì)胞形成閉合管的能力如分支點之間的連接來定量。通過和負(fù)對照比較來定量抑制效果且定為0至3的等級(0-1＝無抑制，2-3＝強(qiáng)抑制效果)。14a)沒有加入抑制性抗體的對照實驗，管形成的抑制＝0，形成閉合多邊形，大量分支點，分支點是連接的且沒有顯著的細(xì)胞聚集。14b)用50μl/ml的scFv25*培養(yǎng)后，管形成抑制＝3.0，沒有形成閉合多邊形，非常少量的分支點且分支點沒有連接。符號“*”表示在進(jìn)行實驗之前將各自的scFv克隆成IgG1形式，通過圖10中所示的其編號識別scFv。14c)用100l/ml對照抗體(抗-α2整聯(lián)蛋白抗體)培養(yǎng)后，管形成抑制＝3.0，沒有形成閉合多邊形，沒有可見分支點。
圖15顯示了管形成試驗的全部結(jié)果，用表來表示。通過光學(xué)顯微鏡來測定管形成的程度并如圖14中所述的來定量。符號“*”表示在進(jìn)行實驗之前將各自的scFv克隆成IgG1形式，通過圖10中所示的編號識別scFv?？少彽玫目筃P-1抗體沒有顯示任何顯著抑制管形成的效果?！癙BS10％”表示對照實驗，沒有添加抗體。
圖16顯示了在競爭性ELISA中測試的VEGF165NP-1相互作用的抑制?！?”表示p值＜0.01。發(fā)現(xiàn)28個scFv中的12個顯著抑制了NP-1和VEGF165之間的相互作用。
圖17顯示了測定scFv對細(xì)胞表面NP-1的表位。用圖例中顯示的對照scFv、不同NP-1結(jié)合的scFv或VEGF預(yù)培養(yǎng)HT1080細(xì)胞，并測試了熒光素標(biāo)記scFv的結(jié)合。數(shù)據(jù)顯示scFv8和scFv24以及VEGF具有互相重疊的表位，而scFv13具有與scFv8和scFv24以及VEGF截然不同的表位。
圖18顯示了HT1080細(xì)胞穿過內(nèi)皮侵襲試驗的結(jié)果，用表來表示。scFv26、scFv27、scFv34和scFv35抑制了HT1080細(xì)胞的侵襲。以侵襲細(xì)胞抑制的％來測定侵襲。對于抑制值“+”表示1-10％的抑制。
圖19顯示了HUVEC細(xì)胞移動試驗的結(jié)果。scFv8*、scFv25*、scFv26*、和scFv31*顯示出對HUVEC細(xì)胞移動的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)抑制效果。符號“*”表示在進(jìn)行實驗之前將各自的scFv克隆成IgG1形式，通過圖10中所示的編號來識別scFv。左邊三條顯示了HUVEC細(xì)胞移動和VEGF165濃度的相關(guān)性。使用的濃度為0-5ng/ml?？梢钥闯鯤UVEC細(xì)胞的移動隨著VEGF165增加而增加。
實施例實施例1構(gòu)建免疫文庫兩只BALB/c鼠，每只用2×107個低聚甲醛固定的HT1080細(xì)胞(人纖維肉瘤細(xì)胞系，ATCC，CCL-121)皮內(nèi)免疫。第一次免疫后，在39天內(nèi)重復(fù)注射兩次，將小鼠處死并分離出脾臟，冰凍于液氮中。通過Charles River，Germany GmbH，Kiβlegg進(jìn)行免疫。
按照制造商所述的使用RNeasy Midi試劑盒(QIAGEN#75142)分離總RNA，使用每個脾臟制品的一半。通過變性甲醛凝膠和光度測量來測定RNA的濃度和純度。
使用8.9μg新鮮制備的RNA和10pmol引物混合物(IgG1-c、IgG2a-c、IgG2b-c、IgG3-c、VLL-c、VLK-c)使用Super-scriptTMII試劑盒(GibcoBRL Life Technologies #18064-014)合成cDNA。這些引物退火成編碼IgG重鏈基因以及κ和λ族輕鏈基因的RNA。使用無限制性位點的9個正向引物(MVH1、M+VH2、MVH3、MVH4、MVH5、MVH6、MVH7、MVH8、MVH9)和4個反向引物(M-JH1、M-JH2、M-JH3、M-JH4)的36個單獨組合從1μ1cDNA PCR擴(kuò)增VH基因。使用無限制性位點的一個引物混合物(M-VK1、M-VK2、M-VK3、M-VK4、M-VL1、M-JK1、M-JK2、M-JK3、M-JL1)PCR擴(kuò)增VL基因。將PCR產(chǎn)物凝膠純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，#28706)并使用帶有限制性位點的9個正向引物(MVH1SfiI、MVH2 SfiI、MVH3 SfiI、MVH4 SfiI、MVH5 SfiI、MVH6 SfiI、MVH7 SfiI、MVH8 SfiI、MVH9 SfiI)和4個反向引物(M-JH1 SalI、M-JH2 SalI、M-JH3 SalI、M-JH4 SalI)單獨組合再擴(kuò)增VH和帶有限制性位點的一個引物混合物(M-VK1 ApaLI、M-VK2 ApaLI、M-VK3 ApaLI、M-VK4 ApaLI、M-VL1 ApaLI、M-JK1 NotI、M-JK2 NotI、M-JK3 NotI、M-JL1 NotI)再擴(kuò)增VL。將PCR產(chǎn)物凝膠純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，#28706)，并對于VH使用sfiI/SaII和對于VL使用ApaLI/NotI限制位點克隆進(jìn)噬菌體展示載體pXP10中。通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli TG-1中，形成107個獨立克隆大小的文庫。
實施例2選擇和篩選scFv(在固定細(xì)胞上選擇)從固定HT1080細(xì)胞免疫小鼠產(chǎn)生的噬菌體展示文庫中選擇單鏈Fv。使用噬菌體展示載體pXP10產(chǎn)生文庫。
用0.05％EDTA收集HT1080細(xì)胞，用低聚甲醛固定，稀釋于PBS中至1×107個細(xì)胞/ml并固定于96孔UV交聯(lián)板上的孔中(CorningCostar)。用PBS中5％脫脂奶粉(#70166，F(xiàn)luka)(MPBS)封閉UV交聯(lián)板上的孔。用MPBS在25℃預(yù)封閉1012cfu(菌落形成單位)噬菌體文庫/106細(xì)胞1小時，隨后在室溫(RT)培養(yǎng)細(xì)胞1.5小時。用PBS+0.05％Tween-20洗滌UV交聯(lián)板上的孔六次后用PBS洗滌六次。通過加入pH2.2的10mM甘氨酸來洗脫結(jié)合的噬菌體，并用pH7.4的1MTris/HCl中和。通常，第一輪選擇中洗脫103至106cfu，因此和原始所有組成成分(repertoire)相比較，富集的所有組成成分的多樣性降低了。含有富集的所有組成成分的洗脫液通過感染按指數(shù)生長的E.ColiTG1而得到擴(kuò)增。選擇含有噬菌粒的E.coli并在補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的LB瓊脂平板上30℃生長過夜來繁殖。該步驟后，富集的所有組成成分可以作為多克隆集合擴(kuò)增并用于重復(fù)方式的進(jìn)一輪選擇直至匯聚至獲得所需的特性，或空間分離并在單克隆水平上篩選。用輔助噬菌體VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染按指數(shù)生長的前一輪選擇的培養(yǎng)物，并在補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×TY中將培養(yǎng)物20℃生長過夜來制得用于下一輪選擇的噬菌體顆粒。用0.5M NaCl/4％ PEG-6000從澄清細(xì)菌上清液中沉淀選擇好的噬菌體并重懸浮于PBS中。一輪選擇后進(jìn)行單克隆水平上的篩選。
實施例2.1選擇和篩選scFv(在懸浮液中的細(xì)胞上選擇)單鏈Fv選自含有1011獨立克隆的人來源的大量非免疫噬菌體展示的所有組成成分，由Cambridge Antibody Technology Ltd.，Cambridge，UK提供。
為了選擇，用0.05％EDTA收集HT1080細(xì)胞(人纖維肉瘤細(xì)胞系；ATCC，CCL-121)并稀釋于DMEM+10％FCS中至1×107個細(xì)胞/ml。用DMEM+10％FCS在25℃預(yù)封閉2×1012cfu噬菌體文庫/107個細(xì)胞1小時，隨后在用DMEM+10％FCS預(yù)封閉的Eppendorf管中25℃顛倒旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)細(xì)胞1.5小時。分別將3×107個細(xì)胞用于第一輪選擇和107個細(xì)胞用于第二輪選擇。通過在220×g離心五分鐘來洗滌細(xì)胞，接著除去上清液并重懸浮于洗滌緩沖液中。用DMEM+10％FCS+0.05％吐溫-20作為洗滌緩沖液洗滌五次并用DMEM+10％FCS作為洗滌緩沖液洗滌五次。通過加入pH2.2的10mM甘氨酸來洗脫結(jié)合的噬菌體，并用pH7.4的1M Tris/HCl中和。通常，第一輪選擇中洗脫103至106cfu，因此和原始所有組成成分相比較，富集的所有組成成分的多樣性降低了。含有富集的所有組成成分的洗脫液通過感染按指數(shù)生長的E.Coli TG1得到擴(kuò)增。選擇含有噬菌粒的E.coli并在補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的LB瓊脂平板上30℃生長過夜來繁殖。該步驟后，富集的所有組成成分可以作為多克隆集合擴(kuò)增并用于重復(fù)方式的進(jìn)一輪選擇直至匯聚至獲得所需的特性，或空間分離并在單克隆水平上篩選所需功能。用輔助噬菌體VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染按指數(shù)生長的前一輪選擇的培養(yǎng)物，并在補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×TY中將培養(yǎng)物20℃生長過夜來制得用于下一輪選擇的噬菌體顆粒。用0.5M NaCl/4％PEG-6000從澄清細(xì)菌上清液中沉淀選擇好的噬菌體并重懸浮于PBS中。該實施例中兩輪選擇后，進(jìn)行單克隆水平上的篩選。
實施例3選擇和篩選scFv(在固定細(xì)胞上篩選)為了篩選，將包含于噬菌體展示載體中的編碼所選擇scFv的基因再克隆至表達(dá)載體pXP14中。該載體指引與Streptag和E-tag融合的scFv表達(dá)且不含有絲狀噬菌體基因-3。來自單克隆的含有表達(dá)載體的E.coli TG1在微量板上的單個孔中生長，使得每個孔只含有一個scFv克隆。細(xì)菌在96孔板(#9297，TPP)中的補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY中30℃生長直至OD600達(dá)到0.7。用終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并繼續(xù)在25℃過夜。通過加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至50μg/ml終濃度在25℃1小時制得含有單鏈Fv的澄清裂解液，并在3000×g離心15分鐘。在篩選ELISA之前，加入等體積的DMEM+10％FCS 1小時來封閉澄清裂解液。為了篩選ELISA，用0.05％EDTA收集HT1080細(xì)胞，用低聚甲醛固定，并稀釋于PBS中至1×107個細(xì)胞/ml，并固定于96孔UV交聯(lián)板(Corning Costar)的孔上。用MPBS封閉UV交聯(lián)板的孔，并將含有scFv的封閉的澄清裂解液加入，25℃1.5小時。用PBS+0.1％吐溫20洗滌兩次并用PBS洗滌一次，用綴合α-E-tag的HRP(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；以1∶5000稀釋于0.1％吐溫-20的MPBS中)溫育1小時，用PBS+0.1％吐溫-20洗滌三次并用PBS洗滌三次，用POD(#1484281，Roche)顯色并在370nm讀出信號。使用上述的ELISA篩選程序針對HT1080細(xì)胞和對照人成纖維細(xì)胞Hs-27(ATCC CRL-1634)再次測試陽性克隆。
典型篩選中，針對結(jié)合HT1080細(xì)胞篩選了2760(30×92)個克隆，5％陽性，定義為呈現(xiàn)背景扣除信號＞0.1的克隆。再次測試155個陽性，克隆用來特異性結(jié)合HT1080細(xì)胞，和H s-27對照細(xì)胞相比較，28％陽性，定義為在HT1080上呈現(xiàn)背景扣除信號值是Hs-27對照細(xì)胞上信號的兩倍的克隆。使用該選擇和篩選方法來鑒定scFv1。
實施例3.1選擇和篩選scFv(在粘附細(xì)胞上篩選)為了篩選，將包含于噬菌體展示載體中的編碼所選擇scFv的基因再克隆至表達(dá)載體pXP14中。該載體指引與Streptag和E-tag融合的scFv表達(dá)且不含有絲狀噬菌體基因-3。含有來自單克隆的表達(dá)載體的E.coli TGl在微量滴定板上的單個孔中生長，使得每個孔只含有一個scFv克隆。細(xì)菌在96孔微量滴定板(#9297，TPP)中的補(bǔ)充100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY中30℃生長直至OD600達(dá)到0.7。用終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并繼續(xù)在25℃過夜。通過加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至50μg/ml終濃度在25℃1小時制得含有單鏈Fv的澄清裂解液，并在3000×g離心15分鐘。在篩選ELISA之前，加入等體積的DMEM+10％FCS 1小時來封閉澄清裂解液。為了篩選ELISA，將HT1080細(xì)胞以3×104細(xì)胞/孔的密度播種于96孔板(#9296，TTP)上，在DMEM+10％FCS中37℃過夜。用DMEM+10％FCS在37℃封閉加樣孔1小時，加入含有scFv的封閉的澄清裂解液，25℃1.5小時。用PBS+0.1％吐溫-20洗滌兩次平板，用PBS洗滌一次，用綴合α-E-tag的HRP(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；以1∶5000稀釋于含有0.1％吐溫-20的PBS中的5％脫脂奶粉(#70166，F(xiàn)luka))溫育1小時，用PBS+0.1％吐溫-20洗滌三次，用PBS洗滌三次，用POD(#1484281，Roche)顯色并在370nm讀出信號。使用上述的ELISA篩選程序陽性克隆針對HT1080和對照人纖維原細(xì)胞Hs-27(ATCCCRL-1634)再測試陽性克隆。
典型篩選中，針對結(jié)合HT1080細(xì)胞篩選了1472(16×92)個克隆，16％陽性，定義為呈現(xiàn)背景扣除信號＞0.1的克隆。再次測試238個陽性克隆的特異性結(jié)合HT1080細(xì)胞，和Hs-27對照細(xì)胞相比較，28％陽性，定義為在HT1080上呈現(xiàn)背景扣除信號值是Hs-27對照細(xì)胞上信號的兩倍的克隆。使用該選擇和篩選方法來鑒定scFv2。
實施例3.2產(chǎn)生功能抑制抗體使用大的原初人噬菌體展示的抗體文庫，Cambridge AntibodyTechnology Ltd.，Cambridge，UK提供，在重組NP-1上選擇另外的NP-1抗體。如(Vaughan，T.J等，1996Nat Biotechnol.14，309)中所述的進(jìn)行選擇。兩輪選擇后，在ELISA中篩選單個克隆的能特異性識別重組NP-1的能力，且NP-1存在于細(xì)胞ELI SA和FACS中的細(xì)胞表面上。
實施例4a測序和大規(guī)模表達(dá)通過Sequiserve GmbH，Vaterstetten，Germany使用引物pXP2Seq2(5′-CCCCACGCGGTTCCAGC-3′)和pXP2Seq1(5′TACCTATTGCCTACGGC-3′)進(jìn)行所有scFv基因的測序。氨基酸序列顯示于圖10中，核苷酸序列顯示于圖11中。
將甘油儲液中通過測序鑒定的唯一序列在LB/Amp(100μg/ml)/1％葡萄糖瓊脂板上劃線接種并在30℃培養(yǎng)過夜。10mlLB/Amp/Glu(1％)培養(yǎng)基接種單個克隆并在30℃和200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。過夜后的第二個早晨將培養(yǎng)物放置于冰上直至接種于2LErlenmeyer搖瓶中的補(bǔ)充100μg/ml氨卞青霉素和0.1％葡萄糖的1L2×TY培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在25℃振蕩生長直至OD600達(dá)到0.5-0.6，然后用終濃度0.1mM的IPTG誘導(dǎo)。加入新鮮氨卞青霉素至50μg/ml并在22℃振蕩培養(yǎng)過夜。早晨將培養(yǎng)物在4℃5000×g離心15分鐘，丟棄上清液并小心地在冰上用吸管將沉淀重懸浮于10ml預(yù)冷的含有完全蛋白酶抑制劑(#1697498，Roche)的PBS-0.5M Na緩沖液中。完成重懸浮后，將細(xì)菌懸浮液轉(zhuǎn)移至20ml oakridge離心管中并加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至終濃度50μg/ml，冰上1小時。裂解的細(xì)菌在4℃20000×g離心15分鐘，并將上清液(裂解液)轉(zhuǎn)移至15ml塑料管中。為了親和性純化，將裂解液以1ml/分鐘裝載于1mlStrepTactin(#2-1505-010，IBA)柱上，其已用10柱體積(CV)PBS-0.5M Na緩沖液通過平行純化系統(tǒng)(自制)平衡。用PBS洗滌10CV后，用5CV PBS/5mM脫硫生物素(#D-1411，Sigma)進(jìn)行洗脫并收集1ml級分。在UV280測量級分，集合含有蛋白質(zhì)的級分并用Amicon UltraCentrifugal Filter Devices 10.000MWCO(#UFC801024，Millipore)在4700×g濃縮。在考馬斯藍(lán)染色的12％Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上檢測濃縮的scFv的純度，并以等分試樣冰凍于-80℃的20％甘油水溶液中。
實施例4b將scFv克隆成IgG形式并表達(dá)scFv由通過接頭序列連接的可變輕鏈和重鏈序列組成。使用含有限制位點的引物通過PCR分別擴(kuò)增可變輕鏈和可變重鏈。那些限制位點還存在于載體中，其含有合適的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)。擴(kuò)增的可變區(qū)用限制性內(nèi)切酶切割并克隆進(jìn)切割載體中。通過測序證實正確的序列。
使用了四個載體，一個含有IgG1形式的重鏈恒定區(qū)。第二個含有IgG4形式的重鏈恒定區(qū)，和兩個分別含有λ和κ輕鏈的恒定區(qū)。不同限制位點使切割載體并連接載體中的可變區(qū)成為可能。
為了在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)IgG，載體含有Epstein Barr病毒來源的復(fù)制子(oriP序列)，其提高了在293-EBNA-HEK細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平，因為EBNA蛋白質(zhì)導(dǎo)致游離型載體的復(fù)制。
用用于重鏈的載體和用于輕鏈的載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞中兩個鏈的表達(dá)和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中IgG的裝配。然后將裝配的IgG分泌至培養(yǎng)基。使用如磷酸鈣轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染方法，其中形成磷酸鈣和DNA的沉淀并引入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)基變?yōu)闊o血清培養(yǎng)基。每3天對每個IgG收集三次。將上清液(培養(yǎng)基)無菌過濾并保存于4℃。
為了純化IgG，通過蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠純化上清液，根據(jù)體積通過重力流或通過HPLC。為了達(dá)到200ml，使用重力流方法。對于兩個純化類型，將上清液裝載于蛋白質(zhì)A柱上，用50mM Tris pH7緩沖液洗滌并用pH～2的0.1M檸檬酸鹽洗脫。將0.25M Tris pH9加入洗脫液中使pH為5.5-6.0。根據(jù)IgG進(jìn)一步的用途，在PBS中透析并保存于-20℃。
實施例5腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的FACS分析為了測試純化的抗HT1080單鏈Fv和靶細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，我們進(jìn)行了熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析，使用HT1080細(xì)胞(ATCCCCL-121)、KHOS細(xì)胞(ATCC CRL-1544)、PC-3細(xì)胞(ATCC CRL-1435)、BT-474細(xì)胞(ATCC HTB-20)、Hela細(xì)胞(DSMZ ACC-57)、HL60細(xì)胞(DSMZ ACC-3)、Jurkat細(xì)胞(DSMZ ACC-282)、MCF7細(xì)胞(DSMZ ACC-115)和chang肝細(xì)胞(DSMZ ACC-57含有Hela細(xì)胞的雜質(zhì))(所有都是106細(xì)胞/ml)，Hs-27細(xì)胞(106細(xì)胞/ml)作為對照細(xì)胞系(參見圖5)。將細(xì)胞與10μg/ml的純scFv在CellWash(BD(Becton，Dickinson andCompany)#349524)4℃溫育20分鐘，洗滌，用第二FITC標(biāo)記的抗E-標(biāo)記單克隆抗體(Amer-sham#27-9412-01)檢測結(jié)合的scFv。洗滌樣品并在Becton Dickinson FACSscan上分析。圖5顯示了對于和scFvl反應(yīng)的細(xì)胞的對數(shù)熒光強(qiáng)度(FL1-H；X軸)和相對細(xì)胞數(shù)量(計數(shù)；y-軸)之比。細(xì)線表示對照細(xì)胞系(HS-27)，粗線表示腫瘤細(xì)胞系或chang肝細(xì)胞。scFv1和scFv2以比對照細(xì)胞系高10倍的信號特異性染色腫瘤細(xì)胞系。
實施例6FACS的競爭性分析為了測試純化的抗神經(jīng)纖毛蛋白-1 scFv阻斷靶細(xì)胞上普通神經(jīng)纖毛蛋白-1表位的能力，用0.5mM EDTA/PBS收集HT1080單個細(xì)胞懸浮液。在CellWash(BD，#349524)中與10μg/ml scFv溫育約1×106細(xì)胞，4℃一小時。用Cell Wash洗滌后，加入10μg/ml FITC標(biāo)記的scFv并在4℃溫育20分鐘。在Becton Dickinson FACSscan上分析結(jié)合FITC標(biāo)記的scFv的信號，之前用和沒用其它神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合劑培養(yǎng)。
實施例7用FITC標(biāo)記抗體片段用熒光異硫氰酸酯(FITC)(Molecular Probes，Eugene，USA#F1906)標(biāo)記scFv，通過以下方法將二甲基亞砜中的10mg/ml FITC溶液等分部分加入100μg溶解于PBS/0.5M NaHCO3中的scFv1中，pH9.5，比例為30∶1(FITCscFvl)。將樣品在室溫攪拌下溫育兩小時，使用脫鹽柱(2Micro Spin G-25，Pharmacia 27-5325-01)分離游離FITC。通過質(zhì)譜和通過UV/VIS光譜測定標(biāo)記的比例，其中在280nm計算質(zhì)濃度，494nm計算FITC濃度。
實施例8抑制抗體片段鑒定的侵襲試驗ChemoTx系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作一次性的趨化/細(xì)胞移動室，以96孔格式用8μm濾器痕跡蝕刻的聚碳酸酯，孔徑大小5.7mm直徑/位點。
將稀釋于Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中的13.3μl的0.3mg/ml Matrigel(Matrigel是從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)鼠肉瘤提取的溶解基底膜制劑，該肉瘤是富含胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的腫瘤。其主要成分是層粘連蛋白，其次是IV膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白和觸覺蛋白。其還含有TGF-成纖維細(xì)胞生長因子、組織纖溶酶原激活物，和其它在EHS腫瘤中天然生成的生長因子(BectonDickenson，BD#356234))應(yīng)用于96孔板B-H排上的膜濾器上，A排上于0.05M HCl(Sigma#945-50)中稀釋I型膠原S(Roche#10982929)1.2μg/位點，并在干燥器中20℃培養(yǎng)過夜，為了膠凝。在補(bǔ)充GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)和10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中HT1080細(xì)胞生長至70-80％匯合。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗滌細(xì)胞兩次，然后在原位用1∶100稀釋于DMEM/Glut amaxI/0.1％BSA中的二苯并二酰亞胺H33342(Sigma#B-2261)標(biāo)記，37℃15分鐘，7.5％CO2。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌細(xì)胞兩次并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA37℃負(fù)載15分鐘，7.5％CO2，用于回收。用PBSw/oCa2+，Mg2+(Gibco，10010-015)洗滌細(xì)胞兩次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)分離細(xì)胞，用DulbeccoS PBS/0.1％BSA/10mM Hopes(Gibco#15630-056)收集，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hopes洗滌兩次，懸浮于Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepos并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hopes稀釋至6.7×106細(xì)胞/ml。將6.7×106細(xì)胞/ml用40μg/ml作為抑制入侵負(fù)對照的對照scFv和HT1080細(xì)胞特異性scFv以1∶1在冰上溫育1小時。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋至6.7×105細(xì)胞/ml后，將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv稀釋液一式三份吸至趨化性室(B-H排)上，密度為3.4×104細(xì)胞/孔，在37℃，7.5％CO2，溫育6小時。在低部室DMEM/GlutamaxI和5％FCS用作化學(xué)引誘劑。1×104至4×104細(xì)胞/位點的標(biāo)準(zhǔn)曲線在I型膠原S涂覆的趨化性室A排上進(jìn)行。在底部室使用了DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(細(xì)胞未移動)。從膜頂端刮去未移動細(xì)胞后(除了A排的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，將通過膜移動(在標(biāo)準(zhǔn)曲線情況中未移動)的熒光細(xì)胞在FluostarGalaxy(bMG)微平板讀出器上測量，使用370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長。
實施例8.1VEGF對HT1080細(xì)胞侵襲的影響侵襲試驗設(shè)定和實施例8中所述的設(shè)定一樣。用Matrigel(0.3mg/ml；BD#356234，Bedford，MA)涂覆侵襲膜(Neuroprobe#106-8，Gaithersburg，MD)過夜。用二苯并二酰亞胺H 33342將80％匯合的HT1080細(xì)胞染色，然后用0.05％EDTA分離。細(xì)胞(7×106/ml，最終35.000/孔)與下列物質(zhì)在4℃預(yù)溫育1小時a.0、25、50或100ng/ml重組人VEGF(R&DSystems#293-VE，Minneapolis)，存在或不存在下20μg/ml抗人VEGF抗體(R&D Systems#AF-293-NA)。DMEM中的5％FCS(未熱滅活)用作膜下面孔中的化學(xué)引誘劑；b.存在或不存在20μg/ml抗人VEGF抗體，用5％FCS和25、50或100ng/ml VEGF作為化學(xué)引誘劑；c.存在或不存在20μg/ml抗人VEGF抗體，0、25、50或100ng/mlVEGF，和DMEM中1％BSA(Sigma#A7030，ST.Louis，MO)用于膜下的孔中；d.存在或不存在20μg/ml抗人VEGF抗體，使用含有1％BSA的DMEM中25、50或100ng/ml VEGF作為化學(xué)引誘劑。
將50μl預(yù)溫育的細(xì)胞懸浮液(a-d)吸移至膜頂部，并將侵襲板在37℃7.5％CO2溫育6小時。入侵試驗的讀出和實施例8所述的讀出相同。當(dāng)用不同濃度的重組VEGF預(yù)溫育時(a)，沒有看見侵襲顯著增加。還有，和實施例8的結(jié)果相比較，添加抗人VEGF抗體沒有影響HT1080細(xì)胞的侵襲(a)。將重組VEGF加入化學(xué)引誘劑FCS中沒有引起HT1080細(xì)胞侵襲增加(b)。VEGF濃度的改變也沒有顯示出效果。添加抗人VEGF抗體對該結(jié)果也沒有影響(b)。當(dāng)BSA用作化學(xué)引誘劑時(c)，用VEGF預(yù)溫育沒有引起HT1080細(xì)胞侵襲。使用DMEM中VEGF作為化學(xué)引誘劑和1％BSA也沒有刺激HT1080細(xì)胞的侵襲(d)，而5％FCS作為化學(xué)引誘劑誘導(dǎo)了侵襲(圖2a中從左第四條)。
實施例9使用CALI用于目標(biāo)鑒定的侵襲試驗該實施例大體上和實施例8相同，除了使用FITC標(biāo)記的scFv(參見，實施例7標(biāo)記)和在侵襲試驗中引入了CALI方法。
ChemoTx系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作一次性的趨化/細(xì)胞移動室，以96孔格式用8μm濾器痕跡蝕刻的聚碳酸酯，孔徑大小5.7mm直徑/位點。
將稀釋于Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中的13.3μl的0.3mg/ml Matrigel(參見實施例8)應(yīng)用于96孔板B-H排上的膜濾器上，A排上于0.05M HCl(Sigma#945-50)稀釋I型膠原S(Roche#10982929)1.2μg/位點，并在干燥器中20℃培養(yǎng)過夜，為了膠凝。在補(bǔ)充GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)和10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中HT1080細(xì)胞生長至70-80％匯合。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗滌細(xì)胞兩次，然后在原位用二苯并二酰亞胺H 33342(Sigma#B-2261)標(biāo)記并以1∶100稀釋于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA 中，37℃15分鐘，7.5％CO2。用DMEM/Glut amaxI/0.1％BSA洗滌細(xì)胞兩次并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA37℃負(fù)載15分鐘，7.5％CO2，用于回收。用PBSw/oCa2+，Mg2+(Gibco，10010-015)洗滌細(xì)胞兩次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)分離細(xì)胞，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mMHepes(Gibco#15630-056)收集，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌兩次，懸浮于Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀釋至6.7×106細(xì)胞/ml。用40μg/ml作為CALI后抑制侵襲的對照的FITC-標(biāo)記的抗β1整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon#MAB1963)和HT1080特異性FITC標(biāo)記的scFv以11將6.7×106細(xì)胞/ml在冰上溫育1小時。將1.3×105HT1080細(xì)胞/孔或HT1080細(xì)胞/scFv或Ab稀釋液一式三份吸移至兩個96孔板上，黑色，超薄透明平底特別的光學(xué)器件(Costar#3615)。將一塊板放置于黑暗中冰上，另一塊在冰上用波長488nm激光連續(xù)照射(0.5W，30秒)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋至6.7×105細(xì)胞/ml后，將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv稀釋液一式三份(未照射的一式三份在照射的一式三份旁邊)吸移至趨化性室(B-H排)上，密度為3.4×104細(xì)胞/孔，在37℃ 7.5％CO2培養(yǎng)6小時。在低部室含有5％FCS的DMEM/GlutamaxI用作化學(xué)引誘劑。1×104至4×104細(xì)胞/位點的標(biāo)準(zhǔn)曲線在I型膠原S涂覆趨化性室A排上進(jìn)行。在低部室使用了DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(細(xì)胞未移動)。從膜頂端刮去未移動細(xì)胞后(除了A排的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，將通過膜移動(在標(biāo)準(zhǔn)曲線情況中未移動)的熒光細(xì)胞在Fluostar Galaxy(bMG)微平板讀出器上測量，使用370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長。常規(guī)實驗中，45000的值對應(yīng)于100％移動的細(xì)胞。
通過比較它們侵襲腫瘤胞外基質(zhì)(Matrigel)的相對能力來評價HT1080細(xì)胞的侵襲表型，使用上述的Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)。CALI后scFvl對HT1080細(xì)胞的侵襲顯示了25％的抑制效果。侵襲試驗的結(jié)果，用和沒用CALI(參見實施例8)顯示于圖2中。圖2顯示了CALI將scFv1轉(zhuǎn)化成抑制抗體片段。
實施例10MTS存活力試驗通過測量四唑染料MTS(MTS，Celltiter Aqueousone，Promega#G4000)轉(zhuǎn)化成甲來測定存活細(xì)胞。將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv稀釋液(從侵襲試驗中制得的稀釋液獲得)一式三份地吸移至96孔平板上(黑色，超薄透明平底特別的光學(xué)器件，Costar#3615)，密度為3.4×104細(xì)胞/孔。將10μl MTS加入每個孔中并在37℃7.5％CO2溫育1小時。用Fluostar Galaxy(bMG)微平板讀出器在492nm測定吸收值。對于所有測試的scFv，沒有看見對細(xì)胞存活的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例11抑制性抗體片段鑒定的細(xì)胞基質(zhì)粘附試驗用一種基質(zhì)蛋白質(zhì)涂覆96孔平底平板(Costar#3614)的21個孔，該蛋白質(zhì)選自I型膠原S1μg/孔(Roche#10982929)、IV型膠原1μg/孔(Rockland 009-001-106)、纖連蛋白1μg/孔(Sigma F2518)和層粘連蛋白1μg孔(Roche 1243217)，各自在Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中，4℃過夜。同時，A排中的3個孔用2％BSA(Sigma#A-7030)/Dulbeccos PBS涂覆作空白值。用DulbeccoS PBS洗滌兩次孔，并用2％BSA(Sigma#A-7030)/Dulbeccos PBS 37℃封閉1小時，用Dulbeccos PBS洗滌。收集HT1080細(xì)胞，用2.5mM(終濃度)Calcein AM(Molecular Probes C-3099)染色，用PBSw/o CaCl2w/oMgCl2(Gibco 10010-015)洗滌兩次并于緩沖液中(0.5％BSA(Sigma#A-7030)+10mM Hepes+DMEM(Gibco 31966-02))稀釋至1.5×105/ml。用10μg/ml scFv混合HT1080細(xì)胞并在冰上溫育30分鐘。將HT1080細(xì)胞單獨和HT1080/scFv稀釋液一式三份地吸移至以密度1.5×104細(xì)胞/孔并在37℃7.5％CO2溫育1小時。用Dulbeccos PBS另外洗滌兩次后，將沖走其中未粘附的細(xì)胞，在A排一式三份地進(jìn)行來自稀釋于Dulbeccos PBS中的3.7×103至1.5×104染色細(xì)胞/孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將洗滌的孔裝滿100μl Dulbeccos PBS，并在FluostarGalaxy(bMG)微平板讀出器上測量粘附細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸收值，使用485/520nm的激發(fā)/發(fā)射波長。scFvl顯示出對HT1080細(xì)胞與I型膠原S、IV型膠原、纖連蛋白以及層粘連蛋白粘附的約20％抑制效果。scFv2顯示出對HT1080細(xì)胞和層粘連蛋白的粘附27％的抑制效果，對HT1080細(xì)胞與IV型膠原和纖連蛋白的粘著抑制效果相對低。沒有看見對HT1080細(xì)胞和I型膠原S粘附的作用。scFv1和scFv2的結(jié)果顯示于圖4中。
實施例12用CALI的目標(biāo)鑒定的細(xì)胞基質(zhì)粘附試驗用Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中的I型膠原S(Roche#10982929)1μg/孔涂覆96孔平板(TPP#9296)(細(xì)胞培養(yǎng)處理的)中的B-H排，并在A排孔10-12涂覆2％BSA(Sigma#A-7030)/DulbeccosPBS，4℃過夜。用Dulbeccos PBS洗滌平板，用2％BSA/Dulbeccos PBS封閉B-H排和A排10-12，37℃1小時，并再次用Dulbeccos PBS洗滌。在補(bǔ)充GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)和10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中，HT1080細(xì)胞生長至70-80％匯合。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗滌細(xì)胞兩次，然后在原位用二苯并二酰亞胺H33342(Sigma#B-2261)染色，并以1∶100稀釋于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中，37℃15分鐘，7.5％CO2。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA 洗滌細(xì)胞兩次并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA負(fù)載，37℃15分鐘，7.5％CO2，用于收集。用PBSw/o Ca2+，Mg2+(Gibco，10010-015)洗滌兩次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)分離細(xì)胞，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes(Gibco#15630-056)收集，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes洗滌兩次，懸浮于Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀釋至6.7×106細(xì)胞/ml。用40μg/ml作為CALI后抑制侵襲的對照的FITC-標(biāo)記的抗β1整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon#MAB1963)和HT1080特異性FITC標(biāo)記的scFv以1∶1將6.7×106細(xì)胞/ml在冰上溫育1小時。將1.3×105HT1080細(xì)胞/孔或HT1080細(xì)胞/scFv或Ab稀釋液一式三份地移至兩個96孔板上，黑色，超薄透明平底特別的光學(xué)器件(Costar#3615)。將一塊板放置于黑暗中冰上，另一塊在冰上用波長488nm激光連續(xù)照射(0.5W，30秒)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋至6.7×105細(xì)胞/ml后，將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv稀釋液一式三份地(未照射的三份在照射的三份旁邊)吸移至涂覆的和封閉的板上。A排孔10-12中，吸DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中的6.7×105細(xì)胞/ml作為背景對照。平板在37℃7.5％CO2培養(yǎng)1小時，用DulbeccosPBS洗滌兩次，其中沖走非粘著細(xì)胞。進(jìn)行A排孔1-9中1×104至4×104細(xì)胞/孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所有其它孔中移入50μl Dulbeccos PBS。已經(jīng)粘附于I型膠原S(在標(biāo)準(zhǔn)曲線情況中未粘附)的熒光細(xì)胞，在Fluostar Galaxy(bMG)微平板讀出器上測量，使用370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長。在CALI后scFv1顯示出對HT1080細(xì)胞對I型膠原S粘附的30％抑制效果。在CALI后scFv2顯示出對HT1080細(xì)胞和I型膠原S粘附的約10％抑制效果。一系列scFv2實驗中已經(jīng)顯示出對HT1080細(xì)胞和I型膠原S粘附5％的抑制效果，不用CALI。用和不用CALI的粘附試驗結(jié)果顯示于圖3中。
實施例13免疫沉淀將HT1080和Hs-27細(xì)胞(108)裂解于3ml 50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，含有蛋白酶抑制劑混合物(1pill于50ml緩沖液)的1％曲通X-100(v/v)(Boehringer Mannheim，Cat.-No.1697498)和100μM Pefablock(Roth，Cat.-No.A154.1)。與Streptactin瓊脂糖(IBA，#2-1201-010)在4℃預(yù)溫育裂解物2小時，將上清液用于免疫沉淀反應(yīng)。將HT1080特異性scFv(50μg/1mg細(xì)胞提取物)加入澄清裂解液中，樣品在4℃旋轉(zhuǎn)2小時，在700g溫和離心使Streptactin瓊脂糖成為沉淀，用1ml體積的PBS+0.1％吐溫緩沖液洗滌四次，然后用50μl 10mM D-脫硫生物素的PBS 0.1％吐溫20從Streptactin瓊脂糖沉淀洗脫分離出復(fù)合體。通過SDS-PAGE分離免疫復(fù)合物并銀染用于MS分析。
scFv1和scFv2降低了蛋白質(zhì)，通過銀染在SDS-PAGE上以分子量～130kDa的條帶被檢測。該條帶只在HT1080細(xì)胞提取物中檢測到，在Hs-27細(xì)胞(對照細(xì)胞)未檢測到，參見圖6。
實施例14通過質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)將SDS PAGE后從免疫沉淀獲得的凝膠條帶接受凝膠中胰蛋白酶消化，37℃過夜。使用5％甲酸提取肽并使用ZipTip μC18(Millipore)使所得到的肽混合物脫鹽，并首先用2μl的30％ACN/0.1％TFA洗脫，然后用2μl的70％ACN/0.1％TFA洗脫。合并這兩個級分，將獲得的一微升肽混合物以1∶1比例和α-氰基-4-羥基肉桂酸(3mg/ml)混合，在Teflon涂覆的不銹鋼靶上共結(jié)晶并在產(chǎn)生肽質(zhì)量指紋(PMF)的MALDI-TOF設(shè)備上分析，質(zhì)量范圍為m/z 800-3000。獲得的PMF用于檢索所有在NCBI和SwissProt數(shù)據(jù)庫中的人類登記。所有情況中，只考慮以小于10ppm的質(zhì)量偏差和所給蛋白質(zhì)相配的肽用于鑒定。
通過使用scFv1或scFv2獲得的約130kDa大小的條帶，產(chǎn)生達(dá)17個肽波峰(不同實驗中使用相同scFv)，其和神經(jīng)纖毛蛋白-1相配，最大蛋白質(zhì)覆蓋為22％(206/923個殘基)。3個多肽，即肽片段659-672、680-702和776-787明顯支持神經(jīng)纖毛蛋白-1的特征。神經(jīng)纖毛蛋白-1的剪接變體，稱為可溶性神經(jīng)纖毛蛋白-1，和923個氨基酸的神經(jīng)纖毛蛋白-1比較時，缺失氨基酸645-923。因此，獲得的質(zhì)譜清楚地證明了全長形式的NP-1通過scFv1和scFv2免疫沉淀。質(zhì)譜顯示于圖12中。
實施例15繪制表位圖譜的方法可以根據(jù)以下方法之一進(jìn)行表位圖譜的繪制。
實施例15.1“傳統(tǒng)”表位作圖以重組(融合)蛋白質(zhì)表達(dá)目的抗原cDNA的限定片段，并在各種實驗如Western印跡或ELISA中探測。
實施例15.2噬菌體展示技術(shù)發(fā)展了使用隨機(jī)肽噬菌體展示文庫的表位作圖的技術(shù)來將目的抗原cDNA的小隨機(jī)片段克隆進(jìn)噬菌體蛋白質(zhì)pIII纖維噬菌體中，并在噬菌體表面上展示它們(Fack等，(1997)J.Immunol.Methods7，43-52)。表位展示噬菌體可以用抗體在稱為“生物淘選”的方法中捕獲。對應(yīng)噬菌體的插入片段的測序給出了一些表位的信息。該方法原則上能夠鑒定構(gòu)象表位。
實施例15.3肽掃描技術(shù)這是基于激活膜上固定肽的合成，使用Fmoc化學(xué)。將氨基酸溶液運(yùn)用于激活膜形成膜上的氨基(用PEG激活膜)和所用氨基酸的激活羧基之間的肽鍵。每個循環(huán)后，進(jìn)行特定洗滌方法、乙?；饔?、脫保護(hù)和監(jiān)控游離氨基酸。和體內(nèi)蛋白質(zhì)合成相反，膜結(jié)合寡肽鏈?zhǔn)菑腃-至N-端逐步合成的。含有天然以及修飾氨基酸的寡肽可以合成至20個氨基酸的長度。合成后將膜平衡并封閉非特異性結(jié)合位點。與目的抗體溫育和數(shù)個洗滌步驟后，使用HRP綴合的第二抗體結(jié)合ECL系統(tǒng)進(jìn)行檢測。根據(jù)抗體可以將膜剝離，再生成和再使用10次。在固體支持物上合成理想地包括目的抗原的全部氨基酸序列的小重疊寡肽。該方法可以在氨基酸水平上鑒定線性抗原決定部位。其還可以進(jìn)行快速突變研究。
實施例16抑制管形成在明膠(0.2％明膠HBSS w/o Ca2+/Mg2+，1小時室溫)涂覆的150cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞(cell Line Service，Heidelberg；#0170 Hu)至80-90％匯合。只使用2至10傳代數(shù)的細(xì)胞。使用血管生成試驗試劑盒(Chemicon# ECM625)用于試驗。
材料96孔MTP，一半孔，組織培養(yǎng)處理的，黑色平底，Corning #3882用于HUVEC細(xì)胞的胰蛋白酶，0.25mg/ml，Clonetics# CC-5012明膠，2％，Sigma#G1393Biospin P6柱，Biorad# 7326200緩沖液PBS Dulbecco′s，Invitrogen#14040-091HBSS w/o Ca2+/Mg2+，Invitrogen#14170-088培養(yǎng)基用于HUVEC細(xì)胞(CLS Heidelberg)的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基，含有2％FCS、0.4％ECGS/H、0.1ng/ml EGF、1.0ng/ml bFGF、1.0μg/ml氫化可的松、慶大霉素/兩性霉素B。
scFv的純化用Biospin P6柱(Biorad)純化ScFv來除去脫硫生物素、內(nèi)毒素和甘油，并保存于PBS中冰上過夜。在280nm處測量吸收值來測定純化scFv的蛋白質(zhì)濃度。加入PBS將所有scFv溶液調(diào)節(jié)至相同濃度。制備用于管形成試驗的MTP將所需量的緩沖液加入ECMatrixTM(都包括于血管生成試劑盒中)。將25μl稀釋的ECMatrixTM加入預(yù)冷的96孔MTP的每個孔中(平板的一半孔)。將MTP在37℃溫育＞1小時使基質(zhì)溶液固化。在室溫下用scFv或合適的IgG預(yù)溫育分離的內(nèi)皮細(xì)胞30分鐘。
細(xì)胞接種和抗體溫育通過除去細(xì)胞培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶中分離HUVEC細(xì)胞，用10ml HBSSw/o Ca2+/Mg2+洗滌細(xì)胞一次，隨后加入5ml胰蛋白酶(Clonetics)并在37℃溫育2-3分鐘。通過加入5ml帶有FCS的細(xì)胞培養(yǎng)基停止胰蛋白酶反應(yīng)。合并上清液，室溫240×g離心5分鐘，小心除去上清液并將細(xì)胞重懸浮于5ml培養(yǎng)基中，使用Neubauer細(xì)胞計數(shù)室計數(shù)。通過將所需數(shù)量的細(xì)胞重懸浮于合適量的細(xì)胞培養(yǎng)基中來制得細(xì)胞總混合物，加入抗體溶液后獲得50μl每孔10000細(xì)胞的濃度?？字械慕K濃度通常為scFv 10μg/ml，IgG 50μg/ml。對于每個結(jié)合劑，制得3×預(yù)混物。對于每個結(jié)合劑，接種前在總體積150μl中用合適量scFv或IgG預(yù)溫育3×預(yù)混物和3×10000細(xì)胞，室溫30分鐘，使得接觸基質(zhì)蛋白質(zhì)之前結(jié)合NP-1。將50μl細(xì)胞抗體混合物轉(zhuǎn)移至25μl固化ECMatrix涂覆的MTP每個孔中。每個實驗中包括合適的對照(對于樣品scFv、鼠IgG、商業(yè)抗NP-1抗體(R&D Systems，#AF566)、抗α2整聯(lián)蛋白、以及非特異性對照scFv相同濃度的PBS)。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)16小時。通過光學(xué)顯微鏡測定管形成的程度并基于細(xì)胞形成閉合多邊形的能力、多邊形數(shù)量和面積、分支點的數(shù)量和細(xì)胞形成閉合管的能力例如分支點之間的連接來定量。如果形成閉合多邊形的能力、分支點的數(shù)量和形成分支點之間閉合連接的能力降低，就認(rèn)為ScFv是陽性的。通過比較負(fù)對照定量抑制效果并分成0至3之間的等級(0-1＝?jīng)]有抑制，2-3＝強(qiáng)抑制效果)。數(shù)個scFv轉(zhuǎn)化成IgG1格式并再次測試。圖14a-c顯示了管形成試驗的表示圖。數(shù)個scFv顯示出顯著的管形成抑制(抑制＞2.2)。表1，如圖15所示，歸納了管形成試驗的所有結(jié)果。數(shù)個scFv顯著地抑制了管形成，而可購得的抗NP-1抗體沒有顯示任何顯著抑制管形成。
實施例17ELISA中NP-1/VEGF相互作用的抑制為了測試scFv抑制重組NP-1和VEGF之間相互作用的能力，將PBS中50nM濃度的VEGI165(R&Dsystems，#293-VE/CF)涂覆在Maxisorp微量滴定板(Nunc，#430341)上。50ng/ml濃度的重組NP-1-Fc(R&Dsystems，#566-NNS)與NP-1scFv(25μg/ml)預(yù)溫育，室溫1小時，并加至VEGF165涂覆的微量滴定板上。用抗Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch，#H909-035-098)測定結(jié)合的NP-1，隨后和BM藍(lán)POD底物(Roche，#11484281)反應(yīng)，在370nM測定吸收值。測試了28個scFv的抑制重組NP-1和VEGF165之間相互作用的能力。發(fā)現(xiàn)12個scFv顯著抑制了NP-1和VEGF165之間的相互作用。將該結(jié)果和實施例16中所述的管形成試驗中的結(jié)果相比較。scFv8抑制了NP-1和VEGF165之間的相互作用并抑制了HUVEC管形成；scFv13沒有抑制NP-1和VEGF165之間的相互作用但抑制了HUVEC管形成；s cFv24抑制了NP-1和VEGF165之間的相互作用但沒有抑制HUVEC管形成。
實施例18測定NP-1的表位根據(jù)制造商的指導(dǎo)用熒光素異硫氰酸酯(Molecular Probes，#F-1906)標(biāo)記ScFv。HT1080細(xì)胞與對照scFv、NP-1結(jié)合scFv(例如scFv8、scFv13或scFv22)(均為25μg/ml)或VEGF165(R&Dsystems，#293-VE/CF)(5μg/ml)0℃預(yù)溫育2小時，加入熒光素標(biāo)記的NP-1結(jié)合scFv(5μg/ml)，0℃30分鐘。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)合熒光素標(biāo)記的scFv，并記錄熒光強(qiáng)度的幾何平均數(shù)。為了測定是否NP-1結(jié)合scFv具有和VEGF重疊的表位，互相和細(xì)胞表面NP-1結(jié)合，用直接標(biāo)記scFv進(jìn)行競爭FACS。和VEGF競爭ELISA一致，scFv8抑制了NP-1和VEGF165之間的相互作用并抑制了HUVEC管形成；scFv13沒有抑制NP-1和VEGF165之間的相互作用但抑制了HUVEC管形成；scFv24抑制NP-1和VEGF165之間的相互作用但沒有抑制HUVEC管形成。此外，scFv8和scFv24具有互相重疊的表位，scFv13具有與scFv8和scFv24截然不同的表位。
實施例19HT1080細(xì)胞跨內(nèi)皮的侵襲試驗制備單層內(nèi)皮細(xì)胞用50μl/孔0.2％明膠(Sigma G-1393)涂覆Neuroprobe膜，稀釋于HBSS w/o Ca+/Mg+離子(Gibco 14170-088)中，并在通風(fēng)櫥下室溫溫育1小時。用胰蛋白酶(Cambrex CC-5012)和ECGM(CLS即用型上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基)收集匯合的HUVEC細(xì)胞，并用ECGM稀釋至2×105/ml。用海綿除去涂覆膜上殘留的流體。Neuroprobe系統(tǒng)的底室裝滿28.5μl/孔HBSS，并將膜放置于頂部。在膜上每個孔中點上(spotted)50μl(1×104)HUVEC細(xì)胞懸浮液，并在37℃5％CO2培養(yǎng)48小時。
制備HT1080細(xì)胞將5×105個細(xì)胞接種于6個150cm2培養(yǎng)瓶中，并在37℃ 5％CO2培養(yǎng)48小時。
HT1080細(xì)胞的染色將Calcein AM(Molecular Probes C3099)以1∶1000稀釋于90ml含有Glutamax的DMEM中，Glutamax含有0.1％的BSA(Sigma A-7030)。從HT1080細(xì)胞除去培養(yǎng)基，將15ml/瓶的Calcein溶液加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃5％CO2培養(yǎng)15分鐘。除去溶劑并用HBSS w/o Ca+/Mg+離子洗滌細(xì)胞兩次。用EDTA和含有G1utamax的DMEM收集細(xì)胞，Glutamax含有0.1％的BSA，并用含有Glutamax的DMEM稀釋至7×105/ml，Glut amax含有的0.1％BSA。
抑制細(xì)胞侵襲一式三份進(jìn)行所有實驗。將170μl HT1080細(xì)胞懸浮液吸移至96孔V底平板的每個孔中。加入17μl scFv(min.10μg/ml)、0.25mg/ml細(xì)胞松弛素D(CCD)(SigmaC-8273)，并將細(xì)胞培養(yǎng)15分鐘。使用非特異性抗體作為負(fù)對照。
標(biāo)準(zhǔn)曲線1×104細(xì)胞46.8μl細(xì)胞+133.2μl含有Glutamax 0.1％BSA的DMEM2×104細(xì)胞93.6μl細(xì)胞+86.4μl含有Glutamax 0.1％BSA的DMEM4×104細(xì)胞57.2μl細(xì)胞直接點樣制備侵襲的膜系統(tǒng)從底室將膜分離并從膜的底部除去溶劑。將底部孔中的溶劑也除去。為了測試樣品(B-H排)，用30μl/孔ECGM/20％FCS(InVitrogen1027O106)填滿底室。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線和對于背景，A排的所有孔填滿30μl/孔ECM并將膜放置于頂部。
將55μl(3.5×104)HT1080樣品吸移至HUVEC細(xì)胞層頂部。37℃5％CO2培養(yǎng)12-16小時。用細(xì)胞刮除器將B-H排細(xì)胞刮除，并用Dulbeccos PBS漂洗膜。用棉簽(在PBS中預(yù)濕)擦拭B-H排的孔并再次用DulbeccosPBS漂洗膜。小心干燥膜并在485/520nm測量熒光(FluostarGalaxy)。4個不同的單鏈以6-10％的值抑制了侵襲。如圖18所示的表2歸納了結(jié)果。
實施例20HUVEC遷移試驗根據(jù)制造商(BD Biosciences，Bedford/MA，Cat.-Nr.354143)的指導(dǎo)進(jìn)行HUVEC遷移試驗。概括地，用抗體(50μg/ml)在室溫溫育250μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Promoce11，Heidelberg，Germany，Cat.-Nr.22210)的2×104HUVEC 30分鐘，基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有1ng/ml EGF、1μg/ml氫化可的松、0.4％FCS、50ng/ml兩性霉素B和50μg/ml慶大霉素(全部來自Cambrex，East Ruther-ford/NJ)，然后將細(xì)胞接種于24孔嵌入物的頂室，在每個孔的底部含有熒光素涂覆的、3μm孔徑的FluoroBlok膜。用另外含有5ng/mlVEGF165(R&DSystems，Minneapolis/MN)的相同培養(yǎng)基裝滿底室。平板在37℃ 5％CO2培養(yǎng)22小時，然后將24孔嵌入物轉(zhuǎn)移至含有0.5ml的HBSS(Invitrogen，Carlsbad/CA)中的4μM calcein-AM(MolecularProbes，Eugene/OR)的溶液的新平板上。90分鐘溫育后，將平板在BMGFluoStar平板讀出器(BMG LabTechnologies，Offenburg，Germany)上485nm激發(fā)和520nm發(fā)射波長讀出平板。使用Kruskal-Wallis測試進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05為顯著性。一些結(jié)果顯示于圖19中。作為實例，7個IgG顯示于圖19中，顯示出20-60％的HUVEC細(xì)胞遷移抑制。scFv8*、scFv25*、scFv26*和scFv31*顯示出統(tǒng)計學(xué)相關(guān)抑制效果。HUVEC細(xì)胞遷移和VEGF165濃度的相關(guān)性也顯示于圖19中(左邊三條)。使用0-5ng/ml濃度來測定濃度相關(guān)性。HUVEC細(xì)胞遷移隨著VEGF165濃度的增加而增加。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)合劑(NPB)，其中NPB是多肽、抗體、scFv、抗體片段或生物綴合物，其特征是調(diào)節(jié)神經(jīng)纖毛蛋白-1(NP-1)的功能或具有抑制NP-1依賴性內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和/腫瘤細(xì)胞侵襲的能力，其中NPB和NP-1結(jié)合并調(diào)節(jié)NP-1的功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的NPB，含有選自SEQ ID No1或SEQ ID No2的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的NPB，含有選自SEQ ID No5至SEQ ID No38的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的NPB，其中NPB沒有結(jié)合、干擾或抑制VEGF/神經(jīng)纖毛蛋白-1的相互作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的NPB，其中NPB是含有一個CDR3(互補(bǔ)決定區(qū)3)的多肽、抗體、scFv、抗體片段或生物綴合物，該CDR3具有至少一個選自SEQ ID No73至SEQ ID No108的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項的NPB，其中用可檢測標(biāo)記來標(biāo)記所述NPB；尤其是其中所述可檢測標(biāo)記選自放射性同位素、酶和發(fā)色團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB的用途，用于測定神經(jīng)纖毛蛋白-1的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB的用途，用于調(diào)節(jié)神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能，尤其是調(diào)節(jié)或抑制神經(jīng)纖毛蛋白依賴性的細(xì)胞優(yōu)選腫瘤細(xì)胞的侵襲或粘附。
9.診斷試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB和容器。
10.組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB和藥物學(xué)上可接受的載體。
11.分離的核酸分子，編碼根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB。
12.載體，包含根據(jù)權(quán)利要求11的核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB在制備用于治療或預(yù)防神經(jīng)纖毛蛋白依賴性血管生成和尤其和腫瘤相關(guān)的非生理性血管生長藥物中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB在制備用于治療或預(yù)防癌癥和/或腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物中的用途，其中轉(zhuǎn)移潛能取決于神經(jīng)纖毛蛋白-1相關(guān)的侵襲和/或粘附，優(yōu)選其中腫瘤細(xì)胞是源自中胚層細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。
15.權(quán)利要求13或14的用途，其中NPB抑制表達(dá)的神經(jīng)纖毛蛋白-1的功能，尤其是其中分子和神經(jīng)纖毛蛋白-1的胞外域結(jié)合。
16.測定自然生成侵襲性癌細(xì)胞侵襲力對神經(jīng)纖毛蛋白-1功能從屬性的離體方法，包括步驟b)將癌細(xì)胞和抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子接觸；c)在適于所述癌細(xì)胞生長的條件下將所述癌細(xì)胞和膠狀基質(zhì)接觸；d)測定所述癌細(xì)胞通過膠狀基質(zhì)的移動。
17.測定自然生成侵襲性癌細(xì)胞粘附力對神經(jīng)纖毛蛋白-1功能從屬性的離體方法，包括步驟a)將癌細(xì)胞和抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1功能的分子接觸；b)在適于所述癌細(xì)胞生長的條件下將所述癌細(xì)胞和胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)層接觸；c)測定所述癌細(xì)胞對ECM蛋白質(zhì)層的粘附。
18.權(quán)利要求17的方法，其中ECM蛋白質(zhì)層包括選自I型膠原S、膠原VI、纖連蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、觸覺蛋白和玻連蛋白中的一種蛋白質(zhì)。
19.鑒定和神經(jīng)纖毛蛋白-1胞外域特異性結(jié)合的配體的方法，其中所述配體能夠抑制血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞的管形成和/或腫瘤細(xì)胞的侵襲或粘附，包括步驟a)將配體的噬菌體文庫和癌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞接觸；b)分離所述細(xì)胞；c)除去未特異性結(jié)合和/或未結(jié)合所述細(xì)胞的噬菌體；d)洗脫和所述細(xì)胞結(jié)合的噬菌體；和任選地e)測定通過和神經(jīng)纖毛蛋白-1所述結(jié)合表示的配體的特性f)在生化或生物試驗中測試配體干擾NP-1功能的能力。
20.權(quán)利要求19的方法，替代步驟e)，進(jìn)一步包括步驟e)將洗脫的噬菌體和被固定的NP-1接觸；f)用去污劑和/或高鹽洗滌所述NP-1；g)洗脫和NP-1結(jié)合的噬菌體；和h)測定通過所述洗脫的噬菌體表示的配體的特性。
21.治療或預(yù)防患者癌癥或轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB、根據(jù)權(quán)利要求10的組合物、根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列或可通過由權(quán)利要求19或20方法鑒定的配體給藥于患者來抑制神經(jīng)纖毛蛋白-1介導(dǎo)的侵襲和/或粘附的轉(zhuǎn)移。
22.治療或預(yù)防患者癌癥或轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的NPB、根據(jù)權(quán)利要求10的組合物、根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列或可通過由權(quán)利要求19或20方法鑒定的配體給藥于患者來抑制腫瘤相關(guān)的、神經(jīng)纖毛蛋白依賴性的血管生成。
全文摘要
本發(fā)明涉及干擾神經(jīng)纖毛蛋白－1(neuropilin－1)在血管生成范圍內(nèi)功能的分子和癌癥的治療。提供了分子、多肽、抗體、組合物和方法，用于降低、抑制或治療血管生成、血管侵襲入腫瘤，和/或特定腫瘤細(xì)胞的侵襲或轉(zhuǎn)移潛能。此外，提供可以鑒定干擾了神經(jīng)纖毛蛋白－1功能性的分子的方法。此外，提供了方法，可以測定自然生成腫瘤細(xì)胞對于其侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能是否取決于神經(jīng)纖毛蛋白－1的功能。
文檔編號C07K16/28GK1742022SQ200380109161
公開日2006年3月1日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月15日
發(fā)明者C·M·翁格爾, G·貝斯特, C·策厄梅爾, B·萊恩, C·特雷拉, J·尼韋納, D·G·杰伊, B·K·尤斯塔斯, R·克瑙爾, K·H·延森 申請人:克斯里恩醫(yī)藥股份公司