專利名稱：一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法，具體是利用制備色譜技術(shù)提取、純化牛初乳中的IgG。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡(jiǎn)稱Ig)是牛初乳和常乳中最引人注目的免疫因子，初乳中富含的多種免疫球蛋白(IgG、IgM等)能夠形成抗體，與病源微生物及毒素等抗原結(jié)合，在哺乳動(dòng)物新生幼仔自身免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟、正常運(yùn)作之前，可以保護(hù)其免受病源體的侵襲。牛初乳中免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡(jiǎn)稱Ig)有IgG、IgA、IgM、IGD和IgE等種類，而且對(duì)于每一類還可以有更細(xì)致的分類。因此如果要從Ig中分離出IgG而且要達(dá)到很高的濃度(效價(jià))，單純依靠一般效率的分離手段是很難完成的，目前已有一些提取牛初乳中的IgG的方法，但這些方法存在著提取、純化出的IgG含量低、工藝復(fù)雜等不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡(jiǎn)單、提取純化出的IgG含量高的一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明的提取、純化方法步驟如下1、將收集到的牛初乳過(guò)濾，利用離心機(jī)在30℃-50℃離心脫脂，將脫脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒；2、加鹽析物質(zhì)沉淀去除酪蛋白及無(wú)抗體活性蛋白；3、乳清脫鹽、除糖，鹽析、透析將去除酪蛋白及無(wú)抗體活性蛋白的上清液經(jīng)強(qiáng)酸型樹脂(Catex，Na+型)處理，去除過(guò)量的鹽析物質(zhì)；在乳清中加入分析純硫酸銨，使其飽和度達(dá)到35％，4℃靜置12-13h，在4℃下離心25-35min，保留沉淀，用原乳清液體積5％的PBS(磷酸鹽緩沖液，pH6.8，0.01mol/L)溶解沉淀，將沉淀置入透析袋中，在4℃下對(duì)PBS透析至透析液中無(wú)NH+4存在(或用5000道爾頓的中空纖維膜超濾至無(wú)NH+4存在)，然后凍干，得到IgG初步分離濃縮產(chǎn)物；4、離子交換柱層析分離純化；5、凝膠過(guò)濾層析純化，純化后即可得含量達(dá)90％以上的IgG。
本發(fā)明由于選擇合適的離子交換填料和凝膠過(guò)濾填料(選擇以SepharoseFF為基架的離子交換介質(zhì)DEAE Sepharose F.F選擇凝膠過(guò)濾填料Sephacry/s-200HR)，利用制備色譜技術(shù)提取、純化牛初乳中的IgG.，并選擇二甲基十二烷基芐基溴化銨作為鹽析物質(zhì)，沉淀去除不具備抗體活性的初乳蛋白，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，使提取、純化出的牛初乳中的IgG.含量可達(dá)90％以上。
具體實(shí)施例方式1、將收集到的牛初乳在4-10℃過(guò)濾，利用4000r/min離心機(jī)，30℃-50℃離心脫脂，將脫脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒25-35min之后冷凍保藏；2、將冷凍的脫脂牛初乳室溫解凍并升溫至20℃-30℃，攪拌下緩慢加入等體積的2％ DMLDAB(二甲基十二烷基芐基溴化胺)水溶液，調(diào)節(jié)pH7.9-pH8.1，沉淀酪蛋白及各種無(wú)抗體活性的的初乳蛋白組分，將渾濁混合物加熱至43℃-45℃，冷卻至室溫，沉淀15-20小時(shí)，離心18-25min除去沉淀，保留上清液；3、上清液經(jīng)強(qiáng)酸型樹脂(Catex，Na+型)處理，去除過(guò)量的DMLDAB；在乳清中加入分析純硫酸銨，使其飽和度達(dá)到35％，4℃靜置12-13小時(shí)，在4℃下離心25-35min，保留沉淀；用原乳清液體積5％的PBS(磷酸鹽緩沖液，pH6.8，0.01mol/L)溶解沉淀，將沉淀置入透析袋中，在4℃下對(duì)PBS透析至透析液中無(wú)NH+4存在(或者用5000道爾頓的中空纖維膜超濾至無(wú)NH+4存在)。然后凍干，得到IgG初步分離濃縮產(chǎn)物；4、離子交換柱層析分離純化(1)離子交換柱填充及連接填料采用DEAE Sepharose F.F(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)，將柱填料分別用蒸餾水、0.5mol/L NaOH溶液處理，然后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡，在0.3MPa下填充到規(guī)格為45mmi.d.×200mm的離子交換柱管中，制成DEAE Sepharose F.F離子交換柱。將離子交換柱管部分安裝到用生化培養(yǎng)箱改制的冷阱柱箱中(溫控范圍2℃-50℃)，將梯度轉(zhuǎn)換接頭與P2000高效液相色譜泵連接(將泵的最小壓力設(shè)置為“0”MPa)。用UV200紫外檢測(cè)器檢測(cè)，402色譜工作站記錄繪圖；(2)、樣品準(zhǔn)備及上樣洗脫取2.0g IgG初步分離的樣品，用pH7.4，0.01mol/L的PBS30mL溶解，置于透析袋中，然后在4℃下對(duì)2500mL的pH7.4，0.01mol/L的PBS透析24h后上樣，上樣后分別采用3種洗脫液進(jìn)行分段洗脫(用TSP高效液相色譜系統(tǒng)的P2000二元梯度泵代替普通的梯度混合器)，第一階段采用pH7.4，0.01mol/L的PBS洗脫；第1個(gè)峰流出后，再采用pH5.4，0.02mol/L的PBS進(jìn)行第二階段洗脫；第2個(gè)峰流出后，改用pH5.4，0.08mol/L的PBS洗脫至第3個(gè)峰流出，洗脫體積流速為300mL/h，分離過(guò)程中控制柱溫為4℃；5、凝膠過(guò)濾層析純化采用Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾填料(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，將填料在0.2MPa下填充到16mmi.d.×800mm凝膠過(guò)濾柱管中。填充后，用pH7.6，0.005mol/LPBS在4℃下平衡12h，體積流速為36mL/h。將DEAESepharose F.F分離得到的3個(gè)峰分別用pH7.6，0.005mol/L的PBS溶解并上樣，洗脫液為pH7.6，0.005mol/L的PBS，洗脫體積流速為36mL/h。分離過(guò)程中控制柱溫為4℃，根據(jù)組分的保留時(shí)間，用BS-100A型自動(dòng)餾分收集器將3個(gè)峰收集并凍干。即獲IgG純品，IgG含量為90％以上。
權(quán)利要求
1.一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于其步驟為(1)、將收集到的牛初乳過(guò)濾，利用離心機(jī)在30℃-50℃離心脫脂，將脫脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒；(2)、加鹽析物質(zhì)沉淀去除酪蛋白及無(wú)抗體活性蛋白；(3)、乳清脫鹽、除糖、鹽析、透析將去除酪蛋白及無(wú)抗體活性蛋白的上清液經(jīng)Catex，Na+型強(qiáng)酸型樹脂處理，去除過(guò)量的鹽析物質(zhì)；在乳清中加入分析純硫酸銨，使其飽和度達(dá)到35％，4℃靜置12-13h，在4℃下離心25-35min，保留沉淀，用原乳清液體積5％的pH6.8，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液PBS溶解沉淀，將沉淀置入透析袋中，在4℃下對(duì)PBS透析至透析液中無(wú)NH+4存在，或用5000道爾頓的中空纖維膜超濾至無(wú)NH+4存在，凍干后得到IgG初步分離濃縮產(chǎn)物；(4)、用離子交換柱層析分離純化；(5)、凝膠過(guò)濾層析純化，即可得IgG純品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的去除酪蛋白及無(wú)抗體活性蛋白的方法中所用的鹽析物質(zhì)是二甲基十二烷基芐基溴化胺水溶液，其方法的步驟是將脫脂消毒后的牛初乳在20℃-30℃下，攪拌緩慢加入等體積的2％的二甲基十二烷基芐基溴化胺水溶液，調(diào)節(jié)pH7.9-pH8.1，沉淀各種無(wú)抗體活性的的初乳蛋白組分，將渾濁混合物加熱至43℃-45℃，冷卻至室溫，沉淀15-20小時(shí)，離心18-25min除去沉淀，保留上清液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種提取純化、牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的離子交換柱層析分離純化的方法的步驟是(1)離子交換柱填充及連接填料采用DEAE Sepharose F.F(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)，將柱填料分別用蒸餾水、0.5mol/LNaOH溶液處理，然后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡，在0.3MPa下填充到規(guī)格為45mm i.d.×200mm的離子交換柱管中，制成DEAESepharose F.F離子交換柱。將離子交換柱管部分安裝到用生化培養(yǎng)箱改制的冷阱柱箱中，溫控范圍2℃-50℃，將梯度轉(zhuǎn)換接頭與P2000高效液相色譜泵連接，將泵的最小壓力設(shè)置為“0”MPa，用UV200紫外檢測(cè)器檢測(cè)，402色譜工作站記錄繪圖；(2)、樣品準(zhǔn)備及上樣洗脫取2.0g IgG初步分離的樣品，用pH7.4，0.01mol/L的PBS30mL溶解，置于透析袋中，然后在4℃下對(duì)2500mL的pH7.4，0.01mol/L的PBS透析24h后上樣，上樣后分別采用3種洗脫液進(jìn)行分段洗脫，第一階段采用pH7.4，0.01mol/L的PB洗脫；第1個(gè)峰流出后，再采用pH5.4，0.02mol/L的PBS進(jìn)行第二階段洗脫；第2個(gè)峰流出后，改用pH5.4，0.08mol/L的PBS洗脫至第3個(gè)峰流出，洗脫體積流速為300mL/h，分離過(guò)程中控制柱溫為4℃。
4.如權(quán)利要求1所述的一種提取純化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的凝膠過(guò)濾層析純化的方法的步驟是用SephacrylS-200 HR凝膠過(guò)濾填料(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，將填料在0.2MPa下填充到16mm i.d.×800mm凝膠過(guò)濾柱管中，填充后，用pH7.6，0.005mol/L PBS在4℃下平衡12h，體積流速為36mL/h，將DEAE Sepharose F.F分離得到的3個(gè)峰分別用pH7.6，0.005mol/L的PBS溶解并上樣，洗脫液為pH7.6，0.005mol/L的PBS，洗脫體積流速為36mL/h，分離過(guò)程中控制柱溫為4℃，根據(jù)組分的保留時(shí)間，用BS-100A型自動(dòng)餾分收集器將3個(gè)峰收集并凍干即可得IgG純品。
全文摘要
一種提取純化牛初乳中的IgG的方法，步驟如下將收集到的牛初乳過(guò)濾，離心脫脂，將脫脂后的牛初乳巴氏消毒；加鹽析物質(zhì)去除酪蛋白及無(wú)抗體活性蛋白；乳清脫鹽、除糖鹽析、透析；用離子交換柱層析法分離純化；凝膠過(guò)濾層析純化，即可得IgG。本發(fā)明利用制備色譜技術(shù)提取、純化牛初乳中的IgG.，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，使提取、純化出的牛初乳中的IgG.含量可達(dá)90％以上。
文檔編號(hào)C07K16/04GK1660905SQ20041001358
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者張瀟宇, 鄭永杰, 王曉工, 薄金嶺, 諸曉強(qiáng), 楊秀茹, 遲濤, 王雪蓮 申請(qǐng)人:黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心