專利名稱：高純度磷脂酰肌醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高純度磷脂酰肌醇的制備方法。
背景技術(shù)：
磷脂廣泛分布于動(dòng)物、植物、微生物、藻類等生物體內(nèi)，主要作為細(xì)胞膜的構(gòu)成成分，起著各種重要的作用。天然磷脂通常是由磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)及鞘磷脂等組成的混合物，作為粉狀大豆磷脂，PC含量19～31％，PE含量18～20％，PI含量18～21％，PS含量1％，PA含量15～20％。
肌醇脂類是80年代發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞生物信息跨膜傳遞上起重要作用的信使系統(tǒng)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控等密切相關(guān)。PI是肌醇脂類系統(tǒng)組分之一，約占細(xì)胞總磷脂的5～10％，它廣泛存在于細(xì)胞膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，代謝活躍，具有重要的生理功能。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明高純度的PI對(duì)某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病有一定的治療作用，最近有研究發(fā)現(xiàn)其硫酸鹽SPI是一種新型抗HIV(human immunodeficiency virus)藥物。PI具有重要的生理功能以及獨(dú)特的乳化性能，可被廣泛用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品和工業(yè)制劑等許多領(lǐng)域。
分離純化PI對(duì)于深入研究它的代謝、生理作用及開(kāi)發(fā)它的藥用價(jià)值都有著重要的意義。Folch(Folch J.Complete fraction of brain cephalinIsolation from it ofphosphatidylserine，phosphatidylethanolamine and diphosphoinositide.J.Biol.Chem.，1949，177497)首先從腦中分離出肌醇磷脂。以后提取方法雖有許多改進(jìn)，但仍較復(fù)雜，主要是使用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、二甲苯等有機(jī)試劑中的一種或幾種的混合液進(jìn)行抽提，再結(jié)合硅膠、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂等吸附劑的柱層析法或薄層層析法分離純化PI，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，需要耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，成本高、產(chǎn)量低。近幾年，國(guó)外有人嘗試通過(guò)化學(xué)合成、酶解法來(lái)制備高純度的PI，但對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求嚴(yán)格，且常常造成所含脂肪酸或磷酸酯的不飽和鍵衰敗。目前，我國(guó)對(duì)高純度PI開(kāi)發(fā)利用的研究發(fā)展緩慢，一直停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，PI的工業(yè)化生產(chǎn)是研究的難點(diǎn)。
據(jù)目前已有提取方法制備的PI純度不高，常含有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)。溶劑萃取與柱層析技術(shù)相結(jié)合可以提高PI的純度，但溶劑耗量大，產(chǎn)品極少，得率很低，工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)受限，正因?yàn)槿绱?，最終得到的產(chǎn)物很昂貴。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)單、有效、可工業(yè)化生產(chǎn)的高純度磷脂酰肌醇(PI)的制備方法。
本發(fā)明的方法步驟如下1、將含磷脂原料與3～10倍體積的堿性乙醇混合，在室溫到50℃之間，最好在40℃以下，不斷攪拌抽提，去除混合磷脂原料中的PC、PE，得PI粗品；可以抽提一次，最好是分開(kāi)多次抽提。
向乙醇中添加堿性物質(zhì)以獲得堿性乙醇。乙醇可以是無(wú)水乙醇，也可以是含水乙醇，最好是含水5％重量百分比以下的乙醇，以避免磷脂結(jié)塊，使抽提、分離操作困難。
堿性物質(zhì)可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、碳酸鈉、醋酸鈉、醋酸鉀等，只要使抽提液變成堿性。堿性乙醇的pH為8.0～12.0，最好是9.0～11.0，堿性過(guò)高會(huì)增加設(shè)備的負(fù)擔(dān)，造成部分磷脂的水解。
2、將上述堿性乙醇抽提后得到的PI粗品溶于非極性溶劑，加入含堿性物質(zhì)的含水極性溶劑進(jìn)行液-液萃取，將PI萃取到含水極性溶劑中，得PI萃取液。
提取溫度在所使用的溶劑的沸點(diǎn)以內(nèi)，30～50℃為宜。
使用的含水極性溶劑，含水量為20～70％重量百分比，最好是40～60％重量百分比。含水極性溶劑中溶解的堿性物質(zhì)可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、醋酸鈉、醋酸鉀、氨水、碳酸銨等，水溶液只要能變成堿性即可，其濃度最好是原料1摩爾對(duì)1/2～4摩爾。另外，也可以用緩沖液，pH為7.5～12.0，最好是8.0～10.0之間。
3、向上述PI萃取液，按每100ml提取液10～30mg的比例，添加鈣、鎂、鐵、鋁等金屬的醋酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、有機(jī)酸鹽等金屬鹽，攪拌后，避光陰涼處?kù)o置，過(guò)濾或離心得沉淀，經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得高純度的PI。
本發(fā)明優(yōu)選使用粉狀大豆磷脂為原料，本方法也適合于含有PI的其他原料，動(dòng)物、植物、微生物和藻類混合磷脂，化學(xué)方法或發(fā)酵法得到的混合磷脂原料均可。這些原料可以直接使用，或用氯仿、甲苯、乙醚、丙酮、甲醇、異丙醇等有機(jī)試劑抽提濃縮，預(yù)處理后使用。
本發(fā)明利用溶劑酸堿性、極性對(duì)磷脂溶解性的影響，通過(guò)簡(jiǎn)單的溶劑萃取、金屬離子沉淀，可得到較高純度的PI，提供了一種簡(jiǎn)單、有效、可工業(yè)化生產(chǎn)的制備PI的方法。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1將10g粉狀大豆磷脂(PI含量為18％)，加入到40℃、五倍體積的堿性乙醇(無(wú)水乙醇∶氨水＝100∶3，V/V)抽提液中，攪拌浸提一小時(shí)，離心分離抽出液，將殘?jiān)c堿性乙醇混合，重復(fù)同樣的操作二次，不溶物在60℃真空干燥，得到粉末狀的磷脂酰肌醇粗品4.28g，其中含磷脂酰肌醇41.5％，磷脂酸39.4％。稱取1g該磷脂酰肌醇粗品，溶于60ml正己烷，充分溶解后與溶有0.325g無(wú)水醋酸鈉的55％含水乙醇100ml一同裝入分液漏斗，在室溫下振蕩1分鐘，靜置過(guò)夜。分離含水乙醇層，加入0.03g氯化鈣，攪拌15分鐘，在4℃狀態(tài)下靜置過(guò)夜。離心分離沉淀，真空干燥得到高純度磷脂酰肌醇0.18g，含磷脂酰肌醇為87.8％。
實(shí)施例2稱取DEAE-纖維素20g，懸浮于50ml 1N醋酸鈉(pH7.0)中，靜置過(guò)夜。過(guò)濾后加水緩慢攪拌、過(guò)濾，去除濾液，向纖維素中加入甲醇，慢慢攪拌，過(guò)濾后進(jìn)一步用氯仿-甲醇(1∶4，V/V)洗凈，完成纖維素的活化。重復(fù)實(shí)施例1中的操作得到高純度磷脂酰肌醇樣品，稱取1g加入到100ml含有活化后纖維素的氯仿-甲醇(1∶4，V/V)混合液中，在室溫下攪拌1小時(shí)，過(guò)濾，用200ml氯仿-甲醇(1∶4，V/V)混合液沖洗，然后再用400ml含0.1％醋酸鈉(W/V)的氯仿(1∶4，V/V)洗脫，收集洗脫液，30℃真空濃縮，加入10倍體積的丙酮，分離沉淀溶于少量的氯仿，加入五倍體積的30％酒精浸洗3次，至氯仿溶液上層無(wú)白色物質(zhì)后，再加入10倍體積的丙酮，離心后將沉淀冷凍干燥至恒重，可得到磷脂酰肌醇0.45g，磷脂酰肌醇含量為96.5％。
實(shí)施例3將10g粉狀大豆磷脂，加入到40℃、五倍體積的含0.01％NaOH的乙醇抽提液中，攪拌浸提一小時(shí)，離心分離抽出液，將殘?jiān)c堿性乙醇混合，重復(fù)同樣的操作二次，不溶物在60℃真空干燥，得到粉末狀的磷脂酰肌醇粗品4.46g，其中含磷脂酰肌醇37.5％，磷脂酸36.4％，磷脂酰乙醇胺1.7％，磷脂酰膽堿0.6％。稱取1g磷脂酰肌醇粗品，溶于60ml正己烷。充分溶解后與溶有0.325g無(wú)水醋酸鈉的55％的含水乙醇100ml一同裝入分液漏斗，在室溫下振蕩1分鐘，靜置過(guò)夜。分離含水乙醇層，加入0.026g氯化鈣，攪拌15分鐘，在4℃狀態(tài)下靜置過(guò)夜。離心分離沉淀，真空干燥得到高純度磷脂酰肌醇0.16g，含磷脂酰肌醇為80.6％。
實(shí)施例4將100g粉狀大豆磷脂，加入到40℃、三倍體積的無(wú)水乙醇抽提液中，攪拌浸提一小時(shí)，離心分離抽出液，殘?jiān)尤胍掖贾貜?fù)同樣的操作二次，得到不溶物66.7g，其中含磷脂酰肌醇29.7％，磷脂酸21.5％，磷脂酰乙醇胺18.3％，磷脂酰膽堿7.2％。將20g大豆磷脂乙醇不溶物，加入到40℃、五倍體積的堿性乙醇(無(wú)水乙醇∶氨水＝100∶3，V/V)抽提液中，攪拌浸洗一小時(shí)，離心分離抽出液，將殘?jiān)c堿性乙醇混合，重復(fù)同樣的操作二次，不溶物在60℃真空干燥，得到粉狀的磷脂酰肌醇粗品11.2g，其中含磷脂酰肌醇45.7％，磷脂酸39.9％，幾乎不含磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿。將上述磷脂酰肌醇粗品10g溶于600ml正己烷，用2升溶有6.5g醋酸鈉的55％含水乙醇，在連續(xù)逆向提取裝置中、40℃狀態(tài)下提取己烷相，得到含有磷脂酰肌醇的含水乙醇相，加入0.56g氯化鈣，攪拌15分鐘，在4℃狀態(tài)下靜置過(guò)夜，離心分離沉淀，真空干燥得到高純度磷脂酰肌醇3.5g，含磷脂酰肌醇為88.3％。
權(quán)利要求
1.一種高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)將混合磷脂原料與3～10倍體積的堿性乙醇混合，在室溫到50℃之間，不斷攪拌抽提，去除混合磷脂原料中的PC、PE，得PI粗品；(2)將上述堿性乙醇抽提后得到的PI粗品溶于非極性溶劑，加入含堿性物質(zhì)的含水極性溶劑進(jìn)行液—液萃取，將PI萃取到含水極性溶劑中，得PI萃取液，提取溫度在所使用的溶劑的沸點(diǎn)以內(nèi)；(3)向上述PI萃取液，按每100ml提取液10～30mg的比例，添加鈣、鎂、鐵、鋁的醋酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽或有機(jī)酸鹽，攪拌后，避光陰涼處?kù)o置，過(guò)濾或離心得沉淀，經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得更高純度的PI。
2.如權(quán)利要求1所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，向乙醇中添加堿性物質(zhì)以獲得堿性乙醇，乙醇可以是無(wú)水乙醇或含水5％重量百分比以下的乙醇。
3.如權(quán)利要求2所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，堿性乙醇的pH為8.0～12.0，優(yōu)選9.0～11.0。
4.如權(quán)利要求2所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，向乙醇中添加的堿性物質(zhì)可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、碳酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉀。
5.如權(quán)利要求1所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，使用的含水極性溶劑，含水量為20～70％，優(yōu)選40～60％。
6.如權(quán)利要求1所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，使用的含水極性溶劑中溶解的堿性物質(zhì)可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、醋酸鈉、醋酸鉀、氨水或碳酸銨，其濃度是原料1摩爾比1/2～4摩爾。
7.如權(quán)利要求1所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，使用粉狀大豆磷脂為原料，或者含有PI的動(dòng)物、植物、微生物和藻類混合磷脂，或者化學(xué)方法或發(fā)酵法得到的混合磷脂原料。
8.如權(quán)利要求5所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，所述原料可以直接使用，或用氯仿、甲苯、乙醚、丙酮、甲醇、異丙醇等有機(jī)試劑抽提濃縮，預(yù)處理后使用。
9.如權(quán)利要求5所述的高純度磷脂酰肌醇的制備方法，其特征在于，所述原料為乳狀磷脂或油腳，經(jīng)過(guò)丙酮提取，乳狀磷脂或油腳∶丙酮＝1∶18～30(V/V)，1400轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘，經(jīng)真空干燥，40～50℃，真空度0.07～0.09，制得粉狀磷脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高純度磷脂酰肌醇(PI)的制備方法。PE的溶解度在堿性乙醇中明顯高于乙醇，使用堿性乙醇抽提，可有效地從大豆磷脂中去除磷脂酰膽堿(PC)和PE，將得到的PI粗品溶于非極性溶劑中，加入含堿性物質(zhì)的含水極性溶劑進(jìn)行液－液萃取，將PI萃取到含水極性溶劑中，再加入金屬鹽純化，可得高純度PI。
文檔編號(hào)C07F9/117GK1560057SQ20041002372
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者劉代成, 安立國(guó), 陶務(wù)端, 朱令仁 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)