專利名稱：光可切除的磁粒子分子標簽、其制備方法及在多肽合成制備中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種光可切除的磁粒子分子標簽及其制備方法和用途，特別涉及一種光化學敏感可光切除的磁粒子分子標簽、其制備方法及其在多肽規(guī)?；铣珊图兓苽渲械膽?。
背景技術：
自從二十世紀四十年代科學家發(fā)明固相多肽方法以來，人們用9-芴基甲氧羰基(Fmoc-)或叔丁氧羰基(Boc-)已經合成了成千上萬條各種序列的多肽，許多多肽類新藥品都是通過此類方法合成制備而來。隨著現代生物技術及分子生物學、蛋白組計劃的快速發(fā)展，科學家和各類生物醫(yī)藥研發(fā)機構對多肽這類在生物體系中存在重要生理活性的物質開始非常關注，越來越多的科學家開始研究多肽，希望在多肽中篩選得到有活性并且價格便宜的新藥品，這些因素促使多肽合成和純化制備領域快速發(fā)展，從最初的手工合成，到現在使用多肽合成儀全自動化合成，從液相合成到固相合成，Fmoc/Boc高通量合成等，新的合成方法層出不窮。
人們在研究開發(fā)中發(fā)現，對于多肽合成和純化制備一體化考慮，快速、精確、低成本的把目的全長多肽序列合成并制備得到高純度的藥品或試劑仍然存在很大的困難，主要因為(1)在用固相多肽合成中，不可避免的會遇到許多由于空間障礙造成連接的不完全；(2)不合格的催化劑或不純試劑也會造成截短序列。這些因素使得每一步連接循環(huán)都不可能保證100％的連接率，于是就產生少量的截短序列，如果不進行處理，則交錯的連接下去，對下游純化造成很大困難。
一般情況下，用過量的乙酰酐封閉肽鏈N末端未反應的氨基，阻止錯位鏈的繼續(xù)組裝，這樣處理可以解決純化問題，但隨著計劃合成多肽序列的增長，干擾序列由于只差一個或幾個氨基酸殘基，后續(xù)分離行為即使用現在經典的反相高壓色譜梯度(RP-HPLC)分離，也難于完全分離，更難于大量的高效制備。
這樣就要求把整個多肽合成和制備純化過程，特別是長的肽序列作為一個整體進行系統(tǒng)優(yōu)化，設計出一種更高效的合成和分離方法去解決上述問題?？茖W家發(fā)現除了在合成中使用“加帽”的方式優(yōu)化合成以外，在肽一樹脂的最后一個氨基酸N端衍生一個可以切割下來的化學敏感性的分子標簽，9-芴基甲氧羰基(fmoc--)，親脂性-(lipophilic)或生物素(biotinylated)，可以大大改善多肽特別是長肽合成和純化制備的HPLC行為，通過2次RP-HPLC分離純化，使整個多肽純化制備可以比常規(guī)使用的方式簡單、快速、高效的多(Weng C.Chen et aI，Fmocsolid phase peptide synthesis，A Practical Approach，Oxford university press，2000，266-276)。
該技術使用化學敏感性的分子標簽，在純化操作中給體系中引入了雜質分子，無論截短加帽序列或者目標全長肽或引入的分子標簽，都需要通過不斷給HPLC進樣而得到有效純化，并且需要二次純化，由于使用梯度洗脫，耗時并耗費大量昂貴試劑(如乙氰)。
有鑒于此，發(fā)明人考慮到以下兩點(1)磁性粒子可以通過外加磁場富集、沉析和聚集；(2)光敏感的可切除分子連接替代化學敏感的分子連接不給系統(tǒng)引入新的雜質(易于分離)。光可切割的分子連接在多肽合成中作為間接應用分子，與樹脂載體連接，作為安全捕獲連接已經有很多報道(Cano，et all，J.Org.chem，2002，67，129-135)，也有光可切除連接(linker)做為骨架分子與其他載體材料連接，如與AMPS樹脂、CPG玻璃珠等連接(美國BiosearchTechnologies Inc.產品)，具體連接實例見文獻報道(D.H.Rich and S.K.Gurwara，J.Am.Chem.Soc.，1975，97，1575；H.venkatesan and M.M.Greengurg，ibid.，1996，61，525；C.P.Homes and D.G..Jones ibid.，1995，60，2318；M.R.Carrasco，et al.TetrahedronLett.1997，38，6331.)，但沒有發(fā)現此類骨架分子與磁粒子連接用于多肽標記的報道。將二者結合，發(fā)明人得到了一種新的光可切除的磁粒子分子標簽、其制備方法及其在多肽規(guī)?；铣芍苽渲械膽茫芎玫目朔松鲜霾蛔?。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供了一種磁粒子分子標簽，使用磁性粒子，在其上連接光敏感性的分子基團，把其作為新型的分子標簽。
本發(fā)明的另一目的是提供制備上述磁粒子分子標簽的合成方法。
本發(fā)明的再一目的是使用該分子標簽對常規(guī)的固相多肽合成全長目標肽鏈進行衍生標記、切割，通過外部磁力介導分離，光切除分子標簽并最終分離，得到目標全長高純多肽。
一種光可切除的磁粒子分子標簽，在磁粒子的表面連接有對光敏感的活性分子，磁粒子可以是順磁性的粒子，如Fe3O4，其粒徑為1-1.5μm。光敏感分子連接骨架分子選擇Biosearch Technologies Inc.公司的名為Photolabile--Nu-Linker的產品，通過化學方法將光敏感分子與磁粒子連接得到磁粒子分子標簽，得到的磁粒子分子標簽表面含有活性基團，如氨基。該磁粒子分子標簽對酸，如三氟乙酸(TFA)穩(wěn)定，對近紫外線，特別是365nm的光照敏感。
一種光可切除的磁粒子分子標簽的制備方法，依次包括如下步驟(1)將光可切除連接分子用無水1-羥基苯并三氮唑和二異丙基乙二胺，在N，N-二甲基甲酰胺溶液中活化；(2)加入表面包覆有氨基的磁粒子，避光反應；(3)分離、洗滌、干燥得磁粒子分子標簽。
下面結合附圖進一步詳細敘述本發(fā)明的磁粒子分子標簽。


圖1是磁粒子結構示意圖；圖2是光可切除分子修飾磁粒子獲得得分子標簽復合物的結構示意圖；圖3是肽樹脂結構示意圖；圖4分子標簽組合物與肽樹脂結合原理圖；磁粒子及其選擇。本發(fā)明使用的功能磁性粒子內部是一個具有順磁性的磁核，組成材料是Fe3O4，在外部磁場的作用下能夠定向移動，撤掉磁場，則可分散開來，磁核外部包覆一層高分子材料，表面分布著許多活性基團，例如氨基(圖1所示)，可以和其它活性分子相連接，可以吸附、富集其他蛋白、抗原、抗體、酶、細胞和核酸等，該功能磁?？梢詮牡聡捞炷莨净蜃筒┖掌澤锕旧藤彽玫?。
光可切除連接分子及選擇。發(fā)明人選擇Biosearch Technologies Inc.公司的產品名稱為Photolabile--Nu-Linker，結構如下所示的連接骨架分子。
光可切除分子修飾磁粒子分子標簽復合物的制備。圖2為光可切除分子修飾磁粒子獲得得分子標簽復合物的結構示意圖，M代表磁粒子，其與光可切除連接之間用對酸穩(wěn)定的酰氨鍵連接(如下結構圖所示)，在磁粒的外周包覆好NH2基團后(替代度d＝1mmol/mg)，與光可切割分子在HOBT(1-羥基苯并三氮唑)，DIEA(二異丙基乙二胺)過量情況下，DMF溶液中反應2.5小時制備，反應完畢，用磁鐵吸附沉析出反應連接好的分子標簽，用分別用DMF，二氯甲烷，甲醇洗并沉析各3次，減壓干燥備用。
肽-樹脂合成和末端標記。圖3為肽樹脂結構示意圖，肽樹脂合成按標準肽合成程序進行，在每一個氨基酸連接完成，進行末端加帽封閉，最后一個氨基酸連接完畢，末端脫保護，對于加帽封閉了末端的截短肽不能和分子標簽綴合物結合。
圖4為分子標簽組合物與肽樹脂結合原理圖。合成樹脂與多肽序列之間的連接對酸不穩(wěn)定，磁性粒子與光可切割分子之間的連接位置對酸穩(wěn)定，光可切割分子與多肽序列之間的連接是光切割點，對365nm光不穩(wěn)定，可切除。
通過上述方法得到的磁粒子分子標簽可用于多肽固相合成和純化制備，并且分子標簽可以通過濃縮洗滌而重復利用，其具體工藝方法及操作過程如下(1)用固相合成方法在樹脂上合成多肽鏈，采用經典的Fmoc或Boc方法連接第一個氨基酸。
(2)在合成循環(huán)中每個氨基酸連接完畢，采用乙酸酐或者2-氯-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯[Z(2-CI)-Osu]試劑加帽封閉未反應完全的N端氨基，使截短序列不能繼續(xù)組裝合成，為以后純化制備創(chuàng)造條件，保證全長序列的純化方便。
(3)在多肽序列組裝合成到末端最后一個氨基酸完成后，加帽完畢，脫保護，游離出NH2基團，用DCM(二氯甲烷)洗滌。
(4)用HBTU(o-Benzotriazole-N，N，N’，N’-tetramethyl-uranium-hexafluorophosphate，六氟磷酸鄰-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基鈾，)、HOBT、DIEA 2-5倍過量情況下，在N，N-二甲基甲酰胺溶液或N，N-二甲基甲酰胺與二氯甲烷體積比1∶1溶液中活化分子標簽，避光加入準備好的肽-樹脂反應器中，N2氣攪動下避光反應2-3小時，用異丙醇、二氯甲烷、DMF、甲醇洗滌，真空干燥樹脂混合物。
(5)把上述分子標簽-肽-樹脂混合物用標準多肽切割混合物從樹脂上切割下來，切割液離心，取未沉淀的液體，加入冷乙醚析出，用乙醚洗滌，結合外部磁力吸附導引沉淀。
(6)放置得到的聚集沉析物，使殘留乙醚揮發(fā)完全。
(7)加入雙蒸水，充分溶解分子標簽-肽，使?jié)舛冉咏?mg/ml。
(8)將分子標簽-肽溶液用近紫外線(365nm)照射2.5-5小時，使分子標簽與目標全長肽完全解離。
(9)用磁鐵吸附干凈磁粒與光可切除的連接物沉析聚集，收集上清液。
(10)凍干上清液得到目標全長高純多肽，取部分進行HPLC分析和MS檢測。
把磁性粒子作為新型分子標簽，對常規(guī)的固相多肽合成全長目標肽鏈進行衍生標記、切割，通過外部磁力介導分離，光切除分子標簽和最終分離，得到目標全長高純多肽。本發(fā)明所采用的新型標簽分子及其介導的固相多肽合成和純化制備工藝，在分子標簽從樹脂上切割下來沉析洗滌的過程中就可以把大量截端加帽封閉的干擾序列清除掉，將目標產品進行了純化。本發(fā)明所述的方法解決了目前該領域中困擾人們的關于高效合成和得到高純級生物活性多肽投入巨大、效率差、困難度大等問題。本發(fā)明可以簡單、快速的精確合成目的全長多肽，具有低成本，高效率，節(jié)省儀器和試劑投入，可以大規(guī)模制備的優(yōu)點。因而本發(fā)明彌補了目前高效低成本快速合成和純化制備高純度多肽的工藝方法缺陷和不足。
具體實施例方式
下面的實施例是結合上述發(fā)明內容對本發(fā)明做進一步的解釋，這些實施例不是對本發(fā)明做的任何范圍的限制，本領域的技術人員在權利要求的范圍內所進行的某些改變和調整也認為屬于對本發(fā)明的范疇。
實施例1磁粒子分子標簽的合成稱取1克Fe3O4磁粒，磁粒外周已經包覆好NH2末端，末端NH2摩爾數為1mmol/g，稱取2mmol的光可切除連接分子4-Hydroxymethyl-2-methoxy-5-nitrophenoxybutyri Acid(4-羥甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧化丁酸)，用無水HOBT，DIEA，4倍摩爾數過量情況下，在5ml DMF溶液體系中，活化光可切除分子，把活化5-8分鐘的液體加入磁粒子中，避光反應2.5小時，反應完畢，用磁鐵吸附沉析出反應連接好的分子標簽，分別用DMF、DCM、甲醇洗滌并沉析各3次，減壓干燥備用，得1.32克連接好的磁粒子分子標簽。
實施例2合成制備0.5mmol P23肽合成制備序列為SKYTESFVAAFKRAGAGVEKAEA-NH2，序列長度為23個氨基酸的多肽。
稱取0.5克替代度為d＝1mmol/g的王樹脂，加入多肽反應器，用標準Fmoc偶連方式組裝合成多肽，在每一步氨基酸連接完畢用過量乙酸酐按乙酸酐∶DMF＝1∶1(V/V)，4-6mL封閉未反應的NH2末端，阻止截端序列的繼續(xù)組裝合成，在最后一個氨基酸合成完畢切除末端NH2的保護。
洗干凈，使肽-樹脂保持濕潤，稱取2.5克實施例1制備的磁粒子分子標簽，在5ml DMF中用HOBT、PyBOP(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，六氟磷酸-1-氧基三吡咯烷基瞵-苯并三唑)、DIEA 4倍摩爾量作為催化劑活化分子標簽，活化5-8分鐘，加入肽-樹脂中避光反應2.5小時，用標準肽合成洗脫程序洗脫干凈樹脂，樹脂干燥后，用標準多肽TFA切割混合物[(9.5ml三氟乙酸(TFA)0.4ml苯甲硫醚(thioanisole)0.4ml 1，2-二巰基乙醇(EDT)0.2ml苯甲醚(anisole)]避光2.5小時，切割混合物在4000rpm離心棄掉樹脂，把上層得到的液體用200ml冷乙醚，在外加磁場下沉析、吸附和聚集，繼續(xù)用冷乙醚洗分子標簽—肽3-6次，截短末端加帽肽不能被分子標簽綴合物標定，被洗棄去掉，把聚集沉析下來的聚集物，室溫下30分鐘放置，揮發(fā)掉乙醚，加水溶解到純肽含量到1mg/ml左右，用紫外燈，最好365nm紫外光照射2.5-3小時進行光切割，產生純凈肽和分子標簽。外加磁場去除磁?！饪汕谐肿訕撕灳Y合物，清液中含有純凈全長目標肽，凍干純凈肽得232mg，進行HPLC純度分析，為96％，MS分子量確證(理論單元子分子量MW＝2416.24，實際測試為2417.52)。
實施例3 合成制備1mmol P38肽合成制備序列為HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRIKNK-NH2的序列長度為38個氨基酸的多肽稱取0.5克替代度為d＝0.3-0.8mmol/g的Rink Amide-AM樹脂加入多肽反應器，用標準Fmoc偶連方式組裝合成多肽，在每一步氨基酸連接完畢用過量乙酸酐按乙酸酐∶DMF＝1∶1(V/V)，4-6mL封閉未反應的NH2末端，阻止截端序列的繼續(xù)組裝合成，在最后一個氨基酸合成完畢切除末端NH2的保護，洗干凈，使肽-樹脂保持濕潤，稱取2.5克實施例1制備的磁粒子分子標簽，在5ml DMF中用HOBT、PyBOP、DIEA 4倍摩爾量作為催化劑活化分子標簽，活化5-8分鐘，加入肽-樹脂中避光反應2.5小時，用標準肽合成洗脫程序洗脫干凈樹脂，樹脂干燥后，用標準多肽TFA切割混合物避光2.5小時，切割下的混合物在4000rpm離心棄掉樹脂，把上層得到的液體用200ml冷乙醚，在外加磁場下的沉析，吸附和聚集，繼續(xù)用冷乙醚洗-分子標簽—肽3-6次，截短末端加帽肽不能被分子標簽綴合物標定，被洗棄去掉，把聚集沉析下來的聚集物，室溫下30分鐘放置，揮發(fā)掉乙醚，加水溶解到純肽含量到1mg/ml左右，用紫外燈最好365nm紫外光照射2.5-3小時進行光切割，產生純凈肽和分子標簽，外加磁場去除磁?！饪汕谐肿訕撕灳Y合物，清液中含有純凈全長目標肽，凍干純凈肽得580mg，進行HPLC純度分析為92％，MS分子量確證(理論單原子分子量MW＝4548.4，實際測試為4549.95)。
實施例4合成制備20mmol P12肽規(guī)模合成制備序列為TPQAYPLREAGS-NH2的序列長度為12個氨基酸的多肽。
稱取20克替代度為d＝0.3-0.8mmol/g的王樹脂加入多肽反應器，用標準Fmoc偶連方式組裝合成多肽，在每一步氨基酸連接完畢用過量乙酸酐按乙酸酐∶DMF＝1∶1(V/V)，40-60mL封閉未反應的NH2末端，阻止截端序列的繼續(xù)組裝合成，在最后一個氨基酸合成完畢切除末端NH2的保護，洗干凈，使肽-樹脂保持濕潤，稱取50克磁性分子標簽，在100mlDMF中用HOBT、PyBOP、DIEA 4倍摩爾量作為催化劑活化分子標簽，活化5-8分鐘，加入肽-樹脂中避光反應2.5小時，用標準肽合成洗脫程序洗脫干凈樹脂，樹脂干燥后，用標準多肽TFA切割混合物[190ml三氟乙酸(TFA)8ml苯甲硫醚(thioanisole)8ml 1，2-二巰基乙醇(EDT)4ml苯甲醚(anisole)]避光2.5小時，切割下的混合物在4000rpm離心棄掉樹脂，把上層得到的液體用4000ml冷乙醚，在外加磁場下的沉析，吸附和聚集，繼續(xù)用冷乙醚洗分子標簽—肽3-6次，截短末端加帽肽不能被分子標簽綴合物標定，被洗棄去掉，把聚集沉析下來的聚集物，室溫下30分鐘放置，揮發(fā)掉乙醚，加水溶解到純肽含量到1mg/ml左右，用紫外燈最好365nm紫外光照射5小時進行光切割，產生純凈肽和分子標簽。外加磁場去除磁粒—光可切除分子標簽綴合物，清液中含有純凈全長目標肽。凍干純凈肽得14.65g，進行HPLC純度分析為96.3％，MS分子量確證(理論單原子分子量MW＝1288.64，實際測試為1288.75)。
權利要求
1.一種光可切除的磁粒子分子標簽，其特征在于在磁粒子的表面連接有對光敏感的活性分子。
2.根據權利要求1所述的磁粒子分子標簽，其特征在于磁粒子是順磁性的粒子，其表面含有游離氨基。
3.根據權利要求1所述的磁粒子分子標簽，其特征在于磁粒子組成材料為Fe3O4。
4.根據權利要求1所述的磁粒子分子標簽，其特征在于磁粒子的粒徑為1-1.5μm。
5.根據權利要求1所述的磁粒子分子標簽，其特征在于光敏感的活性分子對近紫外線光照敏感。
6.根據權利要求5所述的磁粒子分子標簽，其特征在于光敏感的活性分子結構為
7.根據權利要求1-6任意之一所述的磁粒子分子標簽可以通過外加磁場聚集、沉淀。
8.一種制備權利要求1所述的磁粒子分子標簽的方法，依次包括如下步驟(1)將光可切除連接分子用無水1-羥基苯并三氮唑和二異丙基乙二胺，在N，N-二甲基甲酰胺溶液中活化；(2)加入表面包覆有氨基的磁性粒子，避光反應；(3)分離、洗滌、干燥得磁粒子分子標簽。
9.權利要求1所述的磁粒子分子標簽在多肽合成制備方面的應用。
10.權利要求9所述的磁粒子分子標簽用于多肽固相合成和純化制備，其工藝方法如下(1)用固相合成方法在樹脂上合成多肽鏈，采用經典的Fmoc或Boc方法連接第一個氨基酸。(2)在合成循環(huán)中每個氨基酸連接完畢，采用乙酸酐或者2-氯-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯試劑加帽封閉未反應完全的N端氨基，使截短序列不能繼續(xù)組裝合成，為以后純化制備創(chuàng)造條件，保證全長序列的純化方便。(3)在多肽序列組裝合成到末端最后一個氨基酸完成后，加帽完畢，脫保護，游離出NH2基團，用二氯甲烷洗滌。(4)用六氟磷酸鄰-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基鈾、1-羥基苯并三氮唑、二異丙基乙二胺2-5倍過量情況下，在N，N-二甲基甲酰胺溶液或N，N-二甲基甲酰胺與二氯甲烷體積比1∶1溶液中活化分子標簽，避光加入準備好的肽-樹脂反應器中，N2氣攪動下避光反應2-3小時，用異丙醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇洗滌，真空干燥樹脂混合物。(5)把上述分子標簽-肽-樹脂混合物用標準多肽切割混合物從樹脂上切割下來，切割液離心，取未沉淀的液體，加入冷乙醚析出，用乙醚洗滌，結合外部磁力吸附導引沉淀。(6)放置得到的聚集沉析物，使殘留乙醚揮發(fā)完全。(7)加入雙蒸水，充分溶解分子標簽-肽，使?jié)舛冉咏?mg/ml。(8)將分子標簽-肽溶液用近紫外線照射2.5-5小時。(9)用磁鐵吸附干凈磁粒與光可切除的連接物沉析聚集，收集上清液。(10)凍干上清液得到目標全長高純多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁粒子分子標簽、其制備方法及在多肽合成制備中的應用。在磁粒子上連接光敏感性的分子基團，將其作為新型的分子標簽，對常規(guī)固相多肽合成全長目標肽鏈進行衍生標記、切割，通過外部磁力介導分離，光切除分子標簽并最終分離，得到目標全長高純多肽。本發(fā)明的新型分子標簽可用于固相多肽合成和純化制備中，能簡單、快速、精確合成目的全長多肽，具有低成本，高效率，節(jié)省儀器和試劑投入，并可大規(guī)模制備的優(yōu)點。
文檔編號C07K1/13GK1597692SQ200410026338
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月19日 優(yōu)先權日2004年7月19日
發(fā)明者王亞宏 申請人:西安藍晶生物科技有限公司