專利名稱：高免疫活CpG－S ODN和拮抗CpG－S ODN作用的CpG－N ODN的基因序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寡核苷酸及其在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用，具體地說，涉及一種免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)及對其有拮抗作用的寡核苷酸(CpG-N ODN)。
背景技術(shù)：
含有未甲基化CpG的寡核苷酸片段是細(xì)菌DNA的最小作用單位，因此具有免疫刺激作用的含未甲基化CpG的寡核苷酸被稱作免疫刺激寡核苷酸(Immnostimulatory oligonucleotides，CpG-S ODN)。其結(jié)構(gòu)特征為含有CpG基元即6個堿基互補回文結(jié)構(gòu)的六聚體，該六聚體中必須至少含有一個CpG二核苷酸，CpG的5’端必須有一個嘌呤，結(jié)構(gòu)類似ApA，GpA或GpT等，3’端必須有二個嘧啶如TpT，目前已知具有免疫刺激作用的六聚體包括AACGTT，AGCGCT等。
CpG-S ODN具有兩方面的作用小劑量CpG-S ODN對小鼠免疫細(xì)胞具有廣泛的免疫活性，大劑量則可誘導(dǎo)全身性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)和膿毒癥的發(fā)生。
大量研究表明①小劑量CpG-S ODN能夠直接或間接激活樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)；誘導(dǎo)IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子釋放。因此，單獨使用即可有效抑制小鼠腫瘤生長、促進腫瘤消退，并可形成保護性免疫記憶，從而能夠有效防止腫瘤復(fù)發(fā)。除此之外，由于CpG ODN是一種優(yōu)良的Th1型疫苗佐劑，因此也可與腫瘤疫苗配伍治療惡性腫瘤，在腫瘤預(yù)防與治療方面具有良好的應(yīng)用前景。由于目前尚缺乏對人免疫細(xì)胞具有高免疫活性的CpG-S ODN，因此需要尋找高免疫活性的CpG-S ODN對腫瘤預(yù)防與治療具有重要意義。②CpG-S ODN誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子釋放而抑制Th2型類免疫應(yīng)答，所以可用來治療Th2型類免疫應(yīng)答介導(dǎo)的過敏性疾病如哮喘。③CpG-S ODN能活化樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等細(xì)胞，因此治療細(xì)菌或病毒等病原體引起的感染性疾病、免疫功能低下性疾病。
由于CpG-S ODN廣泛存在于細(xì)菌DNA中，當(dāng)細(xì)菌感染發(fā)生時，細(xì)菌大量繁殖可以導(dǎo)致CpG-S ODN大量復(fù)制。過量的CpG-S ODN通過激活單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)大量釋放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等多種細(xì)胞因子引起SIRS和膿毒癥的發(fā)生，其病死率高達50-80％，至今尚無有效的治療手段。有文獻報告細(xì)菌基因組DNA中含有未甲基化的CpG基元不一定具有免疫刺激作用，甚至具有阻斷或中和CpG-SODN作用，此類寡核苷酸被稱為CpG-N ODN(CpG-neutralizing oligonucleotides，CpG-N ODN)，因此研究對CpG-S ODN具有拮抗作用的CpG-N ODN對SIRS和膿毒癥的治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種免疫刺激寡核苷酸，其具有高免疫活性，可形成保護性免疫記憶，能抑制Th2型類免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸在預(yù)防和治療感染性疾病、過敏性疾病、免疫缺陷性疾病和腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸(CpG-NODN)，具有阻斷或中和CpG-S ODN的作用。
本發(fā)明的還一目的在于提供一種對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸在用于制備治療SIRS和膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，一種免疫刺激寡核苷酸，具有如下基因序列GGC GGC GGC GCG；CGC GGC GCC GGG；GGC GGC GGC GGA；CCG CGC GCG GGC；TGG CGC GGG GCG；GCC GGC GCC CGG；GCG CGC GCG GTA；CCA GGC GGC GGG；GGC CGC GGG GGT；CAG CCC GGG GGA；GCT CCC GGG CTT；GCG CTC GGG CTT；CCG CCC GCG CCT；或GCA CCC GCG CGC其中的一種。
其中，優(yōu)選的基因序列GGC GGC GGC GCG；CCG CGC GCG GGC；TGG CGC GGG GCG；GCC GGC GCC CGG；GGC CGC GGG GGT；CAG CCC GGG GGA；
GCT CCC GGG CTT；GCG CTC GGG CTT；或CCG CCC GCG CCT其中的一種。
本發(fā)明所述的一種高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸具有高免疫活性，可形成保護性免疫記憶，能抑制Th2型類免疫應(yīng)答，其用于制備治療感染性疾病、過敏性疾病、免疫缺陷性疾病和腫瘤藥物中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)另一發(fā)明目的，一種對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸，具有如下基因序列GGC CGC GGG GAC；GCC GCC GCC GCC；CGC CTC GGG GAG；TGC CGC GGC AGA；CTC CAC GTG CCG；GCC GCC GCC GTC；或GCT GCC GCC GCC其中的一種。
其優(yōu)選的基因序列CGC CTC GGG GAG；TGC CGC GGC AGA；CTC CAC GTG CCG；GCC GCC GCC GTC；或GCT GCC GCC GCC其中的一種。
本發(fā)明所述的一種對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸具有阻斷或中和CpG-S ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力，其在用于制備治療SIRS和膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
為了得到高活性的CpG-S ODN和CpG-N ODN，本發(fā)明的研究人員從病毒的基因組入手進行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解所有小病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組DNA存在眾多的未甲基化CpG二核苷酸，其中許多具有CpG-S ODN結(jié)構(gòu)特征。因此理論上推測其應(yīng)具有很強的免疫刺激作用。但事實恰恰相反，病毒DNA不僅可逃脫機體免疫系統(tǒng)對其的免疫識別和清除，而且可在宿主細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制，這種能力在逆轉(zhuǎn)錄病毒中表現(xiàn)得更為顯著。因此病毒DNA中應(yīng)存在阻斷或中和CpG-S ODN作用的寡核苷酸序列，但并不知道其結(jié)構(gòu)特征是什么？有關(guān)腺病毒DNA(Adenoviral DNA，Adv DNA)的研究給予了研究人員非常有益的啟示。盡管血清型2、5Adv DNA(亞屬C)和血清型12Adv DNA(亞屬A)中均含有數(shù)量相當(dāng)?shù)奈醇谆疌pG二核苷酸，因此推測它們均應(yīng)具有相同的免疫刺激作用。但是Krieg等的實驗結(jié)果顯示血清型12Adv DNA具有很強的免疫刺激作用，而血清型2、5Adv DNA則不僅無免疫刺激作用，而且具有阻斷CpG-S ODN誘導(dǎo)TNF-α、IL-6分泌的作用。本發(fā)明的研究人員也重復(fù)了該實驗，結(jié)果與Krieg的一致。該結(jié)果說明(1)血清型12Adv DNA中存在CpG-S ODN，血清型2、5Adv DNA中存在具有阻斷或中和EC DNA或CpG-S ODN作用的寡核苷酸序列；(2)血清型12Adv DNA中CpG二核苷酸參與CpG基元的組成并發(fā)揮免疫刺激作用；(3)血清型2、5Adv DNA中CpG二核苷酸可能未完全參與CpG-S ODN的組成而發(fā)揮免疫刺激作用，因為對血清型2、5Adv DNA序列分析表明，參與CpG基元組成的CpG只占CpG總數(shù)量的1/15-30，提示這些CpG基元的作用可能被其它具有中和作用的寡核苷酸所抑制。
根據(jù)以上分析，本發(fā)明的研究人員推測血清型12Adv DNA含有具有很強免疫刺激作用的CpG-S ODN，而血清型2、5Adv DNA中存在天然的具有阻斷或中和CpG-S ODN的CpG-N ODN，CpG-N ODN的序列特征可能與CpG兩端寡核苷酸序列特點改變有關(guān)。
因此，本發(fā)明的研究人員采用生物信息學(xué)技術(shù)，以CpG二核苷酸為“電子探針”(CpG二核苷酸為檢索“標(biāo)簽”)，以CpG-S ODN中的六聚體為比較模板，對血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA進行序列分析，尋找血清型2、5Adv DNA中具有共同結(jié)構(gòu)特征的12個堿基的寡核苷酸序列；并通過體外生物活性的篩選后，得到具有阻斷或中和CpG-S ODN作用的寡核苷酸(CpG-N ODN)；觀察CpG-NODN對細(xì)菌DNA介導(dǎo)SIRS動物模型小鼠的保護作用，明確CpG-N ODN在SIRS防治中的作用。
本發(fā)明的研究人員從PubMed上的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲取了血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA序列(ACCESSIONNC 001405、M73260、NC 001460、NC 000913)。
采用生物信息學(xué)技術(shù)，使用Primer Premier 5、BioEdit version 5.0.6等生物軟件，對血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA中256種含CpG的六核苷酸序列進行了分析和比較，確定了血清型2、5Adv DNA中特有的19種含CpG的六核苷酸序列；使用BioEdit version 5.0.6，查找出血清型2、5Adv DNA中以這19種CpG六核苷酸為核心的12堿基寡核苷酸(ODN)；使用生物軟件RNAstructure version 3.71，對12堿基ODN的二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，找出了4種可能的共同結(jié)構(gòu)特征(1)c-g位于干環(huán)頂端；(2)g-c位于干環(huán)頂端；(3)c-g或g-c位于干環(huán)側(cè)面；(4)無干環(huán)結(jié)構(gòu)(見圖1)，從而完成了對CpG-N ODN分子的初設(shè)計。
根據(jù)此設(shè)計合成了10條磷酸硫代骨架的ODN，其中c-g位于干環(huán)頂端的3條(ODN1-3)、g-c位于干環(huán)頂端的3條(ODN 4-6)、c-g或g-c位于干環(huán)側(cè)面的2條(ODN7-8)、無干環(huán)結(jié)構(gòu)形成的2條(ODN9-10)。本發(fā)明的研究人員對10條ODN的體外生物學(xué)活性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)2條無明顯刺激性的ODN，8條ODN具有誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力，即8條ODN為免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)。
使用生物軟件RNAstructure version 3.71，對ODN的二級結(jié)構(gòu)自由能進行了分析，在此基礎(chǔ)上，對10條ODN的刺激性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進行了分析并發(fā)現(xiàn)，ODN的生物活性可能與預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的4種共同結(jié)構(gòu)特征無關(guān)；而可能與預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的自由能高低密切相關(guān)。因此，使用生物軟件RNAstructure version 3.71對CpG-NODN分子進行了再設(shè)計。根據(jù)此設(shè)計合成了11條磷酸硫代骨架的ODN，本發(fā)明的研究人員對11條ODN的體外生物學(xué)活性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)5條無明顯刺激性的ODN，6條ODN為免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)。
本發(fā)明的研究人員在兩次篩選實驗中共獲得14條免疫刺激寡核苷酸(CpG-SODN)，其基因序列為GGC GGC GGC GCG；CGC GGC GCC GGG；GGC GGC GGCGGA；CCG CGC GCG GGC；TGG CGC GGG GCG；GCC GGC GCC CGG；GCG CGCGCG GTA；CCA GGC GGC GGG；GGC CGC GGG GGT；CAG CCC GGG GGA；GCT CCC GGG CTT；GCG CTC GGG CTT；CCG CCC GCG CCT；或GCA CCC GCGCGC其中的一種；其中優(yōu)選的為GGC GGC GGC GCG；CCG CGC GCG GGC；TGG CGC GGG GCG；GCC GGC GCC CGG；GGC CGC GGG GGT；CAG CCC GGGGGA；GCT CCC GGG CTT；GCG CTC GGG CTT；或CCG CCC GCG CCT其中的一種。
同時本發(fā)明的研究人員對7條無明顯刺激性的ODN抑制CpG-S ODN的活性進行鑒定，表明該7條ODN均有抑制CpG-S ODN誘導(dǎo)的hPBMC釋放TNF-α的能力，即7條ODN為對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸(CpG-N ODN)，其基因序列為GGC CGC GGG GAC；GCC GCC GCC GCC；CGC CTC GGG GAG；TGCCGC GGC AGA；CTC CAC GTG CCG；GCC GCC GCC GTC；或GCT GCC GCCGCC其中的一種；優(yōu)選的為CGC CTC GGG GAG；TGC CGC GGC AGA；CTC CACGTG CCG；GCC GCC GCC GTC；或GCT GCC GCC GCC其中的一種。
本發(fā)明所述的免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)及對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸(CpG-N ODN)可采用本領(lǐng)域常用合成方法合成，比如固相亞磷酰胺三酯法。
本發(fā)明的研究人員經(jīng)過對本發(fā)明所設(shè)計并合成的核苷酸進行藥理學(xué)分析研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)具有廣泛的免疫活性，直接或間接激活樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)；誘導(dǎo)IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子釋放，可形成保護性免疫記憶，能抑制Th2型類免疫應(yīng)答，其用于制備治療感染性疾病、過敏性疾病如哮喘、免疫缺陷性疾病和腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的拮抗寡核苷酸(CpG-N ODN)具有阻斷或中和CpG-S ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力，其在用于制備治療SIRS和膿毒癥藥物中的應(yīng)用。


圖112堿基ODN預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)4種可能的共同結(jié)構(gòu)特征具體實施方式
下面實施例為進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實驗例1本實驗例在于通過采用生物信息學(xué)技術(shù)，獲取CpG-S ODN和CpG-N ODN基因序列。
1.從PubMed上的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲取了血清型2、5和12Adv DNA、ECDNA序列(ACCESSIONNC_001405、M73260、NC_001460、NC_000913)。
2.采用生物信息學(xué)技術(shù)，使用Primer Premier 5、BioEdit version 5.0.6等生物軟件，對血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA中256種含CpG的六核苷酸序列進行了分析和比較(見表1)，根據(jù)①在血清型2、5Adv DNA中出現(xiàn)頻率較高；②在Adv 12 DNA和EC DNA中出現(xiàn)頻率較低；③Adv2Adv12≥2或Adv2EC≥5等3條原則，確定了血清型2、5Adv DNA中特有的19種含CpG的六核苷酸序列。
表1 Adv2、5、12 DNA和EC DNA中256種含CpG的六核苷酸序列分析和比較

3.使用BioEdit version 5.0.6，查找出血清型2、5Adv DNA中以這19種CpG六核苷酸為核心的12堿基寡核苷酸(ODN)；使用生物軟件RNAstructure version 3.71(該軟件既可預(yù)測RNA的二級結(jié)構(gòu)，也可預(yù)測DNA的二級結(jié)構(gòu))，對12堿基ODN的二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，找出了4種可能的共同結(jié)構(gòu)特征(1)共同特征1c-g位于干環(huán)頂端；(2)共同特征2g-c位于干環(huán)頂端；(3)共同特征3c-g或g-c位于干環(huán)側(cè)面；(4)共同特征4無干環(huán)結(jié)構(gòu)(見圖1)。
4.合成了10條磷酸硫代骨架的12堿基ODN，其中c-g位于干環(huán)頂端的3條(ODN1-3)、g-c位于干環(huán)頂端的3條(ODN 4-6)、c-g或g-c位于干環(huán)側(cè)面的2條(ODN7-8)、無干環(huán)結(jié)構(gòu)形成的2條(ODN9-10)。
5. 10條ODN的體外生物學(xué)活性的鑒定工作分離并培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞(hPBMC)，調(diào)整hPBMC細(xì)胞懸液濃度為1×106/ml，加入24孔板中，每孔1ml。置37℃ CO2孵箱培養(yǎng)2h后，加入10μg/ml各待篩選的ODN，置37℃ CO2孵箱培養(yǎng)4h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用雙抗體夾心ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-的濃度，明確10條ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力(見表2)，據(jù)此篩選出了2條無明顯刺激性的ODN:ODN1和ODN 6；而其它8條ODN具有誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力。
表2. 10條寡核苷酸10μg/ml刺激時誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α能力的測定(n＝3，x±s)

6.使用生物軟件RNAstructure version 3.71，對ODN的二級結(jié)構(gòu)自由能進行了分析，在此基礎(chǔ)上，對上述10條ODN的刺激性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進行了分析并發(fā)現(xiàn)，ODN的生物活性可能與預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的4種共同結(jié)構(gòu)特征無關(guān)；而可能與預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的自由能高低密切相關(guān)不含GGCG結(jié)構(gòu)且自由能大于-1.0的ODN可能為無免疫刺激性的ODN(見表3)。因此，使用生物軟件RNAstructure version 3.71對CpG-N ODN分子進行了再設(shè)計，根據(jù)此設(shè)計合成了11條磷酸硫代骨架的ODN。
表3. 10條ODN的刺激性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系

7. 11條ODN的體外生物學(xué)活性的鑒定工作方法同步驟5，據(jù)此篩選出了5條無明顯刺激性的ODNODN15、18、19、20、21；而其它6條ODN具有誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力(見表4)。
表4. 11條寡核苷酸10μg/ml刺激時誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α能力的測定(n＝3，x±s)

實驗例2本實驗例在于研究寡核苷酸的合成方法。
本發(fā)明所述的方法采用固相亞磷酰胺三酯法，簡單地說，是溶液中的單體通過縮合反應(yīng)形成3’→5’磷酸二酯鍵，從而連接到固相支持物上。
1.基本材料(1)支持物固相合成是將核酸固定在固相載體上完成合成反應(yīng)的，最常用的固相載體為可控微孔玻璃珠(CPG，controlled pore glass)，CPG的孔徑根據(jù)所合成的寡核苷酸的長度而定，一般合成鏈長小于60nt時，選擇孔徑500埃，鏈長大于60nt時，使用1000埃CPG，使用CPG的縮合效率高達98％-99.9％，可以滿足合成長達175nt的寡核苷酸的條件。CPG通過連接化合物與初始核苷酸的羥基共價結(jié)合，核苷酸的5’羥基用二甲氧基三苯甲基(DMT)保護。
(2)單體合成所用單體為核苷亞磷酰胺，是經(jīng)過化學(xué)修飾的核苷酸，含下面幾個功能基團。
1. 3’位P上二異丙胺基，縮合所用的功能基2. 3’位P上腈乙基，保護基，合成完畢后脫去。
3. 5’-DMT，保護基，縮合前脫去。
4. A和C的雜環(huán)氨基上的苯甲酸保護基，合成完畢后脫去。
5. G上嘌呤環(huán)氨基上的異丙酰保護基，合成完畢后脫去。
(3)反應(yīng)步驟合成的第一步----去封閉(Deblocking)，用三氯乙酸去除CPG所連核苷上的DMT，以暴露5’羥基，供下一步縮合。此步需要注意TCA為一較強的酸，可能會有脫嘌呤作用，故TCA與寡核苷酸接觸時間不要超過規(guī)定時間。
第二步----活化(Activation)，在縮合之前，單體與四唑混合并進入合成柱，此時四唑提供一個質(zhì)子給3’磷酸上二異丙胺基的N原子，質(zhì)子化的二異丙胺是一個良好的游離基團，與四唑形成亞磷酰胺四唑這種活性中間體。此步四唑過量保證了單體活化充分。
第三步----連接(Coupling)，亞磷酰胺四唑與CPG所連的核苷酸碰撞時，與其5’羥基發(fā)生親核反應(yīng)，發(fā)生縮合并脫掉四唑，合成的寡核苷酸鏈延長一個。此步單體相對于CPG所連核苷酸上5’-羥基過量保證了連接的高效率。
第四步----蓋帽(Capping)，為了防止未反應(yīng)的與CPG相連的5’羥基在隨后的循環(huán)中被延長，需要在連接反應(yīng)充分進行之后使之封閉，常用乙?；瘉矸忾]此羥基。臨用前混合乙酸酐和N-甲基咪唑等形成一活性很強的乙?；噭?，與少量為參與連接反應(yīng)的5’羥基縮合成酯鍵。由于須封閉的羥基少且乙?；噭┗钚愿吆统浞诌^量，此步反應(yīng)速度很快，幾秒鐘即足夠。太長的蓋帽時間有在非預(yù)期位置發(fā)生乙?；磻?yīng)的可能，且增加乙酸酐與痕量水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。
第五步----氧化(Oxidation)，連接反應(yīng)后新加上的核苷酸通過亞磷酯鍵(磷為三價)與CPG上相連的寡核苷酸鏈連接，此亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，因此需將此處三價磷氧化為五價的磷。常用的氧化劑為碘的四氫呋喃溶液。此步反應(yīng)速度亦很快。應(yīng)注意最后一個循環(huán)時，氧化步驟不可省略。此外亦可用其他氧化劑來完成氧化，從而得到各種符合實驗需要的寡核苷酸。
循環(huán)上述一至五步，寡核苷酸鏈即可延伸至所需長度時即可完成。
2.合成后處理
(1.)切割將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學(xué)切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG上連接化合物與初始核苷間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。
(2.)脫保護基須在此步前選好后續(xù)的純化方法。一般用新鮮的濃氨水處理較長時間以脫掉腈乙基、苯甲酰基、異丙基，用三氟乙酸脫5’-DMT.
(3.)純化根據(jù)所合成寡核苷酸的組成和應(yīng)用來選定純化的方法。常用的純化方法有C18柱、OPC柱、PAGE和HPLC。
(4.)定量。根據(jù)寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。
(5.)儲存。通常一次合成提供的寡核苷酸的量會比所需要的量大得多，所以會涉及到寡核甘酸的儲存問題。一般來說，這不成為問題，因為寡核甘酸的穩(wěn)定性很好。需要注意的是避免紫外線等劇烈的物理環(huán)境，避免反復(fù)凍融，-20C可穩(wěn)定保存一年以上。
實驗例3本實施例是對7條無明顯刺激性的ODN抑制CpG-S ODN的活性進行鑒定。
分離并培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞(hPBMC)，調(diào)整hPBMC細(xì)胞懸液濃度為1×106/ml，加入24孔板中，每孔1ml。置37℃ CO2孵箱培養(yǎng)2h后，加入10μg/ml各待篩選的ODN 30分鐘后，再加入5μg/ml的CpG-S ODN(TGG CGC GGGGCG)，置37℃ CO2孵箱培養(yǎng)4h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用雙抗體夾心ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的濃度，明確上述7條ODN抑制CpG-S ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α的能力，此次實驗結(jié)果表明上述7條ODN均有抑制CpG-S ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF-α釋放的能力，因此我們正式稱之為CpG-N ODN(見表5)。
表5.CpG-N ODN對CpG-S ODN誘導(dǎo)人PBMC釋放TNF-α的影響(n＝6，x±s)

★與CpG-S ODN組比較，p＜0.01
實驗例4本實施例在于研究CpG-N ODN對CpG-S ODN攻擊小鼠的保護作用。
清潔級昆明種小白鼠90只(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄不拘，隨機分為對照組、CpG-S ODN、ODN1、ODN6、ODN15、ODN18、ODN19、ODN20、ODN21組。對照組給予注射用水，注射體積為200μl/20g體重。CpG-S ODN組，給予80μg/20g體重的CpG-S ODN；其余各組在給予相應(yīng)的CpG-NODN 400μg/20g體重后，立即給予80μg/20g CpG-S ODN；給藥方式為尾靜脈注射，觀察7天內(nèi)小鼠一般情況及死亡率(表6)。結(jié)果顯示CpG-S ODN可導(dǎo)致小鼠3天內(nèi)全部死亡，7條CpG-N ODN可降低CpG-S ODN攻擊小鼠的死亡率。
表6. 7條CpG-N ODN對CpG-S ODN攻擊小鼠的保護作用

★與CpG-S ODN組比較，p＜0.0權(quán)利要求
1.一種高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸，其特征在于，具有如下基因序列GGC GGC GGC GCG；CGC GGC GCC GGG；GGC GGC GGC GGA；CCG CGC GCG GGC；TGG CGC GGG GCG；GCC GGC GCC CGG；GCG CGC GCG GTA；CCA GGC GGC GGG；GGC CGC GGG GGT；CAG CCC GGG GGA；GCT CCC GGG CTT；GCG CTC GGG CTT；CCG CCC GCG CCT；或GCA CCC GCG CGC其中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸，其特征在于，具有如下基因序列；GGC GGC GGC GCG；CCG CGC GCG GGC；TGG CGC GGG GCG；GCC GGC GCC CGG；GGC CGC GGG GGT；CAG CCC GGG GGA；GCT CCC GGG CTT；GCG CTC GGG CTT；或CCG CCC GCG CCT其中的一種。
3.一種對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸，其特征在于，具有如下基因序列GGC CGC GGG GAC；GCC GCC GCC GCC；CGC CTC GGG GAG；TGC CGC GGC AGA；CTC CAC GTG CCG；GCC GCC GCC GTC；或GCT GCC GCC GCC其中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸，其特征在于，具有如下基因序列CGC CTC GGG GAG；TGC CGC GGC AGA；CTC CAC GTG CCG；GCC GCC GCC GTC；或GCT GCC GCC GCC其中的一種。
5.權(quán)利要求1或2所述的高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸在用于制備治療感染性疾病、過敏性疾病、免疫缺陷性疾病和腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3或4所述的對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸在用于制備治療SIRS和膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸及其對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸的基因序列，同時公開了高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸在制備治療感染性疾病、過敏性疾病、免疫缺陷性疾病和腫瘤藥物中的應(yīng)用；對免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸在制備治療SIRS和膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07H21/04GK1699394SQ20041003478
公開日2005年11月23日 申請日期2004年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者周紅, 王良喜, 鄭江 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)