專利名稱：來源于絲蛋白的促細(xì)胞生長肽的提取與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于絲蛋白的能極好促進(jìn)細(xì)胞生長的肽，其制備方法，及其作為皮膚養(yǎng)護(hù)材料在藥物、準(zhǔn)藥物(quasi drug)、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用，以及作為生物材料應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
背景技術(shù)：
由于自從古時(shí)候絲線已經(jīng)被用作為外科手術(shù)縫合線，因此絲蛋白被看作是生物相容的材料，并且最近，關(guān)注于此性質(zhì)在各種領(lǐng)域的新用途的新發(fā)展變得活躍了。
例如，絲線溶解形成絲蛋白溶液，然后通過沉淀、干燥、粉碎等轉(zhuǎn)化成粉劑從而用于化妝品的添加劑；將絲蛋白水溶液在平板等上澆鑄成薄膜狀材料用作細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)或傷口覆蓋包被材料；絲蛋白溶液被制成凝膠狀材料以用于食品和化妝品。這些應(yīng)用的發(fā)展仍在繼續(xù)進(jìn)行。
這樣的進(jìn)展例子包括，如特開(日本未審查專利公開文本)62-000415，特公(已審查專利公開文本)01-044320，特開(日本未審查專利公開文本)01-254164，特公(已審查專利公開文本)06-004679，特開(日本未審查專利公開文本)11-139986，特開(日本未審查專利公開文本)11-276876，專利號2997758，專利號2990239，特開(日本未審查專利公開文本)11-253155，專利申請2002-230656，專利申請2002-148849，特開(日本未審查專利公開文本)2001-163899。(參見專利文獻(xiàn)1至12)。
在新絲綢材料的開發(fā)過程中，已經(jīng)清楚了絲蛋白具有各種功能，比如促細(xì)胞生長作用，抗氧化作用，殺菌作用，酒精消化作用和抗血凝結(jié)作用。
可是還沒有闡明絲蛋白中的何位置或結(jié)構(gòu)是造成那些功能的原因。
本發(fā)明人關(guān)注絲蛋白相關(guān)的細(xì)胞生長作用，并從事開發(fā)和研究其功能，目的在于，溶解蠶繭纖絲或絲線而后轉(zhuǎn)化成粉末、薄膜、膠(gel)等，然后，利用蠶繭纖絲或絲線用作用于傷口覆蓋材料的皮膚養(yǎng)護(hù)材料、化妝品以及改良的合成纖維材料(例如，參見專利文獻(xiàn)8，9，10，11及12)。
在以上開發(fā)和研究過程中，發(fā)現(xiàn)絲心蛋白的H和L鏈和絲膠蛋白a成分，都構(gòu)成絲蛋白，它們對于來源于正常人皮膚的成纖維細(xì)胞有促進(jìn)生長的作用(例如，參見專利文獻(xiàn)13、14和15)。
在另一方面，繭絲被用作纖維，除用于制衣之外，通過各種方法步驟將繭絲處理成生絲進(jìn)而處理成絲纖維，還用于如下的領(lǐng)域，比如，醫(yī)療用品(外科手術(shù)的縫合線)、化妝品(蓬松劑)等，另外最近已經(jīng)認(rèn)識到在繭絲和生絲的這些加工過程中，絲蛋白的分子量會減少。
另外，在將繭絲或絲線轉(zhuǎn)化成粉末、薄膜、膠等的步驟中(尤其是繭絲或絲線的溶解步驟)，發(fā)現(xiàn)絲蛋白的分子量會減少[H.Yamada等，材料科學(xué)和工程C，14，41-46頁(2001)]，[Tubouchi Kouzou，Yamada Hiromi，Takasu Yoko日本蠶業(yè)科學(xué)協(xié)會學(xué)報(bào)，第71卷，第1期，第1-5頁(2001)](參見非專利文獻(xiàn)，非專利文獻(xiàn)2)。
通過這種加工減少分子量的絲蛋白在電泳圖譜上顯示為分子量介于10,000和200,000道爾頓范圍內(nèi)的一片寬條帶。
那些低于10,000道爾頓的絲蛋白大都在透析等步驟中被去除了，而且實(shí)際上它們的分子量已減少到了氨基酸和寡肽的水平。
發(fā)現(xiàn)降低了分子量的絲蛋白具有減少的促人細(xì)胞生長活性或者抑制細(xì)胞生長(參見專利文獻(xiàn)11)。
換句話說，未降解的絲心蛋白和未降解的絲膠蛋白對促進(jìn)細(xì)胞生長來說是極好的，然而在繭處理步驟中，通過用酸、堿、光、熱等處理造成肽鍵復(fù)雜和異質(zhì)(heterogeneous)的裂解會導(dǎo)致隨其分子量的減少而抑制細(xì)胞生長。
因此，為了利用絲蛋白促細(xì)胞生長功能之目的，優(yōu)選使用未降解的絲心蛋白或未降解的絲膠蛋白、絲心蛋白H鏈(分子量，大約350,000)或L鏈、絲膠蛋白a(分子量，大約400,000)等未降解狀態(tài)。
可是，這三種成分(尤其是H鏈和絲膠蛋白a)有著巨大的分子量，在長期儲存中保持它們特性不變的穩(wěn)定性是低的。
另外，按重量計(jì)算，絲心蛋白中僅含L鏈少于10％，其量很少。
再者，還未見報(bào)道闡明這三種成分之每一種的哪部分擁有促細(xì)胞生長活性。
特開(日本未審查專利公開文本)62-000415 特公(已審查專利公開文本)01-044320[專利文獻(xiàn)3]特開(日本未審查專利公開文本)01-254164[專利文獻(xiàn)4]特開(日本未審查專利公開文本)04-202435[專利文獻(xiàn)5]特公(已審查專利公開文本)06-004679[專利文獻(xiàn)6]特開(日本未審查專利公開文本)11-139986[專利文獻(xiàn)7]特開(日本未審查專利公開文本)11-276876[專利文獻(xiàn)8]專利號2997758[專利文獻(xiàn)9]專利號2990239[專利文獻(xiàn)10]特開(日本未審查專利公開文本)11-253155[專利文獻(xiàn)11]專利申請2002-230656[專利文獻(xiàn)12]專利申請2002-148849[專利文獻(xiàn)13]特開(日本未審查專利公開文本)2001-163899[專利文獻(xiàn)14]專利申請2001-180169[專利文獻(xiàn)15]特開(日本未審查專利公開文本)2002-128691[非專利文獻(xiàn)1]H.Yamada等，材料科學(xué)和工程C，14，41-46頁(2001)[非專利文獻(xiàn)2]
Tsubouchi Kouzou，Yamada Hiromi，Takasu Yoko日本蠶業(yè)科學(xué)協(xié)會學(xué)報(bào)，第71卷，第1期，第1-5頁(2002)[非專利文獻(xiàn)3]Tashiro Yutaka和Otsuki Eiichi，細(xì)胞生物學(xué)雜志，第46卷，第1頁(1970)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)問題絲心蛋白H鏈和絲膠蛋白的a成分對于促進(jìn)細(xì)胞生長是極好的，然而它們有著大于300,000的高分子量并且傾向于結(jié)晶化。
與這些相比，絲心蛋白L鏈的分子量為25,000，小于H鏈和a成分的分子量，但是它比普通蛋白質(zhì)更容易具有結(jié)晶的傾向。
此外，按重量計(jì)算，絲心蛋白H鏈與L鏈的比率大約是13(H鏈)比1(L鏈)，L鏈的百分比是很小的。
高分子量與高結(jié)晶性的蛋白質(zhì)在水溶液中是不穩(wěn)定的。
另外，當(dāng)向含有油性成分等的藥物或化妝品添加劑加入這些蛋白質(zhì)時(shí)，會容易發(fā)生膠生成，轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定的物理特性，并且在長期儲存中(長于1年)它們的穩(wěn)定性低。
在另一方面，分子量小于絲心蛋白H鏈或絲膠蛋白a并對于細(xì)胞生長極好的物質(zhì)包括各種細(xì)胞的生長因子，比如，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)具有介于17,700到19,000范圍內(nèi)的分子量。
這些因子由腫瘤和癌細(xì)胞或迅速生長的細(xì)胞分泌，它們中的一些被用作治療皮膚潰瘍的藥劑(Fiblast噴霧劑，Kaken制藥有限公司)，但是它們的安全性令人擔(dān)憂。
本發(fā)明成功解決了這些問題。
也就是說，本發(fā)明的目的是獲得安全性、穩(wěn)定性極好(這歸因于它們相對低的分子量)和促細(xì)胞生長作用的肽，，它們都不同于由像腫瘤細(xì)胞那樣的異常細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞生長因子。
解決問題的手段為了解決以上問題，本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行了辛勤研究并成功鑒定出位于絲心蛋白特定位置的肽鏈具有促細(xì)胞生長功能，由此完成本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明在以下方面(1)有重大意義，對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽組合物，其包含一個(gè)或多個(gè)肽鏈的部分肽，該肽鏈選自形成構(gòu)成絲蛋白的非晶體部分(noncrystalline portion)的肽鏈，其中所述部分肽具有由四至四十個(gè)氨基酸殘基所形成的特定氨基酸序列。
更具體地，本發(fā)明提供對促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽組合物，其包含來自一個(gè)或多個(gè)肽鏈的部分肽，該肽鏈選自，構(gòu)成家蠶(domesticated silkworm)絲的絲心蛋白H-鏈的N-末端部分(I)、非晶體部分(A)和C-末端部分(a)的各個(gè)肽鏈，其L-鏈的肽鏈，以及構(gòu)成屬于半目大蠶蛾屬(Antheraea)之野生蠶(如天蠶(Antheraea Yamamai)的絲心蛋白的N-末端部分(I)、非晶體部分(A)和C-末端部分(a)的各個(gè)肽鏈，其中所述部分肽具有由四至四十個(gè)氨基酸殘基所形成的特定氨基酸序列。
另外，在第二方面(2)提供一種肽組合物，其中帶有以上特定氨基酸序列的肽鏈具有以下氨基酸序列(1)至(8)中的任意序列(1)A-6-2 VITTDSDGNE(2)A-6-6 NINDFDED(3)SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)AfH1 YGWGDGGYGSDS(6)AfH5 DEYVDN(7)AfH6 VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)AfH7 DDGFVLDGGYDSE此外，在第三方面(3)提供一種對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽，其包含以下氨基酸序列(1)至(8)中的任意序列(1)A-6-2 VITTDSDGNE(2)A-6-6 NINDFDED(3)SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)AfH1 YGWGDGGYGSDS(6)AfH5 DEYVDN(7)AfH6 VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)AfH7 DDGFVLDGGYDSE
此外，在第四方面(4)提供一種從非晶體部分分離并獲得對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽的方法，其通過水解來自于家蠶的未降解的絲蛋白或來自于屬于半目大蠶蛾屬的野生蠶的未降解的絲心蛋白，接著分子分級分離。
此外，在第五方面(5)提供一種上述第四項(xiàng)發(fā)明中的從非晶體部分分離并獲得對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽的方法，其中水解是通過使用稀酸、羥胺或蛋白酶來進(jìn)行的。
此外，在第六方面(6)和在第七方面(7)提供一種促細(xì)胞生長劑，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第八方面(8)和在第九方面(9)提供一種細(xì)胞粘附劑，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第十方面(10)和在第十一方面(11)提供一種傷口促愈合劑，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第十二方面(12)和在第十三方面(13)提供一種化妝品材料，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第十四方面(14)和在第十五方面(15)提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)(substrate)，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
本發(fā)明成功地提供了對于細(xì)胞生長極好的新型的肽，其具有分子量小于10,000的特定的氨基酸序列，分子量優(yōu)選在4,000至400的范圍內(nèi)，其既可通過從絲蛋白的非晶體部分分離和分級分離肽，也可通過合成類似于這樣的肽的肽來獲得。
這些肽可以用作生物材料，例如，細(xì)胞粘附劑，促細(xì)胞生長劑，傷口促愈合劑，皮膚養(yǎng)護(hù)材料，如化妝品等，以及細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式來自于絲蛋白非晶體部分的對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽及其肽組合物通過如下過程獲得，并且也確定了它們的氨基酸序列。
(1)屬于半目大蠶蛾屬的野生蠶如家蠶或天蠶的蠶繭層脫膠之后，溶解于LiSCN水溶液中并離心分離。回收分離的上清液并用水透析。再次離心透析液，并回收分離的上清液。
(2)向經(jīng)分離回收的純化的上清液中加入蛋白酶，如胰凝乳蛋白酶，進(jìn)行水解處理。
(3)水解處理后的溶液的上清液(非晶體部分)同沉淀層(晶體部分(crystalline portion)分離并被回收。
(4)通過反相色譜分級分離上清液(非晶體部分)。
(5)將通過反相色譜分離的每個(gè)級分進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
(6)通過凝膠過濾色譜法，將對細(xì)胞生長極好的級分按分子量進(jìn)行分級分離，并且測定具有高于對照級分2倍細(xì)胞生長率的級分(肽鏈)的氨基酸序列。
(7)基于獲得的肽，設(shè)計(jì)并合成出預(yù)期顯示極好促細(xì)胞生長作用的肽。
因此，本發(fā)明可以分離和分級分離來自于絲蛋白非晶體部分的分子量小于10,000，優(yōu)選4,000至400范圍內(nèi)的肽，該肽具有極好的促細(xì)胞生長活性，合成這種肽的類似肽，以及將這些肽用作生物材料，如細(xì)胞粘合劑，細(xì)胞生長促進(jìn)劑，傷口促愈合劑，皮膚養(yǎng)護(hù)材料，如化妝品等，和細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
源于本發(fā)明絲蛋白的促細(xì)胞生長肽是指顯示出高于對照2倍細(xì)胞生長率的肽，其中對照按實(shí)施例1至3所述，在三天細(xì)胞培養(yǎng)測試中在不含外加肽的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
家蠶絲心蛋白的基本結(jié)構(gòu)就家蠶來說，在吐絲的時(shí)候，蠶吐出絲蛋白以結(jié)成蠶繭(含有繭絲和蛹)。在繭絲中，其中心存在有絲心蛋白，而其周圍有絲膠蛋白，已知它們的存在比率是70％至80％(絲心蛋白)比20％至30％(絲膠蛋白)。
繭絲中絲心蛋白(絲蛋白指單獨(dú)的絲心蛋白或絲膠蛋白或指它們的結(jié)合體)的分子量大約為370,000。
(參見非專利文獻(xiàn)3)在大約370,000分子量的絲心蛋白中，大小為大約350,000的分子(H-鏈)和大小為大約25,000的分子(L-鏈)通過S-S鍵互相結(jié)合。
絲心蛋白H-鏈有非常高的分子量，其由相似的氨基酸殘基序列重復(fù)而組成。
根據(jù)Gen Bank登錄號AF 226688，H-鏈的前體蛋白由N-末端部分(I)、晶體部分(R)和非晶體部分(A)的重復(fù)部分、和C-末端部分(a)組成。
通過十二個(gè)晶體部分(R01至R12)間隔十一個(gè)非晶體部分(A01至A11)從而重復(fù)形成該重復(fù)部分。
晶體部分是由高度結(jié)晶性的二肽(Gly-X)大量重復(fù)組成，X是以高度結(jié)晶性的Ala(A)或外加Ser(S)作為主要成分，其另外的次要成分包括Tyr(Y)，Val(V)等。
尤其是GAGAGS或GA的重復(fù)很多見。
因此，在晶體部分中G和A的總量超過50％，并且能達(dá)到約70％以上。
非晶體部分的A01至A11肽就它們的氨基酸序列來說互相相似，每個(gè)氨基酸序列中只發(fā)現(xiàn)了微小差別。
另外，每個(gè)非晶體部分(A01至A11)中的G和A的總量少于50％。
從它們的氨基酸序列和氨基酸成分來看，N-末端部分和C-末端部分被認(rèn)為是非晶體，與A01至A11相似，其各自G和A的總量均少于50％。
另一方面，非晶體部分中存在有一些部分，其中大約6至10個(gè)殘基的部分肽中G和A的總量會超過50％。
<絲心蛋白H-鏈前體>
I-R01A01R02A02R03A03R04A04R05A05R06A06R07A07R08A08R09A09R10A10R11A11R12-aN-末端部分IN-末端部分(I)是肽的起始部分，其氨基酸序列如下所示MRVKTFVILCCALQYVAYTNANINDFDEDYFGSDVTVQSSNTTDEIIRDASGAVIEEQITTKKMQRKNKNHGILGKNEKMIKTFVITTDSDGNESIVEEDVLMKTLSDGTVAQSYVAADAGAYSQSGPYVSNSGYSTHQGYTSDFSTSAAV晶體部分R01，R02，……，R12R01，R02，……，R12都是被稱為晶體部分的部分，每個(gè)晶體部分的氨基酸殘基數(shù)量大于300?？墒菓?yīng)當(dāng)注意到，R12的氨基酸殘基數(shù)量是54個(gè)。
每個(gè)晶體部分(R01至R11)中的G和A的總量超過約70％。
非晶體部分A01，A02，……，A11它們由28至32個(gè)氨基酸殘基組成并被稱為非晶體部分(A)。
它們的氨基酸序列如下所示A01 GSSGFGPYVANGGYSRSDGYEYAWSSDFGTA02 GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGTA03 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
A04 GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGTA05 GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGTA06 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA07 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA08 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA09 GSSGFGPYVNGGYSGYEYAWSSESDFGTA10 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA11 GSSGFGPYVANGGYSRREGYEYAWSSKSDFETC-末端部分aC-末端的非晶體部分的氨基酸序列如下所示AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNCGIPRRQLVVKFRALPCVNC為方便和參考以理解本發(fā)明，蛋白質(zhì)中氨基酸或氨基酸殘基的符號、其電荷特征等如下表10所示。


基于側(cè)鏈性質(zhì)，氨基酸被分成四組，即酸性氨基酸，極性不帶電荷的氨基酸，非極性氨基酸和堿性氨基酸(1)酸性氨基酸E，D(2)極性不帶電荷的氨基酸N，S，Q，Y，T，C，F(xiàn)(3)非極性氨基酸A，G，V，P，L，I，W(4)堿性氨基酸H，K，R
在與絲心蛋白H-鏈晶體部分和非晶體部分的氨基酸序列比較后，如下所示的絲心蛋白L-鏈為非晶體部分。
<絲心蛋白L-鏈中的氨基酸序列>
MKPIFLVLLVATSAYAAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSIAILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINSYTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGCAGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAHLLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHV另一方面，來源于野生蠶的絲蛋白的氨基酸序列不同于家蠶的，而屬于半目大蠶蛾屬的野生蠶，例如天蠶、柞蠶(Antheraea pernyi)、蓖麻蠶(SamiaCynthia ricini)、琥珀蠶(Antheraea assama)及Antheraea mylitta，它們幾乎有完全一樣的氨基酸序列。
對于天蠶的絲心蛋白，僅由10個(gè)或更多個(gè)丙氨酸殘基(A)重復(fù)而組成的部分被稱為晶體部分，除此之外的其它部分被稱為非晶體部分。
與家蠶的絲心蛋白相比，屬于半目大蠶蛾屬的野生蠶的絲心蛋白在晶體部分和非晶體部分的每個(gè)重復(fù)部分中有較少的殘基數(shù)量。
除了晶體部分(具有10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的丙氨酸殘基)，天蠶絲心蛋白的非晶體部分的氨基酸序列如下所示。
從氨基酸組成來看，N-末端部分和C-末端部分也是非晶體部分。
<來自天蠶絲心蛋白的非晶體部分的基本結(jié)構(gòu)>
N-末端部分起始肽MRVTAFVILCCALQYATANNLHHHDEYVDNHGQLVERFTTRKHYERNAATRPHLSGNERLVETIVLEEDPYGHEDIYEEDVVINRVPGASSSAAAASSASAGSGQTIIVERQASHGAGGA非晶體部分
AGAAAGAAAGSSARGGSGFYETHDSYSSYGSGSSSAAAASSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDSGSGAGGRGDGGYGSGSSRRAGHDHAAGSSGGGYSWDYSSYGSESGSGAGGVGGGYGGGDGGYGSGSSRRAGHDRAAGSSGAGGSGGGYGWGDGGYGSDSGSGAGRAGGDYGWGDGGYGSDSRQAGHERAAGSSGAGGSGRGYGWGDGGYGSDSGSGAGGAGGDYGWGDGGYGSDGSGAGGAGGDYGWGDGGYGSDSSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDSSGAGGAGGYGGYGSDSSGAGGSGGGYGWGDGGYGSGSGSGAGGVGGGYGWGDGGYGSDSSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDSRRAGHDRAAGCSGAGGTGGGYGWGDGGYGSDSSGAGGSGGGYGWGDGGYGSNSSGAGRSGGGYGWGDGGYSSDSSGAGGSGGYGGYGSDSGSGAGGVGGGYGWGDGGYGGYGSDSGSGAGGVGGGYGRGDSGYGSGSSGHGRSSGSSGAGGSGGGYGWDYGSYGSDSSSGAGGSGGGYGWDYGGYGSDSGSGAGGSGGGYGWGDGGYGSDSSRRAGHDRAYGAGSGAGASRPVGIYGTDDGFVLDGGYDSEGSC-末端部分SSSGRSTEGHPLLSICCRPCSHRHSYEASRISVH對于能極好促進(jìn)細(xì)胞生長的絲蛋白的成分，本發(fā)明進(jìn)行分析每個(gè)成分的哪一部分會帶來促細(xì)胞生長作用，發(fā)現(xiàn)該作用與非晶體部分相聯(lián)系。
絲心蛋白的非晶體部分指的是具有上述氨基酸序列的部分。
因此，在非晶體部分中包含了N-末端部分和C-末端部分。
家蠶非晶體部分的A01至A11(28至32個(gè)殘基的肽)都顯示出極好的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，然而A01至A11的氨基酸序列是不同的。
在其32個(gè)殘基以外的8個(gè)殘基的范圍內(nèi)，A11的氨基酸殘基序列不同于其他A01至A10中任一個(gè)的氨基酸殘基序列。
因此，即使氨基酸殘基序列有大約30％或更少的差異，也不會影響到促細(xì)胞生長活性。
而且，即使氨基酸殘基數(shù)量在大約20％的范圍內(nèi)增加/減少，也不會影響到促細(xì)胞生長活性。
可是，優(yōu)選氨基酸序列差異少于50％以保持促細(xì)胞生長活性。
另一方面，氨基酸殘基數(shù)量非常少的肽可能不會表現(xiàn)出促細(xì)胞生長活性。
尤其當(dāng)氨基酸殘基數(shù)量不超過2個(gè)時(shí)，會抑制細(xì)胞生長。
因此，促細(xì)胞生長肽較好是4至40個(gè)殘基的肽，優(yōu)選為6至32個(gè)殘基。
另外，發(fā)現(xiàn)了非晶體部分中包含較多酸性氨基酸殘基和/或極性不帶電荷的氨基酸殘基，而且?guī)缀鯖]有堿性氨基酸殘基的部分肽能較好地具有促細(xì)胞生長作用。
尤其是酸性氨基酸殘基顯示出極好的促細(xì)胞生長活性。
非晶體部分作為一個(gè)整體來看有極好的促進(jìn)生長活性，然而從局部來看，因?yàn)镚和A的總量會超過55％并且包含大量的堿性氨基酸，因而有一些氨基酸序列部分顯示出低的促進(jìn)生長活性。
因此從絲心蛋白的非晶體部分分離和回收部分肽，其中有酸性氨基酸和/或極性不帶電荷的氨基酸并基本上沒有堿性氨基酸。
在回收的部分肽中，將具有40個(gè)或更少氨基酸殘基并顯示出高于對照二倍細(xì)胞生長率的肽定為SDFGP，其中對照按實(shí)施例1至3所述，在細(xì)胞培養(yǎng)測試中沒有外加肽。
具有4至40個(gè)氨基酸殘基的多個(gè)肽的混合物也被定為是SDFGP，只要其細(xì)胞生長率顯示出高于對照2倍或更高的活性 。
對于上述情況，來自于非晶體部分的部分肽必須滿足以下各項(xiàng)，這從表6顯示的結(jié)果中就能容易地推斷出來(1)G和A的總量相對于肽中氨基酸殘基總數(shù)量不超過55％。這是因?yàn)檩^高的G和A的含量會易于形成晶體。
(2)堿性氨基酸殘基的數(shù)量相對于肽中氨基酸殘基總數(shù)量不超過25％。
(3)其中存在酸性氨基酸和/或極性不帶電荷的氨基酸。
當(dāng)這些條件不能被滿足時(shí)，細(xì)胞生長會被抑制。
關(guān)于這一點(diǎn)，氨基酸或肽的性質(zhì)根據(jù)它們的側(cè)鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生差異。
盡管酸性氨基酸對促細(xì)胞生長作用極好，但是因?yàn)镋和D之間的側(cè)鏈長度有差異，因此它們之間的側(cè)鏈和主鏈的柔韌性或構(gòu)象存在差異，從而導(dǎo)致不同的促細(xì)胞生長作用。
同樣地，這對被稱為極性不帶電荷的氨基酸或堿性氨基酸的各種氨基酸也一樣正確，并且由于物理化學(xué)性質(zhì)的變化，也不總是能產(chǎn)生相同的細(xì)胞促進(jìn)與細(xì)胞抑制活性。
形成我們身體的細(xì)胞主要分成粘附細(xì)胞和流動(floating)細(xì)胞。
粘附細(xì)胞包括皮膚細(xì)胞、血管細(xì)胞、腺細(xì)胞等等。流動細(xì)胞包括血液細(xì)胞等。
粘附細(xì)胞的生長過程始于粘附，然后增殖，因此該過程大致被分成粘附和增殖。
本發(fā)明的SDFGP具有支持粘附和增殖的性質(zhì)，而且這兩者相比，對粘附相對更好。
對增殖更好會導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，并會使長期使用牽涉到安全性議題上。
因此，本發(fā)明的SDFGP，其對粘附效果良好，具有增殖促進(jìn)作用，而且不抑制細(xì)胞生長，將其用作皮膚養(yǎng)護(hù)材料和生物材料是極好的。
實(shí)際上當(dāng)從絲蛋白中分離并回收部分肽時(shí)，絲蛋白用裂解特定肽鍵的蛋白酶或用能達(dá)到相同目的的化學(xué)制品裂解，然后回收屬于非晶體部分并且不超過40個(gè)氨基酸殘基的肽。
另外，基于所得到的肽也可能設(shè)計(jì)出對細(xì)胞生長極好的肽，然后合成出該肽。
1.從絲蛋白中分離并回收肽為了分離并回收絲蛋白的非晶體部分，可以利用非晶體部分的特性。
由于非晶體部分易溶于水，可以在接近中性的水(pH5.0至9.0)中浸泡絲(silk)材料。
可是，僅僅通過浸泡絲材料并不能有效地獲得非晶體部分的肽。
因此要主動裂解絲蛋白的特定肽鍵。
該肽鍵裂解方法最好使用能主動裂解特定肽鍵的化學(xué)物質(zhì)、酶等。
以下描述該方法。
1)原材料對于家蠶來說，使用的原材料是含絲心蛋白H-鏈、L-鏈并留有絲膠蛋白a成分的絲蛋白。
對于野生蠶(如，天蠶、柞蠶、蓖麻蠶、琥珀蠶及Antheraea mylitta等)來說，使用的原材料是這樣的原材料，其中能與家蠶的絲心蛋白H-鏈一樣清晰地在電泳圖譜中觀察到絲心蛋白的條帶。
原材料可以分別是絲心蛋白和絲膠蛋白，或是它們的共同體。
因此，本發(fā)明的原材料可以包括所有的繭絲、生絲、絲織品和編織品、絲線(絲心蛋白纖維)、其剩余的線或纖維、粉、薄膜等可用作原材料的材料，以及由蠶(如家蠶和野生蠶)吐的蛋白纖維材料(絲材料)。
應(yīng)當(dāng)注意的是，這些材料必須包括家蠶的絲心蛋白H-鏈和絲膠蛋白a成分以及野生蠶的相應(yīng)成分。
由于絲心蛋白H-鏈比L-鏈更易于降解，所以部分保留的H-鏈顯示出L-鏈大部分被保留而不降解。
2)材料的溶解性以上1)的用中性鹽溶解的材料可以是脫膠的材料，半脫膠的材料，未脫膠的材料，或其中間材料。
它可以是來自于蠶繭的絲膠蛋白纖維。
重點(diǎn)是在經(jīng)過各種處理步驟后，它們的絲蛋白沒有降解，或絲心蛋白H-鏈、絲膠蛋白a成分及其相應(yīng)蛋白質(zhì)仍部分未降解。
H-鏈、a成分等是否保留被它們在電泳圖譜中各自相應(yīng)的條帶所確證。
被用作生絲線增溶劑的中性鹽包括，例如，氯化鈣，乙二胺銅，硫代氰酸鈉，硫代氰酸鋰，溴化鋰，硝酸鎂等等。
中性鹽最好是處于飽和水溶液或者處于不小于50％飽和度的濃度[重量(g)/體積(ml)]中。
對于含有絲心蛋白和絲膠蛋白的情形，例如，繭絲，未脫膠材料，半脫膠材料等，均用以上中性鹽以溶解絲線的相似方式溶解。
另一方面，當(dāng)絲膠蛋白如在蠶繭的絲膠蛋白纖維中的情況一樣，含量達(dá)到98％或更多時(shí)，以70至90攝氏度用8M尿素進(jìn)行溶解10分鐘。
另外，蠶繭的絲膠蛋白纖維也可以在室溫(20至30攝氏度)用9M LiBr溶解30分鐘。
根據(jù)以上情況，溶解的條件可以變化。
在中性鹽溶液中溶解絲材料的步驟中，可以向中性鹽中加入醇，如甲醇、乙醇和丙醇。
當(dāng)將氯化鈣用作中性鹽時(shí)，在不高于94攝氏度的溫度下進(jìn)行溶解，優(yōu)選在75至85攝氏度的范圍內(nèi)。
當(dāng)使用溴化鋰時(shí)，在低于大約50攝氏度的溫度下溶解原材料。因此，根據(jù)使用的中性鹽，溶解的條件會變化，并且使用可使絲心蛋白H-鏈和絲膠蛋白a成分保留的方法或其相應(yīng)的方法來溶解。
在溶解絲材料期間，(1)可以通過攪拌加速溶解。
(2)在較低的溫度下溶解困難。
盡管較高的溫度可以使溶解變得容易，但是可能發(fā)生分子量急速降低。
除絲心蛋白或絲心蛋白和絲膠蛋白的混合物之外，用中性鹽溶解絲的溶液還包含中性鹽、醇等。
首先從該溶液中去除不溶材料，然后用透析膜或透析設(shè)備去除分子量小于5,000的低分子量化合物。
通過這樣的透析獲得了絲蛋白溶液。
3)用酶降解并回收通常而言，用蛋白酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)裂解時(shí)裂解發(fā)生在特定的肽鍵上，而且由于裂解是在溫和條件下進(jìn)行的，因此不易于發(fā)生氨基酸殘基側(cè)鏈上的修飾。
另外，可以避免產(chǎn)生蛋白質(zhì)非特異性裂解所產(chǎn)生的復(fù)雜片段。
這樣的酶包括賴氨酰內(nèi)切酶，精氨酰內(nèi)切酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，凝乳酶，胰酶，彈性蛋白酶等。
向絲蛋白水溶液加入蛋白酶，在特定肽鍵之間裂解絲蛋白。
在這些蛋白酶中間，尤其優(yōu)選胰凝乳蛋白酶來分離晶體和非晶體部分。
來自絲蛋白的裂解的肽主要由絲蛋白晶體部分產(chǎn)生的片段組成，它們傾向于聚集和聚集為沉淀(凝結(jié)或結(jié)晶)。
既使它們的聚集幾乎沒有發(fā)生，但源于晶體部分的肽更容易傾向于聚集，而且將醇(甲醇、乙醇等)等作為凝結(jié)劑添加會引起衍生于晶體部分的肽所觸發(fā)的聚集，從而沉淀出來。
去除沉淀后，剩下的是來自于非晶體部分的肽的溶液。
為了去除沉淀，將含沉淀的溶液離心(1,000至10,000G)以去除沉淀。
無沉淀的溶液是源于非晶體部分的肽的水溶液，該肽是從非晶體部分分裂而成的。
干燥該溶液，就得到了薄膜狀或粉狀的肽。
應(yīng)當(dāng)注意的是，將醇加入到產(chǎn)生自非晶體部分的肽的水溶液中時(shí)，非晶體部分的肽開始依次聚集，并隨著醇濃度的升高而沉淀出來。
來自非晶體部分的肽可以含有來自晶體部分的部分肽，只要后者在大約50％之內(nèi)。
可是，要獲得對促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽，即使肽是來自非晶體部分的，甘氨酸和丙氨酸殘基的總量也最好不要超過55％。
另外，堿性氨基酸殘基的數(shù)量最好不要超過構(gòu)成肽的殘基數(shù)的25％。
另一方面，酸性氨基酸殘基和極性不帶電荷的氨基酸殘基占較大量是優(yōu)選的。
特別地，酸性氨基酸殘基占較大量對促細(xì)胞生長作用更好。
通過冷凍干燥或噴霧干燥的方法來進(jìn)行干燥。
即使來自非晶體部分的肽在干燥后結(jié)晶，但由于它們較低的分子量，它們也很容易溶解在水中。
2.來自于絲蛋白的促成纖維細(xì)胞生長肽(SDFGP)的合成分離和回收的來自絲蛋白的SDFGP包括以下肽這些僅僅是SDFGP的實(shí)例。
不言而喻，有許多SDFGP滿足以上所述( 部分)的條件。
A-6-2 VITTDSDGNEA-6-6 NINDFDEDSfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNSfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
AfH 1 YGWGDGGYGSDSAfH 5 DEYVDNAfH 6 VETIVLEEDPYGHEDIYEEDAfH 7 DDGFVLDGGYDSE既使這些SDFGP中僅有一部分的氨基酸序列可用作能顯示出極好促細(xì)胞生長作用的SDFGP。
另外，可以在40個(gè)殘基范圍內(nèi)重復(fù)這些肽或與其它肽相連。
可是，單一的氨基酸狀態(tài)卻不具有促細(xì)胞生長功能。
促細(xì)胞生長功能所必需的氨基酸殘基數(shù)不能少于4個(gè)殘基。
另一方面，考慮到肽合成的效率，優(yōu)選殘基數(shù)是40個(gè)或更少。
可模擬絲蛋白非晶體部分的氨基酸序列合成SDFGP，并且合成出滿足以上所述( 部分)條件的肽。
合成肽的氨基酸殘基數(shù)為4至40個(gè)，優(yōu)選6至32個(gè)。
在這種情況下，其氨基酸序列不必與絲蛋白的相同。
例如，絲心蛋白H-鏈的非晶體部分(A0至A11)的氨基酸序列并不完全相同，然而它們的生長促進(jìn)活性大致相同，而且它們都與SDFGP一致。
因此，其氨基酸序列可以有大約30％或更少的差異，優(yōu)選相差50％或更少。
在這種情況下，越多酸性氨基酸越好，而且優(yōu)選存在極性不帶電荷的氨基酸。
相反，優(yōu)選不含堿性氨基酸。
換句話說，每個(gè)SDFGP的氨基酸殘基都可以用其他氨基酸殘基替換。
既然如此，堿性氨基酸殘基數(shù)被設(shè)計(jì)為所構(gòu)成肽中的25％或更少。
另一方面，在肽(SDFGP)中優(yōu)選有較大量的酸性氨基酸。
全部氨基酸殘基可以由酸性氨基酸和/或極性不帶電荷的氨基酸組成。
因此，A-6-2的DSDGDE，A-6-6的DEDEDE和EDEDED，SfHA的SSESSE和YGGYEY，AfH1的DGGYGGD，AfHS的DEYDEY，AfHG的YEEDYEED，等等，以及另外許多別的肽，如EEEE，EEEEEE，EYEYEY，EEYEEY，YYYYYY，EGSEGS，都可以成為SDFGP。
不言而喻，只要它們在上述 所述的條件范圍內(nèi)，并有10,000或更小的分子量，優(yōu)選在4,000至400的范圍內(nèi)，這些肽就可以被重復(fù)或與其他肽相連。
另外，氨基酸殘基可以用其他氨基酸殘基替換。
4.應(yīng)用由絲蛋白和SDFGP的非晶體部分得到的肽不僅對于細(xì)胞生長促進(jìn)作用極好，而且易溶于水。
另外，它們的分子量大約低于4,000，因而它們的形態(tài)(forms)在長期溶解狀態(tài)中能得以穩(wěn)定。
更進(jìn)一步，混合各種SDFGP可以較單個(gè)SDFGP促進(jìn)更高的細(xì)胞生長。
所以，這些混合物可以加入細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)、洗劑、乳劑、乳油(cream)、油膏(ointment)、滴劑(instillation)、食品，等等。
由于本發(fā)明的肽和SDFGP對于促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長極好，所以對于皮膚養(yǎng)護(hù)、細(xì)胞培養(yǎng)，以及對于將來除以上領(lǐng)域之外的其他領(lǐng)域的改進(jìn)，如織物纖維、化妝品粉末、樹脂等，它們是都是極好的材料。
蠶絲(silk)絲心蛋白酶消化液的細(xì)胞生長活性(1)絲綢絲心蛋白非晶體部分的酶降解，以及隨后的分離和分級分離切開家蠶的繭以去除蛹，在90攝氏度下，將繭層(10g)浸沒在30體積8M尿素中10分鐘以提取絲膠蛋白。
提取后的殘余物用水洗，干燥，并制備成絲心蛋白。
一克絲心蛋白浸沒于10ml 9M LiSCN中溶解。向其中加入10ml蒸餾水并以3,000rpm離心10分鐘。
上清液裝入半透膜管中，用50體積的水透析。
透析進(jìn)行四次，每隔30分鐘換外部的透析液。
透析后，再次離心溶液，然后加入0.1M磷酸二氫鈉(pH8.5)調(diào)節(jié)其pH到7至8。
向該溶液加入相當(dāng)于絲心蛋白1/100量的胰凝乳蛋白酶，40攝氏度放置4小時(shí)，之后沉淀會形成。
源于絲心蛋白非晶體部分(A)的上清液中的蛋白質(zhì)或肽被叫做非晶體部分(A’)，源于晶體部分(C)的沉淀中的蛋白質(zhì)或肽被叫做晶體部分(C’)。
晶體部分用水洗，溶于1ml 9M LiSCN中，并且使用上述半透膜管在50個(gè)體積的水中透析，然后測定水溶液中蛋白質(zhì)的量。
不進(jìn)行進(jìn)一步處理就測定上清液中的蛋白質(zhì)的量。
(2)涂在細(xì)胞培養(yǎng)容器上通過加入70％乙醇，該晶體部分(C’)和非晶體部分(A’)水溶液的濃度每個(gè)都各自調(diào)節(jié)到0.025％和0.0025％，1ml每種稀釋后的溶液裝進(jìn)聚苯乙烯制成的培養(yǎng)皿(35mm，F(xiàn)alcon)中，然后空氣干燥。
僅向培養(yǎng)皿中加入1ml 70％乙醇作為對照。
(3)細(xì)胞培養(yǎng)使用的細(xì)胞是人皮膚成纖維細(xì)胞(源于成人普通皮膚)，購(冷凍)于SankoJunyaku有限公司。
使用的培養(yǎng)基質(zhì)是用于人皮膚成纖維細(xì)胞生長的低血清培養(yǎng)基質(zhì)，購于Kurabo工業(yè)有限公司。[10ml LSGS(低血清生長補(bǔ)充劑)加入到500ml 106S培養(yǎng)基質(zhì)(皮膚成纖維細(xì)胞的基本培養(yǎng)基質(zhì))中]。
應(yīng)當(dāng)注意到LSGS具有促細(xì)胞生長活性。
向每個(gè)培養(yǎng)皿加入2ml培養(yǎng)基質(zhì)，并且接種80,000個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)3天。
(4)用Alamer藍(lán)染料測定活細(xì)胞數(shù)量每個(gè)培養(yǎng)皿加入2ml培養(yǎng)基質(zhì)和0.1ml Alamer藍(lán)(Iwaki Glass公司)，在37攝氏度培養(yǎng)2小時(shí)，用570nm和600nm處的吸收值計(jì)算Alamer藍(lán)的減少量，該量與活細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。
與沒有絲蛋白成分的對照(100％)相比，人皮膚成纖維細(xì)胞在涂有晶體部分和非晶體部分的培養(yǎng)皿中的生長情況如表1所示。
在所有情況下，在涂有絲蛋白成分的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長率都顯示出較對照更高的值。
濃度為0.025％的非晶體部分(C’)的生長率特別高。這部分是SDFGP的混合物。
較高濃度(0.025％)的晶體部分的生長率比較低濃度的(0.0025％)差。
這被認(rèn)為是由于晶體部分的絲蛋白造成了細(xì)胞生長抑制。
細(xì)胞生長促進(jìn)肽的氨基酸序列實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)絲心蛋白非晶體部分較其晶體部分能更高活性地促進(jìn)細(xì)胞生長。
可是，實(shí)施例1中分級分離的非晶體部分可能是酶解產(chǎn)生的肽的混合物。
因此，進(jìn)一步分離非晶體部分以鑒定出促進(jìn)細(xì)胞生長的位置。
首先，根據(jù)其極性差異，使用反相色譜層析以分離實(shí)施例1中非晶體部分所含的肽。
按原始材料計(jì)，使用的體積是RESOURCER RPCK 3ml。
A泵用0.1％的TFA(三氟乙酸)，B泵用0.1％TFA/90％乙腈，在0至15分鐘內(nèi)，以0％的B至75％的B的梯度進(jìn)行色譜層析。
結(jié)果，確定了有6個(gè)峰(A-1，…，A-6)。
收集每個(gè)峰，用蒸發(fā)器干燥，然后再溶解在少量緩沖液(PBS)中。
A-1至A-6的濃度各自用70％乙醇調(diào)節(jié)到0.025％，然后每種取1ml加入聚苯乙烯制成的細(xì)胞培養(yǎng)皿(35mm，F(xiàn)alcon)中，并空氣干燥。
對照的培養(yǎng)皿僅包含1ml 70％乙醇，然后空氣干燥。
使用這些培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞培養(yǎng)的方法與實(shí)施例1中的相同。
在涂有來自非晶體部分肽片段的培養(yǎng)皿中，人皮膚成纖維細(xì)胞的生長率如表2所示。
在來自非晶體部分的片段中，A-6對生長極好，相對于對照，顯示出大約4倍的增長。
接下來，根據(jù)其分子量，顯示最佳細(xì)胞生長促進(jìn)活性的A-6中所含的肽用Superdex肽HR10/30儀(凝膠過濾色譜)進(jìn)行分離。
結(jié)果，確定了有7個(gè)峰，A-6-1，…，A-6-7。
它們的分子量均在2,500以下。
在7個(gè)峰中，收集5個(gè)突出而明顯的峰(A-6-2，A-6-3，A-6-4，A-6-6，A-6-7)中的肽，并把每種肽涂于細(xì)胞培養(yǎng)皿上，加入培養(yǎng)基質(zhì)，接種細(xì)胞并培養(yǎng)2天，然后測定細(xì)胞生長情況。
細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)與實(shí)施例1中的相同。
細(xì)胞生長率的測定結(jié)果如表3所示。
A-6-2和A-6-6在培養(yǎng)2天后的生長率高于對照生長率1.5倍，顯示出極好的促細(xì)胞生長作用。
培養(yǎng)3天后的生長率超過2倍。
接著，用BI技術(shù)日本有限公司的LF3000蛋白質(zhì)測序儀分析A-6-2和A-6-6的氨基酸序列，得到其如下的氨基酸序列A-6-2VITTDSDGNEA-6-6NINDFDEDA-6-2和A-6-6都是來源于絲心蛋白N-末端的肽。
根據(jù)氨基酸組成，N-末端部分是非晶體部分。
接下來，合成A-6-2和A-6-6的肽(由Hokkaido系統(tǒng)科學(xué)有限公司負(fù)責(zé)承包合成)，并在培養(yǎng)3天后如上所述地測定合成肽的生理活性，證實(shí)這些肽和絲蛋白提取物一樣顯示出細(xì)胞生長促進(jìn)作用。
另外，混和合成的A-6-2和A-6-6肽后，其細(xì)胞生長促進(jìn)作用更優(yōu)于每個(gè)肽各自進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
合成肽的細(xì)胞生長率合成肽(由Hokkaido系統(tǒng)科學(xué)有限公司負(fù)責(zé)承包合成)衍生自基于家蠶絲心蛋白H-鏈和天蠶絲心蛋白的氨基酸序列上的總共12個(gè)位點(diǎn)，測定它們的細(xì)胞活性。
(1)肽的合成從家蠶絲心蛋白中挑選來源于晶體部分2個(gè)位點(diǎn)的部分肽(SfHC-1，SfHC-2)和來源于非晶體部分2個(gè)位點(diǎn)的部分肽(SfHE，SfHA)，并合成它們。
進(jìn)一步，從天蠶絲心蛋白中挑選晶體部分的Ala(A)重復(fù)位點(diǎn)(AfH0)和非晶體部分的7個(gè)部分肽(AfH1至AfH7)，并合成它們。
源于家蠶絲心蛋白H-鏈的部分肽有4種，源于天蠶絲心蛋白的部分肽有8種(AfH0至AfH7)。這些肽的每個(gè)氨基酸序列如下所示。
源于家蠶絲心蛋白H-鏈的部分肽(4種)SfHC-1 GAGAGSGAGAGSGAGAGYGAGYSfHC-2 GAGAGSGAASGAGAGAGAGAGTSfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNSfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT源于天蠶絲心蛋白的部分肽(八種)AfH 0 AAAAAAAAAA
AfH 1 YGWGDGGYGSDSAfH 2 SGAGGSGGYGGYGSDSAfH 3 GSGAGGRGDGGYGSGSSAfH 4 RRAGHDRAAGSAfH 5 DEYVDNAfH 6 VETIVLEEDPYGHEDIYEEDAfH 7 DDGFVLDGGYDSE(2)合成肽涂布于培養(yǎng)皿中約1mg的每種合成肽溶解于200.1 PBS中。溶解的肽溶液用70％乙醇稀釋到0.025％和0.0025％的濃度，并把1ml每種溶液加入培養(yǎng)皿并干燥。
SfHC-1、SfHC-2和SfHE難溶，因此加入1ml 9M LiSCN溶解。
溶解的溶液裝入半透膜管，用100個(gè)體積的水透析，每30分鐘換掉外面的水，然后通過275nm處的吸收值確定蛋白質(zhì)的量。
SfHC-2沒有酪氨酸以及類似物，因此不可能測定其吸收值。由于SfHC-1和SfHE在它們?nèi)芙馇昂髱缀跤邢嗤牧浚约僭O(shè)SfHC-2也有相同的量，并與其他肽所用的相同方法用70％乙醇稀釋，裝入培養(yǎng)皿并干燥。
進(jìn)一步，AfH0也難溶并似乎由于其小分子量而會在透析中損失掉，因此在用70％乙醇稀釋后通過充分?jǐn)嚢枋怪芙?，裝入培養(yǎng)皿并干燥。
(3)細(xì)胞培養(yǎng)使用的細(xì)胞是人皮膚成纖維細(xì)胞(源于成人的正常皮膚)，購(冷凍)于Sanko Junyaku有限公司。
使用的培養(yǎng)基質(zhì)是用于人皮膚成纖維細(xì)胞生長的低血清培養(yǎng)基質(zhì)，購于Kurabo工業(yè)有限公司。
每個(gè)培養(yǎng)皿加入培養(yǎng)基質(zhì)2ml，接種大約80,000個(gè)細(xì)胞并培養(yǎng)3天。
然后，加入0.1ml Alamer藍(lán)(Iwaki Glass公司)，于37攝氏度培養(yǎng)2小時(shí)，減少的Alamer藍(lán)的量與活細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，減少的量是從在570nm和600nm處吸收值計(jì)算出來的這些細(xì)胞培養(yǎng)的測定方法與實(shí)施例1中的相同。
其結(jié)果示于表4和5。
對于來自家蠶的絲心蛋白來說，非晶體部分的部分肽、SfHE和SfHA比起晶體部分的部分肽、SfHC-1和SfHC-2有著更高的生長率，并顯示出高于對照值2倍以上，表明非晶體部分的部分肽或它們的混合物是SDFGP。
AfH0中幾乎沒有活性，AfH0是來自天蠶絲心蛋白晶體部分的部分肽，而且其較高濃度(0.025％)會導(dǎo)致較低的生長率，暗示了其細(xì)胞生長的抑制作用。
合成的非晶體部分的部分肽，AfH1至AfH7，顯示出生長率存在差異的促細(xì)胞生長作用。
例如，AfH3和AfH6都分別含有一個(gè)堿性氨基酸殘基。由于AfH3含有較少的酸性氨基酸殘基，而AfH6含有較多的酸性氨基酸殘基，因而AfH6顯示出更高的細(xì)胞生長促進(jìn)作用。
特別地，AfH1，AfH5，AfH6和AfH7顯示出極好的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，而它們都是通過合成獲得的SDFGP。
如表5所示，并非所有衍生自非晶體部分的部分肽都成為有著高生長率的SDFGP。
如表6所示，這歸因于構(gòu)成每個(gè)肽的氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異。
合成肽的細(xì)胞生長活性基于實(shí)施例1至3的結(jié)果，合成肽(由Hokkaido系統(tǒng)科學(xué)有限公司負(fù)責(zé)承包合成)具有酸性氨基酸和極性不帶電荷的氨基酸，當(dāng)測定主要成分的促成纖維細(xì)胞生長活性時(shí)，這些合成肽被認(rèn)為能顯示出細(xì)胞生長活性。
細(xì)胞生長活性的測定用類似于[實(shí)施例1]中的方法進(jìn)行。
細(xì)胞培養(yǎng)3天，用肽濃度為0.025.g/cm2獲得的結(jié)果示于表7。
對于谷氨酸來說，四個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的殘基對細(xì)胞生長活性極好。
合成肽對細(xì)胞粘附和增殖的促進(jìn)作用源于絲蛋白的合成肽、主要具有酸性氨基酸或極性不帶電荷的氨基酸的合成肽等，它們的細(xì)胞生長活性進(jìn)一步分成細(xì)胞粘附和細(xì)胞增殖來具體測定。
該方法部分不同于[實(shí)施例1](3)中的細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
在當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)中，使用的細(xì)胞是人皮膚成纖維細(xì)胞(源于成人的正常皮膚)，購(冷凍)于Sanko Junyaku有限公司。
使用的培養(yǎng)基質(zhì)是用于人皮膚成纖維細(xì)胞生長的低血清培養(yǎng)基質(zhì)，購于Kurabo工業(yè)有限公司。[106S培養(yǎng)基質(zhì)500ml]。
106S培養(yǎng)基質(zhì)是皮膚成纖維細(xì)胞的基本培養(yǎng)基質(zhì)。
LSGS(低血清生長補(bǔ)充劑)不在此使用。
在粘附作用的測定中，在向培養(yǎng)基質(zhì)接種細(xì)胞后的5小時(shí)去除浮在培養(yǎng)基質(zhì)中的細(xì)胞，測定粘附在培養(yǎng)皿底部的活細(xì)胞數(shù)。
在增殖作用的測定中，測定向培養(yǎng)基質(zhì)接種細(xì)胞后3天的活細(xì)胞數(shù)。
除了細(xì)胞培養(yǎng)方法之外，在細(xì)胞培養(yǎng)皿上涂布肽、用Alamer藍(lán)染料測定活細(xì)胞數(shù)等都按照[實(shí)施例1]中所述的方法進(jìn)行。
粘附作用和增殖作用所得到的結(jié)果分別示于表8和9，結(jié)果是與培養(yǎng)皿中不涂布肽的對照的活細(xì)胞數(shù)相比較而得出的。
也就是說，表8顯示了在涂有各種肽的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞5小時(shí)后的粘附情況。
此處，合成肽用標(biāo)號或氨基酸序列來表示。
在此情況中，涂布于培養(yǎng)皿上的每種肽的濃度是0.025.g/cm2。
其中未涂有肽的粘附率(％)設(shè)成100。
表9顯示了在涂有各種肽的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞3天后的增殖情況。
此處，合成肽用標(biāo)號或氨基酸序列來表示。
在此情況中，涂布于培養(yǎng)皿上的每種肽的濃度是0.025.g/cm2。
其中未涂有肽的粘附率(％)設(shè)成100。
應(yīng)當(dāng)注意的是，對照中的活細(xì)胞數(shù)在3天的培養(yǎng)過程中增加了約150％，對照的值(100％)是基于培養(yǎng)3天后的活細(xì)胞數(shù)得出的。
因此，當(dāng)培養(yǎng)3天后細(xì)胞數(shù)既沒有增加也沒有減少時(shí)，生長率會變成約70％。
在涂有晶體部分和非晶體部分的培養(yǎng)皿中人皮膚成纖維細(xì)胞的生長率

(*標(biāo)準(zhǔn)差)[表2]在涂有來自非晶體部分的肽片段的培養(yǎng)皿中人皮膚成纖維細(xì)胞的生長情況

(*標(biāo)準(zhǔn)差)[表3]在涂有得自肽鏈(表2，A-6)的5個(gè)片段的培養(yǎng)皿中的人皮膚成纖維細(xì)胞的生長率

(*標(biāo)準(zhǔn)差) 在涂有合成的家蠶絲心蛋白部分肽的培養(yǎng)皿中的人皮膚成纖維細(xì)胞的生長情況

(*標(biāo)準(zhǔn)差)[表5]在涂有合成的天蠶絲心蛋白部分肽的培養(yǎng)皿中的人皮膚成纖維細(xì)胞的生長情況


(*標(biāo)準(zhǔn)差)[表6]構(gòu)成合成肽的每個(gè)氨基酸基團(tuán)的百分比和細(xì)胞生長率(表4和5中的細(xì)胞生長率是在較高肽濃度(0.025％)下獲得的值)
合成肽的細(xì)胞生長活性
5小時(shí)培養(yǎng)后在涂有每種肽的培養(yǎng)皿中的人皮膚成纖維細(xì)胞的粘附情況
培養(yǎng)3天后在涂有每種肽的培養(yǎng)皿中的人皮膚成纖維細(xì)胞的生長情況

權(quán)利要求
1.對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽組合物，包含一個(gè)或多個(gè)肽鏈的部分肽，所述肽鏈選自形成絲蛋白非結(jié)晶部分的肽鏈，所述部分肽具有由四至四十個(gè)氨基酸殘基所形成的特定氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽組合物，其中具有特定氨基酸序列的肽鏈具有以下氨基酸序列(1)至(8)中任意的氨基酸序列(1)VITTDSDGNE(2)NINDFDED(3)AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)YGWGDGGYGSDS(6)DEYVDN(7)VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)DDGFVLDGGYDSE
3.對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽，包含以下氨基酸序列(1)至(8)中的任意序列(1)VITTDSDGNE(2)NINDFDED(3)AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)YGWGDGGYGSDS(6)DEYVDN(7)VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)DDGFVLDGGYDSE
4.一種分離并獲得對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽的方法，其通過水解來自家蠶的未降解絲蛋白或來自屬于半目大蠶蛾屬的野生蠶的未降解蠶絲的絲心蛋白，然后按分子量分級分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的分離并獲得對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽的方法，其中水解是通過使用稀酸，羥胺或蛋白酶而進(jìn)行的。
6.一種包含如權(quán)利要求1和2的肽組合物的促細(xì)胞生長劑。
7.一種包含如權(quán)利要求3的肽的促細(xì)胞生長劑。
8.一種包含如權(quán)利要求1和2的肽組合物的細(xì)胞粘附劑。
9.一種包含如權(quán)利要求3的肽的細(xì)胞粘附劑。
10.一種包含如權(quán)利要求1和2的肽組合物的促傷口愈合劑。
11.一種包含如權(quán)利要求3的肽的促傷口愈合劑。
12.一種包含如權(quán)利要求1和2的肽組合物的化妝品材料。
13.一種包含如權(quán)利要求3的肽的化妝品材料。
14.一種包含如權(quán)利要求1和2的肽組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
15.一種包含如權(quán)利要求3的肽的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
全文摘要
目的是要獲得由于其低分子量從而在安全性、穩(wěn)定性和促細(xì)胞生長作用方面極好的肽，其不同于由異常細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生的細(xì)胞生長因子。對于促進(jìn)細(xì)胞生長極好的肽組合物包含一個(gè)或多個(gè)肽鏈的部分肽，所述肽鏈選自形成構(gòu)成絲蛋白的非結(jié)晶部分的肽鏈，所述部分肽具有由四至四十個(gè)氨基酸殘基所形成的特定氨基酸序列。本發(fā)明成功地提供了對于細(xì)胞生長極好的新型的肽，其具有分子量不大于10,000，優(yōu)選在4,000至400范圍內(nèi)的特定氨基酸序列，其既可通過從絲蛋白的非晶體部分分離和分級分離肽，也可通過合成類似于這樣的肽的肽來獲得。這些肽可以用作生物材料，例如，細(xì)胞粘附劑，促細(xì)胞生長劑，傷口促愈合劑，皮膚養(yǎng)護(hù)材料，如化妝品等，以及細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。
文檔編號C07K14/435GK1535723SQ20041003524
公開日2004年10月13日 申請日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月28日
發(fā)明者坪內(nèi) 三, 坪內(nèi)纮三, 山田弘生, 生 申請人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所