專利名稱：新的類似微型反向重復轉座元件(mite)的轉座元件和轉錄活化元件的制作方法
技術領域：
本發(fā)明相關于新型植物來源的轉座元件，更具體的，相關于一個MITE(微型反向重復轉座元件)類似序列。更具體的，本發(fā)明相關于分離自胡蘿卜(Daucus cartota)的新型轉座元件。
本發(fā)明進一步相關于包含轉座元件的新型轉錄活化元件。更具體的，當與本發(fā)明相關的轉錄元件被插入到一個基因中時，能夠促進周圍或其插入位點附近的基因的轉錄，或者抑制所述基因轉錄的被滅活。本發(fā)明更進一步相關于包含所述轉錄活化元件的轉基因植物。
背景技術：
在幾乎所有的生物體的基因組中都能夠發(fā)現(xiàn)轉座元件，在原核生物與真核生物之間或動物與植物之間毫無例外的都存在著?，F(xiàn)在已經(jīng)知道這些轉座元件能夠從一個基因組的基因中轉移到另一個之中，并能夠使得插入該元件的序列的上游或下游的基因組基因失去活性。此外，已經(jīng)表明除了這種活性，轉座元件導致不同類型的基因組重排(缺失，倒轉，重復等)；并已有報道表明上述事實導致基因組可塑性，這對于生物體的進化十分重要，并且更具體的，這些轉座元件在生物體適應環(huán)境中基因組壓力的進化中扮演重要的角色(McClintock，Science26792-801(1984)；Arber et al.，F(xiàn)EMS Microb.Ecol.，155-14(1994))。
轉座元件被粗略的分為三類DNA型(轉座子和插入序列)，RNA型(逆轉座子)(Berg et al.(ed.)，Mobile DNA(1989))，和不屬于上述兩種的微型反向重復轉座元件(MITE)(Wessler et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))。
對于其中的DNA型和RNA型轉座元件，它們在基因組中的實際轉座反應已經(jīng)確定，而對于MITE，盡管它們與DNA型轉座元件非常相似，但還沒有報道作為它們在基因組中轉座的證明。
大多數(shù)MITE都是通過計算機檢索，從正在進行的基因組計劃所闡明的不同生物體基因組基因的核酸序列數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的。第一個發(fā)現(xiàn)是由Bureau et al.(Bureau et al.，Plant Cell41283-1294(1992))于1992年發(fā)現(xiàn)的Tourist家族。從此，在不同的植物和昆蟲以及動物基因組中都發(fā)現(xiàn)不同的MITE。
通常，MITE被定義為具有如下特征(1)在其5＇-和3＇-末端具有完全或者非完全反向倒轉重復序列(這一點與DNA型轉座元件相似)，(2)在反向重復序列的兩個末端出現(xiàn)類似目標復制序列，一段包含兩個或更多核苷酸的序列，類似于DNA型轉座元件插入到基因組DNA中所形成的，以及(3)它們通常大小為小于2kb(Wessleret al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))。
至于那些如同DNA型轉座元件一樣，在其末端反向重復序列之間具有編碼轉座酶的開放閱讀框的MITE，已知只有在真菌和動物中發(fā)現(xiàn)的IS630-Tcl/Mariner家族(Kachroo et al.，Mol.Gen.Genet.245339-348(1994)；Smit et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931443-1448(1996))。但是，對于植物來源的MITE，還未發(fā)現(xiàn)有這種編碼轉座酶的開放閱讀框。所以，關于植物MITE的轉座機制和其作用還有很多點尚不清楚。
附帶的，在高等生物體的基因操縱中進行的基因轉移試驗多數(shù)為核基因組插入類型。這是因為在高等生物體中沒有類似于原核生物中質粒的物質。
對于這種插入到核基因組中的基因轉移，可以使用物理方法包括基因槍，脂質體或電穿孔技術將偶聯(lián)用于插入到高等生物體核基因組中的目的基因的載體轉入，以及使用生物方法包括將如前所述的包含基因的載體轉入到病毒或微生物體中，利用所述病毒或微生物體所具有的DNA轉移/插入系統(tǒng)將基因轉入到高等生物體的核基因組中。
但是，這些物理和生物方法都存在問題，因為插入到高等生物體中的基因的表達活性在不同的個體中是不同的，因此并不穩(wěn)定。在許多例子中，這是由位置效應所引起的基因沉默所造成的(Peach et al.，Plant Mol.Biol.1746-60(1991))。這種位置效應是在酵母以及其它許多真核生物中都能夠發(fā)現(xiàn)的一種現(xiàn)象，而且已知在插入的基因本身的核苷酸序列沒有變化，表達活性的變化主要依賴于所述基因在染色體上插入位點的變化，在某些例子中，基因的表達被完全滅活(基因沉默)(Molecular Biology of the Cell，3rd edition，434-435(1995))。
假定造成基因沉默這種現(xiàn)象是由于所有在真核生物體中的基因都不是均一轉錄的，并且在核基因組中基因被轉錄的活性位點和基因沉默的隱藏位點是相互交織的。已經(jīng)知到由于對于轉錄所必需的蛋白不能接觸到基因，或者由于該位點基因組DNA的甲基化所造成的核小體結構變化或異染色質化，插入到隱藏位點的基因根本不能被轉錄，結果發(fā)生基因表達的滅活(基因沉默)(Ng et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.，9158-163(1999)；Matzke et al.，Curr.Opin.Plant Biol.1142-148(1999))。
進一步了解到，即使在同一生物體中，如同哺乳動物的X染色體可見一樣，基因沉默還依賴于細胞分化的時期。而且，已知由當前尚未知的機制造成的基因沉默一旦發(fā)生，能夠通過交配由其后代繼承(Molecular Biology of the Cell，3rd edition，434-453(1995))。
同時，在基因操作中，目的基因(外源基因)通過物理或生物方法(除了用于基因敲除的同源重組方法)被轉入到高等生物體中，基因在細胞核基因組中的插入位點在不同細胞中是不同的而且?guī)缀醪豢赡苋藶榭刂啤Ｒ虼?，外源基因轉入到高等生物中以不確定的方式導致包含外源基因在活性位點的細胞或包含外源基因在隱藏位點的細胞的形成。
在植物中，已知當外源基因被轉入到隱藏位點，會受到隱藏位點的影響，導致外源基因的表達顯著減小或者接近于零；而且也知道即使外源基因被插入到活性位點，外源基因的表達也會隨著重復的細胞分裂造成的生長過程產(chǎn)生的基因沉默而變得不穩(wěn)定并減小(Peach et al.，Plant Mol.Biol.1746-60(1991))。
所假定的外源基因表達滅活的一個主要原因是染色體上核DNA結構。參與核DNA結構的一個元件為MAR(基質結合區(qū))，也被稱為SAR(腳手架結合區(qū))序列。其被發(fā)現(xiàn)為一種將核基因組DNA錨定于核基質的序列。在動物中，已經(jīng)表明在基因轉移后，當包含MAR的雞A元件被連接到外源基因上時，插入的基因的表達上升(Stief et al.，Nature341；343-345(1989))。但是，后續(xù)的研究表明MAR對基因表達的增加有效，但是其單獨使用并不能抵消位置效應(Bonifer et al.，Nculeic Acids Res.224202-4210(1994)；Poljak et al.，Nucleic Acids Res.224386-4394(1994))。在植物中，用轉化株研究MAR的效應。但是，至今還未得到任何可重復的結果?，F(xiàn)在認為單獨用MAR不能抵消位置效應(MeshiShokubutsu no Genome Science(Genome Science ofPlants)，153-160(1996)，published by Shujunsha)。
目前，遺傳修飾的植物已經(jīng)被用作遺傳修飾的食品。但是，在發(fā)展基因食品中待解決的最重要的問題是上述的會導致外源基因表達滅活的基因沉默現(xiàn)象。為避免基因沉默現(xiàn)象，從大量其外源基因插入位點盡可能的少的發(fā)生基因沉默的植物個體中以及即使經(jīng)過很多年的傳代也不會發(fā)生基因沉默的植物個體中進行選擇對于發(fā)展基因修飾的植物是必需的。對于這種選擇，必須培養(yǎng)大量的植物個體并且要重復很多代，因此不但需要大量的人力和時間還需要大量的土地，也即會發(fā)生土壤面積問題。
因此，找到另一種避免基因沉默的策略在植物的基因工程中是一個迫切并非常重要的問題，要發(fā)展一種抑制由基因沉默造成的位置效應或者活化插入的外源基因轉錄的方法，更具體的為發(fā)展具有這種效應的“轉錄活化元件”。
發(fā)明公開如上文所述，植物MITE的功能還有許多點尚不清楚。關于MITE的功能，基于研究發(fā)現(xiàn)MITE經(jīng)常出現(xiàn)在不同基因的啟動子的上游(Wessler et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))推測其可能對基因表達的活化其作用。而且，因為發(fā)現(xiàn)大量的MITE經(jīng)常出現(xiàn)在基質結合區(qū)(MAR)(Avramova et al.，Nucleic Acids Res.26761-767(1998))，推測它們與基因組結構相關。
因此，從闡明還未經(jīng)充分研究的基因組結構和基因表達關系的科研角度來說，MITE是非常令人感興趣的轉座元件(插入元件)?？紤]到MITE的可能性，當在基因組基因間進行轉座后整合到基因組結構中時，能夠改變基因組結構并且控制基因表達，可以預期它們能夠在外源基因插入情況中作為穩(wěn)定或阻止基因表達活性滅活的因子。
因此，一方面本發(fā)明的目的是提供新型植物來源的MITE類似元件，以及如上所述的科研和工業(yè)用途。
具體的，本發(fā)明首先相關于如下1到5所述的新型MITE類似的元件(下文中為方便起見這種MITE類似元件有時被稱為“IS2元件”)1.一種能夠導致靶序列重復的MITE類似元件(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]；2.如上述1所定義的MITE類似元件，在其5＇和3＇末端各有完全或不完全末端倒轉重復序列；3.如上述1或2所定義的MITE類似元件，其包括核苷酸序列中至少一個具有一種以上的副本，如下述公式所代表(1)XttgcaaY(其中X代表g或t，Y代表a或c)，或公式(2)Zatgcaa(其中Z代表t或a)；4.如上述1到3中任一所定義的MITE類似元件，其末端反向重復序列包括如SEQ ID NO10所出示的核酸序列為其5＇末端，以及如SEQ ID NO11所出示的核酸序列為其3＇末端；5.包括如SEQ ID NO1所示核酸序列的MITE類似元件；本發(fā)明進一步相關于如下6和7所述新型MITE類似元件(下文中，為方便起見這種MITE類似元件被稱為“IS1元件”)6.MITE類似元件的末端反向重復序列包括如SEQ ID NO12所出示的核酸序列為其5＇末端，以及如SEQ ID NO13所出示的核酸序列為其3＇末端，并且其能夠導致靶序列TA的重復；7.包括如SEQ ID NO2所示核酸序列的MITE類似元件第二方面，本發(fā)明的目的是提供“轉錄活化因子”，其能夠抑制由位置效應引起的被稱為基因沉默的基因活化現(xiàn)象，或者能夠激活其附近或邊緣區(qū)的基因轉錄。
具體的。本發(fā)明相關于如下8到12中所述的轉錄活化因子8.包含至少一個轉座元件的轉錄活化因子；9.如8中所定義的轉錄活化因子，其中的轉座元件為MITE類似元件；10.如9中所定義的轉錄活化因子，其中的轉座元件包括的MITE類似元件包含如下的DNA(a)或DNA(b)(a)具有如SEQ ID NO1所示核酸序列的DNA；(b)能夠與上面核酸序列(a)在嚴謹條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]重復的MITE類似元件；和/或包含如下面DNA(c)或(d)的MITE類似元件(c)具有如SEQ ID NO2所示核酸序列的DNA；(d)能夠與上面核酸序列(c)在嚴謹條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點的TA重復的MITE類似元件。
11.如9中所定義的的轉錄活化元件，其中的轉座元件為串聯(lián)偶聯(lián)產(chǎn)物，其來自于包含如下DNA(a)或(b)的MITE類似元件(a)具有如SEQ ID NO1所示核酸序列的DNA；(b)能夠與上面核酸序列(a)在嚴謹條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]重復的MITE類似元件；和/或包含如下面DNA(c)或(d)的MITE類似元件(c)具有如SEQ ID NO2所示核酸序列的DNA；(d)能夠與上面核酸序列(c)在嚴謹條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點的TA重復的MITE類似元件。
12.轉錄活化元件包括具有如SEQ ID NO3所示核酸序列的DNA；本發(fā)明進一步相關于被引入的外源基因表達盒，其包括如上所述的轉錄活化元件。具體的，如下面13到15所述的表達盒13.用于植物中的基因表達盒包括如上面8到12中任一條所定義的轉錄活化元件，和一段DNA序列可操縱地連接到所述的因子上；14.如上面13中所定義的被插入的基因表達盒，其中的DNA序列被可操縱地連接到包含啟動子和/或中止子的轉錄活化元件；15.如上面14中所定義的被插入的基因表達盒，其中進一步包括DNA序列可操縱地連接到轉錄活化元件上，插入的目的基因序列得到表達。
本發(fā)明進一步相關于包含上述轉錄活化元件的質粒(例如作為插入的外源基因表達盒)以及包含利用所述質粒引入轉錄活化元件的轉基因植物。
附圖簡述

圖1表示相應于本發(fā)明中MITE類似元件的IS2元件的結構。
圖2表示相應于本發(fā)明中MITE類似元件的IS1元件的結構，以及其末端反向重復序列和其被插入的重復序列(劃線的部分中的TA)。
圖3為構建gDCPAL3-pro/SK方法的示意圖。
圖4為胡蘿卜PAL基因gDCPAL3和gDCPAL4的比較示意圖。
圖5為本發(fā)明中的MITE類似元件(IS1元件)的核酸序列和已知為Stowaway家族(Bureau and Wessler，Plant Cell，6907-917(1994))的比較示意圖。黑色背景中白色字母所指示的序列為表現(xiàn)出同源性的末端倒轉重復序列。
圖6作為本發(fā)明中MITE類似元件的IS2元件末端所發(fā)現(xiàn)的不完全重復序列和靶重復序列(劃線的部分中的AAAAGAAAA)。
圖7為構建IS1-35S/SK方法的示意圖。
圖8為構建IS2-35S/SK方法的示意圖。
圖9為構建IS12-35S/SK方法的示意圖。
圖10為構建MU3-35S/SK方法的示意圖。
圖11為構建pIS1-35S/AB35S，pIS2-35S/AB35S，pIS12-35S/AB35S和pMU3-35S/AB35S方法的示意圖。
圖12表示了實施例3(1)的結果，在包含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉化有pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)，pIS12-35S/AB35S(IS12)和pAB35S(35S)(對照)煙草BY-2細胞中，對新生的愈傷組織的數(shù)目進行了比較。圖中上面和下面的圖分別表示了用包含100μg/ml和300μg/ml卡那霉素的選擇培養(yǎng)基獲得的結果。
圖13表示實施例3(2)的結果，對引入pAB35S(35S)形成的煙草愈傷組織(對照)(左圖)和引入pIS12-35S/AB35S(IS12)形成的煙草愈傷組織(右圖)的GUS活性進行了比較。
實現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式I.新型MITE類似元件已發(fā)現(xiàn)的MITE不只包括如上所述的Tourist和Stiwaway家族，還包括Castaway，Crackle，Emigrant，Explorer，Ditto，Gaijin，Krispie，Pop，Snap，Wanderer，Wujin，Wukong，Wuneng和Xbr家族。當MITE在其末端區(qū)具有完全或非完全反向重復序列的結構特征時，反向重復序列在MITE的核酸序列和長度上有很大的不同。而且，在MITE中靶重復序列為對于Tourist為TAA，對于Stowaway為TA，對于Castaway為TAA，對于Crackle為GTTGATAT，對于Ditto為TTA，對于Emigrant為TA，對于Gaijin為ATT或TAG或TGA或GGT或GTT或GAA，對于Krispie為TTGAAC，對于Pop為AAAACAAA或AAAAAAAA，對于Snap為TTTTTTT，對于Wanderer為TTA或TAA，對于Wujin為TA或CATA，對于Wukong為TATA或TACA，對于Wuneng為TTAA或TTAT，對于Xbr為TTAA，(任何明確的靶重復序列都未在Explorer中發(fā)現(xiàn))(Bureau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938524-8529(1996)；Casacuberta et al.，Plant J.，1679-85(1998)；Song et al.，Mol.Gen.Genet.，258449-456(1998)；Tu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，947475-7480(1997)；Unsal and Morgan，J.Mol.Biol.，248812-823(1995))。
另一方面，IS2元件作為上述本發(fā)明中的新型MITE類似元件的一個具體體現(xiàn)，其具有(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]作為其靶重復序列，這在已知的任何MITE中(插入元件)都未曾發(fā)現(xiàn)。從這個角度，IS2元件可以被稱為不同于任何已知家族的屬于新家族的插入元件。
關于IS1元件，其作為本發(fā)明中的新型MITE類似元件的一個具體體現(xiàn)，具有TA作為靶重復序列，因此可以被稱為屬于已知Stowaway家族的新型MITE類似元件(Bureau，T.E.and Wessler，S.R.，Stowawaya new family of inverted repeat elements associated with the genes of bothmonocotyledonous and dicotyledonous plants.Plant Cell，6907-16(1994))。
下文中，描述了這些IS2和IS1元件。
1.IS2元件IS2元件的特征為能夠在插入位點的基因組基因中造成(A)nG(A)n的靶重復。數(shù)字n為不小于1的整數(shù)。當沒有特別限制時，其具體的為如2到6，優(yōu)選的為3到5，更加優(yōu)選的為4。
更具體的，本發(fā)明中的MITE類似元件為一類大小不超過2kb的DNA，優(yōu)選的為0.2到2kb，在其5＇和3＇末端區(qū)域具有相互方向相反的重復序列(末端反向重復序列)。
從這個觀點，本發(fā)明中的IS2元件符合上述的MITE的三點特征的要求(Wessler et al.Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))，也即(1)在5＇和3＇末端具有完全或不完全反向重復序列；(2)在基因插入位點兩端的反向重復序列的相同方向中發(fā)現(xiàn)重復序列包括兩個或更多個堿基對作為靶重復序列；(3)它們的大小不超過2kb；因此能夠被證實為具有MITE類似序列的轉座元件(插入元件，MITE類似元件)。
本發(fā)明的IS2元件結構特征為在其核酸序列中包含至少一個如下述公式所表示的核酸序列(1)XttgcaaY(其中X代表g或t，Y代表a或c)(SEQ ID NO4 to 7)或公式(2)Zatgcaa(其中Z代表t或a)(SEQID NO8 to 9)，都是以連續(xù)或不連續(xù)重復方式。
這種重復序列的位置和數(shù)目沒有特別的限制，而且它們可以包含在出現(xiàn)在IS2元件兩個末端的末端反向重復序列中，或者在所述的末端反向重復序列之間的中間區(qū)域中。
本發(fā)明中的IS2元件具體的包括在末端重復序列之間的中間序列中的如上述公式(1)和(2)所代表的復數(shù)形式重復序列，以及在末端反向重復序列中如公式(1)所代表的復數(shù)形式重復序列，如圖1所示。
本發(fā)明中的IS2元件的末端反向重復序列并不需要嚴格互補，但唯一的要求是5＇和3＇末端區(qū)能夠在嚴格的條件下相互雜交，結果，IS2元件具有如圖1所示的莖干結構。從這一角度，本發(fā)明的IS2元件不僅包括那些完全反向重復序列作為其末端反向重復序列，還包括那些不完全反向重復序列作為其末端反向重復序列。
作為相應于本發(fā)明IS2元件的具體例子，其包含的末端反向重復序列為如SEQ ID NO10所示的核酸序列在其5＇末端區(qū)域，如SEQ IDNO11所示的核酸序列在其3＇末端區(qū)域。作為IS2元件的一個更具體的例子，其具有如SEQ ID NO1所示的核酸序列。IS2可以具有一個或更多個替換，增加或缺失的核苷酸在其末端反向重復序列或出現(xiàn)在所述的重復序列之間的序列中，只要所產(chǎn)生的變體保持的功能等價物具有與IS2元件基本相同的功能或活性。本發(fā)明的MITE類似元件也包括這種功能等價物。
作為優(yōu)選的功能等價物，其具有和IS2元件基本相同的功能和活性，該IS2元件具有如SEQ ID NO1所示的核酸序列，并能造成插入位點的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]靶重復，等價物能夠在嚴謹條件下與IS2元件雜交。關于“嚴謹條件”，所述的條件為1×SSC加0.1％(w/w)SDS在50℃或更高溫度處理超過1小時的時間。關于功能等價物，更具體所述的其核酸序列與如SEQ ID NO1所示的IS2具有不低于70％，優(yōu)選的不低于85％，更優(yōu)選的不低于90％，進一步優(yōu)選的不低于95％的同源性。
2.IS1元件本發(fā)明的IS1元件使得基因組基因插入位點TA靶重復，以及特征性的具有末端反向重復序列，如SEQ ID NO12所示的核酸序列在5＇端區(qū)域，如SEQ ID NO13所示的核酸序列在3＇端區(qū)域。本發(fā)明的IS1元件具體的為具有不超過1kb大小的DNA，優(yōu)選的為100bp到500bp。根據(jù)這些事實，本發(fā)明的IS1元件可以被定義為MITE類似元件，如上述IS2元件。
關于本發(fā)明中的IS1元件，所具體提及的具有如圖2所示的結構。更具體的，所提及的具有如SEQ ID NO2示的核酸序列。具有這種核酸序列的MITE類似元件可以有一個或更多個核苷酸發(fā)生替代，增加或缺失在其末端反向重復序列或者出現(xiàn)在5＇和3＇的這些重復序列之間的序列，只要所產(chǎn)生的變體保持的功能等價物具有與IS2元件基本相同的功能或活性。本發(fā)明的MITE類似元件也包括這種功能等價物。
優(yōu)選作為功能等價物為那些基本具有如SEQ ID NO2所示核酸序列的MITE類似元件(IS1元件)的功能或活性，其核酸序列與所述的IS1具有不低于70％，優(yōu)選為不低于85％，更優(yōu)選為不低于90％，進一步優(yōu)選為不低于95％的同源性。
上文所述的MITE類似元件(IS2和IS1元件)都發(fā)現(xiàn)自胡蘿卜基因組，更具體的來自于胡蘿卜苯基丙氨酸氨裂解酶基因，如后文所述，能夠如后面實施例部分所述的被分離得到。只要具有如上文所述的結構和特征，本發(fā)明的MITE類似元件的起源沒有限制。
應指出轉座元件通常作為植物基因組自身進行自我修飾的機制，對其生物體的進化以及對環(huán)境的適應可能具有顯著作用。
關于本發(fā)明中的MITE類似元件，其相關于植物基因組自我修飾機制的功能的機制還不清楚。但是，和逆轉座子的例子不同(McDonald，BioScience40183-191(1990))，其具有增強子元件并且基因啟動子由所述元件發(fā)生轉座產(chǎn)生的所述增強子元件的插入導致的活化的事實還沒有被發(fā)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的MITE類似元件可以被認為具有很高的可能性導致插入的植物基因組的基因結構的變化，并且造成基因組結構的動態(tài)變化，例如基因組DNA或者核小體結構的不可卷繞性的變化，通過和那些已知的增強子元件非常不同的機制。
用本發(fā)明的MITE類似元件，利用上述特性，通過與已知技術不同的技術使控制位于所述元件附近的基因的表達變得可能。一般認為當外源基因被插入到基因組DNA的隱藏位點時，其表達被抑制或滅活。因此，利用本發(fā)明的MITE類似元件并基于上述特性去激活或活化通過轉基因技術被引入的外源基因的被降低或抑制的表達能力被認為是可能的。相應的，本發(fā)明的MITE類似元件對于構建轉基因表達盒和包含所述的表達盒的質粒來穩(wěn)定的產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程處理的植物是有用的，并且對利用所述表達盒和質粒穩(wěn)定的產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程處理的植物也是有用的。
II.轉錄活化元件本發(fā)明進一步相關于一種轉錄活化元件。
此處所指轉錄活化元件包括能夠促進在所述元件附近或邊緣的一組基因轉錄的元件，或能夠阻止被轉入基因組DNA的目的外源基因的抑制或抑制因位置效應產(chǎn)生基因沉默使其失活的元件。每一種已知負責轉錄活化的元件(因子)能夠活化特定基因的轉錄，通過作為增強子出現(xiàn)在所述基因啟動子的附近并且對所述啟動子直接順式作用。相反的，本發(fā)明的轉錄活化元件能夠促進位于其附近或邊緣的單一基因或一組復數(shù)形式基因的轉錄，而不論相對于啟動子的位置；而且包括那些能夠主要通過抑制轉錄滅活的遺傳現(xiàn)象來促進轉錄的元件，因此與已有的轉錄活化元件的概念相比在概念上包括更廣范圍的因子。
本發(fā)明的轉錄活化元件的特征為包含至少一個轉座元件。
在此所指的轉座元件包括所有上述DNA型和RNA型以及MITE。因此，本發(fā)明的轉錄活化元件包括前述種類中至少一種作為轉座元件，而不論其來源于同一物種或不同物種。
優(yōu)選的轉錄活化元件包含MITE作為轉座元件。
MITE按照前面所述定義為具有如下特征的元件(1)在其5＇和3＇末端區(qū)域具有完全或不完全反向重復序列(相似于DNA型轉座元件)；(2)在反向重復序列的兩端具有靶重復序列，其包含按照相同方向排列的重復序列和包含兩個或更多個堿基對，類似于DNA型轉座元件插入到基因組DNA中所形成；(3)大小通常小于2kb(Wessler et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))；任何屬于如上所定義的種類的MITE都能夠作用實現(xiàn)本發(fā)明的轉座元件。其中作為特別適合的MITE為前面所提到的本發(fā)明中的新型MITE類似元件，即“IS2元件”，“IS1元件”以及功能類似物。
因此，本發(fā)明的轉錄活化元件優(yōu)選的包含至少一種核酸序列，其選自所述IS2元件，IS1元件和功能類似物。
更具體的，本發(fā)明的轉錄活化元件包括(1)具有IS1元件或其功能類似物的核酸序列；(2)具有IS2元件或其功能類似物的核酸序列；(3)具有IS1元件或其功能類似物的核酸序列和IS2元件或其功能類似物的核酸序列串聯(lián)所產(chǎn)生的核酸序列(IS1元件和IS2元件的順序是任意的)；以及(4)具有IS1元件(或IS2元件)或其功能類似物通過任意核酸序列與IS2元件(或IS1元件)或其功能類似物相連接產(chǎn)生的核酸序列。轉錄活化因子的優(yōu)選實施例包括(i)IS2元件或其功能類似物和(ii)IS1元件(或IS2元件)或其功能類似物和IS2元件(或IS1元件)或其功能類似物前后連接的產(chǎn)物。作為后面(ii)的一個具體實施例，所提到的元件具有如SEQ ID NO3所示的核酸序列。
關于上述(4)中所提到的轉錄活化元件，在IS1元件和IS2元件之間(順序是任意的)的核酸序列并沒有特別的限制，只要不會阻礙發(fā)明所產(chǎn)生的效果，可以為任意的核酸序列。作為具體的，但并非限制性的例子，此處所提及的為來源于胡蘿卜PAL啟動子序列。通常，這種核酸序列具有5到1,000bp的大小，優(yōu)選的為300到500bp。作為這種轉錄活化元件模型的具體體現(xiàn)，此處具體的提到了具有如SEQ IDNO14所示的核酸序列的一種。
本發(fā)明的轉錄活化元件能夠可操縱地連接到轉入植物體中的目的基因序列(轉基因序列(包括外源基因序列))，以及進一步的，連接于所述轉基因的轉錄活化元件能夠可操縱地連接到功能DNA序列或如植物中作為啟動子功能和/或植物中作為增強子功能的序列上。
此處所用的術語“可操縱地連接”是指轉錄活化元件所處的位置能夠有效的接近于上述轉基因序列或各種功能DNA序列來發(fā)揮它對這些序列的影響，而不論插入位點和方向。
實際應用于本發(fā)明的轉基因包括那些需要在植物中表達的DNA，而不論其對于所述植物是同源性或異源性。這些轉基因包括，但不限于，編碼β-葡萄糖苷酸酶的基因；抗生素抗性基因；編碼殺蟲劑和殺菌劑蛋白毒素基因；抗病原復合物基因；合成高敏感性復合物基因，如過氧化物酶，葡聚糖酶，幾丁質酶和植物抗毒素；農(nóng)用化學品，除草劑和殺蟲劑抗性基因；合成植物酶的基因(如與蛋白，淀粉，糖和脂肪含量和質量相關的酶)以及編碼其調控因子的基因；相關于植物酶抑制劑的基因，如蛋白酶和淀粉酶抑制劑；涉及植物激素合成的基因；涉及昆蟲激素和信息素合成的基因；涉及藥用和營養(yǎng)的復合物，如β-胡蘿卜素和維生素；以及干擾出現(xiàn)在植物中核酸序列的反義序列(Transgenic Plant，vol.1，Academic Press，1993)。
本發(fā)明進一步相關于適合應用于植物中的基因表達盒，其包括上述轉錄活化元件和可操縱地連接于其上的DNA序列。此處所指的“基因表達盒”是指能夠被轉入到植物中的質?；蚱鋪喥巍?br> 作為可操縱地連接到轉錄活化元件上的DNA序列，包括功能性DNA序列例如啟動子和終止子。所述的DNA序列包括上面所述的任一種轉基因序列。
此處所指的啟動子表示一段DNA序列，當產(chǎn)生目的蛋白的結構基因被連接到所述啟動子的下游時，啟動子能夠通過在植物細胞中的轉錄和隨后的翻譯調控所述蛋白的表達，其還包括在植物中有功能的和用于植物轉化的相關技術領域的所有啟動子。大量的啟動子已經(jīng)應用于植物的轉化，包括如從根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)分離的啟動子，即羧乙基精氨酸合成酶(ocs)啟動子(L.Comai et al.，1985；C.Waldron et al.，1985)，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子和胭脂氨酸(nos)啟動子?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動子，其通常用于轉化，也能夠充分的用于本發(fā)明。35S啟動子的修飾形式，例如兩個并聯(lián)的35S啟動子(R.Kay et al.，1987)和mas-35S啟動子(L.Comai et al.，1990)也能夠被使用。而且，花椰菜花葉病毒19S啟動子(J.Paszkowski et al.，1984)和玄參花葉病毒來源的34S啟動子(M.Sanger et al.，1990)也能夠被應用。更多的例子還包括肌動蛋白啟動子，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位(rbcS)啟動子等植物來源的啟動子。
終止子包括能夠有效的終止植物中目的結構蛋白的轉錄的核酸序列，并包括用于植物轉化相關技術領域在植物中有功能的所有終止子。具體的，例如胭脂氨酸合成酶(nos)終止子作為典型例子。
本發(fā)明的轉錄活化元件或轉基因表達盒包含所述元件，其能夠用于誘導或調控被轉入到植物中的基因的表達，并且這通常廣泛應用于植物中。
植物包括但不限制于農(nóng)業(yè)上有用的植物，而不論其為單子葉植物或雙子葉植物。例如在單子葉植物中有玉米，稻，小麥，大麥，非洲或印度黍，燕麥，黑麥，黍和其它谷類農(nóng)作物，以及百合，蘭花，鳶尾屬植物，棕櫚，郁金香，莎草等其它不同種類的觀賞植物。雙子葉植物包括菊花，金魚草，康乃馨，木蘭，罌粟，甘藍，玫瑰，豌豆，猩猩木，棉花，仙人掌，胡蘿卜，越橘，胡椒薄荷，向日葵，西紅柿，榆樹，橡樹，楓樹，白楊，大豆，瓜類，甜菜，油菜，馬鈴薯，萵苣，番木瓜等。
本發(fā)明進一步提供了轉基因植物，其包括本發(fā)明的轉錄活化元件或者本發(fā)明的包含所述元件的轉基因表達盒，其中對于被轉入的目的外源基因由位置效應造成的基因沉默(滅活)現(xiàn)象已經(jīng)被抑制，或外源基因的轉錄已經(jīng)被活化。所述的轉基因植物包括其后代。
在此使用的“植物”這一術語是指不僅包括完全的植物體還包括植物體的一部分，例如葉子，種子，莖或切開物。其進一步包括原生質體，植物愈傷組織，分生組織和類似的植物細胞。
產(chǎn)生轉基因植物的方法沒有特別的限制，可以為任何一種常規(guī)用于相關技術領域的DNA轉移方法。具體的，為一種用包含本發(fā)明的轉錄活化元件或包含所述元件的轉基因表達盒的表達質粒將DNA轉入植物細胞的方法；還包括如已知的用土壤桿菌，電學方法(電穿孔)和基因槍方法。
所得到的植物細胞包含本發(fā)明的轉錄活化元件，所述元件的轉基因表達盒，或者表達質粒，該細胞能夠用所描述的植物組織培養(yǎng)技術中的常規(guī)方法進行復制，例如S.B.Gelvin，R.A.Schilperoot and D.P.S.VermaPlant Molecular Biology Manual(1991)，Kluwer AcademicPublishers or Valvekens et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，855536-5540(1988)，可以得到來源于所述植物細胞的植物體或其部分。
本發(fā)明的表達質?？梢詾槿魏我环N，只要它包括要被插入目的DNA序列(轉基因)以及轉錄活化元件和功能性DNA序列例如啟動子和終止子。但優(yōu)選的這些DNA序列被可操縱的相互連接。術語“可操縱地連接”是指質粒具有達到預期目的的功能。具體的，當所討論的質粒被引入到植物細胞中時，目的轉基因(結構基因)在轉錄活化元件的控制下進行表達并且表達能夠被終止子有效的終止，在所述的質粒中不存在啟動子的滅活。
本發(fā)明進一步包括能夠使轉基因在植物中表達的方法。這種方法的實現(xiàn)至少如上文所述的通過將整合著外源基因的轉基因表達盒轉入到植物中的步驟，以及使所述轉基因在所述植物中表達的步驟。將轉基因表達盒(DNA)轉入到植物中以及所述轉基因的表達能夠通過本領域已知的技術來實施(Plant Molecular Biology Manual，1991，KluwerAcademic Publishers)。
實施例下面的實施例進一步詳細的闡明了本發(fā)明。但并不意味著它們是對本發(fā)明范圍的限制。實施于本發(fā)明的遺傳工程技術和分子生物學試驗程序(限制酶切處理條件，連接反應條件，大腸桿菌的轉化等)能夠被常規(guī)并廣泛的應用，例如J.Sambrook，E.F.Frisch，T.ManiatisMolecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and D.M.GloverDNA Cloning，IRL Press，1985中所描述的。
實施例1
1)靶植物，靶基因為尋找MITE類似元件，胡蘿卜(DaucuscarotaL.cv.Kurodagosun)作為靶植物，所述胡蘿卜中苯基丙氨酸氨裂解酶(PAL)的基因作為靶基因。
2)胡蘿卜PAL基因gDCPAL3和gDCPAL4的克隆從胡蘿卜基因組文庫中克隆得到胡蘿卜基因組序列。按照如發(fā)明人以前所描述的(Ozeki，Y.，Davies，E.and Takeda，J.Structure andexpression of chalcone synthase gene in carrot suspension cultured cellsregulated by 2，4-D.Plant Cell Physiol.，341029-1037(1993))，用λEMBL3質粒(Toyobo的產(chǎn)品)從培養(yǎng)的胡蘿卜細胞中(Ozaki，Y.andKomamine，A.Induction of anthocyanin synthesis in relation toembryogenesis in a carrot suspension culture；Correlation of metabolicdifferentiation with morphological differentiation.Physiol.Plantarum，53570-577(1981))構建胡蘿卜基因組文庫。
具體的，按照Murray和Thompson(1980)的方法(Murray，M.G.and Thompson，W.F.；Rapid isolation of high molecular weight plantDNA.Nucl.Acids Res.84321-4325(1980))用溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)溶液從凍干的胡蘿卜中制備胡蘿卜基因組DNA。所得到的基因組DNA用Sau3AI部分酶切，酶切得到的DNA片段用蔗糖密度梯度方法根據(jù)大小使其分開。收集15到20kb的DNA片段并將其連接到經(jīng)BamHI酶切的λEMBL3載體上，隨后用噬菌體顆粒包裝從而構建了胡蘿卜核酸文庫。
然后，，按照Ozeki et al.的方法(Ozeki，Y.，Matsui，K.，Sakuta，M.，Matsuoka，M.，Ohashi，Y.，Kano-Murakami，Y.，Yamamoto，N，and Tanaka，Y.Differential regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes duringanthocyanin synthesis and by transfer effect in carrot cell suspensioncultures.Physiol.Plantarum，80379-387(1990))使用PAL cDNA(ANT-PAL cDNA)作為克隆探針，從胡蘿卜基因組文庫中篩選(Sambrook et al.，1989)PAL的基因組克隆。用于篩選胡蘿卜基因組文庫的雜交反應于68℃經(jīng)過夜處理，使用的溶液包含6×SSC，60mM磷酸鈉(pH6.8)，10mM EDTA，1％SDS，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％Ficoll 400和100μg/ml變性鮭精DNA。膜在室溫下在包含0.5％SDS的2×SSC溶液中清洗兩次(15分鐘×2)，在室溫下在包含0.1％SDS的0.1×SSC或1×SSC溶液中清洗兩次(10分鐘×2)，最后，在68℃在0.1×SSC溶液中清洗兩次(30分鐘×2)。
結果，得到8個陽性克隆。制備這些克隆的限制性酶譜，并根據(jù)酶譜，克隆鑒別為兩個基因，分別命名為gDCPAL3和gDCPAL4。
用gDCPAL3，培養(yǎng)陽性克隆的λ噬菌體，提取λDNA，用BamHI酶切，并根據(jù)Sambrook et al.(1989)等所描述的Southern方法轉移到尼龍膜上。然后，從上述ANT-PAL cDNA經(jīng)EcoRI酶切并在所得到的DNA片段(984bp)的5＇端標記[32P]，其作為探針進行Southern分析，得到與上述探針雜交的2.77kbp DNA片段。該DNA片段用BamHI酶切，并亞克隆到經(jīng)小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理過的pBluescript SK質粒上，得到gDCPAL3-pro/SK(圖3)。然后，所得的質粒gDCPAL3-pro/SK用限制性內切酶SalI和ApaI酶切，并按照Sambrooket al.(1989)所描述的方法用核酸外切酶III和綠豆核酸酶酶切得到一系列缺失的DNA片段，用這些片段來測定gDCPAL3DNA的核酸序列。按照Ozeki and Takeda(1994)所描述的方法(Regulation ofphenylalanine ammonia-lyase genes in carrot suspension cultured cells.Plant Cell.Tissue and Organ Culture，38221-225(1994))，從胡蘿卜中提取的mRNA用于延伸引物方法，根據(jù)得到的條帶的位置來測定轉錄起始位點(+1)。
用gDCPAL4，根據(jù)上述同樣的方法得到gDCPAL4-pro/SK質粒并測定gDCPAL4DNA的核酸序列。具體的，從陽性gDCPAL4克隆的λ噬菌體中所得到的λDNA用HindIII和BamHI酶切，用上述探針進行Southern分析，與探針雜交的1.63kbp DNA片段用HindIII和BamHI酶切，并亞克隆到經(jīng)小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理過的pBluescript SK質粒上，得到gDCPAL4-pro/SK。然后，得到的gDCPAL4-pro/SK質粒用限制性酶XbaI和BstXI酶切，并按照Sambrook et al.(1989)所描述的方法用核酸外切酶III和綠豆核酸酶酶切得到一系列缺失的DNA片段，用這些片段來測定gDCPAL4DNA的核酸序列。
3)結果對照gDCPAL3和gDCPAL4的核酸序列表明gDCPAL3的啟動子區(qū)有微型反向重復轉座元件(MITE)，其具有在gDCPAL4中未發(fā)現(xiàn)的完全反向重復序列，存在于兩處，即-1897到-1599(長度為299bp)和-1157到-389(長度為769bp)(圖4)。這些序列被分別命名為IS1和IS2。
這些序列和插入位點周圍的核酸序列用自動測序儀(LICOR 4000L型產(chǎn)品)進行測序。IS1的核酸序列如SEQ ID NO2所示，IS2的核酸序列如SEQ ID NO1所示。
IS1和IS2的特征如下所述(1)IS1其具有如SEQ ID NO2(全長299bp)所示的核酸序列，分別在5＇和3＇末端區(qū)域具有非完全反向重復序列(32bp)，以及在基因組插入位點具有靶重復序列TA來作為靶基因?；谶@些事實，估計新型MITE元件的核酸序列屬于已經(jīng)報道的Stowaway家族(Bureau，T.E.andWessler，S.R.Stowawaya new family of inverted repeat elementsassociated with the genes of both monocotyledonous and dicotyledonousplants.Plant Cell，6907-16(1994))。IS1的主干結構和末端反向重復序列區(qū)域和插入位點區(qū)域的結構如圖2所示。
基于所得到的核酸序列的信息，用商業(yè)數(shù)據(jù)庫(如，GENE TYX-MAC/CD1995)對核酸序列進行同源性分析，在其末端反向重復序列中，發(fā)現(xiàn)MITE元件有70-90％的同源性屬于Stowaway家族(Bureau andWessler(1994))。證實了所述元件為屬于Stowaway家族的轉座元件(圖5)。
(2)IS2其具有如SEQ ID NO1(全長769bp)所示的核酸序列，分別在5＇和3＇末端區(qū)域具有非完全反向重復序列(158bp)，以及在基因組插入位點具有靶重復序列AAAAGAAAA來作為靶基因。核酸序列進行同源性比較，但沒有檢測到其與已知的轉座元件具有同源性。因而發(fā)現(xiàn)其為一類轉座元件，特別為MITE類似元件，組成了一類不屬于任何已知的轉座元件家族的新的家族。IS2的全部結構(主干結構)如圖1所示，其末端反向重復序列區(qū)和其插入位點的結構如圖6所示。
實施例2(1)IS1，IS2，IS12和MU3的克隆(i)IS1的克隆(圖7)從來源于如實施例1所述的制備用于核酸序列測定的gDCPAL3啟動子區(qū)的3＇終點具有缺失DNA片段的質粒中，選擇具有缺失到-1581的質粒gDCPAL3-IS1/SK，用KpnI酶切質粒，并用T4DNA聚合酶使其末端補平并用ScaI酶切隨后用瓊脂凝膠電泳得到321bp DNA片段。該片段被亞克隆到用HincII酶切并經(jīng)CIP處理過的pBluescript SK質粒。從含有上述亞克隆的大腸桿菌中提取質粒，并測定核酸序列來表明每個插入DNA片段的方向。通過這種方式，具有IS1的5＇末端被插入到pBluescript SK質粒多克隆位點的KpnI端的質粒被選擇并被命名為IS1/SK。而且，用HindIII和SmaI酶切pBI221(Clontech Inc.)所得的花椰菜花葉病毒35S啟動子(35S)片段用瓊脂糖凝膠電泳回收亞克隆到經(jīng)HindIII和SmaI酶切并經(jīng)CIP處理過的pBluescript SK質粒，所得的質粒命名為35S/SK。從IS1/SK中，用KpnI和HindIII酶切，隨后用瓊脂糖凝膠電泳得到插入的DNA片段，并被亞克隆到經(jīng)KpnI和HindIII酶切并經(jīng)CIP處理的35S/SK中，得到在35S啟動子區(qū)的上游區(qū)域有IS1區(qū)的IS1-35S/SK。
(ii)IS2的克隆(圖8)從來源于如實施例1所述的制備用于核酸序列測定的gDCPAL3啟動子區(qū)的3＇終點具有缺失DNA片段的質粒中，選擇具有缺失到-389的質粒gDCPAL3-IS12/SK，用KpnI酶切質粒，并用T4DNA聚合酶使其末端補平并用DdeI酶切隨后用瓊脂凝膠電泳得到797 bp DNA片段。該片段被亞克隆到用HincII酶切并經(jīng)CIP處理過的pBluescript SK質粒。從含有上述亞克隆的大腸桿菌中提取質粒，并測定核酸序列來表明每個插入DNA片段的方向。通過這種方式，具有IS2的5＇末端被插入到pBluescript SK質粒多克隆位點的KpnI端的質粒被選擇并被命名為IS2/SK-1。具有IS2的3＇末端被插入到KpnI端，也即反方向，被選擇并被命名為IS2/SK-2(反向)。
IS2/SK-1用KpnI和HindIII酶切并用用瓊脂糖凝膠電泳回收插入的DNA片段，該片段被亞克隆到經(jīng)KpnI和HindIII酶切并經(jīng)CIP處理過的35S/SK質粒，所得的質粒命名為IS2-35S/SK，其在35S啟動子區(qū)域的上游具有IS2區(qū)域(正向鏈)。
(iii)IS12的克隆(IS1-IS2串聯(lián)產(chǎn)物)(圖9)如上(ii)描述所得到的IS2/SK-2(反向)用KpnI酶切質粒，并用T4DNA聚合酶使其末端補平，用HindIII酶切隨后用瓊脂凝膠電泳回收插入DNA片段。該片段經(jīng)PstI酶切，并用T4DNA聚合酶使其末端補平，然后被亞克隆到用HindIII酶切并經(jīng)CIP處理過的IS1-35S/SK質粒，得到具有IS1區(qū)和IS2區(qū)以串聯(lián)形式在35S啟動子區(qū)的上游區(qū)域的IS12-35S/SK。
(iv)MU3的克隆(圖10)關于MU3，gDCPAL3-IS12/SK用KpnI酶切，并用T4DNA聚合酶使其末端補平，用ScaI酶切隨后用瓊脂凝膠電泳回收得到1,514bpDNA片段。該片段被亞克隆到用HincII酶切并經(jīng)CIP處理過的pBluescript SK質粒。從含有上述亞克隆的大腸桿菌中提取質粒，并測定核酸序列來檢查每個插入DNA片段的方向。具有IS1的5＇末端被插入到pBluescript SK質粒多克隆位點的KpnI端的質粒被選擇并被命名為MU3/SK。用KpnI和HindIII酶切MU3/SK所得的插入DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳回收。并被亞克隆到經(jīng)KpnI和HindIII酶切并經(jīng)CIP處理過的35S/SK質粒，得到MU3-35S/SK，其經(jīng)由gDCPAL3來源的區(qū)域序列(441bp)，在35S啟動子區(qū)域的上游區(qū)域有IS1區(qū)和IS2區(qū)。
(2)IS1，IS2，IS12和MU3插入到植物基因表達載體(圖11)pABN-Hm1(Mita，S.，Suzuki-Fujii，K.and Nakamura，K.Sugar-inducible expression of a gene for β-amylase in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol.，107895-904(1995)；gift from Dr.Kenzo Nakamura atNagoya Univeristy)用HindIII酶切得到β-淀粉酶啟動子(1.7kb)，其用T4 DNA聚合酶補平末端，然后用XbaI酶切，CIP處理，并用瓊脂糖凝膠電泳分離得到的10kbp DNA片段包含Ti質粒區(qū)和卡那霉素抗性基因[nos啟動子/新霉素磷酸轉移酶II的編碼區(qū)基因(nptII)/nos終止子]，β-葡萄糖苷酸酶基因的編碼區(qū)(GUS)/nos終止子，潮霉素抗性基因[35S啟動子/潮霉素磷酸轉移酶的編碼區(qū)基因(HPT)/nos終止子]。在其上亞克隆35S片段，其通過用HindIII酶切，T4DNA聚合酶補平并用XbaI酶切得到，構建pAB35S。
所得質粒用XhoI和XbaI酶切并用CIP處理，然后通過切去35SDNA片段用瓊脂糖凝膠電泳制備載體。按照前述方法所制備的IS1-35S/SK，IS2-35S/SK，IS12-35S/SK和MU3-35S/SK分別用XhoI和XbaI酶切，用瓊脂糖凝膠電泳回收DNA片段用于插入(外源基因表達盒)。這些DNA片段被連接到上述的載體上并用來轉化E.coliDH5α。用所得的每種大腸桿菌轉化子接種于包含25μg/L卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中(1％酪蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，1.5％用于細菌培養(yǎng)基的瓊脂粉)，用快速質粒DNA抽提法從克隆中抽提質粒，所得到的質粒用限制性酶切圖譜來檢查，構建得到pIS1-35S/AB35S，pIS2-35S/AB35S，pIS12-35S/AB35S和pMU3-35S/AB35S，也即將上面的轉基因表達盒分別插入到負責卡那霉素抗性的nptII基因和為結構基因的GUS基因中，構建物的證實如圖11所示。
(3)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備YEP固體培養(yǎng)基(通過在包含1％酵母提取物1％細菌蛋白胨和0.5％氯化鈉的YEP培養(yǎng)基中加入用于細菌培養(yǎng)基的瓊脂粉到達濃度為1.5％，隨后用高壓滅菌固化制備)上，用取自甘油保藏的根癌農(nóng)桿菌EHA 101在其上劃線涂板，并在28℃避光培養(yǎng)2天。長出的根癌農(nóng)桿菌單克隆被分別用牙簽挑取接種到1.5ml的YEP培養(yǎng)基中并于28℃振蕩培養(yǎng)過夜。80ml的YEP培養(yǎng)基被放于500-ml的燒瓶中，加入0.8ml的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，于28℃振蕩培養(yǎng)直到OD600＝0.4。并用冰冷卻，轉移到預先用冰冷卻過的離心管中，在4℃以6,000rpm離心5分鐘，除去上清液，并加入20ml 10％的甘油來懸浮沉淀。該過程被重復三次，培養(yǎng)基被充分的去除來得到根癌農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞。為了保存，細胞懸浮于400μl10％甘油中，懸浮液按照每管40μl分配到管中，隨后用液氮進行快速冷凍。
(4)將質粒轉入到根癌農(nóng)桿菌中如上面(2)所得到的構建物(質粒pIS1-35S/AB35S，pIS2-35S/AB35S，pIS12-35S/AB35S和pMU3-35S/AB35S)用電穿孔(使用Shimadzu GTE-10)被分別轉入到根癌農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞中。具體的，如上(2)所述制備的每種質粒各約100ng，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)，pIS12-35S/AB35S(IS12)和pMU3-35S/AB35S(MU3)，以及質粒pAB35S(35S)作為沒有轉錄活化元件(IS1和/或IS2)插入的對照，分別和40μl按照上述(3)制備的感受態(tài)細胞，每種混合物被轉入到電穿孔池中。給予電脈沖(1.2kV，35μF，550Ω)，并立即加入1mlYEP培養(yǎng)基，并在28℃孵育1小時。取出約50μl并涂板于包含50μg/L潮霉素的YEP固體培養(yǎng)基，然后在28℃下避光孵育2天。用鉑環(huán)將已經(jīng)生長的單一克隆再涂于包含50μg/L潮霉素的YEP固體培養(yǎng)基的其它部分之上并于28℃孵育24小時。取出一部分細胞于5ml包含50μg/L潮霉素的YEP培養(yǎng)基中在28℃振蕩培養(yǎng)過夜。
實施例3(1)將包含轉錄活化元件的構建物轉入到煙草培養(yǎng)細胞中用根癌農(nóng)桿菌，其中轉入有實施例2中制備的構建物，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)或pIS12-35S/AB35S(IS12)(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉化子”)，構建物IS1，IS2和IS12被分別轉入到煙草培養(yǎng)細胞中。對照試驗中，轉入有pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌被使用并按照同樣的程序。
首先，上述的培養(yǎng)于5ml YEP液體培養(yǎng)基的根癌農(nóng)桿菌轉化子被轉入到50ml離心管并在3,000rpm離心10分鐘。棄去上清液，25ml的Linsmaier & Skoog培養(yǎng)基(Linsmaier，E.M.and Skoog，F(xiàn).；Physiol.Plantarum 18，100-127(1965)；下文中命名為＂Lins培養(yǎng)基＂)被加入到沉淀物中，經(jīng)過重新懸浮，室溫下3,000rpm再次離心10分鐘，棄去上清液。這個過程被重復4次。收集根癌農(nóng)桿菌的細胞，Lins培養(yǎng)基被加入用于懸浮使OD600＝0.2，加入乙酰丁香酮使其達到10μg/ml的濃度，然后重新懸浮。
被用來轉入每種構建物的培養(yǎng)的煙草細胞BY-2(由東京大學Dr.Toshiyuki Nagata惠贈)預先培養(yǎng)于45ml包含2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)Lins培養(yǎng)基中，每隔一周，1ml包含細胞的培養(yǎng)液的懸浮液被加入到新鮮的Lins培養(yǎng)基中，使用轉入后經(jīng)過約100小時的潛伏期并已經(jīng)進入對數(shù)生長期的細胞。
無菌的90-mm培養(yǎng)皿被接種所述煙草培養(yǎng)細胞BY-2(4ml)，經(jīng)上述程序清洗的100μl根癌農(nóng)桿菌轉化子細胞被均一的加入到煙草培養(yǎng)細胞中。經(jīng)過輕微混合，在22℃避光共培養(yǎng)3天。
然后，12mlLins培養(yǎng)基被加入到培養(yǎng)細胞液中進行懸浮，懸浮物被轉入到50-ml離心管中并以1,000rpm離心1分鐘，棄去上清。該程序被重復4次。然后，12ml包含250μg/ml claforan的Lins培養(yǎng)基被加入并將上述程序重復一次。棄去上清液后，約25mlLins培養(yǎng)基被加入到沉淀細胞中來將其懸浮，取0.25μl培養(yǎng)基，用血球計對其中的細胞進行計數(shù)。細胞被均一的接種于包含100μg/ml或300μg/ml卡那霉素(進一步包含250μg/ml的claforan)的Lins固體選擇性培養(yǎng)基使得每個培養(yǎng)皿中的細胞數(shù)目達到4×105，6×105，8×105，10×105或15×105。它們在28℃避光培養(yǎng)。培養(yǎng)后1個月，轉基因的培養(yǎng)煙草細胞數(shù)目(愈傷組織轉化子)在每個皿中形成并且測定其形成率或產(chǎn)量。所得到的結構出示在表1和圖12中。
表1培養(yǎng)于包含卡那霉素的培養(yǎng)基上煙草培養(yǎng)細胞BY-2形成的愈傷組織轉化子的數(shù)目以及愈傷組織轉化子的形成率卡那霉素100μg/ml細胞數(shù)目 468 10(×105)IS1 4±020±4 43±3 99±10(0.10) (0.33)(0.54) (0.99)IS2 10±7 72±1384±4 137±12(0.25) (1.20)(1.05) (1.37)IS12 16±3 70±6 124±16220±4(0.40) (1.67)(1.55) (2.20)35S 3±240±8 47±2 83±13(對照)(0.08) (0.67)(0.59) (0.83)卡那霉素300μg/ml細胞數(shù)目 4 6 8 10(×105)IS1 0 3±0 10±3 20±5(0.00) (0.05) (0.1 3) (0.20)IS2 0 4±2 36±4 72±11(0.00) (0.07) (0.45) (0.72)IS12 2±115±1 41±2 89±5(0.05) (0.25) (0.51) (0.89)35S 0 0 3±237±16(對照)(0.00) (0.00) (0.04) (0.37)上形成的愈傷組織的數(shù)目下產(chǎn)率(×10-2％)
從上述結果，發(fā)現(xiàn)構建物IS2或IS1的插入到煙草培養(yǎng)細胞中能夠增強在包含卡那霉素的培養(yǎng)基中愈傷組織轉化子的產(chǎn)量并且其產(chǎn)量高于沒有這種元件插入的培養(yǎng)煙草細胞(35S)形成的愈傷組織轉化子。具體的，其中引入構建物IS2或IS12的愈傷組織轉化子的產(chǎn)量(轉基因的煙草培養(yǎng)細胞)與沒有引入這種元件的對照(35S)相比高1.6到2.6倍。
特別當培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度達到300μg/ml時，可以觀察到通過引入構建物IS2或IS12，愈傷組織轉化子的產(chǎn)量與對照(35S)相比增加到10倍或更高。這表明構建物IS2或IS12的插入導致了負責卡那霉素抗性的ntpII基因的表達水平和在所述構建物的附近或邊緣區(qū)出現(xiàn)的上升。
(2)煙草愈傷組織轉化子的GUS活性的測定基于上述結果，作為報道基因的GUS基因的表達被用上述構建物pIS12-35S/AB35S(IS12)來檢查，以檢查上述插入的構建物是否能夠增強結構基因的表達。
檢查GUS基因的表達首先通過從多個煙草愈傷組織轉化子中隨機獨立的選擇愈傷組織，從每個愈傷組織中提取核DNA，并且經(jīng)過Southern分析證實了基因的轉入后，從愈傷組織中提取蛋白并測量GUS活性。具體的，取0.75g煙草愈傷組織轉化子并用GUS-Light(Tropix，Inc.)抽提蛋白。用Bio-Rad的蛋白試劑盒來測定蛋白濃度，然后用GUS-Light(Tropix)和發(fā)光計Lumat LB905(Bertold Japan)，GUS活性測定5秒。所得結果出示在圖13中。在圖中，所示的GUS活性(縱座標)的按照光度值比每單位重量的蛋白，其通過從光度計所得的光度值除以蛋白重量來計算。
圖13中很明顯的表明與沒有元件插入pAB35S(35S)所形成的對照相比，轉入IS12構建物的煙草愈傷組織轉化子平均具有超過2.6倍的GUS活性。從這點，發(fā)現(xiàn)通過構建物IS12的插入能夠顯著增加GUS基因的表達。
這表明上述構建物中包含的每種元件(IS1元件，IS2元件，其連接產(chǎn)物(如IS12元件))為轉錄活化元件。
實施例4將包含轉錄活化元件的構建物轉入到煙草植物中(葉盤法)所用的根癌農(nóng)桿菌帶有實施例2中制備的構建物，也即將pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)或pIS12-35S/AB35S(IS12)轉入其中(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉化子”)，利用葉盤法將構建物IS1，IS2和IS12分別轉入到煙草葉中。對照試驗中，使用轉入不含構建物的pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌并采用如下所述同樣的程序。
具體的，每個煙草(SR 1)葉浸入到10％次氯酸溶液，用藥匙作為攪拌器輕柔攪拌2分鐘以除去氣泡，更新溶液并重復同樣的程序5次。葉子被取出并浸入到滅菌水中，并進行輕柔攪拌。當用新的次氯酸溶液置換原有的溶液時，同樣的過程被重復三次。用滅菌的紙巾除去水分后，用軟木塞鉆孔器在葉子上打孔產(chǎn)生葉盤(葉脈被除去)。然后浸入到10ml的滅菌水中。所制備的葉盤浸入到上述培養(yǎng)于5mlYEP培養(yǎng)基的根癌農(nóng)桿菌轉化子中(用滅菌水調整OD600＝0.25)。然后，細菌懸浮物和葉盤共同倒入滅菌的紙巾中并用另一塊滅菌的紙巾除去水分。
葉子里面朝外的放置于MS感染培養(yǎng)基中，通過補加含40mg/L乙酰丁香酮和0.2％植物凝膠的MS培養(yǎng)基來制備(Murashige，T.and Skoog，F(xiàn).；Physiol.Plantarum15，473-497(1962))，將其于25℃避光培養(yǎng)2天。然后，每個葉盤通過用MS區(qū)別培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補充有0.1mg/L α-萘乙酸，1mg/L芐基腺嘌呤，150mg/L卡那霉素，500mg/L claforan和0.2％植物凝膠)擦拭除去細菌細胞，然后里面朝外的放置于MS區(qū)別培養(yǎng)基中在25℃進行培養(yǎng)。每隔2周用新鮮的MS區(qū)別培養(yǎng)基置換原來培養(yǎng)基，一個月的潛伏期后，對新生的芽進行計數(shù)。所得的結果出示在表2中。
表2在煙草葉盤上新生芽的數(shù)目對照

從上述結果很清楚的表明，與不含元件的對照相比(35S)，當煙草植物包含構建物IS1或IS2時，其芽的新生率為對照的1.4倍，而且特別當其包含IS1和IS2的串聯(lián)形式時(IS12)，所得的芽為對照的兩倍。這表明本發(fā)明的元件(IS1元件，IS2元件以及兩者連接所得產(chǎn)物(IS12或者類似物))能夠增加出現(xiàn)在煙草植物內所述元件附近或邊緣區(qū)的卡那霉素基因(ntpII基因)的活性。這些結果支持了實施例3中所得的論斷，即本發(fā)明中的元件為轉錄活化元件。
實施例5將包含轉錄活化元件的構建物轉入到胡蘿卜體細胞胚中用根癌農(nóng)桿菌，其中轉入有實施例2中制備的構建物，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)，pIS12-35S/AB35S(IS12)或pMU3-35S/AB35S(MU3)(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉化子”)，構建物IS1，IS2，IS12和MU3被分別轉入到胡蘿卜體細胞胚中。對照試驗中，轉入有pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌被使用并按照下述同樣的程序。
首先，胡蘿卜發(fā)芽的胚軸在無菌條件下被切成約1cm的長度，然后放置于包含4.5×10-6M 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)的MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)24小時，然后放置于不含2，4-D的MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天。培養(yǎng)基被置換并按照同樣的方式培養(yǎng)7天使得胡蘿卜體細胞胚開始在胚軸上產(chǎn)生。
上述的培養(yǎng)于5ml YEP液體培養(yǎng)基的根癌農(nóng)桿菌轉化子在3,000rpm離心10分鐘，棄去上清液，約30ml MS培養(yǎng)基被加入到沉淀物中去懸浮細胞。這個過程被重復兩次并充分除去YEP培養(yǎng)基。然后，在3,000rpm離心10分鐘，棄去上清液，加入包含10mg/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基到沉淀中并調整OD600＝約0.3。
將上面用網(wǎng)收集的胡蘿卜胚軸加入到其中，并將混合物輕柔振蕩5分鐘。用滅菌的紙巾擦拭除去胚軸的水分，并將其浸入到包含10mg/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中于22℃避光培養(yǎng)3天。用滅菌的紙巾擦拭除去胚軸的水分，并將其浸入到包含500μg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基中并用此培養(yǎng)基通過輕柔振蕩進行清洗。用同樣的方式除去水分，胚軸避光培養(yǎng)于包含500μg/L羧芐青霉素和100μg/L卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基上(包含0.8％瓊脂)。經(jīng)過1.5到3個月，有新生愈傷組織的胚軸被計數(shù)。所得的結果出示在表3中。
表3含新生愈傷組織的胚軸數(shù)目對照

表3很清楚的表明，胡蘿卜體細胞胚和煙草愈傷組織的例子一樣，在包含2，4-D培養(yǎng)基(+2，4-D)的去分化生長條件和不包含2，4-D培養(yǎng)基(-2，4-D)的分化生長條件下當插入構建物IS1，IS2，IS12和MU3時能夠增強再生的效率。所觀察到再生效率增加最大的為插入IS2構建物的例子中。
實施例6將包含轉錄活化元件的構建物轉入到水稻中用根癌農(nóng)桿菌，其中轉入有實施例2中制備的構建物，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)或pIS12-35S/AB35S(IS12)(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉化子”)，構建物IS1，IS2和IS12被分別轉入到水稻的種子中。對照試驗中，轉入有pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌被使用并按照同樣的程序。
具體的，從充分成熟的水稻種子中(Nihonbare)，首先選擇那些外形和顏色都正常的，然后在缽中輕柔去殼。去殼的種子被放置于50mlFalcon試管中，加入2.5％的次氯酸鈉，混合物在100-120rpm振蕩20分鐘。然后，棄去上清液，加入滅菌水并輕柔振蕩混合物。重復該過程3次，種子放置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上并于28℃避光培養(yǎng)。
經(jīng)過3到4周，愈傷組織從盾片上形成并長出黃色的胚芽，只有那些直徑為2-3mm并且看上去分散的被放置于新鮮的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上并于28℃避光培養(yǎng)7天。
將上述的根癌農(nóng)桿菌轉化子種植于YEP固體培養(yǎng)基并于28℃避光培養(yǎng)3天。用藥匙將根癌農(nóng)桿菌的細胞刮下并加入到AAI培養(yǎng)基中(Toriyama，K.and Hirata，K.；Plant Science41，179-183(1985))，并補加有乙酰丁香酮，OD600調整到0.18到0.2。于25℃避光振蕩培養(yǎng)1小時。
按照上述方式培養(yǎng)的水稻愈傷組織被放置于滅菌的濾茶器中，并加入上面培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌所形成的懸浮液。濾茶器被振蕩3分鐘并間隔的搖晃以保證整個愈傷組織的浸入，然后將濾茶器和其內容物整個放置于滅菌的紙巾上，除去多余的細菌培養(yǎng)液。愈傷組織被放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中并于25℃避光培養(yǎng)3天。
共培養(yǎng)的愈傷組織被收集到濾茶器中，浸入到補加有500mg/lclaforan的滅菌水中，濾茶器被振蕩以除去根癌農(nóng)桿菌，濾茶器和其內容物被共同放置于滅菌的紙巾上除去水分。愈傷組織被放置于選擇性培養(yǎng)基中并于28℃避光培養(yǎng)。3到4周后，從大量的愈傷組織中隨機挑選愈傷組織，取被選定的愈傷組織的一部分并放置于GUS染色溶液中(0.75mM X-Gulc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸)，0.5mM高鐵氰化鉀，0.5mM亞鐵氰化鉀，0.3％Triton X-100，20％甲醇，50mM磷酸緩沖液(pH7.0))。在37℃反應過夜以檢測GUS的活性。愈傷組織被染成藍色并且表現(xiàn)出GUS活性的為轉基因的轉化水稻愈傷組織。所得結果出示在表4中。
表4水稻愈傷組織用于GUS的染色結果

表4結果清楚的表明與對照相比(35S)，轉入有構建物IS1和IS2的轉化效率為對照的1.5倍和約2倍。
上述實施例1到6表明通過用本發(fā)明的轉錄活化元件(IS1，IS2，IS12，MU3)，再生效率(轉化效率)能夠被增強。下述的三種可能性被認為是其原因(1)Ti質粒轉入植物細胞的效率被增強的可能性；(2)由于IS1和/或IS2元件使得nos啟動子活性增強以及隨后nptII基因轉錄起始活性增強使得基因產(chǎn)物數(shù)量的增加，并且導致能夠在用于選擇的包含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長的細胞數(shù)目增加，共同導致細胞再生的效率被增強的可能性；(3)IS1和/或IS2元件活化其附近或邊緣區(qū)基因或阻止所述基因區(qū)被滅活的可能性。
通過Ti質粒方式轉入的基因不導致在植物染色體的預定位點上的插入，其插入位點是不確定的。所以，所討論的基因能否插入到活性位點是偶然的，其是由染色體的結構或在隱藏位點的附近通過基因組DNA甲基化或其它原因導致基因去活化所決定的。認為如果轉基因被轉入到隱藏位點，其會被染色體的“場”所影響導致轉基因被滅活。
用于上述實施例的構建物中，發(fā)現(xiàn)轉錄活化元件(IS1或/和IS2)插入到nptII基因(卡那霉素抗性基因)的終止子端，也即卡那霉素抗性基因的nos啟動子的相反端。所以，不可能是這些元件對于卡那霉素抗性基因的順式作用。
但是，上述例子中的結果表明即使在本發(fā)明中的轉錄活化元件插入到的位置不能夠直接作用于nos啟動子的情況下，在培養(yǎng)的煙草細胞中卡那霉素抗性細胞(轉化的煙草愈傷組織)的數(shù)目增加，特別是即使當培養(yǎng)基中的卡那霉素的含量高達300mM時，卡那霉素抗性細胞(轉化的煙草愈傷組織)的數(shù)目增加(實施例3(1))，并且通過將上述的構建物轉入到不同植物的植物細胞中時，卡那霉素抗性植物的再生效率增加(實施例4到6)。這些結果表明IS1或/和IS2元件作用于出現(xiàn)在所述元件附近的卡那霉素抗性基因，不是通過直接導致nos啟動子順式活化的模式來起作用，結果細胞保持所述的卡那霉素抗性基因的活性(包括活化和阻止滅活)。因此，這表明可能和傳統(tǒng)的作為增強子出現(xiàn)在特定基因啟動子附近的轉錄活化元件(因子)并通過順式作用于所述啟動子來活化轉錄不同，本發(fā)明的轉錄活化元件當其插入到基因組基因中時，能夠活化出現(xiàn)在其附近或邊緣的一組基因或多組基因(不論其作用的基因啟動子的位置和方向)并且促進轉錄活性，也即通過上述(3)的機制來起作用。
在上述實施例使用的構建物中，IS1或/和IS2元件被插入到GUS基因的35S啟動子端。實施例3(2)中插入所述構建物的煙草培養(yǎng)細胞所表現(xiàn)出的GUS活性清楚的表明本發(fā)明的轉錄活化元件也能夠作用于出現(xiàn)在下游附近的35S啟動子從而增強GUS基因的轉錄活性。這個結果支持了上面所作的論斷并表明本發(fā)明的轉錄活化元件表現(xiàn)出上述(3)中的活性，也即“IS1或/和IS2元件活化其鄰近基因區(qū)或阻止基因區(qū)被滅活”。
在上述實施例中，已知不僅在培養(yǎng)細胞(實施例3)而且在植物組織中，在煙草葉盤試驗(實施例4)中煙草植物胚芽的再生效率被確實的提高，作為從胡蘿卜胚軸進行植株再生基礎的胚性愈傷的形成效率增加(實施例5)，并且作為水稻植株再生基礎的愈傷組織的形成效率增加(實施例6)，都是通過用本發(fā)明中的轉錄活化元件。這些結果表明本發(fā)明的轉錄活化元件作用于由于位置效應使所討論的轉入植物基因組的外源基因產(chǎn)生基因沉默(滅活)而導致植物細胞變得不能進行植物再生或形成愈傷組織，使得植物再生或形成的效率增加，因此特別有用。
考慮到最近的發(fā)現(xiàn)MITE如MAR一樣能夠結合核基質(Tikhonovet al.，Plant Cell 12249-264(2000))，認為MITE能夠在核內起和MAR相同的作用?；谶@點，可以預期本發(fā)明中的轉錄活化元件，MITE能夠單獨或和如MAR的元件聯(lián)合使用來產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的植物來進一步增加植物再生或形成的效率工業(yè)適用性在產(chǎn)生遺傳修飾的植物中要克服的最重要的問題是導致外源基因表達失活的基因沉默現(xiàn)象。在發(fā)展遺傳修飾植物中為避免基因沉默現(xiàn)象，必須從大量植物個體中選擇出那些所討論的外源基因插入到盡可能少的導致基因沉默的位點的植物個體。
本發(fā)明提供新型植物來源的MITE類似元件，當所述MITE類似元件插入到植物基因組中，非?？赡茉斐苫蚪M結構的變化，基于此，對基因組結構的動態(tài)變化有作用，例如能夠促進基因組DNA的展開或造成核小體結構的變化，通過與常規(guī)的增強子元件不同的機制來起作用。
因此，通過使用本發(fā)明的MITE類似元件的特征，利用不同于以前的技術使調控出現(xiàn)在其附近的基因表達變得可能。也就是，用具有上述特征的本發(fā)明的MITE類似元件，可以增加或活化轉基因技術轉入的外源基因降低的表達能力。在這一方面，本發(fā)明的MITE類似元件可用于構建轉基因表達盒和包含所述表達盒的質粒來產(chǎn)生遺傳修飾的生物體并進一步用于穩(wěn)定的產(chǎn)生能夠表達轉基因的經(jīng)遺傳修飾的生物體。
本發(fā)明的轉錄活化元件包括轉座元件例如如上所述的MITE類似元件中的一種(優(yōu)選的為IS1元件或/和IS2元件)，具有抑制和解決植物中進行基因轉移由于位置效應造成的基因表達失活現(xiàn)象(基因沉默現(xiàn)象)的活性。因此，可以預期通過本發(fā)明的轉錄活化元件單獨使用或和其它參與到核DNA結構中的元件例如MAR(基質結合元件)聯(lián)合使用，可能使基因穩(wěn)定的表達并顯著的減少通常在基因轉移后進行的篩選步驟以及用于傳種和生長的重組植物數(shù)量。
基因組大小巨大的植物如百合，菊花和小麥在其基因組內具有大量的隱藏位點，因此外源基因大都被插入到隱藏位點。對于這些植物，用先前技術很難或幾乎不可能產(chǎn)生重組植物。相反，用本發(fā)明的轉錄活化元件，可以顯著的抑制被引入到植物基因組中的外源基因的基因沉默并可以預期所述元件能夠有效的將外源基因轉入到如上所述那些被認為很難來產(chǎn)生基因重組的植物中來產(chǎn)生重組植物。
本發(fā)明的轉錄活化元件也被認為是能夠活化(包括轉錄活化)被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在其插入位點的附近或邊緣區(qū)的基因的元件。因此，本發(fā)明的轉錄活化元件被預期不僅使轉基因技術能夠實用變得可能，即使對于那些如上所述由于基因組過大使基因沉默頻繁出現(xiàn)而難于產(chǎn)生遺傳修飾的植物而言；而且對于即使已經(jīng)用于遺傳工程的植物種類如大豆，棉花，馬鈴薯和西紅柿而言，也可能增加基因傳遞的效率，同時，增加有用特性的基因轉錄的活性，例如除草劑抗性基因和殺蟲劑蛋白基因，通過用這些轉錄活化元件插入到這些有用特性基因的啟動子的上游位點或其附近位點。而且與常規(guī)的產(chǎn)生遺傳修飾植物的方法相比，它們被預期可以產(chǎn)生具有高產(chǎn)量和高質量的遺傳修飾植物。
序列表<110>小關良宏(OZEKI，Yoshihiro)<110>三榮源有限公司(SAN-EI GEN F.F.I.，INC.)<120>新的類似微型反向重復轉座元件(MITE)的轉座元件和轉錄活化元件(NOVEL MINIATURE INVERTED-REPEAT TRANSPOSABLE ELEMENTS(MITEs)-LIKEELEMENT AND TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION ELEMENT)<130>SPI041440-47<150>JP 1999/206316<151>1999-07-21<150>JP 1999/206320<151>1999-07-21<150>JP 2000/175825<151>2000-06-12<160>14<210>1<211>769<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>1gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt 60tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgtaa aagttgccag tgaggttgca 180aaagttgcaa atgagtttgt aaaagttgca aatgaggttg caaaagttgc aaataaaaat 240ggaaagttgc aacagttgca actgcaattg caactagttc aactgaaaac tgtaagttgc 300
aaaagttgca aatgaggttg caactaaatg caactgaaaa ctgtaagtaa caacagatgt360atggtgtgcc cctggcgggg ccgttagatt acaatagaat caactgaatg caatcatatg420caactgaata caactatatg caatcatata tgcaattaca aatcctgatt tcaagttcca480gttttcgaat gtcattttcg aaatcgatat atatatatat atatatatat cgatttcgaa540aatgacattc gaaaactgga acttgaaatc aggaattcag ctgcatatga agttgcaaaa600gaggttgcaa cacggctggc gccgcctgta gttgcaaatg aggttgcaaa agttgcaaac660agtatttttg aaaaaaagat tttatgaaaa ggtattttta aaaataattc tggaaggtag720tatttttgaa aacaataaaa gaaaaggtag gtagttttgt agatttccc769<210>2<211>299<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>2ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tttctttttg ggacgtctca aaaaaaataa 60cctagaatac ttactatttt ttaacactat ttttcactat tacacccacc aactctatat120tttatactat tttattatta aataaacact attacaccca ctacttttct ccactatctc180aaatctatta ttaaatattg ataggtccac cactttaccc acttttcaac tacatttact240acatttttct taatctccgt gaaagtcaaa ctcattcaca taaaatggga cagagggag 299<210>3<211>1192<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>3
ggtaccgggc cccccctcga ggtcactccc tacgtcccat tttatgtgac ctcattttct60ttttgggacg tctcaaaaaa aataacctag aatacttact attttttaac actatttttc 120actattacac ccaccaactc tatattttat actattttat tattaaataa acactattac 180acccactact tttctccact atctcaaatc tattattaaa tattgatagg tccaccactt 240tacccacttt tcaactacat ttactacatt tttcttaatc tccgtgaaag tcaaactcat 300tcacataaaa tgggacagag ggagtaatta ttaattttaa tagacggtat cgataagctt 360atcgataccg tctcagattc gcaaacataa aaagaaaagg gatcttttta aaaataccca 420tctgtaaaat tattttttta aaaatactac catctttttc attgttttta aaaatacctt 480ttcataaatt ttttttttca aaaatacgat ttgcaacttt tgcaacctca tttgcaacct 540tgggcggcgc agccgtaaaa gttgccagtg aggttgcaaa agttgcaaat gagtttgtaa 600aagttgcaaa tgaggttgca aaagttgcaa ataaaaatgg aaagttgcaa cagttgcaac 660tgcaattgca actagttcaa ctgaaaactg taagttgcaa aagttgcaaa tgaggttgca 720actaaatgca actgaaaact gtaagtaaca acagatgtat ggtgtgcccc tggcggggcc 780gttagattac aatagaatca actgaatgca atcatatgca actgaataca actatatgca 840atcatatatg caattacaaa tcctgatttc aagttccagt tttcgaatgt cattttcgaa 900atcgatatat atatatatat atatatatcg atttcgaaaa tgacattcga aaactggaac 960ttgaaatcag gaattcagct gcatatgaag ttgcaaaaga ggttgcaaca cggctggcgc 1020cgcctgtagt tgcaaatgag gttgcaaaag ttgcaaacag tatttttgaa aaaaagattt 1080tatgaaaagg tatttttaaa aataattctg gaaggtagta tttttgaaaa caataaaaga 1140aaaggtaggt agttttgtag atttcccaga cctcgagggg gggcccggta cc 1192<210>4<211>8<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)
<400>4gttgcaaa 8<210>5<211>8<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>5gttgcaac 8<210>6<211>8<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>6tttgcaaa 8<210>7<211>8<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>7tttgcaac 8<210>8
<211>7<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>8tatgcaa 7<210>9<211>7<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>9aatgcaa 7<210>10<211>158<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>10gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt60tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgt 158<210>11<211>158<212>DNA
<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>11acggctggcg ccgcctgtag ttgcaaatga ggttgcaaaa gttgcaaaca gtatttttga 60aaaaaagatt ttatgaaaag gtatttttaa aaataattct ggaaggtagt atttttgaaa 120acaataaaag aaaaggtagg tagttttgta gatttccc 158<210>12<211>32<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>12ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tt32<210>13<211>32<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>13aaactcattc acataaaatg ggacagaggg ag32<210>14<211>1553<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>14
ggtaccgggc cccccctcga ggtcactccc tacgtcccat tttatgtgac ctcattttct60ttttgggacg tctcaaaaaa aataacctag aatacttact attttttaac actatttttc 120actattacac ccaccaactc tatattttat actattttat tattaaataa acactattac 180acccactact tttctccact atctcaaatc tattattaaa tattgatagg tccaccactt 240tacccacttt tcaactacat ttactacatt tttcttaatc tccgtgaaag tcaaactcat 300tcacataaaa tgggacagag ggagtaatta ttaattttaa taaattatat gtgattttga 360ttatgtgtgg attcttgata aaatatcaca gagttgatat aaattctaaa gatttaacca 420caatgtttca aaatctcata gattttagta ggattcaaaa aatttaaaat acgttcaaaa 480atctcataaa attcatcatt ttattaaatc caaaaaaatc cagtaatatt tgacaatcag 540attttaatga attttaaatt gaacaatctc agttgaatac catgagattt taaaatataa 600tttaaaattc taattgaata ccaccagatt ttgtaaaata atttaaaatt ttaattgaat 660attcaagatt ttaatatatt ttaaataatc tcgatctgaa ttacaaaaaa tgcttaaaat 720ctgaatccca tacgtcctct cagattcgca aacataaaaa gaaaagggat ctttttaaaa 780atacccatct gtaaaattat ttttttaaaa atactaccat ctttttcatt gtttttaaaa 840ataccttttc ataaattttt tttttcaaaa atacgatttg caacttttgc aacctcattt 900gcaaccttgg gcggcgcagc cgtaaaagtt gccagtgagg ttgcaaaagt tgcaaatgag 960tttgtaaaag ttgcaaatga ggttgcaaaa gttgcaaata aaaatggaaa gttgcaacag 1020ttgcaactgc aattgcaact agttcaactg aaaactgtaa gttgcaaaag ttgcaaatga 1080ggttgcaact aaatgcaact gaaaactgta agtaacaaca gatgtatggt gtgcccctgg 1140cggggccgtt agattacaat agaatcaact gaatgcaatc atatgcaact gaatacaact 1200atatgcaatc atatatgcaa ttacaaatcc tgatttcaag ttccagtttt cgaatgtcat 1260tttcgaaatc gatatatata tatatatata tatatcgatt tcgaaaatga cattcgaaaa 1320ctggaacttg aaatcaggaa ttcagctgca tatgaagttg caaa8gaggt tgcaacacgg 1380ctggcgccgc ctgtagttgc aaatgaggtt gcaaaagttg caaacagtat ttttgaaaaa 1440aagattttat gaaaaggtat ttttaaaaat aattctggaa ggtagtattt ttgaaaacaa 1500
taaaagaaaa ggtaggtagt tttgtagatt tcccagacgg tatcgataag ctt155權利要求
1.一種微型反向重復轉座元件(MITE)類似元件，其具有作為反向重復序列的在5′末端區(qū)域如SEQ ID NO12所示的核苷酸序列以及在3′末端區(qū)域如SEQ ID NO13所示的核苷酸序列，并且能夠造成在基因組基因中其插入位點上的靶序列TA的重復。
2.MITE類似元件，其包括下列DNA(a)或(b)(a)一種DNA，其具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；(b)一種DNA，其能夠與具有上述(a)中的核苷酸序列的互補序列的DNA在嚴謹條件下雜交，并能夠造成在基因組基因中其插入位點上的靶序列TA的重復。
3.轉錄活化元件，其特征在于包含至少一個如權利要求1或2所述的MITE類似元件作為轉座元件。
4.轉基因表達盒，其包括如權利要求3所述的轉錄活化元件和可操縱地連接到所述元件上的DNA序列。
5.如權利要求4所述的轉基因表達盒，其中與所述轉錄活化元件可操縱地連接的DNA序列包括啟動子和/或終止子。
6.如權利要求5所述的轉基因表達盒，其進一步包括所需的待表達轉基因序列作為可操縱地連接到轉錄活化元件上的所述DNA序列。
7.一種質粒，其包含權利要求3所述的轉錄活化元件。
8.一種質粒，其包含權利要求4-6中任一項所述的轉基因表達盒。
9.生產(chǎn)轉基因植物的方法，其包含將權利要求6所述的轉基因表達盒導入到植物中，所述表達盒具有啟動子和終止子作為可操縱連接到轉錄活化元件上的DNA序列，以及任選具有所需的待表達的轉基因序列。
10.如權利要求9所述的生產(chǎn)轉基因植物的方法，其中所述植物為玉米、水稻、小麥、百合、菊花、棉花、大豆、甜菜、馬鈴薯或番木瓜。
全文摘要
本發(fā)明提供新型胡蘿卜來源的MITE類似元件(轉座元件)。進一步提供包括至少一個轉座元件的轉錄活化元件，特別是上述MITE類似元件。具體的，提供具有包括如SEQID NO1所示核酸序列或其功能類似物的DNA和/或包含如SEQ ID NO2所示核酸序列或其功能類似物的轉錄活化元件。本發(fā)明的轉錄活化元件能夠增加或活化被減少的通過轉基因技術轉入的外源基因的表達。因此，轉基因活化元件對于轉入到植物基因組的外源基因的穩(wěn)定表達起作用，并用于穩(wěn)定的產(chǎn)生遺傳修飾的植物。
文檔編號C07K14/415GK1539974SQ20041003694
公開日2004年10月27日 申請日期2000年7月19日 優(yōu)先權日1999年7月21日
發(fā)明者小關良宏, 小柳美喜子, 福田崇, 香田隆俊, 俊, 喜子 申請人:三榮源有限公司, 小關良宏