專利名稱：一種新的龍膽有效部位的制備及其應用的制作方法
技術領域：
本項發(fā)明涉及一種中藥有效部位的制備，以及該有效部位在制藥領域當中的應用。
背景技術：
目前在全世界范圍內，各種原因導致的肝病仍是威脅人類健康的大敵。在發(fā)展中國家，情況更加嚴峻，尤其是各種病毒性肝炎的發(fā)病率居高不下。病毒性肝炎(viral hepatitis)是由多種肝炎病毒引起的常見傳染病，具有傳染性強、傳播途徑復雜、流行面廣泛，發(fā)病率較高等特點。據估計，世界上大約有3.5億名乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者，保守推測HBV攜帶者約占世界總人口的10％左右，每年有近100萬人死于HBV引起的疾病。中國是全球HBV感染率較高的地區(qū)之一。
來自中國統(tǒng)計年鑒的全國肝炎流行病學調查數據表明，中國有6億多人感染過乙型肝炎，大約1.2億人攜帶乙型肝炎病毒。在中國，病毒性肝炎是普遍的致命性疾病平均年發(fā)病率約為0.1％左右，即全國每年發(fā)生急性病毒性肝炎約120萬例，但估計實際發(fā)病數目比報告數目高出5至8倍，因此每年實際發(fā)病數目應超過600萬。慢性肝炎的病例數目亦高居不下，據中國醫(yī)藥報調查，中國現(xiàn)有慢性肝炎病人2000萬例，每年死于肝病約30萬人，其中50％為原發(fā)性肝細胞癌，絕大多數與乙型和丙型肝炎病毒感染有關。
近年來，有關病毒性肝炎治療藥物的研究，主要分為兩大主流一為抗病毒藥物，主要作用為抑制病毒復制；一為免疫調節(jié)藥物，用于調整患者的免疫反應。在藥物分類上，則可分為疫苗、干擾素、核苷類似物及免疫修飾劑四大類。目前在我國，肝病的治療以干擾素、核苷類似物以及中草藥制劑為主。但是無論是干擾素還是核苷類似物對肝病的治療效果較為有限，而且治療成本較高，給患者帶來較大的經濟壓力，同時這些化學藥副作用大，如干擾素常見的副作用有發(fā)熱、疲勞、肌肉疼痛、血小板減少、白血球減少等；核苷類似物Lamivudine常出現(xiàn)停藥反彈、耐藥性，部分患者還會出現(xiàn)肝臟代償失全等較為嚴重的不良反應。
中醫(yī)對肝病的治療具有長久的歷史，并且總結出一套行之有效的防治經驗，如在金匱要略中將黃疸分為下列數種黃疸、酒疸、女勞疸、黑疸等，并有大量的方劑在廣泛應用。現(xiàn)代研究亦表明，中醫(yī)藥在肝病治療當中確有獨到優(yōu)勢，體現(xiàn)在可以多方面調節(jié)機體平衡，保肝作用確切，不良反應少等；與化學藥物相比，中藥的成本相對較低，開發(fā)傳統(tǒng)藥物治療肝病與我國實際國情相符。
在傳統(tǒng)中醫(yī)當中龍膽為瀉肝膽實火、清下焦?jié)駸嶂?，具有悠久的應用歷史。如以龍膽為君藥的方劑龍膽瀉肝湯、當歸龍薈丸等的使用尤為廣泛。在中醫(yī)當中肝病的病因主要歸于濕熱毒邪內蘊于肝膽，累及其他經絡臟腑，對于肝陽上亢、濕熱黃疸等證，多取龍膽之瀉火除濕之功進行治療。
現(xiàn)代研究亦發(fā)現(xiàn)龍膽中的次生代謝產物龍膽苦苷(gentiopicroside)可以抑制多種原因導致的體內炎癥介質TNF(Tumor Necrosis Factor)水平上升，從而減緩由TNF導致的肝損傷(Yoshikazu Kondo，F(xiàn)umihide Takano，et al.Suppression of Chemically andImmunologically Induced Hepatic Injuries by Gentiopicroside.Planta Med.1994，60414-416)。馬錢酸亦屬于環(huán)烯醚萜苷類物質，其甲酯馬錢素具有顯著的抗炎作用(Maria delCarmen Recio，Rosa Maria Giner，et al.Structural Considerations on the Iridoids asAnti-Inflammatory Agents.Planta Med.1994，60232-234)。因此根據傳統(tǒng)醫(yī)學綜合目前相關專業(yè)領域的基礎研究進展，結合現(xiàn)代新技術對傳統(tǒng)中藥進行二次開發(fā)是中藥現(xiàn)代化的必由之路。

發(fā)明內容
本項發(fā)明是利用現(xiàn)代技術手段，對傳統(tǒng)中藥進行二次開發(fā)的研究成果。對一系列傳統(tǒng)肝病治療用中藥進行系統(tǒng)的研究，以一種先進的技術手段從傳統(tǒng)中藥龍膽當中獲得了一種全新的具有顯著生物活性的龍膽有效部位。本項發(fā)明所涉及龍膽藥材為傳統(tǒng)中藥龍膽，龍膽為龍膽科多年生植物龍膽Gentiana scabra，三花龍膽G.triflora和東北龍膽G.manshurica的根。
本項發(fā)明所解決的技術問題是在藥理篩選模型的基礎之上得到具有顯著保肝、抗炎作用的龍膽有效部位，該有效部位能夠大體上代表傳統(tǒng)藥材的功效，但是具有質量可控，劑量小、使用方便等優(yōu)點，有別于傳統(tǒng)中藥的粗、大、黑的落后面貌；由此有效部位制成的中藥制劑與傳統(tǒng)中成藥相比，在質量可控性、療效等諸多方面有了顯著提高。
本項發(fā)明解決的另外一個重要技術問題是對篩選出的龍膽有效部位進行技術控制，我們從2個方面進行解決，首先是細化制備方法，確保這種龍膽有效部位的穩(wěn)定；其次是制定有效部位的質量標準，對有效部位進行詳盡的化學研究，以合適的技術手段控制有效部位質量。研究發(fā)現(xiàn)篩選出的有效部位主要由馬錢酸和龍膽苦苷組成，故將該活性物質稱為由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位；分析表明馬錢酸和龍膽苦苷的重量百分比為50-95％，不同制備方法得到的提取物含量略有差別；這種由馬錢酸和龍膽苦苷組成的有效部位為我們首次獲得，目前尚未見此類有效部位的報道或是應用。
本項發(fā)明還公開了含有由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位與合適藥用輔料制成的制劑，具體劑型包括針劑、片劑和膠囊劑等。
1、由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的制備參照文獻，龍膽當中的主要次生代謝產物環(huán)烯醚萜苷類物質具有明顯的生物活性，此類物質穩(wěn)定性較差，以水提取降解損失較多，研究發(fā)現(xiàn)以醇/水和丙酮/水混和溶劑提取則可以有效的解決降解問題，尤其是丙酮/水的混和溶媒，可以有效提高此類物質的提取轉移率。龍膽當中還含有大量的單糖、雙糖類物質，這些成分為非活性物質，為獲得較高效價的有效部位，應當選擇性的祛除這些物質。
合成吸附劑可以有效的富集次生代謝產物當中的糖苷類物質，目前在抗生素工業(yè)當中有大量的應用，在中藥當中的應用也逐漸增多。通過比較數種吸附劑制備龍膽有效部位，最終發(fā)現(xiàn)日本三菱化工出產的聚苯乙烯合成吸附劑DIAION HP20型填料制備得到的龍膽有效部位的生物活性和產品穩(wěn)定性均是最好。而且該吸附劑機械、化學穩(wěn)定性均較好，各種合成殘余物均得到有效控制，能夠達到藥物對溶劑殘留的要求。
取龍膽藥材粗粉，加入3-5倍體積的30-90％甲醇、乙醇或丙酮，熱回流提取，每次1小時，提取2-3次；合并提取液，減壓濃縮，至1-5g(生藥)/mL，冷藏24小時以上，過濾或離心除去沉淀。
取DIAION HP20填料裝入層析柱當中，以乙醇充分處理，祛除殘余有機雜質，然后以水洗除乙醇，備用。將上述龍膽提取液上柱，每克填料上0.5-2.5mL藥液，現(xiàn)以2-3倍去離子水沖洗，在以2-4倍40-70％的醇液(甲醇或乙醇)洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮干，真空干燥，得到龍膽有效部位。
2、含有由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位制成的中藥制劑(1)粉針劑取龍膽有效部位，加入適量支架劑及其他必須輔料，如甘露醇、右旋糖苷等，加入活性炭脫色，過濾，調節(jié)PH至7.0，分裝，滅菌，凍干即得。優(yōu)選每支含有龍膽有效部位300mg。
(2)片劑取龍膽有效部位，加入必須量的崩解劑如淀粉、羧甲基淀粉鈉、L-HPC等，潤滑劑如硬脂酸鎂等，以干法或濕法制粒，干燥，壓片，包衣即得。
(3)膠囊劑取龍膽有效部位，加入必須藥用輔料，制粒，干燥，裝膠囊，即得龍膽有效部位硬膠囊劑。軟膠囊劑的制備如下取龍膽有效部位，加入適量植物油如氫化植物油，適量磷脂，過膠體磨混勻，壓制制備得到軟膠囊劑。
3、從龍膽當中得到的有效部位的化學成分的研究取龍膽有效部位20g，以硅膠柱色譜和薄層色譜反復制備得到一系列化合物，具體結構經光譜解析并對照相關參考文獻鑒定(化合物結構如下所示)。其中龍膽苦苷(GS-1)和馬錢酸(GS-3)的量較多(在TLC色譜圖上可以清晰的看到此2化合物的斑點)，由此將該有效部位稱為由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位；獐牙苦苷(GS-2)與馬錢素和龍膽苦苷同屬于環(huán)烯醚萜苷類物質，亦具有明顯的保肝作用，為民間常用的急性肝炎治療用草藥青葉膽的主要活性成分；在該有效部位中，除環(huán)烯醚萜苷外尚含有其他物質，如咖啡酸糖苷(GS-4)等。
根據對龍膽有效部位的化學研究結果，我們制定出了富含馬錢酸和龍膽苦苷的龍膽有效部位的質控項目(1)馬錢酸和龍膽苦苷的檢查、鑒別采用薄層色譜法(TLC)，通過與對照標準物質比較，鑒別出有效部位當中含有的馬錢酸和龍膽苦苷。色譜板正相硅膠板；展開系統(tǒng)甲苯∶甲酸甲酯∶甲醇∶甲酸＝10∶20∶2∶1；顯色劑香草醛-硫酸試液或紫外光254nm觀察；具體薄層色譜圖參見附圖2。
從TLC色譜圖可以清晰的看到龍膽有效部位當中2個主要成分龍膽苦苷和馬錢酸。
(2)馬錢酸和龍膽苦苷含量測定龍膽有效部位中馬錢素和龍膽苦苷的含量測定法參照中國藥典2000版一部，采用HPLC法測定。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑甲醇∶水(3∶7)為流動相；檢測波長為270nm。分別取龍膽有效部位和2個對照品馬錢酸及龍膽苦苷，配制為合適濃度，注入液相色譜儀，外標法計算含量。
馬錢酸和龍膽苦苷的含量占固形物的50-95％。
4、由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的藥理藥效研究采用CCl4所致急性肝損傷模型(小鼠、大鼠)，對龍膽有效部位的保肝效果進行評價，如下述試驗數據，龍膽有效部位具有顯著的保肝作用。
表1小鼠口服龍膽有效部位對CCl4所致急性肝損傷的保護作用N SGPT SGOT對照組 1334.04±8.06 46.09±10.65模型組 1361.42±15.94 69.01±7.12龍膽有效部位(100mg/Kg) 1334.07±11.41**42.58±9.68**龍膽有效部位(200mg/Kg) 1332.90±7.01**36.82±6.13**聯(lián)苯雙酯(150mg/Kg) 1331.51±5.80**34.80±9.81**聯(lián)苯雙酯(300mg/Kg) 1329.17±9.88**32.05±9.48**與模型組比較**P＜0.01表2.大鼠口服GS龍膽有效部位對CCl4所致急性肝損傷的保護作用N SGPT SGOT對照組 1341.33±4.31 69.98±7.24模型組 1385.23±11.40 184.27±33.11龍膽有效部位(70mg/Kg) 1374.08±21.08*119.05±23.82*龍膽有效部位(140mg/Kg) 1358.99±9.89**88.38±24.82**聯(lián)苯雙酯(100mg/Kg) 1346.72±18.89**122.28±17.71*聯(lián)苯雙酯(200mg/Kg) 1340.12±6.78**79.13±11.83**與模型組比較**P＜0.01；*P＜0.05
表3.大鼠靜脈注射龍膽有效部位對CCl4所致急性肝損傷的保護作用N SGPT SGOT對照組 1347.58±8.49 53.17±8.22模型組 1396.00±11.26 161.22±27.17龍膽有效部位(40mg/Kg) 1378.35±13.42*127.71±22.56*龍膽有效部位(80mg/Kg) 1343.85±8.93**69.64±16.31**甘利欣(2mg/Kg) 1356.41±5.42*87.95±19.77*甘利欣(4mg/Kg) 1341.16±5.02**69.12±12.08**與模型組比較**P＜0.01；*P＜0.0

附圖1、3批龍膽有效部位正相TLC色譜圖附圖2、口服龍膽有效部位對小鼠急性肝損傷對保護作用附圖3、口服龍膽有效部位對大鼠急性肝損傷對保護作用附圖4、靜注龍膽有效部位對大鼠急性肝損傷對保護作用具體實施方式
例1、由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的制備實施例1取100g龍膽藥材粗粉，加入30％的乙醇溶液400mL，熱回流1小時，重復提取2次，濾出提取液，合并，減壓回收至100mL，冰箱冷藏1天，離心，取上清液，加入裝有300mL HP20填料的層析柱中，以500mL去離子水沖洗，然后以60％乙醇溶液沖洗，收集乙醇洗脫液600mL，減壓揮干，真空干燥得到龍膽有效部位7.6g。
TLC展開得到的龍膽有效部位，可以看到在與標準品馬錢酸和龍膽苦苷相同的Rf值處均出現(xiàn)清晰的斑點；HPLC法測定馬錢酸和龍膽苦苷的含量，2個主要化合物的含量占有效部位固形物含量的66.54％。
例2、取100g龍膽藥材粗粉，加入40％的丙酮溶液400mL，熱回流1小時，重復提取3次，濾出提取液，合并，減壓回收至100mL，冰箱冷藏2天，離心，取上清液，加入裝有300mLHP20填料的層析柱中，以500mL去離子水沖洗，然后以60％乙醇溶液沖洗，收集乙醇洗脫液600mL，減壓揮干，真空干燥得到龍膽有效部位6.2g。
TLC展開得到的龍膽有效部位，可以看到在與標準品馬錢酸和龍膽苦苷相同的Rf值處均出現(xiàn)清晰的斑點；HPLC法測定馬錢酸和龍膽苦苷的含量，2個主要化合物的含量占有效部位固形物含量的90.54％。
例3、由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的粉針劑的制備實施例粉針劑處方龍膽有效部位 300g甘露醇 300g注射用水 加至4000mL制法按照上述處方，將龍膽有效部位和甘露醇溶于注射用水當中，加入活性炭4g，100℃煮沸15min，靜置24小時；過濾，加稀鹽酸調節(jié)PH至7.0；分裝于10ml西林瓶中，每支4mL；置入凍干機凍干，冷凍溫度為-40℃，5小時；升華溫度-15℃-20℃，共24小時；40℃干燥2小時；壓蓋密封。
性狀本品為淡黃色塊狀物質量指標每支制劑含有龍膽有效部位300mg，每支含馬錢酸和龍膽苦苷不低于150mg(HPLC法測定)。
例4由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的粉針劑的制備實施例粉針劑處方龍膽有效部位 300g右旋糖苷 30g注射用水 加至4000mL制法按照上述處方，將龍膽有效部位和右旋糖苷溶于注射用水當中，加入活性炭4g，100℃煮沸15min，靜置24小時；過濾，加稀鹽酸調節(jié)PH至7.0；分裝于10ml西林瓶中，每支4mL；置入凍干機凍干，冷凍溫度為-40℃，5小時；升華溫度-15℃-20℃，共24小時；40℃干燥2小時；壓蓋密封。
性狀本品為淡黃色塊狀物質量指標每支制劑含有龍膽有效部位300mg，每支含馬錢酸和龍膽苦苷不低于150mg(HPLC法測定)。
例5、由馬錢酸和龍膽苦苷組成的有效部位的膠囊劑的制備膠囊劑處方龍膽有效部位 150g淀粉 90g5％羥丙甲纖維素(HPMC)q.s.
微粉硅膠 1.5g制成1000粒膠囊制法取龍膽有效部位研細，過100目篩，淀粉過80目篩，備用；取HPMC，加水制成5％溶液，作為黏合劑；龍膽有效部位與淀粉以等量遞加法混勻，加入5％HPMC溶液，過30目篩制粒，60℃干燥，30目篩整粒，得到干顆粒；干顆粒加入過100目篩的微粉硅膠混勻；測定顆粒當中中藥物的含量；裝膠囊，裝量約為280mg，包裝即得。
質量指標每粒膠囊含有龍膽有效部位150mg，每粒含馬錢酸和龍膽苦苷不低于75mg(HPLC法測定)。
例6、由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的片劑制備片劑處方龍膽有效部位 300g微晶纖維素 95gL-HPC 20g交聯(lián)CMC-Na 20g硬脂酸鎂 4.0g制成1000片制法按照上述制劑處方，取龍膽有效部位，加入微晶纖維素、L-HPC，以95％乙醇作為黏合劑，過20目篩制軟材，60℃干燥，整粒，加交聯(lián)CMC-Na和硬脂酸鎂混勻后壓片；以7％的LE薄膜包衣即得。
質量指標每片含有龍膽有效部位300mg，每粒含馬錢酸和龍膽苦苷不低于150mg(HPLC法測定)。
例7由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的片劑制備片劑處方
龍膽有效部位 100g玉米淀粉 300g乳糖 70gL-HPC 20g交聯(lián)CMC-Na 20g硬脂酸鎂 4.0g制成1000片制法按照上述制劑處方，取龍膽有效部位，加入淀粉、乳糖、L-HPC，以95％乙醇作為黏合劑，過20目篩制軟材，60℃干燥，整粒，加交聯(lián)CMC-Na和硬脂酸鎂混勻后壓片；以7％的LE薄膜包衣即得。
質量指標每片含有龍膽有效部位100mg，每粒含馬錢酸和龍膽苦苷不低于50mg(HPLC法測定)。
權利要求
1.一種由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位的制備方法，其特征在于該制備方法包括下列步驟(1)取龍膽藥材粗粉，以30-90％甲醇、乙醇或丙酮熱回流提取，提取液減壓濃縮至每毫升濃縮液含有1-5g藥材，冷藏1-2天，離心或過濾除去沉淀，得到提取液；(2)取步驟(1)得到的提取液，以DIAION HP20為填料的柱色譜進行純化，每克填料上0.5-2.5mL藥液，先以2-3倍柱床體積的去離子水沖洗，再以2-4倍柱床體積的40-70％甲醇或乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮干，真空干燥，得到由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位；
2.一種根據權利要求1所述制備方法得到的由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位，其特征在于馬錢酸和龍膽苦苷的重量百分比為50-95％；
3.一種中藥制劑，其特征在于該制劑含20-90重量％的由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位和10-80％藥用輔料；
4.一種如權利要求3所述的中藥制劑，其具體劑型為水針劑、粉針劑、片劑、軟膠囊劑、硬膠囊劑、顆粒劑；
5.根據權利要求1所述制備方法得到的由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位在制備用于治療肝損傷藥物的用途；
6.權利要求5所述的同途，其特征為馬錢酸和龍膽苦苷的重量百分比為50-95％。
全文摘要
本項發(fā)明公開一種由馬錢酸(lognic acid)和龍膽苦苷(gentiopicroside)組成的龍膽有效部位的制備以及該有效部位在制藥領域中的應用。這種由馬錢酸和龍膽苦苷組成的龍膽有效部位來自傳統(tǒng)中藥龍膽，藥理試驗結果表明該有效部位具有顯著的抗炎、利膽作用，對各種原因導致的肝損傷、膽囊炎、膽管阻塞具有良好的治療作用。
文檔編號C07H17/04GK1590398SQ20041004287
公開日2005年3月9日 申請日期2004年5月28日 優(yōu)先權日2004年5月28日
發(fā)明者胡少勇, 袁解乾 申請人:胡少勇, 袁解乾