專利名稱：多叉分支的聚乙二醇－氨基酸寡肽及其活性衍生物和藥物結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽、其活性衍生物、其與藥物分子的結(jié)合物、包含該結(jié)合物的藥物組合物、以及它們的制備辦法、以及它們的生物醫(yī)藥用途、尤其是在制備藥物中的用途。
背景技術(shù)：
天然藥物活性成分中的蛋白質(zhì)、多肽、萜類、甾體、生物堿、黃酮、蒽醌、苯丙素酚類等在生理活性上都表現(xiàn)出各種有效的性能，在醫(yī)藥中得到了廣泛的應(yīng)用。它們的甙類、核苷類、多肽類衍生物也有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用。作為天然活性成分，它們具有生物降解快，基本無殘留，毒副作用小等優(yōu)點。但同時也有相應(yīng)的問題存在，例如生物利用率低、生理半衰期短、水溶性差、引發(fā)機體免疫等不利之處。
為解決此問題，已廣泛地使用聚乙二醇衍生物，使其與蛋白質(zhì)、肽或其他治療藥物的結(jié)合，以延長藥物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在臨床使用中，PEG及其衍生物作為制作藥物制劑的載體已經(jīng)在很多商業(yè)藥品中得到了廣泛的應(yīng)用，而將PEG鍵合到藥物分子的嘗試在最近十年里也得到了長足的發(fā)展，在許多批準藥品中被廣泛使用，如PEG-intron和PEGasys，α-干擾素與聚乙二醇的鍵合物就表現(xiàn)出了更長的循環(huán)半衰期和更好的治療效果。紫杉醇與聚乙二醇的鍵合物也相應(yīng)的降低了毒性和延長了生物活性。聚乙二醇在人體內(nèi)的代謝過程已相當(dāng)清楚，是一種安全的、無副作用的藥物改性劑。
在與藥物結(jié)合時，常用到一種被稱為聚乙二醇化(PEGylation)的工藝，即聚乙二醇的端基被化學(xué)活化后具有一適當(dāng)?shù)墓倌軋F，此官能團對要結(jié)合的藥物中的至少一個官能團具有活性，能與之形成穩(wěn)定的鍵。
有報道表明聚乙二醇可以用于和很多藥物連接。第5824701和5840900號美國專利以及中國專利CN1283643報道了此類衍生物和紫杉醇鍵合的前藥，在該藥物模型中聚乙二醇兩端都只鍵合了一個紫杉醇分子。聚乙二醇為一種線性聚合物，通常僅在其端基位置修飾以用于鍵合藥物分子。為了提高對藥物分子的負載率，第6153655號美國專利披露了一種鏈端分支聚乙二醇結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在聚乙二醇的兩端通過氨基連接生成了兩個功能基團。但是引進非生物的支鏈小分子引進了藥物的不確定性。第5977163和6262107號美國專利以及中國專利CN1164533公開了一種聚谷氨酸支載的紫杉醇前藥，此藥物模型中紫杉醇沿聚谷氨酸骨架鏈隨機的連接到谷氨酸的活性羧基上，較寬的聚合率分布以及對聚谷氨酸毒性的不可確知性限制了該發(fā)明的使用。在本實驗室前期的工作中，一種線性聚乙二醇-氨基酸寡肽(WO03/074586)被成功的合成以用于多種藥物分子。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一個新型的、能夠負載更多藥物的聚乙二醇化合物，以及這種聚乙二醇化合物與藥物分子形成的結(jié)合物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供這種新型聚乙二醇化合物在制備凝膠方面的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的這種新型的聚乙二醇化合物為多叉分支的聚乙二醇化合物，它含有多于兩個的端基。和已有的線性的PEG相比，通過改造后能夠負載更多的藥物分子?；诖祟惗嗖娣种ЫY(jié)構(gòu)的聚乙二醇，本發(fā)明提供一種新型的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽和其活性衍生物，它將能夠明顯提高對藥物分子的負載率。這種多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽活性衍生物還能在適當(dāng)?shù)臈l件下形成凝膠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是提供一種通式I的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其活性衍生物化合物 其中R1選自多羥基結(jié)構(gòu)、多氨基結(jié)構(gòu)或多羧基結(jié)構(gòu)；N是3-2000的一個整數(shù)；m是2-12中的一個整數(shù)；i是3-30中的一個整數(shù)；R2是氨基酸的側(cè)鏈基團，可以相同或不同；X是連接基團，選自于但不限于O(CH2)kCO、O(CH2)kOCO、O(CH2)kNHCO、NR(CH2)kOCO、NR(CH2)kNHCO、NR(CH2)kCO組成的組的基團，且k為0-10的整數(shù)；Y是選自由羥基、酯基、酰氯、酰肼、馬來酰亞胺、吡啶二硫化物活性基團組成的組。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種通式II的聚乙二醇-氨基酸寡肽
其中R1是一個中心分子，含有多個端基活性基團，通過這些基團衍生出的線性聚乙二醇最終形成多叉分支的聚乙二醇，R1可以是多羥基分子、多氨基分子、多羧基分子；n為任何整數(shù)，表征其聚合度，選自3-2000；m是2-12中的一個整數(shù)；i是3-30中的一個整數(shù)，表征分叉數(shù)；R2是相關(guān)氨基酸的側(cè)鏈基團，可以相同，可以不同；X是連接基團，連接多叉分支的聚乙二醇的端基與氨基酸寡肽的氨基，選自于但不限于O(CH2)kCO、O(CH2)kOCO、O(CH2)kNHCO、NR(CH2)kOCO、NR(CH2)kNHCO、NR(CH2)kCO，k為0-10的整數(shù)。
更優(yōu)選地，提供一種通式IIa和通式IIb的化合物 R1是一個中心分子，含有多個端基活性基團，通過這些基團衍生出的線性聚乙二醇最終形成多叉分支的聚乙二醇，R1可以是多羥基分子、多氨基分子、多羧基分子；
n為任何整數(shù)，表征其聚合度，選自3-2000；m是2-12中的一個整數(shù)；j是1-4中的一個整數(shù)；i是3-30中的一個整數(shù)，表征分叉數(shù)；R為選自于以下組中的基團H、C1-12烷基、取代芳基、芳烷基、雜烷基、和取代烷基；X是連接基團，連接多叉分支的聚乙二醇的端基與氨基酸寡肽的氨基，選自于但不限于O(CH2)kCO、O(CH2)kOCO、O(CH2)kNHCO、NR(CH2)kOCO、NR(CH2)kNHCO、NR(CH2)kCO，k為0-10的整數(shù)。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的氨基酸為天然氨基酸和合成氨基酸，優(yōu)選為谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、胱氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、酪氨酸或絲氨酸。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的中心分子R1為季戊四醇或甘油。通過季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇為四叉分支的聚乙二醇，通過甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇為三叉分支的聚乙二醇。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種通式III的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽活性衍生物 其中R1是一個中心分子，含有多個活性基團，通過這些基團衍生出的線性聚乙二醇最終形成多叉分支的聚乙二醇，R1可以是多羥基分子、多氨基分子、多羧基分子；n為任何整數(shù)，表征其聚合度，選自3-2000；m是2-12中的一個整數(shù)；i是3-30中的一個整數(shù)，表征分叉數(shù)；R2是相關(guān)氨基酸的側(cè)鏈基團，可以相同，可以不同；X是連接基團，連接多叉分支的聚乙二醇的端基與氨基酸寡肽的氨基，選自于但不限于O(CH2)kCO、O(CH2)kOCO、O(CH2)kNHCO、NR(CH2)kOCO、NR(CH2)kNHCO、NR(CH2)kCO，k為0-10的整數(shù)；Z是活性基團，選自于但不限于以下組中酯基、碳酸酯基、酰氯、酰肼、馬來酰亞胺、吡啶二硫化物。
在優(yōu)選的實施方案中，所述的氨基酸為天然氨基酸和合成氨基酸，優(yōu)選為谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、胱氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、酪胺酸或絲氨酸。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的R1為季戊四醇或甘油。通過季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇為四叉分支的聚乙二醇，通過甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇為三叉分支的聚乙二醇。
本發(fā)明的另一個方面是提供一種通式IV的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其活性衍生物與藥物分子的結(jié)合物 其中P是上述的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽或其活性衍生物；ii是1-30中的一個整數(shù)；TA為藥物分子；TA與P通過一個易水解的鍵或者一個穩(wěn)定的鍵相聯(lián)接。
上述多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽與藥物分子的結(jié)合物中，氨基酸側(cè)鏈基團R2同樣可以參與連接藥物分子TA。
優(yōu)選地，所述的藥物分子選自由氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、核苷、糖類、有機酸、甙類、黃酮類、醌類、萜類、苯丙素酚類、甾體及其甙類、生物堿組成的組，或者，選自由華蟾酥毒基、甘草次酸、黃楊寧、燈盞乙素和東莨菪內(nèi)酯組成的組。優(yōu)選地，所述藥物分子是選自由紫杉醇(包括多烯紫杉醇和脫乙酰紫杉醇)、喜樹堿(包括依立替康和拓撲替康)、依托泊苷、斑蝥胺、雷公藤甲素以及它們的衍生物組成的組的抗腫瘤劑。
本發(fā)明的再一個方面是提供一種包含上述的結(jié)合物和藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑的藥物組合物，所述的藥物組合物為片劑、栓劑、丸劑、軟和硬明膠膠囊劑、散劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑的劑型。
根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合物可改善藥物吸收，延長作用時間，增強療效，降低給藥劑量及避免某些毒副作用。
本發(fā)明的又一個方面是提供一種由上述的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其衍生物與通式V的化合物R3-(Z1)l(V)形成的凝膠，其中，Z1是活性基團，可以和基團Y反應(yīng)形成共價連接或者非共價鍵連接；l是2-20中的一個整數(shù)；R3為一類含有多個(2-20)Z1活性基團的分子；R3可以是一個聚合物或者小分子。
其中以共價鍵連接形成的凝膠可以下式表征 優(yōu)選地，所述的R3選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯嗎啉、聚氨基酸、它們的共聚物以及它們的衍生物；更優(yōu)選地，所述的R3選自聚賴氨酸或聚谷氨酸，更進一步地，所述的R3選自賴氨酸寡肽或胱氨酸寡肽。
本發(fā)明的再一個方面是提供所述的凝膠在生物醫(yī)藥中的用途，包括包含上述凝膠的手術(shù)阻粘連劑、外科手術(shù)密封材料或藥物載體。
本發(fā)明的凝膠可以用作藥物載體，改善藥物吸收，延長作用時間，增強療效，降低給藥劑量及避免某些毒副作用。
具體實施例方式
聚乙二醇(PEG)，其結(jié)構(gòu)通式如下所示 其中R為H或C1-12烷基，n為任何整數(shù)，表征其聚合度。
當(dāng)R為低級烷基時，R可以是含有1-6個碳原子的任何低級烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正戊基或正己基。當(dāng)R為環(huán)烷基時，R優(yōu)選為含3-7個碳原子的環(huán)烷基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基和環(huán)己基。優(yōu)選的環(huán)烷基為環(huán)己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其他聚乙二醇類似物或聚乙二醇共聚物也可用于此發(fā)明應(yīng)用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯嗎啉等。
對聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成結(jié)合物的聚乙二醇的分子量為300～60000道爾頓，這相當(dāng)于n為大約6～1300。更優(yōu)選的是，n為28、112和450，這分別相應(yīng)于分子量為1325、5000和20000。由于通常由其平均分子量而非自重復(fù)單元限定的起始PEG化合物的潛在不均一性，優(yōu)選用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整數(shù)n表示PEG聚合物中的自重復(fù)單元。
本發(fā)明中所用的多叉分支的聚乙二醇其結(jié)構(gòu)通式如下所示 其中R1是為一中心分子，含有多個端基基團，通過這些基團衍生出的線性聚乙二醇最終形成多叉分支的聚乙二醇，n為任何整數(shù)，表征其聚合度，i表征分叉數(shù)，是3-30中的一個整數(shù)。
R1可以是一個多羥基分子，與線性聚乙二醇通過醚鍵，酯鍵連接。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的R1為多羥基季戊四醇或甘油。通過季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇為通過醚鍵連接的四叉分支的聚乙二醇，通過甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇為三叉分支的聚乙二醇。
R1也可以是一個多氨基分子，與線性聚乙二醇通過氨鍵，酰胺鍵連接。
R1也可以是一個多羧基分子，與線性聚乙二醇通過酯鍵，酰胺鍵連接。
在本發(fā)明的結(jié)合物中所用的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽將氨基酸寡肽、特別是谷氨酸寡肽結(jié)合到該聚合物的母體上，使該聚合物能夠提供與藥物分子的連接點，由此與蛋白質(zhì)、多肽或者其他天然藥物活性成分中的游離氨基、羥基等連接在一起。特別是對小分子的天然藥物活性成分，可以在一個多叉分支的聚乙二醇-谷氨酸寡肽中連接更多個藥物分子，以保證更高的藥物負載率。
與聚谷氨酸不同之處在于，谷氨酸寡肽在每條寡肽鏈中具有確定數(shù)目的活性羧基。因此，當(dāng)結(jié)合藥物如紫杉醇分子時，藥物分子的負載率將很容易確認和重復(fù)。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是除了保留有親水性聚乙二醇或其衍生物通常的溶解性、非免疫原性和無毒等特征外，寡肽基團將提供對藥物分子的負載點。
氨基酸寡肽，其結(jié)構(gòu)通式如下所示 其中m為2-12中的一個整數(shù)，表征其聚合度；R2是相關(guān)氨基酸的側(cè)鏈基團。
例如，對賴氨酸寡肽，R2是-CH2CH2CH2NH2；對絲氨酸寡肽，R2是-CH2OH；對谷氨酸寡肽，R2是-CH2CH2COOH。
寡肽中的氨基酸可以相同(同多肽)，可以不同(異多肽)。
本發(fā)明中使用的氨基酸包括所有天然氨基酸和合成氨基酸。特別優(yōu)選是谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸和絲氨酸。
寡肽合成可參照通用的合成辦法，使用保護氨基酸，在脫水劑的作用下可得到很好產(chǎn)率的氨基酸聚合物。當(dāng)然，如使用的寡肽為同多肽，不存在有結(jié)構(gòu)順序問題，因此可以采用更簡便的辦法制備，如混合酸酐法、活化酯法、N-羧基內(nèi)酸酐(NCA)法等。
以N-羧基內(nèi)酸酐(NCA)法為例 該反應(yīng)具有如下優(yōu)點反應(yīng)速度快，合成周期短；合成結(jié)束后，所得到的氨基游離的肽可以不用分離而直接用于第二輪的肽合成。側(cè)鏈可以較少保護，除NCA的側(cè)鏈需要保護以外，氨基組分只有賴氨酸和半胱氨酸必須保護。
谷氨酸寡肽化合物可以通過本領(lǐng)域中的已知方法制備或者可以從商業(yè)來源得到。
本發(fā)明的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽是通過由多叉分支的聚乙二醇和氨基酸寡肽反應(yīng)行成的。
在實際應(yīng)用中，需要對多叉分支的聚乙二醇的端基部分予以活化，以保證其能夠和寡肽的氨基或者羧基發(fā)生反應(yīng)而將二者結(jié)合。針對需要實現(xiàn)的用途，可以采用以下幾種方法對端基官能團進行改性a.氨基化，氨基化后的親水性聚合物，由反應(yīng)活性較大的氨基取代了羥基，在與一個含羧酸基的分子進行反應(yīng)形成鍵合物中尤其重要。
b.羧基化，親水性聚合物羧基化后，可提高其反應(yīng)性，使之可以和另一含氨基或羥基的分子反應(yīng)形成鍵合物。
c.其他如羧基酯、碳酸酯、酰氯、酰肼、馬來酰亞胺、吡啶二硫化物等改性方式也可適當(dāng)采用。
這幾種方法均可使親水性聚合物和寡肽上的官能團以化學(xué)鍵的方式連接，以使二者的優(yōu)良性能各自得到很好的發(fā)揮。
在目前使用許多藥物、尤其是天然藥物成分中都含有氨基、羧基、羥基等官能團，它們在生物體內(nèi)通常都與單糖、多糖、核苷、多聚核苷、磷?；瘸煞纸Y(jié)合，以形成在生物體中有活性的藥理結(jié)構(gòu)。
因此，多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽可以通過相同的方式和這些藥物分子結(jié)合，以替代生物有機分子，并克服藥物分子在生物體內(nèi)生理半衰期短的，藥效持續(xù)時間短的缺陷。
本發(fā)明的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽與藥物分子的結(jié)合物可以下式表示 其中P是多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽；ii是1-30中的一個整數(shù)，表征聚乙二醇-氨基酸寡肽上的藥物分子數(shù)；TA為藥物分子；連接藥物分子TA的鍵可以是一個易水解的鍵(如酯鍵)或者一個穩(wěn)定的鍵。
多叉分支的聚乙二醇-谷氨基酸寡肽與藥物分子可例如通過反應(yīng)形成酯鍵而結(jié)合在一起，該過程可簡單地如下所示 酯鍵是一個易水解的鍵，在生物體中可以降解而釋放出活性成分。
其他易水解的鍵包括碳酸酯，碳酰胺鍵等。
在本發(fā)明的結(jié)合物中可使用合適的藥物分子構(gòu)成其中的藥物部分，其包括氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、核苷、糖類、有機酸、甙類、黃酮類、醌類、萜類、苯丙素酚類、甾體及其甙類、生物堿等。
在本發(fā)明的結(jié)合物中，藥物分子部分優(yōu)選是由天然植物中分離的藥物活性成分，如華蟾酥毒基、甘草次酸、黃楊寧、燈盞乙素和東莨菪內(nèi)酯。該藥物分子部分特別優(yōu)選是用于治療腫瘤的天然藥物成分，例如紫杉醇、喜樹堿、依托泊苷、斑蝥胺、雷公藤甲素以及它們的衍生物等。其中，喜樹堿的衍生物，包括依立替康和拓撲替康；紫杉醇的衍生物，包括多烯紫杉醇和脫乙酰紫杉醇(泰索第，taxotere)。
本發(fā)明的結(jié)合物可以純化合物形式或適宜的藥物組合物進行給藥，可采用任何可接受的給藥方式或用于類似的用途的試劑進行。因此，采用的給藥方式可選擇通過口、鼻內(nèi)、非腸道、局部、透皮或直腸方式，其形式為固體、半固體、凍干粉或液體藥劑形式給藥，例如，片劑、栓劑、丸劑、軟和硬明膠膠囊劑、散劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑等，優(yōu)選采用適用于精確劑量的簡單給藥的單元劑量形式。組合物可包含常規(guī)藥用載體或賦形劑和作為活性成分(一種或多種)的本發(fā)明的結(jié)合物，此外，還可包含其它藥劑、載體、輔劑等。
通常，根據(jù)所需給藥方式，藥學(xué)上可接受的組合物將包含約1至約99重量％的本發(fā)明結(jié)合物、以及99至1重量％的適宜的藥用賦形劑。優(yōu)選組合物包含約5至75重量％的本發(fā)明結(jié)合物，其余為適宜的藥用賦形劑。
可采用液體形式給藥的藥物組合物例如可通過溶解、分散等手段將本發(fā)明的結(jié)合物(約0.5至約20％)和選擇性存在的藥用輔劑溶解、分散于載體中，載體的實例為水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，從而形成溶液劑或混懸劑。
如果需要的話，本發(fā)明的藥物組合物還可包含少量的輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、抗氧化劑等，例如檸檬酸、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等。
該類劑型的實際制備方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的或者顯而易見的，例如可參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。無論如何，按照本發(fā)明的技術(shù)，所使用的組合物將含有治療有效量的本發(fā)明結(jié)合物，以用于治療相應(yīng)的疾病。
本發(fā)明還提供一種以多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽在適當(dāng)?shù)臈l件下形成的凝膠。該凝膠通過多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽或其活性衍生物與其他分子(包括另一類的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽，聚乙二醇活性衍生物以及其他小分子)反應(yīng)形成。凝膠可以是通過共價鍵或者非共價鍵連接形成。
根據(jù)本發(fā)明，以共價鍵連接形成的凝膠可以下式表征 其中Z1是活性基團，可以和基團Z反應(yīng)形成共價連接；l是2-20中的一個整數(shù)；R3為一類含有多個(2-20)Z1活性基團的分子；R3可以是一個聚合物或者小分子。
下面結(jié)合實例描述本發(fā)明的結(jié)合物及其制備方法，它不限制本發(fā)明。本發(fā)明的實施方式并不局限于上述說明，在不背離本發(fā)明意圖的基礎(chǔ)上所進行的改進和變化也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
實施例實施例1四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽(1a)的制備 10克四叉分支聚乙二醇(分子量為10000)和2克N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯溶于100毫升乙睛中，再加入1毫升無水吡啶。反應(yīng)混合物在氮氣保護下室溫攪拌過夜。多余溶劑通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，產(chǎn)物真空干燥。固體產(chǎn)物加入40毫升無水二氯甲烷中，不溶物通過過濾除去，有機相用醋酸鈉緩沖溶液(0.1M，pH5.5)洗滌一次。再用無水硫酸鈉干燥，濃縮。產(chǎn)物用乙醚轉(zhuǎn)移，過濾真空干燥。產(chǎn)率9.5克(95％)。HNMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氫)，3.24(s，3個氫)，4.45(t，2個氫)，2.82(s，4個氫)。
0.6克谷氨酸二肽(Glu-Glu)溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)，在溶液中添加4克上步反應(yīng)制備的四叉分支聚乙二醇-琥珀酰亞胺基碳酸酯(分子量為10000)。溶液室溫下攪拌6小時，過濾除去渾濁物。殘余物用100毫升異丙醇沉淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥。產(chǎn)物可通過離子交換色譜純化。得到四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽(1a)。產(chǎn)率2.5克。H NMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氫)，4.41(t，2個氫)，2.37(s，2個氫)，2.32(t，2個氫)。
實施例2三叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽(1b)的制備10克三叉分支聚乙二醇(分子量為15000)和1克N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯溶于100毫升乙腈中，再加入0.8毫升無水吡啶。反應(yīng)混合物在氮氣保護下室溫攪拌過夜。多余溶劑通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，產(chǎn)物真空干燥。固體產(chǎn)物加入40毫升無水二氯甲烷中，不溶物通過過濾除去，有機相用醋酸鈉緩沖溶液(0.1M，pH5.5)洗滌一次。再用無水硫酸鈉干燥，濃縮。產(chǎn)物用乙醚轉(zhuǎn)移，過濾真空干燥。產(chǎn)率9.5克(95％)。HNMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氫)，3.24(s，3個氫)，4.45(t，2個氫)，2.82(s，4個氫)。
0.4克谷氨酸二肽(Glu-Glu)溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)，在溶液中添加4克上步反應(yīng)制備的三叉分支聚乙二醇-琥珀酰亞胺基碳酸酯(分子量為10000)。溶液室溫下攪拌6小時，過濾除去渾濁物。殘余物用100毫升異丙醇沉淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥。產(chǎn)物可通過離子交換色譜純化。得到三叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽(1b)。產(chǎn)率2.5克。H NMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氫)，4.41(t，2個氫)，2.37(s，2個氫)，2.32(t，2個氫)。
實施例3四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(2a)的制備 0.3克甘氨酸二肽(Glu-Glu)溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)，在溶液中添加3克實施例1制備的四叉分支聚乙二醇-琥珀酰亞胺基碳酸酯(分子量為10000)。溶液室溫下攪拌6小時，過濾除去渾濁物。殘余物用100毫升異丙醇沉淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥。產(chǎn)物可通過離子交換色譜純化。得到四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(2a)。產(chǎn)率2.5克。HNMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氫)，4.54(t，2個氫)，4.91(s，2個氫)。
實施例4三叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(2b)的制備0.2克甘氨酸二肽(Glu-Glu)溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)，在溶液中添加3克實施例2制備的三叉分支聚乙二醇-琥珀酰亞胺基碳酸酯(分子量為15000)。溶液室溫下攪拌6小時，過濾除去渾濁物。殘余物用100毫升異丙醇沉淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥。產(chǎn)物可通過離子交換色譜純化。得到三叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(2b)。產(chǎn)率2.5克。HNMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氫)，4.54(t，2個氫)，4.91(s，2個氫)。
實施例5四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽與紫杉醇的結(jié)合物的制備 1.35克由實施例3制得的四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(分子量為10000)、0.5克紫杉醇、0.1克4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于15毫升無水二氯甲烷中，再添加0.2克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。溶液在氮氣保護下，室溫過夜攪拌反應(yīng)。多余溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，殘余物添加8毫升1，4-二氧六環(huán)溶解。過濾除去沉淀，溶液濃縮，殘余物添加30毫升異丙醇(IPA)，過濾，產(chǎn)物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽-紫杉醇酯(3)。產(chǎn)率1.3克。熔點59-62℃。
實施例6四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽和喜樹堿衍生物的結(jié)合物的制備 0.7克喜樹堿(Camptothecin)和0.5克N-叔丁氧羰基甘氨酸(BOC-gly)，溶解在10毫升無水二氯甲烷中，加入0.62克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和0.36克4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌過夜。過濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的固體，減壓濃縮溶液，加入50毫升乙醚。過濾收集沉淀真空干燥。
0.5克喜樹堿N-叔丁氧羰基甘氨酸酯(由上步制得)溶解在10毫升氯仿中，添加10毫升三氟乙酸，室溫下攪拌5小時。減壓濃縮溶液，加入50毫升乙醚。過濾，收集沉淀，真空干燥，制得喜樹堿衍生物。
0.5克由實施例1制得的四叉分支聚乙二醇谷氨酸二肽(分子量為10000)、0.3克喜樹堿衍生物(由上一步制備)、32毫克的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于30毫升無水二氯甲烷中，再添加0.2克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。溶液在氮氣保護下，室溫過夜攪拌反應(yīng)。多余溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，殘余物添加50毫升異丙醇(IPA)，過濾，產(chǎn)物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-甘氨酸-喜樹堿酯(4)。產(chǎn)率0.5克。熔點60-63℃。
實施例7四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽和華蟾酥毒基(Cinobufagin)結(jié)合物的制備 0.5克四叉分支聚乙二醇谷氨酸二肽(由實施例1制得，分子量為10000)溶解在10毫升二氯甲烷中。添加300毫克華蟾酥毒基，32毫克4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和200毫克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。溶液在氮氣保護下，室溫過夜攪拌反應(yīng)。多余溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，殘余物添加20毫升1，4-二氧六環(huán)溶解。過濾除去沉淀，溶液濃縮，殘余物添加100毫升異丙醇(IPA)，過濾，產(chǎn)物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-華蟾酥毒基酯(5)。產(chǎn)率0.5克。熔點58-60℃。
實施例8四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽和東莨菪內(nèi)酯(Scopoletin)結(jié)合物的制備
1克四叉分支聚乙二醇谷氨酸二肽(由實施例1制得，分子量為10000)溶在25毫升二氯甲烷中，再加入0.30克的東莨菪內(nèi)酯，0.1克的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和0.4克的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。此溶液在室溫下氮氣保護攪拌12小時。溶液減壓蒸除，殘余物添加100毫升異丙醇(IPA)。過濾收集沉淀再用乙醚洗滌后抽干。合并沉淀物，真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-東莨菪內(nèi)酯(6)。產(chǎn)率1克。熔點58-61℃。
實施例9四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物的制備 2克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸寡肽(分子量為10000，由實施例3制備)，溶在25毫升二氯甲烷中，再加入90毫克的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0.2毫克的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。此溶液在室溫下氮氣保護攪拌12小時。溶液減壓蒸除，殘余物添加100毫升異丙醇(IPA)。過濾收集沉淀，再用乙醚洗滌后抽干。真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽-N-羥基琥珀酰亞胺酯(7)。產(chǎn)率1.8克。熔點55-57℃。
實施例10四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽(8)的制備 0.3克N-9-芴甲氧羰基-賴氨酸四肽(Fmoc-Lys-Fmoc-Lys-Fmoc-Lys-Fmoc-Lys)溶于20毫升二甲基甲酰胺(DMF)，在溶液中添加3克四叉分支聚乙二醇-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(分子量為10000，由實施例1制備)。溶液室溫下攪拌6小時，過濾除去渾濁物。溶液用100毫升異丙醇，沉淀，過濾。濾液添加100毫升乙醚沉淀。合并沉淀物，溶解在20毫升氯仿中，添加5毫升哌啶，室溫下攪拌3小時。減壓濃縮溶液，加入50毫升異丙醇。過濾，收集沉淀，產(chǎn)物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽(8)。產(chǎn)率2.0克。熔點55-57℃。
實施例11由四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物和聚乙二醇二胺制備凝膠 200毫克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸寡肽活性衍生物(分子量為10000，由實施例9制備)，溶解在2毫升的乙酸鹽緩沖溶液(10mM，pH5.0)中，加入2毫升磷酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH7.4)，其中含200毫克聚乙二醇二胺(分子量為5000)，溶液輕輕震搖直至形成凝膠。
實施例12由四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物和小分子胺(賴氨酸二肽)制備凝膠 200毫克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物(分子量為10000，由實施例9制備)，溶解在1毫升的乙酸鹽緩沖溶液(10mM，pH5.0)中，加入1毫升磷酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH7.4)，其中含20毫克賴氨酸二肽，溶液輕輕震搖直至形成凝膠。
實施例13由四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物和另一四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽制備凝膠 200毫克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物(分子量為10000，由實施例9制備)，溶解在2毫升的乙酸鹽緩沖溶液(10mM，pH5.0)中，加入2毫升磷酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH7.4)，其中含100毫克四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽(分子量為10000，由實施例10制備)，溶液輕輕震搖直至形成凝膠。
實施例14由四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽和聚谷氨酸制備凝膠 200毫克四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽(分子量為10000，由實施例10制備)，溶解在1毫升的磷酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH7.4)中，加入1毫升磷酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH7.4)，其中含50毫克聚谷氨酸(分子量為10000)，溶液輕輕震搖直至形成凝膠。
實施例15藥物組合物本實施例說明代表性非胃腸道給藥的藥物組合物的制備過程，所述組合物包含本發(fā)明的結(jié)合物。
成分實施例5的結(jié)合物 2克0.9％鹽水溶液至100毫升將實施例5的結(jié)合物溶解于0.9％鹽水溶液，得到100毫升的靜脈注射用溶液，將其通過0.2μm的膜過濾材料過濾，在無菌條件下包裝。
權(quán)利要求
1.通式I的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其活性衍生物化合物 其中R1選自多羥基結(jié)構(gòu)、多氨基結(jié)構(gòu)或多羧基結(jié)構(gòu)；N是3-2000的一個整數(shù)；m是2-12中的一個整數(shù)；i是3-30中的一個整數(shù)；R2是氨基酸的側(cè)鏈基團，可以相同或不同；X是連接基團，選自由O(CH2)kCO、O(CH2)kOCO、O(CH2)kNHCO、NR(CH2)kOCO、NR(CH2)kNHCO、NR(CH2)kCO組成的組的基團，且k為0-10的整數(shù)；Y是選自由羥基、酯基、酰氯、酰肼、馬來酰亞胺、吡啶二硫化物活性基團組成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，所述的化合物為通式II的聚乙二醇-氨基酸寡肽
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述的化合物為通式IIa的化合物 其中，R為選自由H、C1-12烷基、取代芳基、芳烷基、雜烷基、和取代烷基組成的組的基團。
4.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述的化合物為通式IIb的化合物 其中，R為選自由H、C1-12烷基、取代芳基、芳烷基、雜烷基、和取代烷基組成的組的基團。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述的氨基酸為天然氨基酸和合成氨基酸。
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其中，所述的氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、胱氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、酪氨酸或絲氨酸。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述的R1為季戊四醇、甲基葡萄糖甙、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油或聚甘油結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇-氨基酸寡肽為四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽(1a)；三叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽(1b)；四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(2a)；三叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽(2b)；或四叉分支聚乙二醇-賴氨酸四肽(8)。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物為通式III的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽活性衍生物 其中Z是選自由酯基、酰氯、酰肼、馬來酰亞胺、吡啶二硫化物活性基團組成的組。
10.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中，所述的Z為N-羥基琥珀酰亞胺酯基。
11.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中，所述的氨基酸為天然氨基酸和合成氨基酸。
12.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中，所述的氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、胱氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、酪胺酸或絲氨酸。
13.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中，所述的R1為季戊四醇、甲基葡萄糖甙、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油或聚甘油結(jié)構(gòu)
14.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中，所述的衍生物為四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽-N-羥基琥珀酰亞胺酯(7)。
15.通式IV的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其活性衍生物與藥物分子的結(jié)合物 其中P是如權(quán)利要求1-13之一的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽或其活性衍生物；ii是1-30中的一個整數(shù)；TA為藥物分子；TA與P通過一個易水解的鍵或者一個穩(wěn)定的鍵相聯(lián)接。
16.如權(quán)利要求15所述的結(jié)合物，其中，所述的藥物分子選自由氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、核苷、糖類、有機酸、甙類、黃酮類、醌類、萜類、苯丙素酚類、甾體及其甙類、生物堿組成的組。
17.如權(quán)利要求15所述的結(jié)合物，其中，所述的藥物分子選自由華蟾酥毒基、甘草次酸、黃楊寧、燈盞乙素和東莨菪內(nèi)酯組成的組。
18.如權(quán)利要求15所述的結(jié)合物，其中，所述藥物分子是選自由紫杉醇、喜樹堿、依托泊苷、斑蝥胺、雷公藤甲素以及它們的衍生物組成的組的抗腫瘤劑。
19.如權(quán)利要求18所述的結(jié)合物，其中，所述的喜樹堿衍生物選自依立替康和拓撲替康。
20.如權(quán)利要求18所述的結(jié)合物，其中，所述的紫杉醇的衍生物選自多烯紫杉醇和脫乙酰紫杉醇。
21.如權(quán)利要求14所述的結(jié)合物，其中，所述的結(jié)合物為四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽-紫杉醇酯(3)；四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-甘氨酸-喜樹堿酯(4)；四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-華蟾酥毒基酯(5)；或四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-東莨菪內(nèi)酯(6)。
22.包含如權(quán)利要求14-21之任一項所述的結(jié)合物以及藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，所述的藥物組合物為片劑、栓劑、丸劑、軟和硬明膠膠囊劑、散劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑的劑型。
24.一種由如權(quán)利要求1-14之一的多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其衍生物與通式V的化合物R3-(Z1)l(V)形成的凝膠，其中，Z1是活性基團，可以和基團Y或Z反應(yīng)形成共價連接或者非共價鍵連接；l是2-20中的一個整數(shù)；R3為一類含有多個(2-20)Z1活性基團的分子；R3可以是一個聚合物或者小分子。
25.如權(quán)利要求24所述的凝膠，其中，所述的R3選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯嗎啉、聚氨基酸、它們的共聚物以及它們的衍生物。
26.如權(quán)利要求24所述的凝膠，其中，所述的R3選自聚賴氨酸或聚谷氨酸。
27.如權(quán)利要求24所述的凝膠，其中，所述的R3選自賴氨酸寡肽或胱氨酸寡肽。
28.包含如權(quán)利要求24-27之一所述凝膠的手術(shù)阻粘連劑、外科手術(shù)密封材料或藥物載體。
全文摘要
一種通式II的多叉分支的聚乙二醇－氨基酸寡肽以及活性衍生物，其中R
文檔編號C07K17/08GK1706865SQ20041004801
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月11日
發(fā)明者嵇世山, 朱德權(quán) 申請人:北京鍵凱科技有限公司