專利名稱：白花敗醬草中幾種高純度藥用物質(zhì)的快速制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分的分離純化方法，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及的是白花敗醬草中高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷高速逆流色譜快速分離制備方法。
背景技術(shù)：
白花敗醬草(Patrinia Villosa Juss)又名苦菜、苦齋、鹿腸，系敗醬科多年生草本植物，分布于我國(guó)華東、華中、華南及西南各地。因其含有多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等有益成份而被人們廣泛食用，它也是一種常用中藥，始載于《神龍本草經(jīng)》，后又被《中國(guó)藥典》(1977版)收載，具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、清心安神、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、改善肝功能、增強(qiáng)抑菌和抗病毒等作用，臨床上常用于治療闌尾炎、痢疾、肝炎、扁桃體炎、流行性腮腺炎、癰腫等癥?，F(xiàn)代研究表明白花敗醬草主要含有三萜類與環(huán)烯醚萜類化合物如白花敗醬醇甙(villosolside)、白花敗醬醇(villosol)、番木別甙(loganin)、莫諾甙(morroniside)、白花敗醬甙(villoside)等，此外還有以敗醬烯與異敗醬烯為主的揮發(fā)油、內(nèi)酯、香豆素等，但很多未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，也未見(jiàn)相關(guān)專利，更未見(jiàn)有從白花敗醬草分離得到具有多種藥理活性的金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷[F.U.Afifi，E.Khalil，S.Abdalla，Journal of Ethnopharmacology，65(1999)，173-177；Didem Deliorman Orhan，Mustafa Alsan，Goknur Aktay ect，LifeScience，72(2003)，2273-2283.]的報(bào)道，它們的結(jié)構(gòu)式如下
金色酰胺醇酯 異葒草苷 異牡荊苷采用柱色譜法和重結(jié)晶等傳統(tǒng)的分離制備方法分離植物中的有效單體，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、污染環(huán)境[C.L Ky，M.Noirot，S.Hamon，J.Agric.Food.Chem.1997，45786；W.M.Yan，Acta Botanica Sinica，1979，2054；J.J Liu，G.L.Zhao，H.Wang，X.H.Zhang，J.Cent.South.Univ.T.2002，9246]，而且所用固定相對(duì)樣品有不可逆性吸附作用等不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
因此，人們對(duì)采用效果更好的分離技術(shù)來(lái)解決上述問(wèn)題存在需求。
本發(fā)明的目的是提供一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題。
高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一種較新的液液分配色譜技術(shù)，它不用任何固體支撐體或載體而克服了傳統(tǒng)分離方法對(duì)樣品的不可逆性吸附作用，因而樣品回收率高，同時(shí)還具有應(yīng)用范圍廣、儀器操作簡(jiǎn)單、分離量大等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備當(dāng)中。
本發(fā)明提供的從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法具體包括藥材提取、粗提物制備及粗提物的分離純化三道工序，其特征在于工序(1)采用不同濃度的乙醇依次提取藥材獲取提取物，工序(2)采用有機(jī)溶劑對(duì)提取物分段萃取并結(jié)合硅膠柱層析得到粗提物，工序(3)采用高速逆流色譜法對(duì)粗提物進(jìn)行分離純化，它包括配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)入制備好的粗提物樣品，根據(jù)檢測(cè)圖譜接收目標(biāo)組分。
1.藥材提取取白花敗醬藥材適當(dāng)粉碎后，先用40％乙醇回流提取，過(guò)濾后的藥渣再用95％乙醇回流提取，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味。
2.部位獲取取提取所得浸膏，加適量水混懸后，先用石油醚萃取，靜止分取石油醚層，再向水層中加入正丁醇萃取，靜止后分取正丁醇層，減壓濃縮石油醚和正丁醇萃取物，真空干燥。
取石油醚萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯剃度洗脫，接收石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脫流份，以此為進(jìn)一步分離純化樣品。
3.部位的分離純化應(yīng)用高速逆流色譜分離純化，它包括步驟(1)配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成分，(2)石油醚萃取物的硅膠柱初分物所用溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成，(3)正丁醇萃取物所用溶劑體系由乙酸乙酯、正丁醇、水組成。
其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的用量比為1∶1∶1∶1，乙酸乙酯、正丁醇、水的用量比為2∶1∶3。
4.分離物的純度檢測(cè)與結(jié)構(gòu)鑒定采用高效液相色譜法對(duì)分得組分進(jìn)行純度檢測(cè)(峰面積歸一化法)，揮干溶劑后進(jìn)行MS、1HNMR和13CNMR分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。
本發(fā)明是采用高速逆流色譜對(duì)中藥粗提物進(jìn)行分離純化，簡(jiǎn)便、快速，同時(shí)也避免了樣品損失?？朔藗鹘y(tǒng)制備方法操作繁瑣、分離周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，并具有制備量大、分離效率高、產(chǎn)品純度好、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣使用。


圖1為石油醚萃取物的半制備型高速逆流色譜(HSCCC)的色譜2為正丁醇萃取物的半制備型高速逆流色譜(HSCCC)的色譜3為為石油醚和正丁醇粗提物及各分離部分的高效液相色譜(HPLC)的色譜圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明實(shí)施例11.稱取白花敗醬草藥材粗粉6.0kg，用10倍量40％乙醇回流提取兩次，每次1.5h，過(guò)濾，向?yàn)V渣中加入8倍量95％乙醇再次回流提取2次，每次1.5h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏約2000ml。
2.取濃縮后的浸膏，加1000ml水混懸后，置于5000ml分液漏斗中，加石油醚1000ml充分振搖后靜止分層，分取石油醚層，如此萃取三次，合并石油醚萃取液。再向水層中加入1000ml正丁醇，充分振搖后靜止分層，分取正丁醇層，如此萃取三次，合并正丁醇萃取液。減壓濃縮萃取液(濃縮溫度60度)后減壓干燥得石油醚萃取物150g，正丁醇萃取物25g。
3.取石油醚萃取物150g進(jìn)行硅膠柱層析(8.0×120cm，硅膠量2500g，200-300目)，依次用石油醚∶乙酸乙酯(20∶1-1∶1)剃度洗脫，接收石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脫液，減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得固體量600mg。
4.應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)分離純化石油醚萃取物的硅膠柱初分物和正丁醇萃取物。
(1)石油醚萃取物的硅膠柱初分物的高速逆流色譜分離純化溶劑體系及用量體積比為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1∶1∶1，逆流色譜柱體積為300ml，上樣量600mg，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率54％，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，在此情況下記錄的色譜圖見(jiàn)圖1。
具體的操作步驟是按上述溶劑體積比配制溶劑體系，在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，分取上下相，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成份，結(jié)果分離得到1個(gè)部分，即流份“I”。
對(duì)該部分進(jìn)行高效液相分析表明“I”為單一色譜峰，峰純度為99.2％。
(2)正丁醇萃取物的高速逆流色譜分離純化溶劑體系及用量體積比為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，逆流色譜柱體積為300ml，上樣量250mg，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率49％，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，在此情況下記錄的色譜圖見(jiàn)圖2。
具體的操作步驟同(1)，結(jié)果分離得到2個(gè)部分，即“II”和“III”。
對(duì)這兩部分進(jìn)行高效液相分析表明“II”和“III”均為單一色譜峰，峰純度分別為98.3％和99.1％。
HPLC分析條件色譜柱Lichrospher C18(6.0×150mmi.d.5μm)，石油醚萃取物的硅膠柱初分物流動(dòng)相為CH3CN∶H2O∶HAC＝70∶30∶1，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254mn，在此條件下石油醚萃取物的硅膠柱初分物及HSCCC分離部分色譜圖見(jiàn)圖3。正丁醇萃取物流動(dòng)相為CH3CN∶H2O∶HAC＝20∶80∶1，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，在此條件下正丁醇萃取物及各分離部分的色譜圖見(jiàn)圖3。其中圖3-1為石油醚萃取物的硅膠柱初分物色譜圖，圖3-2為石油醚萃取物的硅膠柱初分物的HSCCC分離部分(金色酰胺醇酯)色譜圖，圖3-3為正丁醇萃取物色譜圖，圖3-4為異葒草苷色譜圖，圖3-5為異牡荊苷色譜圖，峰1為金色酰胺醇酯，峰2為異葒草苷，峰3為異牡荊苷。
結(jié)構(gòu)鑒定對(duì)分離得到的金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷在VarianINOVA-500型核磁共振儀和Varian MAT-212型質(zhì)譜儀上，進(jìn)行1HNMR、13CNMR和MS分析，所得數(shù)據(jù)如下。
金色酰胺醇酯白色針狀結(jié)晶(乙酸乙酯)，UVλmax(nmMeOH)254nm。TOF-MS467.16[M+Na]+，911.29[2M+Na]。HR-TOF/MS444.1947，分子式為C27H28N2O4。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ166.03、170.14、171.05為三個(gè)羰基碳信號(hào)，三個(gè)季碳信號(hào)(138.21、137.92、134.01)，15個(gè)處于較低場(chǎng)且對(duì)稱的次甲基信號(hào)(131.16～126.11)，兩個(gè)處于較高場(chǎng)的次甲基碳信號(hào)(54.76、49.06)，三個(gè)亞甲基碳信號(hào)(64.54、37.16、36.52)，一個(gè)甲基碳信號(hào)(20.50)。
在1HNMR(500MHz，DMSO-d6)中，δ8.25(d，J＝8.5Hz)和7.91(d，J＝8.1Hz)為N原子上連接的H信號(hào)，δ7.87～7.12為15個(gè)對(duì)稱的芳基質(zhì)子信號(hào)，δ4.82和4.30為兩個(gè)次甲基質(zhì)子信號(hào)，δ3.15、3.09、4.55、3.98、2.84為亞甲基碳上質(zhì)子信號(hào)。
異葒草苷黃色粉末，UVλmax(nm MeOH)348，270，255。TOF-MS447[M+1]-，895[2M-1]-，471[M+Na]+，919[2 M+Na]+，449[M+1]+，487[M+K]+。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.55(1H，brs，5-OH)，7.44(1H，dd，J＝2.5Hz，9.0Hz，6′-H)，7.38(1H，d，J＝2.5Hz，2′-H)，6.90(1H，d，J＝9.0Hz，5′-H)，6.64(1H，S，3-H)，4.58(1H，d，J＝10.0Hz，1″-H)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ163.44(C-2)，102.38(C-3)，181.45(C-4)，160.59(C-5)，108.88(C-6)，163.44(C-7)，93.73(C-8)，156.27(C-9)，102.79(C-10)，121.56(C-1′)，112.92(C-2′)，145.95(C-3′)，150.44(C-4′)，116.00(C-5′)，118.82(C-6′)，73.18(C-1″)，70.50(C-2″)，78.95(C-3″)，70.19(C-4″)，81.35(C-5″)，61.34(C-6″)。
異牡荊苷 黃色粉末，UVλmax(nm MeOH)334，270，302i。TOF-MS455[M+Na]+，433[M+1]+，471[M+K]+，887[2M+Na]+，903[2M+K]+。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.46(1H，brs，5-OH)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz，3′，5′-H)，6.94(2H，d，J＝8.4Hz，2′，6′-H)，6.71(1H，s，3-H)，6.42(1H，s，8-H)，4.56(1H，d，J＝9.8Hz，1″-H)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ163.32(C-2)，102.60(C-3)，181.73(C-4)，160.64(C-5)，108.95(C-6)，163.32(C-7)，93.79(C-8)，156.31(C-9)，102.95(C-10)，121.00(C-1′)，128.35(C-2′，6′)，116.01(C-3′，5′)，161.32(C-4′)，73.13(C-1″)，70.52(C-2″)，78.93(C-3″)，70.20(C-4″)，81.38(C-5″)，61.37(C-6″)。
權(quán)利要求
1.一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，具體包括藥材提取、粗提物制備及粗提物的分離純化三道工序，其特征在于工序(1)采用不同濃度的乙醇依次提取藥材獲取提取物，工序(2)采用有機(jī)溶劑對(duì)提取物分段萃取并結(jié)合硅膠柱層析得到粗提物，工序(3)采用高速逆流色譜法對(duì)粗提物進(jìn)行分離純化，它包括配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)入制備好的粗提物樣品，根據(jù)檢測(cè)圖譜接收目標(biāo)組分。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于工序(1)中不同濃度乙醇為40％和95％的藥用乙醇，先用40％乙醇提取藥材后再用95％乙醇提取，合并提取液，減壓濃縮至浸膏
3.按照權(quán)利要求1所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于工序(2)中提取液萃取所用的有機(jī)溶劑為石油醚(60-90℃)和正丁醇，先用石油醚萃取，再用正丁醇萃取，得到石油醚和正丁醇萃取物。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于石油醚萃取物首先進(jìn)行硅膠柱初分，用石油醚-乙酸乙酯剃度洗脫，接收石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脫流份，以此為進(jìn)一步分離純化樣品。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于采用高速逆流色譜法對(duì)所得粗提物進(jìn)行分離純化，石油醚萃取物的硅膠柱分離物的高速逆流色譜法中所用的兩相溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水。
6.按照權(quán)利要求1或5所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于高速逆流色譜法中所用溶劑體系正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的最佳配比為1∶1∶1∶1，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。
7.按照權(quán)利要求1或3所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于對(duì)正丁醇部位粗提物的高速逆流色譜法進(jìn)行分離純化所用的兩相溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯∶正丁醇∶水。
8.按照權(quán)利要求1或7所述的一種從白花敗醬草中分離純化高純度金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷的方法，其特征在于高速逆流色譜法中所用兩相溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯∶正丁醇∶水的最佳配比為2∶1∶3，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。
全文摘要
本發(fā)明提供白花敗醬草幾種高純度藥用物質(zhì)的快速制備方法。它包括(1)藥材提取，(2)粗提物制備，(3)所得粗提物的高速逆流色譜分離純化，它包括配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成分，所構(gòu)成的兩相溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水和乙酸乙酯、正丁醇、水組成。由該法經(jīng)一步洗脫得到純度高于98％的金色酰胺醇酯、異葒草苷和異牡荊苷。本方法具有制備量大、操作簡(jiǎn)便、快速、樣品無(wú)損失等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣使用。
文檔編號(hào)C07C231/22GK1634875SQ20041006801
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者范國(guó)榮, 彭金詠, 洪戰(zhàn)英, 柴逸峰, 吳玉田, 汪學(xué)昭 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)