專利名稱：用離子交換層析純化蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及蛋白質(zhì)純化。具體說，本發(fā)明涉及使用離子交換層析從包含多肽和至少一種污染物的組合物中純化多肽(例如抗體)。
背景技術(shù)：
對于生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)來說，蛋白質(zhì)的大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)的純化是一個日逾重要的問題。通常，使用經(jīng)過基因工程改造能產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的哺乳動物或細(xì)菌細(xì)胞系，通過插入一種含有該蛋白質(zhì)基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來產(chǎn)生蛋白質(zhì)。由于所用的細(xì)胞系是活的有機(jī)體，它們必須用含有糖、氨基酸和生長因子，通常由動物血清制備物提供的復(fù)合生長培養(yǎng)基來喂養(yǎng)。從喂養(yǎng)給細(xì)胞的化合物混合物中和從細(xì)胞本身的副產(chǎn)品中，將所需蛋白質(zhì)分離出來，達(dá)到足夠作為人治療用的純度，是一種艱難的挑戰(zhàn)。
從細(xì)胞碎片中純化蛋白質(zhì)的程序首先由蛋白表達(dá)的位點所決定?？墒挂恍┑鞍踪|(zhì)直接從細(xì)胞分泌到周圍的生長培養(yǎng)基中；其它蛋白質(zhì)則在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。對于后一種蛋白質(zhì)，純化過程的第一步涉及裂解細(xì)胞，這可通過不同方法完成，包括機(jī)械剪切、滲透壓休克或酶處理。這些破壞方法使細(xì)胞的全部內(nèi)容物釋放到組織勻漿中，并額外產(chǎn)生了由于其體積小難于除去的亞細(xì)胞片段。通常須通過差速離心或過濾除去它們。在蛋白質(zhì)產(chǎn)生過程中，由于細(xì)胞自然死亡直接分泌的蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，也產(chǎn)生同樣的問題，盡管量較小。
一旦獲得了含有感興趣蛋白質(zhì)的澄清溶液，通常嘗試聯(lián)合應(yīng)用不同層析技術(shù)來將其與細(xì)胞產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)分離。這些技術(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷、疏水程度、或大小來分離蛋白質(zhì)混合物。這些技術(shù)中的每一種都可采用數(shù)種不同的層析樹脂，這使得可對涉及的具體蛋白質(zhì)制定專用的純化方案。各種這些分離方法的要點是，使蛋白質(zhì)以不同速度沿一根長層析柱向下運動，而達(dá)到物理性分離，這種分離隨蛋白質(zhì)沿柱再向下運動而增加，或選擇性的粘附于分離基質(zhì)，再以不同溶劑差別性洗脫。就某些情況而言，當(dāng)雜質(zhì)特異性粘附于層析柱，而感興趣的蛋白質(zhì)不粘附時，所需蛋白質(zhì)即可與雜質(zhì)分離開來，即，感興趣的蛋白質(zhì)存在于“流穿液”中。
離子交換層析是一種常用于蛋白質(zhì)純化的層析技術(shù)。在離子交換層析中，如果周圍緩沖液的離子強(qiáng)度足夠低，溶質(zhì)表面的帶電部分就被結(jié)合在層析基質(zhì)上的相反電荷所吸引。通?？商岣呔彌_液的離子強(qiáng)度(亦即，導(dǎo)電率)與溶質(zhì)競爭離子交換介質(zhì)的帶電位點，來實現(xiàn)洗脫。改變pH從而改變?nèi)苜|(zhì)帶電荷量是實現(xiàn)溶質(zhì)洗脫的另一種方法。導(dǎo)電率或pH的改變可以是逐漸的(梯度洗脫)或分步的(分步洗脫)。在過去，這些改變是漸進(jìn)的，亦即，pH或?qū)щ娐蕟蜗蛟龃蠡驕p小。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一種離子交換層析方法，其中使感興趣的多肽在第一導(dǎo)電率或pH下與離子交換材料結(jié)合，然后用導(dǎo)電率或pH不同的，或兩者都不同的中間緩沖液洗滌離子交換材料。在該中間洗滌后的特定時刻，與離子交換層析的標(biāo)準(zhǔn)方法相反，用洗滌緩沖液洗滌離子交換材料，其中從中間緩沖液改變到洗滌緩沖液的導(dǎo)電率或pH、或兩者，與前面步驟中導(dǎo)電率或pH、或兩者的改變方向相反。在用洗滌緩沖液洗滌準(zhǔn)備好離子交換材料后，才通過使用洗脫緩沖液(它具有和前面步驟中使用的緩沖液的導(dǎo)電率或pH、或兩者都不同的導(dǎo)電率或pH、或兩者)來洗脫感興趣的多肽分子。
離子交換層析的本新穎應(yīng)用方法對必須以充分生產(chǎn)規(guī)模(其中同時要求多肽產(chǎn)物的純度和高回收率)從非常接近的相關(guān)污染物分子中分離產(chǎn)物分子特別有用。
因此，本發(fā)明提供了一種從包括多肽和污染物的組合物中純化多肽的方法，該方法包括依次進(jìn)行的下列步驟(a)用加樣緩沖液使多肽結(jié)合到離子交換材料上，其中加樣緩沖液處于第一導(dǎo)電率和pH；(b)用第二導(dǎo)電率和/或pH的中間緩沖液洗滌離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下污染物；
(c)用第三導(dǎo)電率和/或pH的洗滌緩沖液洗滌離子交換材料，其中從中間緩沖液到洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH的變化，和從加樣緩沖液到中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH的變化方向相反；和(d)用第四導(dǎo)電率和/或pH的洗脫緩沖液洗滌離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下多肽。第一導(dǎo)電率和/或pH可以和第三導(dǎo)電率和/或pH相同。
當(dāng)離子交換材料包括陽離子交換樹脂時，中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH優(yōu)選比加樣緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH大；洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH優(yōu)選比中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH??；而洗脫緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH優(yōu)選比中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH大。優(yōu)選的，洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH與加樣緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH相同。
污染物和多肽的優(yōu)選洗脫是通過分別改變中間緩沖液和洗脫緩沖液的導(dǎo)電率同時保持這兩種緩沖液的pH大致相同來實現(xiàn)的。
本發(fā)明還提供了一種從包含多肽和污染物的組合物中純化多肽的方法，該方法包括依次進(jìn)行的下列步驟(a)用加樣緩沖液使多肽結(jié)合到陽離子交換材料上，其中加樣緩沖液處于第一導(dǎo)電率和pH；(b)用比加樣緩沖液大的第二導(dǎo)電率和/或pH的中間緩沖液洗滌陽離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下污染物；(c)用比中間緩沖液小的第三導(dǎo)電率和/或pH的洗滌緩沖液洗滌離子交換材料；和(d)用比中間緩沖液大的第四導(dǎo)電率和/或pH的洗脫緩沖液洗滌離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下多肽。
此外，本發(fā)明提供了一種從包含抗體和污染物的組合物中純化抗體的方法，該方法包括將組合物加到陽離子交換樹脂上，其中加到陽離子交換樹脂上的抗體量是每毫升陽離子交換樹脂大約20毫克到大約35毫克，而且可任選的，還包括將抗體從陽離子交換樹脂上洗脫出來。該方法優(yōu)選還包括一個從離子交換樹脂上洗脫出一種或多種污染物的中間洗滌步驟。該中間洗滌步驟通常在抗體洗脫步驟之前。
本發(fā)明還提供了包含抗-HER2抗體和它的一種或多種酸性變體的混合物的組合物，其中組合物中酸性變體的量不到大約25％，優(yōu)選不到約20％，例如，范圍在約1％到約18％之內(nèi)?？扇芜x的，該組合物還包括一種藥物學(xué)上可接受的載體。
附圖簡述

圖1是流程圖，顯示如何通過改變導(dǎo)電率(如下文實施例1的NaCl濃度)或通過改變pH(例如流程圖中所示pH值)來進(jìn)行陽離子交換層析。
圖2是流程圖，顯示如何通過改變導(dǎo)電率(如圖中描述的NaCl濃度)或通過改變pH(如所示pH值)來進(jìn)行陰離子交換層析。
圖3是在實施例1中以完全生產(chǎn)規(guī)模進(jìn)行陽離子交換層析得到的吸收示蹤。用箭頭標(biāo)出了用本文所述的不同緩沖液洗滌柱的點。
圖4描述了在各層析組分中(作為相應(yīng)層析的所有組分總量百分比計算)回收的重組人源化抗-HER2單克隆抗體(rhumAb HER2)。流穿、洗滌步驟、和預(yù)合并組分是從加樣開始到合并開始收集到的所有流出樣品。合并組分是從前導(dǎo)肩的轉(zhuǎn)折點開始的五倍柱體積的洗脫流出樣品。再生組分含有從合并結(jié)束到再生結(jié)束捕獲的流出物。
圖5顯示了用羧基嗍(Carboxysulfon)陽離子交換高效液相層析(CSxHPIEX)評估的各陽離子交換層析合并樣品中rhuMAb HER2的質(zhì)量。峰a、b和l是rhuMAb HER2的脫酰胺基形式。峰3是未脫酰胺基的rhuMAb HER2。峰4是rhuMAb HER2的含有C-末端賴氨酸的變體和異—天冬氨酸變體的組合。
圖6顯示了各層析用0.025M MES/0.070M NaCl，pH5.6洗滌的吸光度(280nm)概貌譜。rhuMAb HER2加到陽離子交換樹脂中的量影響了峰頂?shù)奈舛人?，亦即達(dá)到峰頂所需的緩沖液量。由于在該洗滌中存在小峰(在30mg/ml加樣中最可見)，將峰頂定義為至少0.5吸光度單位(AU)的吸光度水平。
圖7A和7B分別顯示了humMAb4D5-8輕鏈(SEQID NO1)和humMAb4D5-8重鏈(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
優(yōu)選例的詳述定義本文要純化的“組合物”包含感興趣的多肽和一種或多種污染物。組合物可以是“部分純化”的(亦即，已進(jìn)行過一次或多次純化步驟，例如下文實施例1中的蛋白質(zhì)A層析)或可以直接獲自產(chǎn)生該多肽的宿主細(xì)胞或有機(jī)體(如組合物可以包含收集的細(xì)胞培養(yǎng)液)。
本文所用的“多肽”通常指具有約10個以上氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的多肽是哺乳動物蛋白質(zhì)，其例子包含腎素；包括人生長激素和牛生長激素的生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促濾泡激素；降鈣素；促黃體素；胰高血糖素；因子VIIIC、因子IX、組織因子和vonWillebrands因子等凝血因子；蛋白質(zhì)C等抗凝血因子；心鈉素；肺表面活性劑；尿激酶或人尿或組織型血纖蛋白溶酶原激活劑(t-PA)等血纖蛋白溶酶原激活劑；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(活化后可調(diào)節(jié)的、正常T細(xì)胞表達(dá)并分泌的)趨化因子；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；人血清白蛋白等血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；β-內(nèi)酰胺酶等微生物蛋白質(zhì)；DNase；IgE；CTLA-4等細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白質(zhì)A或D；類風(fēng)濕因子；骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、營養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5、NT-6)等神經(jīng)營養(yǎng)因子或NGF-β等神經(jīng)生長因子；血小板衍生生長因子(PDGF)；aFGF和bFGF等成纖維細(xì)胞生長因子；上皮生長因子(EGF)；TGF-α和TGF-β等轉(zhuǎn)化生長因子，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-1和IGF-II)；去(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)；CD3、CD4、CD8、CD19和CD20等CD蛋白質(zhì)；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)性因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素-α、-β和-γ等干擾素；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物岐化酶；T-細(xì)胞受體；膜表面蛋白質(zhì)；衰變加速因子；病毒抗原例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM等整聯(lián)蛋白；HER2、HER3或HER4受體等腫瘤相關(guān)抗原；和上述任一多肽的片段和/或變體。最優(yōu)選的是結(jié)合人HER2的全長抗體。
“污染物”是和所需多肽產(chǎn)物不同的物質(zhì)。污染物可以是所需多肽的變體(如所需多肽的脫酰胺基變體或氨基天冬氨酸變體)或其它多肽、核酸、內(nèi)毒素等。
起始多肽的“變體”或“氨基酸序列變體”是包含與起始多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。通常，變體具有和天然多肽至少80％的序列相同性，優(yōu)選至少90％序列相同性，更優(yōu)選至少95％序列相同性，而最優(yōu)選至少98％序列相同性。通過將序列對齊排列來提供最大同源性后，F(xiàn)itch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801382-1386(1983)(用Needleman等，分子生物學(xué)雜志48443-453(1970)描述的算法)確定了序列相同性百分比。通過將合適的核苷酸變化引入編碼多肽的DNA中，或通過多肽合成可制備多肽的氨基酸序列變體。這樣的變體包含例如感興趣的多肽的氨基酸序列中殘基的缺失、插入和取代，如果最終構(gòu)建物具有所需特征，可進(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合來得到最終構(gòu)建物。氨基酸改變還可以改變多肽的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。例如，在美國專利5,534,615中描述了產(chǎn)生多肽的氨基酸序列變體的方法(納入本文以供參考)。
“酸性變體”是比感興趣的多肽更加酸性(例如用陽離子交換層析測定)的感興趣多肽的變體。酸性變體的例子是脫酰胺基變體。
多肽分子的“脫酰胺基”變體是一種多肽，其中原始多肽的一個或多個天冬酰胺殘基已被轉(zhuǎn)換成天冬氨酸，亦即，中性酰胺側(cè)鏈已被轉(zhuǎn)換成具有總酸性特征的殘基。下列實施例中的脫酰胺基humMAb4D5抗體在其一個或兩個VL區(qū)的CDR1中的Asn30被轉(zhuǎn)換為天冬氨酸。本文所用的術(shù)語“脫酰胺基人DNase”指天然的成熟人DNA酶氨基酸序列中位點74的天冬酰胺殘基處被脫去酰胺基(美國專利5,279,823；納入本文以供參考)。
本文用于包含抗-HER2抗體的組合物的術(shù)語“混合物”，指存在所需抗-HER2抗體和其一種或多種酸性變體。酸性變體可以包含占多數(shù)的脫酰胺基抗-HER2抗體和少量其它酸性變體。已發(fā)現(xiàn)例如在獲自重組表達(dá)的抗-HER2抗體的制備物中，多達(dá)約25％的抗-HER2抗體是脫酰胺基化的。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，多肽是重組多肽?！爸亟M多肽”是在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽，該宿主細(xì)胞已被編碼該多肽的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，或作為同源重組的結(jié)果產(chǎn)生多肽?？苫Q使用“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”，指將核酸引入細(xì)胞的過程。在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后，核酸可以整合到宿主細(xì)胞基因組中，或作為染色體外因子存在?！八拗骷?xì)胞”包含體外細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞和在宿主動物中的細(xì)胞。例如在美國專利5,534,615中描述了重組產(chǎn)生多肽的方法(納入本文以供參考)。
以最廣泛的意義使用術(shù)語“抗體”，具體指包括單克隆抗體(含全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)，和長度足以展現(xiàn)所需生物學(xué)活性的抗體片段。
本文的抗體針對感興趣的“抗原”。優(yōu)選的抗原是生物學(xué)上重要的多肽，將其抗體施給患病或失常的哺乳動物能在該哺乳動物中得到治療性效益。然而，也要考慮針對非多肽抗原(例如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；見美國專利5,091,178)的抗體。當(dāng)抗原是多肽時，它可以是跨膜分子(如受體)或配體(如生長因子)。示范性抗原包括上文討論的多肽。本發(fā)明包含的抗體的優(yōu)選分子靶包括CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34等CD多肽；EGF受體、HER2、HER3或HER4受體等HER受體家族的成員；細(xì)胞粘著分子如LFA-1、Macl、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整聯(lián)蛋白(包括其a或b亞基)(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11抗體)；VEGF等生長因子；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；多肽C等?？蓪⒖扇苄钥乖蚱淦危芜x的和其它分子偶聯(lián)，用作誘導(dǎo)抗體的免疫原。對于跨膜蛋白例如受體，受體的片段(例如受體的胞外功能域)可用作免疫原。另外，可將表達(dá)跨膜蛋白的細(xì)胞用作免疫原。這些細(xì)胞可衍生自天然來源(如癌癥細(xì)胞系)或可以是已用重組技術(shù)轉(zhuǎn)化，能表達(dá)跨膜蛋白的細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指獲自一群基本同源的抗體，亦即，構(gòu)成該群體的各個抗體是相同的，除了可能天然存在的少量突變處。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一的抗原位點。另外，和通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物相反，各個單克隆抗體針對的是抗原上的一個決定簇。修飾語“單克隆的”表示抗體的特征是獲自基本同源的抗體群體，而且不應(yīng)解釋成要求用任何具體方法生產(chǎn)該抗體。例如本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過Kohler等，自然256495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或通過重組DNA方法(見例如，美國專利號4,816,567)制備。在另一個實施例中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離得到“單克隆抗體”。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離小鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過鏈改組(Marks等，生物/技術(shù)，10779-783(1992))和作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫策略的組合感染及體內(nèi)重組(Waterhouse等，核酸研究，212265-2266(1993))生產(chǎn)高親和力(nM范圍)的人抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的選擇。另外，現(xiàn)在有可能產(chǎn)生能夠在免疫后不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白，而產(chǎn)生人抗體的所有組分的轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)。例如已描述了在嵌合體和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生被完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno，733(1993)；和Duchosal等，自然，355258(1992)。
本文的單克隆抗體特別包括“嵌合性”抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與衍生自某具體動物或?qū)儆诰唧w抗體類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一動物或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的相應(yīng)序列相同或同源，只要這些抗體的片段展示出所需生物學(xué)活性，它們也包含于其中。(美國專利號4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984)。
本文所用的術(shù)語“高變區(qū)”指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(亦即，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫學(xué)感興趣的多肽的序列，5thEd，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))的氨基酸和/或“高變環(huán)”中的那些殘基(亦即，輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是除了本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)殘基。下文實施例中的rhuMAb HER2抗體的CDR和FR殘基(humAb4D5-8)由Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)作了鑒定。
非人(如小鼠)抗體的“人源化”形式是含有(衍生自)非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合體抗體。大部分人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人動物(如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類)的、具有所需特異性、親和性和容量的高變區(qū)(供者抗體)的殘基所替換。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包含在受者抗體或在供者抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步精制抗體性能。通常，人源化抗體將基本包含全部的至少一個、通常是兩個可變區(qū)，其中所有的或基本上所有的高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，而所有的或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體還可任選的包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。
在制造人源化抗體中所用的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈的)的選擇對減少抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最適”方法，將針對已知的人可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)的序列，然后接受與嚙齒類的序列最接近的人序列，作為人源化抗體的人構(gòu)架(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。
另一種方法采用衍生自輕鏈或重鏈特定亞類的所有人抗體共有序列的特定構(gòu)架。同樣的構(gòu)架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
更重要的是，被人源化的抗體應(yīng)保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)性質(zhì)。要達(dá)到這個目的，根據(jù)優(yōu)選方法，使用親代和人源化序列的三維模型，通過分析親代序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過程，來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是一般可得到的，而且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟悉的。計算機(jī)程序也可得到，它描述并顯示了所選的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這些演示的檢查使得我們能夠分析殘基在候選免疫球蛋白功能中的可能作用(亦即，對影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基的分析)。以此方法，可從受則序列和引入序列中選擇FR殘基并使它們聯(lián)合，從而達(dá)到所需抗體特征，例如對靶抗原提高的親和力。通常，CDR殘基直接和最實質(zhì)性的影響到抗原結(jié)合。
“抗體片段”包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；二抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。業(yè)已開發(fā)了不同技術(shù)用于抗體片段的生產(chǎn)。傳統(tǒng)上，這些片段衍生自對完整抗體的蛋白酶水解消化(見例如，Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理方法24107-117(1992)和Brennan等、科學(xué)22981(1985))。然而，現(xiàn)在能通過重組宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)這些片段。例如，能從上文討論的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。另外，能直接從大腸桿菌中回收Fab′-SH片段，并將其化學(xué)偶聯(lián)來形成F(ab′)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。在另一實施例中，用亮氨酸拉鏈GCN4來啟動F(ab′)2分子的裝配以形成F(ab′)2片段。根據(jù)另一方法，能直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離F(ab′)2片段。用于生產(chǎn)抗體片段的其它技術(shù)對熟練技術(shù)人員是顯然明了的。
在其它實施例中，所選的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185?！皢捂淔v”或“sFv″抗體片段包含抗體的VH和VL區(qū)，其中這些功能域存在于一條多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽還包含VH區(qū)和VL區(qū)之間的一個多肽接頭，它使sFv能形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對于sFv的綜述，見Pluckthun的單克隆抗體的藥物學(xué)vol.113，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
術(shù)語“二抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)。通過使用短至不允許同一鏈上的兩個功能域之間配對的接頭，從而迫使此二功能域與另一鏈的二個互補區(qū)配對，形成兩個抗原結(jié)合位點。二抗體在例如EP404，097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)有更充分的描述。
當(dāng)在本申請中使用時，詞語“線性抗體”指Zapata等在Polypeptide Eng.8(10)1057-1062(1995)中描述的抗體。簡單說，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)，它形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。
“多特異性抗體”具有對至少兩個不同表位的結(jié)合特異性，其中各表位常常來自不同的抗原。盡管這些分子正常情況下將只結(jié)合兩個抗原(亦即，雙特異性抗體，BsAb)，具有額外特異性的抗體如三特異性抗體也包含在本文所用的該詞語的范圍內(nèi)。BsAb的例子包含那些一條臂針對腫瘤細(xì)胞抗原而另一條臂針對細(xì)胞毒觸發(fā)分子的抗體(例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗惡性B-細(xì)胞(1D10)，抗-CD3/抗p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-腎細(xì)胞腫瘤，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗結(jié)腸癌)，抗-CD3/抗-促黑素細(xì)胞激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(NCAM)/抗-CD3，抗葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛腫瘤相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗-CD3)；一條臂特異性與腫瘤抗原結(jié)合而另一條臂與毒素結(jié)合的BsAb(例如抗—皂角苷/抗-Id-I，抗-CD22/抗-皂角苷，抗-CD7/抗皂角苷，抗-CD38/抗-皂角苷，抗-CEA/抗-蓖麻毒蛋白A鏈，抗-干擾素-α(IFN-α)/抗雜交瘤獨特型，抗-CEA/抗-長春花生物堿)；用于轉(zhuǎn)換酶活化前體藥物的BsAb如抗-CD30/抗-堿性磷酸酶(它催化絲裂霉素磷酸前體藥物轉(zhuǎn)化成絲裂霉素醇)；能用作纖溶劑的BsAb，如抗-血纖蛋白/抗-組織纖溶酶原激活劑(tPA)，抗-血纖蛋白/抗-尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)；用于靶向免疫復(fù)合物到細(xì)胞表面受體的BsAb，例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(如FcγRI，或FcγRIII)；用于治療感染性疾病的BsAb，例如抗-CD3/抗單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-細(xì)胞受體CD3復(fù)合物/抗-流感，抗-FcγR/抗-HIV；用于體外或體內(nèi)檢測腫瘤的BsAb，例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗-半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb；和作為診斷工具的BsAb，例如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長素釋放抑制因子/抗-底物P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特異性抗體的例子包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37?？梢匀L抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)制備雙特異性抗體。
制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是基于兩條免疫球蛋白重—輕鏈對的共表達(dá)，其中兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分類，這些雜交瘤(四聯(lián)瘤(quadroma))可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常是用多個親和層析步驟進(jìn)行該正確分子的純化，非常麻煩而且產(chǎn)量低。WO 93/08829和Traunecker等，胚胎學(xué)雜志，103655-3659(1991)中公開了相似的程序。
根據(jù)不同方法，將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體—抗原結(jié)合位點)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選在具有至少一部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合必須位點的第一重鏈恒定區(qū)存在于至少一個融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和如需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入到分開的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體中。這對調(diào)節(jié)實施例中的三個多肽片段的突變性質(zhì)提供了極大的機(jī)動性，即當(dāng)在構(gòu)建中使用了不相等的三種多肽鏈的獨特比率時，提供了最適產(chǎn)量。然而，有可能將兩個或所有三個臺聯(lián)的編碼序列插入到一個表達(dá)載體中，當(dāng)至少兩個多肽鏈的表達(dá)比率相等時，或比率無特殊意義時可得到高產(chǎn)量。
在本方法的一個優(yōu)選例中，雙特異性抗體是由一條臂中帶有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，和另一條臂中的雜交免疫球蛋白重鏈—輕鏈配對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成的。發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從不要的免疫球蛋白鏈組合物中分離出所需雙特異性化合物，因為在僅一半雙特異性分子中免疫球蛋白輕鏈的存在提供了分離的便捷方法。此方法公開于WO94/04690。產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見例如，Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
根據(jù)WO96/27011中描述的另一個方法，可以工程改造一對抗體分子間的界面而使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體的百分比最大化。優(yōu)選界面包含抗體恒定區(qū)CH3區(qū)的至少一部分。在該方法中，用具有較大側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)替換第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈。在第二抗體分子界面上通過用較小側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大側(cè)鏈氨基酸來建立與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償“空穴”。這提供了使異源二聚體的產(chǎn)量增加超過其它不要的終產(chǎn)物如同源二聚體的機(jī)制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”的抗體。例如，異源偶聯(lián)物中抗體之一可與親和素偶聯(lián)，另一個可與生物素偶聯(lián)。已提議將這些抗體用于例如使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向于不要的細(xì)胞(美國專利號4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)?？捎萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域熟知的，而且已在美國專利4,676,980中和多種交聯(lián)技術(shù)一起公開。
從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也已在文獻(xiàn)中有所描述。例如，可用化學(xué)鍵制備雙特異性抗體。Brennan等，在科學(xué)，22981(1985)中描述了蛋白酶水解切開完整抗體來產(chǎn)生F(ab′)2片段的程序。將這些片段在二硫酚結(jié)合劑亞砷酸鈉存在下還原，來穩(wěn)定鄰近二硫酚并防止分子間形成二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab′片段轉(zhuǎn)變成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，將Fab′-TNB衍生物之一通過用巰基乙胺還原再轉(zhuǎn)變成Fab′-硫，并和等摩爾量的另一個Fab′-TNB衍生物混合來形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。
近來的進(jìn)展已促進(jìn)了直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段，可將該片段化學(xué)偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。Shalaby等，在實驗醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了一種完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。分離出大腸桿菌分泌的各種Fab′片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。
也已經(jīng)描述了直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的不同技術(shù)。例如，已用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生了雙特異性抗體。Kostenlny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽和兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合連接。在鉸鏈區(qū)還原抗體同源二聚體以形成單體，然后再氧化形成抗體異二聚體。該方法還可用來產(chǎn)生抗體同源二聚體。Hollinger等，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中描述的“二抗體”技術(shù)已提供了制備雙特異性抗體片段的另一種機(jī)制。該片段包含通過一個短至不允許同一鏈上的兩個功能域之間配對的接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)。因此，這迫使一個片段的VH和VL區(qū)和另一個片段的互補VL和VH區(qū)配對，從而形成兩個抗體結(jié)合位點。使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略也已有報道。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
也考慮了具有二價以上的抗體。例如可以制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
詞組“離子交換材料”指帶負(fù)電(即陽離子交換樹脂)或帶正電(即陰離子交換樹脂)的固相?？梢酝ㄟ^在固相上吸附一個或多個帶電配體(如通過共價連接)來提供電荷。另外，或此外，電荷可以是固相的固有性質(zhì)(如以硅為例，它具有全盤負(fù)電荷)。
“固相”指一個或多個帶電配體能粘附的非水基質(zhì)。固相可以是純化柱、一種分散微粒的不連續(xù)相、膜或濾膜等。能形成固相的材料的例子包括多糖(如瓊脂糖和纖維素)；和硅(如可控孔徑玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷顆粒和上述任一衍生物等其它機(jī)械上穩(wěn)定的基質(zhì)。
“陽離子交換樹脂”指一種帶負(fù)電的固相，因其具有自由陽離子，能交換固相上或固相中流過的水溶液中的陽離子。附著在固相上形成陽離子交換樹脂的帶負(fù)電的配體可以是例如羧酸鹽或磺酸鹽。商業(yè)上可購得的陽離子交換樹脂包含羧基-甲基-纖維素、BAKERBOND ABXTM、固定在瓊脂糖上的硫丙基(SP)(如Pharmacia的SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM)和固定在瓊脂糖上的磺?；?如Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)。
本文所用的術(shù)語“陰離子交換樹脂”指帶正電(如具有附著于其上的一個或多個帶正電的配體，例如季銨基團(tuán))的固相。商業(yè)上可購得的陰離子交換樹脂包含DEAE-纖維素、QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM(Pharmacia)。
“緩沖液”是通過其酸-堿偶聯(lián)組分的作用來抵抗pH變化的溶液。在緩沖液，生物系統(tǒng)中緩沖液的制備和使用指南，Gueffroy，D.Ed.CalbiochemCorporation(1975)中描述了取決于緩沖液所需pH而定的可使用的不同緩沖液。在一個實施例中，緩沖液具有的pH范圍從大約5到大約7(如下文實施例1)。將pH控制在該范圍內(nèi)的緩沖液的例子包括MES、MOPS、MOPSO、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和銨鹽緩沖液，以及這些緩沖液的組合。
“加樣液”是指用來將含有感興趣的多肽分子和一種或多種污染物的組合物加到離子交換樹脂上的緩沖液。加樣緩沖液具有的導(dǎo)電率和/或pH，能使感興趣的多肽分子(和通常一種或多種污染物)與離子交換樹脂結(jié)合。
“中間緩沖液”被用來在洗脫感興趣的多肽前從離子交換樹脂上洗脫出一種或多種污染物。中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH能使污染物從離子交換樹脂上被洗脫下來，但不洗脫下顯著量的感興趣的多肽。
本文使用的術(shù)語“洗滌緩沖液”指在洗脫感興趣的多肽分子之前，用來洗滌或重平衡離子交換樹脂的緩沖液。方便的，洗滌緩沖液和加樣緩沖液可以同一緩沖液，但這不是必須的。
“洗脫緩沖液”用來將感興趣的多肽從固相上洗脫下來。洗脫緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH能使感興趣的多肽從離子交換樹脂上洗脫下來?！霸偕彌_液”可以用來再生離子交換樹脂，從而使它能被再次使用。再生緩沖液具有所需的能充分將所有污染物和感興趣的多肽從離子交換樹脂上除去的導(dǎo)電率和/或pH。
術(shù)語“導(dǎo)電率”指水溶液在兩個電極間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流是通過離子運輸?shù)?。因此，?dāng)水溶液中離子量增大時，溶液將具有更高的導(dǎo)電率。導(dǎo)電率的度量單位是mmho(mS/cm)，而且能用導(dǎo)電率計測量(由Orion等出售)。溶液的導(dǎo)電率可通過改變其中的離子濃度而變化。例如，可改變?nèi)芤褐芯彌_劑濃度和/或鹽(如NaCl或KCl)的濃度，來達(dá)到所需導(dǎo)電率。優(yōu)選的，如下文實施例中，改變各種緩沖液的鹽濃度來達(dá)到所需導(dǎo)電率。
從含有多肽和一種或多種污染物的組合物中“純化”多肽，指通過從組合物中(完全或部分的)除去至少一種污染物來提高組合物中多肽的純度?！凹兓襟E”可以是得到“均一”組合物(在本文中“均一”指含感興趣多肽的重量相對于組合物的總重量至少約70％，優(yōu)選重量至少約80％的組合物)的總純化過程中的一部分。
除非另外指出，本文所用的術(shù)語“HER2”指人HER2蛋白而“HER2”指人HER2基因。例如在Semba等，PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto等，自然，319230-234(1986)(GeneBank登錄號X03363)中描述了人HER2基因和HER2蛋白。
本文所用的術(shù)語“humMAb4D5-8”指含有SEQ ID NO1的輕鏈氨基酸序列和SEQ ID NO2的重鏈氨基酸序列或其變體(其保留了結(jié)合HER2和抑制過度表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞生長的能力)的人源化抗-HER2抗體(見美國專利5,677,171；納入本文以供參考)。
多肽的“pI”或“等電點”指多肽正電荷與其負(fù)電荷平衡的pH?？蓮亩嚯陌被釟埢膬綦姾蓙硭愠鰌I，或用等電聚焦(如以下實施例中所用的CSx層析)來測定。
將某分子“結(jié)合”到離子交換材料上，指在合適的條件下(pH/導(dǎo)電率)使該分子和離子交換材料接觸，在該條件下該分子通過分子和離子交換材料上一個或多個帶電基團(tuán)之間的離子相互作用可逆的固定在離子交換材料中或材料上。
“洗滌”離子交換材料，指使合適的緩沖液在離子交換材料中或上通過。
將分子從離子交換材料上“洗脫”下來，指通過改變離子交換材料周圍的緩沖液離子強(qiáng)度從離子交換材料上除下該分子，該離子強(qiáng)度能使緩沖液與分子競爭離子交換材料上的帶電位點。
“治療”指治療性處理和預(yù)防性措施。需要治療的人包含已患疾病和要預(yù)防疾病的人?！笆С！敝溉魏斡萌绫疚乃黾兓亩嚯闹委煂@益的任何狀況。這包括具有使哺乳動物易患所討論疾病的那些病理狀態(tài)的慢性和急性失常或疾病。
本文所用的詞語“標(biāo)記”指直接或間接偶聯(lián)于多肽的可檢測的化合物或組合物。標(biāo)記可以是本身可檢測的(如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)或，就酶性標(biāo)記而言，可以催化可檢測到的底物化合物或組合物的化學(xué)變化。
本文所用的術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞毀壞的物質(zhì)。該術(shù)語包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化療劑和毒素，例如來自細(xì)菌、真菌、植物或動物的酶活性毒素或其片段的毒素。
“化療劑”是用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ò⒚顾?、亞德利亞霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、環(huán)磷酰胺、噻替哌、白消安、cytoxin、taxoid，例如paclitaxel(TAXOLTM，Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)、和doxetaxel、toxotere、氨甲喋呤、順氯氨鉑、美法侖、長春堿、博來霉素、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞賓、卡鉑、鬼臼噻吩苷、道諾霉素、洋紅霉素、氨基喋呤、放線菌素D、絲裂霉素、esperamicin(見美國專利號4,675,187)，美法侖和其它相關(guān)的芥氮(nitrogen mustard)。該定義中還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的激素制劑，例如它莫西芬和奧那司酮。
實施本發(fā)明的模式本發(fā)明提供了從含有多肽和一種或多種污染物的組合物(如水溶液)中純化多肽的方法。該組合物通常是多肽重組生產(chǎn)得到的，但也可以是肽合成(或其它合成方法)生產(chǎn)得到的，或者該多肽可以從該多肽的天然來源純化得到。該多肽優(yōu)選是抗體，如結(jié)合HER2抗原的抗體。
為了重組生產(chǎn)該多肽，分離編碼它的核酸，并將其插入可復(fù)制載體中以進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。使用常規(guī)程序(例如，當(dāng)多肽是抗體，使用能與編碼該抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)易于分離編碼多肽的DNA并對其測序。許多載體是可得到的。載體組分通常包含但不限于，下列的一種或多種信號序列、復(fù)制起始點、一個或多個標(biāo)記基因、增強(qiáng)元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄中止序列(如美國專利5,534,615中描述的，納入本文以供參考)。
適合于克隆或表達(dá)本文載體中DNA的宿主細(xì)胞是上述的原核生物、酵母或更高等的真核細(xì)胞。適合該目的的原核生物包含真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌，如埃希氏菌屬(如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷博氏菌屬、變形菌屬、沙門氏菌屬(如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonnellatyphimurium))、沙雷氏菌(如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescan))、和志賀氏菌屬，以及芽胞桿菌如枯草桿菌B.subtilis和地衣芽胞桿菌B.licheniformis(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公開的地衣芽胞桿菌41P)、假單胞菌屬(如銅綠假單胞菌)、和鏈霉菌。優(yōu)選的大腸桿菌宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，雖然其它菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的，這些例子是說明性的，不是限制性的。
除了原核生物，絲狀真菌或酵母等真核微生物也是多肽編碼載體的合適的克隆和表達(dá)宿主。在低等真核宿主微生物中，釀酒酵母或一般面包酵母是最常用的。然而，一些其它屬、種和菌株也是一般可得到的，在本文中可用，例如裂殖酵母(Schizosaccaromycespombe)；克魯維酵母菌屬宿主，如乳酸克魯維酵母菌K.lactis、脆壁克魯維酵母菌K.fragilis(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母菌K.bulgaricus(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母菌K.wickeramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母菌K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐熱克魯維氏酵母菌K.thermotolerans和馬克斯酵母菌K.marxianus；yarrowia(EP 402226)；巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris(EP 183070)；念珠菌Candida；木霉Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙脈孢菌Neurospora crassa；許旺酵母Schwanniomyces如許旺酵母Schwannniomyces occidentalis；和絲狀真菌如青霉素鏈孢菌Neurospora Penicillium、Tolypocladium、和曲霉菌Aspergillus宿主如A.nidulans和黑曲霉A.niger。
用于糖基化多肽表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無脊椎動物細(xì)胞的例子包含植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定了許多桿狀病毒株和變體以及對應(yīng)的來自宿主的得到許可的昆蟲細(xì)胞，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda(幼蟲))、伊蚊埃及伊蚊(Aedes aegypti(蚊))、白紋伊蚊Aedes albopictus(蚊)、果蠅drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶bombyx mori。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株是廣泛可得到的，如苜蓿銀紋夜蛾Autograoha californica NPV的L-1變種和家蠶NPV的Bm-5病毒株。而且這些病毒可根據(jù)本發(fā)明作為本文中的病毒使用，具體用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。還能利用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽?；?、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。
然而，興趣最大在于脊椎動物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中增殖脊椎動物細(xì)胞已成為常規(guī)程序。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或用于在懸浮培養(yǎng)液中生長的亞克隆293細(xì)胞，Graham等，J.Gen virol3659(1977))；乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO，Urlaub等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980)〕；小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宮癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci，38344-68(1982))；MRC細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝細(xì)胞癌系(Hep G2)。
用上述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來產(chǎn)生多肽，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基(被修改成適用于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因)中培養(yǎng)。
用來產(chǎn)生本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞可在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商品上可購得的培養(yǎng)基如Ham′s F10(Sigma)、最低極限必需培養(yǎng)基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco′s改進(jìn)Eagle′s培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)對培養(yǎng)宿主細(xì)胞是適合的。此外，在Ham等，酶學(xué)方法5844(1979)，Barnes等，生物化學(xué)年鑒，102255(1980)，美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re.30,985中描述的任何培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基之任一種可能必須補充以激素和/或其它生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(如HEPES)、核苷酸(如腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大霉素GENTAMYCINTM藥)、痕量元素(定義為通常在最終濃縮物中以微摩爾級存在的無機(jī)化合物)和葡萄糖或等價能源。還可包含任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，以合適濃度加入的補充物。培養(yǎng)條件如溫度、pH等，是前面用于為表達(dá)所選的宿主細(xì)胞的那些條件，對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將是明顯的。
當(dāng)使用重組技術(shù)時，可在細(xì)胞內(nèi)、周質(zhì)間隙內(nèi)、產(chǎn)生多肽，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果多肽在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步，將通過如離心或超過濾除去微粒碎片，宿主細(xì)胞或溶解的細(xì)胞(如勻漿時產(chǎn)生的)。當(dāng)多肽分泌到培養(yǎng)基中，通常首先用商業(yè)上可購得的蛋白濃縮濾膜如Amicon或MilliporePellicon超過濾單元濃縮這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液。
然后多肽經(jīng)過一次或多次純化步驟，包括本文所要求權(quán)利的離子交換層析方法。其它純化程序的例子可以在離子交換層析步驟之前、之中、或之后進(jìn)行，包括在疏水反應(yīng)層析(如苯基瓊脂糖)上組分、乙醇沉淀、等電聚焦、反相HPLC，硅層析、HEPARIN SEPHAROSETM層析，進(jìn)一步陰離子交換層析和/或進(jìn)一步陽離子交換層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(如用蛋白A、蛋白G、抗體、特異性底物、配體或抗原作為捕獲劑)。
如本文權(quán)利要求的那樣進(jìn)行離子交換層析。首先決定使用陰離子還是陽離子交換樹脂。通常，陽離子交換樹脂可用于pI大于7的多肽，而陰離子交換樹脂可以用于pI小于7的多肽。
根據(jù)已知方法制備陰離子或陽離子交換樹脂。通常，在將含有多肽和一種或多種污染物的組合物加到樹脂上之前，先使平衡緩沖液通過樹脂。方便的，平衡緩沖液和加樣液相同，但這不是必需的。
用于層析的不同緩沖液由使用陽離子還是陰離子交換樹脂而定。這在圖1和2的流程圖中有更加清楚的顯示。
根據(jù)圖1(其顯示了使用陽離子交換樹脂進(jìn)行的示范性步驟)的具體參照，各緩沖液的pH和/或?qū)щ娐时惹耙粋€緩沖液大，除外的是洗滌緩沖液，其導(dǎo)電率和/或pH比前一個中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH小。將含有感興趣的多肽和污染物的水溶液用pH和/或?qū)щ娐誓苁乖摱嚯暮臀廴疚锝Y(jié)合到陽離子交換樹脂上的加樣緩沖液加到陽離子交換樹脂上。如下文實施例中，加樣緩沖液可以具有第一低導(dǎo)電率(如從約5.2到約6.6mmhos)。加樣緩沖液的示范性pH可以是大約5.0(見圖1)?？梢詫⑷鐝拇蠹s20mg/ml到約35mg/ml的多肽(如全長抗體)加到離子交換樹脂上。
然后用中間緩沖液(其具有第二導(dǎo)電率和/或pH使得基本洗脫污染物，但不洗下實質(zhì)量的感興趣多肽)洗滌陽離子交換樹脂。這可以通過提高中間緩沖液的導(dǎo)電率或pH或兩者達(dá)到。加樣緩沖液到中間緩沖液的改變按照需要可以是分步或梯度的。在本文實施例中，中間緩沖液具有比加樣緩沖液更大的導(dǎo)電率(亦即，中間緩沖液的導(dǎo)電率在約7.3到約8.4mmhos范圍內(nèi))。另外，如圖1所示，在本發(fā)明該實施例中使用陽離子交換樹脂時，中間緩沖液的pH可以超過加樣緩沖液的。例如，中間緩沖液可以具有約5.4的pH。
用中間緩沖液洗滌之后，用導(dǎo)電率或pH或兩者比中間緩沖液小的(亦即，導(dǎo)電率或pH或兩者的變化和前一步驟相反，即逆向變化，這與文獻(xiàn)中的離子交換層析步驟不同。)洗滌緩沖液來洗滌或重新平衡陽離子交換樹脂。在下文實施例中，洗滌緩沖液和加樣緩沖液具有同樣的導(dǎo)電率(亦即，范圍在約5.2到約6.6mmhos之間)，因此它的導(dǎo)電率比中間緩沖液的小。在另一個實施例中，只要洗滌緩沖液的導(dǎo)電率比中間緩沖液的小，可以將洗滌緩沖液的導(dǎo)電率降低到比加樣緩沖液的導(dǎo)電率小或大。在另一個實施例中，洗滌緩沖液的pH可以比中間緩沖液的pH小(如洗滌緩沖液的pH可以是約5.0)。與中間緩沖液比較，洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH的改變可以通過分步或梯度改變這些參數(shù)之一或兩者來達(dá)到。
前面一段的洗滌步驟之后，將陽離子交換樹脂準(zhǔn)備好用于從其上面洗脫下所需多肽分子。這采用能使所需多肽不再結(jié)合于陽離子交換樹脂，從而從樹脂上被洗脫下來的pH和/或?qū)щ娐实南疵摼彌_液來實現(xiàn)。洗脫緩沖液的pH和/或?qū)щ娐释ǔ１惹懊娌襟E中使用的加樣緩沖液、中間緩沖液和洗滌緩沖液的pH和/或?qū)щ娐矢摺Ｔ谙挛膶嵤├?，洗脫緩沖液的導(dǎo)電率范圍是約10.0到約11.0mmhos。另外，或此外，洗脫緩沖液的pH可以比洗滌緩沖液和中間緩沖液的要高(例如，洗脫緩沖液的pH是大約6.0)。導(dǎo)電率和/或pH的改變按照需要可以是分步或梯度的。因此，所需多肽可以在方法的這個階段從陽離子交換樹脂上回收。
在另一個實施例中，離子交換材料包括陰離子交換樹脂。本發(fā)明的該實施例在本文圖2中描述。如該圖所示，導(dǎo)電率的改變通常如上述關(guān)于陽離子交換樹脂的一樣。然而，pH改變的方向?qū)τ陉庪x子交換樹脂是不同的。例如，如果通過改變pH來達(dá)到污染物和多肽的洗脫，則加樣緩沖液具有第一pH，而中間緩沖液的pH降低，從而能洗脫出污染物。在第三步中，用洗滌緩沖液洗滌/重平衡柱，而且導(dǎo)電率或pH或兩者的變化和前一步中是反向的。因此，洗滌緩沖液pH可以比中間緩沖液大。在該步驟之后，用第四導(dǎo)電率和/或pH的洗脫緩沖液將感興趣的多肽從陰離子交換樹脂上洗脫下來。如果pH改變了，通常它將比加樣緩沖液、中間緩沖液和洗滌緩沖液的pH小。漸進(jìn)的緩沖液pH和/或?qū)щ娐实母淖內(nèi)缟纤?，可以是分步或梯度的?br> 在本發(fā)明的優(yōu)選例中，改變一個參數(shù)(即導(dǎo)電率或pH)來達(dá)到多肽和污染物的洗脫，而另一個參數(shù)(即分別是pH或?qū)щ娐?保持大致穩(wěn)定。例如，雖然不同緩沖液(加樣緩沖液、中間緩沖液、洗滌緩沖液和/或洗脫緩沖液)的導(dǎo)電率可能不同，但它們的pH基本相同。
在本發(fā)明的一個可任選的實施例中，在多肽洗脫后用再生緩沖液再生離子交換樹脂，從而使柱能再用。通常，再生緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH是能使所有污染物和感興趣的多肽基本從離子交換樹脂上洗脫下來的那些。通常，再生緩沖液具有非常高的導(dǎo)電率來將污染物和多肽從離子交換樹脂上洗脫下來。
本文的方法具體用于從至少一種污染物中分離感興趣的多肽，其中污染物和感興趣的多肽分子僅在離子電荷上輕微有所不同。例如，多肽和污染物的pI可以僅“輕微不同”，如它們可僅差約0.05到約0.2pI單位。在下文實施例中，該方法可用來從具有8.79pI的單脫酰胺基變體中分離pI為8,87的抗-HER2抗體。另外，該方法可用來例如從未脫酰胺基DNA酶中分離脫酰胺基DNA酶。在另一個實施例中，該方法可用來從某多肽的糖基化變體中分離該多肽，例如和非變體多肽比較，分離具有不同分布唾液酸的某多肽變體。
根據(jù)本文的離子交換層析方法獲得的多肽制備物如需要，可經(jīng)過額外的純化步驟。示范性的進(jìn)一步純化步驟在上文已有討論。
可任選的，按照需要將多肽和一種或多種異源分子偶聯(lián)。該異源分子可以是比如能提高該多肽血清半衰期的分子(如聚乙二醇，PEG)，或它可以是標(biāo)記物(如酶、熒光標(biāo)記物和/或放射性核素)或細(xì)胞毒分子(如毒素、化療藥物、放射性同位素等)。
包含多肽、可任選的和異源分子偶聯(lián)的多肽的治療配方，可以通過將具有所需純度的多肽與可任選的藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remingtong′s Pharmaceutical Science 16thedition，Osol，A.Ed(1980))混合，以凍干制劑或以水溶液形式來制備?！八幬飳W(xué)上可接受的”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度對受體是無毒的，包含如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸等緩沖液；抗壞血酸和甲硫氨酸等抗氧化劑；防腐劑(如氯化十八烷基甲基芐基銨；氯化己烷雙銨；氯化苯甲烴銨；苯索氯銨；酚，丁基或芐基醇；甲基或丙基對羥基苯甲酸酯等烷基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間二苯酚、環(huán)己醇；3-戊醇和m-甲酚)；低分子量(小于10個殘基)的多肽；血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)；聚乙烯吡咯烷酮等親水多聚物；甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸等氨基酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；EDTA等螯合劑；蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇等糖類；鈉等成鹽抗衡離子；金屬復(fù)合物(如Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文特別感興趣的humMAb4D5-8抗體可以制備成凍干制劑，如在WO 97/04801中描述的那樣；在此納入本文以供參考。
本文的配方還可包含一種以上活性化合物，優(yōu)選的是彼此無不良影響而具有互補功能的那些活性化合物。這樣的分子優(yōu)選以對指定目的有效量聯(lián)合存在。例如，對于抗-HER2抗體，可將taxoid或它莫西芬等化療劑加到配方中。
還可將活性成分包裹在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)(如脂質(zhì)體白蛋白微球、微乳狀液、納米顆粒和納米膠囊)中或在粗乳狀液中分別通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合(如羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)制備的微囊中。這些技術(shù)在Remingtong′s Pharmaceutical Science 16thedition，Osol，A.Ed(1980)中已公開。
用于體內(nèi)施藥的配制物必須是無菌的。這可容易的通過無菌過濾膜來完成。
可以制備持續(xù)釋放制備物。持續(xù)釋放制備物的合適例子包含含有多肽變體的固態(tài)疏水聚合物的半透基塊，該基塊是異型制品形式，如薄膜或微囊。持續(xù)釋放基塊的例子包含聚酯、水凝膠(如聚(2-羥乙基-異丁酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解乙烯-醋酸乙酯、可降解乳酸-乙二醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(可注射微球，由乳酸-乙二醇酸共聚物和leuprolide乙酸酯構(gòu)成)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
然后將如本文公開的純化的多肽或含有多肽和藥物學(xué)上可接受載體的組合物用于這些多肽和組合物的各種診斷、治療或其它已知的用途。例如，將該多肽用于治療哺乳動物的疾病，可通過給予哺乳動物治療有效劑量的該多肽。
給出下面的實施例用于說明而不是限制。在說明書中所有的引用文獻(xiàn)在此納入本文以供參考。
實施例1在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生含有SEQ ID NO1的輕鏈氨基酸序列和SEQ IDNO2的重鏈氨基酸序列的全長人IgG rhuMAb HER2(humAb4D5-8 Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992))。蛋白產(chǎn)生和分泌到細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基后，將CHO細(xì)胞通過切向流過濾(PROSTACKTM)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出來。然后將CHO細(xì)胞收集的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)直接加到平衡好的PROSE ATM柱上(Bioprocessing，Ltd)進(jìn)行蛋白A層析。
蛋白A層析后，用硫丙基(SP)-SEPHAROSE FAST FLOWTM(SPSFF)柱(Pharmacia)進(jìn)行陽離子交換層析進(jìn)一步分離所需抗-HER2分子。層析操作以結(jié)合和洗脫模式進(jìn)行。
通過依次用再生緩沖液(0.025M MES/1.0M NaCl，pH5.6)然后用平衡緩沖液(0.025M MES/50mM NaCl，pH5.6)洗滌準(zhǔn)備好SPSFF柱用于加樣。然后將調(diào)節(jié)到pH為5.60±0.05和導(dǎo)電率為5.8±0.2的蛋白A合并液上柱。在洗脫前，該柱分三步洗滌(1)最小1個柱體積的加樣緩沖液(0.025M MES/50mM NaCl，pH5.6)；(2)中間緩沖液(0.025M MES/70mM NaCl，pH5.6)直到達(dá)到280nm峰頂點；和(3)最小為1.2柱體積的洗滌緩沖液(0.025M MES/50mM NaCl，pH5.6)。然后用洗脫緩沖液(0.025M MES/95mM NaCl，pH5.6)將rhuMAb HER2從柱上洗脫出來。洗脫280nm圖譜在前導(dǎo)邊緣有一個肩部(圖3)。在該肩部的拐點，合并開始并繼續(xù)另5個柱體積。然后用再生緩沖液再生柱(0.025M MES/1.0MNaCl，pH5.6)。
材料和方法柱和加樣準(zhǔn)備裝填一根還原級的SPSFF柱。尺寸是27.0ml體積、1.0cm直徑和34.5cm床高。將一等分的蛋白A合并液的pH用1.5M Tris堿滴定到5.6。加入等體積注射用無菌水(SWFI)減小合并液的導(dǎo)電率。
層析該研究的層析用Pharmacia的UNICORNTMHPLC系統(tǒng)進(jìn)行。以線性流速200cm/h進(jìn)行平衡、加樣和最初洗滌步驟。所有層析步驟以線性流速100cm/h進(jìn)行。層析步驟的順序見表1。用加樣密度為每毫升SPSFF樹脂15、20、25、30、35和40mg rhuMAb HER2進(jìn)行總共六次層析。
表1-層析步驟1

1.用操作模式進(jìn)行樹脂平衡剩余步驟按照Pharmacia Unicorn Program進(jìn)行。
2.CV＝柱體積總蛋白通過分光光度掃描各樣品測定各層析組分的蛋白濃度(流穿、洗滌步驟、洗脫預(yù)合并液、洗脫合并液和再生)。將結(jié)果用來計算產(chǎn)物回收量。rhuMAb HER2的消光系數(shù)是1.45。用來推算結(jié)果的算式(圖4)是蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)＝280nm/1.45×稀釋系數(shù)各組分中的蛋白量(mg)＝蛋白濃度(mg/ml)×組分體積(mL)產(chǎn)量(％)＝組分量(mg)/總量(mg)×100。
rhuMAb HER2抗體變體(CSxHPIEX)的測定rhuMAb HER2 SPSFF層析柱分離抗體變體。通過CSx HPIEX層析測試了所研究的各層析組分中變體抗體的相對量。以1ml/min在55℃進(jìn)行BAKERBOND WIDEPORETMCSx HPIEX柱(4.6×250mm)。從第三梯度形成流動相(表2)。
表2-梯度流程

跑柱以55℃1ml/min流速。
A緩沖液是0.025M MES，pH5.9；B緩沖液是1M醋酸銨，pH7.0；而C溶液是注射用無菌水。用梯度的初始濃度(49％A；1％B；和50％C)平衡此柱，注入用SWFI稀釋并含有＜300微克蛋白的200微升樣品。綜合得到的各層析圖來確定各組分的各峰百分比面積(表3和圖5)。
表3-rhuMAb HER2的CSx HPIEX分析

比較層析從Unicorn以ASCII格式輸出了各層析文件的吸光度數(shù)據(jù)(AU280nm)。將0.025M MES/0.07M NaCl，pH5.6洗滌的數(shù)據(jù)翻譯成Excel格式并拷貝到KALEIDAGRAPHTM中，用其將洗滌圖展開(圖6)并彼此進(jìn)行比較。
結(jié)果和討論當(dāng)抗體用重組DNA技術(shù)(見圖5中的CSx峰a，b和1)制備時，產(chǎn)生了rhuMAb HER2的脫酰胺基變體和其它酸性變體。脫酰胺基和其它酸性變體組成了(用整合曲線下方面積或用CSx層析獲得的圖譜計算)最初蛋白A層析步驟獲得的組合物的大約25％。發(fā)現(xiàn)本文所述的離子交換方法能用來充分降低抗-HER2組合物中脫酰胺基變體和其它酸性變體的量，即降到約13％或以下(即經(jīng)過如本文所述的陽離子交換層析制備物中酸性變體量減少了大約50％或更多)。
如本文上述進(jìn)行陽離子交換層析得到的吸光度示蹤顯示于圖3。本方法分離出和非脫酰胺基抗-HER2抗體只有輕微不同的抗-HER2抗體的脫酰胺基變體。從最初條件換到中間洗液導(dǎo)電率的增加開始洗脫脫酰胺基抗-HER2抗體。然而，發(fā)現(xiàn)在該導(dǎo)電率下繼續(xù)洗滌會洗脫非脫酰胺基抗-HER2抗體，導(dǎo)致產(chǎn)物損失。觀察到直接從中間緩沖液進(jìn)行到洗脫緩沖液如果合并開始過早會導(dǎo)致從產(chǎn)物中不可接受的除去脫酰胺基抗-HER2抗體太少，或如果將合并延遲至脫酰胺基抗-HER2抗體被還原，會導(dǎo)致不可接受的抗-HER2抗體低產(chǎn)量。發(fā)現(xiàn)通過回到最初施用的較低導(dǎo)電率，脫酰胺基抗-HER2抗體的洗脫將繼續(xù)，但無顯著的抗-HER2抗體產(chǎn)物洗脫。
評估了rhuMAb HER2加樣對(a)緩沖液的要求，(b)合并液中的產(chǎn)物回收和(c)合并液中的產(chǎn)物質(zhì)量的效果。
在加樣密度為15mg/ml到35mg/ml時，洗脫合并液中的產(chǎn)物量大約是75％。對于加樣密度40mg/ml，合并液中的產(chǎn)物量下降到了65％(圖4)。合并液中回收降低大部分是因為兩個洗滌步驟中抗體損失的增加(分別在70mMNaCl和50mM NaCl)。
如用CSx HPIEX分析測定的(圖5)那樣，所有洗脫合并液中的rhuMAb HER2的質(zhì)量是相等的。和加樣材料比較；非脫酰胺基抗體(峰3)富集，異-Asp102或Lys450抗體(峰4)量無變化，Asp30脫酰胺基抗體量減少(峰a，b，1和其它)。
這些陽離子合并液中的rhuMAb HER2質(zhì)量通過中間洗滌步驟得到了提高。由于結(jié)合在樹脂上的rhuMAb HER2量增加了，達(dá)到280nm峰頂點所需的中間緩沖液體積消耗減少了。40mg/ml加樣密度所需緩沖液體積是大約2.5柱體積。15mg/ml加樣密度所需的緩沖液體積是大約15柱體積。緩沖液需要的準(zhǔn)確增加量和這兩個極端之間5mg/ml遞增的改變不是線性關(guān)系。在加樣密度為20mg/ml和15mg/ml之間可見最大增加。此時需要從7.5倍柱體積倍增到前面提到的15倍柱體積緩沖液。然而如果達(dá)到70mM NaCl洗滌峰頂點，產(chǎn)物質(zhì)量對任何測定的加樣密度來說是相等的。
該研究測定了可將多少rhuMAb HER2加到SPSFF樹脂上。在每毫升樹脂15到40毫克抗體范圍內(nèi)，在洗脫合并液中回收的rhuMAb HER2質(zhì)量上沒有不同。然而，當(dāng)用大于35mg/ml加到樹脂上時，回收的rhuMAb HER2質(zhì)量大約下降了10％。為了穩(wěn)定產(chǎn)量，推薦將35mg/ml設(shè)定為rhuMAb HER2制備的最大加樣量。另外，由于在20和15mg/ml之間70mM NaCl洗滌體積需要量大為增加；推薦將20mg/ml設(shè)定為rhuMAb HER2制備的最小加樣量。
權(quán)利要求
1.一種從包含多肽和污染物的組合物中純化該多肽的方法，其特征在于，該方法包括依次進(jìn)行的下列步驟(a)用加樣緩沖液使多肽結(jié)合到離子交換材料上，其中加樣緩沖液處于第一導(dǎo)電率和pH下；(b)用第二導(dǎo)電率和/或pH的中間緩沖液洗滌離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下污染物；(c)用第三導(dǎo)電率和/或pH的洗滌緩沖液洗滌離子交換材料，其中從中間緩沖液到洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH的變化，和從加樣緩沖液到中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH的變化方向相反；和(d)用第四導(dǎo)電率和/或pH的洗脫緩沖液洗滌離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該離子交換材料是陽離子交換樹脂。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該離子交換材料是陰離子交換樹脂。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH比加樣緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH大，而洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH比中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH小。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH和加樣緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH大致相同。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，洗滌緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH比中間緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH大。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述污染物和多肽的洗脫是通過分別改變中間緩沖液和洗脫緩沖液的導(dǎo)電率而實現(xiàn)的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在(a)-(d)各步驟中，pH保持大致穩(wěn)定。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽和所述污染物具有略微不同的pI。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述污染物是多肽的脫酰胺基變體。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述中間緩沖液和洗脫緩沖液的導(dǎo)電率是通過改變其中的鹽濃度來改變的。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述中間緩沖液和洗脫緩沖液的導(dǎo)電率是通過改變其中的NaCl濃度來改變的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(d)后用再生緩沖液洗滌離子交換材料。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述陽離子交換樹脂是固定在瓊脂糖上的硫丙基。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽是抗體。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體結(jié)合HER2。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中污染物是多肽的脫酰胺基變體。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括將組合物在離子交換層析方法之前、之中或之后經(jīng)過一次或多次進(jìn)一步的純化步驟，來獲得該多肽的均一制備物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，該方法還包括將純化多肽和異源分子偶聯(lián)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述異源分子是聚乙二醇，標(biāo)記物或細(xì)胞毒制劑。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過將多肽的均一制備物和藥物學(xué)上可接受的載體混合，從而制備藥物組合物。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法純化的多肽。
23.一種從包含多肽和污染物的組合物中純化多肽的方法，其特征在于，該方法包括依次進(jìn)行的下列步驟(a)用加樣緩沖液使多肽結(jié)合到陽離子交換材料上，其中加樣緩沖液處于第一導(dǎo)電率和pH下；(b)用導(dǎo)電率和/或pH比加樣緩沖液大的第二導(dǎo)電率和/或pH的中間緩沖液洗滌陽離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下污染物；(c)用導(dǎo)電率和/或pH比中間緩沖液小的第三導(dǎo)電率和/或pH的洗滌緩沖液洗滌離子交換材料，和(d)用導(dǎo)電率和/或pH比中間緩沖液大的第四導(dǎo)電率和/或pH的洗脫緩沖液洗滌離子交換材料，從而從離子交換材料上洗脫下多肽。
24.一種從包含抗體和污染物的組合物中純化該抗體的方法，其特征在于，該方法包括將組合物加到陽離子交換樹脂上，其中加到陽離子交換樹脂上的抗體量是每毫升陽離子交換樹脂大約20毫克到大約35毫克抗體。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述陽離子交換樹脂是固定在瓊脂糖上的硫丙基。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將抗體從陽離子交換樹脂上洗脫下來。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，該方法還包括在將抗體從陽離子交換樹脂上洗脫下來之前，在中間洗滌步驟中將污染物從陽離子交換樹脂上洗脫下來的步驟。
28.一種包含抗-HER抗體和一種或多種其酸性變體的組合物，其特征在于，該酸性變體量少于約25％。
29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含藥物學(xué)上可接受的載體。
30.如權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于，該抗-HER2抗體是humMAb4D5-8。
全文摘要
描述了一種用離子交換層析純化多肽的方法，它涉及改變緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH來從一種或多種污染物中分離出感興趣的多肽。
文檔編號C07K16/06GK1626547SQ200410068790
公開日2005年6月15日 申請日期1999年5月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月6日
發(fā)明者C·D·貝斯, G·S·布蘭克 申請人:基因技術(shù)股份有限公司