專利名稱：一種重組人血小板衍生生長因子及其編碼基因與表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種重組人血小板衍生生長因子及其編碼基因與表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是1974年由Ross等首先發(fā)現(xiàn)的，最初從血小板中獲得，故稱為血小板衍生生長因子。PDGF是血清中主要的細(xì)胞有絲分裂原，是由18kD的A鏈和/或16kD的B鏈通過二硫鍵相連的二聚體。體內(nèi)有三種二聚體形式(PDGF-AA，AB，BB)，具有多種生物學(xué)功能，是多種細(xì)胞的強(qiáng)力絲裂原和趨化物。PDGF可促進(jìn)皮膚上皮細(xì)胞營養(yǎng)代謝，保護(hù)皮膚及預(yù)防皮膚由于各種原因?qū)е碌膿p傷。PDGF還可以有效地促進(jìn)皮下膠原細(xì)胞的功能，加速皮膚膠原細(xì)胞的生長，加速細(xì)胞分泌膠原，從而達(dá)到抗皺及延緩衰老的作用。
目前研究發(fā)現(xiàn)PDGF在損傷修復(fù)過程中起重要作用，具有愈傷活性，主要是增加粒狀組織形成的活性，美國FDA已批準(zhǔn)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達(dá)的人重組血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的羧甲基纖維素鈉膠(NaCMC)用于遠(yuǎn)端神經(jīng)性糖尿病潰瘍的治療，及軟組織損傷的臨床試驗(yàn)。
PDGF B鏈?zhǔn)怯?2號(hào)染色體上6個(gè)外顯子基因產(chǎn)生的。B鏈基因與正常人細(xì)胞中的c-sis基因完全一樣，c-sis基因編碼的蛋白為分子量27kD，共241個(gè)氨基酸的前肽原，它包含有20個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，61個(gè)氨基酸的肽原和一個(gè)16kD，160個(gè)氨基酸的成熟多肽。在成熟B鏈的C端很可能發(fā)生了裂解，形成的最終成熟產(chǎn)物是一12kD，109個(gè)氨基酸的多肽?？僧a(chǎn)生B鏈蛋白的細(xì)胞包括胎兒成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和胸乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。在生理狀態(tài)下，PDGF以α顆粒的形式儲(chǔ)存于血小板中。
從人血小板提取物中分離純化的PDGF-BB，通過N端氨基酸分析表明存在三種不同的剪切形式，20％Ser1，45％Thr6及35％Thr33，這些切割的異質(zhì)性，導(dǎo)致在純化PDGF中的不均一性。(Hart CE，Bailey M，Curtis DA et al.Purificationof PDGF-AB and PDGF-BB from human platelet extracts and identification ofall three PDGF dimers in human platelets.Biochemistry.1990；29(1)166-72.)。釀酒酵母表達(dá)的109個(gè)氨基酸的重組PDGF-BB(Cook AE，Kirwin PM，CraigS et al.Purification and analysis of proteinase-resistant mutants ofrecombinant platelet-derived growth factor-BB exhibiting improvedbiological activity.Biochem J.1992；28157-65)，N端氨基酸序列同樣存在2種主要形式，即109個(gè)氨基酸的全長B鏈和104個(gè)氨基酸的缺失B鏈，導(dǎo)致重組蛋白可能形成3種不同分子量的蛋白混合物，即109個(gè)氨基酸全長的和104個(gè)氨基酸剪切后的及兩者混合的二聚體，且3種蛋白的比例不可控，使得PDGF-BB的精確質(zhì)量控制較困難。另外，PDGF-BB在釀酒酵母中表達(dá)，表達(dá)量低(僅為0.4mg/L)，成本高，產(chǎn)物過糖基化，限制了它的廣泛使用。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(Pichia pastoris)是近幾年建立的一種真核表達(dá)系統(tǒng)(Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)45-66)，是表達(dá)外源蛋白最成功的表達(dá)系統(tǒng)之一。由于它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖迅速，費(fèi)用低及操作簡便的特點(diǎn)，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)能對重組蛋白進(jìn)行正確加工、折疊及適度糖基化的優(yōu)點(diǎn)。目前已有200多種蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中得以表達(dá)(Cregg JM，Cereghino JL，Shi JY，et al.Recombinant protein expression inPichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000，16(1)23-52)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種重組人血小板衍生生長因子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的重組人血小板衍生生長因子，名稱為Thr6-PDGF-BB，是由兩條B鏈組成的二聚體，所述B鏈?zhǔn)蔷哂行蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列的多肽或?yàn)镾EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的多肽。
序列表中的SEQ ID №1由104個(gè)氨基酸殘基組成。
上述重組人血小板衍生生長因子B鏈的編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)編碼序列表中SEQ ID №1多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS，65℃。
序列表中的SEQ ID №2由312個(gè)堿基組成。
含有本發(fā)明的重組人血小板衍生生長因子B鏈編碼基因的載體、細(xì)胞系及宿主菌，如pPIC9Kmp和含有pPIC9Kmp的巴氏畢赤酵母GS115，pCdhfrmp和含有pCdhfrmp的CHO/dhfr-細(xì)胞株均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述重組人血小板衍生生長因子的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)重組人血小板衍生生長因子的方法，是將含有上述重組人血小板衍生生長因子B鏈編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，表達(dá)得到重組人血小板衍生生長因子。
所述宿主可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等。
所述酵母菌優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為CHO細(xì)胞。所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115。
用于構(gòu)建所述重組酵母表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如可在酵母中表達(dá)的pPIC9，pPIC9K；可在大腸桿菌中表達(dá)的pBV220、pQE30、pET15；可在CHO細(xì)胞中表達(dá)的pCdhfr1(劉國奇，陳小密，徐靜，于長明等攜帶共擴(kuò)增基因的CHO細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建。細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志2000；16(1)17-19)本發(fā)明的重組人血小板衍生生長因子Thr6-PDGF-BB含104個(gè)氨基酸，可在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)，表達(dá)量大于500mg/L，且重組蛋白進(jìn)行了正確加工、折疊及適度糖基化。Thr6-PDGF-BB表達(dá)純化產(chǎn)物為單一分子量的蛋白純品，純度達(dá)99％，氨基酸序列均一，肽重復(fù)性好，能精確進(jìn)行質(zhì)量控制。Thr6-PDGF-BB也可在大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、枯草桿菌等宿主中表達(dá)。
本發(fā)明的重組人血小板衍生生長因子Thr6-PDGF-BB表達(dá)純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性優(yōu)于PDGF-BB同為畢赤酵母表達(dá)的蛋白濃度均為1mg/ml的Thr6-PDGF-BB和PDGF-BB相同條件放置4℃12個(gè)月后，Thr6-PDGF-BB純化產(chǎn)物的SDS-PAGE仍為均一的蛋白條帶，而PDGF-BB純化產(chǎn)物除原有的蛋白主帶外，還出現(xiàn)多條小分子蛋白帶，說明蛋白發(fā)生了降解；Thr6-PDGF-BB的比活性仍為7.5×105IU/mg蛋白，而PDGF-BB的比活性下降了40％。試驗(yàn)證明Thr6-PDGF-BB的穩(wěn)定性優(yōu)于PDGF-BB。
本發(fā)明的重組人血小板衍生生長因子及其B鏈編碼基因與表達(dá)方法將在血小板衍生生長因子的應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。


圖1為pPIC9Kmp核酸序列測定圖譜圖2為Thr6-PDGF-BB N末端氨基酸序列測定圖譜。
圖3為純化后的Thr6-PDGF-BB SDS-PAGE電泳圖譜圖4為純化后的Thr6-PDGF-BB氨基酸組成分析圖譜圖5為純化后的Thr6-PDGF-BB肽質(zhì)量指紋圖譜圖6為毛細(xì)管電泳測定純化后的Thr6-PDGF-BB的純度具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、Thr6-PDGF-BB的表達(dá)一、Thr6-PDGF-BB在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達(dá)1、總RNA的提取按Trizol試劑盒(Gibcol公司產(chǎn)品)說明書從人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞中提取總RNA。
2、逆轉(zhuǎn)錄PCR以提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增PDGF的B鏈部分基因(從第六個(gè)氨基酸Thr起始)，采用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。
引物序列如下5’端引物 5’CCG CTC GAG AAA AGA ACC ATT GCT GAG CCG GCCA 3’(帶下劃線的堿基為Xho I酶切位點(diǎn)序列)；3’端引物 5’G GAA TTC TTA GGTCAC AGG CCG T 3’(帶下劃線的堿基為EcoR I酶切位點(diǎn)序列)。
于50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行一步法RT-PCR，反應(yīng)體系含有AMV/Tfl5×buffer 10μl、dNTP 1mmol/L、25mmol/L MgSO42μl、5’端和3’端引物各50pmol、Tfl DNA聚合酶5U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U及總RNA 50ng。反應(yīng)條件48℃逆轉(zhuǎn)錄45min，94℃2min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增先按如下溫度程序進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃變性30s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸40s；最后72℃總延伸7min，回收PCR產(chǎn)物。
3、構(gòu)建分泌型重組人Thr6-PDGF-BB酵母表達(dá)載體pPIC9Kmp用XhoI及EcoRI酶切步驟2中的PCR產(chǎn)物，與經(jīng)同樣酶切處理的分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9連接，TSS法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆pPIC9mp，SacI及HpaI酶切pPIC9mp，回收含有Thr6-PDGF-BB的基因片斷，與經(jīng)同樣酶切處理的分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9K連接，TSS法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆pPIC9Kmp，將陽性菌株送Takara公司進(jìn)行核酸序列測定，測序結(jié)果如圖1所示，表明重組表達(dá)載體pPIC9Kmp構(gòu)建成功，其中，插入的Thr6-PDGF-BB的B鏈編碼基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，Thr6-PDGF-BB的B鏈具有序列表序列1的氨基酸殘基序列。
4、轉(zhuǎn)化畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9Kmp經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌GS115，轉(zhuǎn)化條件為1.5kv，25μF。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布MD平板，篩選得到his+重組克隆，將每個(gè)克隆順序點(diǎn)種于MM、MD平板，30℃培養(yǎng)2-3d，確定每個(gè)菌株的Mut表型。
5、高表達(dá)菌株的篩選將篩選出的his+重組克隆接種于5ml BMGY中，30℃300r/min培養(yǎng)至A6002.0-6.0，室溫4000r/min，離心4min。收集的菌體用BMMY懸浮并稀釋至A600為1.0，30℃300r/min誘導(dǎo)。每12h補(bǔ)加甲醇至0.5％。誘導(dǎo)48h后收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)，選取目的蛋白(28kD左右條帶)表達(dá)量高的菌株用于發(fā)酵培養(yǎng)。
6、發(fā)酵培養(yǎng)采用補(bǔ)料高密度發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵從新鮮平板上挑一單菌落到種子培養(yǎng)基BMGY中，30℃，250r/min培養(yǎng)20-25h后，按10％接種量接入50L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)(用氨水調(diào)pH至5左右)，當(dāng)碳源甘油耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加補(bǔ)料生長培養(yǎng)基(含12mL/L PTM1 50％甘油)，并維持溶氧處于30％左右。當(dāng)細(xì)胞光密度(A600)為500左右時(shí)停止補(bǔ)料，甘油耗盡后開始流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧處于30％左右，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后停止流加甲醇，待甲醇消耗完后放罐。
Thr6-PDGF-BB的表達(dá)量為500mg/L。而釀酒酵母表達(dá)的PDGF-BB表達(dá)量僅為0.4mg/L(Cook AE，Kirwin PM，Craig S et al.Purification and analysis ofproteinase-resistant mutants of recombinant platelet-derived growthfactor-BB exhibiting improved biological activity.Biochem J.1992；28157-65)。
7、蛋白純化將發(fā)酵液經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)離心后，對20mM PB超濾，上樣于裝填SP XL Sepharose的陽離子交換柱，用含1mol/L NaCl的PBS洗脫；洗脫液加(NH4)2SO4至1mol/L，上樣于平衡好的Phenyl Sepharose FF疏水層析柱，20mmol/L PB洗脫目的蛋白；目的蛋白峰上樣于pH7.2，20mmol/L PB，0.15mol/L NaCl平衡的Superdex 75凝膠過濾柱，收集洗脫峰。洗脫峰的15％SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，表明該洗脫峰只有一條帶。圖3中，M為蛋白Marker；1為純化后的蛋白。
8、畢赤酵母表達(dá)的Thr6-PDGF-BB的重組蛋白鑒定按目前通用的Edman化學(xué)降解法對純化后的Thr6-PDGF-BB進(jìn)行了N末端氨基酸序列測定，結(jié)果如圖2所示，表明N末端15個(gè)氨基酸序列依次為TIAEP AMIAE CKTRT，與理論一致，說明該重組蛋白N端加工正確，未發(fā)生不正確剪切。
利用氨基酸自動(dòng)分析儀對純化后的Thr6-PDGF-BB進(jìn)行了氨基酸組成分析，結(jié)果如圖4所示，表明1mol的Thr6-PDGF-BB中含有0.0794mol天冬氨酸(D)殘基，含有0.0191mol絲氨酸(S)殘基，含有0.1434mol谷氨酸(E)殘基，含有0.0151mol甘氨酸(G)殘基，含有0.0096mol組氨酸(H)殘基，含有0.1115mol精氨酸(R)殘基，含有0.0676mol異亮氨酸(I)殘基，含有0.0943mol丙氨酸(A)殘基，含有0.068mol脯氨酸(P)殘基，含有0.0202mol半胱氨酸(C)殘基，含有0mol酪氨酸(Y)殘基，含有0.1182mol纈氨酸(V)殘基，含有0.0085mol甲硫氨酸(M)殘基，含有0.0823mol賴氨酸(K)殘基，含有0.0334mol苯丙氨酸(F)殘基，含有0.0486mol亮氨酸(L)殘基，含有0.0807mol蘇氨酸(T)殘基，結(jié)果與理論值一致。
肽圖分析與氨基酸序列和組成分析合并研究，可作為蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的精確鑒別。經(jīng)化學(xué)裂解法后利用Voyager Biospectrometer飛行質(zhì)譜工作站，對純化后的Thr6-PDGF-BB進(jìn)行了肽質(zhì)量指紋圖譜測定，結(jié)果如圖5所示，表明肽圖與參照品一致，進(jìn)一步證明蛋白結(jié)構(gòu)正確和工藝的穩(wěn)定性。
利用靈敏度和分辨率都較高的BECKMAN P/ACE SYSTEM 5500毛細(xì)管電泳儀，測定了純化后的Thr6-PDGF-BB純度，結(jié)果如圖6所示，表明Thr6-PDGF-BB的純度達(dá)到了99％。
9、畢赤酵母表達(dá)的Thr6-PDGF-BB的生物活性測定采用NIH 3T3細(xì)胞株/MTT法測定純化后的Thr6-PDGF-BB生物活性，其中NIH 3T3細(xì)胞株購自中國藥品生物制品檢定所，效價(jià)校正參考品為PDGF-BB國際標(biāo)準(zhǔn)品，IS94/728，購自英國NIBSC。具體方法如下消化和收集NIH 3T3細(xì)胞，配成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)18-24h。吸取各孔上清，分別加入梯度稀釋的樣品液和標(biāo)準(zhǔn)品液，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)64-72h。加入MTT溶液，培養(yǎng)5h后，加入DMSO裂解液，室溫放置30min后比色，測定波長510nm處的OD值，按下式計(jì)算Thr6-PDGF-BB的生物活性樣品生物活性＝國際標(biāo)準(zhǔn)品生物活性×(樣品稀釋倍數(shù)÷標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù))×(樣品半效稀釋倍數(shù)÷標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù))。結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)的Thr6-PDGF-BB(比活性為7.5×105IU/mg)的生物學(xué)活性高于同系統(tǒng)表達(dá)的109個(gè)氨基酸的PDGF-BB(比活性為5×105IU/mg)，更高于釀酒酵母表達(dá)的PDGF-BB(比活性為1×104IU/mg)。(Cook AE，Kirwin PM，Craig S et al.Purification and analysis of proteinase-resistant mutants of recombinantplatelet-derived growth factor-BB exhibiting improved biological activity.Biochem.J.1992；28157-65)。將純化后的Thr6-PDGF-BB和同為畢赤酵母表達(dá)的蛋白濃度均為1mg/ml的Thr6-PDGF-BB和PDGF-BB相同條件放置4℃12個(gè)月后，進(jìn)行以下操作1)進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明Thr6-PDGF-BB純化產(chǎn)物仍為均一的蛋白條帶，而PDGF-BB純化產(chǎn)物除原有的蛋白主帶外，還出現(xiàn)多條小分子蛋白帶，說明蛋白發(fā)生了降解；2)按照上述方法進(jìn)行生物活性檢測的結(jié)果表明，Thr6-PDGF-BB的比活性仍為7.5×105IU/mg蛋白，而PDGF-BB的比活性從5×105IU/mg下降為3×105IU/mg蛋白，下降了40％。
二、Thr6-PDGF-BB在大腸桿菌中的表達(dá)1、Thr6-PDGF-BB的表達(dá)設(shè)計(jì)引物上游引物，CGG AAT TCA TGA CCA TTG CTG AGC 下游引物，CGG CATCCT TAT CAG GTC ACA GGC CGT GCA，分別在兩端引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，以pPIC9Kmp為模板擴(kuò)增Thr6-PDGF-BB的B鏈編碼基因，其中，反應(yīng)程序?yàn)橄劝慈缦聹囟瘸绦蜻M(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸40s；最后72℃總延伸7min，回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化，與經(jīng)過同樣處理的原核表達(dá)載體pBV220連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，PCR篩選陽性克隆。將陽性克隆經(jīng)30℃過夜活化，次日以2％比例接種于LB培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A600＝0.4-0.6)，立即轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床，200r/min培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。離心，重懸沉淀，超聲破碎菌體，將沉淀物和上清進(jìn)行SDS-PAGE，確定目的蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。包涵體經(jīng)2mol/L尿素洗滌2次，8mol/L尿素變性溶解，溶解上清進(jìn)行Superdex75凝膠過濾，純化的樣品在復(fù)性緩沖液(100mmol/L Na2HPO4、100mmol/L NaH2PO4、0.1mmol/LGSSG、1mmol/L GSH、0.1％PEG)4℃復(fù)性24h，獲得目的蛋白。
2、大腸桿菌表達(dá)的Thr6-PDGF-BB的生物活性測定測定方法同上述畢赤酵母表達(dá)的Thr6-PDGF-BB的生物活性測定。結(jié)果表明大腸桿菌表達(dá)的Thr6-PDGF-BB比活性為1×105IU/mg，而同系統(tǒng)表達(dá)的PDGF-BB比活性為7×104IU/mg。
三、Thr6-PDGF-BB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)1、Thr6-PDGF-BB的表達(dá)設(shè)計(jì)引物上游引物C CTC GAG ACC ATG GAC CAT TGC TGA GCC GGC C下游引物GC GTCGAC TTA TCA GGT CAC AGG CCG TGC A，分別在5’端，3’端引入酶切位點(diǎn)XhoI及SalI，5’端引入起始密碼子ACC ATG G，以pPIC9Kmp為模板擴(kuò)增Thr6-PDGF-BB的B鏈編碼基因，其中，反應(yīng)程序?yàn)橄劝慈缦聹囟瘸绦蜻M(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸40s；最后72℃總延伸7min，回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XhoI及SalI消化，與經(jīng)過同樣處理的表達(dá)載體pCdhfr1(劉國奇，陳小密，徐靜，于長明等攜帶共擴(kuò)增基因的CHO細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建。細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志2000；16(1)17-19)連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，PCR篩選陽性克隆pCdhfrmp，提取質(zhì)粒已備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine plus(購自Gibco公司)。CHO/dhfr-細(xì)胞株購自ATCC，轉(zhuǎn)染24h后，換新鮮IMDM培養(yǎng)液(含10％的透析胎牛血清)，之后每4d換液一次。經(jīng)過2周的培養(yǎng)，待細(xì)胞形成克隆，挑取單個(gè)克隆于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，收集上清檢測目的蛋白的表達(dá)，陽性克隆用1×10-6mol/L氨甲喋呤(MTX)進(jìn)行加壓篩選以提高表達(dá)量。Thr6-PDGF-BB的表達(dá)量為100μg/每106個(gè)細(xì)胞/d。
2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的Thr6-PDGF-BB的生物活性測定測定方法同上述畢赤酵母表達(dá)的Thr6-PDGF-BB的生物活性測定。結(jié)果表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的Thr6-PDGF-BB比活性為1×106IU/mg，而同系統(tǒng)表達(dá)的PDGF-BB比活性為7×105IU/mg。
序列表<160>2<210>1<211>104<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr Arg Thr Glu1 5 10 15Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe20 25 30Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg Cys Ser Gly Cys Cys35 40 45Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln Val Gln Leu Arg Pro50 55 60Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro Ile Phe Lys65 70 75 80Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys Cys Glu Thr85 90 95Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr100<210>2<211>312<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2accattgctg agccggccat gatcgccgag tgcaagacgc gcaccgaggt gttcgagatc60
tcccggcgcc tcatagaccg caccaacgcc aacttcctgg tgtggccgcc ctgtgtggag120gtgcagcgct gctccggctg ctgcaacaac cgcaacgtgc agtgccgccc cacccaggtg180cagctgcgac ctgtccaggt gagaaagatc gagattgtgc ggaagaagcc aatctttaag240aaggccacgg tgacgctgga agaccacctg gcatgcaagt gtgagacagt ggcagctgca300cggcctgtga cc31權(quán)利要求
1.一種重組人血小板衍生生長因子，是由兩個(gè)B鏈組成的二聚體，所述B鏈?zhǔn)蔷哂行蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列的多肽或?yàn)镾EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的多肽。
2.權(quán)利要求1所述的重組人血小板衍生生長因子B鏈的編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)編碼序列表中SEQ ID №1多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2雜交的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述重組人血小板衍生生長因子B鏈編碼基因的載體、細(xì)胞系及宿主菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體、細(xì)胞系及宿主菌，其特征在于所述載體為pPIC9Kmp或pCdhfrmp；所述宿主菌為含有pPIC9Kmp的巴氏畢赤酵母GS115；所述細(xì)胞系為含有pCdhfrmp的CHO/dhfr-細(xì)胞株。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述重組人血小板衍生生長因子的方法，是將含有重組人血小板衍生生長因子B鏈編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，表達(dá)得到重組人血小板衍生生長因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主為酵母菌，大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述酵母菌為巴氏畢赤酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述巴氏畢赤酵母為巴氏畢赤酵母GS115；所述重組表達(dá)載體為pPIC9Kmp。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主為CHO細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述CHO細(xì)胞為CHO/dhfr-細(xì)胞株；所述重組表達(dá)載體為pCdhfrmp。
全文摘要
本發(fā)明公開了種重組人血小板衍生生長因子及其編碼基因與表達(dá)方法。本發(fā)明所提供的重組人血小板衍生生長因子，是由兩個(gè)B鏈組成的二聚體，所述B鏈?zhǔn)蔷哂行蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列的多肽或?yàn)镾EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的多肽。本發(fā)明的重組人血小板衍生生長因子及其B鏈編碼基因與表達(dá)方法將在血小板衍生生長因子的應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C07K14/49GK1661011SQ20041006899
公開日2005年8月31日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者陳薇, 于長明, 付玲, 白森 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 北京勁邦生物工程有限公司