專利名稱：一種人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有人角質(zhì)細胞生長因子2或其衍生序列的表達質(zhì)粒載體。
背景技術：
重組人角質(zhì)細胞生長因子2及其衍生序列在大腸桿菌中表達，在多篇文獻中已涉及。專利US6077692中使用Human Genomics Science公司的pHE4進行表達，啟動子為噬菌體啟動子并受一前一后兩個lacO操作子的調(diào)控，ColE1復制子，卡那霉素抗性。專利WO9625422中使用的是Qiagen公司的pQE-60表達載體，啟動子為噬菌體T5啟動子并受兩個位于3’端的lacO操作子的調(diào)控，ColE1復制子，氨芐青霉素抗性。還有使用Novogene公司的pET系列載體進行表達的(H.Emoto et.al，J.Bio.Chem.272(37)23191-23194，1997；S.Bagai.et.al，J.Bio.Chem.277(28)23828-23837，2002)，還有使用invitrogen公司的pSE載體進行表達的(馬雁彬等，中國生物化學與分子生物學報，17(6)761-765，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有人角質(zhì)細胞生長因子2或其衍生序列并且能夠高效表達重組人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體含有一個Trc啟動子；兩個lacO操作子；一編碼人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白的基因序列或其衍生序列；還含有RBS-ATG序列、轉(zhuǎn)錄終止子、卡那霉素編碼序列、復制子、lacI阻遏蛋白編碼序列及其它連接序列。
在專利申請?zhí)?00410022645.1中我們描述了一種KGF-2表達方法，使用invitrogen公司的pThioHisA載體，發(fā)現(xiàn)其本底表達很高，提示可能由于KGF-2基因序列結(jié)構(gòu)原因?qū)е耹acI阻遏蛋白不能有效地結(jié)合在lacO操作子上，導致較高的本底轉(zhuǎn)錄。KGF-2蛋白對大腸桿菌有毒性，較高的本底表達導致宿主菌生長停滯，決定了氨芐青霉素不宜作為篩選基因。因此，選用一種低拷貝數(shù)的雙lacO操作子調(diào)控的卡那霉素抗性質(zhì)粒用于KGF-2表達是比較合適的，基于以上分析我們構(gòu)建了本發(fā)明中描述的表達質(zhì)粒載體。
本發(fā)明所述的質(zhì)粒載體呈卡那霉素抗性，攜帶阻遏蛋白lacI編碼基因，復制子為ColE1，啟動子為Trc啟動子，由-35區(qū)序列5’TTGACAATTAAT3’和-10區(qū)序列5’TATAAT3’組成。在Trc啟動子的5’端和3’端分別有一lacO操作子，由序列5’TGTGAGCGGATAACAAT3’組成，第一個起始于-60至-51區(qū)域，第二個起始于+1至+10區(qū)域。角質(zhì)細胞生長因子2基因序列為編碼蛋白序列如SEQ ID No.1或其衍生序列。
本發(fā)明所述的人KGF-2蛋白表達質(zhì)粒載體中具有代表性的質(zhì)粒載體pTiK226其結(jié)構(gòu)如圖1所示，其序列如SEQ ID No.2。
用上述的質(zhì)粒載體pTiK226表達時，其本底表達水平比另一類似質(zhì)粒載體pTrc217的本底表達水平低，如圖2所示。pTrc217質(zhì)粒載體與pTiK226非常相似，只是將SEQ ID No.2中的4540-4561片斷替換為序列(5’CATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCT 3’)，從而缺少質(zhì)粒pTiK226中位于Trc啟動子5’端的lacO操作子，只含3’端的lacO操作子。證實了兩個lacO操作子在控制本底表達方面比一個操作子強。
我們同時構(gòu)建了另一種雙lacO操作子調(diào)控的T7啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的表達質(zhì)粒pT7DL201，此質(zhì)粒將SEQ ID No.2中的4540-4597片斷替換為序列(5’AAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTT 3’)，此表達載體將pTiK226質(zhì)粒中的Trc啟動子替換為T7啟動子，并由兩個位于其3’端的lacO操作子調(diào)控，其本底表達比質(zhì)粒pTrc217低，但高于質(zhì)粒pTiK226，如圖2所示。這種差異在一定程度上可能因啟動子的強弱不同以及兩個lacO操作子所處位置不同造成，但非常可能的原因是啟動子與待表達基因間的距離不同造成。Trc啟動子與目的基因間的距離較長，消弱了目的基因不利結(jié)構(gòu)的影響。
KGF-2蛋白在大腸桿菌中的表達，Michael等(Biotechnol.Prog.2044-50，2004)表明ompT蛋白對KGF-2的表達純化有非常重要的影響，BL21系列大腸桿菌為ompT和lon蛋白酶缺陷型菌株，比較適合作為pTiK226質(zhì)粒的宿主菌。
本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體用于在大腸桿菌中高效表達重組人KGF-2蛋白。


圖1是重組表達質(zhì)粒載體pTiK226的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是重組表達質(zhì)粒載體pT7DL201、pTiK226、pTrc217本底表達示意圖。
圖3是重組人KGF-2蛋白的表達純化電泳圖譜。
圖4是重組KGF-2蛋白細胞活性。
具體實施例方式
實施例1、重組表達質(zhì)粒pT7DL201、pTiK226、pTrc217的構(gòu)建以K2O(5’CCCTCTAGAAATAATTTTGTTAATTGTGAGCGGATAACAATTTC)和K2R(5’GCACTCGAGTGTAAAACGACGGCCAGTGC)作引物，以質(zhì)粒pTrcKGF2(其構(gòu)建詳見專利申請?zhí)?00410022645.1)作模板，PCR擴增產(chǎn)物用XhoI/XbaI酶切后與載體pET41b(Novagene)的XhoI/XbaII雙酶切大片斷相連接，篩選得到表達質(zhì)粒pT7DL201。
以SphI_lacO_K2F(5’CGTGCATGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATGTTGACAATT AATCATCCGG)和K2R作引物，以質(zhì)粒pTrcKGF2作模板，PCR擴增產(chǎn)物用SphI/XhoI酶切后與載體pET41b(Novagene)的SphI/XhoI雙酶切大片斷相連接，篩選得到表達質(zhì)粒pTiK226，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，序列如SEQ ID No.2。
以SphI_K2F(5’CTTGCATGCCATCATAACGGTTCTGGCAA)和K2R作引物，以質(zhì)粒pTrcKGF2作模板，PCR擴增產(chǎn)物用SphI/XhoI酶切后與載體pET41b(Novagene)的SphI/XhoI雙酶切大片斷相連接，篩選得到表達質(zhì)粒pTrc217。
本發(fā)明所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞為大腸桿菌細胞，最佳的大腸桿菌為BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)placI。表達質(zhì)粒pT7DL201、pTiK226、pTrc217轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)placI，用含25ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)至OD600約為0.4，加入終濃度1mM IPTG誘導，表達產(chǎn)物跑SDS-PAGE電泳，如圖2所示。
pT7DL201、pTiK226、pTrc217此三種表達質(zhì)粒的RBS-ATG序列都相同，其序列為5′AGAGGTATATACATATG3′；轉(zhuǎn)錄終止子都是T7啟動子，復制子都是ColE1復制子，卡那霉素編碼序列和lacI阻遏蛋白編碼序列及其它連接序列都相同，不同的只是啟動子和lacO操作子的個數(shù)及位置。由圖2可見，pTiK226的本底表達最低，pT7DL201次之，pTrc217的本底表達最高，可見質(zhì)粒載體pTiK226最適于KGF-2蛋白的表達。另外，pTiK226表達質(zhì)粒采用了卡那霉素抗性，這比使用氨芐青霉素抗性更適合生產(chǎn)應用，因為盡管其本底表達很低，但還是存在一定的本底表達，如果使用氨芐青霉素抗性在生產(chǎn)上擴大培養(yǎng)時會帶來一定問題，可能使生產(chǎn)菌株不穩(wěn)定。pTiK226表達質(zhì)粒攜帶了lacI阻遏蛋白編碼序列，可以很方便地轉(zhuǎn)化入不同的宿主菌，如果不攜帶此序列，選擇合適的宿主菌，比如BL21(DE3)placI也能獲得高效表達。pTiK226表達質(zhì)粒采用ColE1復制子，此復制子的拷貝數(shù)中等。選用高拷貝數(shù)的復制子，本底表達會升高，表達菌株不穩(wěn)定；選用低拷貝數(shù)的復制子，有可能降低本底表達，但很可能影響最終的表達量。pTiK226表達質(zhì)粒采用的RBS-ATG序列并不是唯一可選的序列，通過形成二級結(jié)構(gòu)阻礙翻譯順利進行從而降低本底表達并不是一種可行方法，因可能造成表達量降低。pTiK226表達質(zhì)粒采用的RBS-ATG可以使翻譯順利進行，在此序列上所作的修改或采用其它的序列，對KGF-2的高效表達都沒有決定性的意義。除上述這些必要序列外，連接這些必要序列的其它序列對KGF-2的高效表達沒有決定性的意義，對其所作的任何修改在不影響表達質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的前提下都沒有實質(zhì)意義。
2、重組KGF-2蛋白的制備將表達質(zhì)粒pTiK226轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL2(DE3)或BL2(DE3)placI后，用含25ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入終濃度1mM IPTG誘導4小時后離心收菌，懸浮于50mMTris/0.15MNaCl/1mMEDTA/pH8.0緩沖液中，超聲破碎后離心去除沉淀，將上清過肝素親和層析柱，大約在1.0M NaCl濃度洗脫得到重組KGF2蛋白。用羊抗人KGF2多抗(USB公司，F(xiàn)4212)作免疫印跡證實表達產(chǎn)物為人KGF2蛋白。如圖3所示。
用原代培養(yǎng)的人角質(zhì)細胞測定重組KGF2蛋白的效價。取手術后包皮組織，剪成小片，用dispase酶消化，分離出表皮，表皮再用trypsin消化，然后用soybean trypsin inhibitor終止消化，離心收集，用completed k-SFM(invitrogen公司)培養(yǎng)至長滿60％培養(yǎng)瓶以上。消化后在96孔培養(yǎng)板中每孔接種1000-2000細胞，用completed k-SFM培養(yǎng)24小時或更長，用K-SFM洗一至兩次，然后用K-SFM培養(yǎng)24小時，然后換成加有不同濃度重組KGF2的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，然后加入含10％alamarBlue(Biosource公司)的K-SFM培養(yǎng)直至顏色改變，測OD570和OD630值。測得的EC50與文獻報道的基本相同，如圖4所示。
SEQ ID No.1序列特征1.長度208氨基酸2.類型蛋白質(zhì)1 MWKWILTHCA SAFPHLPGCC CCCFLLLFLV SSVPVTCQAL GQDMVSPEAT NSSSSSFSSP61 SSAGRHVRSY NHLQGDVRWR KLFSFTKYFL KIEKNGKVSG TKKENCPYSI LEITSVEIGV121 VAVKAINSNY YLAMNKKGKL YGSKEFNNDC KLKERIEENG YNTYASFNWQ HNGRQMYVAL181 NGKGAPRRGQ KTRRKNTSAH FLPMVVHSSEQ ID No.2序列特征1.長度5466堿基 2.類型核酸3.鏈型單鏈 4.拓撲學線性1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg61 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc121 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg181 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc241 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt301 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc361 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta421 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt481 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta541 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat601 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa
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權利要求
1.一種人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于含有一個Trc啟動子；兩個lacO操作子；一編碼人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白的基因序列或其衍生序列。
2.按照權利要求1所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于所述的Trc啟動子由-35區(qū)序列5’TTGACAATTAAT3’和-10區(qū)序列5’TATAAT3’組成。
3.按照權利要求1所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于所述的Trc啟動子的5’端和3’端分別有一lacO操作子，由序列5’TGTGAGCGGATAACAAT3’組成，第一個起始于-60至-51區(qū)域，第二個起始于+1至+10區(qū)域。
4.按照權利要求1所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于所述的角質(zhì)細胞生長因子2基因序列為編碼蛋白序列如SEQ ID No.1或其衍生序列。
5.按照權利要求1所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于所述的質(zhì)粒載體pTiK226其序列如SEQ ID No.2。
6.按照權利要求1所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞為大腸桿菌細胞。
7.按照權利要求6所述的人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白表達質(zhì)粒載體，其特征在于所述的大腸桿菌為BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)placI。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有人角質(zhì)細胞生長因子2或其衍生序列的表達質(zhì)粒載體。本發(fā)明所述的表達質(zhì)粒載體含有一個Trc啟動子；兩個lacO操作子；一編碼人角質(zhì)細胞生長因子2蛋白的基因序列或其衍生序列；還含有RBS－ATG序列、轉(zhuǎn)錄終止子、卡那霉素編碼序列、復制子、lacI阻遏蛋白編碼序列及其它連接序列。本發(fā)明具有代表性的質(zhì)粒載體為pTiK226。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體用于在大腸桿菌中高效表達重組人KGF－2蛋白。
文檔編號C07K14/475GK1786174SQ20041007961
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權日2004年12月8日
發(fā)明者趙彬, 趙晶 申請人:昆明滇虹藥業(yè)有限公司