專利名稱：N－l－精氨酸的分離提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸的分離提純方法，特別涉及一種15N-L-精氨酸的分離提純方法。
背景技術(shù)：
L-精氨酸是人體和動物體內(nèi)的半必需氨基酸，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域有著重要的用途。15N-L-精氨酸由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等研究領(lǐng)域作為示蹤劑而被廣泛應(yīng)用。15N-L-精氨酸的制備一般采用生物發(fā)酵法或蛋白質(zhì)水解法。不論是哪種方法生產(chǎn)精氨酸，都要涉及到如何使精氨酸與大量的雜質(zhì)相分離的問題。
現(xiàn)有技術(shù)分離精氨酸一般采用沉淀法、電滲析法和離子交換法。
沉淀法是利用沉淀劑(如苯甲醛、五氯酚、十二烷基璜酸鈉等)能使精氨酸與其生成溶解度較小的復(fù)合物而沉淀，從而達(dá)到精氨酸與其他氨基酸分離的目的。但是該方法中的沉淀劑苯甲醛、五氯酚均為有毒化合物，提取精氨酸后的廢液排放會對環(huán)境造成污染；而十二烷基璜酸鈉雖然無毒害，但該方法操作步驟繁瑣，劑量不易控制。15N-L-精氨酸作為醫(yī)藥、食品等行業(yè)用的示蹤劑，不宜采用以上三種溶劑進(jìn)行純化。
電滲析法雖然原理簡單，但該方法投資較大，精氨酸回收率不高，從而使得該方法應(yīng)用不廣。
離子交換法提取精氨酸的研究報道較多，但是至今仍未形成規(guī)模化生產(chǎn)。目前，該方法由于含有精氨酸的混合液中存在大量的雜質(zhì)(主要是色素和多種其他氨基酸)，從而影響了交換容量，洗脫時不能與其他氨基酸分開，影響了總提取收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種新的15N-L-精氨酸的分離提純方法，該方法直接從生物發(fā)酵液中分離提純15N-L-精氨酸，從而避免了有毒操作，提高了15N-L-精氨酸的收率。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案；一種15N-L-精氨酸的分離提純方法，以含有精氨酸的發(fā)酵液為原料，采取以下步驟分離提純a、將含有精氨酸的發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)成酸性，離心分離出上清液，上清液用強(qiáng)酸性樹脂吸附，用氨水解吸，得到含15N-L-精氨酸的解吸液；b、將步驟a所得含15N-L-精氨酸的解吸液真空濃縮至干，用蒸餾水溶解后，加入活性炭脫色，抽濾得到含15N-L-精氨酸的澄清濾液；c、將步驟b所得含15N-L-精氨酸的澄清濾液真空濃縮，加入無水乙醇，經(jīng)冷卻結(jié)晶、過濾、真空干燥后得到純凈的15N-L-精氨酸產(chǎn)品。
步驟a中所述的用草酸調(diào)節(jié)成酸性的pH值為3-4，所述的強(qiáng)酸性樹脂為凝膠強(qiáng)酸苯己烯系樹脂，所述的解吸氨水濃度為0.05～0.2mol/L。
步驟b中所述的脫色在70～90℃下進(jìn)行。
步驟c中所述的加入無水乙醇時的溫度控制在60～80℃，所述的冷卻結(jié)晶時的溫度控制在室溫至-18℃，所述的真空干燥時的溫度控制在50～60℃。
步驟a中所述的樹脂吸附控制離心上清液的空柱流速SV＝0.1～1.2％。
本發(fā)明15N-L-精氨酸的分離提純方法由于采用了以上技術(shù)方案，使其與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和特點(1)避免了無毒操作，發(fā)酵液無需進(jìn)行預(yù)處理，采用凝膠強(qiáng)酸苯己烯系樹脂能除去發(fā)酵液中的大量色素，而且能使15N-L-精氨酸與其他氨基酸(如蘇氨酸、脯氨酸等)分開，15N-L-精氨酸的單斑得率＞90％，因此，該工藝既簡單，又便于操作。
(2)用無水乙醇作為精制溶劑，可將色素較多地留在母液中，制得的產(chǎn)品純度＞98％，色澤雪白，15N-L-精氨酸的總提取收率＞80％。
具體實施例方式
下面通過幾個具體實施例對本發(fā)明15N-L-精氨酸的的分離提純方法作進(jìn)一步的說明。
實施例1將用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵后得到的含15N-L-精氨酸的發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH＝3.0，用離心機(jī)離心分離除去發(fā)酵液中的菌絲體和沉淀物，得到上清液，將上清液通過凝膠強(qiáng)酸苯己烯系樹脂柱吸附，控制空柱流速SV＝0.3％，之后用蒸餾水清洗樹脂至中性，然后用0.10mol/L的氨水解吸，得到僅含有15N-L-精氨酸的解吸液。解吸液經(jīng)真空濃縮至干后，加入適量蒸餾水溶解，在75℃下加入活性炭脫色，抽濾后的澄清濾液再經(jīng)真空濃縮，于70℃下加入無水乙醇，然后冷卻至室溫，于-18℃冷凍過夜，15N-L-精氨酸結(jié)晶析出，將結(jié)晶連同母液一起過濾、抽干，用無水乙醇洗滌兩次，再過濾、抽干，得到15N-L-精氨酸的結(jié)晶物，然后將結(jié)晶物于60℃真空干燥，得到純凈的15N-L-精氨酸產(chǎn)品。
實施例2將用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵后得到的含15N-L-精氨酸的發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH＝3.6，用離心機(jī)離心分離除去發(fā)酵液中的菌絲體和沉淀物，得到上清液，將上清液通過凝膠強(qiáng)酸苯己烯系樹脂柱吸附，控制空柱流速SV＝0.8％，之后用蒸餾水清洗樹脂至中性，然后用0.15mol/L的氨水解吸，得到僅含有15N-L-精氨酸的解吸液。解吸液真空濃縮至干后，加入適量蒸餾水溶解，在80℃下加入活性炭脫色，抽濾后的澄清濾液再經(jīng)真空濃縮，于80℃加入無水乙醇，冷卻至室溫，于-18℃冷凍過夜，15N-L-精氨酸結(jié)晶析出，將結(jié)晶連同母液一起過濾、抽干，用無水乙醇洗滌兩次，再過濾、抽干，得到15N-L-精氨酸的結(jié)晶物，然后將結(jié)晶物于50℃真空干燥，得到純凈的15N-L-精氨酸產(chǎn)品。
實施例3將用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵后得到的含15N-L-精氨酸的發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH＝4，用離心機(jī)離心分離除去發(fā)酵液中的菌絲體和沉淀物，得到上清液，將上清液通過凝膠強(qiáng)酸苯己烯系樹脂柱吸附，控制空柱流速SV＝1.2％，之后用蒸餾水清洗樹脂至中性，然后用0.2mol/L的氨水解吸，得到僅含有15N-L-精氨酸的解吸液。解吸液真空濃縮至干后，加入適量蒸餾水溶解，在90℃下加入活性炭脫色，抽濾后的澄清濾液再經(jīng)真空濃縮，于60℃加入無水乙醇，冷卻至室溫，于-18℃冷凍過夜，15N-L-精氨酸結(jié)晶析出，將結(jié)晶連同母液一起過濾、抽干，用無水乙醇洗滌兩次，再過濾、抽干，得到15N-L-精氨酸的結(jié)晶物，然后將結(jié)晶物于55℃真空干燥，得到純凈的15N-L-精氨酸產(chǎn)品。
上述實施例中，所得15N-L-精氨酸產(chǎn)品的純度達(dá)到98％以上，總提取得率達(dá)到80％以上。當(dāng)采用N原子豐度為5.31％的低豐度原料制備15N-L-精氨酸時，所得產(chǎn)品中的15N豐度達(dá)到5.1％以上，當(dāng)采用N原子豐度為98.90％的高豐度原料制備15N-L-精氨酸時，所得產(chǎn)品中的15N豐度達(dá)到98％以上。
權(quán)利要求
1.一種15N-L-精氨酸的分離提純方法，其特征在于以含有精氨酸的發(fā)酵液為原料，采取以下步驟分離提純a、將含有精氨酸的發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)成酸性，離心分離出上清液，上清液用強(qiáng)酸性樹脂吸附，用氨水解吸，得到含15N-L-精氨酸的解吸液；b、將步驟a所得含15N-L-精氨酸的解吸液真空濃縮至干，用蒸餾水溶解后，加入活性炭脫色，抽濾得到含15N-L-精氨酸的澄清濾液；c、將步驟b所得含15N-L-精氨酸的澄清濾液真空濃縮，加入無水乙醇，經(jīng)冷卻結(jié)晶、過濾、真空干燥后得到純凈的15N-L-精氨酸產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的15N-L-精氨酸的分離提純方法，其特征在于步驟a中所述的用草酸調(diào)節(jié)成酸性的pH值為3-4，所述的強(qiáng)酸性樹脂為凝膠強(qiáng)酸苯己烯系樹脂，所述的解吸氨水濃度為0.05～0.2mol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的15N-L-精氨酸的分離提純方法，其特征在于步驟b中所述的脫色在70～90℃下進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1所述的15N-L-精氨酸的分離提純方法，其特征在于步驟c中所述的加入無水乙醇時的溫度控制在60～80℃，所述的冷卻結(jié)晶時的溫度控制在室溫至-18℃，所述的真空干燥時的溫度控制在50～60℃。
5.如權(quán)利要求1所述的15N-L-精氨酸的分離提純方法，其特征在于步驟a中所述的樹脂吸附控制離心上清液的空柱流速SV＝0.1～1.2％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種
文檔編號C07C227/40GK1789236SQ20041008956
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者孫建春, 李良君, 杜曉寧 申請人:上海化工研究院