專利名稱：一種偶聯(lián)生產(chǎn)生物柴油和1,3－丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種偶聯(lián)法生產(chǎn)生物柴油和1，3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
生物柴油是指由可再生的油脂原料通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)得到的長鏈脂肪酸酯，是一種可以替代普通柴油使用的環(huán)保燃油。目前，世界的石油儲(chǔ)量正在逐漸減少，而且油品燃燒后排放的廢氣引起的環(huán)境污染也是人類面臨的一大問題，因此，開發(fā)可再生環(huán)保型替代性的燃料已成為當(dāng)前最重要的課題之一。
目前，生產(chǎn)生物柴油的方法主要有化學(xué)法和生物酶法?；瘜W(xué)法采用過量的甲醇或乙醇在氫氧化鈉或氫氧化鉀催化下與油脂反應(yīng)，高溫高壓可以加快反應(yīng)速度，醇過量有利于反應(yīng)向正方向進(jìn)行，但反應(yīng)結(jié)束后需要用水洗滌、酸中和、蒸餾回收過量的醇和副產(chǎn)物甘油，得到的粗甘油中含有鹽，難以直接利用，甘油精制耗能較大，致使精制甘油價(jià)格較高，且有廢液排放。生物酶法是利用脂肪酶將甲醇或乙醇與油脂中的甘油進(jìn)行交換形成脂肪酸甲酯或乙酯(生物柴油)及副產(chǎn)物甘油，此法具有反應(yīng)條件溫和、醇用量少、無污染物排放等優(yōu)點(diǎn)，但反應(yīng)時(shí)間較長，酶價(jià)格較高，而且甲醇和乙醇對(duì)脂肪酶的活性有抑制作用。通常采用固定化酶的方法解決酶反復(fù)使用的問題，但副產(chǎn)物甘油容易附著在載體表面，影響了傳質(zhì)和酶催化效率，給大規(guī)模生產(chǎn)帶來困難。
生物柴油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物甘油是發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的原料，而1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，可作為有機(jī)溶劑應(yīng)用于油墨、印染、涂料、潤滑劑、抗凍劑等行業(yè)，還可用作藥物合成中間體。1，3-丙二醇最主要的用途是作為聚合物單體合成性能優(yōu)異的高分子材料，不但可以使聚酯塑料具有自然循環(huán)的可生物降解特性，而且是制造性能優(yōu)異的新型聚酯纖維聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PTT)的重要單體原料，可替代乙二醇、1，2-丙二醇，1，4-丁二醇等中間體生產(chǎn)聚酯及作為碳鏈延伸劑。PTT是紡織工業(yè)中一種新型聚酯化學(xué)纖維，具有許多優(yōu)良的性能，如尼龍樣的彈性恢復(fù)、抗紫外、臭氧及氮氧化物的著色性、低靜電、低水吸附、全色范圍內(nèi)無需添加任何特殊化學(xué)品而呈現(xiàn)出的良好的連續(xù)印染性等。它具有廣闊的應(yīng)用前景，是目前合成纖維新品種開發(fā)的熱點(diǎn)，因此，開發(fā)低成本的1，3-丙二醇已成為科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。以甘油為原料通過微生物轉(zhuǎn)化生成1，3-丙二醇的研究始于1881年，但直到20世紀(jì)80年代才逐漸引起人們的重視。與以石油為原料的化學(xué)合成法相比，生物法具有利用可再生資源、反應(yīng)條件溫和、操作簡便安全、副產(chǎn)物少、無環(huán)境污染等特點(diǎn)，但其原料甘油較高的價(jià)格成為微生物法生產(chǎn)1，3-丙二醇產(chǎn)業(yè)化最大的障礙，而化學(xué)法生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物甘油含鹽較多，不利于直接利用它來生產(chǎn)1，3-丙二醇。
為了解決上述問題，本發(fā)明采用生物酶法催化油脂和甲醇或乙醇反應(yīng)生成生物柴油，同時(shí)利用親水性超濾膜將副產(chǎn)物甘油分離出來，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，使酶催化與微生物轉(zhuǎn)化兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)生物柴油和1，3-丙二醇的偶聯(lián)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種偶聯(lián)生產(chǎn)生物柴油和1，3-丙二醇的技術(shù)，將脂肪酶催化短鏈醇與油脂反應(yīng)生成生物柴油和微生物轉(zhuǎn)化甘油為1，3-丙二醇兩個(gè)過程通過超濾膜偶聯(lián)起來，使兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行。在生物柴油生產(chǎn)過程中，短鏈醇采用分段或連續(xù)滴加的方式加入，這樣可以避免過量的有機(jī)溶劑導(dǎo)致酶中毒；通過超濾膜透析過濾可以及時(shí)去除生物柴油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物甘油，延長固定化酶的使用壽命；甘油直接經(jīng)微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，免除了甘油的分離純化工序，降低了生產(chǎn)1，3-丙二醇的原料成本，節(jié)省了時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是首先采用生物酶催化法將油脂轉(zhuǎn)酯生成生物柴油，同時(shí)利用親水性的中空纖維超濾膜或平板膜將副產(chǎn)物甘油分離出來，在膜的另一側(cè)用微生物直接將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的步驟如下1)微生物培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基中必須具備微生物生長所需的營養(yǎng)成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、銨鹽、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸鹽(磷源)和硫酸鹽(硫源)等。另外還需要鈉、鉀、鎂、鈣等陽離子以及鋅、鐵、錳、銅、鈷、硼和鉬等微量元素，每種微量元素的含量大約在0.01mg/L～50mg/L的范圍內(nèi)，培養(yǎng)基需在120℃下滅菌15～20分鐘方能使用。
2)種子培養(yǎng)在搖瓶中進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速為100～300r/min，溫度為27～40℃，培養(yǎng)時(shí)間為9～30h。微生物細(xì)胞是克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、檸檬菌(Citrobacter)或丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)。
3)發(fā)酵培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)器中進(jìn)行，接種量為5％～20％，攪拌轉(zhuǎn)速為100～400r/min，溫度為27～40℃。發(fā)酵過程中可以向培養(yǎng)器中通氮?dú)饣蚩諝猓饬繛?.2～4vvm。發(fā)酵方式為批式流加發(fā)酵，發(fā)酵的時(shí)間為10～70h。1，3-丙二醇發(fā)酵甘油初始濃度為2～15％，pH為6～8，產(chǎn)物1，3-丙二醇的濃度可達(dá)到10～85g/L。
4)酶催化與微生物轉(zhuǎn)化偶聯(lián)過程將經(jīng)預(yù)處理去除雜質(zhì)的原料油脂和占油脂質(zhì)量10～30％的固定化酶加入酶反應(yīng)器中，控制反應(yīng)溫度為30～60℃，攪拌的同時(shí)添加甲醇或乙醇，攪拌轉(zhuǎn)速為100～300r/min，甲醇或乙醇采用分段或連續(xù)滴加的方式加入，分段加入可以分為3～30段，連續(xù)滴加甲醇和乙醇的稀釋速率分別為0.003～0.02h-1和0.005～0.03h-1，反應(yīng)進(jìn)行1～5h后，用循環(huán)泵將反應(yīng)液(不含固定化酶)泵入親水性平板超濾膜或中空纖維膜的一側(cè)，膜的另一側(cè)為上述1，3-丙二醇的發(fā)酵液(含微生物細(xì)胞)，整個(gè)反應(yīng)過程15～50h，油脂的轉(zhuǎn)化率可達(dá)80～97％，甘油的利用率達(dá)到90～99％。
所用脂肪酶來源于米黑毛霉(Mucor miehei)、皺褶假絲酵母(Candidaantarctica)、柱晶假絲酵母(Candida Cylindracea)的固定化脂肪酶，原料油脂是廢油脂、菜籽油、大豆油、桐子油、棕櫚油、黃連木油、蓖麻油、工程微藻油，短鏈醇為甲醇和乙醇。
5)膜過濾條件所用的超濾膜為不對(duì)稱、親水性的超濾膜，切割分子量在10～50kDa之間，可以是平板膜或中空纖維膜。膜兩側(cè)分別泵入酶催化反應(yīng)液和1，3-丙二醇發(fā)酵液，當(dāng)使用中空纖維膜時(shí)，建議管程走酶催化反應(yīng)液，殼程走1，3-丙二醇發(fā)酵液，膜兩側(cè)液體流量與酶反應(yīng)器或細(xì)胞培養(yǎng)器的體積之比分別為3.6～7.2h-1和4.8～9.6h-1。膜的操作壓力為0.1MPa～0.5Mpa，兩側(cè)的壓力接近，反應(yīng)液一側(cè)的壓力略高于發(fā)酵液(0.001MPa～0.05Mpa)。膜的操作溫度取決于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度，通常為27～40℃，反應(yīng)液一側(cè)的溫度略高于發(fā)酵液，兩側(cè)的溫度差在0～5℃之間。當(dāng)兩側(cè)的溫度相差較大時(shí)，用膜前后的換熱器冷卻或加熱反應(yīng)液。
所用膜材料是有機(jī)膜或無機(jī)陶瓷膜，有機(jī)膜指聚醚砜、纖維素酯、聚酰亞胺/聚醚酰亞胺、聚脂肪酰胺和聚丙烯腈，無機(jī)陶瓷膜是指氧化鋁膜、二氧化鈦膜、二氧化硅膜、二氧化鋯膜及其復(fù)合膜。
本發(fā)明的效果和益處在于利用了超濾膜將脂肪酶催化和微生物轉(zhuǎn)化兩個(gè)過程偶聯(lián)起來，實(shí)現(xiàn)生物柴油與1，3-丙二醇的聯(lián)產(chǎn)。在酶催化過程中，采用分段或連續(xù)滴加的方式加入甲醇或乙醇，可以減少甚至消除過量的短鏈醇導(dǎo)致的脂肪酶中毒失活；通過膜超濾可以及時(shí)除去酶催化過程中形成的副產(chǎn)物甘油，延長固定化酶的使用壽命；甘油在膜的另一側(cè)經(jīng)微生物細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，節(jié)省了甘油分離的費(fèi)用，降低了生產(chǎn)成本，縮短了整個(gè)生產(chǎn)的時(shí)間，可節(jié)約能源，提高了生產(chǎn)效率。


附圖是本發(fā)明偶聯(lián)法生產(chǎn)生物柴油和1，3-丙二醇的工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下詳細(xì)結(jié)合技術(shù)方案和附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例11)菌種和酶發(fā)酵的菌種為克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，是一種兼性厭氧菌，購自中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，菌種保藏號(hào)是1.1736。固定化脂肪酶Novozym 435購自諾和諾德公司，來源于Candidaantarctica，固定在一種大孔丙烯酸樹脂上。
2)培養(yǎng)基分種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基兩種，分述如下A.種子培養(yǎng)基(1L)甘油20gK2HPO4·3H2O4.454gKH2PO41.3g (NH4)2SO42.0gMgSO4·7H2O0.2g 酵母粉1.0gCaCO32.0g微量元素TE12mL2％CaCl2溶液1mL 0.5％FeSO4溶液1mL微量元素TE1組成(1L)飽和鹽酸0.9mL ZnCl270mgMnCl2·4H2O100mgH3BO360mg
CoCl2·6H2O200mgNiCl2·6H2O25mgNaMoO4·2H2O35mgCuCl2·2H2O20mgB.發(fā)酵培養(yǎng)基組成(1L)(NH4)2SO46.61g KH2PO41.36gMgCl2·6H2O0.26gCaCl20.29g檸檬酸0.42g酵母粉1.0g甘油40g微量元素TE25mL微量元素TE2組成(1L)飽和鹽酸10mL ZnCl20.379gFeCl3·6H2O5.4g MnCl2·4H2O0.17gCoCl2·6H2O0.47gH3BO30.06gCuCl2·2H2O0.47gNaMoO4·2H2O0.005g3)發(fā)酵過程分種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)兩種，其中種子培養(yǎng)在500mL的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為100mL，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min；發(fā)酵培養(yǎng)在全自動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)器中進(jìn)行，工作體積為2L，實(shí)際裝液量為1L，甘油初始濃度為4％，接種量為10％，轉(zhuǎn)速控制為200r/min，氮?dú)獾耐饬?.4vvm，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0，溫度控制在37℃。
4)將2kg大豆油加入反應(yīng)器中，同時(shí)加入300g的固定化脂肪酶Novozym435，加熱至40℃，加入甲醇22.3g(醇油摩爾比為0.3∶1)開始反應(yīng)，反應(yīng)過程中攪拌轉(zhuǎn)速為170r/min，每1小時(shí)加甲醇一次，共加甲醇266g，用泵強(qiáng)制反應(yīng)液循環(huán)，通過平板膜，膜的另一側(cè)為1，3-丙二醇發(fā)酵液。
5)平板膜為不對(duì)稱性親水醋酸纖維素膜，切割分子量為40kDa，面積為400cm2，操作條件為溫度38℃，壓力0.12MPa，酯化反應(yīng)液和1，3-丙二醇發(fā)酵液流速與反應(yīng)器的體積比分別為5.4h-1和7.2h-1。酶催化的反應(yīng)液用膜前換熱器冷卻至38±1℃，過膜后用換熱器加熱至40±2℃。
實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果如下反應(yīng)進(jìn)行了30h，發(fā)酵液中1，3-丙二醇的濃度為52.76g/L，乙醇濃度為7.22g/L，乙酸濃度為4.85g/L，2，3-丁二醇濃度為4.28g/L，生產(chǎn)出生物柴油1753g。
實(shí)施例21)1，3-丙二醇發(fā)酵菌種、培養(yǎng)基以及發(fā)酵過程同實(shí)施例1。
2)2kg菜籽油加入反應(yīng)器中，同時(shí)加入320g固定化脂肪酶Novozym 435，加熱至45℃，加入乙醇11g(醇油摩爾比為0.1∶1)開始反應(yīng)，反應(yīng)過程中攪拌轉(zhuǎn)速為170r/min，乙醇采用滴加的方式加入，稀釋速率為0.01h-1，共加乙醇380g，用泵強(qiáng)制反應(yīng)液循環(huán)，通過中空纖維膜，膜的另一側(cè)為1，3-丙二醇發(fā)酵液。
3)中空纖維膜為醋酸纖維素超濾膜，切割分子量為10kDa，表面積為0.5m2，操作壓力為0.13Mpa，溫度為38℃，膜的管程為酯化反應(yīng)液，流速與酶催化反應(yīng)器的體積比為6.0h-1，殼程為1，3-丙二醇發(fā)酵液，流速與細(xì)胞培養(yǎng)器的體積比為8.4h-1。
4)酶催化的反應(yīng)液用膜前換熱器冷卻至38±1℃，過膜后用換熱器加熱至45±2℃。
實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下反應(yīng)進(jìn)行了34h，發(fā)酵液中1，3-丙二醇的濃度為55.48g/L，乙醇濃度為10.48g/L，乙酸濃度為6.10g/L，2，3-丁二醇濃度為5.10g/L，生產(chǎn)出生物柴油1711g。
權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)生產(chǎn)生物柴油和1，3-丙二醇的方法，是將脂肪酶催化短鏈醇與油脂反應(yīng)生成生物柴油和微生物轉(zhuǎn)化甘油為1，3-丙二醇兩個(gè)過程通過膜過濾偶聯(lián)起來，使兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行；酶法所用脂肪酶來源于米黑毛霉(Mucor miehei)、皺褶假絲酵母(Candida antarctica)、柱晶假絲酵母(Candida Cylindracea)的固定化脂肪酶，原料油脂是廢油脂、菜籽油、大豆油、桐子油、棕櫚油、黃連木油、蓖麻油、工程微藻油，短鏈醇為甲醇和乙醇，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)條件為溫度30～60℃，攪拌速度100～300r/min，甲醇或乙醇采用分段或連續(xù)流加的方式，分段流加可以分為3～30個(gè)時(shí)段，連續(xù)滴加甲醇稀釋速率為0.003～0.02h-1，乙醇稀釋速率為0.005～0.03h-1，反應(yīng)時(shí)間為10～30h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80～97％；微生物法將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，所述微生物是克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、檸檬菌(Citrobacter)和丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)，發(fā)酵過程中菌種的接種量為5％～20％，細(xì)胞培養(yǎng)器攪拌轉(zhuǎn)速為100～400r/min，溫度為27～40℃，氮?dú)饣蚩諝獾耐饬繛?.2～4vvm，甘油初始濃度為2％～15％，pH為6.0～8.0，產(chǎn)物1，3-丙二醇的濃度達(dá)到10～85g/L；該工藝所用膜為不對(duì)稱性的親水超濾膜，膜器件是平板膜或中空纖維膜，其特征在于1)將脂肪酶催化甲醇或乙醇與油脂反應(yīng)生成生物柴油和微生物轉(zhuǎn)化甘油為1，3-丙二醇兩個(gè)過程通過膜過濾偶聯(lián)起來，使兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行；2)所用膜材料是有機(jī)膜或無機(jī)陶瓷膜，有機(jī)膜指聚醚砜、纖維素酯、聚酰亞胺/聚醚酰亞胺、聚脂肪酰胺和聚丙烯腈，陶瓷膜是指氧化鋁膜、二氧化鈦膜、二氧化硅膜、二氧化鋯膜及其復(fù)合膜，切割分子量為10～50kDa；3)膜的操作壓力為0.1MPa～0.5Mpa，膜兩側(cè)分別為酶催化反應(yīng)液和1，3-丙二醇發(fā)酵液，反應(yīng)液一側(cè)的壓力比發(fā)酵液高0.001MPa～0.05Mpa，液體流量與酶反應(yīng)器和細(xì)胞培養(yǎng)器的體積之比分別為3.6～7.2h-1和4.8～9.6h-1；4)膜的操作溫度取決于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度，通常為27～40℃，反應(yīng)液一側(cè)的溫度比發(fā)酵液一側(cè)高0～5℃，當(dāng)兩側(cè)的溫度差超出上述范圍時(shí)，用膜前后串聯(lián)的兩個(gè)換熱器冷卻或加熱反應(yīng)液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種偶聯(lián)生產(chǎn)生物柴油和1，3－丙二醇的技術(shù)。本發(fā)明的特征在于將脂肪酶催化甲醇或乙醇與油脂反應(yīng)生成生物柴油和微生物轉(zhuǎn)化甘油為1，3－丙二醇兩個(gè)過程通過膜過濾偶聯(lián)起來，使兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的效果和益處是消除了短鏈醇和甘油對(duì)脂肪酶的抑制，延長了固定化酶的使用壽命，同時(shí)免除了甘油分離提取的工序，降低了生產(chǎn)成本，節(jié)省了時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，為生物柴油和1，3－丙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了經(jīng)濟(jì)可行的工藝。
文檔編號(hào)C07C31/20GK1648207SQ200410100479
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者修志龍, 牟英, 張代佳, 孫亞琴 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)