專利名稱：包含酪氨酰－絲氨酰－纈氨酸(ysv)的生物活性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及短肽及其用途。特別是，本發(fā)明涉及具有免疫調(diào)節(jié)性能和抗癌性能的短肽。
相關(guān)領(lǐng)域的描述本領(lǐng)域已知生物活性肽可用于治療疾病和用作藥物組合物。例如，US 6,191,113公開了一種對平滑肌細(xì)胞生長具有抑制活性的肽，其因此可以用于防治與平滑肌細(xì)胞生長有關(guān)的病理狀態(tài)，如動脈硬化、血管成形術(shù)后的再狹窄、移植血管后的腔狹窄、及平滑肌肉瘤等。US 6,184,208公開了另一種肽，發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)一些生理過程，如上皮生長帶的增重活性和頭發(fā)生長。此外，PCT公開WO 03/006492和美國專利申請10/237,405表明某些肽以及它們的藥物組合物具有生物活性并可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。(需要說明的是，在本公開文本中引用的參考文獻并不一定構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)，因此對它們的引用并不等于在任何司法效力上承認(rèn)這些參考文獻為現(xiàn)有技術(shù))。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供具有生物活性的短肽。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽(簡稱YSV)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該三肽具有生物活性。為了進行測試，采用肽L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸。本發(fā)明另一方面包括分離或純化的肽，所述肽包括酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸、基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨組成或由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸組成。本發(fā)明又一方面還涉及基本純化的YSV肽。
本發(fā)明再一方面包括分離或純化的基本上由YSV組成的肽，所述肽具有選自以下的活性免疫響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激作用、細(xì)胞增殖紊亂的調(diào)節(jié)作用、癌生長的調(diào)節(jié)作用、肝癌生長的調(diào)節(jié)作用、白血病細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)作用、宮頸癌生長的調(diào)節(jié)作用、肺癌生長的調(diào)節(jié)作用以及黑素瘤生長的調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明再一方面還包括含肽的藥物組合物，所述肽包含YSV肽、基本上由YSV肽組成或由YSV肽組成。本發(fā)明其他方面涉及含肽的藥物組合物，所述肽包含YSV肽的功能衍生物、基本上由YSV肽的功能衍生物組成或由YSV肽的功能衍生物組成。再有的方面包括藥物組合物，所述組合物包含L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽、基本上由L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽組成或由L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽組成。
本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物組合物的方法，包括提供酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽，并將所述三肽與一種藥物可接受載體混合。
本發(fā)明的另一方面涉及一種降低人疾病影響的方法，所述方法包括給予人藥學(xué)有效劑量的酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽。在本發(fā)明的另外方面，所述人疾病選自其效應(yīng)可通過刺激Y淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而降低的病癥和細(xì)胞增殖紊亂。在本發(fā)明的其他方面，所述細(xì)胞增殖紊亂為癌癥，包括但不限于肝癌、白血病、宮頸癌、肺癌和黑素瘤。
本發(fā)明的另一方面涉及酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽作為藥物組合物的用途。此外，所述三肽可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，也可用于治療細(xì)胞增殖紊亂。在本發(fā)明的具體方面，所述細(xì)胞增殖紊亂為癌癥。在本發(fā)明的具體方面，治療肝癌、白血病、宮頸癌、肺癌和/或黑素瘤。
本發(fā)明的另一方面涉及營養(yǎng)組合物及其在制備營養(yǎng)增補劑中的用途，所述組合物包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸。本發(fā)明的具體方面涉及含肽的營養(yǎng)增補劑，所述肽包括酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽、基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成或由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成。
本發(fā)明另外的方面提供了YSV的增強衍生物或其功能衍生物。所述酪氨酰-絲氨酰纈氨酸三肽的增強衍生物包含能夠以提高或促進所述三肽的療效的方式與三肽連接的增強分子。增強效果可為延長的效果、縮短的效果、延遲發(fā)效的效果、加速發(fā)效的效果、提高強度的效果、降低強度的效果、減少副作用的效果、產(chǎn)生一種或多種作用的效果、延遲平息的效果、加速平息的效果和將所述肽定位于個體中分散的區(qū)域的作用。這種增強分子和增強衍生物的實例如下所述。在本發(fā)明的一些方面中，所述增強分子可為調(diào)節(jié)(但不限于調(diào)節(jié))免疫活性和/或癌癥的生長，其中所述癌包括但不限于宮頸癌、肝癌和白血病。本發(fā)明的其他方面包括增強肽的療效的方法，所述肽包括YSV或其衍生物、基本上由YSV或其衍生物組成或由YSV或其衍生物組成，所述方法包括將所述肽可操作地連接到增強所述肽的療效的分子上。在本發(fā)明的一些方面，所述方法不包括天然存在的肽中與所述YSV肽或其衍生物接近的肽。本發(fā)明的其他方面包括藥物組合物，所述藥物組合物包括YSV的增強衍生物或其功能衍生物、基本上由YSV的增強衍生物或其功能衍生物組成或由YSV的增強衍生物或其功能衍生物組成。
本發(fā)明一方面涉及基本純化的上述YSV肽或其功能衍生物，所述YSV肽或其功能衍生物可操作地連接到能夠增強其療效的分子(也稱為“增強分子”)上。這些分子可按照美國臨時專利申請60/435,796(于2002年12月18日提交，發(fā)明名稱為“生物活性肽結(jié)合物”)中公開的任何方式制備和使用，該專利申請通過引用結(jié)合到本文中?？刹僮鞯剡B接到所述肽的候選分子以及實施這種連接的方式與本領(lǐng)域所用的常規(guī)方式相同。一些可操作地連接到Y(jié)SV肽及其功能衍生物的分子包括但不限于有機化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、分離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。本發(fā)明還涉及基本純化的上述YSV肽或其功能衍生物，所述YSV肽或其功能衍生物連接到能夠增強其療效的分子，其中所述可操縱地連接的分子不是天然存在的肽中與上述肽接近的肽。在本發(fā)明的另一方面，所述基本純化的YSV肽或其功能衍生物可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。所述分子可通過共價鍵或非共價作用連接到本發(fā)明的肽上。
在具體的實施方案中，當(dāng)生物活性分子與YSV或其功能衍生物可操作地連接時，可通過將部分連接分子的性能賦予所述肽而改變其藥代動力學(xué)。可操作地連接的分子可賦予肽的一些性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給機體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
本發(fā)明另一方面涉及基本純化的肽，所述肽包括YSV或其功能衍生物、基本上由YSV或其功能衍生物組成或由YSV或其功能衍生物組成，所述YSV或其功能衍生物連接于可增強其療效的分子上，其中所述可操作地連接的分子不是天然存在的肽中與YSV或其一種功能衍生物接近的肽。一些可操作地連接到Y(jié)SV肽及其功能衍生物的分子包括但不限于有機化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、分離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。本發(fā)明的其他方面包括基本純化的肽，所述肽包括YSV肽或其功能衍生物、基本上由YSV肽或其功能衍生物組成或由YSV肽或其功能衍生物組成，所述YSV肽或其功能衍生物連接于可增強其療效的分子上，所述增強分子可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。所述分子可通過共價鍵或非共價作用可操作地連接到本發(fā)明的肽上。所述基本純化的肽與增強其療效的分子的連接的作用包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
本發(fā)明另一方面涉及包括含有YSV或其一種功能衍生物的肽與另外結(jié)合肽序列的雜合肽，其中所述結(jié)合的另外的序列不是在天然存在的肽中與上述公開的肽接近的序列。在具體的實施方案中，所述雜合肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。在具體的實施方案中，這些結(jié)合的另外的肽序列，其未發(fā)現(xiàn)在天然存在的肽中與YSV或其功能衍生物接近，可通過將部分雜合分子的性能賦予所述肽而改變本發(fā)明上述實施方案中的肽的藥代動力學(xué)?？刹僮鞯剡B接的分子可賦予YSV或其功能衍生物的一些性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
本發(fā)明另一方面涉及基因載體，所述基因載體包括編碼YSV肽或其一種功能衍生物的第一核苷酸序列、基本上由所述第一核苷酸序列組成或由所述第一核苷酸序列組成，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列融合，所述第二核苷酸序列編碼增強上述肽的療效的肽，所述第二核苷酸序列編碼的肽不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物接近的肽。本發(fā)明還涉及基因載體，所述基因載體包括編碼基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽的第一核苷酸序列、基本上由該所述第一核苷酸序列組成或由該所述第一核苷酸序列組成，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列融合，所述第二核苷酸序列編碼增強上述肽的療效的肽，所述第二核苷酸序列編碼的肽不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物接近的肽。本發(fā)明還涉及基因載體，所述基因載體包括編碼由YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列組成的肽的第一核苷酸序列、基本上由所述第一核苷酸序列組成或由所述第一核苷酸序列組成，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列融合，所述第二核苷酸序列編碼增強上述肽的療效的肽，所述肽不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物接近的肽。在具體的實施方案中，所述YSV肽或其一種功能衍生物可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤?？刹僮鞯剡B接的分子可賦予所述YSV肽或其一種功能衍生物的一些性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。本發(fā)明的另一方面涉及包含選自以下列表的核苷酸序列的微生物，所述列表包括上述載體的核苷酸序列；包括編碼含所述YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列的肽的第一核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列融合，所述第二核苷酸序列編碼不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物接近的肽。
就上述核酸序列而言，由這些核酸序列表達的肽和/或雜合肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。
本發(fā)明再一方面涉及一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供連接在能增強其療效的分子上的YSV肽或其一種功能衍生物；將所述連接在所述分子上的肽與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。本發(fā)明涉及的所述方法中，所述肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。可連接在所述YSV肽或其一種功能衍生物的生物有效分子的一些實例包括但不限于有機化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、分離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。本發(fā)明還涉及一種制備含肽的藥物組合物的方法，其中所述肽包含所述YSV肽或其一種功能衍生物，所述方法包括將所述肽可操作地連接到增強所述療效的分子上，其中所述分子不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物接近的肽。所述分子可通過共價鍵或非共價作用與本發(fā)明的肽連接。在一個具體的實施方案中，所述連接的分子可賦予所述肽以增強其療效的性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。本發(fā)明還涉及一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供基本純化的肽，所述肽基本上由連接在能增強其療效的分子上的YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列組成；將所述連接在所述分子上的肽與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。本發(fā)明還涉及一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供基本純化的肽，所述肽由連接在能增強其療效的分子上的YSV肽或其一種功能衍生物組成；將所述連接在所述分子上的肽與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。
本發(fā)明還有一個方面是涉及一種治療人的方法，所述方法包括給予人藥學(xué)有效劑量的基本純化的包括YSV肽或其一種功能衍生物的肽，所述肽連接在能夠增強其療效的分子上。可連接所述YSV肽或其一種功能衍生物的生物學(xué)活性分子的一些實例包括但不限于有機化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。在一些實施方案中，所述可操作地連接的分子子可賦予所述肽以增強其療效的性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
在具體的實施方案中，上述用于治療人的肽可用于調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。
本發(fā)明其他方面包括藥物組合物，所述藥物組合物包括連接于能增強其療效的分子上的YSV肽或其功能衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體、基本上由所述YSV肽或其功能衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體組成或由所述YSV肽或其功能衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體組成。本發(fā)明還涉及所述增強的YSV肽或其衍生物，其中所述肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤?？蛇B接所述YSV肽或其一種功能衍生物學(xué)活性分子的一些實例包括但不限于有機化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。在一些實施方案中，所可操作地連接的分子可賦予所述肽以增強其療效的性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時間長短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
附圖概述如下五幅附圖分別舉例說明了將肽連接到類固醇分子的化學(xué)反應(yīng)。


圖1顯示了將肽通過共價鍵連接到雌酮分子上的一系列化學(xué)反應(yīng)。
圖2顯示了用于創(chuàng)建圖1所示相同連接鍵的第二種作為選擇的系列反應(yīng)。
圖3包含設(shè)計用于將肽通過共價鍵連接到雌二醇分子上的一系列化學(xué)反應(yīng)。
圖4包含用于創(chuàng)建圖3所示相同連接鍵第二種系列反應(yīng)。
圖5說明了將肽通過共價鍵連接到氫化可的松的方法。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述在研究可用作人的免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞增殖紊亂、抗癌和/或抗肉瘤藥物的短肽分子中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸(YSV)分子具有體外免疫調(diào)節(jié)和抗癌性能。該發(fā)現(xiàn)表明YSV分子、含該分子的較大分子，包括較大的肽和在它們的序列中含所述YSV序列的肽以及YSV的功能衍生物可用作免疫調(diào)節(jié)劑和/或抗細(xì)胞增殖紊亂藥物或食物增補劑。
應(yīng)理解可以將其他氨基酸加至所述YSV肽的氨基端或羧基端而作為實施本發(fā)明的另一種方法。在這樣的實施方案中，所述YSV肽保持本文所描述的一種或多種治療或功能性能。例如，在一些實施方式中，在所述肽中增加一個或兩個氨基酸而并未使其生物功能受到影響。在進一步的實施例中，也可以增加三或四個氨基酸而仍保持肽的功能。這些均稱為該肽的變異體。另外，肽的衍生物如將一個氨基酸用相同功能類別的另一個氨基酸保守置換，也可用于實施本發(fā)明的另一方面。例如，具有非極性端或稱疏水側(cè)鏈的肽可以被取代一個側(cè)基而其生物學(xué)功能并不減弱。作為進一步的例子，接頭/間隔可被插入肽形成變體，但這些變體仍保持本研究中所用的原始肽的活性部分。這些被視為本發(fā)明肽的變體。本文所用術(shù)語肽類似物包括具有模擬天然氨基酸結(jié)構(gòu)的氨基酸分子的肽，例如具有不同主鏈結(jié)構(gòu)或D-氨基酸取代的類似物。作為進一步的例子，盡管用于合成肽的氨基酸是L-光學(xué)異構(gòu)形式，但是序列中一或多個氨基酸被D-型取代的肽可具有類似的生物活性。本申請權(quán)利要求中所用術(shù)語“功能性衍生物”涵蓋本發(fā)明肽的片段、變體、類似物和化學(xué)衍生物。
“基本上純化的肽”是指純度至少為10％(w/w)的肽，優(yōu)選純度為20％，更優(yōu)選為40％，更優(yōu)選為60％，進一步優(yōu)選為大于90％。在最優(yōu)選的實施方案中，純度大于99％。如下文所述，基本上純化的肽可做為混合物中的部分成分進行藥物或營養(yǎng)配方的制備。
上述肽用在藥物配方中可用于治療免疫失調(diào)以及對于免疫性有繼發(fā)作用的疾病，例如細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥或感染。在這些肽的藥物配方可能是YSV或其功能衍生物與其它活性或非活性成分的混合，包括其他肽，例如兩個或若干個(例如3-5個)肽可以加到同一配方中，可伴有或不伴有其它成分?；蛘?，YSV或其功能衍生物可以與這兒未列出的肽一起用于制備配方。此類配方可以經(jīng)靜脈、肌肉、皮內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)給藥，或動脈注射直接作用于器官，還可以以粉末、噴霧的方式經(jīng)呼吸道吸入，經(jīng)皮吸收或本領(lǐng)域已知的其它輸送方式。配方還可以口服，并可含有可用于在口服后防肽的胃消化的載體，或本領(lǐng)域已知的任何其它載體(對于經(jīng)皮，如脂質(zhì)體)。
本文所用術(shù)語“雜合肽”是指含有插入具有上述序列的原始生物活性肽或其功能衍生物中的額外肽但仍保持基本類似的活性的肽。額外肽包括前導(dǎo)肽，其含有例如由一或多個原核或真核細(xì)胞識別作為將該雜合肽分泌至胞外的信號的氨基酸序列。分泌可以是直接分泌，或通過分泌小泡間接分泌。
在本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“包含”或“包括”等是指“包含/包括，但不限于”。例如，包括A、B和C的方法、裝置、分子或其他術(shù)語可描述為包含A和B。同樣，包含A和B的方法、裝置、分子或其他屬于可包括任何數(shù)量的其他步驟、組分、原子或其他術(shù)語。
這里所用的術(shù)語“基本上由......組成”是指這樣的一種肽或多肽，其包括YSV肽或在其羧基和/或氨基末端具有額外氨基酸的一種功能衍生物的氨基酸序列，并且所述功能衍生物保持本文所提供的所述肽的活性。因此，作為非限定性實例，在該實例中YSV肽或其一種功能衍生物的活性可調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)，基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽或多肽將具有本文提供的與該肽有關(guān)的調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)的活性，并且不具有在其內(nèi)部和其自身的(即在連接到生物活性分子而進行修飾前)實質(zhì)上降低肽或多肽調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)的能力或構(gòu)成對該肽作為免疫活性調(diào)節(jié)劑這一基本新特征的實質(zhì)改變的任何特征。因此，在前述實例中，其主要活性不是調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)，并且在其中的某處含有所述YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列的全長天然存在的多肽不是“基本由”YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽或多肽。同樣，在前述實例中，其主要活性不是調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)，但在其中的某處含有所述YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列的基因工程化肽或多肽不是“基本由”YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽或多肽。
通過使用本文提供的針對所述YSV肽的測定調(diào)節(jié)免疫活性和/或調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥，包括但不限于宮頸癌、肝癌和白血病)的分析來測定肽或多肽的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定肽或多肽是否符合前述定義的基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成。同樣，通過使用本文提供的針對所述YSV肽的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖紊亂(包括但不限于癌癥，所述癌癥包括但不限于黑素瘤、肺癌和影響肺組織的癌癥)的分析來測定肽或多肽的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定肽或多肽是否符合前述定義的基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成。
在優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語“基本上由.....組成”是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于20個氨基酸殘基的肽和多肽。在更優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于15個氨基酸殘基的肽。在進一步優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于10個氨基酸殘基的肽。在另一優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于6個氨基酸殘基的肽或多肽。在另一優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于4個氨基酸殘基的肽或多肽。在最優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于2個氨基酸殘基的肽或多肽。
藥物制劑可包括任何已知的藥物載體。合適的載體的實例包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)上可接受的載體。這些載體包括但不限于生理鹽水、水、乳液(包括油水混合物或甘油三酸酯乳液)及其他類型的試劑、填料、包衣片劑和膠囊?？筛鶕?jù)藥物組合物的給藥方式選擇合適的載體。
所述YSV肽及其功能衍生物可經(jīng)靜脈注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、皮下植入給藥。所述肽還可以任一口服給藥形式如片劑、膠囊、懸液、溶液等，以未經(jīng)修飾的常用形式或緩釋形式或腸胃道保護或不保護形式給藥。所述肽可進一步以任何局部應(yīng)用的形式如軟膏、霜、凝膠等經(jīng)過或不經(jīng)過皮促進裝置給藥(transdermal facilitatingdevice)。所述也可以自身或者組合其它肽序列來翻譯為其遺傳序列并克隆進表達系統(tǒng)，以產(chǎn)生肽分子而利用本文所述肽的活性。
每種肽的劑量可以是1ng-10g/kg體重。注射用給藥劑量可以是10ng-10mg/kg，更優(yōu)選1μg-1mg/kg。藥物的起效劑量可以低至1ng/kg體重，這可通過一個或多個肽與受體結(jié)合誘導(dǎo)一系列正常機體反應(yīng)而起效?；蛘咭粋€或多個肽直接誘導(dǎo)引起全系列反應(yīng)。對于口服，給藥劑量可以是1ng-10g/kg體重/天，優(yōu)選0.1μg-1g/kg體重/天，更優(yōu)選是1μg-10mg/kg體重/天。
I.有關(guān)YSV肽作用的實施方案1.1用于2.1-2.4的材料BALB/c小鼠，體重18-22g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。
YSV由CS Bio，USA定制。
胎牛血清(FBS)和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基由美國Gibco公司提供。
四甲基偶氮唑鹽(MTT)和刀豆蛋白A(ConA)由美國Sigma公司提供。
人肝癌細(xì)胞BEL7402由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院癌癥研究所提供。
人白血病細(xì)胞K562由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液疾病研究所提供。
人宮頸癌海拉(Hela)細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)研究所提供。
2.1YSV對體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用2.1.1方法(如參考文獻1所述，該文獻通過引用結(jié)合到本文中)將健康的小鼠頸椎脫臼致死。分離脾并無菌分散。將脾淋巴細(xì)胞懸浮液用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌并調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為5×106/ml。用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋YSV至各種濃度2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml。刀豆蛋白A工作液用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1mg/ml。
將所述反應(yīng)劑如下加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中100μl/孔的淋巴細(xì)胞懸浮液，20μl/孔的ConA和100μl/孔的各種濃度的YSV溶液，每種濃度設(shè)置6個平行孔；向12個平行孔中加入100μl/孔的淋巴細(xì)胞懸浮液和120μl/孔的RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％FBS)作為負(fù)對照；向12個平行孔中加入100μl/孔的淋巴細(xì)胞懸浮液，100μl/孔的RPMI-1640培養(yǎng)基(10％FBS)和20μl/孔的ConA作為正對照。
將所述細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)68小時，隨后在150g下離心10min。棄上清液后，向細(xì)胞沉淀中加入50μl/孔的1mg/ml MTT的RPMI-1640溶液，振蕩2min后再制成懸浮液。繼續(xù)培養(yǎng)4小時。在150g下離心10分鐘，棄上清液。用濾紙吸干后，將細(xì)胞與120μl 40mM的鹽酸-2-丙醇混合，并振蕩3min。在ELISA-reader上測定每孔的吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。
2.1.2結(jié)果表1YSV對T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用
*與負(fù)對照組比較，P＜0.0012.1.3結(jié)論在濃度為0.016μg/ml至2μg/ml時，YSV能夠刺激體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。
2.2YSV對體外培養(yǎng)的人肝癌BEL7402細(xì)胞增殖的作用2.2.1方法(如參考文獻2描述，該文獻通過引用結(jié)合到本文中)將對數(shù)生長期的人肝癌BEL7402細(xì)胞與含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)一起培養(yǎng)2至3min，以將其分離。采用倒置相差顯微鏡檢驗細(xì)胞。在觀察到細(xì)胞質(zhì)致密化及細(xì)胞區(qū)室膨脹后，除去上清液。加入幾毫升含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基以終止消化。用移液管溫和地吹氣收獲細(xì)胞。將懸浮的細(xì)胞在150g下離心10min收集，用冷D-Hank氏溶液再懸浮和離心來進行洗滌兩次。將經(jīng)洗滌的細(xì)胞再懸浮于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至密度為5×104/ml。將經(jīng)過處理的BEL7402細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時，以進行預(yù)活化和附著。
該試驗包括三組具有不同YSV濃度的測試組和負(fù)對照組。YSV在培養(yǎng)基中的最終濃度為20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。在負(fù)對照組中，YSV溶液采用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基替代。每組包含5個平行孔。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時。
隨后通過在150g下離心10min以沉淀細(xì)胞。除去上清液后，將100μl/孔的0.5mg/mlMTT的RPMI-1640溶液加入所述細(xì)胞沉淀中，并通過振蕩2min將細(xì)胞重懸浮。繼續(xù)培養(yǎng)4小時。在150g下離心10min后除去上清液。用濾紙吸干后，將100μl/孔40mM的鹽酸-2-丙醇加入細(xì)胞沉淀中并振蕩3min。在ELISA-reader上測定每孔的吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。
2.2.2結(jié)果表2YSV對人肝癌BEL7402細(xì)胞生長的體外抑制作用
*與負(fù)對照組比較，P＜0.052.2.3結(jié)論在濃度為5μg/ml至20μg/ml時，YSV能夠抑制體外人肝癌細(xì)胞BEL7402的生長，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.3YSV對體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞的增殖的作用2.3.1方法(如參考文獻2所述，通過引用結(jié)合到本文中)用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的人白血病K562細(xì)胞調(diào)節(jié)至密度為5×104/ml。將所述細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時。該試驗包括五組在培養(yǎng)基中具有不同YSV濃度的測試組和僅含培養(yǎng)基的負(fù)對照組。YSV的最終濃度為40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。每組包含5個平行孔。將100μl/孔測試溶液加入經(jīng)處理的細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時。
隨后通過在150g下離心10min沉淀細(xì)胞。除去上清液后，將100μl/孔的0.5mg/mlMTT的RPMI-1640溶液加入所述細(xì)胞沉淀中，并通過振蕩2min將細(xì)胞重懸浮。繼續(xù)培養(yǎng)4小時。在150g下離心10min后除去上清液。用濾紙吸干后，將100μl/孔40mM的鹽酸-2-丙醇加入細(xì)胞沉淀中并振蕩3min。在ELISA-reader上測定每孔的吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。
2.2.2結(jié)果表3YSV對人白血病K562細(xì)胞的體外抑制作用
*與負(fù)對照組比較，P＜0.052.3.3結(jié)論在濃度為5μg/ml至40μg/ml時，YSV能夠抑制體外人白血病K562細(xì)胞的生長，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.4對人宮頸癌海拉細(xì)胞生長的體外抑制作用2.4.1方法(如參考文獻2所述，通過引用將其結(jié)合到本文中)將處于對數(shù)生長期的人宮頸癌海拉細(xì)胞與含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS一起培養(yǎng)2至3min，以將其分離。采用倒置相差顯微鏡檢驗細(xì)胞。在觀察到細(xì)胞質(zhì)致密化及細(xì)胞區(qū)室膨脹后，除去上清液。加入幾毫升含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基以終止消化。用移液管溫和地吹氣收獲細(xì)胞。將懸浮的細(xì)胞在150g下離心10min收集，用冷D-Hank氏溶液再懸浮和離心來進行洗滌兩次。將經(jīng)洗滌的細(xì)胞再懸浮于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至密度為5×104/ml。將經(jīng)過處理的細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時，以進行預(yù)活化和附著。
該試驗包括兩組在培養(yǎng)基中具有不同YSV濃度的測試組和僅含培養(yǎng)基的負(fù)對照組。YSV在培養(yǎng)基中的最終濃度為10μg/ml和5μg/ml。每組包含5個平行孔。在經(jīng)處理的細(xì)胞中加入100μl/孔的測試溶液。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時。
隨后通過在150g下離心10min以沉淀細(xì)胞。除去上清液后，將100μl/孔的0.5mg/mlMTT的RPMI-1640溶液加入所述細(xì)胞沉淀中，并通過振蕩2min將細(xì)胞重懸浮。繼續(xù)培養(yǎng)4小時。在150g下離心10min后除去上清液。用濾紙吸干后，將100μl/孔40mM的鹽酸-2-丙醇加入細(xì)胞沉淀中并振蕩3min。在ELISA-reader上測定每孔的吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。
2.4.2結(jié)果表4YSV對人宮頸癌海拉細(xì)胞生長的體外抑制作用
*與負(fù)對照組比較，P＜0.052.4.3結(jié)論在濃度為5μg/ml至10μg/ml時，YSV能夠抑制體外人宮頸癌海拉細(xì)胞的生長，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.5YSV對移植于裸鼠上的人白血病K562生長的作用2.5.1材料YSL深圳康哲藥業(yè)有限公司定制生理鹽水中國OTSUKA藥業(yè)公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基美國GIBCO公司胎牛血清(FBS)美國HYCLONE公司人白血病K562細(xì)胞組由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院血液疾病研究所提供健康裸鼠(BALB/C(nu/nu)，SPF，雄性，年齡4-5周，體重18-22g)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海腫瘤研究所提供2.5.2方法2.5.2.1細(xì)胞培養(yǎng)液將K-562細(xì)胞保存在含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2。
2.5.2.2白血病小鼠模型的制備[3]用RPMI-1640將處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞調(diào)節(jié)至密度為1.6×108/ml。取0.1ml經(jīng)皮下注射到健康裸鼠的右脅腹，以制備白血病模型。
2.5.2.3動物分組和給藥攜帶人白血病K562細(xì)胞的小鼠隨機分成生理鹽水對照組(0.2ml/天)和YSV組(160μg/kg/天)。將受測物質(zhì)溶于0.2ml鹽水中并在接種K562的第二天開始通過腹膜內(nèi)注射給予受測化合物，在連續(xù)的30天內(nèi)每天給藥一次。
2.5.2.4監(jiān)測參數(shù)每天檢測裸鼠的全身狀況，每隔3-4天檢測一次腫瘤尺寸。腫瘤體積(mm3)V＝(1/6)πXYZ，其中X、Y和Z為腫瘤在三個平面上的直徑。
在最后一次給予受測物質(zhì)的第二天，切除下腫瘤，記錄腫瘤的重量并測量腫瘤的體積。腫瘤生長抑制指數(shù)(％)＝(對照組的平均腫瘤重量-治療組的平均腫瘤重量)/對照組的平均腫瘤重量×100。
2.5.2.5統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均顯示為算數(shù)平均值±SD。使用SPSS軟件的ANOVA測試分析數(shù)據(jù)。P＜0.05，為具統(tǒng)計學(xué)意義，可被接受。
2.5.3結(jié)果表1YSV對移植于裸鼠上的人白血病K562生長的作用
*與生理鹽水比較，P＜0.052.5.4.結(jié)論合適劑量的YSV能夠抑制移植于裸鼠上的人白血病K562的生長，與生理鹽水對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.6YSV對移植于C57BL/6小鼠上的黑素瘤B16生長的抑制作用2.6.1材料2.6.1.1肽YSL深圳康哲藥業(yè)有限公司定制2.6.1.2對照物質(zhì)和其他試劑環(huán)磷酰胺(Cy)上海華聯(lián)藥業(yè)有限公司生理鹽水中國OTSUKA藥業(yè)公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基美國GIBCO公司胎牛血清(FBS)美國HYCLONE公司Hank氏溶液Dingtian有限公司2.6.1.3細(xì)胞系小鼠B16黑素瘤細(xì)胞系中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所提供2.6.1.4動物健康C57BL/6小鼠(SPF，雄性，年齡4-5周，14-18g)來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院(Academy of Military Medical Sciences)2.6.2方法2.6.2.1細(xì)胞培養(yǎng)液將B16細(xì)胞保存在含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2。
2.6.2.2黑素瘤小鼠模型的制備[4]用Hank氏溶液將處于對數(shù)生長期的小鼠B16黑素瘤培養(yǎng)物調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為2.5×106/ml，取0.2ml經(jīng)皮下注射到健康C57BL/6小鼠的右腋窩，以制備黑素瘤小鼠模型。
2.6.2.3動物分組和受測物質(zhì)的給藥將攜帶黑素瘤B16的小鼠隨機分成生理鹽水組(0.2ml/天)、環(huán)磷酰胺組(Cy)(20mg/kg/天)和YSV組(640μg/kg/天和320μg/kg/天)。將受測物質(zhì)溶于0.2ml鹽水中并在接種腫瘤的第二天開始通過腹膜內(nèi)注射給予受測化合物，在連續(xù)的20天內(nèi)每天給予黑素瘤小鼠模型一次。
2.6.2.4監(jiān)測參數(shù)自腫瘤植入第二天起，每天觀察小鼠的全身狀況和腫瘤的生長情況。
在最后一次給予受測物質(zhì)的第二天，切除下腫瘤，測量腫瘤的重量。
腫瘤抑制率(％)＝(1-測試組的平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量)×100％。
2.6.2.5統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均顯示為算數(shù)平均值±SD。使用SPSS軟件的ANOVA測試分析數(shù)據(jù)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.6.3結(jié)果表1YSV對C57BL/6小鼠上的黑素瘤B16生長的抑制作用
*與生理鹽水比較，P＜0.052.6.4.結(jié)論在合適劑量下，YSV能夠抑制C57BL/6小鼠上的黑素瘤B16的生長，與生理鹽水對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.7YSV對裸鼠上的A549人肺癌異種移植物的抑制作用2.7.1材料2.7.1.1肽YSV美國CS Bio公司定制合成2.7.1.2對照物質(zhì)和其他試劑環(huán)磷酰胺(Cy)上海華聯(lián)藥業(yè)有限公司生理鹽水中國OTSUKA藥業(yè)公司胎牛血清(FBS)美國HYCLONE公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基美國GIBCO公司2.7.1.3動物健康BALB/C(nu/nu)無胸腺裸鼠(SPF，年齡4-5周，體重18-22g)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海腫瘤研究所。第一個實施方案使用雌性小鼠。第二個實施方案使用雄性小鼠。攜帶A549人肺癌異種移植物的裸鼠來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海腫瘤研究所。
2.7.2方法2.7.2.1肺癌裸鼠模型的制備[5]選擇直徑長度大于1cm并在裸鼠上良好生長的A549人肺癌異種移植物。無菌切除腫瘤塊，切成2-4mm3的片并浸入RPMI1640中。經(jīng)胸腹切口，將腫瘤塊經(jīng)皮下移植到健康裸鼠的背部接近頸部以制備肺癌裸鼠模型。
2.7.2.2分組和給藥方法將攜帶A549異種移植物的裸鼠隨機分成生理鹽水對照組(0.2ml/天)、不同劑量的YSV組和Cy對照組(0.2mg/kg/天)。將受測物質(zhì)溶于0.2ml鹽水中并在接種腫瘤的第二天開始通過腹膜內(nèi)注射給予受測化合物，在連續(xù)的40天內(nèi)每天給予黑素瘤小鼠模型一次。
2.7.2.3監(jiān)測參數(shù)每天觀察小鼠的全身狀況。每3-4天測量小鼠的重量并測定腫瘤的體積V＝(1/6)πXYZ，其中X、Y和Z為腫瘤在三個平面上的直徑。
在最后一次注射的第二天，切除下腫瘤，測量腫瘤的重量和體積。檢驗?zāi)[瘤壞死的情況。
腫瘤抑制指數(shù)(％)＝(生理鹽水組的平均腫瘤重量-治療組的平均腫瘤重量)/生理鹽水組的平均腫瘤重量×100％。
選擇部分具有良好生長條件和堅實密度并且沒有潰瘍或壞死的腫瘤，修整并用10％甲醛固定以進行病理學(xué)試驗。
2.7.2.4統(tǒng)計分析執(zhí)行SPSS軟件，利用一元方差分析(one-way ANOVA analysis)進行統(tǒng)計分析。
2.7.3結(jié)果表1YSV對移植于雌性裸鼠上的A549人肺癌的生長的抑制作用一實驗1
*與生理鹽水比較，P＜0.05表2YSV對移植于雄性裸鼠上的人肺癌的生長的抑制作用一實驗2
*與生理鹽水比較，P＜0.052.7.4.結(jié)論合適劑量的YSV能夠抑制移植于裸鼠上的A549人肺癌異種移植物的生長，與生理鹽水對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
3.總結(jié)論YSV顯示出能夠促進T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，表明其可用作人用的免疫調(diào)節(jié)劑。
YSV顯示出能夠抑制體外人肝癌細(xì)胞BEL7402、人白血病細(xì)胞K562、人宮頸癌海拉細(xì)胞的生長，以及體內(nèi)人白血病細(xì)胞K562、鼠科B16黑素瘤細(xì)胞和A549人肺癌細(xì)胞的生長，表明YSV可用于治療人細(xì)胞增殖性紊亂。
4.參考文獻1.徐叔云、卞如濂和陳修，藥理實驗方法學(xué)(第3版)，人民衛(wèi)生出版社，2002，第1427頁；2.徐叔云、卞如濂和陳修，藥理實驗方法學(xué)(第3版)，人民衛(wèi)生出版社，2002，第1785-1786頁；3.Potter G K，Shen R N，Chiao J W et al.Nude mice as models for human leukemiastudies.Am J Pathol，1984，114360；4.Zhunjiang Xie，Wenqing Liu，Yechun He et al.The inhibition of ginseng glycan andIL-2 on mice melanoma cells in vivo.ACTA ANATOMICA SINICA，2002，33(5)538-540；5.Hanyue，抗癌藥物的研究和實驗技術(shù)(第一版)，北京醫(yī)科大學(xué)和中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社(1997)299。
II.基因治療及治療方法基于上述肽序列的基因療法是通過設(shè)計編碼這些肽之一的核酸序列而進行。核酸可化學(xué)合成并與啟動子有效連接而克隆到表達載體內(nèi)。表達載體隨后以基因治療的形式給予人體，以在人體細(xì)胞內(nèi)表達。本文所采用的“基因載體”一詞包括這些表達載體?？梢杂糜诨蛑委煹妮d體包括腺相關(guān)病毒(Mizuno，M等(1998)，Jpn J Cancer Res 89，76-80)、LNSX載體(Miller，A.D.等(1993)Methods Enzymol 217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)Hum Gene Ther 8，2261-2268)。
用于肽輸送的其它載體包括可在宿主生物體中復(fù)制的生物中的編碼所需肽的表達載體，該宿主生物體希望被給予該肽而不明顯影響該宿主生物體的健康。例如，表達載體可以被轉(zhuǎn)移至對希望被給予該肽的宿主生物體是非致病性的生物體中。在某些實施方案中，表達載體在一種對希望被給予該肽的宿主生物體的健康沒有明顯有害作用的細(xì)菌或真菌生物中以產(chǎn)生所需的肽。例如，編碼所需的肽的表達載體可以是在如乳酸菌、大腸桿菌或酵母的生物體中產(chǎn)生所需的肽的表達載體。在一個實施方案中，表達載體在一種哺乳動物消化道中天然存在的微生物或哺乳動物消化道耐受的微生物中產(chǎn)生所需的肽?？梢员磉_所需的肽的一些微生物物種包括但不限于乳桿菌菌種，如嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，食淀粉乳桿菌(L.amylovorus)，干酪乳桿菌(L.casei)，卷曲乳桿菌(L.crispatus)，雞乳桿菌(L.gallinarum)，加氏乳桿菌(L.gasseri)，約氏乳桿菌(L.johnsonii)，類干酪乳桿菌(L.paracasei)，植物乳桿菌(L.plantarum)，路氏乳桿菌(L.reuteri)，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)等；雙歧桿菌菌種，如青春雙歧桿菌(B.adolescentis)，動物雙歧桿菌(B.animalus)，雙歧雙歧桿菌(B.bifidum)，短雙歧桿菌(B.breve)，嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)，乳酸雙歧桿菌(B.lactis)，長雙歧桿菌(B.longum)等；糞腸球菌(Enterococcus faecalis)或屎腸球菌(Ent.fdacium)；菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)；大腸桿菌(Escherichia coli)；費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)；或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或酵母益生菌(Saccharomyces boulardii)。
化學(xué)合成的或以其它方式包括但不限于將mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子而產(chǎn)生的編碼本發(fā)明肽的核酸序列被摻入表達載體中，以通過本領(lǐng)域已知的基因工程方法基因轉(zhuǎn)移進所希望的宿主中。表達載體可以是DNA載體或RNA載體。例如，表達載體可以基于質(zhì)?；虿《具z傳元件。表達載體可以是染色體外復(fù)制的載體或者整合進染色體的載體。
表達載體包括與編碼本發(fā)明肽的核酸可操作地連接的啟動子。啟動子可以是可調(diào)控的啟動子，如誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。在一些實施方案中，可以選擇啟動子以提供所需水平的肽表達。另外，如果需要，表達載體可以包括其它序列以促進肽的產(chǎn)生、呈遞和/或分泌。在一些實施方案中，編碼本發(fā)明肽的核酸與指導(dǎo)肽分泌的核酸序列可操作地連接。例如，編碼本發(fā)明肽的核酸可以與編碼信號肽的核酸序列有可操作地連接。
在一些實施方案中，被工程化以編碼本發(fā)明肽的表達載體可以是適于在組成哺乳動物正常消化道菌群的細(xì)菌菌種如乳桿菌菌種和枯草芽孢桿菌中表達本發(fā)明肽的表達載體。這種表達載體的例子可參見Casas的美國專利6,100,388和Bellini的美國專利5,728,571。這些文獻以其全文引入本文作參考。應(yīng)理解的是促進本發(fā)明肽在不損害希望給予該肽的宿主生物體的健康的生物體中的表達的任何表達載體均可使用。
在一些實施方案中，被工程化以編碼本發(fā)明肽的表達載體可以是適于在被哺乳動物消化道耐受的酵母菌種如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或更優(yōu)選地酵母益生菌(Saccaromyces boulardii)(其可在人消化道中寄居并用于治療某些形式的腹瀉)中表達本發(fā)明肽的表達載體。組成性表達異源蛋白和肽的酵母表達載體可以使用，因為其非常穩(wěn)定，因此在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中可以傳遞至子代，所述載體可包括指導(dǎo)重組蛋白高水平分泌的信號肽編碼序列。這種酵母載體的例子參見Jang等的美國專利6,391,585，該文獻引入本文作參考。
編碼本發(fā)明肽的表達載體可以經(jīng)本領(lǐng)域已知技術(shù)導(dǎo)入欲表達該肽的生物體中。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母或其它微生物的傳統(tǒng)方法，例如經(jīng)使用化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞、電穿孔或乙酸鋰轉(zhuǎn)化(用于酵母)，以及用這些程序無效的一些細(xì)菌菌種的轉(zhuǎn)化方法的最近進展。在一些實施方案中，表達載體用Leer等(WO95/35389)公開的方法導(dǎo)入已知不能轉(zhuǎn)化的乳酸菌中(該文獻引入本文作參考)。導(dǎo)入的序列可以摻入微生物染色體DNA中或保持染色體外DNA元件的形式。
含有表達載體的這一基因工程微生物隨后可以接種消化道、陰道、氣管等以實現(xiàn)持久的免疫治療。在一些實施方案中，表達本發(fā)明肽的生物體以無活性形式攝入，或者優(yōu)選地，以活性形式攝入。在消化道中，這些微生物產(chǎn)生所述肽，通過分泌或微生物的裂解將其釋放進腔內(nèi)，或以其它方式將肽呈遞給宿主，由此肽產(chǎn)生其對宿主生物體的預(yù)期作用。在其它實施方案中，在鼻通道、陰道或小腸粘膜處將肽呈遞給宿主生物體。
另一種治療方法是使用脂質(zhì)體作為輸送特異核酸至人體細(xì)胞的方式。核酸(如含有編碼SEQ ID NO1-30的肽的核酸的表達載體)在有利于細(xì)胞吸收和染色體摻入的環(huán)境中被輸送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)，Gene Ther 2，710-722和美國專利6,207,456所述?；蛘撸褂肬S6,245,427的方法，肽本身可包在脂質(zhì)體中并直接輸送。上述所有科學(xué)出版物和專利均引入本文作參考。
可用于上述基因治療和治療方法的核酸序列包括編碼這些肽及其功能衍生物的序列?；诤啿⒚艽a子系統(tǒng)，許多核酸序列中的任何一種均可用于編碼這些肽及其衍生物。
下述參考文獻引入本文作參考1.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局。1993，7134 1352.徐叔云，卞如濂，陳修主編。藥理實驗方法學(xué)。1991，1221-12343.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局。1993，71404.何金生，李瑞珠，宗庭益。MTT還原法檢測NK細(xì)胞活性的方法學(xué)研究。中國免疫學(xué)雜志，1996；1(6)356-3585.汪謙.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗方法。人民衛(wèi)生出版社。1998，482-4836.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局。1993，71417.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局。1993，7132-1338.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局。1993，7128-1299.章元沛，蘇懷德.藥理學(xué)實驗(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，137-13810.李家泰.臨床藥理學(xué)(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，1338-1339III.肽與YSV及其衍生物的結(jié)合及配方本發(fā)明的生物活性肽可與其它具生物學(xué)效應(yīng)或作用的分子相結(jié)合，來提供額外的效果或作用，或者增強它們的治療效力。許多可能的結(jié)合分子，它們的生物學(xué)作用以及與肽相結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。對于其它候選的結(jié)合物而言，結(jié)合到肽的化學(xué)反應(yīng)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員無需經(jīng)過過度實驗而推導(dǎo)出。效應(yīng)分子(effective molecule)會在下文描述。具體的例子中描述了本發(fā)明的各種肽如何與它們的效應(yīng)分子相結(jié)合，以及作為結(jié)果的結(jié)合產(chǎn)物的特性?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明的其它肽也可在類似的反應(yīng)中被結(jié)合。
YSV及其衍生物在特定的細(xì)胞或組織類型中具有獨特的醫(yī)療效力。將分子結(jié)合到肽藥物的一個重要目的是為了將肽定位于被治療個體體內(nèi)的特定位置或區(qū)室。在這種方式中，肽藥物及其效應(yīng)分子可被集中在細(xì)胞或組織類型的特定區(qū)域，在所述的特定區(qū)域中，藥物具有預(yù)期的治療效果。這樣能增加相同摩爾數(shù)量的、游離的、非結(jié)合的肽可能具有的效果。相反地，被定位在其治療活性位點的結(jié)合肽藥物的劑量可以顯著的低于為取得相同治療效果所需要的、游離的、非結(jié)合形式藥物的劑量。
將肽藥物定位在最容易發(fā)揮其活性的位點的另一個有益效果在于，減少了不必要的副作用。給予的肽藥物是為了在特定細(xì)胞或組織類型中實現(xiàn)一種變化，但是所給予的肽藥物在個體體內(nèi)也會在其它部位發(fā)揮作用，有時帶來有害的結(jié)果。通過與一個定位分子結(jié)合而將肽定位在所需要的活性位點，可以減少在該個體中其它部位的所述肽的濃度以及帶來的副作用。
包含YSV或其功能衍生物之一的肽、基本由YSV或其功能衍生物之一組成的肽或者由YSV或其功能衍生物之一組成的肽，為了定位到個體體內(nèi)全身的不同部位，可與不同的分子相結(jié)合。下文所描述的將肽定位到所需位置的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他結(jié)合技術(shù)，可被應(yīng)用于本發(fā)明的任意的肽。例如，文獻公開了抗乙型肝炎的藥物的選擇性傳遞到肝細(xì)胞(Fiumeetal.，Ital J Gastroenterol Hepatol，29(3)275，1997，which is incorporated herein by reference in its entirety)。在該項研究中，研究者將單磷酸阿糖腺苷(ara-AMP)，一種抗乙型肝炎病毒活性的磷酸化核苷類似物，結(jié)合到乳糖胺化的人白蛋白，一種末端為半乳糖基的高分子。肝細(xì)胞表達一種能與末端的半乳糖殘基起高親和力反應(yīng)的受體蛋白。通過結(jié)合在該受體上，結(jié)合藥物能夠被肝細(xì)胞選擇性的吸收。吸收以后，結(jié)合藥物被運輸?shù)饺苊阁w，在那兒，結(jié)合藥物兩種成分之間的連接被斷開，以其活性形式釋放ara-AMP。在上述所引用的研究中，結(jié)合藥物在治療慢性乙肝感染的病人時，與游離的ara-AMP具有同樣的效果，但不會導(dǎo)致臨床副作用，例如施用游離的ara-AMP所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。這樣的途徑可用于本發(fā)明的任意的肽。
在與上述相關(guān)的一個研究中，同一個研究團隊(Di Stefanoet a1.，Biochem.Pharmacol.，61(4)459，2001)將一種抗癌的化學(xué)療法試劑，5-氟-2脫氧尿苷(FUdR)，結(jié)合到乳糖胺化的聚L-賴氨酸(lactosaminated poly-L-lysine)上，以達到將化合物定位在肝以及治療肝癌的微小轉(zhuǎn)移。藥物被肝細(xì)胞選擇性吸收，并打斷FUdR與定位分子之間的連接。然后，部分游離的FUdR脫離肝細(xì)胞，產(chǎn)生抗癌試劑的局部治療濃度。這種濃度對于滲透到肝臟中的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的藥理學(xué)活性是足夠的。由于這種結(jié)合藥物是選擇性集中在肝臟中，因此其劑量與游離的、非結(jié)合化合物的最小藥理學(xué)活性劑量相比，顯著降低。這種策略可應(yīng)用到本發(fā)明的任意的肽。例如，乳糖胺化的聚L-賴氨酸與YSV的結(jié)合可以顯著的減少在個體中為治療乙型肝炎感染和肝癌的必需的劑量。
將化合物定位在體內(nèi)特定組織或細(xì)胞類型已成功應(yīng)用于大量的不同組織或細(xì)胞類型中。例如，腫瘤細(xì)胞常常在其表面表達非正常高水平的肽激素受體，比如鈴蟾肽(bombesin)、促黃體生成素釋放激素及生長激素抑制素。在一項研究中，抗癌化合物太平洋紫杉醇(紫杉醇)通過與奧曲肽(一種生長激素抑制素類似物)相結(jié)合，被選擇性定位到分泌激素的腫瘤細(xì)胞，這種腫瘤細(xì)胞高密度地表達生長激素抑制素受體。結(jié)合奧曲肽的紫杉醇與游離的紫杉醇具有相同的效果，但能減少對正常細(xì)胞的毒性(Huang etal.，Chem.Biol.，7(7)453，2000)。本發(fā)明的幾種肽，例如CMS024和CMS034，在動物研究中顯示出有效的抗癌活性。利用Huang等人的技術(shù)，將這些肽與奧曲肽相結(jié)合，可以形成一種潛在的抗癌治療方法，特別是針對高水平表達生長激素抑制素的腫瘤細(xì)胞。這種途徑可適用于過量表達任何數(shù)量肽激素受體的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞。在另一個將藥物定位到特定組織類型的例子中，聚L-天門冬氨酸被用來作為一種載體分子，特異性地將藥物定位運送到結(jié)腸細(xì)胞(Leopold et al.，J.Pharmacokinet.Biopharm.，23(4)397，1995)。
除了肽藥物到特定細(xì)胞或組織類型的特異性定位以外，肽與載體分子的結(jié)合可以提供增強肽藥物的運輸?shù)钠渌绞剑瑥亩黾踊驈牧硪环矫娓纳扑鼈兊闹委熜Ч?，所述肽包含YSV或其功能衍生物、基本由YSV或其功能衍生物組成或者由YSV或其功能衍生物組成。下文描述的任一結(jié)合技術(shù)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的其它技術(shù)，可被用于本發(fā)明的任意的肽。如果化合物不能被高效地運送到其目標(biāo)位置，任何藥物的效力都將會受到限制。藥物必須在不存在由于新陳代謝過程或降解造成實質(zhì)上的活性降低的情況下才能被積極地轉(zhuǎn)運到其活性位點。肽藥物受肽酶活性的支配，并且，作為高度極性分子，難于完成跨脂質(zhì)細(xì)胞膜及內(nèi)皮細(xì)胞的運輸，例如血腦屏障。與其他分子的結(jié)合提供了一種保護肽避免降解，以及增強肽藥物進入細(xì)胞或機體內(nèi)區(qū)室的方式，而通常情況下，細(xì)胞或機體內(nèi)區(qū)室會排斥該化合物。
通過允許肽進入到體內(nèi)特定區(qū)域(而通常情況下，在這些區(qū)域中，肽會被排斥)，結(jié)合技術(shù)開啟了給藥的新途徑。在Patel等，Bioconjugate Chem.，8(3)434，1997，其化學(xué)過程在下文實施例5中進行了詳細(xì)描述，并在此處作為參考全文引用，研究者將一種已知作為有效止痛劑的肽藥物，七肽δ啡肽，與一種有機分子相結(jié)合，該有機分子經(jīng)過特殊設(shè)計以允許肽穿過血腦屏障。這樣藥物可通過靜脈給藥，而不用通過腦室注射。
Patel等人研究中的載體分子被設(shè)計來特異性針對那些含有血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞，同時也允許肽穿越這些屏障。遍及全身的內(nèi)皮細(xì)胞膜，包括血腦屏障，對于表達在其表面的膜結(jié)合肽鏈內(nèi)切酶的序列特異性及濃度是不同的。分子的設(shè)計利用這種特性來使載體分子及其運載物的定位成為可能。該分子含有三條游離端標(biāo)記了二肽Arg-Pro的脂肪酸鏈，其與血腦屏障的肽鏈內(nèi)切酶優(yōu)先結(jié)合。親脂性的脂肪酸鏈?zhǔn)箻O性的肽藥物分子的轉(zhuǎn)運成為可能。從而，標(biāo)記二肽的甘油三酸酯分子既可實現(xiàn)定位也可實現(xiàn)跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運。
結(jié)合方法也可增強肽藥物活性的動力學(xué)。下文所描述的用于增強肽活性動力學(xué)的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)都可用于包含YSV或其功能衍生物的肽、基本由YSV或其功能衍生物組成的肽或者由YSV或其功能衍生物組成的肽。Patel等人發(fā)現(xiàn)止痛劑肽的結(jié)合形式不僅能夠從血流中進入腦，而且與游離肽相比較具有持續(xù)作用。比之顱內(nèi)注射游離肽的效果，靜脈給藥的藥物需要更長時間來發(fā)揮治療效果，但是效果的持續(xù)時間更長，減少得更慢。研究者們發(fā)現(xiàn)結(jié)合肽分子在血清中非常穩(wěn)定，但注射入腦室中卻無效果，顯示出載體分子可能是在從血流轉(zhuǎn)運到腦的過程中被降解和移除。他們猜測，轉(zhuǎn)運結(jié)合物及降解載體分子所需要的時間是導(dǎo)致動力學(xué)改變的原因。不考慮延遲的機制，在臨床應(yīng)用中，結(jié)合肽分子的靜脈穩(wěn)定性、藥物作用的發(fā)生和活性的延遲意味著它可以不用頻繁地給藥。更低的頻率以及更方便的劑量方案增強了這種藥物作為可選治療方案的應(yīng)用價值。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的是，Patel等人的技術(shù)和過程可以容易的適用于任何落入到有限大小范圍的肽的運送，包括本發(fā)明的任意的肽。例如，本發(fā)明的一種肽，其顯示出抗癌效果，比如YSV，能夠與Patel等人所用的同樣的分子相結(jié)合。在一個帶有腦腫瘤的個體的治療中，結(jié)合分子可允許YSV從血流中進入腦，并允許YSV在腦內(nèi)的腫瘤組織中發(fā)揮作用。該技術(shù)人員也熟知改變載體分子的定位的修飾。載體分子的定位特性是在脂肪酸鏈末端含有二肽修飾的兩種氨基酸的特點的作用。Arg-Pro二肽與發(fā)現(xiàn)位于血腦屏障的內(nèi)皮膜表面的一批膜結(jié)合肽鏈內(nèi)切酶優(yōu)先相互作用。其他的內(nèi)皮細(xì)胞和膜可能通過其它二肽組合被定位。
研究者們也利用結(jié)合狀態(tài)來制造可通過消化道或者透皮被有效吸收的肽藥物。下文所描述的用于增強吸收的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)，都可被用來增強包含YSV肽或其功能衍生物的肽的吸收、基本由YSV肽或其功能衍生物組成的肽的吸收或者由YSV肽或其功能衍生物組成的肽的吸收。Kramer等人描述了一種將肽藥物連結(jié)到膽汁酸的過程?；衔锟诜o藥之后的結(jié)合分子的吸收速度與單獨的肽相比顯著增強(J.Biol.Chem.，269(14)10621，1994)。Toth等人(J.Med.Chem.，42(19)4010，1999)描述了將具有抗腫瘤特性的肽藥物與脂氨基酸(LAA)或脂多糖(LS)的結(jié)合，目的是為了增加吸收速度以及增強抗癌肽到其活性位點的遞送。在他們的研究中，生長激素抑制素的一種衍生物與LAA或LS中的任一個相結(jié)合，這種衍生物顯示出很強的抗增殖特性，但具有削弱的藥代動力學(xué)。得到的結(jié)合藥物具有跨皮膚和消化道上皮的改善的吸收譜，增加了抗降解的能力，并依然具有抗腫瘤細(xì)胞活性。這些技術(shù)與本發(fā)明的任意的肽相結(jié)合后將非常有用。通過增加分子的跨腸道上皮細(xì)胞的吸收速度，更多的肽可被運送到血液中并發(fā)揮其對被治療個體的作用。
結(jié)合(Conjugation)也可被用來提供肽藥物的持續(xù)的釋放。用于提供持續(xù)釋放的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他結(jié)合技術(shù)，都可用于提供肽的持續(xù)釋放，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。如上文Patel等人的工作中所看到的，肽藥物的持續(xù)的遞送可通過結(jié)合方法達到。另一個例子是Kim等人的工作(Biomaterials，232311，2002)，在他們的工作中，重組人表皮生長因子(rhEGF)在被裝入生物可降解的聚乳酸聚甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球體膠囊以前，與聚乙二醇(PEG)相結(jié)合。裝入PLGA微膠囊被好幾個小組用于遞送不同的生長因子和形態(tài)發(fā)生蛋白(Meinel等，J.Controlled Rel.，70193，2001)。與非結(jié)合的游離rhEGF相比較，通過與PEG結(jié)合，rhEGF可避免形成不溶于水的聚合體形式以及在與PLGA形成膠囊過程中吸附在水-有機相分界面。與游離的激素相比較，具有結(jié)合激素的配方所表現(xiàn)出的藥代動力學(xué)得到改善，顯示出更持久、更穩(wěn)定，以及全面增強的藥物活性，研究者們推測，這是由于與PEG結(jié)合的激素具有增強的生理穩(wěn)定性。類似的策略可以應(yīng)用來制備本發(fā)明的任意肽的持續(xù)釋放的配方。例如，YSV對免疫系統(tǒng)細(xì)胞具有有力的刺激作用。通過將PEG結(jié)合到這種肽并將結(jié)合藥物加入到PLGA微球體中，YSV隨著藥物的劑量給藥，以及隨著它從PEG結(jié)合物中釋放出來，對于個體的刺激作用可持續(xù)更長，更穩(wěn)定，更一致，并且確保肽藥物到免疫系統(tǒng)的更持續(xù)的遞送。
肽藥物的延長釋放可顯著增強其活性。下文所描述的任何用于提供肽的延長釋放的結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)，都可用于提供肽的延長釋放，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。Oldham等人(Int.J.Oncology，16125，2000)比較了抗癌試劑太平洋紫杉醇與該藥物的一種新形式，太平洋紫杉醇結(jié)合到聚L-谷氨酸(PG-TXL)。PG-TXL相比較游離的太平洋紫杉醇，顯示出具有較高的抗癌活性，提示該藥物具有較好的藥代動力學(xué)特性或者甚至具有更優(yōu)的作用方法。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)PG-TXL通過與游離藥物相同的作用機理來發(fā)揮作用，通過打亂微管亞單位的聚合來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。證據(jù)顯示，與游離肽給藥相比，結(jié)合藥物的更好的抗癌活性來自于游離藥物從結(jié)合物中的持續(xù)并穩(wěn)定的釋放，并更長時間地維持其治療濃度。本發(fā)明的具有抗癌特性的肽，例如CMS008，其所增加的聚(L-谷氨酸)尾端也能夠增強殺死腫瘤的能力。
在一些例子中，肽的酶降解可能會降低肽作為藥物的效力。下文所描述的減少肽的酶降解的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)，可用于減少肽的酶降解，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。研究者們已開發(fā)出很多方法來保護肽免受消化道中腔體分泌的蛋白酶以及結(jié)合到膜上的肽酶的降解。后者被發(fā)現(xiàn)位于所有粘膜組織的表面，而跨越粘膜組織經(jīng)常是肽藥物的進入路線。Bernkop-Schurch等人(J.Drug Target.，755，1999)，報道了含有胃蛋白酶抑制劑的肽藥物配方的構(gòu)建。一種胃酶抑素的類似物共價結(jié)合在粘膜附著聚合體(mucoadhesive polymer)上；這種新的胃蛋白酶抑制劑包含在含有胰蛋白酶的藥片中。在模擬消化過程的實驗室條件下的培養(yǎng)之后，對照藥片的所有的胰蛋白酶都被代謝，然而在含有這種抑制劑的藥片中大約50％的胰蛋白酶被保護不受降解。在另一項研究中，同一個研究小組利用蛋白酶抑制劑在通常會導(dǎo)致毒副作用的劑量下來抑制生物活性肽的降解(Bernkop-Schnurch etal.，Adv.Drug Del.Rev.，52127，2001)。該方法利用殼聚糖，一種從殼質(zhì)中提取的與纖維素相關(guān)的氨基多糖，在甲殼類和其他生物體中發(fā)現(xiàn)的一種主要的結(jié)構(gòu)多糖。通過將蛋白酶抑制劑結(jié)合到殼聚糖，以及在肽藥物配方中包括這種結(jié)合分子，發(fā)現(xiàn)消化道蛋白酶的顯著的抑制，增加了肽的生物利用率，并且沒有在給予游離的蛋白酶抑制劑時可預(yù)見的副作用。在該研究中，各種蛋白酶抑制劑被單獨以及聯(lián)合使用來與殼聚糖載體相結(jié)合。殼聚糖-EDTA結(jié)合物同樣通過結(jié)合某些蛋白酶發(fā)揮活性所必需的無機輔助因子來抑制內(nèi)源性蛋白酶。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，載體分子與效應(yīng)部分之間的大量的可能的組合可以被構(gòu)建來為肽配方提供有益的特性，它們中的任何一種均可容易地適用于本發(fā)明的肽。利用連接在殼聚糖的蛋白酶抑制劑，通過構(gòu)建肽的口服給藥配方，YSV的口服給藥可被用來代替肌肉注射。這種方法并沒有排除在配方中使用更容易被吸收的YSV的結(jié)合形式(在上文中論述)，來構(gòu)建這種肽及其衍生物的更高水平的生物利用度。
除了被另一個分子定位在特定區(qū)域，肽自身可作為定位分子。下文所描述的任何利用肽來將分子定位到所希望區(qū)域的結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它定位技術(shù)，均可用于包含YSV肽或其功能衍生物的肽、基本由YSV肽或其功能衍生物組成的肽或者由YSV肽或其功能衍生物組成的肽。例如，研究者們已使用抗癌藥物二氟甲基鳥氨酸(DFMO)，并為了定位將其結(jié)合到肽上。DFMO是一種高效的細(xì)胞毒素試劑，它可有效地殺傷多種類型的癌細(xì)胞。然而，由于它會很快地從體內(nèi)被清除，它的治療價值受到限制。在該項研究中，將DFMO結(jié)合到α促黑細(xì)胞激素的一個特殊片段或含有兩種氨基酸取代基的類似片段，其顯示出能優(yōu)先結(jié)合到人類黑素瘤細(xì)胞系上的促黑細(xì)胞激素受體(Suli-Vargha et al.，J.Pharm.Sci.，86997，1997)。為使DFMO從肽片斷中通過氨基肽酶方便釋放，藥物被結(jié)合到肽的N末端。研究者們發(fā)現(xiàn)結(jié)合藥物在殺傷黑素瘤細(xì)胞時比單獨的非結(jié)合藥物更有效。
本發(fā)明的肽的作用可部分的歸因于肽自身的內(nèi)在的定位能力。例如，與α促黑細(xì)胞激素片段類似，本發(fā)明的一種特定的肽可聯(lián)結(jié)到某一受體，該受體被發(fā)現(xiàn)位于一種獨特類型細(xì)胞的表面。通過使用該肽作為結(jié)合體，藥物可被定位在用該藥物治療的個體體內(nèi)的那些細(xì)胞的特定區(qū)域。
作為結(jié)合物的肽可發(fā)揮除定位以外的其它功能。下文所描述的任何提高肽的治療效果的結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他結(jié)合技術(shù)，均可用于增強肽的治療效果，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。Fitzpatrick等人通過在兩個分子之間使用肽間隔(spacer)，改進了結(jié)合抗癌試劑(Anticancer Drug Design，101，1995)。已將甲氨蝶呤與人血清蛋白(HSA)相結(jié)合，來增加被腫瘤細(xì)胞吸收以及抗腫瘤細(xì)胞的能力。一旦被細(xì)胞吸收，一些甲氨蝶呤被溶酶體中的酶從結(jié)合物中釋放，并可發(fā)揮其細(xì)胞毒素作用。通過在甲氨蝶呤與容易被溶酶體酶消化的HAS之間插入一個四氨基酸的連接(linker)肽，增加了細(xì)胞內(nèi)由結(jié)合分子產(chǎn)生的活性甲氨蝶呤的數(shù)量。本發(fā)明的肽可通過與特殊的酶的特異性相互作用來發(fā)揮它們的作用。通過在結(jié)合分子內(nèi)摻入本發(fā)明的一種肽作為藥物與其載體分子之間的連接片段，或者增加另一個連接片段，藥物動力學(xué)可被改變。這能夠構(gòu)建一種對蛋白酶的活性更具抗性或更敏感，并且隨后提高或降低藥物分子從結(jié)合物中的釋放速度的前體藥物。就像上文中結(jié)合的化學(xué)治療試劑的例子那樣，藥物分子遞送速度的改變可大大增強藥物的作用效果。
藥物對于一個特定細(xì)胞的作用可根據(jù)其它因素而被改變，例如細(xì)胞的活化狀態(tài)，或者細(xì)胞周圍或細(xì)胞內(nèi)其它分子信號的存在情況。在一些實例中，為了藥物能夠發(fā)揮作用，另一個分子或信號必須存在。Damjancic等人(Exp.Clin.Endocrin.，95315，1990)研究了人心房鈉尿肽(hANP)對內(nèi)源糖皮質(zhì)激素合成缺陷的影響。肽在糖皮質(zhì)激素治療的停藥期間或隨后使用地塞米松進行繼續(xù)治療期間給予患者?；颊咧挥性诎殡S的地塞米松治療期間給予肽激素時，才對hANP起反應(yīng)并且增加利尿與鈉排泄。在糖皮質(zhì)激素治療的停藥期間用hANP處理無效果。協(xié)同給予類固醇激素的作用也能增強肽的活性。在Zhu等人的報道中(Acta Pharm.Sinica，28166，1993)，止痛劑肽京都啡肽(kyotorphin，簡稱KTP)經(jīng)由一個短連接片段結(jié)合到氫化可的松，其活性與單獨肽的活性相比較顯著增強。單獨給予氫化可的松無效果。
這些研究的結(jié)果表明，類固醇激素作為結(jié)合分子的能力或者作為配方中的成分可實現(xiàn)或增強生物活性肽的活性。本發(fā)明的任意的肽也可通過與類固醇激素結(jié)合或共同應(yīng)用被調(diào)節(jié)或活化。Zhu等人的技術(shù)可容易的適用于類固醇分子與本發(fā)明的肽的結(jié)合。圖1至5也提供了連接類固醇激素到本發(fā)明的任意的肽的逐步合成反應(yīng)示例。
上述所舉的例子提供了增加本發(fā)明的任意的肽的有效性及活性的典型方式。在這一領(lǐng)域中進一步的發(fā)展將有助于克服障礙來構(gòu)建基于肽的有效的臨床治療。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的，開發(fā)用于肽生物化學(xué)、制藥研究及臨床檢測的技術(shù)、試劑以及實驗規(guī)程，都可容易地應(yīng)用于本發(fā)明的任意的肽。
實施例1經(jīng)基因工程乳桿菌菌種輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個舉例方法。編碼YSV的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達載體中。所選的表達載體含有在乳桿菌中有功能的組成型啟動子，一個用于以特異的5’至3’方向異入DNA序列的多克隆位點，以及一個賦予對抗生素的抗性的選擇標(biāo)記基因(以輔助克隆程序)，并且還可含有有助于肽的產(chǎn)生和/或分泌的其它序列，如信號肽序列。這種載體的一個例子參見Pavla的美國專利5,592,908，其引入本文作參考。簡要地，該專利討論了在乳桿菌菌種中有功能的若干已知啟動子，以及在所述細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)新啟動子的方法，這些啟動子的任一種均可與編碼本發(fā)明肽的核酸可操作地連接以在乳桿菌中表達所述肽。編碼信號肽如美國專利5,592,908所述的在乳酸乳桿菌中有活性的由16-35個多數(shù)為疏水的氨基酸組成的肽的核酸被插入啟動子和編碼本發(fā)明肽的核酸之間，從而編碼信號肽的核酸與編碼本發(fā)明肽的核酸同框。
除了肽的編碼序列之外，合成的DNA序列還可包括有助于將所述DNA連接并克隆進表達載體的序列。例如，相應(yīng)于載體的多克隆位點的一個位點的限制酶識別位點可在序列的5’和3’端被摻入合成DNA中，從而所述序列可以正確方向克隆進載體中。載體和合成DNA用特定限制酶消化，然后純化。載體和合成DNA連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌合適菌株中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含有載體賦予抗性的抗生素的培養(yǎng)基上鋪板。選擇轉(zhuǎn)化細(xì)菌的菌落進行生長培養(yǎng)和質(zhì)粒制備。證實存在正確方向的合成DNA。
然后將表達載體轉(zhuǎn)化進乳桿菌菌種如嗜酸乳桿菌的細(xì)菌宿主細(xì)胞中。通過載體序列中的選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，肽的分泌可通過進行Western印跡、進行存在于培養(yǎng)基中的肽的凝膠電泳和其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)證實。選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化菌落并用于制備基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)物。培養(yǎng)表達所需肽的基因工程菌的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該細(xì)菌可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。如果需要，可以各種方式處理細(xì)菌培養(yǎng)物以產(chǎn)生由宿主腸道吸收的補劑。這些處理包括凍干或其它保存細(xì)菌的方法，另外可將細(xì)菌與載體試劑如溶液、溶劑、分散介質(zhì)、緩釋劑、乳液等組合。這些試劑制備補劑的用途是本領(lǐng)域熟知的。例如，細(xì)菌可用于制備酸奶產(chǎn)品或其它食品供人類消費，從而表達肽的微生物寄居在人消化道中。將乳酸菌的特殊菌株摻入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各種不同方法參見美國專利6,036,952，其引入本文作參考。通過任一種途徑攝入細(xì)菌后，工程菌可寄居在消化道中使得經(jīng)消化道的粘膜層呈遞和/或吸收本發(fā)明肽。
實施例2經(jīng)基因工程形式的枯草芽孢桿菌輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個舉例方法。編碼表A中所列的一個肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達載體中。所選的表達載體包括穿梭載體，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以選擇轉(zhuǎn)化菌落。這一載體可以含有在枯草芽孢桿菌中有活性的啟動子，如衍生自枯草芽孢桿菌SacB基因的啟動子，以及編碼在枯草芽孢桿菌中有活性的信號或前導(dǎo)肽的核苷酸序列，該信號或前導(dǎo)肽指導(dǎo)表達的異源蛋白從細(xì)菌細(xì)胞中有效輸出。這種載體的一個例子參見Fahnestock的美國專利6,268,169，其引入本文作參考。簡要地，如上所述，以本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成具有限制酶位點和/或促進DNA克隆的其它序列的編碼本發(fā)明肽的DNA。在轉(zhuǎn)化進大腸桿菌、鋪板、選擇和繁殖質(zhì)粒產(chǎn)生質(zhì)粒原液后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進枯草芽孢桿菌，并根據(jù)對鋪板培養(yǎng)基中的抗生素的抗性選擇轉(zhuǎn)化子。
用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)如在SDS-PAGE分析或Western印跡后放射標(biāo)記肽以放射自顯影來證實基因工程枯草芽孢桿菌對肽的產(chǎn)生和分泌。
培養(yǎng)表達所需肽的基因工程菌的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該細(xì)菌可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。
實施例3經(jīng)基因工程糖酵母菌種輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個舉例方法。編碼表A中所列的一個肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達載體中。所選的表達載體包括一穩(wěn)定維持的酵母蛋白表達載體，包括組成型酵母啟動子如pADH1，使載體在酵母和大腸桿菌中均能復(fù)制的位點，賦予營養(yǎng)缺陷型酵母突變體以原養(yǎng)型的用于選擇目的的一個或多個基因，多克隆位點(MCS)，以及如果需要的編碼信號肽的序列。這種載體是市售的并是本領(lǐng)域熟知的或者可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建。在將合成DNA插入酵母載體、轉(zhuǎn)化進大腸桿菌、在選擇培養(yǎng)基上鋪板轉(zhuǎn)化的大腸桿菌、選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落并從所述菌落的細(xì)菌培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA后，將載體經(jīng)熟知技術(shù)如乙酸鋰轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)化進釀酒酵母。選擇用于轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株是突變的營養(yǎng)缺陷型菌株，其需要質(zhì)粒上的一種基因以在基本培養(yǎng)基上生長。通過將酵母在缺少該載體上提供的基因的培養(yǎng)基上鋪板而選擇轉(zhuǎn)化的酵母菌落。只有接受的載體及其選擇基因并表達該基因產(chǎn)物的酵母可在基本培養(yǎng)基上生長成菌落。通過進行Western印跡、存在于培養(yǎng)基中的肽的凝膠電泳或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以證實肽的表達。
選擇酵母轉(zhuǎn)化菌落并用于制備大規(guī)模培養(yǎng)物。培養(yǎng)表達所需肽的基因工程酵母的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該酵母可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。如果需要，可以各種方式處理酵母培養(yǎng)物以產(chǎn)生由宿主腸道吸收的補劑。這些處理包括凍干或其它保存酵母的方法，另外可將酵母與載體試劑如溶液、溶劑、分散介質(zhì)、緩釋劑、乳液等組合。這些試劑制備補劑的用途是本領(lǐng)域熟知的。在另一實施方案中，轉(zhuǎn)化的酵母可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備食品如發(fā)酵奶制品如酸奶和酸乳酒。與這些食品中的活乳酸菌培養(yǎng)物一樣，轉(zhuǎn)化的酵母至少短時寄居在消化道中，并經(jīng)消化道腔將肽提供給宿主。
實施例4將肽定位到特定的區(qū)域下文提供了一種選擇性地將本發(fā)明的肽遞送到特定區(qū)室、器官、細(xì)胞類型或體內(nèi)特定區(qū)域的示范方法。在這一例子中，通過將YSV定位到個體的腎臟內(nèi)組織來治療腎炎。YSV經(jīng)由本領(lǐng)域所公知的化學(xué)反應(yīng)通過共價鍵與低分子量(LMW)溶菌酶——一種特異地集中在腎臟組織的可通過商業(yè)途徑獲得的蛋白部分——相連。實現(xiàn)分子與LMW溶菌酶結(jié)合的技術(shù)已有文獻公開(Folgert等，Br.J.Pharmcology，1361107，2002)。將蛋白或肽與另一種蛋白質(zhì)或肽相結(jié)合的一般技術(shù)在所屬領(lǐng)域的文獻中也已公開(Fischer等，Bioconj.Chem.，12825，2001)。然后，新構(gòu)建的結(jié)合肽樣品通過層析方法如陽離子交換FPLC和/或梯度離心法從連接過程中所使用的化學(xué)試劑中被純化。一旦被純化，該結(jié)合肽給予需要治療腎炎的個體。對于抗腎炎活性，依靠YSV與LMW溶菌酶之間的連接，其會被腎的近端小管細(xì)胞選擇性吸收和代謝，YSV被優(yōu)先定位到腎臟組織。與相同摩爾數(shù)量的YSV自身相比較，這種優(yōu)先遞送形成更強的抗腎炎作用。相反地，這能減少為達到抗腎炎活性的某一水平的肽藥物的量。
實施例5增強肽到其活性位點的遞送下文提供了一種增強神經(jīng)活性肽遞送到腦的典型的方法。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的化學(xué)方法合成本發(fā)明的一種的肽，其在由腦的神經(jīng)細(xì)胞所表達的受體上發(fā)揮作用?；蛘撸部捎晒こ涛⑸锉磉_并從這些生物體的培養(yǎng)物中回收得到，如上文實施例中所描述的那樣。一旦以純化的形式獲得，這種肽被用于一系列的有機化學(xué)反應(yīng)，來構(gòu)建一個甘油三酸酯結(jié)合部分，連接到該肽。該結(jié)合部分由一個季碳中心組成，所述碳中心通過一個酰胺鍵連接到肽的末端羧基碳而與本發(fā)明的肽相連接。附著在季碳中心另外三個基團由與16碳脂肪酸鏈的碳酯聯(lián)接組成。脂肪酸鏈自身末端帶有被認(rèn)為是肽修飾(mask)的二肽基團，其增加了鏈的親水性并將它們特異性地定位于血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞膜。這一合成過程在Patel等.，Bioconjugate Chem.，8(3)434，1997中進行了詳細(xì)說明，并利用了本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的常用試劑與設(shè)備。
一旦在外部導(dǎo)入到個體，該化合物經(jīng)由循環(huán)系統(tǒng)在全身轉(zhuǎn)運，與血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞膜相互作用。在分子跨越血腦屏障的上皮層的運輸過程中，二肽修飾及脂鏈的逐步降解導(dǎo)致本發(fā)明的肽釋放到腦區(qū)室中。在那兒，肽可與神經(jīng)細(xì)胞表面的受體相互作用來發(fā)揮其對腦功能的影響作用。藥物到達血腦屏障以及被運輸?shù)侥X所需的時間，以及伴隨載體部分的降解，改變了藥物活力的動力學(xué)，與游離肽的腦室注射相比較，形成一個更穩(wěn)定持續(xù)時間更長的效果。
實施例6構(gòu)建抗酶降解的肽配方下文提供了一種構(gòu)建用于口服給藥的生物活性肽的配方的典型方法，其可抗在消化道表面內(nèi)部以及沿著消化道表面所發(fā)現(xiàn)的蛋白酶及肽酶活性。在這個例子中，YSV被用于制備對病人進行口服形式給藥的藥物配方。如Larionova等人所描述的那樣(Int.J.Pharma.，189171，1999)，肽被用于與可溶性淀粉以及蛋白酶抑制劑----抑酶肽(aprotinin)，一起制備微粒，抑酶肽是一種由細(xì)胞腔分泌以及刷狀緣(brush border)膜結(jié)合的多種蛋白酶的強烈的抑制劑。簡單地說，可溶性淀粉，蛋白酶抑制劑抑酶肽以及本發(fā)明的肽溶解在一緩沖液中。可溶性淀粉，aprotinin的比例可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的實驗方法確定，例如，Larionova等人利用體外模擬消化試驗來決定對他們研究中所用的肽最有效的比例以及制備條件。水溶液在含有5％Span-80(一種非離子型表面活性劑)的環(huán)己烷中(比例1∶3，v/v)，在機械振動的條件下被乳化。對苯二酰氯的氯仿溶液被加入到乳化液中，持續(xù)攪拌30分鐘，在這期間淀粉分子與aprotinin以及所述肽發(fā)生交聯(lián)。在那個過程中所制備的微粒用環(huán)己烷、具有2％v/vTween85去污劑的95％乙醇溶液、95％乙醇及水依次洗滌。微粒在水中重懸浮并凍干。凍干的化合物可被置于明膠膠囊中，用于需要治療的個體的口服給藥。
一旦被消化吸收后，化合物隨著明膠膠囊的溶解被釋放。微粒在小腸中通過α淀粉酶對淀粉分子的作用而被分解，導(dǎo)致aprotinin以及本發(fā)明的肽的逐步釋放。有效的蛋白酶抑制劑aprotinin在與肽相同的時間和位置協(xié)同釋放，減少了肽的酶降解，并增加了從腸膜吸收獲得的完整肽的比例雖然本發(fā)明用上述的方法和數(shù)據(jù)以及YSV的特定的實施例來描述，但可以理解的是，這僅僅是舉例而不能作為對本發(fā)明的限制。同樣可被理解的是YSV代表了本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的相同的原則也可應(yīng)用于YSV的被修飾但未影響生物學(xué)功能的其它功能等同的肽。例如，YSV的等同肽包括那些具有保守的氨基酸取代基(即，Y、S或V中的一個被具有處于同樣的生化類型的另一個氨基酸殘基所置換，例如疏水性、親水性，正電或負(fù)電基團的)。YSV等同肽的另一個例子是一個更長一些的肽，比如長一個或兩個氨基酸，能保持同樣的生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1.一種分離或純化的肽，所述肽包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸。
2.權(quán)利要求1的分離或純化的肽，所述肽基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成。
3.權(quán)利要求1的分離或純化的肽，所述肽由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成。
4.權(quán)利要求2的肽，其中所述肽具有選自以下的活性免疫響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激作用、細(xì)胞增殖紊亂的調(diào)節(jié)作用、癌生長的調(diào)節(jié)作用、肝癌生長的調(diào)節(jié)作用、白血病細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)作用、宮頸癌生長的調(diào)節(jié)作用、肺癌生長的調(diào)節(jié)作用以及黑素瘤生長的調(diào)節(jié)作用。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的肽，其中所述肽為L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽。
6.權(quán)利要求1-4中任一項的肽，其中所述肽為基本純化的形式。
7.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，所述藥物組合物包含L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成的多肽。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，所述藥物組合物包含L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽。
11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成的多肽。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，所述藥物組合物包含L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽。
13.一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽并將所述三肽與藥學(xué)上可接受的載體混合。
14.一種降低人疾病作用的方法，所述方法包括給予人藥學(xué)有效劑量的酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述人患有選自其作用可通過刺激T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而降低的病癥和細(xì)胞增殖紊亂的疾病。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞增殖紊亂為癌癥。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥選自肝癌、白血病、肺癌、黑素瘤和宮頸癌。
18.包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸的三肽作為藥用化合物的用途。
19.基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸組成的三肽作為藥用化合物的用途。
20.由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸組成的三肽作為藥用化合物的用途。
21.權(quán)利要求18的用途，其中所述化合物用于治療細(xì)胞增殖紊亂。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述細(xì)胞增殖紊亂為癌癥。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述癌癥選自肝癌、白血病、肺癌、黑素瘤和宮頸癌。
24.權(quán)利要求18的用途，其中所述化合物用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。
25.包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽的肽作為營養(yǎng)增補劑的用途。
26.基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成的肽作為營養(yǎng)增補劑的用途。
27.由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成的肽作為營養(yǎng)增補劑的用途。
28.一種包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽的增強衍生物的分子，所述增強衍生物包括連接在酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽上的增強分子，所述增強分子增強所述三肽的療效。
29.一種基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸組成的肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了酪氨酰－絲氨酰－纈氨酸三肽及其作為藥物組合物的用途。同時還公開了制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供酪氨酰－絲氨酰－纈氨酸三肽并將其與藥學(xué)上可接受的載體混合。
文檔編號C07K5/087GK1809586SQ200480017366
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者王偉明, 林剛 申請人:一泰醫(yī)藥研究(深圳)有限公司