專利名稱：針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實施例涉及新穎抗體，尤其涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體，而且尤其涉及III型缺失突變體EGFRvIII。本實施例也涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的人類單克隆抗體，而且尤其為EGFRvIII。本實施例也涉及這些抗體的變體。本發(fā)明也提供這些抗體的診斷和治療配方，及其免疫偶聯(lián)物。
背景技術(shù)：
自上世紀以來，已尋求有助于更好診斷和治療人類和動物癌癥的腫瘤特異分子。除了那些基于病毒誘導癌癥并包含由病毒基因規(guī)定的分子結(jié)構(gòu)的癌癥之外，在大多數(shù)類型的人類癌癥中，很難提供對基于分子結(jié)構(gòu)資料的腫瘤特異物質(zhì)的確切證據(jù)。極少有關(guān)于基于新穎分子結(jié)構(gòu)的腫瘤特異分子的實例。在惡性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤和其它與表皮生長因子受體分子的放大或變化潛在相關(guān)的腫瘤(諸如乳腺癌和其它人類癌癥)的情況下，尚無關(guān)于具有獨特序列的結(jié)構(gòu)變化分子的明確論證。
表皮生長因子受體(EGFR)是原致癌基因c-erb B的170千道爾頓(kilodalton)膜糖蛋白產(chǎn)物。已知EGFR基因的序列(Ullrich等人，1984)?！癏uman EpidermalGrowth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the AmplifiedGene in A431 Epidermoid Carcinoma Cells.”Nature 309418-425)。EGFR基因是最初在鳥類紅細胞增多癥病毒中識別的erb B致癌基因的細胞同源性(Downward等人(1984))?！癈lose Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v-erb B OncogeneProtein Sequence.”Nature 307521-527，Ullrich等人(1984)。已在各種人類腫瘤中觀察到這種致癌基因通過基因放大的活化(Haley等人(1987A)?！癟he EpidermalGrowth Factor Receptor Gene inOncogenes，Genes，and Growth Factors”，Guroff，G編，第12版，第2章，第40-76頁，Wiley，N.Y.)，且尤其為神經(jīng)膠質(zhì)源性的那些表皮生長因子受體基因(Libermann等人，(1985)。Amplification，Enhanced Expressionand Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumoursof Glial Origin，Nature 313144-147；Wong等人，(1987)。Increased Expression of theEpidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associatedwith Gene Amplification.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846899-6903；Yamazaki等人，(1988)。Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal GrowthFactor Receptor Gene(c-erbB)in Human Brain Tumors.Molecular and Cellular Biology81816-1820，Maiden等人，(1988)。Selective Amplification of the Cytoplasmic Domainof the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme.CancerResearch 42711-2714)。
已證實EGF-r在多種類型的人類固體腫瘤中過量表達。Mendelsohn Cancer Cells7359(1989)，Mendelsohn Cancer Biology 1339-344(1990)，Modjtahedi and Dean Int′lJ.Oncology 4277-296(1994)。例如，已在某些肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌中觀察到EGFR過量表達。Modjtahedi andDean Int′l J.Oncology 4277-296(1994)。已證實表皮生長因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)都結(jié)合至EGF-r，而且導致細胞增殖和腫瘤生長。
v-erb B致癌基因和正常EGFR基因之間的一個主要區(qū)別在于病毒致癌基因是正常受體截斷氨基的變型；它們?nèi)鄙俅蟛糠旨毎|(zhì)外結(jié)構(gòu)域，但保留了跨膜和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(Fung等人，(1984))。Activation of the Cellular Oncogene c-erb B by LTRInsertionMolecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus.Cell 33357-368；Yamamoto等人，(1983)。A New Avain Erythroblastosis Virus，AEV-HCarries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosis and Sarcoma.Cell 34225-232，Nilsen等人，(1985)。c-erbB Activation in ALV-InducedErythroblastosisNovel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expressionof an Amino-Truncated EGF Receptor.Cell 41719-726；Gammett等人，(1986)。Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the EpidermalGrowth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of ViralerbB Genes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836053-6057)。這導致了不可以結(jié)合表皮生長因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它物質(zhì)的蛋白質(zhì)(Gilmore的，(1985))。ProteinPhosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro.Cell 40609-618；Kris等人，(1985)。Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probefor the Kinase Activity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein.Cell 40619-625)，且導致以下推測v-erb B蛋白質(zhì)為致癌基因性的是因為激酶結(jié)構(gòu)域未經(jīng)調(diào)節(jié)且結(jié)構(gòu)上為活性的(Downward等人，1984)。
各種基因變化都可以發(fā)生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端中發(fā)生氨基酸的取代和缺失。然而，可獲得的證據(jù)表明氨基截斷對于致癌作用尤為關(guān)鍵。氨基截斷是所有v-erb B致癌基因的一個特征，包括由啟動子的插入或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導引起的那些氨基截斷(Nilsen等人，(1985))。c-erbB Activation inALV-Induced ErythroblastosisNovel RNA Processing and Promoter Insertion Resultsin Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.Cell 41719-726；Gammett等人，(1986)。Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of theEpidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potentialof Viral erbB Genes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836053-6057)。
相反，羧基-末端缺失似乎只與由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導引起的腫瘤有關(guān)，而且似乎決定了宿主范圍和腫瘤類型的特異性(Gammett等人，1986；Raines等人，(1985)。c-erbBActivation in Avian Leukosis Virus-Induced ErythroblastosisClustered Integration Sitesand the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alleles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA822287-2291)。以氨基-截斷鳥類c-erb B基因或感染性病毒致癌基因-人類EGF受體的轉(zhuǎn)染實驗表明該缺失單獨即足以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)(Pelley等人，(1988))。Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not SarcomagenicCharacterization of aReplication-Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB.Journal of Virology621840-1844；Wells等人，(1988)。Genetic Determinants of Neoplastic Transformationby the Retroviral Oncogene v-erbB.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857597-7601)。
EGFR基因的放大發(fā)生于40％的惡性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中(Libermann等人，(1985)。Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGFReceptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin，Nature 313144-147；Wong等人，(1987)。Increased Expression of the Epidermal Growth Factor ReceptorGene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846899-6903)，受體基因的重排在許多具有基因放大的腫瘤中較為明顯。結(jié)構(gòu)變化似乎優(yōu)先影響基因的氨基末端一半(Yamazaki等人，(1985)。Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF ReceptorGene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin，Nature 313144-147；Maiden等人，(1988)。Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the EpidermalGrowth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme.Cancer Research42711-2714)，但重排的性質(zhì)當時并未在任何腫瘤中準確表征。
已報導在若干人類癌癥中的大小變體EGFR基因和放大(Humphrey等人，(1988))。Amplification and Expression of the，Epidermal Growth Factor Receptor Genein Human Glioma Xenografis.Cancer Research 482231-2238；Bigner等人，(1988)J.Neuropathol.Exp.Neurol.，47191-205；Wong等人，(1987)。Increased Expression of theEpidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associatedwith Gene Amplification.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846899-6903；和Humphrey等人。表皮生長因子受體基因在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植中的放大和表達，Cancer Res.48(8)2231-8(1988))。然而，尚無關(guān)于細胞中經(jīng)改變EGFR分子的分子基的測定。1989年，Drs.Bigner和Vogelstein的著作說明已知為III型突變體的EGF受體突變體的序列(也稱為δ-EGFr或EGFRvIII)。此著作描述于美國專利第6,455,498號、第6,127,126號、第5,981,725號、第5,814,317號、第5,710,010號、第5,401,828號和第5,212,290號中。
EGFR變體是由基因重排伴隨EGFR基因放大而引起的。存在八種主要的EGFr變體，已知為(i)EGFRvI缺少EGFR的大部分細胞外結(jié)構(gòu)域，(ii)EGFRvII由EGFR的細胞外結(jié)構(gòu)域中的83 aa框內(nèi)缺失組成，(iii)EGFRvIII由EGFR的細胞外結(jié)構(gòu)域中的267 aa框內(nèi)缺失組成，(iv)EGFRvIV含有EGFR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的缺失，(v)EGFRvV含有EGFR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的缺失，(vi)EGFR.TDM/2-7含有EGFR的細胞外結(jié)構(gòu)域中的外顯子2-7的重復(fù)，(vii)EGFR.TDM/18-25含有EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的外顯子18-26的重復(fù)，和(viii)EGFR.TDM/18-26含有EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的外顯子18-26的重復(fù)(Kuan等人，EGF突變體受體vIII在治療癌癥中作為分子靶標，Endocr Relat Cancer.8(2)83-96(2001))。另外，存在第二種更為罕見的具有第二種在外顯子11和14之間的連接點引入新穎組氨酸殘基的缺失的EGFRvIII突變體(EGFRvIII/Δ12-13)(Kuan等人，EGF突變體受體vIII在治療癌癥中作為分子靶標，Endocr Relat Cancer.8(2)83-96(2001))。
EGFRvIII是在人類癌癥中表皮生長因子(EGF)受體最常見發(fā)生的變體(Kuan等人，EGF突變體受體vIII在治療癌癥中作為分子靶標，Endocr Relat Cancer.8(2)83-96(2001))。在基因放大的過程中，在細胞外結(jié)構(gòu)域中發(fā)生267個氨基酸缺失，產(chǎn)生腫瘤特異單克隆抗體可指向的新穎連接點。EGF受體的這種變體以配位體獨立的方式有助于腫瘤通過組成型信號發(fā)出而發(fā)展。已知EGFrVIII未表達于任何正常組織上(Wikstrand，CJ.等人，“Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumorspecific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.”，CancerResearch 55(14)3140-3148(1995)；Olapade-Olaopa，EO.等人，“Evidence for thedifferential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.Br JCancer.82(1)186-94(2000))。然而，EGFRvIII顯示在腫瘤細胞中的顯著表達，例如，27-76％的乳腺癌活體檢查表達EGFRvIII(Wikstrand，CJ.等人，“Monoclonalantibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lungcarcinomas malignant gliomas.”，Cancer Research 55(14)3140-3148(1995)；Ge H.等人，“Evidence of high incidence of EGFRvIII expression and coexpression with EGFRin human invasive breast cancer by laser capture microdissection andimmunohistochemical analysis.”，Int J Cancer.98(3)357-61(2002))，50～70％神經(jīng)膠質(zhì)癌表達EGFRvIII(Wikstrand，CJ.等人，“Monoclonal antibodies against EGFRVIII aretumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.”CancerResearch 55(14)3140-3148(1995)；Moscatello，G.等人，“Frequent expression of amutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.”Cancer Res.55(23)5536-9(1，995))，16％NSCL癌癥表達EGFRvIII(Garcia de Palazzo，IE.等人，Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lungcarcinomas.Cancer Res.53(14)3217-20(1993))，75％卵巢癌表達EGFRvIII(Moscatello，G.等人，“Frequent expression of a mutant epidermal growth factorreceptor in multiple human tumors.”，Cancer Res.55(23)5536-9(1995))，和68％前列腺癌表達EGFRvIII(Olapade-Olaopa，EO.等人，Evidence for the differential expressionof a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.Br J Cancer.82(1)186-94(2000))。
缺失267個氨基酸并替換為甘氨酸產(chǎn)生可定靶抗體的獨特連接。此外，鑒于EGFRvIII在某些腫瘤中的表達及其在正常組織中的表達缺乏，EGFRvIII在腫瘤治療中可作為用于定靶藥物的理想靶標。具體而言，EGFRvIII似乎可作為腫瘤免疫偶聯(lián)物治療的理想候選物(例如，與抗腫瘤劑或毒素偶聯(lián)的抗體)。另一種治療過量表達EGFRvIII的癌癥的方法涉及使用特異性定靶至未分離正常EGFR的變體受體的腫瘤特異性核酶。發(fā)現(xiàn)核酶在無胸腺裸鼠中顯著抑制乳腺癌生長(Luo等人，Int.J.Cancer.104(6)716-21(2003))。已描述用于整個EGFRvIII蛋白質(zhì)的通用抗體。
參見國際專利申請案第WO 01/62931號和Kuan等人，“EGF mutant receptor vIIIas a molecular target in cancer therapy.”Endocr Relat Cancer.8(2)83-96(2001)；Kuan等人，“EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy.”BrainTumor Pathol.17(2)71-78(2000)；Kuan等人，“Increased binding affinity enhancestargeting of glioma xenografts by EGFRvIII-specific scFv.”International Journal ofCancer.88(6)962-969(2000)；Landry等人，“Antibody recognition of a conformationalepitope in a peptide antigenFv-peptide complex of an antibody fragment specific forthe mutant EGF receptor，EGFRvIII.”Journal of Molecular Biology.308(5)883-893(2001)；Reist等人，“Astatine-211 labeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonalantibody using N-succinimidyl 5-[211At]astato-3-pyridinecarboxylate.”NuclearMedicine and Biology.26(4)405-411(1999)；Reist等人，“In vitro and in vivo behaviorof radiolabeled chimeric anti-EGFRv III monoclonal antibodycomparison with itsmurine parent.”Nuclear Medicine and Biology.24(7)639-647(1997)；Wikstrand等人，“Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvIII tumor-associated antigensystem.”Cancer Immunology，Immunotherapy.50(12)639-652(2002)；Wikstrand等人，“Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breastand lung carcinomas malignant gliomas.”Cancer Research.55(14)3140-3148(1995)；Wikstrand等人，“The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRVIII)characterization and utilization as an immunotherapeutic target.”J.Neurovirol.4(2)148-158(1998)；Wikstrand等人，“The class III variant of the epidermal growthfactor receptor(EGFRvIII)characterization and utilization as an immunotherapeutictarget.”J.Neurovirol.4(2)148-158(1998)；Jungbluth等人，“A monoclonal antibodyrecognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermalgrowth factor receptor.”Proc Natl Acad Sci U S A.100(2)639-44(2003)；Mamot等人，“Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)-targeted Immunoliposomes MediateSpecific and Efficient Drug Delivery to EGFR-and EGFRvIII-overexpressing TumorCells.”Cancer Research 633154-3161(2003))。
然而，每一種上述抗體在變化和/或恒定區(qū)內(nèi)都具有或含有鼠科序列。
這些鼠科衍生蛋白質(zhì)的存在可導致抗體的快速清除或可導致抵抗患者體內(nèi)抗體的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。另外，即使在親和力成熟之后，這些抗體仍具有2.2×10-8至1.5×10-9級別的相對低的親和力。(Kuan等人，“EGF mutant receptor vIII as amolecular target in cancer therapy.”，Endocr Relat Cancer.8(2)83-96(2001))。
為避免使用鼠科或大鼠衍生抗體，研究者已將人類抗體功能引入嚙齒動物以使得嚙齒動物可產(chǎn)生完全人類抗體，參見例如Mendez等人，“Functional transplant ofmegabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice.”Nat Genet.15(2)146-56(1997)。這種方法已結(jié)合針對野生型EGFR的成功抗體的產(chǎn)生而使用，參見例如Yang X等人，“Development of ABX-EGF，a fully human anti-EGFreceptor monoclonal antibody，for cancer therapy.”Crit Rev Oncol Hemato 38(1)17-23(2001)；Yang X-D等人，Eradication of Established Tumors by a Fully HumanMonoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without ConcomitantChemotherapy，Cancer Research 59(6)1236-1243(1999)；和美國專利第6,235,883號。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施例中，本發(fā)明包含特異性結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離人類單克隆抗體和包含序列L E E K K G N Y V V T D H C的肽(SEQ ID NO56)。在一個實施例中，治療劑可與抗體偶聯(lián)。在一個實施例中，使用毒素。在另一個實施例中，本發(fā)明包含特異性結(jié)合至于包含L E E K K G N Y V V T D H C的序列(SEQ ID NO56)中含有的表位的經(jīng)分離人類單克隆抗體，其中如由SPOTs排列中的丙氨酸掃描所測定，結(jié)合所需的殘余物選自由EEK、KKNYV、LEK、EKNY和EEKGN組成的群組。
另外的實施例包括包含由VH3-33基因編碼的重鏈可變區(qū)氨基酸序列的經(jīng)分離人類單克隆抗體。重鏈可變區(qū)氨基酸序列可包括由JH4b基因編碼的氨基酸序列，或由選自由D6-13和D3-9組成的群組的D基因編碼的氨基酸序列。
其它實施例包括包含由A23(VK2)基因編碼的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的經(jīng)分離人類單克隆抗體。輕鏈可變區(qū)氨基酸序列可包括由JK1基因編碼的氨基酸序列。
其它實施例包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體或其片段，而且其包含選自由標識為(SEQ ID)NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的重鏈氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列?？贵w可為單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體?？贵w或片段可與醫(yī)藥學上可接受的載劑或稀釋劑締合，而且可與治療劑結(jié)合。治療劑可為毒素。治療劑可為諸如DM-1、AEFP、AURISTATIN E或ZAP的毒素。所述藥劑可經(jīng)連接劑與抗體締合。所述毒素可經(jīng)第二抗體與抗體締合。另外的實施例包括產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞株和包含編碼抗體基因的轉(zhuǎn)型細胞。例如，所述細胞可為中國地鼠卵巢細胞。
另外的實施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達相關(guān)聯(lián)的細胞增殖的方法，其包含以有效量的抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。在一個實施例中，抗體包含選自由抗體13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ ID NO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)的重鏈氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列。該方法在活體內(nèi)進行，而且在哺乳動物(諸如人類)體內(nèi)進行，所述哺乳動物經(jīng)受涉及上皮細胞增殖的癌癥，諸如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤或卵巢癌。
另外的實施例包括殺死靶細胞的方法。這可以通過使靶細胞和與毒素締合的抗體接觸來達到。抗體結(jié)合至肽LEEKKGNY(SEQ ID NO133)。在一個實施例中，抗體對于肽具有大于1.3*10-9M的結(jié)合親和力。在一個實施例中，毒素選自AEFP、MMAE、DM-1和ZAP。在一個實施例中，抗體毒素化合物對靶細胞的毒性是對無肽細胞毒性的10倍多。在一個實施例中，抗體包含選自由抗體13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ IDNO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ ID NO12)、124(SEQID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)的重鏈氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列。在另一個實施例中，抗體經(jīng)肽連接劑或第二抗體與毒素締合。
本發(fā)明另外的實施例包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體，且其包含重鏈氨基酸序列，其包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR2區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR3區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成。
在一個實施例中，抗體為單克隆抗體、嵌合抗體、人類或人源化抗體。在一個實施例中，抗體與醫(yī)藥學上可接受的載劑、稀釋劑和/或治療劑締合。在一個實施例中，所述治療劑為毒素。
在一個實施例中，所述毒素為DM-1或Auristatin E。
也包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體或其片段，而且其包含選自由標識為(SEQ ID)NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的輕鏈氨基酸序列組成的群組的輕鏈氨基酸序列?？贵w可為單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。其可與醫(yī)藥學上可接受的載劑或稀釋劑締合，或與治療劑(諸如毒素，例如DM1或AURISTATIN E)結(jié)合。
在一個實施例中，涵蓋產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞株或轉(zhuǎn)型細胞，該抗體包含選自由標識為(SEQ ID)NO140、19、20、21、29、23、25.26、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的輕鏈氨基酸序列組成的群組的輕鏈氨基酸序列。另外的實施例包括產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞株和包含編碼抗體基因的轉(zhuǎn)型細胞，諸如中國地鼠卵巢細胞。
另一個實施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達相關(guān)聯(lián)的細胞增殖的方法，其包含以有效量的上述抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。該方法在活體內(nèi)進行，而且在哺乳動物(諸如人類)體內(nèi)進行，所述哺乳動物經(jīng)受涉及上皮細胞增殖的癌癥，諸如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤或卵巢癌。
另一個實施例包括結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體，且其包含輕鏈氨基酸序列，其包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，由選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，由選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成。
上段所述的抗體也可包括重鏈氨基酸序列，其包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR2區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR3區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成。
另外的實施例包括一種抑制與EGFRvIII的表達相關(guān)聯(lián)的細胞增殖的方法，其包含以有效量上述抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。該方法在活體內(nèi)進行，而且在哺乳動物(諸如人類)體內(nèi)進行，所述哺乳動物經(jīng)受涉及上皮細胞增殖的癌癥，諸如肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細胞瘤。
另外的實施例包括經(jīng)分離的多聚核苷酸分子，其包含編碼重鏈氨基酸序列的多聚核苷酸序列或其片段，其選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的重鏈氨基酸序列組成的群組，或包含編碼輕鏈氨基酸序列的多聚核苷酸序列或其片段，其選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和33的抗體13.1.2、131、170、150、095、139、250、211、318、342和333的輕鏈氨基酸序列組成的群組。
另外的實施例包括包含容器，含于其中的組合物和表明所述組合物可用于治療以EGFRvIII的表達為特征的癌癥的包裝說明書或標簽的產(chǎn)品，其中所述組合物包含如上文所述的抗體。所述癌癥包括肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細胞瘤。也包括用于檢測哺乳動物組織或細胞中的EGFRvIII來篩選肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌或卵巢癌的檢定試劑盒，其中EGFRvIII為由上皮癌癥表達的抗原，試劑盒包含結(jié)合抗原蛋白質(zhì)的抗體和用于指示抗體與抗原的反應(yīng)的構(gòu)件(如果存在)。所述抗體可為經(jīng)標記的單克隆抗體，或所述抗體可為未經(jīng)標記的第一抗體，且用于指示反應(yīng)的構(gòu)件包含為抗免疫球蛋白的經(jīng)標記第二抗體。結(jié)合抗原的抗體可由選自由螢光染料、酶、放射性核素和不透射線材料組成的群組的標記物來標記。結(jié)合抗原的抗體也可結(jié)合至過量表達的wtEGFR。該試劑盒可供患者選擇臨床使用。
另一個實施例包括特異性識別含有新穎Gly殘基的EGFRvIII表位的抗體。
另一個實施例包括EGFRvIII的變體。所述變體可具有pFLAG插入物，可由SEQID NO56氨基酸組成，且可存在于計算機模擬中。
另一個實施例包括結(jié)合至識別序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO57)的抗體或其變體。
另一個實施例包括特異性結(jié)合至EGFRvIII的抗體變體。所述抗體變體可進一步結(jié)合至包含SEQ ID NO57的肽。抗體變體可具有與肽中的殘基EKNY或EEKGN相互作用的殘基。在一個實施例中，抗體變體結(jié)合至肽序列比其結(jié)合至野生型的EGFR蛋白質(zhì)緊10倍多。在一個實施例中，抗體變體特異性結(jié)合至EGFRvIII和SEQID NO56肽。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有包含深腔的互補決定區(qū)，其中所述腔由重鏈的CDR2和CDR3、輕鏈的CDR3和輕鏈CDR1的一小部分形成。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體在5埃結(jié)合腔中具有殘基31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和223。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有包含淺槽的互補決定區(qū)，其中所述槽由重鏈CDR2和CDR3與輕鏈CDR1、CDR2和CDR3形成。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體在5埃結(jié)合溝槽中具有殘基31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、163-166、172和211-221。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體在5埃結(jié)合溝槽中具有殘基31-33、35、37、55、96-101、148、163、165、170、172、178、217和218。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有一成型互補位，以使得當肽EEKKGN(SEQ IDNO 127)的抗體決定基結(jié)合至抗體的互補位時，在選自由E2和Y172、K3和H31、K4和H31、N6和D33、N6和Y37及N6和K55組成的群組的兩個殘基之間形成至少一個鍵。在一個實施例中，經(jīng)分離的抗體或變體具有一成型互補位，以使得當肽EEKKGNY(SEQ ID NO 131)的抗體決定基結(jié)合至抗體的互補位時，在選自由K4和Q95、K4和Q95、N6和Q98、G5和H31、Y7和H31及Y7和W165組成的群組的兩個殘基之間形成至少一個鍵。在一個實施例中，抗體具有一結(jié)構(gòu)或與計算機模擬中測定的結(jié)構(gòu)相互作用。
另一個實施例提供一種用于選擇以特定結(jié)合特征結(jié)合至EGFRvIII的變體的方法，所述方法包含使用分子結(jié)構(gòu)以形成互補位，使用分子結(jié)構(gòu)以形成表位，計算二者之間的相互作用能并將所述能級與mAb變體的表位和第二互補位的能級相比較，和基于能級差異選擇變體。所述方法可進一步包括使用互補位的第二變體與表位之間的相互作用能來測定第三相互作用能并比較第三相互作用能和第二相互作用能來決定選擇哪個變體。在一個實施例中變體形成并進行結(jié)合測試。
另一個實施例提供一種選擇以特定結(jié)合特征結(jié)合至EGFRvIII的變體的方法，所述方法檢驗與互補位相互作用的表位的殘基，選擇重要殘基以形成識別序列，使用所述序列以形成EGFRvIII變體，并使用所述EGFRvIII變體來選擇mAb變體。
另一個實施例提供一種使抗體變體形成EGFRvIII的方法，所述方法包含分析與互補位相互作用的表位的殘基，選擇表位的較重要殘基以形成識別序列，使用所述識別序列以形成EGFRvIII變體，并使用所述EGFRvIII變體來選擇抗體變體。在一個實施例中，在計算機模擬中達成抗體的選擇。在一個實施例中，通過產(chǎn)生抵抗EGFRvIII變體的抗體來達到經(jīng)使用EGFRvIII變體來選擇抗體。
在一個實施例中，其中經(jīng)分離的抗體變體結(jié)合至EGFRvIII和SEQ ID NO57肽，抗體可進一步包含以下點突變Tyr172Arg、Leu99Glu、Arg101Glu、Leu217Glu、Leu99Asn、Leu99His、L99T、Arg101Asp或其某些組合。在一個實施例中，抗體為單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
在一個實施例中，抗體或其變體結(jié)合至序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO57)，且所述抗體或變體具有次納摩爾結(jié)合能力。
在又一個實施例中，抗體結(jié)合至EGFRvIII且抗體具有結(jié)合至表位的互補位，且表位具有一組與包括E、K、N和Y的互補位相互作用的殘基。在一個實施例中，所述抗體為抗體131。
在又一個實施例中，抗體結(jié)合至EGFRvIII且抗體具有結(jié)合至具有一組與包含E、E、K、G和N的互補位相互作用的殘基的表位的互補位。在一個實施例中，表位的主要結(jié)構(gòu)為EEKKGNY(SEQ ID NO131)。在一個實施例中，抗體為13.1.2。
在又一個實施例中，抗體結(jié)合至EGFRvIII且具有小于1.3*10-9M、小于1.0*10-9M或小于500pM的KD。在一個實施例中，與野生型的EGFR肽相比，抗體對于SEQ ID NO56具有特異性。在一個實施例中，抗體對野生型的EGFR肽(SEQ ID NO134)的非特異性結(jié)合低于抗體對EGFRVIII(SEQ ID NO135)的特異性結(jié)合的10％。在一個實施例中，抗體選自由131、139和13.1.2組成的群組。在一個實施例中，抗體經(jīng)內(nèi)在化。在一個實施例中，至少約70％或至少約80％的抗體都發(fā)生內(nèi)在化。
在一個實施例中，與對于野生型的EGFR蛋白質(zhì)或其變體(SEQ ID NO134)相比，變體人類單克隆抗體優(yōu)先結(jié)合至對于EGFRvIII蛋白質(zhì)實質(zhì)上獨特的表位。
在一個實施例中，變體包含對應(yīng)于典范類1的重鏈互補決定區(qū)(CDR1)。在一個實施例中，變體包含對應(yīng)于典范類3的重鏈互補決定區(qū)(CDR2)。
在一個實施例中，變體包含對應(yīng)于典范類4的輕鏈互補決定區(qū)(CDR1)。
在一個實施例中，變體包含對應(yīng)于典范類1的輕鏈互補決定區(qū)(CDR2)。在一個實施例中，變體包含對應(yīng)于典范類1的輕鏈互補決定區(qū)(CDR3)。在一個實施例中，變體包含對應(yīng)于典范類1的第一重鏈互補決定區(qū)(CDR1)、對應(yīng)于典范類3的第二重鏈互補決定區(qū)(CDR2)、對應(yīng)于典范類4的第一輕鏈互補決定區(qū)(CDR1)、對應(yīng)于典范類1的第二輕鏈互補決定區(qū)(CDR2)和對應(yīng)于典范類1的第三輕鏈互補決定區(qū)(CDR3)，其中形成這些互補決定區(qū)以使得變體可結(jié)合至與對于EGFR蛋白質(zhì)相比，對于EGFRvIII蛋白質(zhì)實質(zhì)上獨特的表位。


圖1為野生型的EGFR和EGFRvIII之間的顯示267氨基酸缺失和G替換的序列比對。
圖2為EGFRvIII PEP3 14-mer肽的設(shè)計圖。在圖2A中，具有氨基酸LEEKK的EGFRvIII的N-末端序列。(SEQ ID NO58)(1-5)與EGFR的N-末端序列相同，繼而為獨特甘氨酸殘基，繼而為與EGFR中的殘基273至280相同的氨基酸。圖2B代表EGFRvIII(6-272)中缺失的EGFR的氨基酸。
圖3A-L提供本發(fā)明抗體的序列。對于每一種所提供的抗體，對于重鏈和輕鏈可變區(qū)均提供多聚核苷酸和氨基酸序列。因此，對于每一種所列抗體提供四個序列。
圖4為13.1.2抗體重鏈區(qū)與特定種系重鏈區(qū)比較的表格，“-”表示雜交瘤重鏈區(qū)的氨基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基來表示。
圖5為13.1.2抗體輕鏈區(qū)與特定種系輕鏈區(qū)比較的表格，“-”表示雜交瘤輕鏈區(qū)的氨基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基來表示。
圖6為各種雜交瘤衍生抗體重鏈區(qū)與特定種系重鏈區(qū)比較的表格，“-”表示雜交瘤重鏈區(qū)的氨基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基來表示。
圖7為各種雜交瘤衍生抗體輕鏈區(qū)與特定種系輕鏈區(qū)比較的表格，“-”表示雜交瘤輕鏈區(qū)的氨基酸殘基與那個特定位置處的種系相同。自種系的偏移由合適的氨基酸殘基來表示。
圖8為顯示重組EGFRvIII mAb與表達EGFRvIII的細胞(NR6細胞)的結(jié)合的代表圖。菱形代表95，三角形代表133，正方形代表139，“x”代表150，星號代表170，圓形代表221，直線代表230，和長方形代表250。
圖9A顯示對于人類抗-EGFR抗體(ABX-EGF)至H80的染色分析。
圖9B顯示對于抗體131至H80的FACS染色分析。
圖9C顯示對于抗體139至H80的FACS染色分析。
圖9D顯示對于抗體13.1.2至H80的FACS染色分析。
圖9E顯示對于ABX-EGF至H1477的FACS染色分析。
圖9F顯示對于抗體131至H1477的FACS染色分析。
圖9G顯示對于抗體139至H1477的FACS染色分析。
圖9H顯示對于抗體13.1.2至H1477的FACS染色分析。
圖9I顯示對于ABX-EGF至A549的FACS染色分析。
圖9J顯示對于抗體131至A549的FACS染色分析。
圖9K顯示對于抗體139至A549的FACS染色分析。
圖9L顯示對于抗體13.1.2至A549的FACS染色分析。
圖9M為展示EGFRvIII mAb與膠質(zhì)母細胞瘤細胞的結(jié)合的曲線圖。
實心三角形代表結(jié)合至H1477的抗體131。實心正方形代表結(jié)合至H1477的抗體13.1.2?？招娜切未斫Y(jié)合至H80的抗體131?？招恼叫未斫Y(jié)合至H80的抗體13.1.2。
圖9N為展示EGFRvIII mAb至人類表皮樣癌細胞株A431的結(jié)合的曲線圖。實心正方形代表抗體13.1.2。實心三角形代表抗體131。
圖9O為展示抗體13.1.2至NR6鼠科成纖維細胞細胞株的結(jié)合的曲線圖。正方形代表NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圓形代表具有EGFRvIII的NR6。
圖9P為展示抗體131至鼠科成纖維細胞細胞株的結(jié)合的曲線圖。正方形代表NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圓形代表具有EGFRvIII的NR6。
圖10A顯示對于人類抗-EGFR抗體(ABX-EGF)結(jié)合至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。
圖10B顯示對于抗體131至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。
圖10C顯示對于抗體139至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。
圖10D顯示對于抗體13.1.2至表達EGFR細胞(A431)的FACS染色分析。
圖11顯示抗體131分子表面的結(jié)構(gòu)模型。將六個CDR遮蔽為不同的陰影以標記它們的邊緣。結(jié)合腔位于接近中心處。
圖12顯示抗體13.1.2分子表面的結(jié)構(gòu)模型。遮蔽六個CDR且由數(shù)字加以識別。長槽大概沿垂直中心線分布。
圖13A是13.1.2抗體和肽EEKKGN(SEQ ID NO127)錯合物的可能擴展模型。CDR區(qū)遮蔽為陰影以指示邊界。
圖13B顯示13.1.2抗體和肽EEKKGN(SEQ ID NO127)錯合物可能擴展模型中的氫鍵。CDR圈和殘基的陰影與圖12中的相同。將肽殘基自圖頂端的N-末端至C-末端編號為1至6。六個氫鍵由虛線指示。形成氫鍵的六對氨基酸為E2...Y172、K3...H31、K4...H31、N6...D33、N6...Y37和N6...K55。
圖14顯示對于所選擴展模型之一的表位-抗體結(jié)合能與Kd的對數(shù)之間的關(guān)聯(lián)的曲線圖。
圖15描繪肽-13.1.2抗體錯合物的精確擴展模型。肽以空格實心形式呈現(xiàn)。
圖16描繪精確擴展模型中的氫鍵。
圖17為描繪抗體-抗原結(jié)合能相對于相對親和力的對數(shù)的線性擬合的曲線圖。
具體實施例方式
如上文所述，EGFRvIII為EGFR的缺失突變體，其中EGFr的細胞外結(jié)構(gòu)域中的267氨基酸缺失，且于連接處以甘氨酸進行單一氨基酸替換。這些特征顯示于圖1中野生型EGFR與EGFRvIII之間的序列比對中。鑒于在缺失的連接處的甘氨酸的氨基酸替換，理論上可能產(chǎn)生針對存在于EGFRvIII中而不存在于野生型的EGFR中的新穎表位的抗體。因此，如圖2中所示，設(shè)計用于免疫和篩選的肽，稱為PEP3(Kuan等人，EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy，Endocr Relat Cancer.8(2)83-96(2001))。這種14-mer肽具有對于EGFRvIII和野生型的EGFR常見的5個n-末端氨基酸，獨特甘氨酸連接位點和野生型的EGFR(對應(yīng)于殘基273-280)與EGFRvIII(對應(yīng)于殘基7-14)之間的保守序列中所含的8個氨基酸殘基。此外，膠質(zhì)母細胞瘤細胞和以基因編碼的EGFRvIII轉(zhuǎn)染的細胞(B300.19細胞)也可用于免疫和篩選(在本文有時稱為B300.19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染子)。
為產(chǎn)生抵抗EGFRvIII的人類抗體，將轉(zhuǎn)基因XenoMouse小鼠以膠質(zhì)母細胞瘤細胞/EGFRvIII、B300.19/EGFRvIII細胞和針對在與野生型的EGFR相比的EGFRvIII中表示的新穎細胞外結(jié)構(gòu)域中的連接區(qū)的肽(PEP3)的組合進行免疫。將來自經(jīng)免疫小鼠中的B細胞分離并用于產(chǎn)生膠質(zhì)母細胞瘤，繼而篩選以結(jié)合至EGFRvIII或使用XenoMaxTM/SLAMTM技術(shù)直接用于篩選以結(jié)合至EGFRvIII(Babcook等人，Anovel strategy for generating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytesproducing antibodies of defined specificities，Proc Natl Acad Sci U S A.93(15)7843-8(1996)和美國專利第5,627,052號)。經(jīng)識別結(jié)合至EGFRvIII的抗體經(jīng)一系列檢定篩選以確定EGFRvIII的特異性識別。經(jīng)過這個過程來產(chǎn)生、分離并表征結(jié)合至EGFRvIII且對EGFRvIII具有特異性的人類單克隆抗體群體。隨后獨特表明表位定位，但重疊了特異性。在活體外進一步評估所有抗體以評估其為了將細胞毒素藥物傳遞到細胞而通過細胞進行內(nèi)在化的能力。表明有效傳遞藥物的抗體與細胞毒素藥物直接結(jié)合，并檢測其殺死活體外和活體內(nèi)表達EGFRvIII的腫瘤細胞的能力。這些研究為用于治療患者癌癥的抗體藥物偶聯(lián)物的下一次產(chǎn)生提供了基礎(chǔ)，這些患者的腫瘤隱藏有特異性基因病變。
通過上述過程產(chǎn)生完全人類抗-EGFRvIII抗體的群體。使用雜交瘤方式，產(chǎn)生對于野生型的EGFR具有有限交叉反應(yīng)性的幾種抗體，包括對用于與PEP3結(jié)合的ELISA呈陽性的抗體13.1、13.2、13.3和13.4。除了這些，選擇抗體13.1(和尤其為它的亞克隆13.1.2)以供進一步研究和發(fā)展。使用XenoMax方式，產(chǎn)生抗體群體，包括抗體131、139、250和095，其對于與pep3寡核苷酸的結(jié)合具有高度特異性，且與野生型的EGFR具有有限的交叉反應(yīng)性。其中，131抗體具有最令人感興趣的特性。在圖4-7中展示每一種抗體的序列(SEQ ID NO1-33和141-144)。對各種抗體的序列和結(jié)合能力進行比較并將結(jié)果展示于圖4-10中。如圖9A-9L和圖10A-10D中可見，與ABX-EGF相比，抗體131、139和13.1.2都表現(xiàn)出對于EGFRvIII表達細胞(H1477)的較佳選擇性。某些結(jié)果顯示于圖9M-9P中的曲線圖中，其表明簡單與EGFRvIII細胞相比，至少兩種抗體13.1.2和131表現(xiàn)出對于EGFRvIII表達細胞的較佳選擇性。最后，基于預(yù)測的結(jié)構(gòu)模型，形成抗體的變體以獲得具有變化結(jié)合特征的抗體。
另外，本發(fā)明抗體對于結(jié)合至相同或類似表位的其它抗體的篩選極為有用。本發(fā)明抗體可用于闡明其它抗體的交叉競爭研究中，預(yù)期其它抗體對于形成的抗原-抗體錯合物的特征具有相同或經(jīng)改良的影響。
每一種對于EGFRvIII具有極高親和力131抗體和13.1.2都通過細胞良好內(nèi)在化，且當結(jié)合至毒素時表現(xiàn)出可高效殺死細胞。令人感興趣的是，不管是否產(chǎn)生于XenoMouse小鼠的不同免疫中，且不管是否使用不同的技術(shù)，兩種抗體都衍生于極為類似的種系基因。然而，基于表位定位操作，每一種抗體似乎結(jié)合至EGFRvIII分子上稍微不同的表位，且具有對于結(jié)合必要的EGFRvIII上稍微不同的殘基。這些結(jié)果表明使用種系基因?qū)τ诙ò蠩GFRvIII的抗體療法的產(chǎn)生尤為重要，且小變化可通過基于這些結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)進一步設(shè)計抗體和其它療法來改良抗體的結(jié)合和影響。
高度需要結(jié)合至相同表位，或競爭與13.1.2和131抗體結(jié)合的抗體。如下文更詳細討論，已通過SPOTs排列的丙氨酸掃描闡明對于特定抗體結(jié)合重要的殘基。因此，也高度需要共享重要結(jié)合殘基的抗體。
定義除非另外定義，本文所用的科學和技術(shù)術(shù)語將具有所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常了解的含義。另外，除非本文另外要求，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)形式且復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)形式。一般而言，本文所述的結(jié)合細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學及蛋白質(zhì)和寡核苷酸或多聚核苷酸化學及雜交的術(shù)語及其技術(shù)是此項技術(shù)中已熟知且通常使用的那些術(shù)語。標準技術(shù)用于重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)型(例如，電擊、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)。根據(jù)生產(chǎn)者的說明或此項技術(shù)中通常實現(xiàn)的或如本文所述進行酶反應(yīng)和純化技術(shù)。通常根據(jù)此項技術(shù)中熟知的常規(guī)方法和如本說明書通篇所引用和討論的各種通用和更詳盡參考文獻中所述來進行前述技術(shù)和程序。參見，例如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。本文所述的關(guān)于分析化學、合成有機化學和藥物及醫(yī)藥化學而使用的術(shù)語及其試驗程序和技術(shù)在此項技術(shù)中已熟知且通常使用。
標準技術(shù)用于化學合成，化學分析，醫(yī)藥制備、調(diào)配和傳遞以及治療患者。
如本文所用的術(shù)語“經(jīng)分離多聚核苷酸”意思是染色體組、cDNA或合成源的多聚核苷酸或其某種組合，由于其來源，“經(jīng)分離多聚核苷酸”(1)與所有或一部分其中“經(jīng)分離多聚核苷酸”在自然界中發(fā)現(xiàn)的多聚核苷酸無關(guān)，(2)可操作性地連接至多聚核苷酸，在自然界中并未連接，或(3)在自然界中并未作為較大序列的部分而發(fā)生。本文中提到的術(shù)語“經(jīng)分離蛋白質(zhì)”是指cDNA、重組RNA或合成源的蛋白質(zhì)或其某種組合，由于其來源或衍生源，“經(jīng)分離蛋白質(zhì)”(1)與自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)無關(guān)，(2)不含來自相同源的其它蛋白質(zhì)，例如，不含鼠科蛋白質(zhì)，(3)由來自不同物種的細胞來表達，或(4)在自然界中并未發(fā)生。
術(shù)語“多肽”在本文中用作一般術(shù)語，是指多肽序列的天然蛋白質(zhì)、片段或類似物。因此，天然蛋白質(zhì)、片段或類似物是多肽類物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的較佳多肽包含人類重鏈免疫球蛋白分子和人類κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包含重鏈免疫球蛋白分子和輕鏈免疫球蛋白分子(諸如κ輕鏈免疫球蛋白分子或λ輕鏈免疫球蛋白分子)的組合形成的抗體分子，且反之亦然，以及其片段和類似物。
如本文所用的應(yīng)用于一種物體上的術(shù)語“天然發(fā)生”是指在自然界中可發(fā)現(xiàn)一種物體的這個事實。例如，存在于可自天然源分離的有機體(包括病毒)中，而且未經(jīng)在實驗室中人為或以其它方式有意改質(zhì)的多肽或多聚核苷酸序列是天然發(fā)生的。
如本文所用的術(shù)語“可操作性連接”是指所述組分的位置處于可允許它們以其所預(yù)期的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。對照序列“可操作連接”至編碼序列是以在與對照序列相容的條件下可達到表達編碼序列的方式加以連接。
本文所用的術(shù)語“對照序列”是指對于實現(xiàn)多聚核苷酸序列所連接的編碼序列的表達和處理有必要的多聚核苷酸序列。這些對照序列的本質(zhì)視其宿主有機體而不同，在原核生物中，這些對照序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，這些對照序列通常包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“對照序列”意味著包括至少其存在對于例如先導序列和融合伙伴序列的表達和處理所必需的所有組分，而且也包括其存在對于例如先導序列和融合伙伴序列有利的其它組分。
本文所提及的術(shù)語“多聚核苷酸”意思是長度至少為10個基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一種核苷酸的改質(zhì)形式。術(shù)語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。
本文提及的術(shù)語“寡核苷酸”包括天然發(fā)生的和由天然發(fā)生與非天然發(fā)生的寡核苷酸連接子連接在一起的改質(zhì)核苷酸。寡核苷酸是通常包含200個基或更少的長度的多聚核苷酸亞組。寡核苷酸優(yōu)選長度為10到60個基，且最優(yōu)長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20到40個基。寡核苷酸通常為單鏈，例如用于探測；盡管寡核苷酸可為雙鏈，例如用于構(gòu)造基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。
本文提及的術(shù)語“天然發(fā)生的核苷酸包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的術(shù)語“改質(zhì)核苷酸”包括含有改質(zhì)或取代糖基的核苷酸及其類似物。本文提及的術(shù)語“寡核苷酸連接子”包括寡核苷酸連接子，諸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷酰胺酯及其類似物。參見，例如LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等人，Nucl.Acids Res.163209(1988)；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design 6539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and AnaloguesAPractical Approach，第87-108頁(F.Eckstein編，Oxford University Press，OxfordEngland(1991))；Stec等人，美國專利第5,151,510號；Uhlmann and Peyman ChemicalReviews 90543(1990)。如果需要，寡核苷酸可包括用于檢測的標記。如本文所用的術(shù)語“變體”為不同于所列舉的多肽和多聚核苷酸的多肽、多聚核苷酸或分子，但只是為了不對蛋白質(zhì)活性造成不利改變?？纱嬖诒砦坏淖凅w。可存在抗體的變體。在優(yōu)選實施例中，蛋白質(zhì)變體結(jié)合至表位的能力未不利改變。在一個實施例中，蛋白質(zhì)變體可以野生型mAb能力的10-500％結(jié)合。例如，蛋白質(zhì)變體可以野生型mAb能力的10％、50％、110％、500％或大于500％結(jié)合。在一個實施例中，包括在10-500％范圍之間的結(jié)合能力。結(jié)合能力可通過多種方式反映，包括(但不限于)變體對表位的ka、kd或KD。在一優(yōu)選實施例中，表位是本說明書中所述的表位。
在一個實施例中，變體抗體可通過替換、缺失或添加5個或更少氨基酸而不同于野生型的序列。這些變體通?？赏ㄟ^改質(zhì)所揭示多肽序列之一，并使用例如本文所述的代表性程序評估經(jīng)改質(zhì)多肽的結(jié)合特性來識別。在另一個實施例中，多肽變體優(yōu)選展示與經(jīng)識別多肽至少約70％、更優(yōu)至少約90％且最優(yōu)至少約95％的同一性。優(yōu)選地，變體只在保守替換和/或改質(zhì)上不同。變體蛋白質(zhì)包括那些與本說明書所述的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上類似和功能相當?shù)牡鞍踪|(zhì)。在另一個實施例中，如果蛋白質(zhì)與本說明書中所述蛋白質(zhì)功能上相當，那么這種蛋白質(zhì)可以是變體，只要變體的互補位與本說明書中所述的互補位類似。在一個實施例中，任何具有與圖11中所述互補位類似形狀的物質(zhì)都是變體。在一個實施例中，任何具有與圖12中所述互補位類似形狀的物質(zhì)都是變體。在一個實施例中，任何具有與圖13A和13B中所述相互作用表面類似形狀的物質(zhì)都是變體。
在一個實施例中，如果核酸序列在嚴格條件下可選擇性地與野生型的序列雜交，那么抗體為變體。在一個實施例中，合適的適度嚴格條件包括在5xSSC溶液中預(yù)洗，0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8:0)；在50℃-65℃下雜交，5xSSC，隔夜或如果為種間同源物，則在45℃下，0.5xSSC；繼而在65℃下以每次含有0.1％SDS的2x、0.5x和0.2xSSC洗滌兩次，歷時20分鐘。這些雜交DNA序列也屬于本發(fā)明的范疇中，由于編碼的簡并性，如核苷酸序列編碼的抗體多肽也由雜交DNA序列所編碼。本文提及的術(shù)語“選擇性雜交”意思是可檢測地且特異性地結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的多聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在將可偵測結(jié)合至非特異性核酸最小化為合適量的雜交和洗滌條件下選擇性與核酸雜交。高度嚴格條件可用于達到如此項技術(shù)中已知且于本文中所討論的選擇性雜交條件。一般而言，本發(fā)明的多聚核苷酸、寡核苷酸和片段與令人感興趣的核酸序列之間的核酸序列同源性至少為80％，且更一般的為優(yōu)選至少85％、90％、95％、99％和100％的增加的同源性。如果在兩種氨基酸序列之間存在部分或完全同一性，那么這兩種氨基酸序列即為同源。例如，85％同源性意思是當兩種序列進行最大匹配比對時，85％的氨基酸一致。在最大化匹配中允許存在間隙(兩種序列的任一種相匹配)；優(yōu)選為5或更少的間隙長度，2或更少更優(yōu)。或者或優(yōu)選地，如本文所用的這個術(shù)語，如果使用含有突變數(shù)據(jù)矩陣和6或更多間隙代價的ALIGN程序，兩種蛋白質(zhì)序列(或自長度為至少30個氨基酸的蛋白質(zhì)中衍生的多肽序列)具有多于5的比對分值，那么它們同源。參見Dayhoff，M.O.，in Atlasof Protein Sequence and Structure，第101-110頁(第5卷，National Biomedical ResearchFoundation(1972))和此卷的第2期增刊，第1-10頁。如果兩種序列或其部分的氨基酸當使用ALIGN程序最佳比對時大于或等于50％一致，那么這兩種序列或其部分更優(yōu)同源。本文所用的術(shù)語“對應(yīng)于”意思是多聚核苷酸序列與參考多聚核苷酸序列同源(即，一致，但非嚴格演化相關(guān))，或多聚核苷酸序列與參考多聚核苷酸序列一致。對比而言，本文所用術(shù)語“互補”意思是互補序列與參考多聚核苷酸序列的全部或一部分同源。例如，核苷酸序列“TATAC”對應(yīng)于參考序列“TATAC”且與參考序列“GTATA”互補。
以下術(shù)語用于描述兩種或兩種以上多聚核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系“參考序列”、“比較窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分率”和“實質(zhì)上一致”。“參考序列”為已確定的序列，用作序列比較的基準；參考序列可為更大序列的亞組，例如，如序列列表中給定的全長cDNA或基因序列的片段，或可包含完整cDNA或基因序列。一般而言，參考序列長度至少為18個核苷酸或6個氨基酸，長度經(jīng)常為至少24個核苷酸或8個氨基酸，且長度通常為至少48個核苷酸或16個氨基酸。由于兩個多聚核苷酸或氨基酸序列可能每一個(1)包含在兩個分子之間類似的序列(即，完整多聚核苷酸或氨基酸序列的一部分)，和(2)可能進一步包含在兩個多聚核苷酸或氨基酸序列之間不同的序列，一般通過經(jīng)“比較窗口”比較兩個分子的序列以識別和比較序列類似的局部區(qū)域來進行兩個(或更多)分子之間的序列比較。如本文所用的“比較窗口”是指至少18個鄰接核苷酸位置或6個氨基酸的概念片段，其中多聚核苷酸序列或氨基酸序列可與至少18個鄰接核苷酸或6個氨基酸序列的參考序列相比較，且其中多聚核苷酸序列在比較窗口中的位置與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含20％或更少的添加、缺失、替換及其類似物(即，間隙)，以供兩個序列的最優(yōu)序列比對。可通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法，通過用于Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988)的類似方法的研究，通過這些算法的計算機執(zhí)行過程(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的TFASTA，(GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks或Mac Vector軟件封裝)，或通過觀測來進行用于比對比較窗口的序列的最優(yōu)序列比對，且選擇由各種方法產(chǎn)生的最佳序列比對(即，導致同源性于比較窗口上的最高百分比)。
術(shù)語“序列一致性”意思是兩個多聚核苷酸或氨基酸序列于比較窗口上一致(即，在核苷酸×核苷酸或殘基×殘基的基礎(chǔ)上)。術(shù)語“序列一致性百分比”通過比較兩個在比較窗口上最優(yōu)比對的序列，測定于兩個序列中發(fā)生一致核酸基(例如，A、T、C、G、U或I)或殘基以產(chǎn)生匹配位置編號的所在位置的編號，將匹配位置的編號除以比較窗口中的位置總數(shù)(即，窗口大小)，且將所得結(jié)果乘以100，以產(chǎn)生序列一致性百分比。如本文所用的術(shù)語“實質(zhì)上一致”表示多聚核苷酸或氨基酸序列的特征，其中與至少18個核苷酸(6個氨基酸)位置的比較窗口上，經(jīng)常于至少24-48個核苷酸(8-16個氨基酸)位置的窗口上的參考序列相比，多聚核苷酸或氨基酸包含至少85％序列一致，優(yōu)選至少90％至95％序列一致，更通常至少99％序列一致的序列，其中通過將參考序列與可能包括比較窗口上總計20％或更少參考序列的缺失或添加的序列相比較來計算序列一致性百分比。參考序列可為更大序列的亞組。與野生型的蛋白質(zhì)或核酸實質(zhì)上一致的氨基酸或核酸為野生型的蛋白質(zhì)或核酸的變體實例。
如本文所用的20種常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。參見Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub and D.R.Gren編，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))。20種常規(guī)氨基酸(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸(諸如α-氨基酸、α-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸)及其它非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體也可以作為用于本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的實例包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙?；嚢彼?、O-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其它類似氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥基脯氨酸)。在本文所用的多肽符號中，根據(jù)標準用途和常規(guī)，左手方向為氨基末端方向，且右手方向為羧基末端方向。
類似地，除非另外指明，單鏈多聚核苷酸序列的左手端為5′端，雙鏈多聚核苷酸序列的左手端稱為5′方向。初生RNA轉(zhuǎn)錄的5′至3′添加的方向稱為轉(zhuǎn)錄方向，具有與RNA相同的序列且為RNA轉(zhuǎn)錄的5′至5′端的DNA鏈上的序列區(qū)域稱為“上游序列”，具有與RNA相同的序列且為RNA轉(zhuǎn)錄的3′至3′端的DNA鏈上的序列區(qū)域稱為“下游序列”。
如應(yīng)用于多肽的術(shù)語“實質(zhì)上一致”意思是當兩個肽序列諸如通過使用默認間隙重量的GAP或BESTFIT程序最優(yōu)比對時，兩個肽序列共享至少80％的序列一致性，優(yōu)選為至少90％的序列一致性，更優(yōu)為至少95％的序列一致性，且最佳為至少99％的序列一致性。優(yōu)選地，非一致的殘基位置通過保守氨基酸替換而不同。保守氨基酸替換是指具有類似側(cè)鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸群組為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸群組為絲氨酸和蘇氨酸；具有含氨化物側(cè)鏈的氨基酸群組為天冬酰胺和谷酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸群組為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸群組為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；且具有含硫側(cè)鏈的氨基酸群組為半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替換基團為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷酰胺。實質(zhì)上一致的多肽可為變體。
變體蛋白質(zhì)也包括具有微小變化的蛋白質(zhì)。如本文所討論，考慮到了本發(fā)明所包含的抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小變化，只要氨基酸序列中的變化保持在至少75％，更優(yōu)至少80％、90％、95％，且最優(yōu)為99％。尤其而言，也考慮到了保守氨基酸的置換。
保守置換為那些發(fā)生于與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中的置換。經(jīng)基因編碼的氨基酸通常分為以下家族(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不帶電極性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)的家族為絲氨酸和蘇氨酸為脂肪族-羥基家族；天冬酰胺和谷酰胺為含氨化物家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸為脂肪族家族，且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸為脂肪族家族。例如，可合理預(yù)期以異亮氨酸或纈氨酸經(jīng)分離置換亮氨酸，以谷氨酸經(jīng)分離置換天冬氨酸，以絲氨酸經(jīng)分離置換蘇氨酸或以結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸經(jīng)分離置換氨基酸的類似置換將不會對所得分子的結(jié)合或特性具有重要影響，尤其如果置換不涉及框架位點內(nèi)部的氨基酸時。氨基酸變化是否導致功能肽可易于通過檢定多肽衍生物的特異性活性來測定。檢定于下文中加以詳述。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可易于制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。優(yōu)選片段或類似物的氨基和羧基-末端發(fā)生于功能結(jié)構(gòu)域的邊緣附近?？赏ㄟ^將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公開或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫相比較來識別結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，使用計算機比較方法來識別發(fā)生于其它已知結(jié)構(gòu)和/或功能地蛋白質(zhì)中的序列基元或預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)型結(jié)構(gòu)域。已知用于識別折疊為已知的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法。Bowie等人，Science 253164(1991)。因此，前述實例表明，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可識別可用于根據(jù)本發(fā)明的抗體界定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的序列基元和結(jié)構(gòu)構(gòu)型。
優(yōu)選氨基酸替換為以下替換(1)減少對蛋白水解作用的敏感性，(2)減少對氧化作用的敏感性，(3)改變供形成蛋白質(zhì)錯合物的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親和力且(5)授予或改質(zhì)這些類似物的其它物理化學或功能特性。類似物可包括除天然發(fā)生的肽序列之外的序列的各種突變蛋白質(zhì)。例如，可在天然發(fā)生的序列(優(yōu)選為形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外部的多肽部分)中進行單一或多重氨基酸替換(優(yōu)選為保守氨基酸替換)。保守重氨基酸替換不應(yīng)實質(zhì)上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如，置換氨基酸不應(yīng)破壞發(fā)生于親本序列中的螺旋體，或干擾表征親本序列的二級結(jié)構(gòu)的其它類型)。在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton編，W.H.Freeman and Company，New York(1984))、Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze編，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))和Thornton等人，Nature 354105(1991)中描述此項技術(shù)識別的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的實例。
如本文所用的術(shù)語“多肽片段”是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失的多肽，但其中殘留的氨基酸序列與自(例如)全長cDNA序列引出的天然發(fā)生的序列中的對應(yīng)位置一致。片段一般為至少5、6、8或10個氨基酸長，優(yōu)選為14個氨基酸長，更優(yōu)為至少20個氨基酸長，通常為至少50個氨基酸長，且甚至更優(yōu)為至少70個氨基酸長。如本文所用的術(shù)語“類似物”是指包含與引出的氨基酸序列的一部分實質(zhì)上一致的至少25個氨基酸片段的多肽。類似物一般為至少20個氨基酸長，優(yōu)選為至少50個氨基酸長且可經(jīng)常長至全長的天然發(fā)生多肽。片段和類似物都是變體形式。
肽類似物通常以類似于模板肽的特性而作為非肽藥物用于醫(yī)藥工業(yè)中。這些類型的非肽化合物稱為“肽的模擬物”和“肽模擬物”，F(xiàn)auchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber and Freidinger TINS，第392頁(1985)和Evans等人，J.Med.Chetn.301229(1987)。通常借助于計算機分子模型來研發(fā)這些化合物。結(jié)構(gòu)類似于治療用肽的肽模擬物可用于產(chǎn)生相當?shù)闹委熁蝾A(yù)防效果。一般而言，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與樣式多肽類似(即，具有生物化學特性或藥理學活性的多肽)，諸如人類抗體，但其中一個或一個以上肽連接子通過此項技術(shù)中熟知的方法視情況由選自由-CH2NH--、--CH2S--、-CH2-CH2--、--CH＝CH--(順式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--組成的群組的連接子所置換。以相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)替換一個或一個以上統(tǒng)一序列的氨基酸(例如，以D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，可由此項技術(shù)中已知的方法產(chǎn)生包含統(tǒng)一序列或?qū)嵸|(zhì)上一致的統(tǒng)一序列變化的限定肽(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992))；例如，通過添加可形成環(huán)化肽的分子內(nèi)雙硫橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基。肽的模擬物和肽模擬物都是變體形式。
“抗體”或“抗體肽”是指完整抗體或其與供特異性結(jié)合的完整抗體競爭的結(jié)合片段。通過重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶分解或化學分解來產(chǎn)生結(jié)合片段。結(jié)合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和單鏈抗體。除“雙特異性”或“雙功能”抗體之外的抗體應(yīng)理解為其每一個結(jié)合位點一致。當過量抗體將結(jié)合至反受體的受體量減少至少約20％、40％、60％或80％，且更通常大于約85％(如由活體外競爭性結(jié)合檢定所測量)時，抗體實質(zhì)上抑制受體粘合至反受體。
術(shù)語“表位”包括任何可特異性結(jié)合至免疫球蛋白或T-細胞受體或否則與分子相互作用的蛋白質(zhì)決定簇。表位簇通常由諸如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈分子的化學活性表面群組組成，且通常具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征以及特異性電荷特征。表位可為“線性”或“構(gòu)型”。在線性表位中，蛋白質(zhì)與相互作用的分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿蛋白質(zhì)的第一氨基酸序列線性發(fā)生。在構(gòu)型表位，相互作用點于彼此分離的蛋白質(zhì)上的氨基酸上交叉發(fā)生。據(jù)說當解離常數(shù)≤1μM，優(yōu)選≤100nM且更優(yōu)≤10nM，且甚至更優(yōu)≤1nM時，抗體特異性結(jié)合抗原。一旦確定抗原上需要的表位，就可能例如使用本發(fā)明所述技術(shù)產(chǎn)生對于那個表位的抗體。或者，在發(fā)現(xiàn)過程中，抗體的產(chǎn)生和特征可闡明所需表位的信息。基于這些信息，隨后可能競爭性地篩選用于結(jié)合至相同表位的抗體。一種達到此目的的方式是進行尋找彼此競爭性結(jié)合的抗體(例如，競爭結(jié)合至抗原的抗體)的交叉競爭研究。一種基于其交叉競爭的用于“結(jié)合”抗體的高產(chǎn)量處理描述于國際專利申請案第WO 03/48731號。如由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的，抗體可特異性結(jié)合至的任何特定物質(zhì)都可以是表位。表位可包含抗體結(jié)合至的那些殘基。在一個實施例中，表位為EGFRvIII表位。在一更優(yōu)實施例中，表位為本說明書實例4中所述的表位。在一個實施例中，表位為實例14中所述的表位。在一個實施例中，表位包含序列LEEKKGNYVVTD(SEQID NO59)。在一個實施例中，表位包含序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO57)。在一個實施例中，表位包含序列EKNY(SEQ ID NO60)。在一個實施例中，表位包含序列EEKGN(SEQ ID NO61)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解到這些實際上不必在單肽上以此順序組合，而這些是形成與互補位相互作用的表位的殘基。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所將了解的，由產(chǎn)生分子形狀的殘基或側(cè)鏈占據(jù)的空間有助于測定表位為何。同樣，與表位相關(guān)的任何官能基、范德華相互作用、側(cè)鏈的移動度等都可測定表位實際上為何。因此，表位也可以包括能量互動。
術(shù)語“互補位”意味著描述測定對于表位的結(jié)合的結(jié)合區(qū)的通用結(jié)構(gòu)。這個結(jié)構(gòu)影響結(jié)合區(qū)是否結(jié)合至表位及其結(jié)合的方式?；パa位可指負責抗體或其片段結(jié)合至表位簇的抗體的抗原位點?；パa位也指抗體的獨特位，和結(jié)合至表位的互補決定區(qū)(CDR)。在一個實施例中，互補位是圖11中的L1 10、L2 30、L3 50、H1 20、H240和H3 60的抗體區(qū)。在一個實施例中，互補位是包含實例16中用于L1、L2、L3、H1、H2和H3的CDR序列的抗體區(qū)。在一個實施例中，互補位是圖12中的L1，110、L2，130、L3，150、H1 120、H2 140和H3 160的抗體區(qū)。在一個實施例中，互補位是包含實例18中用于L1、L2、L3、H1、H2和H3的CDR序列的抗體區(qū)。在一個實施例中，互補位包含實例18中所列的序列。在一個實施例中，互補位包含與表位相互作用的殘基，如圖13A和圖13B中所示。實體黑色結(jié)構(gòu)為肽結(jié)構(gòu)。在一個實施例中，互補位包含13.1.2mAb的殘基Tyr172Arg。在一個實施例中，13.1.2mAb的互補位包含選自由以下各殘基組成的群組的至少一個殘基Tyr172Arg、Arg101Glu、Leu99Asn、Leu99His、Arg101Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、Arg101Gln和Asn35Gly。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所將了解的，任何抗體的互補位或其變體都可由本申請案所陳述的方式來測定。如果殘基預(yù)測可貢獻10％的結(jié)合能，就認為殘基“重要”。在一個實施例中，如果殘基預(yù)測可貢獻2％的結(jié)合能，就認為殘基“重要”。在一個實施例中，如果殘基預(yù)測可貢獻50％的結(jié)合能，就認為殘基“重要”。在一個實施例中，如果殘基預(yù)測與表位表面或互補位表面相互作用，就認為殘基“重要”。在一個實施例中，如果改變殘基導致結(jié)合損失，就認為殘基“重要”。
術(shù)語“特異性”或“優(yōu)先”結(jié)合至，或類似措辭并不意味著表示抗體只可結(jié)合至那個表位。相反，意思是抗體或其變體可結(jié)合至那個表位，其程度比抗體結(jié)合至抗體所暴露的至少一種其它物質(zhì)的程度更高。在一個實施例中，特異性結(jié)合抗體將以比其至EGFR蛋白質(zhì)更大的親和力結(jié)合至EGFRvIII蛋白質(zhì)(更緊，或較低的KD)。例如，特異性結(jié)合抗體的結(jié)合將更緊至少增加1％、1-2％、2-5％、5-10％、10-20％、20-30％、30-50％、50-70％、70-90％、90-120％、120-150％、150-200％、200-300％、300-500％、500-1000％或更多。
氨基酸，編號，氨基酸的縮寫形式，例如Leu217Gln表示編號氨基酸從第一種氨基酸到第二種氨基酸的突變。因此，Tyr172Arg意思是當野生型的蛋白質(zhì)具有172位置的酪氨酸時，突變具有172位置的精氨酸。
本文所用的術(shù)語“藥劑”表示化合物、化合物的混合物、生物高分子或從生物物質(zhì)形成的萃取物。
本文所用的“哺乳動物”指認為是哺乳動物的任何動物。哺乳動物優(yōu)選人類。
含有酶(木瓜蛋白酶)的抗體的消化導致兩種一致的抗原結(jié)合片段，也稱為“Fab”片段和“Fc”片段，其不具有抗原結(jié)合活性，但具有結(jié)晶能力。含有酶(胃蛋白酶)的抗體的消化導致F(ab′)2片段，其中抗體分子的兩臂保持連接，且包含兩個抗原結(jié)合位點。F(ab′)2片段具有交聯(lián)抗原的能力。
本文所用的“Fv”指保持抗原識別和抗原結(jié)合位點的抗體的最小片段。這些片段也可認為是抗體的變體。
本文所用的“Fab”指包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域的抗體片段。
術(shù)語“mAb”指單克隆抗體。
對于XenoMax方法產(chǎn)生的抗體序列的描述編碼如下“AB”-指抗體，“EGFRvIII”-指抗體的結(jié)合特異性，“X”指衍生自小鼠的XenoMouse，“G1”-指IgG1同位型或“G2”-指IgG2同位型，最后三個數(shù)字指抗體自其衍生的單細胞編號，例如AB-EGFRvIII-XG1-095為具有IgG1同位型XenoMouse小鼠對EGFRvIII的結(jié)合特異性的抗體，且細胞編號為95。
術(shù)語“SC”指單細胞，且特定XenoMax方法衍生的抗體可稱為SC，其后緊跟三個數(shù)字，或只有三個數(shù)字，在本文中指抗體衍生的單細胞編號。
對于雜交瘤衍生的抗體序列的描述編碼如下“AB”-指抗體，“EGFRvIII”-指抗體的結(jié)合特異性，“X”指衍生自小鼠的XenoMouse，“G1”-指IgG1同位型或“G2”-指IgG2同位型，“K”指κ，“L”指λ。最后三個數(shù)字指抗體衍生的純系，例如AB-EGFRvIII-XGlK-13.1.2。
本文所用的“標記”或“經(jīng)標記”指對多肽添加的可檢測部分，例如，放射性同位素標記、螢光標記、酶標記、化學發(fā)光標記或生物素基。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I，螢光標記可包括羅丹明(rhodamine)、鑭系磷或FITC，且酶標記可包括辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶。
如本文所用的術(shù)語“醫(yī)藥劑或藥物”指當適當施與患者時可產(chǎn)生理想治療效果的化合物或組合物。如由The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker，S.編，McGraw-Hill，San Francisco(1985))所例示，根據(jù)此項技術(shù)中的常規(guī)用法在本文中使用其它化學術(shù)語。
如本文所用的“實質(zhì)上純”意思是靶物質(zhì)為主要存在的物質(zhì)(即，以摩爾量計，組合物中比任何其它個別物質(zhì)都大量存在)，且優(yōu)選地，實質(zhì)上經(jīng)純化的部分為其中靶物質(zhì)占存在的所有高分子物質(zhì)至少約50％(以摩爾量計)的組合物。一般而言，實質(zhì)上純的組合物將占組合物中存在的所有高分子物質(zhì)的多于約80％，更優(yōu)多于約85％、90％、95％、99％和99.9％。最優(yōu)地，將靶物質(zhì)純化至基本上為均質(zhì)(通過常規(guī)檢測方法檢測不到組合物中的污染物質(zhì))，其中組合物基本上由單高分子物質(zhì)組成。
術(shù)語“患者”包括人類和獸醫(yī)受檢者。
術(shù)語“SLAMTechnology”指“Selected Lymphocyte Antibody Method”(Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996)和Schrader，美國專利第5,627,052號)。
術(shù)語“XenoMaxTM”指SLAM Technology與XenoMouse小鼠的使用(如下文所述)。
抗體結(jié)構(gòu)已知基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含四聚物。每一四聚物由兩對一致的多肽鏈組成，每一對具有一個“輕鏈”(約25kDa)和一個“重鏈”(約50-70kDa)。每一個鏈的氨基-末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)。每一個鏈的羧基-末端部分界定主要負責效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人類輕鏈分類為κ和λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體的同位型分別界定為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈種可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)來連接，其中重鏈也包括約10個或更多個氨基酸的“D”區(qū)。一般參見，F(xiàn)undamentalImmunology第7章(Paul，W.編，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))。每一輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點。
因此，完整抗體具有兩個結(jié)合位點。除了雙功能或雙特異性抗體之外，兩個結(jié)合位點相同。
這些鏈都展示由三個高變區(qū)連接的相對保守的框架區(qū)(FR)相同的通用結(jié)構(gòu)，也稱為互補決定區(qū)或CDR。每一對兩個鏈的CDR通過框架區(qū)比對，使得可結(jié)合至特異性表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4結(jié)構(gòu)域。每一結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配是根據(jù)Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk J.Mol.Biol 196901-917(1987)；Chothia等人，Nature342878-883(1989)中的定義。
雙特異性或雙功能抗體是具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結(jié)合位點的人造雜交抗體。雙特異性抗體可通過多種包括雜交瘤的融合和Fab′片段的連接的方法來產(chǎn)生。參見例如Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny等人，J.Immunol.1481547-1553(1992)。雙特異性抗體的產(chǎn)生與常規(guī)抗體的產(chǎn)生相比可為相對勞動密集型的工藝，而且雙特異性抗體的產(chǎn)量和純度通常較低。雙特異性抗體不以具有單結(jié)合位點片段的形式存在(例如，F(xiàn)ab、Fab′和Fv)。除了抗體的通用結(jié)構(gòu)方面之外，互補位和表位之間的更特異相互作用可通過結(jié)構(gòu)方式來檢驗。在一個實施例中，CDR結(jié)構(gòu)形成互補位，抗體經(jīng)其可結(jié)合至表位。這種互補位的結(jié)構(gòu)可通過多種方式來測定?？墒褂脗鹘y(tǒng)的結(jié)構(gòu)檢驗方法，諸如NMR或x-射線晶體學。這些方法可檢驗單獨互補位，或當其結(jié)合至表位時的結(jié)構(gòu)?；蛘撸肿幽Ｐ涂稍谟嬎銠C模擬中產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)可借助于市售的封裝，諸如Accelrys(San Diego，CA)的InsightII模型封裝，通過同源模型產(chǎn)生。簡而言之，可利用檢驗抗體序列來尋求已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫，諸如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)。在識別具有已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)之后，這些同源蛋白質(zhì)可用作模型模板。每一種可能模板可經(jīng)比對，由此產(chǎn)生這些模板中基于結(jié)構(gòu)的序列比對。隨后可將具有未知結(jié)構(gòu)的抗體序列與這些模板比對以產(chǎn)生具有未知結(jié)構(gòu)抗體的分子模型。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，存在多種在計算機模擬中產(chǎn)生所述結(jié)構(gòu)的替代方法，可使用其中任何一種。例如，可使用類似于Hardman等人，頒布的采用QUANTA(PolygenCorp.，Waltham，Mass.)和CHARM(Brooks，B.R.，Bruccoleri，R.E.，Olafson，B.D.，States，D.J.，Swaminathan，S.和Karplus，M.，1983，J.Comp.Chem，.4187)的美國專利第U.S.Pat.No.5,958,708號中所述工藝的工藝。
不但互補位的形狀對于測定可能互補位是否結(jié)合至表位及其良好程度很重要，而且表位和互補位之間的相互作用本身是設(shè)計變體抗體的大量信息來源。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，存在多種研究這種相互作用的方式。一種方式是使用可能如上文所述產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)模型，且隨后使用諸如InsightII(Accelrys，San Diego，CA)的程序，其具有一個可對互補位和其表位之間的構(gòu)型和定位空間進行Monte Carlo研究的擴展模塊。結(jié)果是可評估表位和互補位相互作用的地點和方式。在一個實施例中，只有表位的片段或變體用于協(xié)助測定相關(guān)的相互作用。在一個實施例中，整個表位用于互補位和表位之間相互作用的建模。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，這兩種不同方法具有不同的優(yōu)點和不足。例如，僅使用表位片段使得可對每一側(cè)鏈的可能變體進行更為詳盡的檢驗，而無需耗費大量時間。另一方面，通過僅使用表位片段，或僅使用表位代替整個蛋白質(zhì)，表位片段的特征與整個表位的特征可能不同，因此可能增加在計算建模過程中誤導的風險。在一個實施例中，以有限程度使用兩種方法以交叉檢查結(jié)果。在一優(yōu)選實施例中，如果使用表位變體，可最優(yōu)化以便表位變體包含表位的最重要殘基。最重要殘基的一致性可通過多種方式測定，例如如本發(fā)明實例4和14中所述。
通過使用這些產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)，可測定哪些殘基在表位和互補位之間的相互作用中最重要。因此，在一個實施例中，可易于選擇改變哪些殘基來改變抗體的結(jié)合特征。例如，從擴展模型顯而易見，表位中某些殘基的側(cè)鏈可在空間上阻止表位的結(jié)合，由此將這些殘基改變?yōu)榫哂休^小側(cè)鏈一致的殘基。
這可以多種方式來測定。例如，只需觀察兩個模型來評估基于官能基和鄰近基團的相互作用?；蛘撸缟衔乃?，可進行表位和互補位的重復(fù)組對，以獲得更為有利的能量相互作用。也可測定多種抗體變體的這些相互作用來測定其中抗體可結(jié)合至表位的替代方式。也可將各種模型組合來測定如何改變抗體結(jié)構(gòu)來獲得具有所需特定特征的抗體。
上述測定的模型可通過各種技術(shù)來測試。例如，相互作用能可由上文討論的程序來測定以決定需進一步檢驗?zāi)姆N變體。又，使用庫侖和范德華相互作用來測定表位和變體互補位的相互作用能。也使用針對突變的位點來觀察抗體結(jié)構(gòu)中的預(yù)定變化實際上是否可導致結(jié)合特征的所需變化?；蛘?，可改變表位來證實模型正確或用于測定可能在互補位和表位之間發(fā)生的一般結(jié)合主題。
上述用于建模結(jié)構(gòu)的方法可用于測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的何種變化將導致抗體的特定所需特征。這些方法可用于測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的何種變化不會導致抗體的所需特征。
如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，盡管這些模型將為形成本發(fā)明的抗體及其變體提供必要的向?qū)В孕枰M行計算機模擬模型中的常規(guī)測試，可能通過活體外研究。此外，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，任何改質(zhì)也會對抗體活性具有另外的副效應(yīng)。例如，盡管預(yù)期導致更大結(jié)合的改變可引起更大的結(jié)合，也可引起其它會減少或改變抗體活性的結(jié)構(gòu)變化。對于是否為這種情況的測定在所屬領(lǐng)域中很常見，而且可通過多種方式來進行測定。例如，如實例21中，活性可通過ELISA測試來測試?；蛘?，可以通過使用表面等離子體共振裝置來測試樣品。
抗體結(jié)合和供優(yōu)良結(jié)合的變體抗體在一個實施例中，上述模型用于增加抗體對其表位的結(jié)合能力?？贵w可更易于結(jié)合至表位，且因此具有較高的締合常數(shù)(ka)?；蛘撸贵w可較慢自表位離解，且因此具有較低的離解常數(shù)(KD)，或表位-互補位的KD值較小，因此使得表位和互補位之間的結(jié)合程度更高。
在某些實施例中，設(shè)計變體抗體以相反特征結(jié)合。即，抗體不緊密結(jié)合或可能不快速結(jié)合。
在其它實施例中，變體抗體的KD與野生型的抗體不同，但變體抗體對于特定表位更具特異性。這意味著經(jīng)設(shè)計抗體的互補位具有較低結(jié)合至其它表位的風險?？贵w可具有已改變的其它特征。例如，變體對非特異性抗體結(jié)合更具免疫性，或即使當抗體以高濃度存在時，在溶液中仍保持溶劑化。這種變體可存在于所討論的抗體中。例如，盡管下文檢驗的某些變體抗體的較高濃度導致了Biacore實驗中較慢的結(jié)合組分(例如，13.1.2mAb)，但某些變體即使在相同濃度下仍不展示所述較慢組分，例如L217N-2.1?？尚纬捎缮衔臏y定的模型預(yù)測的變體，且隨后經(jīng)測試來測定其實際上是否以所需特征結(jié)合?？蛇x擇與表位具有較大總相互作用能的突變體以供進一步測試。相互作用能可以多種方式測定，其中之一如上文所述。
這些變體可以多種方式測試。示范性的選擇包括，而且不限于KinExA(例如，Lackie頒布的專利第5,372,783號，1994年12月13日)(Sapidyne Instruments Inc.，ID，Boise)、表面等離子體共振(SPR)(e.g.，BIACORETMBiacore，Inc.，Pistcataway，N.J.)、停流螢光、共振鏡和螢光偏振。許多這些選擇不但可以記錄數(shù)據(jù)，而且可以提供用于將數(shù)據(jù)擬合為各種理論曲線并由此測定ka、kd和KD以及其它特性的現(xiàn)成構(gòu)件。重要的是，應(yīng)注意到這些曲線擬合為結(jié)果數(shù)據(jù)并不排除存在一些偏差的可能性。因此，相關(guān)的締合、離解和平衡常數(shù)不但可以通過這些曲線擬合機理來觀察，也可以根據(jù)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的知識直接相互比較。
人類抗體和抗體的人源化人類抗體避免了與具有鼠科或大鼠可變和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的問題。這些鼠科或大鼠衍生蛋白質(zhì)的存在可導致抗體的快速清除或可導致抵抗患者體內(nèi)抗體的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。為避免使用鼠科或大鼠衍生抗體，可通過將人類抗體功能引入嚙齒動物以便于嚙齒動物產(chǎn)生完全人類抗體來產(chǎn)生完全人類抗體。
克隆和重構(gòu)YAC中兆堿基尺寸的人類基因座及將其引入小鼠種系的能力為說明極大或經(jīng)原始映射的基因座的功能組分以及產(chǎn)生人類疾病的有用模型提供了有力途徑。此外，使用這種技術(shù)將小鼠基因座替換為其人類等效物可為發(fā)育期間的人類基因產(chǎn)物的表達和調(diào)節(jié)、它們與其它系統(tǒng)的信息傳遞及其在疾病誘發(fā)和進展中的關(guān)聯(lián)提供獨特見解。
這種策略的重要實際應(yīng)用是小鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內(nèi)源Ig基因已失活的小鼠中提供機會來研究抗體的程序化表達和組合及其在B-細胞發(fā)育中的作用中的潛在機理。此外，這種策略可為產(chǎn)生完全人類單克隆抗體(mAb)-一種在人類疾病種實現(xiàn)抗體治療前景的重要里程碑提供理想來源。預(yù)期完全人類抗體可將免疫和過敏反應(yīng)本質(zhì)最小化為小鼠或小鼠衍生mAb，且因此增加了經(jīng)投予抗體的功效和安全性。使用完全人類抗體預(yù)期可為治療慢性和復(fù)發(fā)性人類疾病提供實質(zhì)好處，諸如炎癥、自身免疫力和癌癥，這些都需要反復(fù)投予抗體。
一種針對這個目的的方法是設(shè)計不足以用于具有人類Ig基因座大片段的小鼠抗體生產(chǎn)的小鼠品系，以預(yù)期這些小鼠可在無小鼠抗體的情況下產(chǎn)生人類抗體的大指令系統(tǒng)。大的人類Ig片段可保持大的可變基因多樣性以及對抗體生產(chǎn)和表達的合適調(diào)節(jié)。通過采用用于抗體多樣化和選擇的小鼠工具和對于人類蛋白質(zhì)免疫耐受性的缺乏，這些小鼠品系中再現(xiàn)的人類抗體指令系統(tǒng)應(yīng)產(chǎn)生對于任何感興趣的抗原(包括人類抗原)都具有高親和力的抗體。使用雜交瘤技術(shù)，可易于生產(chǎn)和選擇具有所需特異性的抗原-特異性人類mAb。如1994年所公開的，結(jié)合第一代XenoMouse品系表明這種一般策略(參見Green等人，Nature Genetics 713-21(1994))。XenoMouse品系設(shè)計為具有分別含有人類重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245kb和190kb大小的種系構(gòu)型片段的酵母人工染色體(YAC)，其含有核可變核恒定區(qū)序列Id。含有YAC的人類Ig經(jīng)證明與供抗體重排和表達的小鼠系統(tǒng)相容且可替換為失活的小鼠Ig基因。這可由其誘發(fā)B-細胞發(fā)育、產(chǎn)生完全人類抗體的類似成人的人類指令系統(tǒng)和產(chǎn)生抗原-特異性人類mAb能力來證實。這些結(jié)果也表明，引入含有較大編號V基因的人類Ig基因座的較大部分、另外的調(diào)節(jié)元素和人類Ig恒定區(qū)可實質(zhì)上概括完整指令系統(tǒng)，其以對于感染和免疫的人類體液反應(yīng)為特征。Green等人的著作最近由引入大于約80％的人類抗體指令系統(tǒng)擴展至分別引入兆堿基大小的人類重鏈基因座和κ輕鏈基因座的種系構(gòu)型YAC片段。參見Mendez等人，NatureGenetics 15146-156(1997)和美國專利申請案第08/759,620號，申請于1996年12月3日。
XenoMouse小鼠的產(chǎn)生于以下專利中進一步討論和敘述美國專利申請案第07/466,008號，申請于1990年1月12日；第07/610,515號，申請于1990年11月8日；第07/919,297號，申請于1992年7月24日，第07/922,649號，申請于1992年7月30日；第08/031,801號，申請于1993年3月15日；第08/112,848號，中請于1993年8月27日；第08/234,145號，申請于1994年4月28日；第08/376,279號，申請于1995年1月20日；第08/430,938號，申請于1995年4月27日；第08/464,584號，申請于1995年6月5日；第08/464,582號，申請于1995年6月5日；第08/463,191號，申請于1995年6月5日；第08/462,837號，申請于1995年6月5日；第08/486,853號，申請于1995年6月5日；第08/486,857號，申請于1995年6月5日；第08/486,859號，申請于1995年6月5日；第08/462,513號，申請于1995年6月5日；第08/724,752號，申請于1996年10月2日和第08/759,620號，申請于1996年12月3日和美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號和第5,939,598號和日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號和第3 068 507 B2號。也可參見Mendez等人，Nature Genetics 15146-156(1997)和Green and Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)。
也可參見歐洲專利第EP 0 463 151 B1號，于1996年6月12日授權(quán)公開，國際專利申請案第WO 94/02602號，于1994年2月3日公開，國際專利申請案第WO96/34096號，于1996年10月31日公開，第WO 98/24893號，于1998年6月11日公開，第WO 00/76310號，于2000年12月21日公開，第WO 03/47336號。在另一種方法中，其它公司，包括GenPharm International公司已使用“微基因座”方法。在微基因座方法中，外源Ig基因座通過包含來自Ig基因座的物質(zhì)(個別基因)來模仿。因此，一種或一種以上VH基因、一種或一種以上DH基因、一種或一種以上JH基因、μ恒定區(qū)和第二恒定區(qū)(優(yōu)選為γ恒定區(qū))形成為用于插入動物體內(nèi)的構(gòu)造。這種方法描述于以下專利中Surani等人的美國專利第5,545,807號和每一專利都屬于Lonberg和Kay的美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號和第6,255,458號，Krimpenfort和Berns的美國專利第5,591,669號和第6,023.010號，Berns等人的美國專利第5,612,205號、第5,721,367號和5,789,215號，及Choi和Dunnand的美國專利第5,643,763號，以及GenPharm International美國專利申請案第07/574,748號，申請于1990年8月29日、第07/575,962號，申請于1990年8月31日、第07/810,279號，申請于1991年12月17日、第07/853,408號，申請于1992年3月18日、第07/904,068號，申請于1992年6月23日、第07/990,860號，申請于1992年12月16日、第08/053,131號，申請于1993年4月26日、第08/096,762號，申請于1993年7月22日、第08/155,301號，申請于1993年11月18日、第08/161,739號，申請于1993年12月3日、第08/165,699號，申請于1993年12月10日、第08/209,741號，申請于1994年3月9日。也可參見歐洲專利第0 546 073 B1號，國際專利申請案WO 92/03918、WO92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884及美國專利第5,981,175號。進一步參見Taylor等人，1992年；Chen等人，1993年；Tuaillon等人，1993年；Choi等人，1993年；Lonberg等人，(1994)；Taylor等人，(1994)和Tuaillon等人，(1995)；Fishwild等人，(1996)。
Kirin也已表明自小鼠中產(chǎn)生人類抗體，其中已通過微細胞融合引入大片染色體或整個染色體。參見歐洲專利申請案第773 288號和第843 961號。XenerexBiosciences正在研發(fā)一種用于潛在產(chǎn)生人類抗體的技術(shù)。在這種技術(shù)中，以人類淋巴細胞(例如，B和/或T細胞)重新構(gòu)成SCID小鼠。小鼠隨后經(jīng)抗原免疫，且可產(chǎn)生對抗抗原的免疫反應(yīng)。參見美國專利第5,476,996號、第5,698,767號和第5,958,765號。
人類抗-小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)已將工業(yè)生產(chǎn)導向制備嵌合或其它人源化抗體。盡管嵌合抗體具有人類恒定區(qū)和鼠科可變區(qū)，仍希望可觀察到某些人類抗-嵌合抗體(HACA)反應(yīng)，尤其在抗體的慢性或多-劑量使用中。因此，為了使HAMA或HACA反應(yīng)的考慮和/或影響失效，仍希望提供對抗EGFRvIII的完整人類抗體。抗體治療如本文所述，EGFRvIII抗體的功能似乎對其操作模式的至少一部分很重要。例如，就功能而言，意思是EGFRvIII抗體在以EGFRvIII操作中的活性。因此，在某些方面，希望結(jié)合作為對抗EGFRvIII的治療候選物的抗體的產(chǎn)生，抗體可固定補充物并補充細胞毒性淋巴細胞，由此參與到CDC和ADCC中。存在多種具有相同功能的抗體同位型，包括(但不限于)以下鼠科IgM、鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、人類IgM、人類IgG1、人類IgG3和人類IgA。又，希望結(jié)合作為對抗EGFRvIII的治療候選物的抗體的產(chǎn)生，抗體可通過Fc受體接合于諸如自然殺手(NK)細胞的效應(yīng)細胞來活化依賴抗體介導的細胞毒反應(yīng)(ADCC)。存在多種可ADCC的抗體同位型，包括(但不限于)以下鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、人類IgG1和人類IgG3。應(yīng)了解，產(chǎn)生的抗體不必一開始就具有這種同位型，但是相反地，產(chǎn)生的抗體可具有任何同位型且抗體可為隨后使用此項技術(shù)中熟知的常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)換的同位型。這些技術(shù)包括使用直接重組技術(shù)(例如，參見美國專利第4,816,397號)和細胞-細胞融合技術(shù)(例如，參見美國專利第5,916,771號和第6,207,418號)。
在細胞-細胞技術(shù)中，制備具有含有任何所需同位型的重鏈的骨髓瘤或其它細胞株和另一種具有輕鏈的骨髓瘤或其它細胞株。隨后這些細胞可經(jīng)融合，且可分離表達細胞株的完整抗體。
例如，本文討論的某些抗-EGFRvIII抗體為人類抗-EGFRvIII IgG1抗體。如果這種抗體具有對EGFRvIII分子的所需結(jié)合，同位型應(yīng)易于轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生人類IgM、人類IgG3或人類IgGA，盡管仍具有相同的可變區(qū)(其界定了抗體的特異性及其某些親和力)。這些分子(包括IgG1)隨后將可固定補充物并參與CDC，且如果包含IgG1或IgG3恒定區(qū)，這些分子也將可通過補充細胞毒性淋巴細胞參與依賴抗體介導的細胞毒反應(yīng)(ADCC)。
因此，由于產(chǎn)生了達到上文所述所需“結(jié)構(gòu)”屬性的抗體候選物，因此，其通常通過同位型轉(zhuǎn)換可具有至少某些所需“功能”屬性。其它治療的設(shè)計和產(chǎn)生基于本文中關(guān)于EGFRvIII產(chǎn)生和表征的抗體活性，促進了除抗體部分之外的其它治療形態(tài)的設(shè)計。
這些形態(tài)包括(但不限于)高級抗體療法(諸如雙特異性抗體、免疫毒素和放射性同位素標記的療法)、肽療法的產(chǎn)生、基因療法，尤其為內(nèi)抗體、抗致敏療法和小分子。
例如，結(jié)合高級抗體療法的產(chǎn)生，其中補充物固定和細胞毒性淋巴細胞的補充為理想屬性，可能通過使用雙特異性、免疫毒素或放射性同位素標記來增強細胞殺死。
例如，結(jié)合雙特異性抗體，可產(chǎn)生包含以下的雙特異性抗體(i)兩種抗體，一種具有對EGFRvIII的特異性且另一種具有對結(jié)合在一起的第二種分子的特異性；(ii)一條鏈對EGFRvIII具有特異性且第二條鏈對第二種分子具有特異性的單抗體；或(iii)對于EGFRvIII和另一種分子具有特異性的單鏈抗體。這些雙特異性抗體可使用熟知技術(shù)產(chǎn)生，例如，結(jié)合(i)和(ii)，例如參見Immunol Methods 472-81(1994)和上述的Wright and Harris，及結(jié)合(iii)，例如參見Traunecker等人，Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992)。在每一種情況下，第二種特異性可賦予Fc鏈活化受體，包括(但不限于)CD16或CD64(例如參見，Deo等人，18127(1997))、CD3(Micromet′sBiTE技術(shù))或CD89(例如參見，Valerius等人，Blood 904485-4492(1997))。根據(jù)前述制備的雙特異性抗體可能殺死表達EGFRvIII的細胞，且尤其是其中本發(fā)明的EGFRvIII抗體有效的那些細胞。
結(jié)合免疫毒素，抗體可使用此項技術(shù)中熟知的技術(shù)改質(zhì)而作為免疫毒素。
例如參見Vitetta Immunol Today 14252(1993)。也例如參見美國專利第5,194,594號。結(jié)合制備放射性同位素標記的抗體，這些經(jīng)改質(zhì)抗體也可易于使用此項技術(shù)中熟知的技術(shù)來制備。例如參見Junghans等人，Cancer Chemotherapy andBiotherapy 655-686中(第2版，Chafner and Longo編，Lippincott Raven(1996))。也參見美國專利第4,681,581號、第4,735,210號、第5,101,827號、第5,102,990號(RE35,500)、第5,648,471號和第5,697,902號。每一種免疫毒素和放射性同位素標記的分子都可能殺死表達EGFRvIII的細胞，且尤其是其中本文所述抗體有效的那些細胞。
可設(shè)計抗體更快速結(jié)合，或更慢自表位離解，且因此可將抗體本身設(shè)計為治療劑。例如，抗體的經(jīng)改變特征可用于對患者投予治療劑。治療免疫偶聯(lián)物如所了解的，與藥物、毒素或其它分子(免疫偶聯(lián)物或免疫毒素)結(jié)合的抗體在定靶殺死表達可通過特異性結(jié)合分子(諸如抗體)特異性結(jié)合的分子的細胞中極為有用。如上文所述，尚未已知在任何正常組織上表達過EGFRvIII。此外，EGFRvIII顯示顯著表達于多種人類腫瘤中。因此，EGFRvIII是用于以免疫毒素定靶的最受矚目的分子。
已出現(xiàn)許多關(guān)于試圖特異性定靶具有單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物的腫瘤細胞的報導(Sela等人，Immunoconjugates 189-216中(C.Vogel，ed.1987)；Ghose等人，TargetedDrugs 1-22中(E.Goldberg編，1983年)；Diener等人，Antibody Mediated DeliverySystems 1-23中(J.Rodwell編，1988年)；Pietersz等人，Antibody Mediated DeliverySystems 25-53中(J.Rodwell編，1988年)；Bumol等人，Antibody Mediated DeliverySystems 55-79中(J.Rodwell編，1988年))。細胞毒素藥物，諸如氨甲喋呤、柔紅霉素、阿霉素、長春新堿、長春堿、美法侖(melphalan)、絲裂霉素C和苯丁酸氮芥已與多種鼠科單克隆看體結(jié)合。在某些情況下，通過中間體載劑分子將藥物分子連接至抗體分子，這些中間體載劑分子諸如血白蛋白(Garnett等人，Cancer Res.462407-2412(1986)；Ohkawa等人，Cancer Immumol.Immunother.2381-86(1986)；Endo等人，Cancer Res.471076-1080(1980))、右旋糖酐(Hurwitz等人，Appl.Biochem.225-35(1980)；Manabi等人，Biochem.Pharmacol.34289-291(1985)；Dillman等人，Cancer Res.464886-4891(1986)；Shoval等人，Proc.Natl.Acad.Sci.858276-8280(1988))或多聚谷氨酸(Tsukada等人，J.Natl.Canc.Inst.73721-729(1984)；Kato等人，J.Med.Chem.271602-1607(1984)；Tsukada等人，Br.J.Cancer 52111-116(1985))。
已采用多種連接子技術(shù)以用于制備這些免疫偶聯(lián)物，且已研究了可離解和不可離解連接子。然而，在大部分情況下，如果藥物分子可從在定靶位點為非改質(zhì)形式的偶聯(lián)物釋放出來，就只能觀察到藥物的完全細胞毒性潛能。
已用于制備抗體-藥物偶聯(lián)物的可離解連接子之一為基于順-丙烯三羧酸的酸-不穩(wěn)定連接子，其利用不同細胞內(nèi)間隔的酸性環(huán)境，諸如在受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用中遇到的內(nèi)體和溶酶體。Shen和Ryser引入這種方法來制備柔紅霉素與大分子載劑的偶聯(lián)物(Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048-1054(1981))。Yang和Reisfeld使用相同技術(shù)將柔紅霉素偶聯(lián)至抗-黑素瘤抗體(J.Natl.Canc.Inst.801154-1159(1988))。近來，Dillman等人也使用酸不穩(wěn)定連接子以類似方式制備柔紅霉素與抗-T細胞抗體的偶聯(lián)物(Cancer Res.486097-6102(1988))。
由Trouet等人研究的另一種方法涉及將柔紅霉素經(jīng)肽空間臂連接至抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.79626-629(1982))。這是在通過溶菌酶肽酶的作用無藥物從這種偶聯(lián)物中釋放出來的前提下進行的。
然而，在活體外細胞毒性測試中已揭示，抗體-藥物偶聯(lián)物很少達到與自由非偶聯(lián)藥物相同的細胞毒性效能。這表明，藥物分子從抗體釋放出來的機理效率很差。在免疫毒素的范圍內(nèi)，經(jīng)單克隆抗體與催化活性蛋白質(zhì)毒素之間的雙硫橋形成的偶聯(lián)物顯示比含有其它連接子的偶聯(lián)物更具細胞毒性。參見，Lambert等人，J.Biol.Chem.26012035-12041(1985)；Lambert等人，Immunotoxins 175-209中(A.Frankel編，1988)；Ghetie等人，Cancer Res.482610-2617(1988)。這歸因于對抗體分子與毒素之間的雙硫鍵的有效離解有利的谷胱甘肽的高細胞內(nèi)濃度。盡管如此，僅有少量關(guān)于使用雙硫橋制備藥物和大分子之間的偶聯(lián)物的報導實例。Shen等人描述了氨甲喋呤轉(zhuǎn)化為巰乙基酰胺衍生物，繼而經(jīng)雙硫鍵與聚-D-賴氨酸偶聯(lián)(J.Biol.Chem.26010905-10908(1985))。此外，一報導描述了含三硫化物的毒素藥物刺孢霉素與抗體的偶聯(lián)物的制備(Menendez等人，F(xiàn)ourth International Conference on MonoclonalAntibody Immunoconjugates for Cancer，San Diego，Abstract 81(1989))。另一報導描述了含三硫化物的毒素藥物刺孢霉素與抗體的偶聯(lián)物的制備(Hinman等人，53Cancer Res.3336-3342(1993))。
缺少二硫化物連接的抗體-藥物偶聯(lián)物的一個原因是帶有含有可易于用于將藥物經(jīng)二硫化物橋連接至抗體的部分的硫原子的細胞毒素藥物的不可利用性。此外，現(xiàn)存藥物在其細胞毒性潛能不減少的情況下，其難于進行化學改質(zhì)。
現(xiàn)存抗體-藥物偶聯(lián)物的另一主要不足在于因為有限數(shù)目的定靶抗原及靜止癌藥物(如氨甲喋呤、柔紅霉素和長春新堿)的相對適度細胞毒性，其不能將足夠濃度的藥物傳遞到定靶位點。為了達到顯著的細胞毒性，有必要將大量的藥物分子直接或通過聚合載劑分子連接至抗體。然而，這些高度改質(zhì)的抗體通常展示出對于定靶抗原削弱的結(jié)合且快速從血流中活體內(nèi)清除。
Maytansinoid為高度細胞毒素藥物。美登素首先由Kupchan等人自東非灌木齒葉美登木中分離，且其顯示比常規(guī)癌癥化學治療劑(如氨甲喋呤、柔紅霉素和長春新堿)大100到1000倍的細胞毒性(美國專利第3,896,111號)。后來發(fā)現(xiàn)某些微生物也產(chǎn)生maytansinoid，諸如異戊酸美登素酯和異戊酸美登素酯的C-3酯(美國專利第4,151,042號)。也已報導異戊酸美登素酯的合成C-3酯和異戊酸美登素酯的類似物(Kupchan等人，J.Med.Chem.2131-37(1978)；Higashide等人，Nature270721-722(1977)；Kawai等人，Chem.Pharm.Bull.323441-3451(1984))。C-3酯由其制備的異戊酸美登素酯的類似物的實例包括芳族環(huán)上(例如，脫氯)或在C-9、C-14(例如，羥基化甲基)、C-15、C-18、C-20和C-4,5處經(jīng)改質(zhì)的異戊酸美登素酯。
天然發(fā)生和合成C-3酯可分為兩個群組(a)具有簡單羧酸的C-3酯(美國專利第4,248,870號、第4,265,814號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,317,821號、第4,322,348號和第4,331,598號)和(b)具有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯(美國專利第4,137,230號、第4,260,608號、第5,208,020號和Chem.Pharm.Bull.123441(1984))。
發(fā)現(xiàn)群組(b)的酯的細胞毒性比群組(a)的酯的細胞毒性大得多。
美登素為有絲分裂抑制劑。已報導以美登素活體內(nèi)處理L1210細胞導致67％的細胞聚集于有絲分裂中。已報導未經(jīng)處理的比對細胞顯示3.2％至5.8％之間的有絲分裂指數(shù)(Sieber等人，43 Comparative Leukemia Research 1975，Bibl.Haemat.495-500(1976))。海膽卵和蛤蜊卵的實驗已表明，美登素通過抑制微管蛋白質(zhì)(微管蛋白)的聚合干擾微管形成來抑制有絲分裂(Remillard等人，Science1891002-1005(1975))。
活體外，已發(fā)現(xiàn)以10-3至10-1μg/μl劑量的美登素即可抑制P388、L1210和LY5178鼠科白血病細胞懸浮液，其中P388細胞株最敏感。也已顯示美登素是人類鼻咽癌細胞活體外生長的活性抑制劑，且報導人類急性淋巴母細胞白血病細胞株CEM可由低至10-7mg/ml的濃度抑制(Wolpert-DeFillippes等人，Biochem.Pharmacol.241735-1738(1975))。
活體內(nèi)，美登素也顯示具有活性。顯示在50至100倍劑量范圍內(nèi)抑制P388淋巴母細胞白血病系統(tǒng)的腫瘤生長，這表明具有高治療指數(shù)；L1210小鼠白血病系統(tǒng)、人類Lewis肺癌系統(tǒng)和人類B-16黑素癌系統(tǒng)也顯示顯著抑制活性(Kupchan，Ped.Proc.332288-2295(1974))。
目前偶聯(lián)maytansinoids和細胞結(jié)合劑(諸如抗體)的方法包括兩個反應(yīng)步驟。首先將細胞結(jié)合劑(例如抗體)以交聯(lián)試劑(諸如N-琥珀酰亞胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP))改質(zhì)以將二硫代吡啶基引入抗體(Carlsson等人，Biochem.J.173723-737(1978)；美國專利第5,208,020號)。在第二個步驟中，將具有硫醇基的反應(yīng)性maytansinoid(諸如DM1(形式上稱為N2′-去乙酰基-N2′-(3-巰基-1-氧代丙基))-美登素)作為起始試劑添加至經(jīng)改質(zhì)抗體中，導致改質(zhì)抗體中硫代吡啶基的置換，及由二硫化物連接的細胞毒性maytansinoid/抗體偶聯(lián)物的產(chǎn)生(美國專利第5,208,020號)。在美國專利第6,441,163號中描述用于偶聯(lián)maytansinoids的一步驟工藝。
由ImmUnogen Corporation(Cambridge，MA)可獲得基于Maytansinoid的免疫毒素技術(shù)。另一種重要的毒素技術(shù)是基于auristatin毒素。Auristatins衍生自由印度洋海的海兔獲得的海兔毒素Dolastatin 10，作為有效的細胞生長抑制物質(zhì)。參見美國專利第4,816,444號和第4,978,744號。關(guān)于其它的海兔毒素，也參見美國專利第4,414,205號(Dolastatin-1、2和3)、第5,076,973號(Dolastatin-3)、第4,486,414號(Dolastatin-A和B)、第4,986,988號(Dolastatin-13)、第5,138,036號(Dolastatin-14)和第4,879,278號(dolastatin-15)。由Dr.Pettit和亞利桑那州大學的同事分離和合成的各種auristatine衍生物已經(jīng)測試且顯示出對細胞的高度毒性。參見Pettit等人，抗腫瘤劑337。海兔毒素10結(jié)構(gòu)改質(zhì)的合成。Anticancer Drug Des.10(7)529-44(1995)，Woyke等人。有效海兔毒素10結(jié)構(gòu)改質(zhì)auristatin PHE的細胞外活性和后抗真菌作用。Antimicrobial Agents and Chemotherapy.453580-3584(2001)，Pettit等人。海兔毒素10和肽衍生物對抗新生隱球菌的特異性活性。Antimicrobial Agents andChemotherapy.422961-2965(1998)，Woyke。新生隱球菌細胞周期期間微管的三維顯影和auristatin PHE對微管整體性和核位置的影響。Submitted，Antimicrobial Agentsand Chemotherapy。
近來，已研發(fā)在作為有效負載在抗體上傳遞時似乎相當有效的其它auristatin衍生物。例如，已顯示單甲基auristatin E(MMAE)在與腫瘤特異性抗體偶聯(lián)時作為對于腫瘤細胞的有效毒素。Doronina等人，Development of potent monoclonal antibodyauristatin conjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在線可得)；Francisco等人，cAC10-vcMMAE，an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugatewith potent and selective antitumor activity.B lood.(2003)May 8[E印刷前公開].Epub2003 Apr 24(在線可得)。除auristatin分子的毒性之外，研究已顯示經(jīng)肽連接的偶聯(lián)物更穩(wěn)定，且因此在緩沖劑和血漿中比其它連接子技術(shù)對正常組織的特異性更大且毒性更小。Doronina等人，Development of potent monoclonal antibody auristatinconjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在線可得)；Francisco等人，cAC10-vcMMAE，an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent andselective antitumor activity.Blood.(2003)May 8[E印刷前公開].′Epub 2003 Apr 24(在線可得)。
這些連接子基于支鏈肽設(shè)計且包括例如mAb-纈氨酸-瓜氨酸-MMAE和mAb-苯丙氨酸-賴氨酸-MMAE偶聯(lián)物。Doronina等人，Development of potent monoclonalantibody auristatin conjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在線可得)；Francisco等人，cAC10-vcMMAE，an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugatewith potent and selective antitumor activity.Blood.(2003)May 8[E印刷前公開].′Epub2003 Apr 24(在線可得)。這些設(shè)計和偶聯(lián)技術(shù)由以下所述，例如King等人的Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkersinhibition of aggregation by rnethoxytriethyleneglycol chains.J Med Chem.45(19)4336-43(2002)和Dubowchik等人的Cathepsin B-sensitive dipeptide prodrugs.2.Models of anticancer drugs paclitaxel(Taxol)，mitomycin C and doxorubicin.BioorgMed Chem Lett.8(23)3347-52(1998)。基于前述的Auristatin E-基免疫毒素技術(shù)由Seattle Genetics Corporation(Seattle，WA)可得。
存在大量由自然源萃取物及半合成和合成類似物獲得的影響微管的新穎化合物，其似乎具有作為用于產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物的毒素的潛能。(參見newmedinc.com網(wǎng)站)。這些分子及使用這些分子的藥物實例包括以下秋水仙堿-位點結(jié)合劑(Curacin)、風車子素(AVE806，風車子素A-4前藥(CA4P)，Oxi-4503)、隱藻素(LY355703)、Discodermolide、Dolastatin和Analogs(Auristatin PHE、Dolastatin 10、ILX-651、Symplostatin 1、TZT-1027)、埃博霉素(BMS-247550、BMS-310705、EPO906、KOS-862、ZK-EPO)、榴塞洛素(Eleutherobin)、FR182877、Halichondrin B(E7389)、月芐三甲氯銨(Halimide)(NPI-2352和NPI-2358)、Hemiasterlins(HTI-286)、Laulimalide、Maytansinoids(″DM1″)(Bivatuzumab美登素、Cantuzumab美登素、huN901-DM1/BB-10901TAP、MLN591DM1、My9-6-DM1、曲妥珠單抗(Trastuzumab)-DM1)、PC-SPES、Peloruside A、白藜蘆醇(Resveratrol)、S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)、海綿素(Spongistatin)、維提島酰胺(Vitilevuamide)、分子發(fā)動機-驅(qū)動蛋白(Molecular Motor-Kinesins)(SB-715992)、設(shè)計的秋水仙堿-位點結(jié)合劑(A-289099，A-293620/A-318315，ABT-751/E7010，D-24851/D-64131，ZD6126)、其它新穎紡錘體毒素(2-甲氧雌二醇(2-ME2)，苯并咪唑氨基甲酸酯(ANG 600系列，甲苯咪唑)，CP248/CP461，HMN-214，R440，SDX-103，T67/T607)。此外，在1998年的Mayer，A.M.S.Marine PharmacologyAntitumor and Cytotoxic Compounds.ThePharmacologist.41(4)159-164(1999)中評論了其它的鼠科衍生毒素。
治療投予和配方延長的作用時間可以通過交替的非經(jīng)腸途徑(諸如，靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射)使得給料進程較不頻繁且更為便利。
當用于活體內(nèi)投予時，本文所述的抗體配方應(yīng)該是無菌的。例如，這可易于通過在凍干和重組之前或之后經(jīng)無菌過濾膜過濾來實現(xiàn)?？贵w通常以凍干形式儲存或儲存在溶液中。治療抗體組合物通常放置在具有無菌存取入口的容器中，例如，具有可回收配方的接合器(諸如皮下注射針可穿過的塞子)的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶。
抗體投予的路徑是根據(jù)已知方法，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、吸入或病灶內(nèi)途徑，或通過如下文所述的緩釋系統(tǒng)注射或灌輸。抗體優(yōu)選通過灌輸或通過大丸劑注射連續(xù)投予。
治療學上采用的抗體的有效量取決于(例如)治療對象，投藥途徑和患者的病況。因此，對于治療學家而言，優(yōu)選視需要滴定劑量并改良投藥路徑以獲得最優(yōu)的治療效果。理論上，臨床醫(yī)師將投予抗體，直到達到理想效果的劑量。這種療法的進程易于通過常規(guī)的檢定或通過本文所述的檢定來控制。
如本文所述的抗體可在含有醫(yī)藥學上可接受的載劑的混合物中制備。治療組合物可優(yōu)選以液體或粉末氣溶膠(經(jīng)凍干)的形式經(jīng)靜脈內(nèi)或經(jīng)鼻或肺投予。組合物也可以視需要非經(jīng)腸或經(jīng)皮下投予。當進行全身性投予時，治療組合物應(yīng)該是無菌，無熱源且在非經(jīng)腸可接受的具有應(yīng)有pH值、等滲性和穩(wěn)定性的溶液中。這些條件為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。簡而言之，通過將具有所需純度的化合物與生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備化合物劑量配方以供儲存和投予。這些材料在所采用的劑量和濃度時對于接受者是無毒性的，且其包括緩沖劑，諸如TRIS HCl、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其它有機酸鹽；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量(小于約十個殘基)肽，諸如聚精氨酸；蛋白質(zhì)，諸如血白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子，諸如鈉和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENPLURONICS或聚乙二醇。
用于注射的無菌組合物可根據(jù)Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)中所述的常規(guī)醫(yī)藥實踐來調(diào)配。例如，可能需要活性化合物在諸如水或天然發(fā)生的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油的媒介物，或如油酸乙酯或其類似物的合成脂肪媒介物中的溶解液或懸浮液?？筛鶕?jù)可接受的醫(yī)藥實踐并入緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑及其類似物。
緩釋制劑的合適實例包括含有多肽的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成形物件、膜或微膠囊的形式。緩釋基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，由Langer等人的J.Biomed Mater.Res.，(1981)15167-277和Langer的Chem.Tech.，(1982)1298-105所述的聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利第3,773,919號、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人的Biopolymers，(1983)22547-556)、非降解伸乙基-乙酸乙烯酯(Langer等人，上述)、降解乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。
盡管諸如伸乙基-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得可釋放分子100天，但某些水凝膠仍持續(xù)較短時間釋放蛋白質(zhì)。當包膠蛋白質(zhì)在體內(nèi)長時間保留時，它們可能因為暴露于37℃的濕氣下而變性或聚集，導致生物活性的喪失且可能改變免疫原性?？筛鶕?jù)所涉及的機理設(shè)計合理的策略以供穩(wěn)定蛋白質(zhì)。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機理為經(jīng)二硫化物互換形成分子間S-S鍵，就可以通過改質(zhì)硫氫基殘基、自酸性溶液中凍干、控制濕氣含量、使用合適的添加劑和研發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物來達到穩(wěn)定。
緩釋組合物也包括懸浮于可將晶體保持在懸浮液中的合適配方中抗體晶體的制劑。當通過皮下或腹膜內(nèi)注射時，這些制劑可產(chǎn)生緩釋效應(yīng)。其它組合物也包括脂質(zhì)體截留的抗體。含有這些抗體的脂質(zhì)體由本身已知的方法來制備美國專利第DE3,218,121號、Epstein等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)823688-3692、Hwang等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)774030-4034、EP 52,322、EP 36,676、EP88,046、EP 143,949、142,641、日本專利申請案第83-118008號、美國專利第4,485,045號和第4,544,545號及EP 102,324。
用于給定患者的抗體配方的劑量可由主治醫(yī)師結(jié)合考慮已知的各種因素來測定以改質(zhì)藥物的作用，包括疾病的嚴重程度和類型、體重、性別、飲食、投藥時間和路徑、其它藥劑和其它相關(guān)臨床因素。治療有效劑量可通過活體外或活體外方法來測定。
治療學上采用的抗體的有效量取決于(例如)治療對象，投藥途徑和患者的病況。因此，治療學家優(yōu)選視需要滴定劑量并改良投藥路徑以獲得最優(yōu)的治療效果。根據(jù)上文提及的因素，一般的日劑量可在約0.001mg/kg到多至100mg/kg或更多之間。理論上，臨床醫(yī)師將投予治療抗體，直到達到理想效果的劑量。這種療法的進程易于通過常規(guī)的檢定或如本文所述來控制。
應(yīng)了解，根據(jù)本文的組合物和方法進行的治療實體的投予應(yīng)與并入配方中的合適載劑、賦形劑及其它試劑一起投予，以提供經(jīng)改良的轉(zhuǎn)移、傳遞、耐受性及其類似性質(zhì)。在所有藥劑化學師已知的配方中可發(fā)現(xiàn)多種合適配方Remington′sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990))，尤其為其文中的Block，Lawrence的第87章。例如，這些配方包括粉末、漿料、軟膏、膠質(zhì)物、蠟、油、脂質(zhì)、含脂質(zhì)(陽離子或陰離子)氣泡(諸如LipofectinTM)、DNA偶聯(lián)物、無水吸收漿料、水中油和油中水乳液、乳液聚乙二醇(各種分子量的聚乙二醇)、半固凝膠和含有聚乙二醇的半固混合物。根據(jù)本發(fā)明，任何前述混合物可適于治療和療法中，只要配方中的活性成分不會被配方鈍化，且所述配方生理學上相容且可容忍所述投藥路徑。也參見Baldrick P.的“Pharmaceutical excipientdevelopmentthe need for preclinical guidance.”，Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)210-8(2000)；Wang W.的“Lyophilization and development of solid proteinPharmaceuticals.”，Int.J.Pharm.203(1-2)1-60(2000)；Charman WN的“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emerging concepts.”J PharmSci.89(8)967-78(2000)；Powell等人的“Compendium of excipients for parenteralformulations”，PDA J Pharm Sci Technol.52238-311(1998)且其中引用的與配方、賦形劑和載劑相關(guān)的額外信息已為藥劑化學師所熟知。
抗體的制備如本文所述，抗體可通過使用如下文所述的XenoMouse技術(shù)來制備。所述小鼠隨后即可產(chǎn)生人類免疫球蛋白分子和抗體，但不足以產(chǎn)生鼠科免疫球蛋白分子和抗體。用于達到相同目的的技術(shù)揭示于本文所揭示的專利、申請案和參考案中。然而，尤其為關(guān)于轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)小鼠及由其產(chǎn)生的抗體的一個實施例揭示于申請于1996年12月3日的美國專利申請案第08/759,620號和1998年6月11日公開的國際專利申請案WO 98/24893和2000年12月21日公開的WO 00/76310中，其揭示內(nèi)容以引入的方式并入本文。也參見Mendez等人的Nature Genetics 15146-156(1997)。
通過使用這種技術(shù)，可生產(chǎn)針對多種抗體的完全人類單克隆抗體。在一個實施例中，將小鼠的XenoMouse細胞株以令人感興趣的抗原(例如，EGFRvIII)免疫，自表達抗體的小鼠中回收淋巴細胞(諸如B-細胞)，且將所述細胞與骨髓型細胞株融合以制備永生化雜交瘤細胞株，且篩選并選擇這些雜交瘤細胞株以識別產(chǎn)生對于令人感興趣的抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細胞株。本文提供用于產(chǎn)生可產(chǎn)生對EGFRvIII具有特異性的抗體的多種雜交瘤細胞株的方法。此外，本發(fā)明提供由這些細胞株產(chǎn)生的抗體的表征，包括這些抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。
或者，代替與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，根據(jù)對初始抗原(優(yōu)選為EGFRvIII蛋白質(zhì))的反應(yīng)活性進一步篩選由所回收的細胞產(chǎn)生、自經(jīng)免疫小鼠XenoMouse細胞株分離的抗體。所述篩選包括以EGFRvIII蛋白質(zhì)進行ELISA，活體外結(jié)合至穩(wěn)定表達全長EGFRvIII的NR6M細胞且由NR6M細胞中的抗體內(nèi)在化EGFRvIII受體。隨后使用EGFRvIII-特異性溶血性平板檢定分離分泌令人感興趣的抗體的單B細胞(Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996))。定靶用于溶菌的細胞優(yōu)選為以EGFRvIII抗原涂敷的綿羊紅細胞(SRBC)。在分泌令人感興趣的免疫球蛋白的B細胞培養(yǎng)基和補充物的存在下，平板的形成表明定靶細胞的特異性EGFRvIII介導溶菌作用?？煞蛛x平板中心處的單抗原-特異性血漿細胞，且編碼抗體特異性的遺傳信息可自單血漿細胞分離。使用反轉(zhuǎn)錄酶PCR可克隆編碼所分泌抗體的可變區(qū)的DNA。所述經(jīng)克隆DNA隨后可進一步插入合適表達載體中，優(yōu)選為載體盒，諸如pcDNA，更優(yōu)為含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的pcDNA載體。隨后，所產(chǎn)生的載體可轉(zhuǎn)染為宿主細胞，優(yōu)選為CHO細胞，且培養(yǎng)于經(jīng)合適改質(zhì)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中以供誘發(fā)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或放大編碼基因的所需序列。本文中描述產(chǎn)生對EGFRvIII具有特異性的抗體的多個單血漿細胞的分離。此外，將編碼抗-EGFRvIII抗體特異性的遺傳物質(zhì)分離、引入隨后轉(zhuǎn)染為宿主細胞的合適表達載體中。
來自XenoMouse小鼠的B細胞也可用作遺傳物質(zhì)的來源，自其可產(chǎn)生抗體展示文庫。所述文庫可使用所述領(lǐng)域的一般技術(shù)經(jīng)由核糖體展示在噬菌體、酵母或活體外發(fā)生。經(jīng)超免疫的XenoMouse小鼠可作為一種富有來源，自其可分離具有高親和力的抗原-反應(yīng)性抗體。因此，經(jīng)對抗EGFRvIII超免疫的XenoMouse小鼠可用于產(chǎn)生抗體展示文庫，自其可分離對抗EGFRvIII的高親和力抗體。所述文庫可針對pep3寡肽進行篩選，且所得衍生抗體針對表達EGFRvIII的細胞進行篩選以確定對于自然展示抗原的特異性。完全IgG抗體隨后可使用重組DNA技術(shù)來表達。例如參見WO 99/53049。
一般而言，由上述細胞株產(chǎn)生的抗體具有完全人類IgG1或IgG2重鏈和人類κ輕鏈。在一個實施例中，抗體具有高親和力，當通過固相和溶液相測量時，其一般具有約10-9M至約10-13M的Kd值。在其它實施例中，抗體具有較低的親和力，自約10-6M至約10-8M。
如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的，根據(jù)本實施例的抗體可在除雜交瘤細胞株之外的細胞株中表達。編碼特定抗體的序列可用于合適哺乳動物宿主細胞的轉(zhuǎn)型?？赏ㄟ^任何已知方法進行轉(zhuǎn)型以將多聚核苷酸引入宿主細胞，例如包括將多聚核苷酸封裝于病毒(或病毒載體)中且以病毒(或載體)或通過此項技術(shù)中已知的轉(zhuǎn)染程序轉(zhuǎn)換宿主細胞，如由美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號和第4,959,455號中所例示。所使用的轉(zhuǎn)型程序取決于待轉(zhuǎn)型的宿主。此項技術(shù)中已熟知將異種多聚核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法，且其包括右旋糖酐調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電擊、多聚核苷酸封裝于脂質(zhì)體中和DNA直接微注射于胞核中。
此項技術(shù)中已熟知可用作供表達宿主的哺乳動物細胞株，且其包括由多種由美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))獲得的永生化細胞株，包括(但不限于)中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎臟細胞(COS)、肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)和許多其它細胞株。通過測定哪些細胞株具有高表達水平且產(chǎn)生具有組成型EGFRvIII結(jié)合特性的抗體來選擇尤其較優(yōu)的細胞株。
實例提供以下實例，包括進行的實驗和得到的結(jié)果僅為了達到說明的目的而并不解釋為對本發(fā)明的限制。
最初產(chǎn)生EGFRvIII-特異抗體的策略涉及用復(fù)合抗原(肽、多種可溶性蛋白質(zhì)和抗原表達細胞)免疫XenoMouse小鼠，隨后通過融合產(chǎn)生雜種細胞或通過XenoMaxTM/SLAMTM技術(shù)分離B細胞而分離抗體產(chǎn)生細胞?？贵w產(chǎn)生細胞通過ELISA為特異性而呈遞到一級篩選，通過FMAT和/或FACS為細胞表面結(jié)合而呈遞到二級篩選。隨后進行內(nèi)在化檢定以識別可能對藥物輸送有用的抗體。測量這些抗體的親和力。選擇特定抗體進行表位定位。此外，選擇特定抗體進行體內(nèi)及體外測試以分析這些抗體對治療癌癥的功效。
實例1′抗原制備A.EGFRvIII PEP3-KLH抗原制備連同實例2，14-mer人類EGFRvIII PEP3(L E E K K G N Y V V T D H C(SEQID NO56))肽通過R&D系統(tǒng)常規(guī)合成。隨后PEP3肽與匙孔血藍蛋白(KLH)結(jié)合，如下EGFRvIII PEP3(200mcg)(R&D)與50mcg的匙孔血藍蛋白(KLH；Pierce，Rockford，IL)混合并用蒸餾水定容到165mcl。加入250mcl結(jié)合緩沖液(0.1M MES，0.9M NaCl，pH 4.7)并通過加入25mcl的10mg/ml的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亞氨氫氯化物的儲存液(EDC，Pierce，Rockford，IL)使EGFRvIII PEP3和KLH交聯(lián)。在室溫下孵育結(jié)合2小時，使用pH7.4的PBS通過一1kDa濾膜(離心濾膜，Millipore，Bedford，MA)將未反應(yīng)的EDC離心除去。
連同實例3，14-mer人類EGFRvIII PEP3(L E E K K G N Y V V T D H C(SEQID NO56))肽通過R&D系統(tǒng)常規(guī)合成。隨后PEP3肽與KLH結(jié)合，如下EGFRvIIIPEP3(200mcg)與50mcg的匙孔血藍蛋白(KLH；Pierce，Rockford，IL)混合并用蒸餾水定容到165mcl。加入250mcl結(jié)合緩沖液(0.1M MES，0.9M NaCl，pH 4.7)并通過加入25mcl的10mg/ml的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亞氨氫氯化物的儲存液(EDC，Pierce，Rockford，IL)使EGFRvIII PEP3和KLH交聯(lián)。在室溫下孵育結(jié)合2小時，使用pH7.4的PBS通過一1kDa濾膜(離心濾膜，Millipore，Bedford，MA)將未反應(yīng)的EDC離心除去。
B.B300.19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染子為了制備B300.19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染子，從A431細胞初始克隆出野生型EGFR，且用于編碼EGFRvIII的EGFR基因被更改從而缺失編碼殘基6-273的密碼子，而在缺失的連接處產(chǎn)生編碼甘氨酸殘基的密碼子。該缺失發(fā)生在缺失GTT(纈氨酸)和CGT(精氨酸)周圍的密碼子內(nèi)，而得到的缺失后密碼子為GGT(甘氨酸)。(Wikstrandet al.J Neurovirol.4(2)148-58(1998))1.野生型EGFR構(gòu)建的克隆使用Micro-fast RNA試劑盒(Invitrogen，Burlington，ON)從A431(ATCC)中提取聚A+mRNA。用隨機pdN6引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(NEB，New EnglandBiolabs，Beverly，Mass.)從polyA+mRNA合成總cDNA。用下列引物由A431cDNA擴增2.3kb的PCR產(chǎn)物正義5′-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3′；(SEQ IDNO62)反義5′-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3′(SEQ ID NO63)使用Pfu DNA聚合酶。
將PCR產(chǎn)物用XhoI消化，凝膠純化，并連接到被XhoI線型化的質(zhì)粒pWBFNP(見國際專利申請案第WO 99/45031號)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒Wt-EGFR/pWBFNP。
2.EGFRvIII構(gòu)建的產(chǎn)生用引物對C13659/C29538和C29539/C14288(BioSource International)由質(zhì)粒Wt-EGFR/pWBFNP擴增出PCR產(chǎn)物，其中C29538和C29539被T4多核苷酸激酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)磷酸化C136595′-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3′(正義)(SEQ ID NO64)C295385′-CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3′(反義)(SEQ ID NO65)；C295395′-GTAATTATGTGGTGACAGATC-3′(正義)(SEQ ID NO66)；C142885′-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3′(反義)(SEQ ID NO67)。
被連接以在編碼EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域的6至273氨基酸的序列中引入缺失，并亞克隆到表達載體pWBDHFR2中(見國際專利申請案第WO 99/45031號)。
用引物對C13659/C29538由Wt-EGFR/pWBFNP模板用Pfu聚合酶(NEB，NewEngland Biolabs，Beverly，Mass.)擴增產(chǎn)生代表缺失的5′端的232bp的片段。用EcoR1(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化并凝膠純化PCR產(chǎn)物。用引物對C29539/C14288從Wt-EGFR/pWBFNP產(chǎn)生代表缺失的3′端的1273bp的片段，且用Pfu聚合酶擴增模板。用Xhol(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化PCR產(chǎn)物。用T4DNA連接酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)將片段連接到用EcoR1/Xho1消化的pWBDHFR2以產(chǎn)生構(gòu)建EGFRvIII/pWBDHFR。
EGFR的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被引入下列獲得的構(gòu)建中從質(zhì)粒Wt-EGFR/pWBFNP中分離出1566bp的片段并連接到用DraIII/XhoI消化的EGFRvIII/pWBDHFR以產(chǎn)生EGFRvIII-FL/pWBDHFR。
3.用EGFRvIII-FL/pWBDHFR轉(zhuǎn)染B300.19細胞B300.19細胞(8×106)被用于每700μl DMEM/HI介質(zhì)中的轉(zhuǎn)染。加入20μgEGFRvIII-FL/pWBDHFR和2μg CMV-Puro質(zhì)粒DNA。用Bio-Rad Gene Pulser在300volts/960uF下將細胞電擊。電擊后，在冰上冷卻細胞10分鐘，隨后加入10非選擇性介質(zhì)(DMEM/HI葡萄糖，10％FBS，50μM BME，2mM L-谷氨酰胺，100單位青霉素-G/ml，100單位MCG鏈霉素/ml)。在37℃、7.5％CO2下孵育細胞48小時。
孵育后，細胞被split入選擇性介質(zhì)(DMEM/HI葡萄糖，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，50μM BME，100單位青霉素-G/ml，100單位MCG鏈霉素/ml，2ug/ml嘌呤霉素)中，在96孔板中以2×104、0.4×104′和0.08×104細胞/孔的濃度，在選擇性介質(zhì)中被選擇14天以產(chǎn)生穩(wěn)定的克隆。將Puro抗性克隆用E752 mAb(抗-EGFR抗體，在Yang et al.，Crit Rev Oncol Hematol.，38(1)17-23(2001)中有所描述)和山羊抗人類IgG PE染色，隨后在FACS Vantage(Becton Dickinson)上分析。
C.構(gòu)建EGFRvIII-RbFc表達構(gòu)建為產(chǎn)生EGFRvIII兔融合蛋白，我們首先構(gòu)建含有編碼兔Fc的DNA的載體。這與編碼EGFRvIII的DNA連接。下面將詳細描述此方法1.RbFc/pcDNA3.1 Hygro的構(gòu)建(下列)引物1322/867用于擴增編碼兔IgG的Hinge-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的721bp的片段。
#1322(正義)5′-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3′(SEQ IDNO68)#867(反義)5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3′(SEQ ID NO69)
將得到的PCR產(chǎn)物用KpnI和NotI消化，凝膠純化并連接到用KpnI/NotI消化的pcDNA3.1(+)/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)，以產(chǎn)生質(zhì)粒RbFc/pcDNA3.1Hygro。
2.EGFRvIII-RbFc/pCEP4的構(gòu)建(下列)引物1290/1293用于用Pfu聚合酶擴增自EGFRvIII-FL/pWBDHFR質(zhì)粒模板的1165bp的產(chǎn)物。
#1290(正義)5′-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3′(SEQ IDNO70)#1293(反義)5′-CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3′(SEQ ID NO71)將PCR產(chǎn)物用NheI和KpnI消化，凝膠純化并連接到用NheI/KpnI消化的RbFc/pcDNA3.1以產(chǎn)生質(zhì)粒EGFRvIII-RbFc/pcDNA3.1Hygro。
2170bp的SnaBI/XhoI片段被從EGFRvIII-RbFc/pcDNA3.1 Hygro中分離出來并亞克隆入SnaBI/XhoI消化的pCEP4(Invitrogen，Burlington，ON)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒EGFRvIII-RbFc/pCEP4。
3.產(chǎn)生293F EGFRvIII-RbFc穩(wěn)定細胞系用如下方法將質(zhì)粒EGFRvIH-RbFc/pCEP4通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染引入293F細胞(Gibco，Grand Island，NY)轉(zhuǎn)染前一天，1×106293F細胞被平板接種到明膠覆蓋的100mm組織培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，并在5％CO2、37℃下孵育。轉(zhuǎn)染前，用10ml新鮮非選擇性介質(zhì)(DMEM/F12，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素G，100U/ml MCG鏈霉素)培養(yǎng)細胞2-3小時。在微離心管中制備轉(zhuǎn)染試劑，如下10μg的DNA(EGFRvIII-RbFc/pCEP4)與62μl的2M磷酸鈣混合，并用去離子水定容到500μl。用另一移液管吸取500ul的2XHBS用于轉(zhuǎn)移所述轉(zhuǎn)染試劑。
逐滴將移液管中的溶液加入細胞，同時為保持合適的pH值，將細胞置于5％CO2孵育箱中直至進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后15-20小時，用PBS洗滌細胞并用10ml新鮮293F非選擇性介質(zhì)喂養(yǎng)細胞。用胰蛋白酶48-72后轉(zhuǎn)染收獲表達的細胞，并將細胞以0.08×104細胞/孔平板接種到96孔板，置于293F選擇性介質(zhì)(DMEM/F12，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素G，100U/ml MCG鏈霉素，250ug/ml濕霉素)中14天。
使用1ug/ml的抗-EGFR抗體E763(美國專利No.6,235,883)作捕捉抗體并用1∶100稀釋的山羊抗-兔IgG HRPO(CalTag)檢測，通過ELISA篩選濕霉素抗性克隆。
用如下方法制作用于抗體滴定(實例3)的EGFRvIII肽-OVA使用來自Pierce(#20291)的經(jīng)預(yù)稱量的DTT還原207μg EGFRvIII PEP3。使用100μL去離子水溶解小瓶7.7mg的經(jīng)預(yù)稱量的DTT。將DTT貯存液加入EGFRvIIIPEP3。使用pH 7.4的PBS將反應(yīng)液定容到600μL。室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)液30分鐘。
通過稱量5克G10葡聚糖凝膠珠子并加入40mlPBS，混合并在室溫下靜置10分鐘，然后以1000rpm離心珠子10分鐘制成G10管柱。除去上清液，并再加入20ml的PBS。將珠子在1000rpm下離心10分鐘。除去上清液，加入足夠量的PBS以產(chǎn)生50％G10葡聚糖凝膠珠子的懸浮液。在5ml旋轉(zhuǎn)柱中加入5ml所述50％懸浮混合物，隨后將該柱置于14ml聚丙烯管中。將柱子在1000rpm下離心3分鐘。另外再加入3ml的PBS，然后再將柱子在1000rpm下離心3分鐘。更換新的聚丙烯管，這樣所述柱子就可以使用了。
從還原肽中移除DTT。在將肽還原的30分鐘反應(yīng)之后，向每個柱子中加入300μL的還原肽。將柱子在1000rpm下離心3分鐘。另外再向每個柱子中加入250μL的PBS，然后再在1000rpm下離心3分鐘。將還原肽收集到14ml的聚丙烯管中。
將所述還原肽與用馬來酰亞胺激活的OVA連接，并收集到微量離心管中。將2mg的馬來酰亞胺激活的OVA用馬來酰亞胺結(jié)合緩沖液溶解(Pierce77126，Rockford IL)以制成10mg/ml的貯存液。將414μg的馬來酰亞胺激活的OVA加入微量離心管中的還原肽中。向反應(yīng)中加入500μL馬來酰亞胺結(jié)合緩沖液。將反應(yīng)液在室溫下孵育2小時并隨后加入2mg的半胱氨酸以猝滅可能存在的任何活性馬來酰亞胺基團。室溫下允許所述半胱氨酸再反應(yīng)30分鐘。將所述偶聯(lián)物使用pH 7.4的1X PBS洗滌并用10K離心柱離心3次。這去除了沒有與OVA結(jié)合的所有自由肽和自由的半胱氨酸。使用凝膠加樣吸頭將所述結(jié)合物從離心柱上取下并加入微量離心管中。最后，使用pH 7.4的1X PBS將結(jié)合物定容到期望濃度。所述結(jié)合物的摩爾比為14.5∶1(肽∶OVA)。
實例2通過雜種細胞產(chǎn)生制造抗-EGFRvIII抗體將產(chǎn)生具有γ-1恒定區(qū)的抗體的八只小鼠(XenoMouse G1小鼠)在第0天免疫，然后對于此方案要在第11、21、32、44和54天加強，然后在第58天進行融合。所有免疫均通過在尾根部皮下給藥和腹腔給藥的方式注射。第0天免疫是用1.5×107B300.19/EGFRvIH轉(zhuǎn)染的細胞(Example 1A)懸浮在與完全Freunds佐劑(CFA)(Sigma，St.Louis，MO)1∶1v/v混合的無致熱原的DPBS中完成的。第11、21和32天加強是用1.5×107B300.19/EGFRvIII轉(zhuǎn)染的細胞在與不完全Freunds佐劑(IFA)(Sigma，St.Louis，MO)1∶1v/v混合的DPBS中完成的。第44天加強是用與IFA1∶1v/v混合的5μg的PEP3(EGFRvIII肽)-KLH結(jié)合(實例1)完成的，且最后的加強是用沒有佐劑的DPBS中5μgPEP3(EGFRvIII肽)-KLH結(jié)合完成的。
在第58天，對小鼠實施安樂死，隨后回收其腹股溝和腰椎淋巴結(jié)。使用組織粉碎機通過機械破壞從淋巴結(jié)中釋放出淋巴細胞，隨后通過CD90陰性選擇除去T細胞。通過將洗滌并富集的B細胞和購自ATCC，cat#CRL 1580(Kearney et al，J.Immunol.1231548-1550(1979))的非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞以1∶1的比例混合而進行融合。此細胞混合物通過以800g離心被輕輕地沉淀。徹底去除上清液后，用2-4ml鏈霉蛋白酶溶液(CalBiochem，cat.#53702，0.5mg/ml在PBS中)處理不超過2分鐘。隨后，加入3-5ml FBS終止酶活性，用電細胞融合溶液ECFS(0.3M蔗糖，Sigma，Cat# S7903，0.1mM醋酸鎂，Sigma，Cat# M2545，0.1mM醋酸鈣，Sigma，Cat#C4705(St.Louis，MO))定容至40ml。
離心后除去上清液，通過在40ml ECFS中再次懸浮洗滌細胞。重復(fù)洗滌步驟，再次用ECFS懸浮細胞以達到2×106細胞/ml的濃度。使用融合產(chǎn)生器(型號ECM2001，Genetronic，Inc.，San Diego，CA)進行電-細胞融合。所用的融合室大小為2.0ml，并使用下列儀器設(shè)置比對條件電壓50V，時間50s，膜破裂條件電壓3000V，時間30μs，融合后固定時間3s。融合后，在DMEM(JRH Biosciences)、15％FCS(Hyclone)并含有HAT的溶液中懸浮細胞，并加入L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素、OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰島素)(均購自Sigma，St.Louis，MO)和IL-6(BoehringerMannheim)在37℃及10％CO2空氣中培養(yǎng)。
將細胞以4×104細胞/孔平板接種到平底96孔組織培養(yǎng)板上。在轉(zhuǎn)移到HT(次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)補料介質(zhì)前，培養(yǎng)被保存在HAT(次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)補料介質(zhì)中2星期。通過在HAT介質(zhì)的存活選擇雜種細胞，并用ELISA篩選上清液的抗原活性。ELISA格式需要在抗原涂覆平板(作為計數(shù)篩選的EGFRvIII肽-OVA涂覆平板和野生型EGFr peptide-OVA涂覆平板)上的孵育上清液并使用辣根過氧化物酶(HRP)標記的小鼠抗人類IgG檢測EGFRvIII特異結(jié)合(見表2.1)。
表2.1

應(yīng)注意到，檢測到至少四個抗原特異雜種細胞13.1、13.2、13.3和13.4。這些在ELISA檢測中EGFRvIII特異性呈陽性的這些雜種細胞通過在表達EGFRvIII的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的300.19細胞與300.19未轉(zhuǎn)染母細胞的對比得到驗證。
使用有限稀釋平板接種在選擇的抗原陰性孔上進行克隆。通過觀察板檢查單克隆抗體生長的存在，通過抗原特異性ELISA篩選來自單克隆孔的上清液并用上文描述的FACS驗證。使用Luminex儀器通過多元ELISA檢定高活性克隆從而檢驗人類γ和ê鏈的純度。基于ELISA和FACS檢定中EGFRvIII的特異性，選擇克隆13.1.2為進一步篩選和分析最有希望的候選。圖3L中展示了13.1.2抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸序列和氨基酸序列，且SEQ ID NO 137和139是重鏈和輕鏈核酸的而138和140為重鏈和輕鏈氨基酸序列的。此外，在圖4和5中展示13.1.2重鏈和輕鏈序列和其所來自的生殖細胞系的序列的一個比較。
實例3通過使用XenoMax技術(shù)產(chǎn)生抗體XenoMouse動物的免疫抗人類EGFRvIII的人類單克隆抗體是通過逐步免疫產(chǎn)生具有γ-1恒定區(qū)抗體的XenoMouse小鼠(XenoMouse G1小鼠)、產(chǎn)生具有γ-2恒定區(qū)抗體的XenoMouse小鼠(XenoMouse XMG2小鼠)和產(chǎn)生具有γ-4恒定區(qū)抗體的(XenoMouse G4小鼠)。
為通過XenoMax技術(shù)產(chǎn)生mAb，XenoMouse G1組和XMG2組小鼠被用EGFRvIII PEP3(實例1A)和表達EGFRvIII的300.19細胞(實例1B)、或用EGFRvIII蛋白(EGFRvIII-ECD)(Dr.Bigner，Duke University)的細菌表達的細胞外結(jié)構(gòu)域和表達的EGFRvIII300.19細胞、或用EGFRvIII兔Fc融合蛋白(EGFRvIII-RbFc)(實例1C)和表達EGFRvIII的300.19細胞、或通過爪墊(FP)僅用EGFRvIII-RbFc、或通過通過皮下注射在尾基部和腹腔(BIP)免疫。
對于爪墊免疫，初始免疫每只小鼠使用或不使用10×106表達EGFRvIII的300.19細胞且使用或不使用與Titermax金(Sigma，Oakville，ON)以1∶1混合的10μg的EGFRvIII PEP3或EGFRvIII-ECD或EGFRvIII-RbFc。隨后的加強使用初始免疫所用免疫原劑量的一半。前4次加強是通過將免疫原與明礬(Sigma，Oakville，ON)混合注入小鼠，過夜吸收，每只小鼠如下表3.1所示。然后注入Titermax中的相應(yīng)反應(yīng)原，再注入明礬，隨后在PBS中的免疫原的最后一次加強如下表3.1所示。特別地，在第0、3、7、10、14、17、21和24天免疫動物。在第19天對動物取血以獲得免疫血清并確定收獲選擇的效價。在第28天收獲動物。
表3.1 爪墊免疫時間表

如在爪墊免疫中描述的，初始BIP免疫每只小鼠用相應(yīng)的免疫原以1∶1v/v與完全Freund′s佐劑(CFA，Sigma，Oakville，ON)混合。隨后的加強首先每只小鼠使用相應(yīng)的免疫原1∶1與不完全Freund′s佐劑(IFA，Sigma，Oakville，ON)混合進行，隨后是每只小鼠用PBS的最后加強。如下表3.2所示，在第0、14、28、42、56和75(最后加強)天免疫動物。在第63天對動物取血以獲得免疫血清并確定收獲選擇的效價。在第78天收獲動物。
表3.2 Bip免疫時間表

通過效能確定選擇收獲的動物通過ELISA確定抗-hEGFRvIII抗體的效價將EGFRvIII-RbFc(2.5μg/ml)或?qū)φ誖bFc(2μg/ml)或EGFRvIII肽-OVA(2μg/ml)(實例1)或?qū)φ誒VA(4μg/ml)涂到CostarLabcoat Universal Binding Polystyrene 96孔板(Corning，Acton，MA)上四度過夜。除去包含游離抗原的溶液并對所述板用紫外光(365nm)處理4分鐘(4000微焦耳)。用蒸餾水洗滌所述板五次。雙份1∶100最初稀釋的從EGFRvIII免疫的XenoMouse動物或首次用于實驗的XenoMouse動物獲得的血清1∶2稀釋后用2％milk/PBS滴定。最后一個孔留空。用蒸餾水洗滌所述板五次。室溫下以1μg/ml的終濃度加入山羊抗人類IgG Fc特異辣根過氧化物酶(HRP，Pierce，Rockford，EL)結(jié)合的抗體1小時。用蒸餾水洗滌所述板五次。加入TMB顯色底物(Gaithersburg，MD)30分鐘將板顯色，加入1M磷酸終止ELISA。XenoMouse動物個體的特異效價由450nm時的光密度確定并在表3.3和3.4中展示。該效價表示免疫血清的倒數(shù)稀釋，因此該數(shù)值越大則體液免疫對hEGFRvIII的反應(yīng)越強烈。
對于通過在尾基部皮下注射和腹腔注射的小鼠，效價的確定正如上文所述，除了涂有EGFRvIII-RbFc(2.0μg/ml)或?qū)φ誖bFc(2.5μg/ml)的平板。
表3.3


基于血清學，表3.3中所有第5組的XenoMouse動物和自第6組的XenoMouse的動物0743-5被選擇做XenoMax收獲。
表3.4


基于表3.4中的血清學數(shù)據(jù)，XenoMouse動物(0695-1、0695-3和0695-4)被選做收獲。
B細胞的選擇來自上述動物的B細胞被收獲并培養(yǎng)。分離出分泌型EGFRvIII-肽特異性抗體，如在Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，937843-7848(1996)中的描述。ELISA被用于識別第一EGFRvIII-肽-OVA-特異的孔。來自XenoMouse動物以500或150或50細胞/孔的密度在245 96孔板中培養(yǎng)出了約5百萬個B細胞，這些細胞在EGFRvIII-肽-OVA上被篩選以識別抗原特異性孔。大約有515個孔在背景上顯示出明顯的OD，在表3.5中展示了一代表樣品。
表3.5

OD＞0.5的244個EGFRvIII-肽-OVA-Elisa陽性孔再次在ofEGFRvIII-肽-OVA上并在OVA上篩選以驗證它們的EGFRvIII-特異性。在表3.6中展示這些結(jié)果的一個代表性實例。
表3.6


有限抗原檢定和分析有限抗原分析是一種將B細胞培養(yǎng)基上清液中抗原特異的抗體與所有其它抗原特異抗體親和力分級的方法。當所涂的抗原很少時，僅僅最高親和力的抗體能夠在平衡狀態(tài)下與任何可檢測水平相結(jié)合。(見(例如)國際專利申請案No.W0 03/48730)EGFRvIII肽-OVA被以三個濃度7.5ng/ml，1.5ng/ml和0.03ng/ml涂到平板上，并住96孔板上4℃過夜。在向平板中加入含有0.05％疊氮化鈉的50ul的1％牛奶溶于PBS的溶液前，每個平板用蒸餾水洗滌5次，然后向每個孔小加入4μl的B細胞上清液。室溫下置于搖床中18小時后，再次用蒸餾水洗滌平板5次。每孔中加入50ul的1μg/ml的山羊抗人類(Fc)-HRP。室溫下1小時后，再次用蒸餾水洗滌平板5次，并向每孔中加入50μl的TMB。通過向每孔中加入50uL 1M的磷酸終止反應(yīng)，并在波長451nm下閱讀平板，結(jié)果在表3.7中展示。
表3.7

將有限抗原分析產(chǎn)生的結(jié)果與在高抗原檢定中獲得的總OD值作比較。通過將在有限抗原檢定中獲得的OD值比上在高抗原檢定中獲得的OD值，完成親和力的相對分級。具有高比率的抗體將具有高的親和力。表3.7展示基于有限抗原檢定OD值與高抗原檢定OD值之比分級的B細胞培養(yǎng)基上清液的樣品。
通過FMAT的幼稚細胞結(jié)合檢定分析EGFRvIII肽-OVA-Elisa陽性孔上清液與NR6細胞(NR6 M細胞)上穩(wěn)定表達的EGFRvIII的天然形式結(jié)合的能力(見Batra等人Epidermal growth factorligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring humanmutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10)1251-9(1995))。NR6 M細胞以每孔8000細胞的密度播種，并在96孔FMAT板中過夜孵育。然后除去并在孔中剩余15μl的介質(zhì)。在孔中加入15μl的B細胞培養(yǎng)基上清液，然后以終濃度為1μg/ml加入15μl抗人類IgGFc Cy5。然后將其放在4℃下孵育2小時。用150μlPBS洗滌細胞，并在FMAT上閱讀之前進行固定。以總螢光密度表示結(jié)果(表3.8)。人類抗-EGFRvIII mAb 13.1.2被用作陽性對照，其起始濃度為終濃度1μg/ml，陰性對照為相同濃度的PK 16.3.1。244個樣本中有134個被測試為與NR6M細胞結(jié)合，其中62具有大于8000的總螢光值，這134結(jié)合中有6個假陽性。
在NR6 Wt細胞(NR6細胞表達EGF受體)上做相同的天然結(jié)合檢定(見Batra等人.Epidermal growth factor ligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of anaturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10)1251-9(1995))以排除因結(jié)合到Wt受體的結(jié)合(表3.8)。ABX-EGF被用作陽性對照且相同濃度的PK16.3.1被用作陰性對照抗體。134個NR6 M結(jié)合體中有3個與NR6 Wt細胞緊密結(jié)合。244個與Elisa中的EGFRvIII肽結(jié)合的孔中有190個孔也結(jié)合到細胞上的天然形式。表3.8中給出了實例。
表3.8


在表3.8種，來自孔187A4中的上清液被識別為Wt結(jié)合體且141C6與NR6 M細胞結(jié)合是的假陽性。孔129H6和183E11是沒有天然結(jié)合的強肽結(jié)合體。
內(nèi)在化檢定進一步檢定前60個天然結(jié)合B細胞培養(yǎng)基上清液的內(nèi)在化受體的能力。NR6 M細胞被以8000細胞/孔的密度接種到96孔FMAT板上并過夜孵育。除去介質(zhì)，并雙份地在總體積30μl介質(zhì)中加入10-15μl B細胞培養(yǎng)基上清液。然后，加入15μl的第二抗體(終濃度為1.5μg/ml的SS Alexa 647抗人類IgG Fab)并將該混合物在冰上孵育1小時。使用無關(guān)B細胞培養(yǎng)基緩沖液以了解培養(yǎng)基介質(zhì)的效果。人類抗-EGFRvIII mAb 13.2.1被用作陽性對照，其起始濃度為終濃度1μg/ml，陰性對照為相同濃度的PK 16.3.1(人類抗KLH IgG2抗體)。孵育后，用冷PBS洗滌細胞，在所有孔中加入50μl介質(zhì)，一個復(fù)本在37℃孵育30分鐘，而另一復(fù)本仍在冰上孵育。除去孵育介質(zhì)后，在37℃孵育組加入100ul冷的50mM谷胱甘肽而在另一組加入100ul冷的介質(zhì)，兩組均放置冰上1小時。然后用100μl冷的PBS洗滌細胞，隨后與1％多聚甲醛混合并在FMAT中閱讀。結(jié)果以％內(nèi)在化表示，以谷胱甘肽/沒有谷胱甘肽時的總螢光值×100計算總螢光值。在表3.9中給出代表性信息。
表3.9


EGFRvIII-特異性溶血蝕斑試驗進行本試驗需要許多專用試劑。用如下方法制配這些試劑。
1.綿羊紅血細胞的生物素?；?SRBC)。SRBC被貯存在RPMI介質(zhì)中作為25％的貯存液。通過將1.0ml的SRBC等分到新微量離心管中獲得裝滿250μl SRBC的細胞小球。在微離心機中用8000rpm(6800rcf)的脈沖旋轉(zhuǎn)沉淀SRBC，吸去上清，用1.0ml pH8.6的PBS將沉淀重新懸起，再重復(fù)離心。重復(fù)洗滌循環(huán)2次，然后將SRBC沉淀轉(zhuǎn)移到15ml塑料管并用pH 8.6的PBS定容至5ml。在單獨的50ml塑料管中，向45ml pH 8.6的PBS中加入2.5mg的Sulfo-NHS生物素。一旦生物素完全溶解，就加入5ml的SRBC，并在常溫下旋轉(zhuǎn)該管1小時。以3000rpm離心SRBC 5分鐘，并吸掉上清。將生物素?；腟RBC轉(zhuǎn)移到微量離心管中，并用上述方法用pH7.4的PBS洗滌3次，然后在15ml塑料管中用免疫細胞介質(zhì)(RPMI 1640)定容至5ml(5％B-SRBC貯存液)。需使用前，將貯存液在4℃保存。
1.用鏈霉抗生物素蛋白(SA)涂覆B-SRBC。將1ml的5％的B-SRBC貯存液轉(zhuǎn)移到新微量離心管中。The B-SRBC cells were washed 3 times as above and resuspended in1.0ml of PBS at pH 7.4 to give a final concentration of 5％(v/v).加入10μl 10mg/ml的鏈霉抗生物素蛋白(CalBiochem，San Diego，CA)貯存溶液，在管內(nèi)混合并在常溫下旋轉(zhuǎn)20分鐘。重復(fù)洗滌步驟并用pH7.41ml的PBS將SA-SRBC再懸浮(5％(v/v))。
3.用EGFRvIII涂覆SA-SRBC。用生物素?；?0μg/ml的EGFRvIII肽-OVA涂覆SA-SRBC，混合并在常溫下旋轉(zhuǎn)20分鐘。用上述方法用1.0ml的pH7.4的PBS洗滌SRBC兩次。用RPMI(+10％FCS)再懸浮EGFRvIII涂覆的SRBC并定容至終濃度5％(v/v)。
4.通過免疫螢光(IF)確定EGFRvIII肽-SRBC的質(zhì)量。10μl的5％SA-SRBC和10μl的5％EGFRvIII肽涂覆的SRBC被分別加入獨立的含有40ul的PBS的新1.5ml微離心管中。以45μg/ml的濃度將對照人類抗EGFRvIII抗體加入每個SRBC樣品中。將這些管在常溫下旋轉(zhuǎn)25分鐘，隨后用100μl的PBS洗滌細胞三次。用50μl的PBS將細胞再懸浮，并與40mcg/mL的與Alexa488(Molecular Probes，Eugene，OR)連接的人類IgG Fc抗體一起孵育。這些管在常溫下旋轉(zhuǎn)25分鐘，并隨后用100μl的PBS洗滌，并用10μl的PBS將細胞再懸浮。將10μl染色的細胞點到干凈的玻璃顯微鏡載玻片上，蓋以玻璃蓋玻片，在螢光下觀察并在任意0-4的范圍計數(shù)。
5.漿細胞的制備。收獲先前經(jīng)多種試驗確定含有分泌感興趣的免疫球蛋白的B細胞克隆的單個微量培養(yǎng)孔的內(nèi)容物。使用100-1000μl的自動移液器通過加入37CRPMI(10％FCS)收集所述孔的內(nèi)容物。用移液管將細胞再懸浮，然后轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中(最終體積約500-700μl)。室溫下在微量離心機中以2500rpm(660rcf)的轉(zhuǎn)速離心細胞1分鐘，并隨后以180度旋轉(zhuǎn)該管并以2500rpm的轉(zhuǎn)速再次離心。吸取冰凍介質(zhì)并用100μl RPMI(10％FCS)再懸浮細胞，并離心。重復(fù)用RPMI(10％FCS)洗滌，并用60μl RPMI(10％FCS)再懸浮細胞并在使用前置于冰上保存。
6.漿細胞的顯微操作。提前用硅樹脂邊緣準備玻璃載玻片(2×3英寸)并允許在常溫下過夜保存。使用前，用約5ul的SigmaCoat(Sigma，Oakville，ON)均勻擦拭玻片的表面，干燥后劇烈地擦拭。向每個60μl的細胞樣品中加入60μl的EGFRvIII肽涂覆的SRBC(5％v/v貯存液)，在RPMI(10％FCS)中制備的4x豚鼠補體(Sigma，Oakville，ON)貯存液和4x增強免疫血清貯存液(用10％FCS在RPMI中1∶150配制的)。將混合物(10-15μl)滴到準備好的玻片上并用未稀釋的石蠟油覆蓋液滴。將玻片在37℃下至少孵育45分鐘。The從蝕斑識別EGFRvIII特異性漿細胞并通過顯微操作回收(見表3.10).
表3.10

單細胞PCR、克隆、表達、純化并鑒定重組抗EGFRvIII抗體。
The genes encoding the variable regions were rescued by on the通過在單顯微操作漿細胞上進行RT-PCR回收編碼可變區(qū)域的基因。提取mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄PCR以產(chǎn)生cDNA。編碼可變重鏈和輕鏈的cDNA被用聚合酶鏈反應(yīng)特異地擴增。將人類可變重鏈區(qū)克隆到IgG1表達載體中。通過將人類IgG1的恒定結(jié)構(gòu)域克隆到pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)的多個克隆位點中產(chǎn)生此載體。將人類可變重鏈區(qū)克隆到IgK表達載體中。通過將人類IgK的恒定結(jié)構(gòu)域克隆到pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen，Burlington，ON)的多個克隆位點中產(chǎn)生此載體。The heavy chain and the light chainexpression vectors were then co-lipofected into a 60mm dish of 70％ confluent humanembryonal kidney 293 cells and the transfected cells were allowed to secrete a recombinantantibody with the identical specificity as the original plasma cell for 24-72hours.從HEK293細胞收獲上清液(3mL)并用夾心ELISA特異地檢測人類IgG的方法證明完整抗體的分泌(表3.11)。使用ELISA通過重組抗體與EGFRvIII的結(jié)合評定特異性(表3.11)。
表3.11

分泌ELISA測試如下進行。對于抗體分泌，將2μg/mL的山羊抗人類IgG H+L和用于抗原結(jié)合的1.5μg/ml的EGFRvIII-Rab Ig Fc融合蛋白涂覆到Costar Labcoat UniversalBinding Polystyrene 96孔板上并保持在四度過夜。用蒸餾水洗滌所述板五次。從未稀釋的小型脂質(zhì)轉(zhuǎn)染上清液對7個孔1∶2滴定重組抗體。用蒸餾水洗滌所述板五次。向用1ug/ml Rb抗Hu Fc在室溫下1小時檢測的分泌平板和結(jié)合平板以1μg/mL的終濃度加入山羊抗人類IgG Fc特異HRP結(jié)合抗體常溫保持1小時。用蒸餾水洗滌所述板五次。加入TMB 30分鐘將板顯色，加入1M磷酸終止ELISA。分析每個ELISA平板以確定每孔在450nm時的光密度。
測序和序列分析在兩個方向?qū)寺〉闹劓溸M行測序，并分析以確定抗體的生殖細胞系序列來源并識別與生殖細胞系序列的改變。在附圖中提供了這些序列。3A-3K和(SEQ ID NO34-55)。在附圖4-7中提供了每個重鏈和輕鏈序列與其來源的生殖細胞系序列的比較。另外，在附圖中對來源于雜種細胞的13.1.2抗體的序列和其生殖細胞系序列進行了比較。4和5。
從本文的討論應(yīng)了解，每個131抗體和13.1.2抗體均具有對EGFRvIII很高的親和性，其被細胞內(nèi)在化，且當與毒素結(jié)合時表現(xiàn)出很高的細胞殺傷效率。有趣的是，每個抗體，即使其產(chǎn)生自XenoMouse小鼠的不同的免疫或使用不同的技術(shù)，均來源于非常相似的生殖細胞系基因。然而基于表位的定位(本文中有所討論)，每個抗體看來與EGFRvIII分子上明顯不同的表位結(jié)合且在對結(jié)合必要的EGFRvIII上具有顯著不同的殘基。這些結(jié)果指示，生殖細胞系基因的運用對針對EGFRvIII的抗體治療學很重要，且微小的改變可以更改抗體的結(jié)合和效果的事實允許了對抗體和其他基于這些結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的抗體治療學的進一步設(shè)計?？?EGFRvIII mAbs與細胞上表達的天然EGFRvIII結(jié)合在這個事例中，測量抗-EGFRvIII抗體與NR6 M細胞的結(jié)合。特別地，檢定來源于XenoMax的未定量的IgG1上清液與NR6 M和NR6 WT的結(jié)合能力。以10000/孔的密度接種細胞并在37℃下FMAT 96孔板中孵育過夜。除去介質(zhì)并加入40μl小型脂上清液滴定，將細胞在冰上孵育1小時。人類13.1.2EGFRvIII抗體和ABX EGF(E7.6.3，美國專利No.6,235,883)抗體作為陽性對照加入。PK 16.3.1抗體用作陰性對照。用冷的PBS洗滌細胞，以1μg/ml、40μl/孔的密度加入第二抗體(SS Alexa抗人類IgG Fc)并在冰上孵育1小時。然后用冷PBS洗滌細胞，再固定然后用FMAT閱讀。通過計數(shù)對NR6 WT的篩選檢測所有抗體的結(jié)合特異性。
重組抗-EGFRvIII抗體的純化。
為了大規(guī)模的生產(chǎn)，重鏈和輕鏈表達載體(2.5μg每鏈/平皿)被脂質(zhì)轉(zhuǎn)染到十個100mm平皿中70％鋪滿的HEK293細胞中。轉(zhuǎn)染細胞在37℃下孵育4天，收獲上清液(6mL)并用6ml的新鮮介質(zhì)替代。在第7天，除去上清液并用初始收獲合并(自10個平板共120ml)。使用蛋白質(zhì)-A瓊脂糖(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)親和層析(1mL)從上清液中純化每個抗體。用500mcL pH2.5的0.1M甘氨酸將抗體從蛋白質(zhì)-A柱上洗滌。洗滌液在pH7.4的PBS中透析，并進行濾膜滅菌。用非還原SDS-PAGE分析抗體以評定其純度和產(chǎn)量。也用OD250的紫外線分析測量濃度。
通過重組抗-EGFRvIII mAb的EGFRvIII受體內(nèi)在化如前所述，表達、純化并定量XenoMax來源的IgG1重組抗體。進一步檢定抗體在NR6M細胞內(nèi)在化EGFRvIII受體的能力。250,000NR6 M細胞與第一抗體(SC95、SC131、SC133、SC139、SC150、SC170、SC211、SC230、SC250和作為對照的人類13.1.2)一起以0.25μg/ml的濃度在96孔v底平板上在冰上孵育7分鐘，有這樣的三個復(fù)本。用冷的10％FCS的PBS洗滌細胞并加入3μg/ml Fab的第二抗體(SS Alexa抗人類IgG Fab)并在冰上孵育7分鐘。用冷的含有10％FCS的PBS洗滌細胞一次并隨后用冷介質(zhì)再懸浮。然后，三個復(fù)本中的兩組在37℃孵育而剩下的一組在4℃孵育1小時。此后，在4℃孵育的細胞和在37℃孵育的一組細胞在冰上用谷胱甘肽處理(如前文所提及)1小時。然后用100μl冷的含有1％FCS的PBS洗滌并再懸浮細胞，并用FACS分析。從自FACS分析獲得的幾何均數(shù)計算％內(nèi)在化[(37℃用谷胱甘肽處理的平均數(shù)-4℃用谷胱甘肽處理的平均數(shù))/(37℃不用谷胱甘肽處理的平均數(shù)-4℃用谷胱甘肽處理的平均數(shù))]。NA意味著進行了FACS分析但數(shù)據(jù)并不在表3.12中提供。
表3.12

13.1.2是一個通過先前針對EGFRvIII表位的雜種細胞產(chǎn)生(實例2)而產(chǎn)生的抗體并作為本試驗中的一個陰性對照。表3.12的這些結(jié)果顯示了兩亞組抗體有效地內(nèi)在化的那些(70-80％)和沒有內(nèi)在化的那些(22％或更少)。
實例4 人類抗EGFRvIII抗體的表位的定位為了確定本發(fā)明的特定抗體結(jié)合的表位，抗EGFRvIII的6個人類的和3個鼠科動物的單克隆抗體(mAb)使用來自特異EGFRvIII的肽序列的合成肽進行定位。定位的抗體為來源于人類雜種細胞的抗EGFRvIII 13.1.2抗體、來源于人類XenoMax的抗EGFRvIII 131、139、250、095和211抗體以及鼠科動物抗EGFRvIII H10、Y10和B9抗體。
使用的方法為常規(guī)SPOT肽陣列(Sigma Genosys)以研究人類抗EGFrVIII抗體與其肽表位間的分子相互作用。SPOTs技術(shù)是基于以適合抗體表位系統(tǒng)分析的肽固相合成。常規(guī)陣列寡肽的合成可從Sigma-Genosys購得。從Sigma-Genosys訂購來自EGFRVIII可變氨基酸序列的重疊寡肽的一肽陣列。
一系列九個12-mer肽作為聚丙烯膜上的蝕斑合成。肽陣列跨EGFrVIII序列的殘基1-20，代表胞外wtEGFr結(jié)構(gòu)域的氨基酸6-273的缺失，和在連接點甘氨酸(G)的產(chǎn)生。每個連續(xù)肽用一個殘基衍生自前一個肽，產(chǎn)生一陣列寡肽的嵌套的、重疊的庫。帶有9個肽的膜與9個不同抗EGFrVIII抗體(1μg/ml)反應(yīng)。通過酶連接免疫吸附試驗使用結(jié)合的HRP第二抗體然后用增強的化學發(fā)光(ECL)評定mAb與膜結(jié)合肽的結(jié)合。在表4.1中展示所用的陣列。
表4.1蝕斑陣列序列

此外，通過組和丙氨酸篩選定位功能性表位。I在這一過程中，使用一組合丙氨酸篩選方法識別EGFrVIII肽中對與抗EGFRvIII mAb相互作用必需的氨基酸。為達到這目標，訂購第二組SPOT陣列用于丙氨酸篩選。如上述掃描12個殘基中的有丙氨酸取代的可變肽的面板。蝕斑#1，未變異的序列，為抗體結(jié)合的一個陽性對照。在表4.2中展示所用的陣列。
Table 4.2丙氨酸篩選陣列


所有9個mAb對人類EGFrVIII的表位通過SPOT程序定位識別。所有9個抗體均可與所述肽反應(yīng)。在表4.3中顯示了用3個鼠科動物抗體和6個來源于XenoMouse小鼠的人類抗體獲得的結(jié)果。突出顯示的殘基為我們變異成丙氨酸且通過測試的抗體取消結(jié)合的殘基。因此這些為結(jié)合到抗體上的相關(guān)殘基。
表4.3

表4.3中展示的有陰影的氨基酸為對抗體識別最相關(guān)的抗原識別位點的殘基。使用重疊序列的肽精確定位所有十個mAb的表位的最短長度，且通過用丙氨酸系統(tǒng)性地取代表位中的每個殘基確定mAb與變異表位結(jié)合的容許度。
在表4.4中，總結(jié)了抗體的附加特征。特別地，非還原或還原條件下在聚丙烯酰胺凝膠電泳的Western平板中測試一亞組抗體對腫瘤細胞系裂解液的結(jié)合。還包括純化的重組蛋白。在還原和非還原條件下結(jié)合的抗體表明表位為線性的。樣品識別EGFRvIII-兔Fc融合蛋白H1477-用EGFRvIII表達構(gòu)建轉(zhuǎn)染的H80人類腫瘤細胞系。這些細胞表達EGFR和EGFRvIII。
EGFR-純化的野生型EGFR蛋白。
A431-僅表達野生型EGFR的人類腫瘤細胞系A(chǔ)459-僅表達野生型EGFR的人類腫瘤細胞系H80-僅表達野生型EGFR的人類腫瘤細胞系EGFR Biacore-作為一對特異性的高敏感測試，在Biacore中測試mAb與純化的EGFR的結(jié)合表4.4


結(jié)果顯示大多數(shù)mAb具有本質(zhì)上相同的結(jié)合特異性，七個mAb顯示與可變EGFrVIII的結(jié)合特異性，同時在純化蛋白的Western印跡和A431細胞的裂解液中2個mAb與野生型EGFr(鼠類H10和人類211)交叉反應(yīng)。注意，然而，盡管在Western印跡中抗體211與幼稚及還原的純化EGFRvIII均結(jié)合，其與非還原蛋白的結(jié)合稍強。在對A431細胞裂解液的測試中，抗體211在非還原樣品中與一群野生型EGFR強烈結(jié)合，但在還原樣品中沒有信號。這表明抗體211的結(jié)合是由于在野生型EGFR中的構(gòu)象表位，且在EGFRvIII中表現(xiàn)不同。5個mAb的表位在跨EGFRvIII可變特異性甘氨酸殘基的殘基2-12內(nèi)，然而4個mAb(包括H10和211)跨EGFRvIII和野生型EGFr共有的殘基7-16。在FACS中抗體131與A431和A549細胞結(jié)合。這些細胞對EGFRvIII表達呈陰性而對EGFR表達呈陽性。在Western中抗體131不與非還原或非還原純化的EGFR或還原或非還原A43及A549細胞裂解液結(jié)合表明抗體131可能與在一些人類腫瘤細胞系的細胞表面表達的可變EGFR結(jié)合。這些變體對變性敏感。
實例5體外抗EGFRvIII抗體的特異性通過對用野生型或變異EGFR轉(zhuǎn)染的NR6細胞進行FACS分析確定純化抗體的特異性。用5μg/ml對應(yīng)抗體將細胞在冰上孵育1小時，用FACs緩沖液洗滌，并隨后用PE結(jié)合的山羊抗人類IgG孵育。
實例6與擴增的EGFR的交叉反應(yīng)性顯示針對可變EGF受體的抗體在發(fā)生基因擴增的細胞上與野生型EGF受體的亞組交叉反應(yīng)(Johns et al.，Int.J.Cancer.98398，2002)。為確定人類EGFRvIII抗體識別是否具有相似的特性，在培養(yǎng)基中對其識別多種細胞上的野生型EGF受體的能力進行測試。用指定細胞系與抗體在4℃下孵育。用FACS緩沖液洗滌后，加入結(jié)合有phyoerythrin的第二抗體，并繼續(xù)孵育。所有分析的細胞系都表達野生型EGFR。通過抗體在A431和SF-539細胞上而不在A498或SKRC-52細胞上的的抗體XG1-131識別野生型EGFR的亞組。另一EGFRvIII的抗體13.1.2并不識別野生型EGFR的亞組。綜合考慮這些數(shù)據(jù)，表明僅針對變異EGFRvIII的抗體的亞組能夠識別細胞表面的野生型EGRF。特定的針對變異EGFRvIII的抗體識別野生型EGF受體的亞群的能力并不依賴于總EGFR密度但可能表示對腫瘤細胞特異的新構(gòu)象表位。針對EGFRvIII的抗體與野生型受體的亞群交叉反應(yīng)的能力可能由變異受體結(jié)點內(nèi)的特異表位和對此獨特決定基的抗體的親和力共同決定(見本文中表位定位和親和力確定部分的結(jié)果)。
實例7 體內(nèi)抗EGFRvIII抗體的特異性抗體與細胞系的結(jié)合這些純化抗體的特異性通過在細胞系的面板上進行FACS分析確定。細胞系使用的是H80-人類膠質(zhì)母細胞瘤細胞系、表達高水平EGFRvIII的H1477(H80-EGFRvIII)、A431-人類表皮腫瘤細胞系和A549-人類肺腫瘤細胞系。所有細胞系均來自Dr.Bigner除了來自ATCC(Rockville，MD，U.S.A)的A431和A549。用10μg/ml對應(yīng)抗體將細胞在冰上孵育30小時，用FACs緩沖液洗滌，并隨后用來自Jackson ImmunoResearch(WestGrove，PA，U.S.A.)的PE結(jié)合的山羊抗人類IgG孵育。在圖9A-9L和10A-10D中，暗的柱狀圖顯示用無關(guān)IgG染色的細胞，輪廓圖或白色柱狀圖表示相關(guān)抗體的染色。
抗EGFRvIII抗體13.1.2、131和139與轉(zhuǎn)染細胞系上的EGFRvIII蛋白結(jié)合。在圖9M-9P中顯示總結(jié)一些結(jié)果的圖。
顯示針對可變EGF受體的抗體在發(fā)生基因擴增的細胞上與野生型EGF受體的亞組交叉反應(yīng)(Johns et al.，Int.J.Cancer.98398，2002)。在這個實例中，用XG1-131和XG1-139對A431和A549染色。圖10B和圖10C展示131和139具有與野生型EGFR特定的交叉反應(yīng)性，而不是僅識別H80、A431和A549細胞系的亞群。然而，此交叉反應(yīng)性僅在這些細胞系上染色的ABX-EGF(E7.6.3)的水平的10％。結(jié)果在圖9A-9P和10A-10D中提供。
針對細胞表面抗原的抗體可被用作將藥物或毒素特異地輸送到細胞的輸送載體。如果此抗體刺激抗原的內(nèi)在化，也許在藥物或毒素從抗體斷裂后，藥物或毒素可導致細胞的死亡。這一機制可用于在動物或患者體內(nèi)特異地殺傷腫瘤細胞。選擇可以將藥物輸送到細胞的抗體的方法是通過二級細胞毒性試驗。在這些試驗中，第一抗體與細胞表面結(jié)合并加入與藥物或毒素結(jié)合的第二抗體。如果第一抗體刺激抗原內(nèi)在化，第二抗體將共內(nèi)在化，一旦藥物或毒素斷裂便導致細胞殺傷。
實例8 二級細胞毒性試驗在下列研究中，EGFRvIII-特異抗體被用來將與第二抗體結(jié)合的毒素導向膠質(zhì)母細胞瘤細胞系(H80)和EGFRvIII轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系(H1477)。來自Pharmingen(BD Biosciences Pharmingen)小鼠抗人類IgG(cat#555784)與毒素AEFP(Seattle Genetics，Inc.)和美登素(DM1，Immunogen Inc.)結(jié)合以產(chǎn)生mah-AEFP(鼠類抗人類IgG-AEFP)和mah-DM1(鼠類抗人類IgG-DM1)。結(jié)合由皂草素蛋白的山羊抗人類IgG，Hum-ZAP(TM，cat # IT-22-250，親和純化的山羊抗人類IgG-皂草素蛋白)是來自Advanced Targeting Systems(San Diego，CA，U.S.A.)。H80和H1477細胞以每孔100μl生長介質(zhì)中1000細胞的濃度平板接種在96孔板上。24小時后，將第一抗體與第二抗體1∶3混合，連續(xù)地在6個空中1∶5稀釋。100μl稀釋的第一抗體和毒素第二抗體混合物以第一抗體的最終初始濃度0.1μg/ml、第二抗體的最終初始濃度0.3μg/ml加入細胞的孔中。允許這些平板繼續(xù)培養(yǎng)3天。在第四天，加入購自Promega(Madison，WI，U.S.A.)的CellTiter-Glo試劑(cat # G7571)并用螢光閱讀。圖11A-111、12A-12I和13A-13I顯示這個實驗的結(jié)果。在大多數(shù)EGFRvIII特異mAb測試中比較在HI477(填圓圈)與在H80(填方塊)的Hum-ZAP為介質(zhì)的抗原特異殺傷。MAb XG1-131和XG1-139用mah-AEFP產(chǎn)生抗原特異二級殺傷，在較小范圍用mah-DM1。在測試的抗體中，XG1-131至少在一個記錄中比13.1.2、XG1-095、XG1-139、XG1-150、XG1-170、XG1-250和XG1-211有更好的表現(xiàn)。IgG1被用作陰性對照且將抗原陽性細胞(H1477)與抗原陰性細胞(H80)進行比較。
需要的特異殺傷的量可視特定的使用而改變。在一個實施例中，任何可能的癌細胞的減少都是足夠的。例如，0-1、1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99或100％目標細胞的減少將是足夠的。在另一個實施例中，期望的目標細胞數(shù)量的減少還是抗體組合的非特異性破壞的一個功能。例如，如果有很少的抗體的非特異性目標和破壞，僅具有10％目標細胞數(shù)目減少的抗體/毒素組合可能就足夠了。例如，抗體/毒素混合物殺傷低于非目標群的10％。同樣，特定的量將取決于特定需要和情況。特別有用的抗體是那些對目標細胞(例如H1477)具有高選擇性并與目標細胞良好結(jié)合的。在一個實施例中，目標為EGFRvIII蛋白或其片段。在一個實施例中，展示了人類或人源化的、可有效內(nèi)在化的、對EGFRvIII蛋白或其片段特異的、與EGFRvIII蛋白或片段緊密相連且與有效的毒素相連的抗體。
實例9 二級細胞毒性試驗除了細胞毒性試驗之外，還在產(chǎn)克隆試驗中測試了EGFRvIII特異性抗體。特異EGFRvIII抗體將與毒素結(jié)合的第二抗體導向EGFRvIII轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細胞瘤細胞系(H1477)，毒素在細胞內(nèi)被釋放，且最終降低了細胞增殖形成克隆的能力。因此，當細胞在第一和二級毒素抗體處理后被再次平板接種時，這些EGFRvIII抗體-毒素的應(yīng)用產(chǎn)生克隆數(shù)量的減少。在這個實例中，H80和H1477細胞被以每孔30,000細胞的密度再次平板接種到6個平板上并過夜孵育。第一抗體和二級毒素抗體以1∶3的比例混合。將此抗體混合物以第一抗體0.5μg/ml、第二抗體1.5μg/ml的終濃度加入合適的孔中。在37℃過夜孵育。孵育后，合適地處理該毒素混合物，且用1x胰蛋白酶將細胞從中分離。細胞被計數(shù)并以每板200細胞的密度平板接種到新的6孔板中。平板接種對應(yīng)每個處理組的三個復(fù)本。在37℃孵育這些平板2-3周，直至形成克隆且可以用肉眼或顯微鏡下識別。吸出介質(zhì)并加入5M亞甲基藍1小時。用水洗滌平板并計數(shù)克隆。圖14A和圖14B展示這個實驗的結(jié)果?？梢姡蜏y試的三種EGFRvAIII抗體，mab-AEFP二級毒素抗體抑制了克隆形成。
實例10 抗EGFRvIII抗體(13.1.2)細胞毒性試驗中的直接結(jié)合通過抗體與細胞毒藥物的直接結(jié)合提供了一個抗體能夠?qū)⒁粋€藥物輸送到一個腫瘤細胞的進一步證據(jù)。在下列實例中，EGRvIII抗體13.1.2直接與auristatin E MMAE，與AEFP通過肽鍵結(jié)合(MMAE和AEFP均購自Seattle Genetics且在上文中有所描述)，且與美登素(DMI)以硫醇鍵結(jié)合(DM1購自Immunogen且在上文中有所描述)。一旦向表達EGFRvIII抗原H1477的細胞中加入結(jié)合物，便觀察到特異的細胞毒性。不表達抗原H80的細胞僅在當暴露于非常高濃度的抗體時才被殺傷。在圖15A-15C中展示此試驗的結(jié)果。
EGFRvIII抗體與藥物或毒素的直接結(jié)合是用于治療的特別有優(yōu)勢的方法。因此，最初的試驗顯示這樣的結(jié)合確實導致表達EGFRvIII的細胞的特異殺傷。
實例11 體內(nèi)抗EGFRvIII抗體特性。
一種確定抗體是否能夠?qū)⒓毎拘运幬镙斔偷郊毎目蛇x方法是評價結(jié)合抗體在體內(nèi)的人類腫瘤的生長的效果。本實例提供了這樣一個方法。在體外培養(yǎng)H1477成神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，通過胰蛋白酶收獲，并如下文所解釋埋在基質(zhì)膠中。向雌性裸鼠體內(nèi)皮下注射五百萬細胞，并允許腫瘤發(fā)展直至其達到約0.5cm3的大小。此時將動物隨機分組，并開始用指示濃度的結(jié)合抗體沒4天一次皮下注射的處理。圖16中的結(jié)果顯示抗體13.1.2當與美登素(dEGFR-DM1)或auristatin E(dEGFR-MMAE)結(jié)合時可導致膠質(zhì)母細胞瘤的退化。如果與相等的未結(jié)合的藥物一同給藥時，(組2)，對腫瘤生長沒有影響，說明體內(nèi)定向腫瘤細胞需要抗體與毒素的結(jié)合。
上文使用的動物模型由將H1477細胞異種移植物注入裸鼠獲得。將不同量的細胞單獨或與MATRIGEL一同注入8周nu/nu雌性小鼠中，幾天后分析腫瘤植入。從這個分析中，識別允許大約尺寸腫瘤的細胞數(shù)量為在MATRIGEL中約22天的五百萬細胞。組G8作為對照被包括，用于展示殺傷是抗體特異的。組G7作為陰性對照被包括。
因此發(fā)展出下列用于毒素研究的一個方案第1天在MATRIGEL中的5百萬個腫瘤細胞被植入8周大雌性小鼠。第22天如表11.1所展示，通過I.V.每四天用抗體前藥處理。
表11.1


結(jié)果在圖16中展示，箭頭指示藥物的添加。組G1、G6和G4展示了有效的殺傷。組G3展示較少量的殺傷。組G8和G7未展示出殺傷。在高劑量的vc-AEFP組-組G8中可能觀察到一定的毒性。這些動物接受兩次250μg的處理和一次125μg的處理。
實例12 在癌癥患者/人類腫瘤中的EGFRvIIIEGFRvIII在人類腫瘤上的表達通過從多個癌癥患者和已知特異結(jié)合EGFRvIII的2個鼠類單克隆抗體(B9，IgG1和Y10，IgG2(Dr.Bigner，Duke University))的結(jié)合的冰凍組織部分的染色確定。相同部分用同型匹配的對照抗體染色。表12.1中展示了從患者樣品中獲得的染色結(jié)果的總結(jié)。
表12.1

EGFRvIII＞+包括所有表達EGFRvIII的腫瘤EGFRvIII＞++包括至少表達10％或更多EGFRvIII的腫瘤表達主要在細胞膜及/或細胞質(zhì)上發(fā)現(xiàn)。顯著數(shù)量的乳(31％)、NSCL(47％)和頭頸(42％)癌樣本染色呈EGFRvIII陽性。在特定例子中，為了獲得高質(zhì)量的IHC染色，兩個抗體的使用可能比用一個抗體更好。冰凍組織樣本比固定組織更好。
所述領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，在使用治療的抗體之前測試患者以確保待處理的腫瘤表達EGFRvIII是有利的。
實例13 體內(nèi)抗EGFRvIII抗體特性實例11的方法將被用來處理肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這將通過制作動物模型廣泛檢測。用于成神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肺癌的動物模型如下形成將表達wt-EGFR的肺癌細胞用EGRFvIII轉(zhuǎn)染。將細胞注入nu/nu小鼠的肺中，允許腫瘤發(fā)展到與上文可比較對階段?？笶GFRvIII結(jié)合物隨后每1至10天(視需要)被皮下注入。將對這些癌細胞繼續(xù)生長的大小、阻礙或壓抑進行監(jiān)控，以確定這些抗EGFRvIII抗體和抗體-毒素結(jié)合物的效果。所述領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本文揭示的任何抗體都可以這么做。
實例14 通過取代分析分析肽的功能特性為了進一步解決這些對EGFRvIII表位不可缺少的氨基酸殘基的識別，進行對表位肽的氨基酸殘基的取代分析。起始位點為來自實例4的序列LEEKKGNYVVTD(SEQ IDNO 59)。在這個實例中，定位的表位的每個氨基酸被逐個由20個L型氨基酸取代，因此，合成所有可能的單位點類似物，并進行篩選以提供肽結(jié)合模式的詳細信息。離散取代模式被用于mAb 131 and 13.1.2的識別。結(jié)果在表14.1中總結(jié)。
表14.1

其顯示，mAb 13.1.2，5殘基對結(jié)合(粗體)很重要，盡管只有4個殘基對于mAb 131的結(jié)合是必須的。剩下的殘基被多種氨基酸取代而沒有顯著的結(jié)合的丟失。盡管在序列和長度上131和13.1.2是相同的，但其結(jié)合模式不同。MAb 131的結(jié)合對殘基EKNY(SEQID NO60)有很強的依賴性。另一方面，數(shù)據(jù)顯示殘基EEKGN(SEQ ID NO61)涉及在mAb13.1.2的結(jié)合。
實例15 mAb鏈改組改組MAb131和13.1.2的重鏈和輕鏈，并將其瞬間轉(zhuǎn)染到293T細胞。七十二小時后，收集上清液并用ELISA進行分泌及EGFrVIII結(jié)合試驗。
結(jié)果顯示抗體來源于有13.1.2κ鏈的131重鏈的表達，反之亦良好地表達，但由于兩種EGFrVIII抗原的抗體不同的結(jié)合模式結(jié)合活性下降了75％(數(shù)據(jù)未顯示)。這顯示了131和13.1.2mAb互補位的不同，再次暗示在兩種mAb選擇的表位的結(jié)構(gòu)特征是不同的。
實例16 131及其互補位的分子模型化本實例表明如何可以產(chǎn)生實施例蛋白的三維結(jié)構(gòu)?？贵w131的可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型通過一個同源模型化方法產(chǎn)生，所述方法使用Accelrys(San Diego，CA)的InsightII模型化包裝。根據(jù)以下所描述的表16.1的可變區(qū)的序列構(gòu)建模型。殘基的編號方式從輕鏈氨基酸開始，并延續(xù)至重鏈氨基酸。
表16.1

使用抗體131的序列在蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中搜索，以識別出同源抗體及其結(jié)構(gòu)。在相似與131抗體的同源抗體序列的基礎(chǔ)上，選擇了一些結(jié)構(gòu)。從蛋白數(shù)據(jù)庫中選到的用于模型化樣品的結(jié)構(gòu)具有蛋白數(shù)據(jù)庫識別號1HEZ、2H1P、1AQK、1DQL、1MF2和1FLR。隨后重疊比對這些模板結(jié)構(gòu)并用于產(chǎn)生這些模板的基于結(jié)構(gòu)的序列比對。隨后將抗體131可變區(qū)的序列與模板序列比對。使用結(jié)構(gòu)與序列的比對結(jié)果用于產(chǎn)生131抗體可變區(qū)的分子模型。CDR1序列的輕鏈是RSSQSLVHSDGNTYLS(SEQ ID NO 103)。CDR2序列的輕鏈是RISRRFS(SEQ ID NO 103)。CDR3序列的輕鏈是MQSTHVPWT(SEQ ID NO 105)。CDR1序列的重鏈是NYGMH(SEQ ID NO 108)。CDR2序列的重鏈是VIWYDGSDKYYADSVRG(SEQ ID NO 110)。CDR3序列的重鏈是DGYDILTGNPRDFDY(SEQ ID NO 112)。
抗體131的互作表面是根據(jù)結(jié)構(gòu)模型計算的并在圖11中顯示。不同CDR識別如下L1(輕CDR1)10、H1(重CDR1)20、L230、H240、L350和H360。所預(yù)測的抗體131互作表面的一個顯著特指是一個深洞。深洞主要由重鏈CDR2、CDR3和輕鏈CDR3所環(huán)繞，并且其一小部分歸因于輕鏈CDR1。所述洞可能是結(jié)合凹穴。在5埃的結(jié)合洞內(nèi)是殘基31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和223。這些殘基可能包含互補位并在結(jié)合EGFRvIII互補位時起到關(guān)鍵接觸的作用。這些殘基通常還可能提供結(jié)合位點的主要結(jié)構(gòu)特征。
實例17 證實抗體131的模型的位點定向突變發(fā)生本實例證明了一個方法，通過這個方法可以測試認為殘基在結(jié)合中是重要的模型。本實例還引出一些抗體變體。通過引入至mAb 131重與輕鏈的單獨殘基突變產(chǎn)生了131克隆的抗體變體。隨后分析這些變體以確定點突變的所替換側(cè)鏈怎樣影響抗原結(jié)合。
在mAb 131重與輕鏈進行了改變。在重鏈上，通過位點定向突變發(fā)生使L216改變成R。在輕鏈上，V99改變成F。影響了變體抗體表達與分泌的兩種突變與野生型序列進行了比較。兩種突變都引起了mAb變體結(jié)合EGFRvIII抗原的損耗。因為這些殘基分別替換成R和F引起了活性的降低，所以這證明了L216和V99可能與EGFRvIII抗原顯著的接觸。當然，這些替換破壞抗體的普通結(jié)構(gòu)，因此其一直是一個選擇。
實例1813.1.2及其互補位的分子模型化13.1.2抗體可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型通過一個同源模型化方法產(chǎn)生，所述方法使用Accelrys(San Diego，CA)的InsightII模型化包裝。使用已發(fā)表的x光晶體結(jié)構(gòu)作為模板，根據(jù)下表18.1所示的可變區(qū)序列構(gòu)建模型。
表18.1


CDR1序列的輕鏈是RSSQSLVHSDGNTYLS(SEQ ID NO101)。CDR2序列的輕鏈是KISNRFS(SEQ ID NO116)。CDR3序列的輕鏈是MQATQLPRT(SEQ ID NO118)。CDR1序列的重鏈是SYGMH(SEQ ID NO121)。CDR2序列的重鏈是VIWYDGSNKYYVDSVKG(SEQ ID NO123)。CDR3序列的重鏈是DGWQQLAPFDY(SEQ ID NO125)。
使用抗體13.1.2的序列在蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索，以識別出同源抗體。根據(jù)其序列與抗體13.1.2.的相似性，選擇了具有蛋白數(shù)據(jù)庫識別號1HEZ、2H1P、8FAB和1AQK的結(jié)構(gòu)作為模型化模板。重疊比對這些模板結(jié)構(gòu)并用于產(chǎn)生這些模板的基于結(jié)構(gòu)的序列比對。隨后將13.1.2抗體可變區(qū)的序列與模板序列比對。使用結(jié)構(gòu)與序列的比對結(jié)果用于產(chǎn)生抗體13.1.2可變區(qū)的分子模型。
計算模型的互作表面并在圖12中顯示。13.1.2模型的一個主要特征是在CDR區(qū)的表面上具有一個長且窄的溝槽。所述溝槽由重鏈CDR2140、CDR3160和輕鏈CDR1 110、CDR2 130和CDR3 150所勾畫。溝槽的一段接觸輕鏈CDR3150的剩余部分，并且另外一段在靠近重鏈-輕鏈界面處打開重鏈CDR3160的較寬區(qū)域。所述溝槽可能是抗原的結(jié)合凹穴。在5埃的結(jié)合洞內(nèi)是殘基31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、163-166、172和211-221。這些殘基可能包含結(jié)合EGFRvIII表位的互補位。這些殘基通常還可能提供結(jié)合位點的主要結(jié)構(gòu)特征。
實例19 肽與抗體的對接模型實例14中的表位作圖研究顯示了需要用于結(jié)合表位至13.2.1mAb抗體接合部位的相關(guān)氨基酸位于6-殘基肽中EEKKGN(SEQ ID.NO127)。因此，產(chǎn)生了這6-殘基肽復(fù)合體與13.1.2結(jié)構(gòu)CDR區(qū)的對接模型。首先，產(chǎn)生了肽EEKKGN(SEQ ID NO127)的模型。除了這次使用1I8I X光晶體結(jié)構(gòu)之外，與前述相似使用這個作為模板，所述晶體結(jié)構(gòu)是在蛋白數(shù)據(jù)庫中識別出的。然后，這個肽結(jié)構(gòu)手工放置于長溝槽內(nèi)以形成起始組裝復(fù)合體。使用InsightII中Docking模塊隨后在構(gòu)像和定向空間中自動進行Monte Carlo搜索。通過給予每個Phi、Psi和Chi角完全旋轉(zhuǎn)自由度，以允許肽構(gòu)像的可彎曲性。在對接過程中，允許5埃結(jié)合溝槽內(nèi)的殘基在其它抗體殘基被固定的同時移動。Monte Carlo搜索發(fā)現(xiàn)的似是而非的構(gòu)造經(jīng)刺激退火和能量最小化以達到最終復(fù)合體結(jié)構(gòu)模型。對于所獲的每一個對接模型，使用InsightII包裝的Discover_3模塊計算抗體與肽之間的互作能量。評估所有對接模型的互作能量，并測驗具有最強全部抗體-肽互作的模型且其在圖13A與13B中顯示。在本對接模型中，如圖13B所示，存在6個肽EEKKGN(SEQ ID NO127)與抗體13.1.2間的氫鍵。從N末端向C末端對肽殘基編號1至6。綠色虛線指示6個氫鍵。形成氫鍵的6對氨基酸是E2...Y172、K3...H31、K4...H31、N6...D33、N6...Y37和N6...K55。在本對接模型中，在延伸α-鏈構(gòu)造中肽束縛與于溝槽。肽中殘基替換地面向溶劑和抗體表面。面向結(jié)合溝槽的殘基是E2、K4和N6，所述結(jié)合溝槽最顯著接觸抗體。這指示這3個殘基可能對于肽結(jié)合與表位作圖結(jié)果一致是重要的。使用Discover_3模塊計算每個6肽殘基與13.1.2抗體接合部位的互作能量，并在表19.1中顯示。表19.1顯示每個6肽殘基與13.1.2抗體接合部位的互作能量。所有的能量以kcal/mol的單位表示。
具有最強互作能量的殘基依次是N6、K4和E2，再一次與實驗數(shù)據(jù)一致證實這些殘基在抗體-抗原互作中是抗原邊的重要貢獻者。這些數(shù)據(jù)提供支持對接模型的有力證據(jù)。在本實施例中，抗體接合部位定義為5埃對接肽內(nèi)的殘基。包含如此定義的互補位的20個殘基是殘基31-33、35、37、55、96-101、148、163、165、170、172、178和217-218。在一個單獨殘基的基礎(chǔ)上，為了評估抗體-抗原互作中抗體的每個這些殘基的貢獻，計算了每個上述20個殘基的互補位與肽EEKKGN(SEQ ID NO127)間的互作能量。結(jié)果列在表19.2中。表19.2顯示每個20互補位殘基與肽EEKKGN(SEQ ID NO127)的互作能量。所有的能量以kcal/mol的單位表示。與肽具有最強互作能量的殘基是Lys55和His31，接著是Tyr172、Ala96、Asp33、Tyr37、Leu99、Thr97、Gln98、Lys178和Asn170。
表19.1

表19.2


實例20改進親和力抗體的合理設(shè)計本實例證明通過位點定向突變發(fā)生，對接模型怎樣可以用作改進親和力抗體合理設(shè)計的根據(jù)。計算機模擬(in silico)使每個13.1.2互補位殘基突變成所有19個其它氨基酸，中引出了總計19×20或380個虛擬突變體。突變通過殘基替換完成，其后接著50步能量最小化步驟，這解決了可由側(cè)鏈改變所誘導的任何局部構(gòu)像改變。計算每個突變體的全部肽與全部互補位間的互作能量。具有較野生型13.1.2強的總共相互反應(yīng)能量的突變體可以潛在地具有與肽EEKKGN(SEQ ID NO127)的較高親和力，并且，甚至可能是與全部的EGFRvIII蛋白。與野生型13.1.2相比，這些突變體大部分具有較高的庫侖互作，但是其中的一些與野生型抗體相比具有較低的van der Waals(VdW)互作。野生型13.1.2抗體的VdW互作能量是-9.689kcal/mol，淘汰掉小于-8.5kcal/mol VdW互作能量的突變體。表20.1中列出了剩余具有較野生型13.1.2強的總共互作能量的突變體。表的底部列出了野生型數(shù)據(jù)用于比較。所有的能量以kcal/mol的單位表示。
表20.1


表20.1列出的突變體可以是工程化改進親和力抗體的候選。對于列表中頂部的14個候選，進一步分析抗原邊與抗體邊每殘基的貢獻，以檢測所提議修飾的影響。用于活體外位點定向突變發(fā)生的10個突變體是Tyr172Arg、Arg101Glu、Leu99Asn、Leu99His、Arg101Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、Arg101Gln和Asn35Gly。結(jié)果可見于實例21。
實例21 證實13.1.2模型的位點定向突變發(fā)生本實例證明了一個方法，通過這個方法可以測試認為殘基在結(jié)合中是重要的上述模型。本實例還引出一些抗體變體。通過單獨殘基突變產(chǎn)生了13.1.2抗體變體，單獨殘基突變是引入13.1.2mAb的重和輕鏈。分析變體以確定抗原結(jié)合中許多側(cè)鏈的貢獻。通過位點定向突變發(fā)生引入的一列突變總結(jié)在表21.1中。
表21.1

表21.1中的10突變中的每一個都引入至13.1.2 mAb的重或輕鏈。每個經(jīng)突變鏈隨后以293個細胞中的互補野生型鏈轉(zhuǎn)染。隨后測試上清液的人類IgG抗體的表達和分泌，以及結(jié)合EGFrVIII抗原。通過ELISA確定的結(jié)果總結(jié)在表21.2中。
表21.2


實例22EGFRvIII/pFLAG變體構(gòu)建體的準備本實例證明作用制造EGFRvIII的變體。引物對9712和9713(Qiagen，Valencia，CA)產(chǎn)生一段1092bp編碼的片段EGFRvIII的胞外域。
Primer # 97125′-ataaaagcttctggaggaaaagaaaggtaatta-3′(正義)(SEQ ID NO128)；Primer # 97135′-TTATTGGTACCTCAGGCGATGGACGGGATCTTA-3′(反義)(SEQ IDNO 129)用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolle，CA)從質(zhì)粒模板EGFRvIII-rbIgG/pCEP4(如上述)擴增。引物#9712引入HindIII位點且引物#9713引入KpnI位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)過柱純化(Qiagen column purification kit，Valencia，CA)，HindIII和KpnI(NEB，NewEngland Biolabs，Beverly，Mass.)消化并膠純化(Qiagen gel purification kit，Valencia，CA)。T4 DNA連接酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)連接片段至HindIII與KpnI(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)線性化的pFLAG-CMV-1(Sigma，St.Louis，MO)。引出的載體被命名為EGFRvIII/pFLAG-CMV-1#1。
實例23EGFRvIII/pFLAG重組蛋白的準備本實例證明怎樣可以制得變體EGFRvIII。首先，500μg EGFRvIII/pFLAG-CMV-1#1質(zhì)粒DNA再懸浮于25ml Opti-MEMI(Invitrogen，Burlington，ON)，并且與再懸浮于25mlOpti-MEMI的500μl 293fectin(Invitrogen，Burlington，ON)結(jié)合?；旌衔镌谑覝叵聹赜?0min，并隨后與準備在1L 293 FreeStyle培養(yǎng)基(Invitrogen，Burlington，ON)中的293T cells(1×109)混合，所述培養(yǎng)基補充有2％FBS和50μg/ml G418(Invitrogen，Burlington，ON)。細胞在37℃、8％CO2及125rpm轉(zhuǎn)速下生長7天。
根據(jù)廠商的實驗方案，使用Anti-FLAG M2 Affinity Chromatography試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)純化融合蛋白。
如下制備單體融合蛋白。首先，純化蛋白(1508μg)以終濃度10mM的DTT 55℃還原30分鐘。然后，加入IAA(碘乙酸)(Sigma，St.Louis，MO)至22mM，并在室溫暗處溫育15分鐘，接著在4℃的7k MWCO透析盒(Pierce，Rockford，Ill)中抗PBS透析。
Examples 24-30抗體變體的結(jié)合研究以下實例包含Biacore實驗(表面等離子共振)和KinExA實驗。這些實例證明怎樣測試由上述實例制得的許多抗體及其變體，以確定它們是否具有所需結(jié)合特征。所有經(jīng)測驗的變體都是13.1.2背景的變體。
實驗儀器所有的表面等離子共振實驗都是使用Biacore 2000光學生物傳感器(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)進行。所有的動力排斥測定(Kinetic Exclusion Assay)都是使用KinExA3000儀器(Sapidyne Instruments，Inc.，Boise，ID)進行。試劑從Anatech，Inc.(San Jose，CA)定制合成并購得Pep-3，NH2-LEEKKGNYWTDHG-OH(MW＝1590Da)(SEQ ID NO130)。室內(nèi)準備所有的mAbs。室內(nèi)準備MW 39,907的抗原EGFRvIIIpflag(反應(yīng)碘乙酸以阻止游離羥硫基(sulfhdryl)基團的聚合)。從FisherScientific(Pittsburgh，PA)購得牛血清白蛋白(BSA)部分V(#BP1605-100)。其它所有普通試劑均購自Sigma-Aldrich，Inc(St.Louis，MO)。
所有用于Biacore和KinExA分析的抗原和mAb樣品在含有100μg/mL BSA的(0.01M HEPES，0.15M NaCl，0.005％表面活性劑P-20，Biacore Inc.，Uppsala，Sweden)真空除氣HBS-P緩沖液中準備。Biacore耦胺劑、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和乙醇胺購自Biacore，Inc.。對于pep-3/mAb 131實驗，Biacore表面活性劑再生具有26mM NaOH的12秒脈沖。所有其它mAb在20分鐘內(nèi)解離至基線。研究級CM5生物學感測器芯片購自Biacore，Inc。
KinExA檢測抗體是Fcγ特異Cy5-標記的羊抗人類IgG()并從0.5mg/mL儲液(1×PBS，pH 7.4)以HEPES緩沖液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，pH 7.2)稀釋1000倍。用于KinExA實驗的固相粒子是NHS激活的Sepharose 4 Fast Flow珠(PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden，#17-0906-01)。在瓊脂糖珠與抗原反應(yīng)之前，微離心管內(nèi)1.5ml的珠儲液等分量經(jīng)離心并以冷的去離子H2O水至少水洗6次。一旦用碳酸鈉緩沖液(0.05M，pH 9.3)沖洗珠子之后，碳酸鈉緩沖液中的抗原(～40μg)就添加到瓊脂糖珠上。瓊脂糖/抗原管4℃過夜搖晃。搖晃之后，搖動瓊脂糖并以1M Tris緩沖液，pH 8.3沖洗兩次?？乖坏闹樽与S后在含有2％BSA的1M Tris緩沖液中室溫下?lián)u晃1小時。
Biacore測量使用標準EDC/NHS和碳水化合物耦聯(lián)以共價固定mAb至CM5感測器芯片。為了最小化大量的傳輸與擁擠，將mAb固定在一定水平上，此時氣給予不超過50-100RU的最大抗原結(jié)合應(yīng)答(Rmax)。每個芯片上的參照流動細胞以無mAb的固定來激活或阻止，使其當作對照。
在23℃下進行所有的Biacore動力學實驗。對于每個實驗，用2倍稀釋液準備一組連續(xù)的6至8個抗原濃度(從1.01μM pep-3開始)。在三個重復(fù)中在室溫感測器的表面以100μL/min任意的注射的抗原樣品。每個pep-3濃度和空白都注射90秒。接著解離13至180分鐘。通過以三個額外空白注射替換三個額外251nM pep-3注射以及接著3-4小時的解離時期獲得了結(jié)合至mAb 131的pep-3解離數(shù)據(jù)。
使用Scrubber軟件(Version l.lf，BioLogic Software，Australia)處理所有的Biacore感測譜。首先在y軸上調(diào)零感測譜，并且隨后在注射開始時x排列。通過減去參照流動細胞的應(yīng)答而移除大量折射指數(shù)的改變。從所有的被分析物和空白感應(yīng)譜中減去所有空白注射的平均應(yīng)答以移除實驗與參照流動細胞間的系統(tǒng)人工因素。使用CLAMP生物感測器數(shù)據(jù)分析軟件(Version 3.40，BioLogic Software，Australia)確定經(jīng)處理數(shù)據(jù)組的ka和kd。所有流動細胞的數(shù)據(jù)都全部適合包括大量傳輸?shù)臈l件的1∶1雙分子結(jié)合模型。對于一些mAb，對應(yīng)于pep-3連續(xù)濃度的第一或第二濃度的注射被排除在非線性動力適合之外，在適合非線性動力中感應(yīng)譜不能通過1∶1互作模型很好的描述是明顯的。從kd/ka的商計算KD。
KinExA平衡測量在室溫下(～23℃)進行所有的KinExA實驗。對于所有的平衡實驗，抗原被連續(xù)地稀釋成具有恒定mAb結(jié)合位點濃度的溶液。對于第一10滴定點，稀釋液是2倍的并且第11和第12連續(xù)稀釋液是10倍的。所有實驗的樣品流動速率是0.25mL/min，并且標記抗體流動速率是0.5mL/min?？乖?抗體樣品隨后允許達到平衡，此過程需要花費～48-72hr。對于pep-3/mAb 131 KinExA實驗，KD-控制滴定中pep-3的起始濃度是352nM，并且恒定[mAb binding site]＝219pM；對于mAb-控制滴定，起始[pep-3]＝251nM，且[mAb binding site]＝11nM。在pep-3/mAb 131的KD-控制實驗期間，流動細胞中每個樣品提出1.25mL?？贵w控制實驗中分析了250μL的樣品體積。對于所有平衡實驗，測量每個樣品的兩個或三個重復(fù)。使用KinExA軟件(Version 2.4，Sapidyne Instruments)，平衡滴定數(shù)據(jù)適合1∶1結(jié)合模型的雙曲線分析。
僅在KD-控制條件下研究了EGFRvIIIpflag/mAb 131復(fù)合體的KinExA。起始[EGFRvIIIpflag]是198nM，并且[mAb binding site]是150pM。流動細胞中提出1mL體積的樣品。收集所有樣品的重復(fù)測試數(shù)據(jù)。使用KinExA軟件(Version 2.4，SapidyneInstruments)，平衡滴定數(shù)據(jù)適合1∶1結(jié)合模型的雙曲線分析。參看以下實例28的結(jié)果和預(yù)測平衡常數(shù)。
對于EGFRvIIIpflag/mAb 13.1.2復(fù)合體的KinExA滴定，EGFRvIII的起始濃度是5.26μM(mAb-控制)、230.1nM(KD-控制)，并且[mAb binding site]＝9.59nM(mAb-控制)、498pM(KD-控制)。在KD-控制實驗期間，流動細胞中每個樣品提出1.30mL?？贵w控制實驗中分析了250μL的樣品體積。對于所有平衡實驗，測量每個樣品的兩個或三個重復(fù)。使用KinExA軟件(Version 2.4，Sapidyne Instruments)，平衡滴定數(shù)據(jù)適合1∶1結(jié)合模型的雙曲線分析。
實例24 抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定通過使用Biacore的Surface Plasmon Resonance(SPR)儀器觀測野生型mAb 131的結(jié)合動力學特征。歸因于極低的kd和快速ka，因此KD是極低的，僅為380pM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝2.246*106和kd＝8.502*10-4。
在一個實施例中，展示了改進的或具有改進動力學的變體抗體。通過改進的動力學，意為結(jié)合表位的一個抗體動力元件好于先前已知用同樣表位的抗體的同樣元件。舉例而言，具有大于(結(jié)合能力)1.3*10-9M KD結(jié)合pep-3的抗體可為改進抗體。涵蓋如此具有小于500nM、500-300nM、300-100nM、100-1nM、1.3nM、1.3nM至1000pM、1000pM至900pM、900-500pM、500-400pM、400-300pM、300-100pM、100-50pM、50-1pM的KD或更小KD的抗體。
實例25抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定與實例24相似，測驗了mAb13.1.2至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計KD的是67nM，但是實驗之間有較小的偏差。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝2.835*105和kd＝0.01922。
實例26抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定與實例24相似，測驗了mAb 095至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計的KD是66nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝1.491*105和kd＝9.927*10-3。
實例27抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定與實例24相似，測驗了mAb 139結(jié)合Pep-3(EGFRvIII表位)的動力。估計的KD是290nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝10328和kd＝2.981×10-3。
實例28抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定為了更完全的分析抗體的結(jié)合特征，進行KinExA實驗以確定mAb 131的結(jié)合特征。根據(jù)雙曲線分析確定的KD是1.74*10-10。在一個KinExA實驗中，EGFRvIIIpflag至mAb131的KD是6.266*10-11。
實例29變體抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定為了更完全的分析13.1.2抗體的結(jié)合特征，進行KinExA實驗以確定mAb 13.1.2的結(jié)合特征。根據(jù)雙曲線分析確定的KD是7.538*10-10。此外，本實例中的抗原是EGFRvIIIpflag，并且其與碘乙酸(IAA)反應(yīng)。
實例30Biacore結(jié)果與KinExA結(jié)果的比較下表30.1中展示了先前實例和KinExA測試的結(jié)果。表30.1中括號內(nèi)的數(shù)字是95％的置信區(qū)間。“ND”是未確定，以及“*”代表結(jié)合EGFRvIIIpflag(反應(yīng)的碘乙酸)，而不是pep-3。
如速率常數(shù)所顯示的，mAb 131展示具有最大的締合常數(shù)并具有最小的解離常數(shù)，因此使得mAb 131有最小的KD。
表30.1

實例31L99T-5.3變體抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定測驗了mAb L99T-5.3至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。第一步驟是使用標準EDC/NHS耦聯(lián)化學，將5,600個共振單元(RU)固定在CM5感測器芯片兩個流動細胞(Fc)的mAb L99T-5.3的8,000個RU上，以及將5,600個共振單元(RU)固定至一個Fc的mAb 13.1.2的8,000個RU上。這個表面密度產(chǎn)生小于100個RU的具有pep-3的結(jié)合信號?？偣彩褂昧藘蓚€CM5感測器芯片以固定兩個mAb。使用先前收集的數(shù)據(jù)，產(chǎn)生了兩個抗體允許待計算95％置信區(qū)間的總共5個獨立實驗。所有研究都使用Biacore2000光學生物感測器。
接著，pep-3流經(jīng)mAb固定的生物感測器表面。pep-3起始濃度為1.25μM，此接在任意三重復(fù)注射中8個兩倍連續(xù)稀釋液之后。為達到雙參照的目的，貫穿連續(xù)注射中每第六個樣品進行空白注射。
最后，用Scrubber處理生物感測器數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)適合采用具有包括大量傳輸條件的1∶1互作模型的Clamp的曲線。1.25μM的高濃度注射排除出動力適合，因為數(shù)據(jù)明顯的不符合1∶1互作模型。這個偏離最有可能是由發(fā)生在高濃度pep-3的非特異互作引起的。所有的動力數(shù)據(jù)滿意地適合1∶1互作模型。
所估計的KD為54-70nM。估計的其它動力參數(shù)ka＝2.238*105和kd＝0.01217，此在各個運行之間液由輕微差異。
實例32-38實例32-38進一步測驗通過使用Biacore裝置，變體mAb的結(jié)合動力。這些實例中的第一步驟是使用標準EDC/NHS耦聯(lián)化學，將5,600個共振單元(RU)固定在CM5感測器芯片的一個流動細胞(Fc)的每個經(jīng)測試的mAb L99T-5.3的8,000個RU上。這個表面密度產(chǎn)生小于100個RU的具有pep-3的結(jié)合信號?？偣彩褂?個CM5感測器芯片以一個固定在每個流動細胞上的同一mAb固定所有的突變體mAb。MAb 13.1.2包括在3個感測器芯片中兩個的一個流動細胞上。所有研究都使用Biacore 2000光學生物感測器。
接著，pep-3運行經(jīng)過mAb固定的生物感測器表面。pep-3起始濃度為4.98μM，此接在任意兩重復(fù)或三重復(fù)注射中8至11個兩倍連續(xù)稀釋液之后。為達到雙參照的目的，貫穿連續(xù)注射中每第六個樣品進行空白注射。
最后，用Scrubber處理生物感測器數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)適合采用具有包括大量傳輸條件的1∶1互作模型的Clamp。取決于mAb及其親和力，當數(shù)據(jù)明顯的不符合1∶1互作模型時，一些高濃度注射(4.98-1.25μM)排除出動力適合。這個偏離最有可能是由發(fā)生在高濃度pep-3的非特異互作引起的。所有的動力數(shù)據(jù)適合1∶1互作模型。
實例32L217Q-10.1變體抗體活體外結(jié)合常數(shù)確定 測驗了mAb L217Q-10.1至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計的KD是92nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝2.04*105和kd＝0.01885。
實例33L217N-2.1變體抗體活體外結(jié)合常數(shù)確定 相似于實例32，測驗了mAb L217N-2.1至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計的KD是185nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝2.198*105和kd＝0.04069。
實例34N35G-3.1變體抗體活體外結(jié)合常數(shù)確定 相似于實例32，測驗了mAb N35G-3.1至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計的KD是204nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝1.497*105和kd＝0.03057。
實例35變體抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定與實例32相似，測驗了mAb L99H-9.2至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計KD為395nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝83390和kd＝0.03293。
實例36變體抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定與實例32相似，測驗了mAb Y172R-1.2至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計的KD是927nM。從曲線裝置中分離到的其它動力學參數(shù)估計ka＝82237和kd＝0.07622。
實例37變體抗體結(jié)合常數(shù)的活體外確定與實例32相似，測驗了mAb L99N-4.1至Pep-3(EGFRvIII表位)的結(jié)合動力。估計的KD是1.4μM。為了確定KD，因為動力是極快而難以適合的，因此MAb L99N-4.1適合使用穩(wěn)定狀態(tài)(平衡)結(jié)合模型。
實例3813.1.2與被設(shè)計變體的比較如可見于表38.1，開發(fā)了具有改進結(jié)合特征的mAb。括號內(nèi)顯示了95％的置信區(qū)間。L99T-5.3展示增加的ka，減少的kd，并且因此全部較低的KD。盡管如果Pep-3結(jié)合mAb 13.1.2和L99T-5.3(在95％的置信區(qū)間)的平衡解離常數(shù)與動力速率常數(shù)間顯示統(tǒng)計上小的顯著差異，但是似乎仍然存在Pep-3結(jié)合L99T-5.3親和力的邊際增量具有直覺偏差。此外，當使用相同的生物感測器芯片時，L99T-5.3似乎總具有較13.1.2高的親和力。
表38.1

額外對接模型與選擇模型級預(yù)測結(jié)合親和力的方法在其它實施例中，上述實例可以與不同長度肽一起進行而不僅僅時6氨基酸長度的肽，只要肽中包括關(guān)鍵結(jié)合殘基即可。舉例而言，代替EEKKGN(SEQ ID NO127)的6氨基酸肽，可以使用EEKKGNY(SEQ ID NO131)的7氨基酸肽?？梢允褂萌魏未笮‰牡谋砦弧Ｔ谄渌鼘嵤├?，肽是選自以下肽LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO56)、LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO59)、LEEKKGNYVVT(SEQ ID NO132)和EEKKGNYVVT(SEQ ID NO57)?？梢允褂媒橛谶@里揭示的段片段至全長肽之間的任何大小的肽或其變體。
如所述領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的，存在額外氨基酸可以改變肽結(jié)合抗體的方式。不僅額外氨基酸的存在允許形成在肽與抗體間替換及額外的鍵合，而且額外的氨基酸可以改變肽的結(jié)構(gòu)以及抗體結(jié)合肽的抗體結(jié)構(gòu)。因此，在一個實施例中，可以測驗不同長度表位肽，例如EEKKGN(SEQ ID NO127)和EEKKGNY(SEQ ID NO131)的結(jié)合特性與結(jié)合最佳化。不僅肽的較長片段精確描繪對肽較長節(jié)段的肽-抗體互作，而且結(jié)合強度和包含在結(jié)合內(nèi)的殘基的改變測驗允許關(guān)于較長肽，由數(shù)據(jù)推導的額外信息。
此外，并且可能是與測試所互補的較長肽片段，可以進行額外的過濾步驟以選擇精確的對接模型。額外的過濾步驟可以允許在許多對接模型中過濾以尋找與可用實驗數(shù)據(jù)一致的模型。
在一個實施例中，過濾是基于良好離析的表位制圖數(shù)據(jù)，例如實驗特征的單獨殘基結(jié)合概況，所述制圖數(shù)據(jù)聯(lián)系于肽中每個氨基酸的計算結(jié)合能量概況。舉例而言，7氨基酸肽的結(jié)合能量概況可以用于選擇含有相似結(jié)合能量概況的對接模型。結(jié)合能量概況是肽中每個氨基酸與特定氨基酸的結(jié)合能量的賦值，氨基酸的結(jié)合創(chuàng)建肽的概況，其是根據(jù)在所述模型中的每個氨基酸結(jié)合能量。舉例而言，在一個對接模型中給定一個包含氨基酸A與B的肽，其中A具有-5的結(jié)合能量且B具有-20的結(jié)合能量，可以具有A1(-5時)與B2(-20時)的概況。這個概況可以用作選擇其它對接模型的過濾。舉例而言，使用這個結(jié)合能量概況作為過濾或“模板”可以導致其它對接模型的選擇，如果候選模型中的肽具有貢獻于位置A的相對低的值，并且具有貢獻于位置B的相對高的值(較大負值，較高絕對值)。在一個另外實施例中，模板需要額外的限制，例如位置B的值比位置A的值高4倍。
可以以許多方式將結(jié)合能量概況模板與其它對接模型內(nèi)肽的概況比較。如果結(jié)合能量概況模板與所需結(jié)合能量概況相似，那么隨后過濾可以用作選出有利對接模型用于進一步測驗。如果結(jié)合能量概況模板與所需結(jié)合能量概況不相似，那么隨后過濾可以用作消除不利對接模型。在一個實施例中，過濾過程包括具有有利和不利結(jié)合能量的模板，并且過濾用于選擇和排除對接模型。如所述領(lǐng)域技術(shù)人員以了解的，存在許多可能的不同結(jié)合能量概況，并且因此取決于不同情況，可以使用許多不同結(jié)合能量概況。在一個實施例中，可以定義結(jié)合能量概況為在肽內(nèi)特定位置具有一系列相對高結(jié)合能量的模板。在一個優(yōu)選實施例中，結(jié)合能量高空模板和模板所選擇的結(jié)合能量概況將在肽EEKKGNY(SEQ ID NO131)的位置2、4或6處具有相對高的結(jié)合能量。在另一個實施例中，結(jié)合能量概況模板在肽EEKKGNY(SEQ ID NO131)的位置2、4或6處具有相對高的結(jié)合能量。在另一個實施例中，結(jié)合能量概況模板在肽EEKKGNY(SEQ ID NO131)的位置3處具有相對的的結(jié)合能量。在以上討論中，所述位置被指派如下E1、E2、K3、K4、G5、N6、Y7。
在一個實施例中，過濾處理首先包含在K3和K4處結(jié)合能量的對比。選擇引起K4對比于K3相對較高結(jié)合能量的對接模型，同時篩除引起K4對比于K3相對較低結(jié)合能量的對接模型。因此，“相對高”意為K4的結(jié)合能量大于(負值更大，更大絕對值)K3。然后，再一次在結(jié)合能量概況模板中過濾對接模型，這一次，選擇在位置2、4或6處具有相對較高能量的結(jié)合模型，同時可以移除其它模型。因此，“相對高”意為在肽中在位置2、4或6處的結(jié)合能量比最低結(jié)合能量高(更大負值，更大絕對值)。因此，在這個實施例中，可以如下總結(jié)結(jié)合能量特征模板E1可以為任何值，E2應(yīng)該比最低值大，K3應(yīng)該小于K4，K4應(yīng)該大于最低值，G5可以為任何值，N6應(yīng)該大于最低值，Y7可以為任何值。因此，只要至少一個(或K3)小于至少E2、K4和N6中一個，E1、G5和Y7可以為任何值。在另一個實施例中，“相對高”可以設(shè)定為如模型化或?qū)嶒灤_定的標準值。在一個實施例中，對接模型通過第一過濾比對接模型通過第二過濾更佳重要。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的，不需要相繼地進行這兩個步驟，且這兩個步驟可以同時進行。
此外，取決于肽、抗體和結(jié)合條件，過濾結(jié)果的這些概況模板可以不同。給予本揭示案，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員尤其參看實例14后，可以確定合適的結(jié)合能量概況模板。舉例而言，如表14.1所示，肽結(jié)合131和13.1.2抗體，存在一些可能的重要殘基。在131mAb中，位置E2、K4、N6和Y7對于特定經(jīng)測試的肽是重要的。在13.1.2mAb中，位置E1、E2、K4、G5和N6對于特定經(jīng)測試的肽是重要的。這些重要的殘基可以是包含于創(chuàng)建結(jié)合能量概況模板中的殘基。如從以下討論可以清楚的知道，實例39中的結(jié)合能量概況模板顯示出與實例14分析所認為的不同。
實例39是模板嚴謹性較低的版本，其允許更多的模型通過篩選步驟。如果向減小通過篩選步驟的模型的樹木，那么可以進一步添加關(guān)于E1和G5的需要。
以下實例證明使用較長肽怎樣可以改變以上證明的結(jié)果及這些改變可以意為什么，以及證明使用上述用于選擇特定對接模型的過濾。
實例39 7氨基酸肽的表位-抗體對接模型本實例證明產(chǎn)生一組對接模型，所述模型是對于7殘基肽在13.1.2的CDR區(qū)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)模型。此外，本實例證明在另一對接模型上選擇一個對接模型的方法。
首先，7殘基肽EEKKGNY(SEQ ID NO131)結(jié)構(gòu)模型在延伸構(gòu)造內(nèi)建成，且用InsightII模型化包裝內(nèi)的Discover_3模塊最小化能量。然后，這個肽結(jié)構(gòu)手工放置于連接位點內(nèi)以形成起始組裝。使用InsightII中Docking模塊隨后在平移和旋轉(zhuǎn)空間中自動進行Monte Carlo搜索。在對接過程中，允許5埃結(jié)合溝槽內(nèi)的殘基在其它抗體殘基被固定的同時移動。肽被限制在5埃起始位置內(nèi)。Monte Carlo搜索發(fā)現(xiàn)的似是而非的構(gòu)造接著經(jīng)刺激退火和能量最小化以達到最終復(fù)合體結(jié)構(gòu)模型。獲得總共63個對接模型。
對于每個對接模型，肽中抗體與單獨殘基間的互作能量用Discover_3計算。表位-抗體結(jié)合中的單獨殘基貢獻概況被檢查以選擇與良好離析表位制圖數(shù)據(jù)一致的對接模型，意即“結(jié)合能量概況模板”。63個對接模型中的19個通過了這個檢查。表39.1中顯示了一個典型的單獨殘基結(jié)合能量概況。與實例14中表位制圖數(shù)據(jù)一致的，K4的結(jié)合能量是顯著的，且N6和E2是大的。這個結(jié)合能量概況模板特別強調(diào)K4大于K3的實事。這個結(jié)合能量概況也特別強調(diào)需要E2、K4和N6相對大。換句話說，E2、K4和N6的結(jié)合能量并不是肽中結(jié)合能量最低的(最少負值或最小絕對值)。表39.17殘基肽內(nèi)單獨殘基與抗體13.1.2的結(jié)合能量概況與實例14的表位制圖數(shù)據(jù)一致。
E1E2K3K4G5 N6 Y7總計-10.97-19.34-13.46-24.26-10.1-18.19 -15.15-111.45
對于基于結(jié)合能量概況上通過過濾的19個模型，在具有親和力數(shù)據(jù)的7個突變體(Tyr172Arg，實例36；Leu217Asn，實例33；Leu217Gln，實例32；Asn35Gly，實例34；Leu99Asn，實例37；Leu99His，實例35和Leu99Thr，實例31)的每一個上進行表位-抗體結(jié)合熱力學仿真。因為本復(fù)合體內(nèi)的靜電交感的程度已經(jīng)接近，所有在一系列的計算中使用許多不同的靜電常數(shù)。突變通過殘基替換完成，其后接著30-100步能量最小化步驟，這解決了可由側(cè)鏈改變所誘導的任何局部構(gòu)像改變。對于每個對接模型，對每個突變體的所選參數(shù)，計算7殘基肽與整個抗體間的互作能量。對于每組8個結(jié)合能量(7個突變體加野生型)，與Kd算法對比進行每組結(jié)合數(shù)據(jù)的線性適合過程。計算每個線性適合的相關(guān)系數(shù)。獲得一個模型的最佳相關(guān)性，所述模型具有表39.1中所述的數(shù)據(jù)，所述最佳相關(guān)性具有靜電常數(shù)l*r和50步的能量最小化。表39.2中顯示了這個模型的表位-抗體結(jié)合能量。所有數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)為0.80。參看以上實例37，因為沒有測量Leu99Asn的高精度KD，所以進行了除Leu99Asn數(shù)據(jù)之外的單獨線性適合。如圖14所示，獲得了一個極好的相關(guān)系數(shù)0.91。因此以上所選的模型很好地代表精確的對接模型。圖15顯示了具有空格填充肽的模型，且圖16顯示了氫鍵。圖16中L3 150是較低部分且H3 160是較高部分。H2 140在肽結(jié)合區(qū)域的右邊。肽自身位于結(jié)合位點內(nèi)，結(jié)合位點內(nèi)E1位于亮遮光內(nèi)的頁頂部，其下是依次變暗的K3、K4、G5、N6和Y7。圖16顯示了包含于氫鍵合的抗體殘基。本實例制得的模型證明存在7個氫鍵。K4...Q95，K4...Q95，N6...Q98，G5...H31，Y7...H31和Y7...W165。
表39.2.
與Kd對數(shù)對比，仿真表位-抗體結(jié)合熱力學

如可見于實例39中所選模型，圖15中代表，對接模型顯示了一些非預(yù)測結(jié)果。一個有趣的結(jié)果是盡管殘基E2、K4和N6在結(jié)合作為整體的肽中是重要的，但是并不是所有的這些氨基酸模型化作為包含于與抗體形成H-鍵。顯示K4包含于都與Q95形成兩個H-鍵，這與K4在結(jié)合能量概況與概況模板中的重要性一致。也顯示N6模擬以鍵合Q98；然而，在這個特別模型中，E2并步顯示在模型中形成H-鍵。一個一致的有趣趨勢是來源于結(jié)合能量概況模板的每個關(guān)鍵殘基(例如E2、K4和N6)大部分被埋藏，并因此與抗體結(jié)合溝槽緊密接觸。因此，對接模型選擇可以說明這些關(guān)鍵殘基是重要的實事，因為其與抗體的緊密互作。此外，E1可能與W214形成氫鍵。
實例39也證明上述方法引起結(jié)合能量與KD間的高相關(guān)，這認為本方法所創(chuàng)建的模型也允許抗體-肽復(fù)合體的KD的最佳化或至少預(yù)測。
如可見于實例39與實例19的對比，存在一些是兩個模型間重要的殘基，一些殘基僅在7氨基酸對接模型中顯示，以及一些殘基在7氨基酸對接模型中步顯示是重要的。舉例而言，7肽表位顯示在K4...Q95、K4...Q95、N6...Q98、G5...H31、Y7...H31、和Y7...W165間創(chuàng)造H鍵。另一方面，6肽表位顯示在E2...Y172、K3...H31、K4...H31、N6...D33、N6...Y37和N6...K55間創(chuàng)造H鍵。如可從上述數(shù)據(jù)看出，6與7氨基酸肽模型都強調(diào)H31的重要性，因為兩個模型都包含與肽形成兩個氫鍵的H31。盡管存在兩個數(shù)據(jù)組之間的其它可能趨勢，但是其也顯示許多結(jié)合互作已經(jīng)從6氨基酸模型改變成7氨基酸模型。然而，這些實例證明可以用這些模型檢測出歸因于表位大小的變化，并因此從較短至較長表位肽的縮放并步應(yīng)該是按照本揭示案的問題。存在氨基酸連續(xù)證明其在許多結(jié)合模型內(nèi)的重要性允許因此偏離許多互作的重要性，因此較短肽模型可以是較長肽互作的更典型代表。
如所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的，關(guān)于6氨基酸肽EEKKGN(SEQ ID NO127)的以上討論或?qū)嵗部梢詰?yīng)用于7氨基酸肽EEKKGNY(SEQ ID NO131)，或任何更長的肽。舉例而言，實例20可以重復(fù)實例39的信息，其是通過位點定向突變發(fā)生合理設(shè)計親和力改進的抗體。此外，使用實例39的結(jié)果可以重復(fù)實例21，接著是通過位點定向突變發(fā)生嘗試合理設(shè)計親和力改進抗體以測試從實例20分離的任何新的抗體。
在一個實施例中，使用實例39的結(jié)果以重新定義抗體與肽之間的互作區(qū)域。舉例而言，EEKKGNY(SEQ ID NO131)的互補位可以定義為包括抗體上預(yù)測為與肽互作(例如，殘基95)的其它殘基?；蛘撸鐚嵗?9，互補位可以定義為5埃對接肽內(nèi)的所有殘基。不同蛋白的計算機模擬親和力成熟。
在許多不同研究中已經(jīng)在活體外成功的得到抗體親和力成熟。通常，任意突變文庫需要通過分子生物學方法構(gòu)建，并且需要開發(fā)選擇/篩選測定以豐富具有良好結(jié)合能力的克隆。所選變體隨后需要經(jīng)純化以確定親和力。這個過程需要進行一系列長且艱苦的實驗。以下實例證明了通過單獨利用抗體-抗原復(fù)合體結(jié)構(gòu)的選擇可能精確預(yù)測親和力成熟。
實例40 通過抗體-抗原結(jié)合熱力學仿真的計算機模擬親和力成熟本實例證明可以使用計算機模擬抗體-抗原結(jié)合熱力學仿真用于親和力成熟。本實例特別證明Fab-12(IgG形式，已知為rhuMAb VEGF)與VEGF(維管內(nèi)皮生長因子)的結(jié)合動力可以通過上述計算機模擬過程預(yù)測。
使用的VEGF-Fab復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)在PDB數(shù)據(jù)庫中，并具有登錄號1BJ1，其在2.4埃解析。使用抗VEGF Fab的一系列突變體的發(fā)表實驗親和力數(shù)據(jù)用于測試觀點。VEGF-Fab結(jié)構(gòu)的3-D相配物用于以下突變體的計算機模擬突變H97Y、S100aT、T28D、28D31H、28D31H97Y100aT、N31H、Y53W、71I73K、71V73V。所述親和力數(shù)據(jù)從Chen，Y等人(J Mol Biol.，293(4)865-81(1999))獲得。如實例39所描述的在許多VEGF-Fab突變體間進行熱力學仿真。結(jié)果列在表40.1中。本實例的結(jié)果證明通過這個過程獲得了結(jié)合能量與親和力列間的顯著相關(guān)。圖17顯示結(jié)合能量的詳細適合對相對親和力的對數(shù)。-0.91的相關(guān)系數(shù)闡明計算機模仿真在原子水平精確地捕獲詳細互作。
表40.1 抗體-抗原結(jié)合能量仿真對比親和力數(shù)據(jù)。

如可從以上實例清楚的了解，可以推斷仿真鑒定不使用活體外實驗的較高親和力突變。此外，本方法對于不同抗體和不同肽明顯是有用的。僅使用高解析抗體-抗原復(fù)合體結(jié)構(gòu)，本方法可以通常應(yīng)用于執(zhí)行親和力成熟計算機模擬。在一個實施例中，這個使用計算機模擬親和力成熟將節(jié)省極大量的時間和資源。
實例41 規(guī)范類抗體確定Chothia等人已經(jīng)描述每個免疫球蛋白鏈的超變區(qū)的根據(jù)“規(guī)范類”的抗體結(jié)構(gòu)(J.Mol.Biol.1987 Aug 20；196(4)901-17)。分析多種免疫球蛋白的Fab和VL片段的原子結(jié)構(gòu)，以確定氨基酸序列與其抗原結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)的關(guān)系。Chothia等人發(fā)現(xiàn)在其包裝中，存在主要負責超變區(qū)主鏈構(gòu)造的相對極少的殘基，其氫鍵或能力呈現(xiàn)不平常的、ψ或ω構(gòu)造。發(fā)現(xiàn)這些殘基發(fā)生在超變區(qū)內(nèi)的位點并在保守β-薄片框內(nèi)。通過測驗具有未知結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白序列，Chothia等人顯示許多免疫球蛋白具有超變區(qū)，這些超變區(qū)與已知結(jié)構(gòu)具有相似的大小，并額外在負載所觀察構(gòu)造的位點處含有同一殘基。
其發(fā)現(xiàn)暗示這些超變區(qū)具有與已知結(jié)構(gòu)相近的構(gòu)造。對于5個超變區(qū)，構(gòu)造的所有組成部分顯示限制于相對小數(shù)目的離散結(jié)構(gòu)類。這些通常發(fā)生超變區(qū)的主鏈構(gòu)造的是術(shù)語“規(guī)范結(jié)構(gòu)”。Chothia等人(Nature.1989 Dec 21-28；342(6252)877-83)和其它(Martin，等人J Mol Biol.1996 Nov 15；263(5)800-15)的進一步工作證實至少抗體6個超變區(qū)的5個存在一小部分所有組成部分的主鏈構(gòu)造。
分析一些上述抗體以確定每個抗體互補決定區(qū)(CDR)的規(guī)范類。如所知的，僅將規(guī)范類分配給抗體重鏈的CDR1和CDR2，以及抗體輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。下表(41.1)總結(jié)了分析結(jié)果。規(guī)范類數(shù)據(jù)是以*HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3的形式，其中“HCDR”指重鏈CDR且“LCDR”指輕鏈CDR。因此，例如，一類規(guī)范1-3-2-1-5指具有HCDR1落入規(guī)范類1、HCDR2落入規(guī)范類3、LCDR1落入規(guī)范類2、LCDR2落入規(guī)范類1、LCDR3落入規(guī)范類5的抗體。
表41.1

如果其滿足長度需要并符合規(guī)范類中所定義的關(guān)鍵殘基，那么每個CDR(除了H3之外)都分配至規(guī)范結(jié)構(gòu)?？梢园l(fā)現(xiàn)每個抗體所定義的氨基酸，例如在參看以上Chothia等人的文章中。
等效物先前描述和實例詳述了本發(fā)明的特定優(yōu)選實施例，并描述發(fā)明者所涵蓋的最佳模式。然而，應(yīng)了解不管內(nèi)容出現(xiàn)多詳細的先前描述，本發(fā)明可以以許多方式實現(xiàn)，并且本發(fā)明應(yīng)該根據(jù)附加權(quán)利要求書和其任何等同物構(gòu)建。
序列表<110>艾伯吉尼斯公司<120>針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體及其使用<130>ABGENIX.087VPC2<150>US 60/483,145<151>2003-06-27<150>US 60/525,570<151>2003-11-26<150>US 60/562,453<151>2004-04-15<160>144<170>用于Windows4.0版的快速序列<210>1<211>109<212>PRT<213>智人<400>1Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105
<210>2<211>124<212>PRT<213>智人<400>2Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Pro Arg Asp Phe Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>112<212>PRT<213>智人<400>3Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu35 40 45Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala50 55 60Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val85 90 95Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105 110<210>4<211>118<212>PRT<213>智人<400>4Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Asn Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ala Arg Gly Leu Glu35 40 45Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Val
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<400>7Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Phe Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Phe Ile Tyr Tyr Arg Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Cys Ser Arg Thr Gly Cys Tyr Gly Gly Trp100 105 110Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro115 120 125<210>8<211>109<212>PRT<213>智人<400>8Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>9<211>116<212>PRT<213>智人<400>9Glu Gly Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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900 905 910Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala915<210>136<211>268<212>PRT<213>智人<400>136Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu1 5 10 15Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val20 25 30Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser35 40 45Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu50 55 60Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly65 70 75 80Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr85 90 95Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln100 105 110Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys115 120 125Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu130 135 140Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys145 150 155 160Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu165 170 175Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly180 185 190Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala195 200 205Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys210 215 220Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu225 230 235 240Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr245 250 255Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg260 265<210>137<211>512<212>DNA<213>智人<400>137caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgga 300tggcagcagc tggccccctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct ctagcaagag cacctctggg 420ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg ca 512<210>138<211>170<212>PRT<213>智人<400>138Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Gly Trp Gln Gln Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val165 170<210>139<211>496<212>DNA<213>智人<400>139gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60atctcctgca ggtctagtca aagcctcgtg catagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120cttcaccaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagctttcac actgaaaatc 240agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaacttcct 300cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgctagcgt tgtgtgcctg 420ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480tcgggtaact cccagg 496<210>140<211>165<212>PRT<213>智人<400>140Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu His Gln Arg Pro Gly Gln Pro35 40 45Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Thr Gln Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val PheIle Phe Pro Pro Ser Asp Glu115 120 125Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe130 135 140Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln145 150 155 160Ser Gly Asn Ser Gln165<210>141<211>110<212>PRT<213>智人<400>141Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala100 105 110<210>142<211>121<212>PRT<213>智人<400>142Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Gly Trp Gln Gln Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala115 120
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權(quán)利要求
1.一種經(jīng)分離人類單克隆抗體，其特異性結(jié)合至EGFRvIII和包含LEEKKGNYVVTDHC序列(SEQ ID NO56)的肽。
2.一種經(jīng)分離人類單克隆抗體，其特異性結(jié)合至包含LEEKKGNYVVTDHC(SEQ IDNO56)的序列中所含的表位，其中用于結(jié)合至所述序列的殘基選自由EEK、KKNYV、LEK、EKNY和EEKGN組成的群組。
3.一種經(jīng)分離人類單克隆抗體，其包含由VH3-33基因編碼的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列進一步包含由JH4b基因編碼的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列進一步包含由選自由D6-13和D3-9組成的群組的D基因編碼的氨基酸序列。
6.一種經(jīng)分離人類單克隆抗體，其包含由A23(VK2)基因編碼的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列進一步包含由JK1基因編碼的氨基酸序列。
8.一種經(jīng)分離抗體或其片段，其結(jié)合至EGFRvIII，且其包含選自由抗體13.1.2(SEQ IDNO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ ID NO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)的重鏈氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述抗體是人類抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或片段，其中所述抗體或片段與醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑締合。
14.一種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求8所述抗體的雜交瘤細胞株。
15.一種經(jīng)轉(zhuǎn)型細胞，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求8所述抗體的基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細胞，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
17.一種抑制與EGFRvIII表達相關(guān)的細胞增殖的方法，其包含以有效量的抗體或其片段處理表達EGFRvIII的細胞，其中所述抗體或其片段結(jié)合至EGFRvIII，且其中所述抗體包含選自由抗體13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ EDNO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQID NO10)、211(SEQ ID NO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)的重鏈氨基酸序列組成的群組的重鏈氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述方法在活體內(nèi)進行。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述方法在哺乳動物體內(nèi)進行。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述哺乳動物患有涉及上皮細胞增殖的癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述癌癥包含肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤或卵巢癌。
23.一種經(jīng)分離抗體，其結(jié)合至EGFRvIII且其包含重鏈氨基酸序列，所述重鏈氨基酸序列包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，其由選自由以下抗體的CDR1區(qū)氨基酸序列組成的群組的序列組成13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ IDNO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)；(b)CDR2，其由選自由以下抗體的CDR2區(qū)氨基酸序列組成的群組的序列組成13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ IDNO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)；和(c)CDR3，其由選自由以下抗體的CDR3區(qū)氨基酸序列組成的群組的序列組成13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ IDNO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述抗體是人類抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體或片段，其中所述抗體或片段與醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑締合。
29.一種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求23所述抗體的雜交瘤細胞株。
30.一種經(jīng)轉(zhuǎn)型細胞，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求23所述抗體的基因。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的細胞，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
32.一種抑制與所述EGFRvIII表達相關(guān)的細胞增殖的方法，其包含以有效量的根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述方法在活體內(nèi)進行。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述方法在哺乳動物體內(nèi)進行。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述哺乳動物患有涉及上皮細胞增殖的癌癥。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述癌癥包含肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤或卵巢癌。
38.一種經(jīng)分離抗體，其結(jié)合至EGFRvIII且其包含輕鏈氨基酸序列，所述輕鏈氨基酸序列包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，其由選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，其由選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，其由選自由標識為SEQ ID NO140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的結(jié)合至EGFRvIII的經(jīng)分離抗體，其進一步包含重鏈氨基酸序列，所述重鏈氨基酸序列包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，其由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR1區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；(b)CDR2，由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR2區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成；和(c)CDR3，其由選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR3區(qū)的氨基酸序列組成的群組的序列組成。
40.一種抑制與所述EGFRvIII表達相關(guān)的細胞增殖的方法，其包含以有效量的根據(jù)權(quán)利要求38所述的抗體或片段處理表達EGFRvIII的細胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述方法在活體內(nèi)進行。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述方法在哺乳動物體內(nèi)進行。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述哺乳動物患有涉及上皮細胞增殖的癌癥。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述癌癥包含肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細胞瘤。
46.一種經(jīng)分離多聚核苷酸分子，其包含編碼重鏈氨基酸序列的核苷酸序列或其片段，其選自由標識為SEQ ID NO138、2、4、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗體13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的重鏈氨基酸序列組成的群組，其中所述經(jīng)分離多聚核苷酸分子將結(jié)合具有標識為SEQID NO56的序列的肽。
47.一種經(jīng)分離多聚核苷酸分子，其包含編碼輕鏈氨基酸序列的核苷酸序列或其片段，其選自由標識為SEQ ID NO19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗體13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、342、333和318的輕鏈氨基酸序列組成的群組，其中所述經(jīng)分離多聚核苷酸分子將結(jié)合具有標識為SEQID NO56的序列的肽。
48.一種制造品，其包含一容器，含于其中的組合物和表明所述組合物可用于治療以EGFRvIII的表達為特征的癌癥的包裝說明書或標簽，其中所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的制造品，其中所述癌癥為肺癌、乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細胞瘤。
50.一種檢定試劑盒，其用于檢測哺乳動物組織或細胞中的EGFRvIII來篩選肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌或卵巢癌，其中所述EGFRvIII為由上皮癌癥表達的抗原，所述試劑盒包含結(jié)合抗原蛋白質(zhì)的抗體和若存在時，用于指示抗體與抗原的反應(yīng)的構(gòu)件。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的檢定試劑盒，其中所述抗體是單克隆抗體。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的檢定試劑盒，其中所述結(jié)合抗原的抗體經(jīng)標記。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的檢定試劑盒，其中所述抗體是未經(jīng)標記的第一抗體且所述用于指示反應(yīng)的構(gòu)件包含為抗-免疫球蛋白的經(jīng)標記第二抗體。
54.根據(jù)權(quán)利要求50所述的檢定試劑盒，其中所述結(jié)合抗原的抗體可由選自由熒光染料、酶、放射性核素和不透輻射材料組成群組的標記物來標記。
55.根據(jù)權(quán)利要求50所述的檢定試劑盒，其中所述結(jié)合抗原的抗體也結(jié)合至經(jīng)過度表達的野生型EGFR。
56.根據(jù)權(quán)利要求50所述的檢定試劑盒，其中所述試劑盒用于供患者臨床選擇。
57.一種抗體，與缺少Gly殘基的表位相比，其優(yōu)先識別含有新穎Gly殘基的EGFRvIII表位。
58.一種經(jīng)純化的EGFRvIII蛋白質(zhì)變體。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的變體，其中EGFRvIII蛋白質(zhì)含有pFLAG插入物。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的變體，其中所述蛋白質(zhì)變體由SEQ ID NO56的所述氨基酸序列組成。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的變體，其中所述蛋白質(zhì)變體存在于計算機模擬中。
62.一種抗體或其變體，其結(jié)合至識別序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO57)。
63.一種經(jīng)分離的抗體變體，其特異性結(jié)合至EGFRvIII。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的經(jīng)分離抗體變體，其進一步特異性結(jié)合至EGFRvIII和包含所述EEKKGNYVVT序列(SEQ ID NO57)的肽。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的經(jīng)分離抗體變體，其中所述形成所述表位的肽中的殘基選自由EKNY和EEKGN組成的群組。
66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的經(jīng)分離抗體變體，其中所述抗體結(jié)合至所述肽序列比其結(jié)合至野生型EGFR蛋白質(zhì)緊密1O倍。
67.一種經(jīng)分離抗體變體，其特異性結(jié)合至EGFRvIII和包含所述LEEKKGNYVVTDHC序列(SEQ ID NO56)的肽。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中所述互補決定區(qū)包含一深腔，其中所述腔由重鏈的CDR2和CDR3、輕鏈的CDR3和輕鏈的CDR1的一小部分形成。
69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中殘基31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和223存在于5埃結(jié)合腔中。
70.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中所述互補決定區(qū)包含一淺槽，其中所述槽由重鏈CDR2和CDR3與輕鏈CDR1、CDR2和CDR3形成。
71.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中殘基31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、163-166、172和211-221存在于5埃結(jié)合槽中。
72.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中殘基31-33、35、37、55、96-101、148、163、165、170、172、178、217和218存在于5埃結(jié)合槽中。
73.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中所述抗體的互補位經(jīng)成型以使得當肽EEKKGN(SEQ ID NO 127)的所述表位結(jié)合至所述抗體的所述互補位時，在選自由E2和Y172、K3和H31、K4和H31、N6和D33、N6和Y37及N6和K55組成的群組的兩個殘基之間形成至少一個鍵。
74.根據(jù)權(quán)利要求67所述的經(jīng)分離抗體或變體，其中所述抗體的所述互補位經(jīng)成型以使得當肽EEKKGNY(SEQ ID NO 131)的所述表位結(jié)合至所述抗體的所述互補位時，在選自由K4和Q95、K4和Q95、N6和Q98、G5和H31、Y7和H31、Y7和W165組成的群組的兩個殘基之間形成至少一個鍵。
75.根據(jù)權(quán)利要求68-74中任一權(quán)利要求所述的抗體，其中所述結(jié)構(gòu)或相互作用于計算機模擬中測定。
76.一種用于選擇針對EGFRvIII的抗體變體的方法，所述方法包含使用抗體分子結(jié)構(gòu)的模型來測定互補位；使用表位結(jié)構(gòu)的模型來將所述表位置于所述互補位中；使用所述互補位和所述表位之間的相互作用能來測定第一相互作用能；使用互補位和表位變體之間的相互作用能來測定第二相互作用能；和基于所述第一和第二相互作用能之間的差異選擇變體。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其進一步包含以下步驟使用所述互補位和所述表位第二變體之間的相互作用能來測定第三相互作用能；將所述第三相互作用能與所述第二相互作用能相比較來決定選擇哪個變體。
78.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中隨后形成所選擇的變體且測試其結(jié)合至所述表位的能力。
79.一種用于產(chǎn)生針對EGFRvIII的抗體變體的方法，所述方法包含分析與所述互補位相互作用的表位殘基；選擇更重要的表位殘基以形成識別序列；使用所述識別序列以形成EGFRvIII變體；和使用所述EGFRvIII變體來選擇抗體變體。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中通過使用所述EGFRvIII變體選擇所述抗體是以計算機模擬進行的。
81.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中通過使用所述EGFRvIII變體選擇所述抗體是通過產(chǎn)生針對EGFRvIII變體的抗體來達到的。
82.一種抗體或變體，其結(jié)合至所述序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO57)，其中所述抗體或變體具有次納摩爾結(jié)合能力。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Tyr172Arg。
84.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Leu99Glu。
85.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Arg101Glu。
86.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Leu217Glu。
87.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Leu99Asn。
88.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Leu99His。
89.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變L99T。
90.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體或變體，其進一步包含點突變Arg101Asp。
91.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
92.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
93.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
94.根據(jù)權(quán)利要求82所述的抗體，其中所述抗體是人類抗體。
95.一種抗體，所述抗體結(jié)合至EGFRvIII且所述抗體具有結(jié)合至表位的互補位，所述表位具有一組與包含E、K、N和Y的所述互補位相互作用的殘基。
96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的抗體，其中所述抗體是131。
97.一種抗體，所述抗體結(jié)合至EGFRvIII且所述抗體具有結(jié)合至表位的互補位，其中所述表位具有一組與包含E、E、K、G和N的所述互補位相互作用的殘基。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的抗體，其中所述表位的主要結(jié)構(gòu)為EEKKGNY(SEQ ID NO131)。
99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的抗體，其中所述抗體是13.1.2。
100.一種抗體，其結(jié)合至EGFRvIII且其具有小于1.3×10-9M的KD。
101.一種抗體，其結(jié)合至EGFRvIII且其具有小于1.0×10-9M的KD。
102.一種抗體，其結(jié)合至EGFRvIII且其具有小于500pM的KD。
103.根據(jù)權(quán)利要求100所述的抗體，其中所述抗體與野生型EGFR肽相比，對SEQ ID NO56具有特異性。
104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的抗體，其中所述抗體與所述野生型EGFR肽(SEQ ID NO134)的非特異性結(jié)合低于所述抗體與EGFRVIII(SEQ ID NO135)的特異性結(jié)合的10％。
105.根據(jù)權(quán)利要求98所述的抗體，其中所述抗體選自由131和13.1.2組成的群組。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的抗體，其中所述抗體經(jīng)內(nèi)在化。
107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的抗體，其中至少約70％的所述抗體發(fā)生內(nèi)在化。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的抗體，其中有效內(nèi)在化是約80％的所述抗體經(jīng)內(nèi)在化。
109.一種變體人類單克隆抗體，其與野生型EGFR蛋白質(zhì)或其變體(SEQ ID NO134)相比，優(yōu)先結(jié)合至對EGFRvIII蛋白質(zhì)大體上獨特的表位。
110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的變體人類單克隆抗體，其中所述變體包含對應(yīng)于典范類1的重鏈互補決定區(qū)(CDR1)。
111.根據(jù)權(quán)利要求109所述的變體人類單克隆抗體，其中所述變體包含對應(yīng)于典范類3的重鏈互補決定區(qū)(CDR2)。
112.根據(jù)權(quán)利要求109所述的變體人類單克隆抗體，其中所述變體包含對應(yīng)于典范類4的輕鏈互補決定區(qū)(CDR1)。
113.根據(jù)權(quán)利要求109所述的變體人類單克隆抗體，其中所述變體包含對應(yīng)于典范類1的輕鏈互補決定區(qū)(CDR2)。
114.根據(jù)權(quán)利要求109所述的變體人類單克隆抗體，其中所述變體包含對應(yīng)于典范類1的輕鏈互補決定區(qū)(CDR3)。
115.根據(jù)權(quán)利要求109所述的變體人類單克隆抗體，其中所述變體包含對應(yīng)于典范類1的第一重鏈互補決定區(qū)(CDR1)；對應(yīng)于典范類3的第二重鏈互補決定區(qū)(CDR2)；對應(yīng)于典范類4的第一輕鏈互補決定區(qū)(CDR1)；對應(yīng)于典范類1的第二輕鏈互補決定區(qū)(CDR2)；和對應(yīng)于典范類1的第三輕鏈互補決定區(qū)(CDR3)，其中所述互補決定區(qū)經(jīng)成型以使得所述變體結(jié)合至與EGFR蛋白質(zhì)相比，對EGFRvIII蛋白質(zhì)大體上獨特的表位。
116.一種殺死靶細胞的方法，所述方法包含將所述靶細胞和與毒素締合的抗體接觸，其中所述抗體結(jié)合至所述肽LEEKKGNY(SEQ ID NO133)，且其中所述靶細胞表達包含LEEKKGNY序列的肽。
117.一種經(jīng)分離抗體，其結(jié)合至EGFRvIII且其與治療劑偶聯(lián)，且包含重鏈氨基酸序列，所述重鏈氨基酸序列包含以下互補決定區(qū)(CDR)(a)CDR1，其由選自由以下抗體的CDR1區(qū)氨基酸序列組成的群組的序列組成13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ IDNO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)；(b)CDR2，其由選自由以下抗體的CDR2區(qū)氨基酸序列組成的群組的序列組成13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ IDNO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)；和(c)CDR3，其由選自由以下抗體的CDR3區(qū)氨基酸序列組成的群組的序列組成13.1.2(SEQ ID NO138)、131(SEQ ID NO2)、170(SEQ ID NO4)、150(SEQ ID NO5)、095(SEQ ID NO7)、250(SEQ ID NO9)、139(SEQ ID NO10)、211(SEQ IDNO12)、124(SEQ ID NO13)、318(SEQ ID NO15)、342(SEQ ID NO16)和333(SEQ ID NO17)。
118.根據(jù)權(quán)利要求117所述的抗體，其中所述治療劑是毒素。
119.一種經(jīng)分離人類單克隆抗體，其特異性結(jié)合至EGFRvIII和包含所述LEEKKGNYVVTDHC序列(SEQ ID NO56)的肽，其中所述抗體進一步與治療劑偶聯(lián)。
120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的抗體，其中所述治療劑是毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎抗體，尤其涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的抗體，而且尤其涉及III型缺失突變體EGFRvIII。本發(fā)明也涉及針對表皮生長因子受體的缺失突變體的人類單克隆抗體，而且尤其為EGFRvIII。本發(fā)明也提供這些抗體的診斷和治療配方，及其免疫偶聯(lián)物。
文檔編號C07H21/00GK1930187SQ200480018185
公開日2007年3月14日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者理查德·韋伯, 馮曉, 奧里特·福德, 拉里·格林, 瓊·古達斯, 布魯斯·基特, 劉穎, 帕拉尼·拉塔納斯瓦米, 羅伯特·拉亞, 楊曉東, 喬斯·克爾瓦蘭, 伊恩·福爾茨, 賈小池, 賈斯帕·康, 查德威克·T·金, 斯科特·L·克拉坎普, 巧娟·簡·蘇 申請人:艾伯吉尼斯公司