專利名稱：正交賴氨酰－tRNA和氨酰－tRNA合成酶對(duì)的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及制備正交tRNA、正交氨酰tRNA合成酶及tRNA/氨酰tRNA合成酶對(duì)的方法和組合物，其中的蛋白質(zhì)插入有非天然氨基酸，如高谷氨酰胺(homoglutamine)，以響應(yīng)選擇者密碼子(selector coden)如四堿基和終止選擇者密碼子。其中包括在一個(gè)蛋白鏈內(nèi)插入多個(gè)不同的非天然氨基酸以響應(yīng)終止選擇者密碼子和四堿基選擇者密碼子。本發(fā)明還涉及利用這種tRNA/氨酰tRNA合成酶對(duì)及其相關(guān)的組合物在細(xì)胞內(nèi)制備蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
除了少數(shù)例子以外，所有已知有機(jī)體的遺傳密碼都編碼相同的20個(gè)氨基酸，但是，將一個(gè)新的氨基酸加入到有機(jī)體的氨基酸譜中所需要的全部組分包括獨(dú)特的tRNA/氨酰tRNA合成酶對(duì)、氨基酸原料以及該氨基酸特異性的獨(dú)特選擇者密碼子(Furter(1998)Protein Sci.，7419-426)。以前我們發(fā)現(xiàn)琥珀無(wú)義密碼子TAG和正交的詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)及大腸桿菌tRNA/氨酰tRNA合成酶對(duì)配合可在大腸桿菌(Wang等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，1225010-5011；Wang等，(2001)Science，292498-500；Wang等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，10056-61；Chin等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9911020-11024)和酵母(Chin和Schultz，(2002)ChemBio Chem，31135-1137)內(nèi)分別編碼具有新穎特性的各種氨基酸。但是，有限數(shù)目的非編碼三聯(lián)密碼子嚴(yán)格限制了有機(jī)體所編碼的氨基酸的最終數(shù)目。
有許多天然的+1移碼突變抑制因子，其中包括編碼谷氨酰胺的Su7來(lái)源的UAGN抑制子(Magliery等，(2001)J.Mol.Biol.，307755-769)、sufJ來(lái)源的編碼蘇氨酸的ACCN抑制型密碼子(Anderson等，(2002)Chem.Biol.，9237-244)以及tRNALys和tRNAGln來(lái)源的CAAA抑制子(Anderson和Schultz，(2003)Biochemistry，42(32)9598-608)。另外，利用遺傳篩選可以從大的突變tRNA文庫(kù)中鑒定出有效的四堿基或五堿基密碼子抑制型tRNA，其中包括大腸桿菌tRNAUCCUSer抑制子(Ibba等，(1999)Proc.Natl.A.cad.Sci.U.S.A.，96418-423；Kwok和Wong，(1980)Can.J.Biochem.，58213-218)。這一自然現(xiàn)象已被用于在體外利用化學(xué)合成的氨?；痶RNA來(lái)誘變非天然氨基酸。許多氨基酸，包括熒光物質(zhì)/淬滅劑對(duì)(Terada等，(2002)Nat.Struct.Biol.，9257-262)已被插入到蛋白質(zhì)中以響應(yīng)AGGU和CGGG(Hou等，(1992)Biochemistry，314157-4160；Yarus等，(1986)J.Mol.Biol.192235-255；Miller，(1972)《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港)。為了進(jìn)一步擴(kuò)充遺傳密碼需要開發(fā)出改良的和/或其他的生物合成機(jī)組分，如正交tRNA、正交氨酰-tRNA合成酶和/或獨(dú)特的密碼子。本發(fā)明可以滿足這些和其他需求，通過閱讀下文可以清楚地了解這一點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了利用正交tRNA和正交氨酰tRNA合成酶制備蛋白產(chǎn)物的新型翻譯系統(tǒng)。本發(fā)明涉及裝配的翻譯系統(tǒng)、使用該翻譯系統(tǒng)的方法以及該系統(tǒng)制備出的翻譯產(chǎn)物。該技術(shù)可用于本文所描述的許多方面，例如而不限于治療性產(chǎn)品、診斷試劑和工業(yè)用酶的制備。
一方面，本發(fā)明提供了一種翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)可利用正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或O-tRNA的修飾變體和/或優(yōu)先用一個(gè)或多個(gè)氨基酸加載正交賴氨酰tRNA的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)或O-RS的修飾變體。在某些實(shí)施方式中，翻譯系統(tǒng)位于細(xì)胞內(nèi)，如大腸桿菌內(nèi)。結(jié)合到O-tRNA上的氨基酸還可以是非天然氨基酸，如高谷氨酰胺。
在翻譯系統(tǒng)的某些實(shí)施方式中，賴氨酰O-tRNA、O-tRNA的變體、O-RS，或者二者都來(lái)源于超嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)(PhKRS)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多O-RS都可用于該翻譯系統(tǒng)，其中包括PhKRS、E444G、PhΔAD和PhΔAD的I41和/或S268突變體。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)超嗜熱古菌O-RS在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)所具有的毒性等于或低于PhΔAD的I41和/或S268突變體。
賴氨酰O-tRNA或突變的O-tRNA還可以包含四堿基密碼子或琥珀密碼子的識(shí)別序列。例如，賴氨酰O-tRNA或其變體可包含AGGA的識(shí)別序列。在翻譯系統(tǒng)的一些相關(guān)方面，賴氨酰O-tRNA或其變體可利用一個(gè)序列為CU(X)nXXXAA的反密碼子環(huán)。在這一方面的某些實(shí)施方式中，CU(X)nXXXAA序列可以是CUCUAAA或CUUCCUAA。實(shí)施例包括包含序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的賴氨酰O-tRNA或其變體。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，O-RS、賴氨酰O-tRNA或其變體抑制終止選擇者密碼子或移碼選擇者密碼子的效率至少要達(dá)到E444G、PhΔAD或PhΔAD的I41和/或S268突變體聯(lián)合具有序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的O-tRNA的50％。在另外的實(shí)施方式中，翻譯系統(tǒng)可利用其他的O-RS和其他的O-tRNA，這些其他的組分可抑制移碼選擇者密碼子，這些移碼選擇者密碼子與賴氨酰O-tRNA或O-tRNA變體和優(yōu)先加載賴氨酰O-tRNA或O-tRNA變體的O-RS所抑制的移碼選擇者密碼子不同。在其他的實(shí)施方式中，翻譯系統(tǒng)既抑制靶多肽編碼靶核酸上的四堿基選擇者密碼子，也抑制終止選擇者密碼子。四堿基選擇者密碼子還可以使用序列AGGA，終止選擇者密碼子還可以使用序列TAG或UAG。在某些實(shí)施方式中，翻譯系統(tǒng)包括含四堿基選擇者密碼子的靶核酸。翻譯系統(tǒng)還可以包含靶核酸編碼的蛋白質(zhì)。例如，這個(gè)蛋白質(zhì)可含有高谷氨酰胺殘基。
翻譯系統(tǒng)還可以包含編碼四堿基選擇者密碼子和終止選擇者密碼子的靶核酸。在某些方面，翻譯系統(tǒng)包含靶核酸編碼的蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
例如，本發(fā)明提供了一種翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用可識(shí)別四堿基選擇者密碼子的第一正交tRNA(O-tRNA)、將第一非天然氨基酸優(yōu)先加載到O-tRNA上的第一正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)、可識(shí)別終止選擇者密碼子的第二O-tRNA以及將第二非天然氨基酸優(yōu)先加載到第二O-tRNA上的第二O-RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，四堿基選擇者密碼子是AGGA，終止密碼子是UAG。翻譯系統(tǒng)還可以位于細(xì)胞內(nèi)。
在翻譯系統(tǒng)的某些實(shí)施方式中，第一或第二O-tRNA是正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或其修飾變體。另外，第一O-tRNA可以是正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或其適宜變體，第二O-tRNA是正交酪氨酰tRNA(酪氨酰O-tRNA)或其適宜變體。翻譯系統(tǒng)還可以包含至少編碼一個(gè)四堿基選擇者密碼子和一個(gè)終止選擇者密碼子的核酸。在這些實(shí)施方式中，四堿基選擇者密碼子可以是AGGA，終止選擇者密碼子可以是TAG或UAG，被翻譯的核酸一般是表達(dá)出的RNA。在某些實(shí)施方式中，核酸編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)至少包含兩個(gè)不同的非天然氨基酸，如高谷氨酰胺和第二非天然氨基酸，如親電子的氨基酸。翻譯系統(tǒng)可以包含各種非天然氨基酸，其中包括高谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施例中，翻譯系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)與肌紅蛋白同源，但是其中包含一個(gè)非天然氨基酸如高谷氨酰胺。
本發(fā)明提供了含有蛋白質(zhì)的組合物，其中的蛋白質(zhì)包含但不僅限于PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體的氨基酸序列，或者這些蛋白質(zhì)的保守變體。本發(fā)明同樣提供了編碼PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體的核酸，或者這些核酸的保守變體。本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO24或SEQ ID NO26相應(yīng)的tRNA的部分或完整序列的核酸，或者這些核酸的任意保守變體。
在其他方面，本發(fā)明提供了包含但不僅限于正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)的組合物，其中的O-RS優(yōu)先用高谷氨酰胺氨酰化O-tRNA。這種O-RS含有PhΔAD的I41和/或S268突變體相應(yīng)的突變，或者這個(gè)蛋白的任何保守變體。在某些實(shí)施方式中，O-RS優(yōu)先氨?；疧-tRNA，其效率至少為PhΔAD的I41和/或S268突變體的50％。在某些實(shí)施方式中，O-RS來(lái)源于超嗜熱古菌。在O-RS和O-tRNA都包含于組合物內(nèi)的某些實(shí)施方式中，O-tRNA可識(shí)別四堿基選擇者密碼子，如AGGA。
在上述組合物包含細(xì)胞或存在于細(xì)胞內(nèi)的某些實(shí)施方式中，O-RS可被細(xì)胞內(nèi)的一種或多種核酸編碼，這些細(xì)胞可以是大腸桿菌細(xì)胞。組合物可包含翻譯系統(tǒng)。在包含細(xì)胞并且其中的O-RS是被細(xì)胞內(nèi)的一種或多種核酸編碼的組合物中，細(xì)胞還可以包含能識(shí)別第一選擇者密碼子和高谷氨酰胺的正交-tRNA(O-tRNA)，例如，其中的O-RS優(yōu)先用高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞包含編碼目的多肽的靶核酸，其中的靶核酸編碼一個(gè)能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。
O-tRNA還可以被多核苷酸的部分或完整序列編碼，如上述的SEQ ID NO24或SEQ ID NO26，或其互補(bǔ)的多核苷酸序列，O-RS包含相應(yīng)于PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體的氨基酸序列，或者該序列的任何保守變體。需要說明的是本文所描述的任一核酸序列都可以RNA或DNA的形式出現(xiàn)；因此，除非在上下文中特別說明，序列如SEQ ID NO24或25可以是RNA的形式，也可以是DNA的形式，無(wú)論是否清晰地指出。在某些實(shí)施方式中，O-RS和O-tRNA抑制終止選擇者密碼子或移碼選擇者密碼子的效率至少要達(dá)到E444G、PhΔAD或PhΔAD的I41和/或S268突變體聯(lián)合具有序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的O-tRNA的50％。在組合物包含細(xì)胞的實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是大腸桿菌細(xì)胞。這個(gè)組合物的細(xì)胞還可以包含其他不同的O-tRNA/O-RS對(duì)和其他不同的非天然氨基酸，其中O-tRNA可識(shí)別第二選擇者密碼子，O-RS優(yōu)先用第二非天然氨基酸氨?；疧-tRNA。細(xì)胞還可以包含編碼第一和第二選擇者密碼子的靶核酸。另外，這種組合物的細(xì)胞還可以包含靶核酸編碼的蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)至少插入有兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
本發(fā)明還提供了至少包含一個(gè)高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)所包含的氨基酸序列與野生型治療性蛋白、診斷蛋白、工業(yè)用酶或這些蛋白的任何部分的序列至少有75％相同。另外，蛋白質(zhì)上還可以連接藥學(xué)上可接受的載體。
在其他方面，本發(fā)明提供了篩選有活性的正交-氨酰-tRNA合成酶(O-RS)的方法，其中的O-RS可將高谷氨酰胺加載到正交tRNA(O-tRNA)上。這些方法的第一步是提供一群細(xì)胞用于篩選，這些細(xì)胞都包含1)O-tRNA，其中O-tRNA對(duì)于細(xì)胞群內(nèi)含有O-tRNA的細(xì)胞來(lái)說是正交的；2)包括一種或多種有活性的O-RS成員的O-RS群，這些成員可在該細(xì)胞群的一種或多種細(xì)胞內(nèi)將高谷氨酰胺加載到O-tRNA上；3)編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸，其中多核苷酸至少編碼一個(gè)可被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子；以及4)高谷氨酰胺。在這個(gè)篩選過程中，與無(wú)RS但是有O-tRNA的對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞群內(nèi)含有活性O(shè)-RS的靶細(xì)胞因其對(duì)選擇標(biāo)記的抑制效應(yīng)增強(qiáng)而被篩選出來(lái)。該方法的第二步是篩選含有活性O(shè)-RS的靶細(xì)胞。本發(fā)明還提供了通過任意篩選方法鑒定正交氨酰-tRNA合成酶的方法。
在這些方法的某些實(shí)施方式中，細(xì)胞還可以被進(jìn)一步篩選以去除那些含有非靶O-RS的細(xì)胞，其中的非靶O-RS可以將高谷氨酰胺之外的氨基酸加載到O-tRNA上。在某些實(shí)施方式中，篩選是正篩選，選擇標(biāo)記是正選擇標(biāo)記。
在這些方法的不同實(shí)施方式中，RS群可以是不同來(lái)源的，其中包括而不限于突變的RS、第一物種之外的一個(gè)或多個(gè)物種來(lái)源的RS，或者二者都有。
本發(fā)明還提供了在細(xì)胞內(nèi)制備在特定位置上是高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的方法。該方法包括在適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟，其中的細(xì)胞含有至少編碼一個(gè)選擇者密碼子和一個(gè)蛋白質(zhì)的核酸，例如，其中的細(xì)胞還可以包含能識(shí)別選擇者密碼子的正交-tRNA(O-tRNA)和優(yōu)先用高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)；提供高谷氨酰胺；將高谷氨酰胺插入到特定位置以響應(yīng)選擇者密碼子，從而制備出蛋白質(zhì)。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS的氨基酸序列利用了E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體、或者其保守變體的完整或部分序列。
定義在詳細(xì)描述本發(fā)明前，需要說明的是本發(fā)明并不局限于某些特定的生物系統(tǒng)，本發(fā)明可以有各種變化。還應(yīng)當(dāng)說明的是本文所用的方法只是為了描述特定的實(shí)施方式，并不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。如本發(fā)明的說明書和附屬權(quán)利要求所使用的，除非特別指明，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”也包括復(fù)數(shù)。因此，“一個(gè)細(xì)胞”也包括兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞；“細(xì)菌”也包括細(xì)菌的混合物等。
除了在此處和說明書的其余部分所定義的，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解的意義相同。
正交賴氨酰-tRNA本文所用的術(shù)語(yǔ)正交賴氨酰-tRNA(賴氨酰-O-tRNA)是與目的翻譯系統(tǒng)正交的tRNA，其中tRNA(1)與天然的賴氨酰tRNA相同或基本類似，(2)來(lái)源于發(fā)生自然突變或人工誘變的天然賴氨酰tRNA，(3)由考慮到(1)或(2)的野生型或突變賴氨酰tRNA序列的任意方法所制備，(4)與野生型或突變的賴氨酰tRNA同源，(5)與表1中所列的被定義為賴氨酰tRNA合成酶底物的典型tRNA同源，或(6)表1中所列的被定義為賴氨酰tRNA合成酶底物的典型tRNA的保守變體。賴氨酰tRNA可以攜帶一個(gè)氨基酸，或者處于非負(fù)載狀態(tài)。還需要說明的是“賴氨酰-O-tRNA”還可以被同源的合成酶加載(氨?；?上賴氨酸之外的氨基酸，如高谷氨酰胺。本發(fā)明的賴氨酰-O-tRNA確實(shí)可用于將任何必需的氨基酸，無(wú)論是天然的或是人工合成的，插入到正在合成的多肽內(nèi)，如翻譯期間，以響應(yīng)選擇者密碼子。
正交賴氨酰氨基酸合成酶本文所用的正交賴氨酰氨基酸合成酶(賴氨酰-O-RS)是一種可以在目的翻譯系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)先將氨基酸加載到賴氨酰-O-tRNA上的合成酶。被賴氨酰-O-RS加載到賴氨酰-O-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無(wú)論是天然的還是人工合成的，不僅僅局限于本文所描述的。合成酶還可以與天然的賴氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與表1所列的賴氨酰-O-RS相同或同源。例如，賴氨酰-O-RS可以是表1所列的賴氨酰-O-RS的保守變體，和/或與表1所列的賴氨酰-O-RS的序列至少有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高的相同性。
正交本文所用的術(shù)語(yǔ)“正交”是指一個(gè)分子(如正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))的功能與細(xì)胞的內(nèi)源性組分一樣，但是其活性與細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)內(nèi)的其相應(yīng)的內(nèi)源性分子相比下降，或者不具有細(xì)胞內(nèi)源性組分的功能。在用于tRNA和氨酰-tRNA合成酶時(shí)，正交的是指正交的tRNA與內(nèi)源性tRNA合成酶配合時(shí)其效率與內(nèi)源性tRNA和內(nèi)源性tRNA合成酶配合時(shí)相比下降，如下降到20％、10％、5％或1％以下。正交分子缺乏細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性互補(bǔ)分子的正常功能。例如，與內(nèi)源性的tRNA被內(nèi)源性RS氨?；啾?，細(xì)胞內(nèi)的正交tRNA被細(xì)胞的內(nèi)源性RS氨?；瘯r(shí)其效率降低，甚至根本檢測(cè)不到。在另外一個(gè)實(shí)施例中，與內(nèi)源性的RS氨?；瘍?nèi)源性的tRNA相比，正交的RS在目的細(xì)胞內(nèi)氨?；魏蝺?nèi)源性的tRNA時(shí)其效率降低，或者根本檢測(cè)不到。第二正交分子可以被引入到細(xì)胞內(nèi)和第一正交分子一起發(fā)揮功能。例如，正交tRNA/RS對(duì)包括引入的互補(bǔ)組分，在細(xì)胞內(nèi)一起行使功能時(shí)其效率與對(duì)照，如相應(yīng)的內(nèi)源性tRNA/RS對(duì)或活性正交對(duì)(如酪氨酰正交tRNA/RS對(duì))相比可以達(dá)到45％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或更高。
同源術(shù)語(yǔ)“同源”是指能聯(lián)合發(fā)揮功能的組分，如正交tRNA和優(yōu)先氨?；籺RNA的正交氨酰-tRNA合成酶。該組分也被稱為“互補(bǔ)的”。
優(yōu)先氨?；g(shù)語(yǔ)“優(yōu)先氨酰化”是指O-RS在將一個(gè)特定氨基酸加載到特定tRNA上時(shí)的效率比加載其他tRNA上時(shí)要高。例如，O-RS加載同源O-tRNA時(shí)的效率比氨酰化非同源tRNA(如作為底物用于制備同源O-tRNA的tRNA，如通過突變)時(shí)的效率要高(如70％、75％、85％、90％、95％、99％或更高)。
選擇者密碼子術(shù)語(yǔ)“選擇者密碼子”是指在翻譯過程中能被O-tRNA識(shí)別但通常不被內(nèi)源性tRNA識(shí)別的密碼子。典型的例子包括終止密碼子、含四個(gè)或更多堿基接的密碼子等。O-tRNA反密碼子環(huán)可識(shí)別選擇者密碼子，如表達(dá)的RNA如mRNA內(nèi)的選擇者密碼子，通過翻譯系統(tǒng)的翻譯可將其相應(yīng)的氨基酸插入到多肽內(nèi)。例如，在本文的一個(gè)實(shí)施方式中，O-tRNA可識(shí)別選擇者密碼子如四堿基密碼子，通過翻譯過程將一個(gè)非天然氨基酸如高谷氨酰胺插入到多肽內(nèi)。選擇者密碼子包括無(wú)義密碼子如終止密碼子，例如琥珀密碼子、赭石密碼子和乳白密碼子；四堿基或多堿基密碼子；稀有密碼子；天然或非天然堿基對(duì)來(lái)源的密碼子等。
抑制型tRNA抑制型tRNA是一種可在給定的翻譯系統(tǒng)內(nèi)改變信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA，例如通過將氨基酸插入到多肽鏈內(nèi)以響應(yīng)選擇者密碼子的機(jī)制。例如，抑制型tRNA可閱讀過終止密碼子、四堿基密碼子、稀有密碼子等。
抑制活性如本文所述，術(shù)語(yǔ)“抑制活性”通常是指tRNA(如抑制型tRNA)在翻譯過程中閱讀過密碼子(如為琥珀密碼子或四堿基或多堿基密碼子的選擇者密碼子)的能力，如果閱讀不過則翻譯終止或產(chǎn)生錯(cuò)誤翻譯(如移碼突變)。抑制型tRNA的抑制活性可以表達(dá)為與第二抑制型tRNA或?qū)φ障到y(tǒng)如缺乏O-RS的對(duì)照系統(tǒng)相比所觀察到的翻譯通讀活性的百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明提供了定量測(cè)定抑制活性的各種方法。一種特定O-tRNA和ORS對(duì)目的選擇者密碼子(如琥珀密碼子)的抑制百分率是指一種位于編碼表達(dá)檢測(cè)標(biāo)記的核酸上的給定表達(dá)檢測(cè)標(biāo)記(如LacZ)，包括選擇者密碼子，在目的翻譯系統(tǒng)內(nèi)的活性相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照構(gòu)建體活性的百分?jǐn)?shù)，其中的目的翻譯系統(tǒng)包含O-RS和O-tRNA，而陽(yáng)性對(duì)照不包含O-tRNA、O-RS和選擇者密碼子。因此，如果缺乏選擇者密碼子的有活性的陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建體在一個(gè)給定翻譯系統(tǒng)內(nèi)的活性是X，那么含有選擇者密碼子的被檢測(cè)構(gòu)建體的抑制百分率為被檢測(cè)構(gòu)建體在與陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)記基本相同的表達(dá)環(huán)境條件下所展示的X的百分比，其中被檢測(cè)標(biāo)記構(gòu)建體所表達(dá)的翻譯系統(tǒng)還包含O-tRNA和O-RS。一般來(lái)說，表達(dá)被檢測(cè)標(biāo)記的翻譯系統(tǒng)還包含能被O-RS和O-tRNA識(shí)別的氨基酸。另外，百分抑制率還可以通過比較被檢測(cè)標(biāo)記與“背景”或“陰性”對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建體來(lái)加以精煉，后者含有與被檢測(cè)標(biāo)記相同的選擇者密碼子，但是系統(tǒng)中不包含O-tRNA、O-RS和/或能被O-tRNA和/或O-RS識(shí)別的相關(guān)氨基酸。這種陰性對(duì)照由于考慮到了標(biāo)記在目的翻譯系統(tǒng)中所產(chǎn)生的背景信號(hào)，因此可以使百分抑制率更加準(zhǔn)確。
抑制效率可通過本領(lǐng)域熟知的多種方法檢測(cè)。例如，可以利用β半乳糖苷酶報(bào)告基因分析方法，如將衍生的lacZ質(zhì)粒(其中構(gòu)建體含有選擇者密碼子和lacZ核酸序列)和含有本發(fā)明的O-tRNA的質(zhì)粒一起導(dǎo)入到適宜有機(jī)體(如可使用正交組分的有機(jī)體)的細(xì)胞內(nèi)。同源的合成酶也要導(dǎo)入(或者以多肽或編碼同源合成酶的多核苷酸的形式)。細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)到預(yù)期的密度時(shí)，如OD600達(dá)到約0.5時(shí)，利用BetaFluorTMβ-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒(Novagen)進(jìn)行β半乳糖苷酶活性分析。百分抑制率可以計(jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照的活性百分?jǐn)?shù)，如衍生的lacZ構(gòu)建體所展示的活性，其中構(gòu)建體在預(yù)期位置上含有有義密碼子而不是選擇者密碼子。
翻譯系統(tǒng)術(shù)語(yǔ)“翻譯系統(tǒng)”是指可以將氨基酸插入到正在合成的多肽鏈(蛋白)上的組分。翻譯系統(tǒng)的組分包括核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明的O-tRNA和/或O-RS也可以加入到體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中，或者作為翻譯系統(tǒng)的一部分，如非真核細(xì)胞如細(xì)菌(如大腸桿菌)或真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等內(nèi)的翻譯系統(tǒng)。
非天然氨基酸如本文所述，術(shù)語(yǔ)“非天然氨基酸”是指20個(gè)天然氨基酸或稀有天然氨基酸硒氨酸或吡咯賴氨酸之外的任何氨基酸、修飾氨基酸和/或氨基酸類似物，如高谷氨酰胺。
來(lái)源于本文所用的術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”是指從特定分子或有機(jī)體、或者特定分子或有機(jī)體的信息中分離的組分，或者利用特定分子或有機(jī)體、或者特定分子或有機(jī)體的信息制備的組分。
陽(yáng)性選擇標(biāo)記本文所用的術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性選擇標(biāo)記”是指當(dāng)一個(gè)標(biāo)記存在時(shí)，如表達(dá)、活化等，會(huì)導(dǎo)致具有該標(biāo)記相應(yīng)性狀的細(xì)胞被鑒定出來(lái)，如可以將具有陽(yáng)性選擇標(biāo)記的細(xì)胞與無(wú)此形狀的細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。
陰性選擇標(biāo)記本文所用的術(shù)語(yǔ)“陰性選擇標(biāo)記”是指一個(gè)標(biāo)記存在時(shí)，如表達(dá)、活化等，可以鑒定出不具有被篩選特性或形狀的細(xì)胞(如，與具有該特性或形狀的細(xì)胞比較時(shí))。
報(bào)告子本文所用的術(shù)語(yǔ)“報(bào)告子”是指可用于鑒定和/或篩選目的系統(tǒng)內(nèi)靶組分的組分。例如，報(bào)告子可以是蛋白，如能賦予抗生素耐藥性或敏感性的酶(如β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、熒光選擇標(biāo)記(如綠色熒光蛋白(如GFP)、YFP、EGFP、RFP等)、冷光標(biāo)記(如螢火蟲熒光素酶蛋白)、親和性的選擇標(biāo)記，或者正或負(fù)選擇標(biāo)記基因如lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、Adh(乙醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2等。
真核生物本文所用的術(shù)語(yǔ)“真核生物”是指在系統(tǒng)進(jìn)化樹內(nèi)屬于真核生物域的有機(jī)體，如動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(如單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。
非真核生物本文所用的術(shù)語(yǔ)“非真核生物”是指非真核有機(jī)體。例如，非真核有機(jī)體可能屬于真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育區(qū)(如大腸桿菌、嗜熱棲桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等)或古細(xì)菌(如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Mj)、馬氏微球菌(Methanosarcina mazei)(Mm)、熱自養(yǎng)甲烷球菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mt)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、坎氏甲烷嗜熱菌(Methanopyruskandleri)、鹽桿菌屬如沃氏鹽桿菌(Haloferax volcanii)和嗜鹽菌NRC-1(Halobacteriumspecies NRC-1)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(Af)、激烈火球菌(Pyrococcusfurious)(Pf)、超嗜熱古菌(Ph)、超耐高溫?zé)岚艟?Pyrobaculum aerophilum)、火球菌(Pyrococcus abyssi)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)(Ss)、硫化葉菌(Sulfolobustokodaii)、Aeuropyrum pernix(Ap)、噬酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)、火山熱原體(Thermoplasma volcanium)等)系統(tǒng)發(fā)育區(qū)。
保守變體如本文所描述，術(shù)語(yǔ)“保守變體”用于指翻譯組分時(shí)是指一個(gè)翻譯組分，如保守突變的O-tRNA或保守突變的O-RS，其功能特性與基本組分O-tRNA或O-RS相似，但是在序列上與參照O-tRNA或O-RS相比有些不同。例如，O-RS可用非天然氨基酸如高谷氨酰胺氨?；パa(bǔ)的O-tRNA或保守突變的O-tRNA，但是O-tRNA和保守突變的O-tRNA在序列上是有差異的。保守變體在序列上可能含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)突變，只要保守變體與相應(yīng)的O-tRNA或O-RS能夠互補(bǔ)。
篩選試劑本文所用的術(shù)語(yǔ)“篩選試劑”是指當(dāng)一個(gè)試劑存在時(shí)可以從一群組分中篩選出某種特定組分。例如，篩選試劑包括而不限于營(yíng)養(yǎng)素、抗生素、光的波長(zhǎng)、抗體、表達(dá)的多核苷酸等。篩選試劑可以使用不同的濃度、密度等。
響應(yīng)本文所用的術(shù)語(yǔ)“響應(yīng)”是指本發(fā)明的tRNA識(shí)別選擇者密碼子并將相應(yīng)的氨基酸，如非天然氨基酸如高谷氨酰胺，插入到正在合成的多肽鏈中的過程，其中的氨基酸是由tRNA攜帶的。
編碼如本文所描述，術(shù)語(yǔ)“編碼”是指利用多聚大分子或序列符號(hào)串上的信息指導(dǎo)合成第二分子或序列符號(hào)串的過程，其中的第二分子或序列符號(hào)串與第一分子或序列符號(hào)串是不同的。如本文所描述，該術(shù)語(yǔ)的使用范圍很寬，可用于許多方面。一方面，術(shù)語(yǔ)“編碼”可用于描述DNA的半保留復(fù)制過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈作為模板由DNA依賴的DNA聚合酶編碼出新合成的一條互補(bǔ)姊妹鏈。
另一方面，術(shù)語(yǔ)“編碼”是指利用一個(gè)分子上的信息指導(dǎo)合成化學(xué)性質(zhì)與第一分子不同的第二分子的過程。例如，DNA分子編碼一個(gè)RNA分子(如通過DNA依賴的RNA聚合酶參與的轉(zhuǎn)錄過程)。另外，RNA分子也可以編碼多肽，比如在翻譯過程中。當(dāng)該術(shù)語(yǔ)用于描述翻譯過程時(shí)，該術(shù)語(yǔ)也可以擴(kuò)展到編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子。在某些方面，RNA分子也可編碼DNA分子，比如通過RNA依賴的DNA聚合酶參與的反轉(zhuǎn)錄過程。在另一個(gè)方面，DNA分子可編碼多肽，應(yīng)當(dāng)理解的是，在這種情況下，術(shù)語(yǔ)編碼是指轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述的是古細(xì)菌tRNALys序列的排列。Pa，火球菌(Pyrococcus abyssi)；Pf，激烈火球菌；Ph，超嗜熱古菌；Pya，超耐高溫?zé)岚艟籘a，噬酸熱原體；Tv，火山熱原體(Thermoplasma volcanum)；Af，閃爍古生球菌；Hh，嗜鹽菌NRC-1；Mj，詹氏甲烷球菌；Mt，熱自養(yǎng)甲烷球菌；Mm，馬氏微球菌；St，硫化葉菌(Sulfolobustokodaii)；Ss，硫磺礦硫化葉菌；Ap，Aeropyrum pernix來(lái)源的基因組序列用GCG程序pileup排列，并用prettybox程序展示。
圖2，A和B都是直方圖，描述的是在體外的種間氨?；?。(A)大腸桿菌完整tRNA或(B)嗜鹽菌完整tRNA被EcKRS(□)、PhKRS(■)或無(wú)合成酶(▲)氨酰化。試驗(yàn)在20μl的反應(yīng)液內(nèi)進(jìn)行，其中含有50mM Tris-Cl，pH7.5，30mM KCl，20mM MgCl2，3mM谷胱甘肽、0.1mg/mL BSA、10mMATP、1μM[3H]賴氨酸(Amersham)、750nM合成酶和0、2、10或40μM全tRNA，反應(yīng)在37℃進(jìn)行20分鐘。
圖3用圖表的形式描述了共有序列來(lái)源的琥珀抑制型tRNA。古細(xì)菌tRNALys序列家族的共有序列在于三葉草構(gòu)型。反密碼子環(huán)從共有序列變成CUCUAAA，形成AKCUA。
圖4是一個(gè)直方圖，描述的是正交合成酶-tRNA對(duì)的體內(nèi)活性。GeneHogs細(xì)胞(Invitrogen)用圖中所示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或者不用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，設(shè)四復(fù)孔，測(cè)定其中的β-半乳糖苷酶的活性。質(zhì)粒pKQ表達(dá)PhKRS的E444G突變體。質(zhì)粒pKQ作為無(wú)合成酶的樣品。質(zhì)粒pACGFP表達(dá)AKCUA，質(zhì)粒pACGFP作為不含tRNA的樣品。LacZ報(bào)告基因來(lái)自于質(zhì)粒pLASC-lacZ。細(xì)胞在2YT培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，加入適量的抗生素，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到OD600等于0.5時(shí)用Miller的方法進(jìn)行分析(Miller，(1972)，《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Experiments in molecular genetics)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)。
圖5.琥珀抑制型tRNA和四堿基抑制型tRNA的構(gòu)建。琥珀抑制型tRNA構(gòu)建自多種tRNALys序列的多序列排列。正交AGGA抑制型tRNA通過篩選受體臂文庫(kù)而獲得。
圖6A和6B.圖6A顯示的是PhKRS活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。殘基E41和Y268可與賴氨酸底物特異性接觸。這些殘基可同時(shí)隨機(jī)用于構(gòu)建活性位點(diǎn)庫(kù)。圖6B顯示的是各種氨基酸的結(jié)構(gòu)。
圖7A和7B提供的是化學(xué)熒光磷光成像(chemifluorescence phosphoimage)，顯示的是AGGA抑制子對(duì)肌紅蛋白表達(dá)的影響。圖7A，在AKUCCU tRNA和PhΔAD，一種hGln特異性的變體，或JYRS存在的情況下，G24位為AGGA密碼子的肌紅蛋白基因的表達(dá)。琥珀抑制子在S4位上對(duì)肌紅蛋白表達(dá)的抑制作用，其企圖與用PhΔAD或JYRS一樣。b，hGln通過AGGA抑制子在24位上插入，AzPhe通過琥珀抑制子在75位上插入，二者插入到同一條多肽鏈上。
圖8.含高谷氨酰胺或賴氨酸的胰酶水解片段的基質(zhì)輔助的寄過解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)分析。
圖9.在24位含高谷氨酰胺、在75位含O-甲基-酪氨酸的全長(zhǎng)肌紅蛋白的電噴霧質(zhì)譜分析。
詳細(xì)描述為了在體內(nèi)將其他的合成氨基酸如高谷氨酰胺插入到基因密碼內(nèi)，需要設(shè)計(jì)一個(gè)能在翻譯系統(tǒng)中發(fā)揮正常功能但是對(duì)于組織內(nèi)的翻譯系統(tǒng)來(lái)說是“正交的”的新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA正交對(duì)，也就是說該正交對(duì)在翻譯系統(tǒng)內(nèi)可獨(dú)立地行使合成酶和tRNA的功能。我們希望正交對(duì)所具有的特性包括tRNA只能解碼或識(shí)別一個(gè)特異性的新密碼，如篩選密碼，該密碼不被任何內(nèi)源性的tRNA所解碼，氨酰-tRNA合成酶只用特異性的非天然氨基酸如高谷氨酰胺優(yōu)先氨?；?或加載)其同源的tRNA。O-tRNA也不能被內(nèi)源性的合成酶氨?；?。例如，在大腸桿菌內(nèi)，一個(gè)正交對(duì)包含一個(gè)基本不能氨?；魏蝺?nèi)源性tRNA的氨酰tRNA合成酶和一個(gè)基本不能被任何內(nèi)源性合成酶氨?；恼籺RNA，在大腸桿菌內(nèi)，內(nèi)源性的tRNA有40種，內(nèi)源性的氨酰tRNA合成酶有21種。
在本文中我們描述了用古細(xì)菌tRNALys序列制備新的正交合成酶/tRNA對(duì)的過程，該正交對(duì)可有效而特異地將氨基酸高谷氨酰胺(hGln)插入到肌紅蛋白內(nèi)以響應(yīng)四堿基選擇者密碼子AGGA。hGln所產(chǎn)生的移碼校正抑制不會(huì)顯著影響蛋白的產(chǎn)量或細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，與第二O-tRNA-ORS對(duì)所產(chǎn)生的TAG抑制互相正交。這一研究的結(jié)果表明可用的三聯(lián)密碼子的數(shù)量和翻譯機(jī)器本身都不再成為進(jìn)一步擴(kuò)展密碼子的顯著障礙。
為了使四聯(lián)密碼子能在體內(nèi)編碼非天然氨基酸，人們必須制備出能特異識(shí)別這個(gè)密碼子的正交tRNA(O-tRNA)以及相應(yīng)的合成酶，這個(gè)合成酶只能利用非天然的目的氨基酸來(lái)氨?；@個(gè)O-tRNA。由于以前所制備的正交詹氏甲烷球菌琥珀抑制型tRNA的反密碼子環(huán)是同型合成酶JYRS的關(guān)鍵識(shí)別元件，因此利用這個(gè)環(huán)來(lái)解碼四堿基密碼子是比較困難的。雖然有可能使JYRS反密碼子環(huán)的結(jié)合特異性下降，但是如果只用反密碼子環(huán)序列來(lái)構(gòu)建與琥珀抑制子和四堿基抑制子不同的互補(bǔ)正交對(duì)可能是比較困難的。因此，本發(fā)明利用不同來(lái)源的正交對(duì)來(lái)構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將兩個(gè)或多個(gè)不同的非天然氨基酸同時(shí)插入到多肽中以響應(yīng)兩個(gè)或多個(gè)不同的選擇者密碼子。
本發(fā)明提供了鑒定和制備另外的正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對(duì)，如O-tRNA/O-RS對(duì)的組合物和方法，其中的正交對(duì)可用于插入非天然氨基酸，如高谷氨酰胺。本發(fā)明的典型O-tRNA能夠在體內(nèi)使高谷氨酰胺插入到多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)，其中的多核苷酸含有能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。O-tRNA的反密碼子環(huán)可識(shí)別mRNA上的選擇者密碼子，并將其對(duì)應(yīng)的氨基酸如高谷氨酰胺插入到多肽的這個(gè)位點(diǎn)上。本發(fā)明的正交氨酰-tRNA合成酶只用特異性的非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?或加載)其O-tRNA。
正交tRNA/正交氨酰-tRNA合成酶及其對(duì)適于制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)描述于題為“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGANOLtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PARIS”(用于制備正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對(duì)的方法和組合物)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO2002/086075和題為“IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”(非天然氨基酸的體內(nèi)插入)的WO2002/085923中。另外，還可以參見國(guó)際專利PCT/US2004/011786，申請(qǐng)日為2004年4月16日。這些專利申請(qǐng)都已完整納入本文作為參考。這種翻譯系統(tǒng)一般都包括含正交tRNA(O-tRNA)的細(xì)胞(可以是非真核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)以及非天然氨基酸(在本發(fā)明中，高谷氨酰胺是這種非天然氨基酸的典型例子)，其中O-RS可用高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA。本發(fā)明的正交對(duì)包含O-tRNA，如抑制型tRNA、移碼tRNA等，以及O-RS。本發(fā)明還提供了其他組分。
一般來(lái)說，當(dāng)正交對(duì)識(shí)別選擇者密碼子并加載氨基酸以響應(yīng)選擇者密碼子時(shí)，正交對(duì)被稱為“抑制”了選擇者密碼子。這就是說，不被翻譯系統(tǒng)(如細(xì)胞)的內(nèi)源性機(jī)器識(shí)別的選擇者密碼子通常不被翻譯，導(dǎo)致多肽合成的中斷，否則多肽就可以從核酸上翻譯出來(lái)。本發(fā)明的O-tRNA可識(shí)別選擇者密碼子，與包含或編碼于上文所列的多核苷酸序列的O-tRNA相比，在同源合成酶存在的條件下，本發(fā)明的O-tRNA為了響應(yīng)選擇者密碼子而產(chǎn)生的抑制效率至少可達(dá)45％、50％、60％、75％、80％、90％或更高。O-RS可用非天然的目的氨基酸如高谷氨酰胺氨酰化O-tRNA。細(xì)胞利用O-tRNA/O-RS對(duì)將非天然氨基酸插入到正在合成的多肽鏈內(nèi)，例如通過一個(gè)包含編碼目的多肽的多核苷酸的核酸，其中的多核苷酸含有能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。在某些我們期望的方面，細(xì)胞可以包含其他的O-tRNA/O-RS對(duì)，其中的O-tRNA可被其他的O-RS加載上不同的非天然氨基酸。例如，一個(gè)O-tRNA可識(shí)別四堿基密碼子，而另一個(gè)可以識(shí)別終止密碼子。另外，多個(gè)不同的終止密碼子或多個(gè)不同的四堿基密碼子也可以特異性地識(shí)別不同的選擇者密碼子。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞包含正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、高谷氨酰胺和包含編碼目的多肽的多核苷酸的核酸，其中的多核苷酸含有能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。翻譯系統(tǒng)也可以是無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，如各種的市售“體外”轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)再加上本文所描述的O-tRNA/ORS對(duì)和非天然氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS和O-tRNA聯(lián)合在一起所產(chǎn)生的抑制效率至少是缺少O-RS的O-tRNA的抑制效率的5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或更高。在一方面，O-RS和O-tRNA聯(lián)合在一起所產(chǎn)生的抑制效率至少是如上文所列序列的正交合成酶對(duì)抑制效率的約35％、40％、45％、50％、60％、75％、80％、90％或更高。
如上所述，本發(fā)明還可以包括位于細(xì)胞或其他翻譯系統(tǒng)內(nèi)的多個(gè)O-tRNA/O-RS對(duì)，這樣就可以插入不止一個(gè)非天然氨基酸，如高谷氨酰胺和其他的非天然氨基酸。例如，細(xì)胞還可以包含其他的O-tRNA/O-RS對(duì)和第二種非天然氨基酸，其中這個(gè)其他的O-tRNA可識(shí)別第二選擇者密碼子，這個(gè)其他的O-RS優(yōu)先用第二種非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。例如，包含一種O-tRNA/O-RS對(duì)(其中O-tRNA可識(shí)別琥珀選擇者密碼子)的細(xì)胞還可以包含第二種正交對(duì)，如亮氨酰、賴氨酰、谷氨酰tRNA等(其中第二O-tRNA可識(shí)別不同的選擇者密碼子，如乳白密碼子、四堿基密碼子等)。不同的正交對(duì)最好來(lái)源不同，這樣有利于對(duì)不同選擇者密碼子的識(shí)別。
O-tRNA和/或O-RS可以是天然的，也可以是通過突變天然的tRNA和/或RS而獲得的，例如通過制備各種有機(jī)體來(lái)源的tRNA文庫(kù)和/或RS文庫(kù)，或者通過各種已有的突變技術(shù)來(lái)獲得。例如，一種制備正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶對(duì)的策略是將宿主之外的有機(jī)體或多種有機(jī)體來(lái)源的異源(相對(duì)于宿主細(xì)胞來(lái)說)tRNA/合成酶對(duì)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。候選異源合成酶的特性包括不能加載宿主細(xì)胞的任何tRNA，優(yōu)選異源tRNA的特性包括不能被宿主細(xì)胞的任何合成酶氨?；Ａ硗?，異源tRNA對(duì)于宿主細(xì)胞的合成酶來(lái)說是正交的。
制備正交對(duì)的第二種策略是制備突變文庫(kù)，然后從中篩選出O-tRNA或O-RS。這些策略可聯(lián)合使用。
正交tRNA(O-tRNA)我們期望本發(fā)明的正交tRNA(O-tRNA)可以在體內(nèi)和體外介導(dǎo)非天然氨基酸如高谷氨酰胺向蛋白質(zhì)內(nèi)的插入，其中的蛋白質(zhì)是由含選擇者密碼子的多核苷酸編碼的，這種選擇者密碼子可被O-tRNA識(shí)別。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的O-tRNA與包含或編碼于上文所列的多核苷酸序列的O-tRNA相比，在同源合成酶存在的條件下，為了響應(yīng)選擇者密碼子而產(chǎn)生的抑制效率至少可達(dá)45％、50％、60％、75％、80％、90％或更高。
抑制效率可通過本領(lǐng)域熟知的多種方法檢測(cè)。例如，可以利用β半乳糖苷酶報(bào)告基因分析方法，如將衍生的lacZ質(zhì)粒(其中構(gòu)建體含有選擇者密碼子和lacZ核酸序列)和含有本發(fā)明的O-tRNA的質(zhì)粒一起導(dǎo)入到適宜有機(jī)體(如可使用正交組分的有機(jī)體)的細(xì)胞內(nèi)。同源的合成酶也要導(dǎo)入(或者以多肽或編碼同源合成酶的多核苷酸的形式)。細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)到預(yù)期的密度時(shí)，如OD600達(dá)到約0.5時(shí)，利用BetaFluorTMβ-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒(Novagen)進(jìn)行β半乳糖苷酶活性分析。百分抑制率可以計(jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照的活性百分?jǐn)?shù)，如衍生的lacZ構(gòu)建體所展示的活性，其中構(gòu)建體在預(yù)期位置上含有有義密碼子而不是選擇者密碼子。
本發(fā)明的典型O-tRNA為本文所列的序列。也可參見本文的表、實(shí)施例和圖中所顯示的典型O-tRNA和O-RS分子的序列。還可參見本文的“核酸和多肽序列及其變體”部分。在RNA分子，如O-RS mRNA或O-tRNA分子中，其尿嘧啶是由一個(gè)給定序列(或者其編碼DNA)或其互補(bǔ)鏈的胸腺嘧啶替換而來(lái)的。序列中還可以有其他的堿基修飾。
本發(fā)明還包括本文特定的O-tRNA相應(yīng)的保守突變的O-tRNA。例如，O-tRNA的保守變體包括那些與特定O-tRNA功能類似的分子，如本文所列的序列以及那些依賴自身互補(bǔ)而保持tRNAL型結(jié)構(gòu)但是其序列與本文的列表、圖或?qū)嵤├兴行蛄?最好不是野生型的tRNA分子)不一樣的序列。參見本文的“核酸和多肽序列及其變體”部分。
含O-tRNA的組合物還可以包含正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，其中的O-RS優(yōu)先用非天然氨基酸如高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA。在某些實(shí)施方式中，含有O-tRNA的組合物還可以包含翻譯系統(tǒng)(如在體外或體內(nèi))。含有編碼目的多肽的多核苷酸的核酸，或者這些物質(zhì)的一種或多種的混合物也可以存在于細(xì)胞內(nèi)，其中的多核苷酸含有能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。參見本文的“正交氨酰-tRNA合成酶”部分。
制備正交tRNA(O-tRNA)的方法也是本發(fā)明的特征。利用該方法制備的O-tRNA也是本發(fā)明的特征。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，O-tRNA可通過構(gòu)建突變體文庫(kù)來(lái)制備。突變的tRNA文庫(kù)可用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)構(gòu)建。例如，突變的tRNA可通過位點(diǎn)特異性突變技術(shù)、隨機(jī)點(diǎn)突變技術(shù)、同源重組技術(shù)、DNA重組技術(shù)或其他回歸突變方法、嵌合構(gòu)建、或者混合使用上述技術(shù)來(lái)制備。
其他的突變也可以被引入到特定位置上，如tRNA環(huán)或區(qū)的非保守區(qū)、保守區(qū)、隨機(jī)區(qū)或者混合區(qū)，如反密碼子環(huán)、接受臂、D臂或環(huán)、可變環(huán)、TPC或tRNA分子上的其他區(qū)域。一般來(lái)說，tRNA分子上的突變包括突變tRNA突變體文庫(kù)內(nèi)每個(gè)成員的反密碼子環(huán)以使其能夠識(shí)別選擇者密碼子。該方法還能夠?qū)⒁粋€(gè)額外的序列(CCA)加到O-tRNA的末端。一般來(lái)說，O-tRNA對(duì)目的有機(jī)體的正交性要高于其起始材料，如tRNA序列群，但是卻保留了對(duì)目的RS的親和性。
本發(fā)明的方法還包括分析tRNAs和/或tRNA合成酶序列的相似性(和/或理論同源性)以確定對(duì)特定有機(jī)體具有正交性的潛在候選O-tRNA、O-RS和/或O-tRNA/O-RS對(duì)。本領(lǐng)域熟知的以及本文所描述的計(jì)算機(jī)程序都可用于這種分析，如BLAST和pileup程序。在一個(gè)實(shí)施例中，為了篩選潛在的正交翻譯組分用于原核有機(jī)體大腸桿菌，需要選擇序列與原核有機(jī)體不一樣的合成酶和/或tRNA。
一般來(lái)說，可以通過負(fù)篩選第一物種的細(xì)胞群來(lái)獲得O-tRNA，其中的細(xì)胞含有O-tRNA群的成員。負(fù)篩選可去除含有O-tRNA文庫(kù)的成員的細(xì)胞，其中的O-tRNA成員可被細(xì)胞內(nèi)源性的氨酰-tRNA合成酶(RS)氨酰化。這樣就可以得到對(duì)第一物種的細(xì)胞具有正交性的tRNA庫(kù)。
在某些實(shí)施方式中，進(jìn)行負(fù)篩選時(shí)需要將選擇者密碼子引入到編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸中，如能賦予抗生素耐藥性的酶如β內(nèi)酰胺酶，編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的酶如β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，毒性產(chǎn)物如自殺基因引入到非必須位置上(還能產(chǎn)生功能性的自殺產(chǎn)物)等。篩選還可以通過使細(xì)胞群在含篩選試劑(比如抗生素，如氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選試劑的濃度是變化的。
例如，為了測(cè)定抑制型tRNA的活性，根據(jù)選擇者密碼子如無(wú)義密碼子或移碼突變?cè)隗w內(nèi)的抑制活性使用一個(gè)篩選系統(tǒng)，其中的選擇者密碼子被引入到編碼負(fù)性選擇標(biāo)記如β半乳糖苷酶基因(bla)的多核苷酸內(nèi)。例如，構(gòu)建在某個(gè)位置(如A184)上含有選擇者密碼子的多核苷酸變體如bla變體。用這些多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如細(xì)菌。如果存在無(wú)法被大腸桿菌內(nèi)源性合成酶有效加載的正交tRNA，細(xì)菌所具有的抗生素耐藥性如氨芐青霉素耐藥性應(yīng)當(dāng)約等于或低于未被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的耐藥性。如果tRNA不是正交的，或者能加載tRNA的異源合成酶在系統(tǒng)內(nèi)共表達(dá)，那么應(yīng)該可以觀察到更高水平的抗生素耐藥性，如氨芐青霉素耐藥性。挑出那些無(wú)法在抗生素濃度約等于未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)胞，如細(xì)菌。
如果存在毒性產(chǎn)物(如RNA酶或自殺酶)，當(dāng)一群候選tRNA的成員被宿主如大腸桿菌的內(nèi)源性合成酶氨酰化時(shí)(即對(duì)于宿主如大腸桿菌的合成酶來(lái)說不是正交的)，選擇者密碼子被抑制，所產(chǎn)生的毒性多核苷酸產(chǎn)物可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。而含有正交tRNA或非功能性tRNA的細(xì)胞存活下來(lái)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，目的有機(jī)體正交的tRNA庫(kù)需要進(jìn)行正篩選，其中選擇者密碼子位于正選擇標(biāo)記，例如耐藥基因如β內(nèi)酰胺酶基因編碼的正選擇標(biāo)記內(nèi)。正篩選在含有編碼或包含細(xì)胞正交的tRNA的多核苷酸、編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸和編碼同源性RS的多核苷酸的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，第二群細(xì)胞含有無(wú)法通過負(fù)篩選去除的細(xì)胞。多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞可在含篩選試劑如氨芐青霉素的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。然后根據(jù)tRNA被共表達(dá)的同源合成酶氨?；哪芰σ约绊憫?yīng)其選擇者密碼子而插入氨基酸的能力來(lái)篩選tRNA。一般來(lái)說，這些細(xì)胞與含有非功能性的tRNA或不能被目的合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞相比其抑制效應(yīng)應(yīng)該是升高的。含有非功能性的tRNA或不能被目的合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞對(duì)抗生素敏感。因而那些(i)不是宿主如大腸桿菌內(nèi)源性合成酶的底物；(ii)能被目的合成酶氨?；灰约?iii)在翻譯過程中有功能的tRNA可在兩輪篩選中保留下來(lái)。
相應(yīng)的，根據(jù)其被篩選的環(huán)境不同，同一個(gè)標(biāo)記既可以是正選擇標(biāo)記，也可以是負(fù)選擇標(biāo)記。就是說，如果為了篩選它則是正選擇標(biāo)記，如果為了耐受它則是負(fù)選擇標(biāo)記。
在上面所描述的方法中，篩選，如正篩選、負(fù)篩選或者正負(fù)篩選的嚴(yán)格程度還包括改變篩選的嚴(yán)格條件。例如，由于自殺酶是毒性很高的蛋白質(zhì)，負(fù)篩選條件的嚴(yán)格程度可通過將不同數(shù)目的選擇者密碼子引入到自殺基因內(nèi)和/或通過使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)加以調(diào)控。在另一個(gè)實(shí)施例中，篩選試劑的濃度是可以改變的(如氨芐青霉素的濃度)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，篩選條件的嚴(yán)格程度是隨時(shí)變化的，因?yàn)樵谇皫纵喓Y選中目的活性較低。因此，在前幾輪中篩選標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格程度較低，而在后幾輪篩選中需要更嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)。在某些實(shí)施方式中，負(fù)篩選、正篩選或者正負(fù)篩選可重復(fù)多次。也可以使用多個(gè)不同的負(fù)選擇標(biāo)記、正選擇標(biāo)記或正負(fù)選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記可以是相同的。
其他類型的篩選方法也可用于本發(fā)明中以制備出正交的翻譯組分，如O-tRNA、O-RS和能加載非天然氨基酸如高谷氨酰胺以響應(yīng)選擇者密碼子的O-tRNA/O-RS對(duì)。例如，負(fù)選擇標(biāo)記、正選擇標(biāo)記或正負(fù)選擇標(biāo)記可以是在適當(dāng)反應(yīng)物存在的情況下能發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記的產(chǎn)物可通過熒光激活的細(xì)胞分選法(FACS)或發(fā)光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)。另外，標(biāo)記還可以是親和選擇標(biāo)記。參見Francisco，J.A.等，(1993)Production and fluorescence-activated cell sorting ofEscherichia coli expressing a functional antibody fragement on the external surface.ProcNatl Acad Sci USA.9010444-8。
制備重組正交tRNA的其他方法見于題為“Methods and compositions for theproduction of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase paris”(用于制備正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對(duì)的方法和組合物)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2002/086075和題為“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”(擴(kuò)充真核遺傳密碼)的USSN60/479,931及60/496,548。還見于Forster等，(2003)Programming peptidomimeticsynthetases by translating genetic codes designed de novoPNAS100(11)6353-6357；和Feng等，(2003)，Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acidchange，PNAS100(10)5676-5681。
正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)本發(fā)明的O-RS在體外或體內(nèi)優(yōu)先用非天然氨基酸如高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA。本發(fā)明的O-RS可通過加入含O-RS的多肽或編碼O-RS或O-RS片段的多核苷酸而提供給翻譯系統(tǒng)。例如，O-RS的例子包含本文列表和實(shí)施例中所列的氨基酸序列或其保守變體。在另一個(gè)實(shí)施例中，O-RS或O-RS片段是由多核苷酸或其互補(bǔ)序列編碼的，該多核苷酸編碼本文列表或?qū)嵤├兴械陌被嵝蛄?。參見本文列表和?shí)施例中所列的典型O-RS分子的序列。也可參見本文的“核酸和多肽序列及其變體”部分。
鑒定可與O-tRNA作用的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，如O-RS的方法也是本發(fā)明的特征。例如，該方法包括篩選，如正篩選，第一物種的細(xì)胞群，其中的個(gè)別細(xì)胞含有1)一組氨酰-tRNA合成酶(RS)的一個(gè)成員(如這組RS內(nèi)可能包括突變的RS、第一物種之外的物種來(lái)源的RS，或者二者都包括)；2)正交tRNA(O-tRNA)(如一個(gè)或多個(gè)物種來(lái)源的)；以及3)編碼選擇標(biāo)記(如正選擇標(biāo)記)并且含有至少一個(gè)選擇者密碼子的多核苷酸。篩選出那些與缺乏RS成員或RS成員數(shù)目少的細(xì)胞相比抑制效率升高的細(xì)胞。抑制效率可用本領(lǐng)域熟知的和本文所描述的方法測(cè)定。抑制效率升高的細(xì)胞包含有活性的RS，這些RS可氨?；疧-tRNA。來(lái)自于第一物種的第一組tRNA被有活性的RS氨?；乃?體外或體內(nèi))與來(lái)自于第二物種的第二組tRNA被有活性的RS氨?；乃较啾容^。氨?；乃娇赏ㄟ^檢測(cè)底物(標(biāo)記的氨基酸或非天然氨基酸，如標(biāo)記的高谷氨酰胺)來(lái)確定。一般來(lái)說被篩選出的有活性的RS氨酰化第二組tRNA的效率比第一組更高，因此可獲得能更有效作用于O-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶。利用這種方法鑒定出的O-RS也是本發(fā)明的特征。
許多分析方法都可用于確定氨?；乃?。這些方法可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。例如，體外氨?；椒治龇椒ū幻枋鲇贖oben和Soll(1985)Methods Enzymol.11355-59中。氨?；竭€可以通過利用一個(gè)與正交翻譯組分相連的報(bào)告分子并檢測(cè)報(bào)告基因在表達(dá)多核苷酸的細(xì)胞內(nèi)的水平來(lái)確定，其中的多核苷酸至少含有一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的選擇者密碼子。見題為“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS(非天然氨基酸的體內(nèi)插入)”的WO 2002/085923和2004年4月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2004/011786。
鑒定出的O-RS還可以被進(jìn)一步修飾以改變合成酶的底物特異性，這樣O-RS就只能將我們所期望的非天然氨基酸如高谷氨酰胺而不是其他任何的20種常見氨基酸加載到O-tRNA上。制備對(duì)非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨酰tRNA合成酶的方法包括突變合成酶，例如在合成酶的活性位點(diǎn)、編輯機(jī)制位點(diǎn)上突變合成酶，在不同的位點(diǎn)上將合成酶的不同區(qū)域連接起來(lái)等等，然后通過篩選過程加以篩選。還有一種策略是根據(jù)先使用正篩選，隨后通過負(fù)篩選來(lái)完成。在正篩選過程中，被引入到正選擇標(biāo)記非必需位置上的選擇者密碼子所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)可使細(xì)胞在正篩選壓力下存活下來(lái)。如果同時(shí)存在天然氨基酸和非天然氨基酸，存活下來(lái)的細(xì)胞就可以編碼有活性的合成酶，這些合成酶利用天然的或非天然的氨基酸可氨?；坏囊种菩蛅RNA。在負(fù)篩選過程中，被引入到負(fù)選擇標(biāo)記非必需位置的選擇者密碼子所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)可去除具有天然氨基酸特異性的合成酶。經(jīng)過負(fù)篩選和正篩選存活下來(lái)的細(xì)胞所編碼的合成酶只能用非天然氨基酸來(lái)氨?；?加載)正交的抑制型tRNA。這些合成酶可被進(jìn)一步突變，如通過DNA重組技術(shù)或其他回歸突變方法突變。
突變的O-RS文庫(kù)可利用本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)來(lái)構(gòu)建。例如，可通過位點(diǎn)特異性突變技術(shù)、隨機(jī)點(diǎn)突變技術(shù)、同源重組技術(shù)、DNA重組技術(shù)或其他回歸突變方法、嵌合構(gòu)建、或者混合使用上述技術(shù)來(lái)制備。例如，可利用兩個(gè)或多個(gè)較小的、低分散的“亞文庫(kù)”來(lái)構(gòu)建突變的RS文庫(kù)。本發(fā)明還包括RS的嵌合文庫(kù)。應(yīng)當(dāng)注意的是也可以構(gòu)建各種有機(jī)體(例如微生物如真細(xì)菌或古細(xì)菌)的tRNA合成酶文庫(kù)，如具有天然多樣性的文庫(kù)(見Short等人的美國(guó)專利No.6,238,884；Schallenberger等人的美國(guó)專利No.5,756,316；Petersen等人的美國(guó)專利No.5,783,431；Thompson等人的美國(guó)專利No.5,824,485；Short等人的美國(guó)專利No.5,958,672)來(lái)篩選正交對(duì)。
合成酶一旦通過正篩選和負(fù)篩選過程，這些合成酶就應(yīng)該進(jìn)一步被誘變。例如，分離編碼O-RS的核酸；利用該核酸制備出一組編碼突變的O-RS(如通過隨機(jī)突變、位點(diǎn)特異性突變、重組或聯(lián)合技術(shù))的多核苷酸；這些步驟的每一步或者所有這些步驟都可以重復(fù)進(jìn)行直到獲得能夠優(yōu)先用非天然氨基酸如高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA的突變O-RS。在本發(fā)明的一個(gè)方面，步驟可進(jìn)行多次，如至少兩次。
其他嚴(yán)格程度的篩選條件也可用于本發(fā)明的方法中以制備O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS對(duì)。篩選條件的嚴(yán)格程度在制備O-RS的一個(gè)步驟或兩個(gè)步驟中可以是不同的。這包括改變篩選試劑的使用濃度等。還可以進(jìn)行額外輪次的正篩選和/或負(fù)篩選。篩選還可以包括氨基酸滲透性的一次或多次改變，翻譯效率的改變、翻譯精確度的改變等。一般來(lái)說，要根據(jù)有機(jī)體的一個(gè)或多個(gè)基因上的突變來(lái)確定進(jìn)行一次或多次改變，其中正交的tRNA-tRNA合成酶對(duì)被用于制備蛋白質(zhì)。
制備O-RS以及改變合成酶的底物特異性的其他通用細(xì)節(jié)可參見名稱為Methodsand compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetaseparis”(用于制備正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對(duì)的方法和組合物)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2002/086075和申請(qǐng)日為2004年4月16日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2004/011786。
來(lái)源和宿主有機(jī)體本發(fā)明的翻譯組分可來(lái)源于非真核有機(jī)體。例如，正交的O-tRNA可來(lái)源于非真核有機(jī)體(或有機(jī)體混合物)，例如古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷球菌，嗜鹽菌如沃氏鹽桿菌和鹽桿菌NRC-1，閃爍古生球菌，激烈火球菌，超嗜熱古菌，Aeuropyrum pernix，海沼甲烷球菌，坎氏甲烷嗜熱菌，馬氏微球菌(Mm)，超耐高溫?zé)岚艟?，火球?Pyrococcus abyssi)，硫磺礦硫化葉菌(Ss)，硫化葉菌(Sulflobustokodaii)，噬酸熱原體，火山熱原體等，或者真細(xì)菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermphilus)等，正交的O-RS也可以來(lái)源于非真核有機(jī)體(或有機(jī)體混合物)，例如古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷球菌，嗜鹽菌屬如沃氏鹽桿菌和鹽桿菌NRC-1，閃爍古生球菌，激烈火球菌，超嗜熱古菌，Aeuropyrum pernix，海沼甲烷球菌，坎氏甲烷嗜熱菌，馬氏微球菌，超耐高溫?zé)岚艟?，火球?Pyrococcus abyssi)，硫磺礦硫化葉菌，硫化葉菌(Sulfolobustokodaii)，噬酸熱原體，火山熱原體等，或者真細(xì)菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在一個(gè)實(shí)施方式中，真核有機(jī)體如植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等也可作為O-tRNA和O-RS的來(lái)源。
O-tRNA/O-RS對(duì)的各個(gè)組分可以來(lái)源于同一有機(jī)體，也可以來(lái)源于不同有機(jī)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-tRNA/O-RS對(duì)來(lái)源于同一有機(jī)體。另外O-tRNA/O-RS對(duì)的O-tRNA和O-RS也可以來(lái)源于不同有機(jī)體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，古細(xì)菌超嗜熱古菌的賴氨酰合成酶/tRNA對(duì)被用作大腸桿菌翻譯系統(tǒng)正交對(duì)。如本文所描述，這個(gè)正交對(duì)被修飾使其能夠識(shí)別四堿基選擇者密碼子，也可以被修飾成能夠用非天然氨基酸如高谷氨酰胺加載O-tRNA的形式。這個(gè)正交對(duì)(或其修飾形式)也可以與以前描述的正交對(duì)聯(lián)合使用，如那些詹氏甲烷球菌來(lái)源的，經(jīng)修飾后能識(shí)別終止選擇者密碼子的正交對(duì)。這樣就可以通過在目的翻譯系統(tǒng)中加入包含兩個(gè)或多個(gè)能被O-tRNA/O-RS對(duì)識(shí)別的選擇者密碼子的蛋白質(zhì)編碼核酸，從而使制備出的蛋白質(zhì)含有兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
可在體內(nèi)或體外，或者利用細(xì)胞，如非真核細(xì)胞或真核細(xì)胞，來(lái)篩選O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS對(duì)以制備出含高谷氨酰胺或其他非天然的目的氨基酸的多肽。非真核細(xì)胞可以是各種來(lái)源的，如真細(xì)菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，或者古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷球菌，嗜鹽菌屬如沃氏鹽桿菌和鹽桿菌NRC-1，閃爍古生球菌，激烈火球菌，超嗜熱古菌，Aeuropyrum pernix，海沼甲烷球菌，坎氏甲烷嗜熱菌，馬氏微球菌，超耐高溫?zé)岚艟?，火球?Pyrococcusabyssi)，硫磺礦硫化葉菌，硫化葉菌(Sulfolobus tokodaii)，噬酸熱原體，火山熱原體等。真核細(xì)胞也可以是各種來(lái)源的，如植物(如復(fù)雜植物，如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(如釀酒酵母)、動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等。含本發(fā)明的翻譯組分的細(xì)胞組合物也是本發(fā)明的特征。
篩選一個(gè)物種的O-tRNA和/或O-RS用于另外一個(gè)物種的描述見申請(qǐng)日為2004年4月16日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2004/011786。
選擇者密碼子本發(fā)明的選擇者密碼子擴(kuò)大了蛋白質(zhì)生物合成機(jī)的遺傳密碼框架。例如，選擇者密碼子包括獨(dú)特的三堿基密碼子，無(wú)義密碼子如終止密碼子，例如琥珀密碼子(UAG)、或乳白密碼子，一種非天然密碼子，至少一個(gè)四堿基密碼子(如AGGA)，一個(gè)稀有密碼子等。不同數(shù)目的選擇者密碼子都可以被插入到目的基因內(nèi)，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或三個(gè)以上等。通過使用不同的選擇者密碼子，可利用多個(gè)正交tRNA/合成酶對(duì)同時(shí)將多個(gè)不同的非天然氨基酸同時(shí)引入到特異性位點(diǎn)上。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括利用終止密碼子作為選擇者密碼子在體內(nèi)將高谷氨酰胺引入到細(xì)胞內(nèi)。例如，制備出可識(shí)別四堿基選擇者密碼子的O-tRNA，然后被O-RS氨?；虞d上高谷氨酰胺。這個(gè)O-tRNA不被翻譯系統(tǒng)內(nèi)源性的氨酰-tRNA合成酶所識(shí)別。可利用常規(guī)的位點(diǎn)特異性突變技術(shù)將選擇者密碼子引入到編碼目的多肽的靶多核苷酸的特定位點(diǎn)上。參見Sayers，J.R.等，(1988)，″5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.″NucleicAcids Res，791-802。當(dāng)O-RS、O-tRNA和編碼目的多肽的核酸在體內(nèi)結(jié)合時(shí)，高谷氨酰胺因響應(yīng)選擇者密碼子而被插入，制備出一個(gè)在特定位置上含高谷氨酰胺的多肽。
非天然氨基酸如高谷氨酰胺在體內(nèi)的插入對(duì)宿主細(xì)胞可以不產(chǎn)生顯著影響。例如，在非真核細(xì)胞如大腸桿菌內(nèi)，由于終止選擇者密碼子UAG的抑制效率依賴于O-tRNA如琥珀抑制型tRNA和釋放因子1(RF1)(RF1可結(jié)合UAG密碼子，啟動(dòng)正在合成的肽從核糖體上釋放下來(lái))之間的競(jìng)爭(zhēng)，因此可通過增加O-tRNA如抑制型tRNA的表達(dá)水平或者利用RF1缺陷株來(lái)調(diào)節(jié)抑制的效率。在真核細(xì)胞內(nèi)，由于UAG密碼子的抑制效率依賴于O-tRNA如琥珀抑制型tRNA和真核釋放因子(如eRF)(eRF可結(jié)合終止密碼子，啟動(dòng)正在合成的肽從核糖體上釋放下來(lái))之間的競(jìng)爭(zhēng)，因此可通過增加O-tRNA如抑制型tRNA的表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)抑制的效率。另外，也可以通過添加其他的化合物來(lái)調(diào)節(jié)釋放因子的活性，例如還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。
非天然氨基酸，包括高谷氨酰胺，也可以被稀有密碼子編碼。例如，當(dāng)體外蛋白合成反應(yīng)體系內(nèi)的精氨酸濃度下降時(shí)，稀有的精氨酸密碼子AGG被證實(shí)可通過一個(gè)丙氨酸?；暮铣蓆RNA有效地將丙氨酸插入到多肽鏈內(nèi)。見Ma等，Biochemistry，327939(1993)。在這種情況下，合成的tRNA可與天然的tRNAArg競(jìng)爭(zhēng)，后者作為稀有成分存在于大腸桿菌內(nèi)。另外，某些有機(jī)體無(wú)法利用所有的三聯(lián)密碼子。藤黃微球菌(Micrococcus luteus)內(nèi)的獨(dú)立密碼子AGA可被用于氨基酸在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物內(nèi)的插入。見Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.，254685(1997)。在體內(nèi)利用這些稀有密碼子可以制備出本發(fā)明的組分。
選擇者密碼子還包括擴(kuò)充的密碼子，例如四堿基或多堿基密碼子，如四堿基、五堿基、六堿基或多堿基密碼子。四堿基密碼子的例子有AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五堿基密碼子的例子有AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本發(fā)明的方法包括使用基于移碼抑制的擴(kuò)充密碼子。四堿基或多堿基密碼子可用于將一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸如高谷氨酰胺插入到同一個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)。在其他的實(shí)施方式中，反密碼子環(huán)可以解碼至少一個(gè)四堿基密碼子、至少一個(gè)五堿基密碼子、至少一個(gè)六堿基密碼子等。由于共有256個(gè)可能的四堿基密碼子，因此，利用四堿基或多堿基密碼子可在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)編碼多個(gè)非天然氨基酸。見Anderson等，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size，Chemistry and Biology，9237-244；以及Magliery，(2001)Expanding the Genetic CodeSelection of EfficientSuppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codons with aLibrary Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307755-769。
例如，利用體外生物合成方法通過四堿基密碼子可將非天然氨基酸插入到蛋白質(zhì)內(nèi)。見Ma等，(1993)Biochemistry，327939；以及Hohsaka等，(1999)J.Am.Chem.Soc.，12134。CGGG和AGGU與兩個(gè)化學(xué)?；囊拼a抑制型tRNA一起可以將賴氨酸的2-萘丙氨酸和NBD衍生物同時(shí)插入到鏈親和素內(nèi)。見Hohsaka等，(1999)J.Am.Chem.Soc.，12112194。在一個(gè)體內(nèi)試驗(yàn)中，Moore等人檢測(cè)了tRNALeu衍生物和NCUA反密碼子抑制UAGN密碼子的能力(N代表U、A、G或C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四聯(lián)密碼子UAGA可被攜帶UCUA反密碼子的tRNALeu解碼，其效率為13～26％，在0或-1框架處解碼。見Moore等，(2000)J.Mol.Biol.298195。在一個(gè)實(shí)施方式中，來(lái)源于稀有密碼子或無(wú)義密碼子的擴(kuò)充密碼子被用于本發(fā)明中，這些密碼子可降低在其他非目的位點(diǎn)上發(fā)生錯(cuò)義通讀和移碼校正抑制的幾率。在本文的實(shí)施例中，描述了一種能識(shí)別AGGA選擇者密碼子的正交對(duì)，該正交對(duì)可在蛋白翻譯過程中將高谷氨酰胺插入。
在一個(gè)給定的系統(tǒng)中，選擇者密碼子還可以是一個(gè)天然的三堿基密碼子，其中內(nèi)源性的翻譯系統(tǒng)不能利用(或很少利用)這個(gè)天然的三堿基密碼子。例如，缺乏能識(shí)別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或三堿基密碼子是稀有密碼子的系統(tǒng)。
選擇者密碼子還包括非天然堿基對(duì)。這些非天然堿基對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)充了現(xiàn)有的遺傳密碼表。一個(gè)額外的堿基對(duì)就可以將三聯(lián)密碼子的數(shù)目從64個(gè)增加到125個(gè)。第三堿基對(duì)的特性包括穩(wěn)定而特異的堿基配對(duì)、可以被聚合酶高保真地插入到DNA內(nèi)、以及在起始非天然堿基對(duì)合成以后可進(jìn)一步延伸引物。可用于本發(fā)明的方法和組合物中的非天然堿基對(duì)描述于Hirao等，(2002)An unnatural base pair forincorporating amino acid analogues into protein，Nature Biotechnology，20177-182和Wu，Y等，(2002)J.Am.Chem.Soc.12414626-14630。其他相關(guān)的文獻(xiàn)將在下文列出。
非天然核苷在用于體內(nèi)時(shí)是可以穿透生物膜的，被磷酸化后形成相應(yīng)的三磷酸鹽形式。另外，這些增加的遺傳信息是穩(wěn)定的，不易被細(xì)胞的酶破壞。Benner及其同事在以前的試驗(yàn)中利用了氫鍵模式的特點(diǎn)，這些氫鍵模式與經(jīng)典的Watson-Crick堿基對(duì)內(nèi)的氫鍵模式是不同的，其中最值得注意的是iso-Ciso-G對(duì)。見Switzer等，(1989)J.Am.Chem.Soc.，1118322和Piccirilli等，(1990)Nature，34333；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4602。一般來(lái)說，這些堿基會(huì)與天然堿基發(fā)生某種程度的錯(cuò)配，并且不能被酶催化而復(fù)制。Kool及其同事的研究表明堿基之間的疏水性包裹作用可被氫鍵代替，從而驅(qū)動(dòng)堿基對(duì)的形成。見Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4602和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36，2825。為了開發(fā)出能滿足上述所有要求的非天然堿基對(duì)，Schultz、Romesberg及其同事系統(tǒng)地合成和研究了一系列的非天然疏水堿基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PICSPICS自身配對(duì)比天然堿基對(duì)更穩(wěn)定，可以被大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)插入到DNA內(nèi)。見McMinn等，(1999)J.Am.Chem.Soc.，12111586和Ogawa等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，1223274。3MN3MN自身配對(duì)可由KF合成，其活性和特異性足以滿足其行使生物學(xué)功能。見Ogawa等，(2000)J.Am.Chem.Soc.1228803。但是，這兩個(gè)堿基都作為鏈的末端以便于進(jìn)一步復(fù)制。最近開發(fā)出了一種可用于復(fù)制PICS自身配對(duì)的突變的DNA聚合酶。另外，7AI自身配對(duì)也能被復(fù)制。見Tae等，(2001)J.Am.Chem.Soc.，1237439。一種新型的金屬堿基對(duì)DipicPy也被開發(fā)出來(lái)，該堿基對(duì)在結(jié)合Cu(II)后可形成穩(wěn)定的堿基對(duì)。見Meggers等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，1221071。由于擴(kuò)充的密碼子和非天然密碼子本來(lái)就是與天然密碼子正交的，因此本發(fā)明的方法可利用這一特性來(lái)制備用于這些密碼子的正交tRNA。
一種翻譯旁路系統(tǒng)也可用于將高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸插入到目的多肽內(nèi)。在翻譯旁路系統(tǒng)中，一個(gè)不能被翻譯成蛋白的大片段序列被插入到基因內(nèi)。這個(gè)序列含有一個(gè)可作為提示符的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)核糖體跳過這個(gè)序列，在這個(gè)插入片段的下游恢復(fù)翻譯。
非天然氨基酸如本文所述，非天然氨基酸是指除硒氨酸和/或吡咯賴氨酸和下列20個(gè)遺傳密碼編碼的α氨基酸之外的所有氨基酸、修飾氨基酸或氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。α氨基酸的通用結(jié)構(gòu)可用結(jié)構(gòu)式I表示 非天然氨基酸一般都具有結(jié)構(gòu)式I的結(jié)構(gòu)，其中R基團(tuán)代表20個(gè)天然氨基酸使用的基團(tuán)之外的任何取代基。見L.Stryer編的《生物化學(xué)》(Biochemistry)(第三版，1988，F(xiàn)reeman and Company，New York)以了解20個(gè)天然氨基酸的結(jié)構(gòu)。需要注意的是，本發(fā)明的非天然氨基酸也可以是上述20個(gè)α氨基酸之外的天然化合物(或者人工制備的合成化合物)。
一般來(lái)說，本發(fā)明的非天然氨基酸在側(cè)鏈上與天然氨基酸是不同的，因此非天然氨基酸可以與其他氨基酸形成酰胺鍵，形成的方式與天然蛋白中的酰胺鍵一樣。但是，非天然氨基酸含有將其與天然氨基酸區(qū)別開來(lái)的側(cè)鏈基團(tuán)。
在將非天然氨基酸插入蛋白質(zhì)的過程中令我們非常感興趣的是它有能力插入高谷氨酰胺。對(duì)于其他的非天然氨基酸來(lái)說，結(jié)構(gòu)式I中的R基團(tuán)可以是烷基、芳基、酰基、酮基、疊氮基、羥基、肼、腈基、鹵素-、酰肼、烯基、炔基、醚、巰醇、硒基、磺?；?、硼酸基、磷酸基、磷、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺等，或上述基團(tuán)的混合物。我們感興趣的其他非天然氨基酸包括而不限于含光活化交聯(lián)物的氨基酸、自旋-標(biāo)記的氨基酸、熒光標(biāo)記的氨基酸、金屬結(jié)合的氨基酸、含金屬的氨基酸、放射性氨基酸、含有新官能團(tuán)的氨基酸、與其他分子共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的氨基酸、光陷阱(photocaged)和/或可感光異構(gòu)的(photoisomerizable)氨基酸、含生物素或生物素類似物的氨基酸、含酮類的氨基酸、糖基化的氨基酸、含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代氨基酸、可化學(xué)裂解或光裂解的氨基酸、與天然氨基酸相比側(cè)鏈延長(zhǎng)的氨基酸(如超過約5個(gè)、約10個(gè)碳原子的聚醚或長(zhǎng)鏈烴)、含碳連接糖的氨基酸、具有氧化還原活性的氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸、以及含一個(gè)或多個(gè)毒性基序的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，非天然氨基酸含有光活化交聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，非天然氨基酸含有連接于氨基酸側(cè)鏈上的糖基和/或其他糖類修飾。
非天然氨基酸除了可以包含新型側(cè)鏈以外，還可以包含經(jīng)修飾的骨架結(jié)構(gòu)，如結(jié)構(gòu)式II和III所示的結(jié)構(gòu) 式中，Z一般為OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可以相同或不同，一般包括S或O，R和R′可以相同，也可以不同，一般選自與上述結(jié)構(gòu)式I所示的非天然氨基酸的R基團(tuán)相同的一組取代基團(tuán)以及氫。例如，本發(fā)明的非天然氨基酸還可以在結(jié)構(gòu)式II和III所示的氨基或羧基上含有取代基團(tuán)。這一類型的非天然氨基酸包括而不限于帶20個(gè)常見氨基酸相應(yīng)的側(cè)鏈或非天然側(cè)鏈的α-羥酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸鹽。另外，α碳原子上的取代基還包括L，D或α-α-雙取代基氨基酸，如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨酪酸等。其他的結(jié)構(gòu)形式包括環(huán)形氨基酸，如脯氨酸類似物以及3、4、6、7、8和9環(huán)脯氨酸類似物，β和γ氨基酸，如取代的β丙氨酸和γ-氨酪酸。本發(fā)明其他結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸包括同型-β-型結(jié)構(gòu)，比如其中臨近α碳原子處有一個(gè)亞甲基或氨基夾心，例如同型-β-酪氨酸、α-胼基-酪氨酸的同分異構(gòu)體。如圖所示 許多非天然氨基酸來(lái)源于天然氨基酸，如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等。例如，酪氨酸類似物包括副取代酪氨酸、正取代酪氨酸和偏取代酪氨酸，其中取代酪氨酸攜帶乙酰基、苯甲?；?、氨基、肼、羥氨基、巰基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烷基、飽和或不飽和烷基、O-甲基、聚醚基等。另外，也可以包含多取代芳環(huán)。本發(fā)明的谷氨酰胺類似物包括而不限于α-羥基衍生物、γ-取代衍生物、環(huán)狀衍生物和酰胺取代基谷氨酰胺衍生物。典型的苯丙氨酸類似物的例子包括而不限于副取代苯丙氨酸、正取代苯丙氨酸和偏取代苯丙氨酸，其中的取代基包括羥基、甲氧基、甲基、丙稀基、醛基或酮基等。非天然氨基酸的特殊例子包括而不限于高谷氨酰胺、3，4-羥基-L-苯丙氨酸、p-乙?；?L-苯丙氨酸、p-炔丙氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-丙稀基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-絲氨酸、L-多巴、含氟苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、p-疊氮基-L-苯丙氨酸、p-酰基-L-苯丙氨酸、p-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷絲氨酸、磷?；z氨酸、磷?；野彼帷-碘-苯丙氨酸、p-溴苯丙氨酸、p-氨基-L-苯丙氨酸以及異丙基-L-苯丙氨酸等。各種非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)顯示在題為“非天然氨基酸的體內(nèi)插入”的WO 2002/085923的圖16、17、18、19、26和29中。
非天然氨基酸的化學(xué)合成上面所提到的許多非天然氨基酸都可以從Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)等公司購(gòu)買到。那些未商業(yè)化的非天然氨基酸可以利用文獻(xiàn)中或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法合成。見Fessendon和Fessendon的《有機(jī)化學(xué)》(Organic Chemitry)(1982，第二版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的《高級(jí)有機(jī)化學(xué)》(AdvancedOrganic Chemistry)(第三版，1985，Wiley and Sons，New York)；以及Carey和Sundberg的《高級(jí)有機(jī)化學(xué)》(Advanced Organic Chemistry)(第三版，A和B部分，1990，PlenumPress，New York)。其他描述非天然氨基酸合成的文獻(xiàn)包括題為“非天然氨基酸的體內(nèi)插入”的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2002/085923；Matsoukas等，(1995)J.Med.Chem.，38，4660-4669；King，F(xiàn).E.和Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J.Chem.Soc.，3315-3319；Friedman，O.M.和Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as ModelSubstrates for Anti-tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.和Frappier，F(xiàn).(1991)Glutamine analogues asPotential Antimalarials，Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.和Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained AminoAcid Analogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.和Rapoport，H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.J.Org.Chem.19891859-1866；Barton等，(1987)Synthesis of Novelα-Amino-Acids and Derivatives Using Radical ChemistrySynthesis of L-andD-α-Amino-Adipic Acids，L-a-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron Lett.434297-4308；以及Subasinghe等，(1992)Quisqualic acidanaloguessynthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and theiractivity at a novel quisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.354602-7。還可以參見2003年12月22日提交的題為“Protein Arrays(蛋白質(zhì)陣列)”的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/41346。
非天然氨基酸的細(xì)胞攝取一般來(lái)說，在設(shè)計(jì)和篩選非天然氨基酸，如用于插入到蛋白質(zhì)中，的時(shí)候需要考慮的一個(gè)問題就是細(xì)胞對(duì)非天然氨基酸的攝取。例如，帶高密度電荷的α氨基酸是不可能透過細(xì)胞膜的。天然氨基酸通過以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的收集進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，但是這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)一般都有不同程度的氨基酸特異性。有一種快速篩選方法可用于評(píng)價(jià)哪種非天然氨基酸可被細(xì)胞攝取。見下列文獻(xiàn)中的毒性分析方法2003年12月22日提交的題為“Protein Arrays(蛋白質(zhì)陣列)”的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/41346；以及Liu，D.R.& Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolutionof an organism with an expanded genetic code.PNAS United States964780-4785。雖然可以通過各種方法很容易地分析攝取的情況，但是，設(shè)計(jì)能利用細(xì)胞攝取通路的非天然氨基酸的另外一種方法是在體內(nèi)提供生物合成通路來(lái)合成氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成在細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)存在許多生物合成通路用于合成氨基酸和其他化合物。但是某種特定非天然氨基酸的生物合成方法在自然界中可能是不存在的，如在細(xì)胞內(nèi)，本發(fā)明提供了這樣的方法。例如，可以通過加入新的酶或者修飾現(xiàn)有的宿主細(xì)胞通路來(lái)設(shè)計(jì)出非天然氨基酸的生物合成通路。額外的新酶可以是天然的酶，也可以是經(jīng)人工改造的酶。例如，p-氨基苯丙氨酸(如上述WO 2002/085923的實(shí)施例中存在的氨基酸)的生物合成依賴于添加其他有機(jī)體來(lái)源的已知酶的混合物?？梢酝ㄟ^用含這些酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞而將這些基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)。這些基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，可以提供一個(gè)酶催化通路來(lái)合成所需要的化合物?？捎糜诒景l(fā)明的這類酶的典型例子見下面實(shí)施例的描述。這些額外的酶的序列可在Genbank中找到。人工修飾的酶也可以同樣的方式加入到細(xì)胞內(nèi)。在這種方式中，可以通過選擇細(xì)胞內(nèi)合成機(jī)器和細(xì)胞的來(lái)源來(lái)制備非天然氨基酸。
許多方法確實(shí)都可用于在體外或體內(nèi)制備生物合成通路所用的新型酶、改造現(xiàn)有的通路、制備非天然氨基酸。許多現(xiàn)有的修飾酶和生物合成通路其他組分的方法都可用于本發(fā)明以制備非天然氨基酸(或者修飾酶使其具有新的底物特異性或其他有用的活性)。例如，DNA重組技術(shù)可用于制備新型酶和/或這種酶的通路以便于在體外或體內(nèi)制備非天然氨基酸(或制備新的合成酶)。見Stemmer(1994)，Rapid evolutionof a protein in vitro by DNA shuffling，Nature370(4)389-391；以及Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation and reassemblyIn vitro recombination formolecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，9110747-10751。一個(gè)相似的方法可以使相關(guān)家族的基因(如同源的基因)快速地進(jìn)化成具有所需特性的酶。這種“家族基因重組”方法的一個(gè)典型例子見于Crameri等(1998)DNA shuffling of a family of genesfrom diverse species accelerates directedevolutionNature，391(6664)288-291的描述。新型酶(生物合成通路的組分或合成酶)也可以通過DNA重組方法制備，這種方法被稱為“制備雜交酶的漸進(jìn)式截?cái)嗉夹g(shù)”(ITCHY)，如Ostermeier等，(1999)″Acombinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology″NatureBiotech171205中所描述的。這種方法也可用于制備酶或其他通路變體的文庫(kù)，其中的酶或通路變體可作為一種或多種體外或體內(nèi)重組方法的底物。見Ostermeier等(1999)″Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，963562-67，和Ostermeier等(1999)，″Incremental Truncation as a Strategy inthe Engineering of Novel Biocatalysts，″Biological and Medicinal Chemistry，72139-44。另外一種方法可通過指數(shù)整體誘變來(lái)制備酶或其他通路變體的文庫(kù)，通過篩選文庫(kù)可以找到一些酶或其他通路變體，這些酶和通路變體能夠催化用于制備非天然氨基酸(或新的合成酶)的生物合成反應(yīng)。在這種方法中，目的序列上的殘基小組合可被用于隨機(jī)地平行鑒定位置發(fā)生改變的從而導(dǎo)致具有新功能的蛋白產(chǎn)生的每一個(gè)氨基酸。能用于本發(fā)明來(lái)制備可生產(chǎn)非天然氨基酸的新酶(或新的合成酶)的這種方法的例子見于Delegrave和Youvan(1993)Biotechnology Research111548-1552的描述。在另一種方法中，利用摻入的(doped)或退化的寡核苷酸來(lái)改造酶和/或通路組分的隨機(jī)或半隨機(jī)突變方法也可以被使用，例如通過Arkin和Youvan(1992)″Optimizingnucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-randommutagenesis″Biotechnology10297-300或Reidhaar-Olson等(1991)″Randommutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes″Methods Enzymol.208564-86所描述的通用突變方法。被稱為“非隨機(jī)”突變的另一種方法通過多核苷酸重新組裝和位點(diǎn)飽和突變技術(shù)來(lái)制備酶和/或通路組分，然后篩選這些酶或組分以確定其是否具有一種或多種合成酶或生物合成通路的功能(如在體內(nèi)制備非天然氨基酸)。見Short的專利申請(qǐng)WO 00/46344，專利名稱為“基因疫苗和酶的非隨機(jī)制備”。
這種突變方法的一種替代方法包括重組有機(jī)體的完整基因組并篩選具有特定通路功能的子代(通常被稱為“完整基因組重組技術(shù)”)。這種方法也可用于本發(fā)明中，如通過基因組重組和篩選有機(jī)體(如大腸桿菌或其他細(xì)胞)來(lái)找到能夠制備出非天然氨基酸(或其中間體)的有機(jī)體。例如，下列文獻(xiàn)中所描述的方法就可用來(lái)設(shè)計(jì)通路以修飾細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)有的和/或新的通路，用于在體內(nèi)制備非天然氨基酸Patnaik等(2002)″Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance″Nature Biotechnology，20(7)707-712；以及Zhang等(2002)″Genome shuffling leads to rapid phenotypicimprovement in bacteria″Nature，02-7，415(6872)644-646。
現(xiàn)在還有一些其他的技術(shù)可被用來(lái)改造用于制備目的化合物的有機(jī)體和代謝通路，這些方法也可用于制備非天然氨基酸。描述這種通路改造方法的文獻(xiàn)包括Nakamura和White(2003)″Metabolic engineering for the microbial production of 1，3propanediol″Curr.Opin.Biotechnol.14(5)454-9；Berry等(2002)″Application ofMetabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo″J.Industrial Microbiology and Biotechnology28127-133；Banta等(2002)″Optimizing anartificial metabolic pathwayEngineering the cofactor specificity of Corynebacterium2，5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis″Biochemistry，41(20)，6226-36；Selivonova等(2001)″Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms″Applied and Environmental Microbiology，673645等等。
一般來(lái)說，無(wú)論用什么方法，用本發(fā)明的人工生物合成通路制備出的非天然氨基酸的濃度都足以滿足蛋白質(zhì)的生物合成，如細(xì)胞內(nèi)的天然含量，但是其濃度還沒有對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他氨基酸的濃度產(chǎn)生顯著影響，或者耗竭掉細(xì)胞內(nèi)的資源。用這種方法在體內(nèi)制備出的濃度一般約為10mM到0.05mM。一旦細(xì)胞經(jīng)過改造可以產(chǎn)生用于特異性通路和非天然氨基酸制備的酶以后，就需要進(jìn)行體內(nèi)篩選以進(jìn)一步優(yōu)化用于核糖體蛋白合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的非天然氨基酸的制備。
用于插入高谷氨酰胺的正交組分本發(fā)明提供了用于在體內(nèi)將高谷氨酰胺插入到正在合成的多肽鏈中以響應(yīng)選擇者密碼子，如終止密碼子、無(wú)義密碼子、四堿基或多堿基密碼子等的正交組分的制備方法和組合物。例如，本發(fā)明提供了正交-tRNA(O-tRNA)、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)及其正交對(duì)。這些正交對(duì)可用于將高谷氨酰胺插入到正在合成的多肽鏈中。
本發(fā)明的組合物包括正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，其中的O-RS優(yōu)先用高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA。在某些實(shí)施方式中，O-RS含有攜帶SEQ ID NO1或其保守變體的氨基酸序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，O-RS優(yōu)先氨酰化O-tRNA，其效率至少是含氨基酸序列SEQ ID NO.1的多肽的50％。
含有O-RS的組合物還可以含有正交tRNA(O-tRNA)，其中的O-tRNA可識(shí)別選擇者密碼子。一般來(lái)說，與包含或編碼于本文序列表和實(shí)施例所列的多核苷酸序列的O-tRNA相比，在同源合成酶存在的條件下，本發(fā)明的O-tRNA為了響應(yīng)選擇者密碼子而產(chǎn)生的抑制效率至少可達(dá)45％、50％、60％、75％、80％、90％或更高。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS聯(lián)合O-tRNA所產(chǎn)生的抑制效率至少比缺少O-RS的O-tRNA所產(chǎn)生的抑制效率高5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或更高。一方面，O-RS聯(lián)合O-tRNA所產(chǎn)生的抑制效率至少是詹氏甲烷球菌來(lái)源的正交酪氨酰-tRNA合成酶對(duì)所產(chǎn)生的抑制效率的45％。
包含O-tRNA的組合物還可以包含細(xì)胞(例如非真核細(xì)胞如大腸桿菌等，或真核細(xì)胞)和/或翻譯系統(tǒng)。
包含翻譯系統(tǒng)的細(xì)胞(如非真核細(xì)胞或真核細(xì)胞)也是本發(fā)明的內(nèi)容，其中的翻譯系統(tǒng)包括正交-tRNA(O-tRNA)；正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)和高谷氨酰胺。一般來(lái)說，O-RS優(yōu)先氨?；疧-tRNA，其效率至少是含氨基酸序列SEQ ID NO.1多肽的50％。O-tRNA可識(shí)別第一選擇者密碼子，O-RS優(yōu)先用高谷氨酰胺氨酰化O-tRNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-tRNA含有SEQ ID NO.2所示的序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列，或者被該序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS含有任何一個(gè)SEQ ID NO.1或其保守變體所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的細(xì)胞還可以包含其他的O-tRNA/O-RS對(duì)和第二種非天然氨基酸，例如，其中的這個(gè)O-tRNA可識(shí)別第二選擇者密碼子，這個(gè)O-RS優(yōu)選用第二種非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。另外，本發(fā)明的細(xì)胞還可以包含含有目的多肽編碼多核苷酸的核酸，其中的多核苷酸含有能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞包括大腸桿菌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有正交-tRNA(O-tRNA)、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、高谷氨酰胺和含有目的多肽編碼多核苷酸的核酸，其中的多核苷酸含有能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的O-tRNA含有本文列表中和實(shí)施例中所示的多核苷酸序列或其互補(bǔ)的多核苷酸序列，或者被這些序列編碼。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，O-RS含有序列表中所示的氨基酸序列或其保守變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS或其片段被編碼本文列表中和實(shí)施例中所示的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼。
本發(fā)明的O-tRNA和/或O-RS可來(lái)源于各種有機(jī)體(如真核和/或非真核有機(jī)體)。
多核苷酸也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的多核苷酸包括人工的(如人造的和非天然產(chǎn)生的)多核苷酸，其中含有編碼本文列表所示多肽的核苷酸序列，和/或與該多核苷酸序列互補(bǔ)或者就是那個(gè)多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸還包括在較嚴(yán)格的條件下能與上述多核苷酸在核酸全長(zhǎng)上雜交的核酸。本發(fā)明的多核苷酸還包括與天然tRNA或其相應(yīng)編碼核酸的序列具有至少75％、80％、90％、95％、98％或更高相同性的多核苷酸(但是本發(fā)明的多核苷酸不是天然tRNA或其相應(yīng)的編碼核酸)，其中的tRNA可識(shí)別選擇者密碼子，如四堿基密碼子。與上述任何多核苷酸序列至少有80％、90％、95％、98％或更高相同性的人工多核苷酸序列，和/或含上述序列保守變體的多核苷酸也包括在本發(fā)明的多核苷酸中。
含本發(fā)明的多核苷酸的載體也是本發(fā)明的特征。例如，本發(fā)明的載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、表達(dá)載體等。含本發(fā)明的載體的細(xì)胞也是本發(fā)明的特征。
O-tRNA/O-RS對(duì)的組分的制備方法也是本發(fā)明的特征。利用這些方法制備出的組分也是本發(fā)明的特征。例如，至少制備一個(gè)與細(xì)胞正交的tRNA(O-tRNA)的方法包括制備突變的tRNA文庫(kù)；突變tRNA突變文庫(kù)內(nèi)每一個(gè)成員的反密碼子環(huán)使其能識(shí)別選擇者密碼子，從而形成一個(gè)O-tRNA文庫(kù)，負(fù)篩選第一物種的第一細(xì)胞群，其中的細(xì)胞含有O-tRNA文庫(kù)的成員。負(fù)篩選可去除含O-tRNA文庫(kù)的成員的細(xì)胞，其中的O-tRNA可被細(xì)胞內(nèi)源性的氨酰-tRNA合成酶(RS)氨?；?。這樣就形成一個(gè)與第一物種的細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)，從而至少可以獲得一個(gè)O-tRNA。利用本發(fā)明的方法制備出的O-tRNA也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括正篩選第一物種的第二細(xì)胞群，其中的細(xì)胞含有與第一物種的細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)的成員、同源的氨酰-tRNA合成酶和正選擇標(biāo)記。通過正篩選篩選出的那些細(xì)胞含有能被同源氨酰-tRNA合成酶氨?；膖RNA庫(kù)的成員，在正選擇標(biāo)記存在的情況下可出現(xiàn)預(yù)期的反應(yīng)，從而可以獲得O-tRNA。在某些實(shí)施方式中，第二細(xì)胞群含有沒有被負(fù)篩選去除的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了能將高谷氨酰胺加載到O-tRNA上的正交-氨酰-tRNA合成酶的鑒定方法。例如，該方法包括篩選第一物種的細(xì)胞群，其中的細(xì)胞都含有1)一組氨酰-tRNA合成酶(RS)的成員(如一組RS可包括突變的RS、第一物種之外的物種來(lái)源的RS、或者二者都包括)；2)正交-tRNA(O-tRNA)(如來(lái)源于一個(gè)或多個(gè)物種)；以及3)編碼正選擇標(biāo)記并且至少包含一個(gè)選擇者密碼子的多核苷酸。
篩選細(xì)胞(如宿主細(xì)胞)以挑出與不含RS群的成員或含量較少的細(xì)胞相比抑制效率升高的那些細(xì)胞。這些被篩選出的細(xì)胞含有能氨酰化O-tRNA的有活性的RS。利用這種方法鑒定出的正交氨酰-tRNA合成酶也是本發(fā)明的特征。
在細(xì)胞(例如非真核細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞等，或者真核細(xì)胞)內(nèi)制備特定位置上為高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的方法也是本發(fā)明的特征。例如，一種方法是在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，其中的細(xì)胞含有核酸，該核酸至少含有一個(gè)選擇者密碼子，編碼一個(gè)蛋白，加入高谷氨酰胺，在至少含有一個(gè)選擇者密碼子的核酸的翻譯過程中高谷氨酰胺被插入到蛋白質(zhì)的特定位置上，生成蛋白質(zhì)。細(xì)胞還含有在細(xì)胞內(nèi)有功能并且能識(shí)別選擇者密碼子的正交-tRNA(O-tRNA)；以及優(yōu)先用高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)。利用這種方法制備的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的特征。
本發(fā)明還提供了包含蛋白質(zhì)的組合物，其中的蛋白質(zhì)含有高谷氨酰胺。在某些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)的氨基酸序列與已知蛋白如治療性蛋白、診斷蛋白、工業(yè)用酶的氨基酸序列或其部分至少75％相同性。另外，組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。
核酸和多肽序列及其變體如上文和下文所描述，本發(fā)明提供了核酸的多核苷酸序列，如O-tRNA和O-RS，、多肽的氨基酸序列，如O-RS，以及包含所述序列的組合物、系統(tǒng)和方法。所述序列的例子如O-tRNA和O-RS也在本文中列出(見本文的序列表和實(shí)施例)。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明并不僅僅局限于這些序列，如實(shí)施例和列表中的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明還包括具有本文所描述的功能如編碼合適O-tRNA或O-RS的許多相關(guān)和不相關(guān)序列。
本發(fā)明提供了多肽(O-RS)和多核苷酸，如O-tRNA、編碼O-RS或其片段的多核苷酸，用于分離氨酰-tRNA合成酶克隆的寡核苷酸等。本發(fā)明的多核苷酸包括那些編碼本發(fā)明的目的蛋白或多肽的多核苷酸，其中的蛋白或多肽含有一個(gè)或多個(gè)選擇者密碼子。另外，本發(fā)明的多核苷酸還包括含有序列表中所列核苷酸序列的多核苷酸；與多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸或者編碼多核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還可以編碼包含本文序列表或?qū)嵤├械哪切┬蛄械陌被嵝蛄?。本發(fā)明的多核苷酸還包括編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。同樣，在高嚴(yán)格條件下，可與上述多核苷酸在全長(zhǎng)核酸序列上雜交的人工核酸也包括在本發(fā)明的多核苷酸范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包含本發(fā)明的多肽和各種賦形劑(如緩沖液、水、藥學(xué)上可接受的賦形劑等)。本發(fā)明還提供了可與本發(fā)明的多肽發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體或抗血清。人工多核苷酸是由人制備的，不是天然發(fā)生的。
本發(fā)明的多核苷酸還包括人工的多核苷酸，這種多核苷酸與天然tRNA、本文列表或?qū)嵤├械娜魏蝨RNA或其編碼核酸的多核苷酸(但是天然tRNA除外)至少有75％、80％、90％、95％、98％或更高的相同性。多核苷酸還包括與天然tRNA的多核苷酸至少有75％、80％、90％、95％、98％或更高相同性的人工多核苷酸。
在某些實(shí)施方式中，載體(如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等)含有本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體包含與本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸功能相連的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞包含攜帶本發(fā)明的多核苷酸的載體。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解的是本發(fā)明還包括公開序列的多種變體。例如，可形成功能相似序列的公開序列的保守變體也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。核酸多核苷酸序列的變體也被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其中的變體可與至少一個(gè)公開序列雜交，并且能識(shí)別選擇者密碼子。本文公開的序列的獨(dú)特序列，例如通過標(biāo)準(zhǔn)序列比較技術(shù)確定的獨(dú)特序列，也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
保守變體由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，“靜默替代”(即核酸序列上的替代不會(huì)導(dǎo)致其編碼多肽的改變)是每個(gè)編碼氨基酸的核酸的隱含特性。同樣，氨基酸序列上的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生“保守氨基酸替代”是指用特性高度相似的不同氨基酸來(lái)替代，也很容易被鑒定為與公開的構(gòu)建體高度相似。每一個(gè)公開序列的這種保守變體也是本發(fā)明的特征。
特定核酸序列的“保守變體”是指那些編碼一樣或基本一樣的氨基酸序列的核酸，或者是指雖然不編碼氨基酸序列、但序列基本相同的核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到導(dǎo)致編碼序列上單個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸(一般少于5％，更常見的是少于4％、2％或1％)發(fā)生改變、添加或刪除的單個(gè)替代、缺失或插入是“保守修飾的變體”，其中的改變可導(dǎo)致氨基酸的刪除、氨基酸的添加或以化學(xué)相似的氨基酸替代原來(lái)的氨基酸。因此，本發(fā)明所列出的多肽序列的“保守變體”包括用具有相同保守取代基團(tuán)的氨基酸替代一小部分氨基酸，一般低于多肽氨基酸總數(shù)的5％，更常見的是低于2％或1％。最后，不改變核酸分子編碼活性的序列添加，如添加非功能序列，被稱為基礎(chǔ)氨基酸的保守變體。
可提供功能相似氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域熟知的，其中一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有相似化學(xué)特性(芳香族側(cè)鏈或帶正電荷的側(cè)鏈)的氨基酸替代，因此不會(huì)在實(shí)質(zhì)上改變多肽分子的功能。下面列出了幾組具有相似化學(xué)特性的天然氨基酸，其中每一組內(nèi)的互相替代都是“保守替代”。
核酸雜交對(duì)比雜交可用于鑒定本發(fā)明的核酸，如本文序列表中所列的那些核酸，包括本發(fā)明的核酸的保守變體，這種對(duì)比雜交方法是一種將本發(fā)明的核酸與不相關(guān)核酸區(qū)別開來(lái)的方法。另外，能與序列表中所列的那些核酸在高、超高、超超高嚴(yán)格條件下雜交的靶核酸也是本發(fā)明的特征。這類核酸的典型例子包括那些與一個(gè)給定核酸序列相比發(fā)生一個(gè)或幾個(gè)靜默核酸替代或保守核酸替代的核酸。
如果一個(gè)被檢測(cè)核酸被說成可與一個(gè)核酸探針特異性雜交，那么這個(gè)被檢測(cè)核酸與探針的匹配程度至少相當(dāng)于與完全匹配的互補(bǔ)靶核酸匹配程度的1/2，即信噪比至少是探針與靶核酸雜交的1/2，雜交的條件為完全匹配的探針與完全匹配的互補(bǔ)靶核酸結(jié)合所產(chǎn)生的信噪比至少等于與任何不匹配的靶核酸雜交所產(chǎn)生的信噪比的約5倍到10倍。
當(dāng)核酸相遇時(shí)發(fā)生雜交，一般是在溶液中。核酸之所以可以發(fā)生雜交是由各種已知的物理-化學(xué)作用力造成的，如氫鍵、溶劑排斥、堿基堆積等。較全面的有關(guān)核酸雜交的指導(dǎo)手冊(cè)是Tijssen(1993)的《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-與核酸探針雜交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes)中第I部分第2章，“雜交原理和核酸探針分析策略概述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)”，(Elsevier，New York)，以及上述Ausubel的文獻(xiàn)。Hames和Higgins(1995)編輯的GeneProbes 1(基因探針1》，牛津大學(xué)出版社IRL出版社，英國(guó)牛津(Hames和Higgins 1)以及Hames和Higgins(1995)編輯的Gene Probes 2(基因探針2)，牛津大學(xué)出版社IRL出版社，英國(guó)牛津(Hames和Higgins 2)詳細(xì)描述了DNA和RNA，其中包括寡核苷酸的合成、標(biāo)記、檢測(cè)和定量方法。
在DNA印跡或RNA印跡中，含有超過100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交到濾膜上的一個(gè)典型雜交條件是50％甲醛、1mg肝素、42℃雜交過夜。嚴(yán)格洗滌條件的例子是65℃用0.2×SSC洗滌15分鐘(見上述文獻(xiàn)Sambrook有關(guān)SSC緩沖液的描述)。一般情況下先用低嚴(yán)格條件再用高嚴(yán)格條件洗滌以去除背景探針信號(hào)。低嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)例子是40℃用2×SSC洗滌15分鐘。如果所檢測(cè)到的信噪比比不相關(guān)探針在特定雜交試驗(yàn)中所產(chǎn)生的信噪比高5倍(或更高)，就說明這是一個(gè)特異性雜交。
“嚴(yán)格的雜交洗滌條件”用于核酸雜交試驗(yàn)如DNA印跡和RNA印跡時(shí)是指序列依賴性的，但是在不同的環(huán)境參數(shù)下該條件是不同的。較全面的有關(guān)核酸雜交的指導(dǎo)手冊(cè)是上述的Tijssen(1993)和Hames和Higgins，1和2。任何被檢測(cè)核酸所用的雜交和洗滌條件的嚴(yán)格程度可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)很容易地確定。例如，在確定雜交和洗滌條件的嚴(yán)格程度時(shí)，可以逐漸提高雜交和洗滌條件的嚴(yán)格程度(如，在雜交或洗滌過程中通過升高溫度、降低鹽濃度、增加洗滌劑的濃度和/或增加有機(jī)溶劑如甲醛的濃度)，直到滿足了所選擇的一組標(biāo)準(zhǔn)。例如，在高嚴(yán)格雜交和洗滌條件下，逐漸增加雜交和洗滌條件直到探針與互補(bǔ)靶核酸完全匹配，所產(chǎn)生的信噪比至少是探針與不匹配靶核酸雜交所產(chǎn)生的信噪比的5倍。
對(duì)于一個(gè)特定探針來(lái)說，十分嚴(yán)格的條件等于其熱熔點(diǎn)(Tm)。Tm是指50％的被檢測(cè)核酸與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。一般來(lái)說，在一定的離子強(qiáng)度和pH條件下，本發(fā)明所選擇的“高嚴(yán)格”雜交和洗滌條件比一個(gè)特定序列的Tm約低5℃。
“超高嚴(yán)格程度”的雜交和洗滌條件是指雜交和洗滌條件的嚴(yán)格程度逐漸升高，直到探針與完全匹配的互補(bǔ)靶核酸結(jié)合所產(chǎn)生的信噪比至少達(dá)到探針與不匹配核酸雜交所產(chǎn)生的信噪比的10倍。靶核酸在這種條件下與探針雜交，如果所產(chǎn)生的信噪比至少是完全匹配的互補(bǔ)靶核酸所產(chǎn)生的信噪比的1/2，那么就可以說靶核酸可以在超高嚴(yán)格條件下與探針結(jié)合。
同樣可以通過逐漸提高預(yù)雜交試驗(yàn)的雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格程度來(lái)確定更高嚴(yán)格程度的雜交條件。例如，逐漸升高雜交和洗滌條件的嚴(yán)格程度，直到探針與完全匹配的互補(bǔ)靶核酸結(jié)合所產(chǎn)生的信噪比至少達(dá)到探針與不匹配核酸雜交所產(chǎn)生的信噪比的10倍、20倍、50倍、100倍、500倍或更高。靶核酸在這種條件下與探針雜交，如果所產(chǎn)生的信噪比至少是完全匹配的互補(bǔ)靶核酸所產(chǎn)生的信噪比的1/2，那么就可以說靶核酸可以在超超高嚴(yán)格條件下與探針結(jié)合。
如果核酸編碼的多肽是基本相同的，那么即使核酸不能彼此雜交，這兩個(gè)核酸也是基本相同的。這種情況發(fā)生在核酸的拷貝是充分利用遺傳密碼所允許的最大簡(jiǎn)并性來(lái)制備的時(shí)候。
獨(dú)特的亞序列一方面，本發(fā)明提供了含獨(dú)特亞序列的核酸，這些亞序列位于選自本文所描述的O-tRNA和O-RS序列的核酸內(nèi)。與任何已知的tRNA或RS核酸序列相應(yīng)的核酸相比，獨(dú)特亞序列都是獨(dú)特的?？衫肂LAST進(jìn)行核酸的排列，使用默認(rèn)參數(shù)。任何獨(dú)特亞序列都可作為探針用于鑒定本發(fā)明的核酸。
同樣，本發(fā)明還包括含獨(dú)特亞序列的多肽，這些獨(dú)特亞序列位于選自本文所描述的O-RS序列的多肽內(nèi)。在這里，與任何已知的RS序列相應(yīng)的多肽相比，獨(dú)特亞序列都是獨(dú)特的。
本發(fā)明還提供了能在嚴(yán)格條件下與獨(dú)特編碼寡核苷酸雜交的靶核酸，該寡核苷酸編碼選自O(shè)-RS序列的多肽內(nèi)的獨(dú)特亞序列，其中的獨(dú)特亞序列與任何對(duì)照多肽(如本發(fā)明的合成酶來(lái)源的親本序列，如通過突變獲得)相應(yīng)的多肽相比都是獨(dú)特的。獨(dú)特序列可通過上述方法確定。
序列比較、相同性和同源性術(shù)語(yǔ)“相同的”或“百分相同性”用于兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的比較時(shí)是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列在一起排列并比較其最大相似性時(shí)，這兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列是相同的，或者有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的，這種比較可利用下面所描述的一種序列比較算法(或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他算法)或通過肉眼觀察來(lái)完成。
術(shù)語(yǔ)“基本相同的”用于兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽(如編碼O-tRNA或O-RS的DNA，O-RS的氨基酸序列)的比較時(shí)是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列在一起排列并比較其最大相似性時(shí)，這兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列至少有約60％、80％、90-95％、98％、99％或更多的核苷酸或氨基酸殘基是相同的，這種比較可利用序列比較算法或通過肉眼觀察來(lái)完成。無(wú)論實(shí)際來(lái)源于何種家系，這種“基本相同的”序列一般被認(rèn)為是“同源的”?！皩?shí)質(zhì)相同性”是指在序列的一個(gè)區(qū)域內(nèi)的比較，這個(gè)區(qū)域至少約含50個(gè)殘基，更優(yōu)選的是至少約含100個(gè)殘基，最優(yōu)選的是至少約含150個(gè)殘基，或者在兩個(gè)序列的全長(zhǎng)上進(jìn)行比較。
當(dāng)?shù)鞍缀?或蛋白序列來(lái)源于同一個(gè)親本蛋白或蛋白序列時(shí)，不論是自然獲得的還是經(jīng)過改造的，這些蛋白和/或蛋白序列都是“同源的”。同樣，當(dāng)核酸和/或核酸序列來(lái)源于同一個(gè)親本核酸或核酸序列時(shí)，不論是自然獲得的還是經(jīng)過改造的，這些核酸和/或核酸序列都是“同源的”。例如，任何天然核酸都可以用現(xiàn)有的突變方法加以修飾使其包含一個(gè)或多個(gè)選擇者密碼子。當(dāng)這個(gè)突變的核酸被表達(dá)時(shí)，就編碼出一條含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸，如高谷氨酰胺的多肽。當(dāng)然，突變過程也可以改變一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)密碼子，從而使其編碼的突變蛋白上產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的改變。同源性一般是根據(jù)兩個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白(或其序列)的序列相同性推算出來(lái)的?？捎糜谕扑阃葱缘男蛄兄g的精確百分相同性根據(jù)所要比較的蛋白和核酸的不同而不同，但是一般來(lái)說至少要有25％的序列相同性才能建立同源性。更高的序列類似性，如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高，也可用于建立同源性。確定序列相同性百分比的方法(如BLASTP和BLASTN，使用默認(rèn)參數(shù))見本文的描述，這些方法都是現(xiàn)有的。
為了進(jìn)行序列比較并確定其同源性，一般需要把一個(gè)序列看作參考序列，被檢測(cè)序列與之比較。在使用序列比較算法時(shí)，將被測(cè)序列與參考序列輸入到計(jì)算機(jī)內(nèi)，如果需要，設(shè)定亞序列匹配值和序列算法程序的參數(shù)。序列比較算法就可以根據(jù)設(shè)定的程序參數(shù)計(jì)算出被測(cè)序列相對(duì)于參考序列的百分序列相同性。
進(jìn)行序列比較的理想序列排列方法可用下列算法完成局部同源性算法，Smith& Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)；同源性排列算法，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)；相似性檢索方法，Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA852444(1988)，以及這些算法的計(jì)算機(jī)程序(Wisconsin Genetics SoftwarePackage內(nèi)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或者通過肉眼檢查(見下面Ausubel等的文獻(xiàn))。
適于確定百分序列相同性和序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST算法，該算法描述于文獻(xiàn)Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中。執(zhí)行BLAST分析的軟件可在國(guó)家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)免費(fèi)下載。這種算法首先通過鑒定查詢序列中長(zhǎng)度為W的短字符來(lái)確定高分序列對(duì)(HSP)，這個(gè)短字符在與數(shù)據(jù)庫(kù)中相同長(zhǎng)度的字符一起排列時(shí)可匹配或達(dá)到某些正閾值記分T。T被稱為相鄰字符記分閾值(Altschul等，同上)。這些初始的相鄰字符采樣數(shù)(hits)作為種子啟動(dòng)檢索來(lái)尋找含有這些字符的HSP。然后字符采樣數(shù)在每一序列的兩個(gè)方向上擴(kuò)展，直到累積排列記分升高。用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)賞分?jǐn)?shù)；總是大于0)和N(錯(cuò)配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；總是小于0)來(lái)計(jì)算核苷酸序列的累積記分。對(duì)于氨基酸來(lái)說，可利用計(jì)分矩陣來(lái)計(jì)算累積記分。字符采樣數(shù)在每個(gè)方向上的延伸停止于下列時(shí)刻累積排列記分從其曾達(dá)到的最大數(shù)值開始回落時(shí)；由于累積了一個(gè)或多個(gè)負(fù)記分殘基排列使累積記分達(dá)到0或0以下時(shí)；或者達(dá)到序列的末端時(shí)。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)的默認(rèn)參數(shù)為字長(zhǎng)(W)＝11，期望值(E)＝10，終止值＝100，M＝5，N＝4，兩條鏈進(jìn)行比較。對(duì)于氨基酸序列來(lái)說，BLASTP程序的默認(rèn)參數(shù)為字長(zhǎng)(W)＝3，期望值(E)＝10，使用BLOSUM62計(jì)分矩陣(見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915)。
除了能夠計(jì)算百分序列相同性以外，BLAST算法還可以進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(見Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA905873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一個(gè)相似性數(shù)據(jù)是最小總概率(P(N))，這一數(shù)據(jù)說明了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間相匹配的可能性。例如，如果將被測(cè)核酸與參考核酸比較后得到的最小總概率約在0.1以下、優(yōu)選約0.01以下、最優(yōu)選的是約0.001以下，則這個(gè)核酸被認(rèn)為與參考序列是相似的。
突變和其他分子生物學(xué)技術(shù)本發(fā)明的以及用于本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行改造。描述分子生物學(xué)技術(shù)的綜合性教科書包括Berger和Kimmel的《分子克隆技術(shù)指導(dǎo)》(Guide to Molecular Cloning Techniques)第152卷“酶學(xué)方法”，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(第三版)1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港，2001(″Sambrook″)和《現(xiàn)代分子生物學(xué)操作指南》(Current Protocols in Molecular biology)，F(xiàn).M.Ausubel等人編輯，《現(xiàn)代操作指南》(Current Protocols)，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，共同投資出版，(2003年增補(bǔ))(″Ausubel″)。這些教科書描述了突變、載體的使用、啟動(dòng)子以及許多其他相關(guān)主題，如與基因制備有關(guān)的主題，這些包含選擇者密碼子的基因可用于蛋白質(zhì)的制備，其中包括高谷氨酰胺、正交tRNA、正交合成酶及其正交對(duì)。
各種突變技術(shù)都可用于本發(fā)明中進(jìn)行tRNA分子的突變、tRNA文庫(kù)的制備、合成酶文庫(kù)的制備、編碼高谷氨酰胺的選擇者密碼子向目的蛋白或多肽內(nèi)的插入。這些技術(shù)包括而不限于位點(diǎn)定向突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA重組或其他的回歸突變方法、嵌合構(gòu)建體、利用含尿嘧啶的模板進(jìn)行的突變、寡核苷酸定向突變、硫代磷酸修飾的DNA突變、利用帶缺口的雙鏈DNA進(jìn)行的突變等。其他合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、利用修復(fù)缺陷宿主系進(jìn)行的突變、限制性篩選和限制性純化、缺失突變、通過總基因合成進(jìn)行的突變、雙鏈斷裂修復(fù)等。利用嵌合構(gòu)建體進(jìn)行的突變也包括在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以利用已知的有關(guān)天然分子或者改變的或突變的天然分子的信息指導(dǎo)突變，如序列、序列比較、物理特性、晶體結(jié)構(gòu)等。
宿主細(xì)胞可用本發(fā)明的多核苷酸或包含本發(fā)明多核苷酸的構(gòu)建體進(jìn)行遺傳改造(如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，如本發(fā)明的載體，這些載體可以是克隆載體，也可以是表達(dá)載體。例如，正交tRNA、正交tRNA合成酶及其衍生的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)可以被可操控地連接到能在目的宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件上。典型的載體都包含轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列和用于調(diào)節(jié)特定靶核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。載體還可以包含基因表達(dá)盒，其中至少含有一個(gè)獨(dú)立的終止子序列，允許表達(dá)盒在真核或原核宿主、或者二者內(nèi)(如穿梭載體)復(fù)制的序列以及用于原核和真核系統(tǒng)內(nèi)的選擇標(biāo)記。載體可以在原核或真核宿主內(nèi)表達(dá)和/或整合，最好是既可在真核宿主內(nèi)又可在原核宿主內(nèi)表達(dá)和/或整合。見Giliman和Smith，Gene881(1979)；Roberts等，Nature，328731(1987)；Schneider，B.等，Protein Expr.Purif.643510(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(這三篇文獻(xiàn)同上)。載體可以是質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、裸多核苷酸或共軛多核苷酸的形式?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法將載體導(dǎo)入到細(xì)胞和/或微生物內(nèi)，如電穿孔(From等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，5824(1985))；用病毒載體感染；用含核酸的小粒子高壓滲透，其中核酸位于小珠或離子的基質(zhì)內(nèi)或表面上(Klein等，Nature327，70-73(1987))。
ATCC提供了可用于克隆的細(xì)菌和噬菌體的目錄，如ATCC出版的《細(xì)菌和噬菌體的ATCC目錄》(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1996)，Gherna等(編)。用于測(cè)序、克隆和分子生物學(xué)其他方面的其他基礎(chǔ)方法及其理論闡述見于Sambrook(同上)、Ausubel(同上)和Watson等(1992)科學(xué)美國(guó)人叢書第二版重組DNA(Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books)，NY。另外，幾乎所有核酸(以及幾乎所有的標(biāo)記核酸，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)的還是非標(biāo)準(zhǔn)的)都可以從各個(gè)公司里購(gòu)買或訂購(gòu)，如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX mcrc.com)、The GreatAmerican Gene Company(Ramona，CA，網(wǎng)址是www.genco.com)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，網(wǎng)址是www.expressgen.com)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)等。
經(jīng)遺傳改造的宿主細(xì)胞可用經(jīng)過適當(dāng)改變以便于進(jìn)行下列操作的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)篩選、活化啟動(dòng)子或篩選轉(zhuǎn)化子。這些細(xì)胞還可以培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因有機(jī)體。有關(guān)細(xì)胞分離和培養(yǎng)(如用于亞序列核酸分離)的其他有用文獻(xiàn)包括Freshney(1994)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)-基本操作技術(shù)》(Culture of Animal Cells，a Manual of BasicTechnique)，第三版，Wiley-Liss，New York及其引用的參考文獻(xiàn)；Payne等(1992)《在液體系統(tǒng)中進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)》(Plant Cell and Tissue Culture inLiquid Systems)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)》(Plant Cell，Tissue and Organ Culture)，F(xiàn)undamentalMethods Springer Lab Manual，Sprmger-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(編)《微生物學(xué)培養(yǎng)基手冊(cè)》(The Handbook of Microbiological Media)(1993)，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L。
目的蛋白和多肽至少含有一個(gè)高谷氨酰胺的目的蛋白或多肽是本發(fā)明的特征，含有兩個(gè)或多個(gè)不同的非天然氨基酸的多肽也是本發(fā)明的特征。賦形劑(如藥學(xué)上可接受的賦形劑)也可以和蛋白質(zhì)一起存在。另外，本發(fā)明的蛋白還可以進(jìn)行翻譯后修飾。
在細(xì)胞內(nèi)制備特定位置上為高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法也是本發(fā)明的特征。例如，一種方法是在適宜的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，其中的細(xì)胞含有至少包含一個(gè)選擇者密碼子并能編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的核酸；提供高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸；其中的細(xì)胞還包含在細(xì)胞內(nèi)有功能并能識(shí)別選擇者密碼子的正交-tRNA(O-tRNA)和優(yōu)先用高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸氨酰化O-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)。在某些實(shí)施方式中，與包含或編碼于本文序列表和實(shí)施例所列的多核苷酸序列的O-tRNA相比，在同源合成酶存在的條件下，這種O-tRNA為了響應(yīng)選擇者密碼子而產(chǎn)生的抑制效率至少可達(dá)45％、50％、60％、75％、80％、90％或更高。利用這種方法制備的蛋白也是本法發(fā)明的特征。
本發(fā)明還提供了含有蛋白的組合物，其中的蛋白包含高谷氨酰胺。在某些實(shí)施方式中，蛋白所包含的氨基酸序列與靶蛋白如治療性蛋白、診斷蛋白、工業(yè)用蛋白或其片段的序列至少有75％的相同性，如那些因?yàn)椴迦肓艘粋€(gè)或多個(gè)非天然氨基酸如高谷氨酰胺而與靶蛋白不同的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的組合物和利用本發(fā)明的方法制備出的組合物也可以存在于細(xì)胞內(nèi)。因此本發(fā)明的O-tRNA/O-RS對(duì)或其單個(gè)組分可被用于宿主系統(tǒng)的翻譯機(jī)器中，從而將高谷氨酰胺插入到蛋白質(zhì)內(nèi)。國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2004/011786(申請(qǐng)日為2004年4月16日，名稱為“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(擴(kuò)充真核遺傳密碼”)和WO 2002/085923(題為“非天然氨基酸的體內(nèi)插入”)描述了這一過程，本文已納入作為參考。例如，當(dāng)O-tRNA/O-RS對(duì)被引入到宿主如大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)后，O-tRNA/O-RS對(duì)在體內(nèi)響應(yīng)選擇者密碼子后可將高谷氨酰胺，一種合成的氨基酸，插入到蛋白質(zhì)內(nèi)，如酪氨酸或苯丙氨酸衍生物，這是作為外源性物質(zhì)加入到培養(yǎng)基內(nèi)的。另外，本發(fā)明的組合物既可以用于體內(nèi)翻譯系統(tǒng)，也可以用于體外翻譯系統(tǒng)。
利用本發(fā)明的細(xì)胞可以大規(guī)模地合成含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。一方面，組合物可以包含至少10μg、50μg、75μg、100μg、200μg、250μg、500μg、1mg、10mg或更多含高谷氨酰胺或多種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，或者含有蛋白質(zhì)的量能夠達(dá)到體內(nèi)蛋白合成方法的要求(本文提供了重組蛋白制備和純化方法的詳細(xì)描述)。另一方面，組合物中所含的蛋白質(zhì)濃度可以是每升細(xì)胞裂解物、緩沖液、藥學(xué)上可接受的緩沖液或其他液體懸液中至少含10μg、50μg、75μg、100μg、200μg、250μg、500μg、1mg、10mg或更高(如以1nL到100L的體積)。在細(xì)胞內(nèi)大量制備(例如大于其他方法，如體外翻譯，在一般情況下所能達(dá)到的規(guī)模)至少含一個(gè)高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的特征。
插入高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或功能的變化，如大小、酸性、親核性、氫鍵、疏水性、蛋白酶靶位點(diǎn)的易接近性、對(duì)基序的靶向性(如用于蛋白芯片時(shí))等。含有高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的催化活性或物理特性可能會(huì)得以改善，或者獲得全新的催化活性或物理特性。例如，下列特性可通過在蛋白質(zhì)內(nèi)插入高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸加以改變毒性、生物分布、結(jié)構(gòu)特性、分光光度特性、化學(xué)和/或光化學(xué)特性、催化能力、半衰期(如血清半衰期)、與其他分子相互作用的能力(共價(jià)的或非共價(jià)的)。包含至少攜帶一個(gè)高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的組合物可用作新型的治療蛋白、診斷蛋白、催化酶、工業(yè)用酶、結(jié)合蛋白(如抗體)以及可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。見Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes ofProtein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4645-652。另外，一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸可以被插入到多肽內(nèi)以形成分子標(biāo)簽，如用于將多肽固定到固體支持物上。見Wang和Schultz的專利申請(qǐng)“蛋白質(zhì)芯片”，申請(qǐng)日為2003年12月22日，代理人備案號(hào)為54-000810PC，參見其中的“利用含非天然氨基酸的多肽制備芯片的方法”的延伸討論。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，組合物包含至少一個(gè)蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)非天然氨基酸，如高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸。這些非天然氨基酸可以是相同的，也可以是不同的，如在蛋白質(zhì)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)不同的位點(diǎn)上含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)不同的非天然氨基酸。另一方面，組合物包含一個(gè)蛋白質(zhì)，這個(gè)蛋白質(zhì)至少有一個(gè)但不是全部的特定氨基酸被高谷氨酰胺替代。對(duì)于一個(gè)給定的含多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)來(lái)說，其中的非天然氨基酸可以是相同的，也可以是不同的(如蛋白質(zhì)包含兩個(gè)或多個(gè)不同類型的非天然氨基酸，或者包含兩個(gè)相同的非天然氨基酸)。對(duì)于一個(gè)給定的含兩個(gè)以上非天然氨基酸的蛋白質(zhì)來(lái)說，其中的非天然氨基酸可以是相同的，也可以是不同的，或者其中有多個(gè)非天然氨基酸是相同的，但是至少有一個(gè)不同非天然氨基酸。
一般來(lái)說，包含非天然氨基酸如高谷氨酰胺的任何蛋白質(zhì)(或其片段)，或者編碼多個(gè)不同非天然氨基酸的任何蛋白(及其相應(yīng)的編碼核酸，如包含一個(gè)或多個(gè)選擇者密碼子的核酸)都可用本發(fā)明的組合物和方法制備。無(wú)需將已知的成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)都一一鑒定，其中的任何一個(gè)都可以被修飾成含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的形式，如通過任何已知的突變方法將一個(gè)或多個(gè)適宜的選擇者密碼子插入到相關(guān)的翻譯系統(tǒng)內(nèi)。已知蛋白序列的常用數(shù)據(jù)庫(kù)包括GenBank EMBL、DDBJ和NCBI。其他數(shù)據(jù)庫(kù)通過搜索互聯(lián)網(wǎng)也可以很容易地找到。
一般來(lái)說，本發(fā)明的蛋白質(zhì)與已知的蛋白(如治療性蛋白、診斷蛋白、工業(yè)用蛋白，或其片段等)至少有60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或更高的相同性，其中包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸?？杀恍揎検蛊浒粋€(gè)或多個(gè)高谷氨酰胺的治療性蛋白、診斷蛋白以及其他蛋白可在下列文獻(xiàn)中找到，但是又不僅僅局限于這些文獻(xiàn)2004年4月16日提交的題為“Expanding the Eukaryotic Genetic Code(擴(kuò)充真核遺傳密碼)”的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2004/011786；以及WO 2002/085923，題為“非天然氨基酸的體內(nèi)插入”。可被修飾使其包含一個(gè)或多個(gè)高谷氨酰胺的治療性蛋白、診斷蛋白以及其他蛋白包括而不限于α-1抗胰蛋白酶、血管他丁、抗溶血因子、抗體(有關(guān)抗體的詳細(xì)描述見下文)、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子(如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降鈣素、CC趨化因子(如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1α、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1β、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配基、C-kit配基、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制因子、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子(如上皮細(xì)胞中性粒細(xì)胞活化肽-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP-1α、MIP-1δ、MCP-1)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、剝脫毒素A和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、纖維蛋白原、纖溶酶、G-CSF、GM-CSF、葡萄糖腦敢脂酶、絨毛膜促性腺激素、生長(zhǎng)因子、Hedgehog蛋白(如Sonic、Indian、Desert)、血紅素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、干擾素(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、白細(xì)胞介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、Neurturin、中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、骨形成蛋白、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽類激素(如人生長(zhǎng)激素、Pleiotropin、蛋白A、蛋白G、發(fā)熱外毒素A、B和C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體1、可溶性I-CAM1、可溶性白細(xì)胞介素受體(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)激素、鏈激酶、超抗原即葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克綜合征毒素TSST-1)、胸腺激素α1、組織纖溶酶原激活因子、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGEF)、尿激酶等。
可以利用本發(fā)明的組合物和方法在體內(nèi)制備出的含本文所描述的高谷氨酰胺的一類蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子或其片段。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的例子包括能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、調(diào)控等的基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子存在于原核細(xì)胞、病毒和真核生物如真菌、植物、酵母、昆蟲和動(dòng)物如哺乳動(dòng)物，提供了一個(gè)大范圍的治療靶位。應(yīng)當(dāng)理解的是表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活化因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制很多，如與受體結(jié)合、刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、與啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合、與啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合的蛋白結(jié)合、解鏈DNA、剪接mRNA前體、多聚腺苷酸化RNA和降解RNA。
本發(fā)明的一類蛋白質(zhì)(如攜帶一個(gè)或多個(gè)高谷氨酰胺的蛋白質(zhì))是表達(dá)活化因子，包括細(xì)胞因子、炎癥分子、生長(zhǎng)因子及其受體、以及癌基因產(chǎn)物，如白細(xì)胞介素(如IL-1、IL-2、IL-8等)、干擾素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1和hyalurin/CD44；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及其相應(yīng)的癌基因產(chǎn)物，如Mos、Ras、Raf和Met；以及轉(zhuǎn)錄活化因子和抑制因子，如p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel，以及類固醇激素受體，如雌激素、孕酮、睪丸酮、醛固酮、LDL受體的配基和皮質(zhì)酮。
本發(fā)明還提供了至少攜帶一個(gè)同型固氨酰胺的酶(如工業(yè)用酶)或其片段。酶的例子包括而不限于酰胺酶、氨基酸消旋酶、?；D(zhuǎn)移酶、脫氫酶、二氧合酶、二芳基丙烷過氧化物酶、表位酶、環(huán)氧化物水解酶、酯酶、異構(gòu)酶、激酶、葡萄糖異構(gòu)酶、糖苷酶、葡萄糖?；D(zhuǎn)移酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、單假氧酶(如p450)、脂肪酶、木素過氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酯酶、枯草桿菌蛋白酶、轉(zhuǎn)氨酶和核酶。
這些蛋白中有許多是可以從公司購(gòu)買到的(見Sigma BioSciences的2003年產(chǎn)品目錄和價(jià)目表)，其相應(yīng)的蛋白序列和基因及其變體通常都是已知的(見Genbank)。它們都可以按照本發(fā)明的方法通過插入一個(gè)或多個(gè)高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸來(lái)加以修飾，例如改變蛋白質(zhì)的一種或多種治療、診斷或酶催化特性。與治療相關(guān)的特性包括血清半衰期、保存半衰期、穩(wěn)定性、免疫原性、治療活性、可檢測(cè)性(如通過在非天然氨基酸如高谷氨酰胺上插入報(bào)告基團(tuán)(如標(biāo)記物或標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)))、LD50或其他負(fù)效應(yīng)的降低、通過胃腸道進(jìn)入體內(nèi)的能力(如口服利用度)等。診斷特性包括保存半衰期、穩(wěn)定性、診斷活性、可檢測(cè)性等。相關(guān)的酶催化特性包括保存半衰期、穩(wěn)定性、酶活性、生產(chǎn)能力等。
其他的多種蛋白也可加以修飾使其包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸。例如，本發(fā)明包含的蛋白質(zhì)可以是用高谷氨酰胺替代一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸的疫苗蛋白，這些蛋白來(lái)自于感染性真菌，如曲霉屬、念珠菌屬的真菌；細(xì)菌，特別是大腸桿菌，可以作為致病菌的模型，和醫(yī)學(xué)上有重要影響的細(xì)菌如葡萄球菌屬(如金黃色葡萄糖球菌)或鏈球菌屬(如肺炎鏈球菌)的細(xì)菌；原蟲如孢子蟲(如剛地弓形蟲)、根足蟲(如內(nèi)阿米巴原蟲)和鞭毛蟲(錐形蟲、利什曼原蟲、毛滴蟲、鞭毛蟲等)；病毒如(+)RNA病毒(例子包括痘病毒類如痘苗病毒；細(xì)小核糖核酸病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒；披膜病毒如風(fēng)疹病毒；黃病毒如HCV；以及冠狀病毒)，(-)RNA病毒(如彈狀病毒如VSV；副黏液病毒如RSV；正粘病毒如流感病毒；布亞病毒；以及沙粒病毒)，dsDNA病毒(如呼腸孤病毒)，RNA到DNA的病毒，即逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV和HTLV，以及某些DNA到RNA的病毒如乙肝病毒。
與農(nóng)業(yè)有關(guān)的蛋白質(zhì)如昆蟲抗性蛋白(如Cry蛋白)、淀粉和脂質(zhì)生成酶、植物和昆蟲毒素、毒素抗性蛋白、霉菌毒素解毒蛋白、植物生長(zhǎng)酶(如核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/氧合酶，″RUBISCO″)、脂肪加氧酶(LOX)、以及磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶也是高谷氨酰胺或其他非天然氨基酸修飾的適宜靶位。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和/或組合物內(nèi)的目的蛋白或多肽(或其片段)是由核酸編碼的。一般來(lái)說，這種核酸至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)選擇者密碼子。
目的蛋白或多肽的編碼基因可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法以及本文“突變和其他分子生物學(xué)技術(shù)”部分描述的方法加以突變使其攜帶用于插入高谷氨酰胺的一個(gè)或多個(gè)選擇者密碼子。例如，目的蛋白的編碼核酸可被突變使其攜帶一個(gè)或多個(gè)選擇者密碼子，因而可以插入一個(gè)或多個(gè)高谷氨酰胺。本發(fā)明包括任何蛋白的這種突變版本，比如至少含有一個(gè)高谷氨酰胺。同樣，本發(fā)明還包括相應(yīng)的核酸，即含有一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)高谷氨酰胺的選擇者密碼子的任何核酸。
為了使蛋白包含高谷氨酰胺，需要使用適于通過正交tRNA/RS對(duì)在體內(nèi)插入高谷氨酰胺的宿主細(xì)胞和有機(jī)體。宿主細(xì)胞用一種或多種載體進(jìn)行遺傳改造(如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，這些載體表達(dá)正交tRNA、正交tRNA合成酶和編碼衍生蛋白的載體。這些組分可以位于同一個(gè)載體上，或者位于不同的載體上，或者兩個(gè)組分位于一個(gè)載體上而第三個(gè)組分位于第二個(gè)載體上。載體可以是質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、裸多核苷酸或共軛多核苷酸。
根據(jù)免疫活性定義多肽由于本發(fā)明的多肽提供了多種新的多肽序列(如在本文的翻譯系統(tǒng)中合成的蛋白中含有高谷氨酰胺或者在新型合成酶、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的新型序列存在的情況下合成的蛋白中含有高谷氨酰胺)，因此多肽可能會(huì)提供能被免疫分析方法識(shí)別的新型結(jié)構(gòu)特征。能特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗血清的制備以及能被這些抗血清結(jié)合的多肽也是本發(fā)明的特征。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括而不限于免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽，這些多肽可特異性識(shí)別并結(jié)合分析物(抗原)。例子包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體和單鏈抗體等。免疫球蛋白的片段，其中包括Fab片段和表達(dá)文庫(kù)如噬菌體展示文庫(kù)產(chǎn)生的片段，也包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”之中。見Paul編輯的《基礎(chǔ)免疫性》(Funcamental Immunology)，第四版，1999，Raven Press，NewYork，中關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)和方法學(xué)的描述。
為了制備用于免疫分析中的抗血清，可按照本文所描述的方法制備和純化一種或多種免疫原性多肽。例如，用重組細(xì)胞制備重組蛋白。純系小鼠(用于此分析中，因?yàn)榧兿敌∈缶哂羞z傳相同性，因此得到的結(jié)果重復(fù)性更高)用含標(biāo)準(zhǔn)佐劑如福氏完全佐劑的免疫原性蛋白按照標(biāo)準(zhǔn)的免疫方法免疫(見Harlow和Lane(1988)，《抗體-實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)》(Antibodies，ALaboratory Manual)(冷泉港出版社，紐約)中關(guān)于抗體制備、用于確定特異性免疫反應(yīng)的免疫分析方法和條件的描述)。關(guān)于蛋白、抗體、抗血清等的其他詳細(xì)描述見USSN 60/479,931、60/463,869和60/496,548，題為“擴(kuò)充真核遺傳密碼”(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)；WO 2002/085923，題為“非天然氨基酸的體內(nèi)插入”；專利申請(qǐng)USSN 60/441,450，名稱為“糖蛋白合成”，申請(qǐng)日為2003年1月16日；以及專利申請(qǐng)“蛋白質(zhì)芯片”，代理人備案號(hào)為P1001US00，申請(qǐng)日為2002年12月22日。
O-tRNA和O-RS以及O-tRNA/O-RS對(duì)的應(yīng)用本發(fā)明的組合物以及用本發(fā)明的方法制備的組合物存在于細(xì)胞內(nèi)。因而本發(fā)明的O-tRNA/O-RS對(duì)或其各個(gè)組分可用于宿主系統(tǒng)的翻譯機(jī)器中，結(jié)果導(dǎo)致高谷氨酰胺被插入到蛋白質(zhì)內(nèi)。Schultz等人的專利申請(qǐng)“非天然氨基酸的體內(nèi)插入”(WO2002/085923)描述了這一過程，本文已納入作為參考。例如，當(dāng)O-tRNA/O-RS對(duì)被導(dǎo)入到宿主如大腸桿菌內(nèi)時(shí)，O-tRNA/O-RS對(duì)就可在體內(nèi)將高谷氨酰胺插入到蛋白質(zhì)如肌紅蛋白或治療性蛋白內(nèi)以響應(yīng)選擇者密碼子如琥珀無(wú)義密碼子，其中的高谷氨酰胺可外源性地加入到培養(yǎng)基中。另外，本發(fā)明的組合物既可用于體外翻譯系統(tǒng)中，也可用于體內(nèi)系統(tǒng)中。含高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)可用作治療性蛋白，也可用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、與其他蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移過程等。
試劑盒試劑盒也是本發(fā)明的特征。例如，本發(fā)明提供了用于在細(xì)胞內(nèi)制備至少含一個(gè)高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的試劑盒，其中的試劑盒包括一個(gè)盛有O-tRNA和/或O-tRNA編碼多核苷酸序列、和/或O-RS編碼多核苷酸序列、和/或O-RS的容器。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包括高谷氨酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包括關(guān)于制備蛋白質(zhì)的說明書。本發(fā)明的任何組合物、系統(tǒng)或裝置都可以用適當(dāng)?shù)陌b材料(如容器等)包裝起來(lái)制成試劑盒的形式。
實(shí)施例下面所提供的實(shí)施例是為了說明本發(fā)明，并不意味著對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道在不偏離本發(fā)明權(quán)利要求范圍的情況下可以對(duì)各種非關(guān)鍵性的參數(shù)做出修改。
實(shí)施例1衍生于ARCHAEL tRNALys的正交合成酶/tRNA對(duì)的制備正交合成酶-tRNA對(duì)來(lái)源于超嗜熱古菌的賴氨酰tRNA合成酶。根據(jù)古細(xì)菌tRNALys序列的多序列排列的共有序列得到的琥珀抑制型tRNA可以在β半乳糖苷酶分析試驗(yàn)中產(chǎn)生32％的琥珀抑制效應(yīng)。因此，這個(gè)正交對(duì)是一個(gè)高效的系統(tǒng)，可用于在大腸桿菌內(nèi)將非天然氨基酸插入到蛋白質(zhì)內(nèi)。
將有機(jī)體的遺傳密碼擴(kuò)充到20個(gè)常見氨基酸之外的其他氨基酸最少需要兩個(gè)新基因可選擇性活化非天然氨基酸但是不能將氨基酸轉(zhuǎn)移到內(nèi)源tRNA上的氨酰-tRNA合成酶基因和可接受非天然氨基酸但是不能被內(nèi)源性合成酶加載的同源正交tRNA基因(Furter，(1998)Protein Sci.，7419-426)。另外，還需要tRNA能夠響應(yīng)非編碼密碼子如無(wú)義密碼子或移碼密碼子并轉(zhuǎn)移氨基酸。已經(jīng)鑒定出的詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶和同源琥珀抑制型tRNA對(duì)的變體(Wang等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，1225010-5011；Wang等，(2001)Science，292498-500)符合這些標(biāo)準(zhǔn)，并已被用于在大腸桿菌內(nèi)將各種非天然氨基酸，包括含酮氨基酸(Wang等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，10056-61)和光交聯(lián)氨基酸，高效高保真地插入到蛋白質(zhì)內(nèi)(Chin等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9911020-11024；Chin和Schultz，(2002)Chem Bio Chem，31135-1137)。拓寬能被遺傳密碼編碼的非天然氨基酸的范圍和數(shù)目就有可能使用新的正交合成酶-tRNA對(duì)和編碼它們的新密碼子(Magliery等，(2001)J.Mol.Biol.，307755-769；Anderson等，(2002)Chem.Biol.，9237-244)。
最近誕生了一種新的方法，該方法利用熱自養(yǎng)甲烷球菌亮氨酰-tRNA合成酶和鹽桿菌NRC-1來(lái)源的同源正交琥珀、乳白和四堿基抑制型tRNA構(gòu)建正交對(duì)(Anderson和Schultz，(2003)Biochemistry，42(32)9598-608)。這些根據(jù)多序列排列的古細(xì)菌亮氨酰tRNA的相同序列而設(shè)計(jì)出的抑制型tRNA可提供有效的正交移碼和乳白抑制型tRNA。正常的正交抑制型tRNA含有CU(X)XXXAA反密碼子環(huán)(其中的(X)XXX是密碼子的反向互補(bǔ)序列)，其莖區(qū)無(wú)錯(cuò)配堿基。我們現(xiàn)在描述的是利用“共有序列抑制型”策略進(jìn)行古細(xì)菌tRNALys序列和古細(xì)菌超嗜熱古菌賴氨酰-tRNA合成酶來(lái)源的正交合成酶-tRNA對(duì)的理論設(shè)計(jì)。
這種tRNA/合成酶對(duì)有幾個(gè)誘人的特征可用于構(gòu)建大腸桿菌內(nèi)的正交抑制型對(duì)?？捎糜诖竽c桿菌的正交tRNA不應(yīng)該與大腸桿菌氨酰-tRNA合成酶發(fā)生交叉反應(yīng)。雖然原核生物和古細(xì)菌的tRNALys序列之間具有很高的相似性，但是其73位堿基是一個(gè)鑒別堿基，原核生物的是A，而古細(xì)菌的是G(Ibba等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96418-423)，這點(diǎn)可防止古細(xì)菌的tRNA成為大腸桿菌合成酶的底物。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的總細(xì)胞裂解物確實(shí)不能酰化古細(xì)菌紅皮鹽桿菌(Halobacteriumcutirubrum)的tRNA(Kwok和Wong，(1980)Can.J.Biochem.，58213-218)。為了構(gòu)建抑制型tRNA需要改變反密碼子的序列，但是不能對(duì)其氨?；钚杂懈弊饔谩Ｍㄟ^對(duì)古細(xì)菌超嗜熱古菌的賴氨酰tRNA合成酶(PhKRS)識(shí)別tRNA的研究(Terada等，(2002)Nat.Struct.Biol.，9257-262)發(fā)現(xiàn)反密碼子可以被改變而不降低tRNA的識(shí)別能力。因此，密碼子如琥珀無(wú)義密碼子UAG的抑制型tRNA有可能能夠從這些tRNA構(gòu)建。最后，古細(xì)菌的I型賴氨酰tRNA合成酶PhKRS的晶體結(jié)構(gòu)是已知的(Terada等，(2002)Nat.Struct.Biol.，9257-262)，這有利于氨酰-tRNA合成酶的改造。
為了確定PhKRS是否是大腸桿菌正交的，需要證明合成酶不能有效地加載大腸桿菌tRNA。PhKRS的基因是從基因組DNA中通過PCR擴(kuò)增出來(lái)的，插入到質(zhì)粒pBAD-Myc/HisA(Invitrogen)內(nèi)過量表達(dá)。所得到的PhKRS蛋白加以純化使之成為均一物質(zhì)。用鹽桿菌NRC-1或大腸桿菌來(lái)源的全tRNA進(jìn)行氨?；治鲈囼?yàn)。鹽桿菌NRC-1來(lái)源的tRNA序列和超嗜熱古菌來(lái)源的tRNA序列是高度同源的(圖1)。因此，我們預(yù)測(cè)嗜鹽菌tRNA可以很容易地被PhKRS加載。確實(shí)，在20分鐘內(nèi)，PhKRS加載的嗜鹽菌全tRNA的量比加載的大腸桿菌全tRNA的量高出14倍以上(圖2；10μM[tRNA])。雖然PhKRS也能少量加載大腸桿菌tRNA，但是，在相同濃度的大腸桿菌全tRNA存在的情況下，其加載速率比大腸桿菌合成酶低28倍，只是背景加載速率的7倍。另外，海沼甲烷球菌(M.mariplaudis)來(lái)源的高同源性古細(xì)菌合成酶只能很微弱地補(bǔ)償lysS/lysU雙突變?nèi)毕莸拇竽c桿菌賴氨酰tRNA合成酶(Ibba等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96418-423)。因此，PhKRS在體內(nèi)可能很難與內(nèi)源性的大腸桿菌合成酶競(jìng)爭(zhēng)加載大腸桿菌的tRNA。
為了進(jìn)一步了解PhKRS的正交性，我們?cè)噲D將PhKRS基因插入到組成型表達(dá)載體pKQ內(nèi)。這個(gè)質(zhì)粒含有組成型谷氨酰胺啟動(dòng)子控制下的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和質(zhì)粒pBAD-Myc/HisA(Invitrogen)來(lái)源的rrnB終止子。這個(gè)質(zhì)粒還含有一個(gè)ColE1復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)用于質(zhì)粒篩選的卡那霉素耐藥選擇標(biāo)記。不幸的是，野生型PhKRS基因在以組成型的方式表達(dá)時(shí)是有毒性的。但是，我們偶然發(fā)現(xiàn)E444G突變體(質(zhì)粒pKQ-PhE444G)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)時(shí)其毒性是降低的。E444G突變可導(dǎo)致對(duì)系統(tǒng)的毒性明顯下降的機(jī)制還不清楚，一種可能是突變阻止了大腸桿菌tNRA的低水平種間錯(cuò)誤加載，這種情況在體外可以觀察到。
下一步就是構(gòu)建能被PhKRS加載的無(wú)義抑制型tRNA。PhKRS的反密碼子結(jié)合決定簇是較弱的，這說明這個(gè)酶應(yīng)該可以接受含有不同反密碼子序列的tRNA(Terada等，(2002)Nat.Struct.Biol.，9257-262)。由于琥珀型抑制研究得的最透，也是大腸桿菌內(nèi)最有效的抑制形式(Anderson等，(2002)Chem.Biol.，9237-244)，因此，我們利用共有序列來(lái)構(gòu)建正交的古細(xì)菌琥珀抑制型tRNA-AKCUA(Anderson和Schultz，(2003)Biochemistry，42(32)9598-608)。利用GCG程序pileup將現(xiàn)有基因組序列中所有的古細(xì)菌tRNALys序列進(jìn)行多序列排列(圖1)。找出排列在一起的tRNA的共有序列，繪出典型的三葉草型結(jié)構(gòu)(圖3)。然后檢查這個(gè)序列，尋找莖區(qū)內(nèi)的非經(jīng)典堿基配對(duì)或錯(cuò)配堿基對(duì)，這些堿基對(duì)會(huì)降低抑制效率(Hou等，(1992)Biochemistry，314157-4160)。tRNALys的共有序列內(nèi)沒有這樣的錯(cuò)配堿基對(duì)。然后將反密碼子環(huán)改變成CUCUAAA，因?yàn)檫@個(gè)序列可產(chǎn)生最佳的琥珀型抑制效果(Yarus等，(1986)J.Mol.Biol.，192235-255)。通過合成的寡核苷酸(Genosys)的重疊延伸構(gòu)建出這個(gè)tRNA序列，然后插入到質(zhì)粒pACGFP的EcoRI和PstI限制性酶切位點(diǎn)之間(Magliery等，(2001)J.Mol.Biol.，307755-769)，置于組成型lpp強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下。所得到的質(zhì)粒pAC-AKCUA還包含p15A復(fù)制起點(diǎn)和氯霉素耐藥選擇標(biāo)記。
為了檢驗(yàn)這個(gè)正交合成酶-tRNA對(duì)的抑制效率，用pKQ-PhE444G、pAC-AKCUA和lacZ報(bào)告質(zhì)粒pLASC-lacZ(TAG)共同轉(zhuǎn)化GeneHogs大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)(Anderson和Schultz，(2003)Biochemistry，42(32)9598-608)。來(lái)源于pSC101的這個(gè)質(zhì)粒含有氨芐青霉素耐藥選擇標(biāo)記和處于lpp啟動(dòng)子控制之下的編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因。在lacZ基因的允許位25位殘基上有一個(gè)琥珀型密碼子，這個(gè)密碼子可導(dǎo)致翻譯的提前終止。在無(wú)琥珀抑制型tRNA存在的情況下，含pLASC-lacZ(TAG)的細(xì)胞所觀察到的β半乳糖苷酶活性只有含質(zhì)粒pLASC-lacZ(Lys)的細(xì)胞所具有活性的0.17％(質(zhì)粒pLASC-lacZ(Lys)在25位上含有一個(gè)AAA(賴氨酸)有義密碼子)，比不含質(zhì)粒的細(xì)胞所具有的活性也只高2倍。如果AKCUA不能被內(nèi)源性的大腸桿菌合成酶加載，當(dāng)tRNA與pLASC-lacZ(TAG)共表達(dá)時(shí)不應(yīng)該產(chǎn)生琥珀型抑制。含pAC-AKCUA和pLASC-lacZ(TAG)的細(xì)胞只有1.7％的抑制效率(相對(duì)于lacZ(lys)表達(dá)時(shí))。如果PhKRS能夠加載正交tRNA，那么當(dāng)質(zhì)粒pKQ-PhE444G被導(dǎo)入到系統(tǒng)內(nèi)時(shí)應(yīng)該可以觀察到更高水平的抑制。確實(shí)，所觀察到的抑制水平達(dá)32％。與此相對(duì)應(yīng)的是，上面所描述的大腸桿菌正交的詹氏甲烷球菌來(lái)源的酪氨酸合成酶-tRNA對(duì)在同源合成酶存在的情況下展示出18.5％的抑制效率，如果沒有同源合成酶則抑制效率只有0.2％。在同源合成酶存在和不存在的情況下，熱自養(yǎng)甲烷球菌(M.thermoautotrophicum)來(lái)源的亮氨酸琥珀型正交對(duì)的抑制效率分別為33.2％和1.5％(Anderson和Schultz，(2003)Biochemistry，42(32)9598-608)。
在這個(gè)實(shí)施例中，我們鑒定出了I型賴氨酰-tRNA合成酶，并且通過古細(xì)菌tRNALys序列的多序列排列設(shè)計(jì)出了一種琥珀抑制型tRNA，二者一起組成正交合成酶-tRNA對(duì)，可用于非天然氨基酸在大腸桿菌內(nèi)的位點(diǎn)特異性插入。PhKRS/AKCUA所具有的高效率(32％的抑制效率)證明了共有序列策略可有效地用于正交抑制型tRNA的構(gòu)建。
實(shí)施例2利用非天然氨基酸進(jìn)行移碼校正抑制可消除PHKRS的毒性超嗜熱古菌的I型賴氨酰tRNA合成酶來(lái)源的正交tRNA-合成酶對(duì)已被用于大腸桿菌中。該系統(tǒng)的tRNA部分可以很好地行使正交琥珀酰抑制子的功能。合成酶表達(dá)質(zhì)粒pKQ-PhE444G能夠加載這種tRNA，但是依然可以觀察到毒性效應(yīng)。當(dāng)其單獨(dú)表達(dá)時(shí)，含pKQ-PhE444G的細(xì)胞的生長(zhǎng)密度只有不含質(zhì)粒的細(xì)胞的56％。報(bào)告質(zhì)粒pAC-AKCUA和pAC-AKCUA也有中等程度的毒性，其生長(zhǎng)密度分別是不含質(zhì)粒的細(xì)胞的72％和52％。當(dāng)pKQ-PhE444G與質(zhì)粒pAC-AKCUA共同轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的密度下降到17％。另外，當(dāng)與β半乳糖苷酶報(bào)告質(zhì)粒pAC-AKCUA(質(zhì)粒pACKO-A184TAG的衍生物)共表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的密度只有5％。這清楚地表明tRNA和合成酶在這個(gè)系統(tǒng)內(nèi)都有毒性效應(yīng)。另外，用兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)可能具有協(xié)同效應(yīng)，使細(xì)胞的存活能力大大降低。為了解決這一問題，我們需要找到PhKRS的低毒性突變體。
我們猜測(cè)在PhKRS上進(jìn)行點(diǎn)突變或其他類型的突變可能能夠降低合成酶的毒性同時(shí)又保留其加載活性。因此，我們將pKQ-PhE444G轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)XL1-red細(xì)胞(Stratagene)內(nèi)，然后將細(xì)胞接種到含25μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上。這個(gè)細(xì)胞株含有幾個(gè)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化質(zhì)粒發(fā)生高頻率突變的基因組突變。從培養(yǎng)板上挑出約100個(gè)克隆，然后在含卡那霉素的25ml液體LB培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)增。預(yù)計(jì)pKQ-PhE444G的非毒性突變株的生長(zhǎng)速度要快于野生型的細(xì)胞株，通過細(xì)胞的系列培養(yǎng)可導(dǎo)致這些突變株的累積。經(jīng)過2個(gè)系列培養(yǎng)，每一步稀釋10000倍，吸出少量細(xì)胞導(dǎo)入到含質(zhì)粒pAC-AKCUA的Genehog細(xì)胞中，然后接種到含25μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素、以及各種濃度的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上。90％以上的轉(zhuǎn)化細(xì)胞無(wú)明顯的毒性，可以在含1000μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。甚至在含1500μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)板上也看到了較小的克隆，說明產(chǎn)生了有效的琥珀型抑制。分離出一個(gè)突變的合成酶，命名為pKQ-PhKep，通過限制性酶切圖譜和PhKRS開放閱讀框架測(cè)序的方法確定其特征。突變的基因含有一個(gè)778bp的插入片段，位于殘基S357之后，但是其他的序列都與質(zhì)粒pKQ-PhE444G相同。通過BLAST檢索發(fā)現(xiàn)這個(gè)插入片段與質(zhì)粒p1658/97上被稱為“insAcp1”的序列同源，但是在這篇文獻(xiàn)中再也沒有提到這個(gè)序列，因此也無(wú)法知道這個(gè)序列的來(lái)源。當(dāng)PhKRS從起始密碼子開始翻譯時(shí)，這個(gè)基因的預(yù)測(cè)產(chǎn)物在S357的下游被截掉6個(gè)氨基酸。為了確定PhKRS的這種截?cái)嗍欠窬褪嵌拘韵陆档脑?，合成了一個(gè)序列為5′-CAGTGGAATTCAGTAAGTTGGCAGCATCAC-3′的引物CA510R，用它在質(zhì)粒pKQ上構(gòu)建截?cái)嗤蛔凅w。利用引物CA279和CA510R通過PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pKQ-PhKep，擴(kuò)增的產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒pKQ的NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間。所得到的質(zhì)粒pKQ-PhΔAD(也被稱為pKQ-Ph510)與質(zhì)粒pAC-AKCUA共轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示得到的轉(zhuǎn)化子與pKQ-PhKep轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有相同的IC50，沒有明顯的毒性。
在殘基357后的截?cái)嗪孟窨梢詣h除PhKRS的反密碼子結(jié)合區(qū)，我們想要了解這種刪除對(duì)合成酶的tRNA識(shí)別特性會(huì)產(chǎn)生何種影響。因此，我們?cè)隗w外過量表達(dá)合成酶并且進(jìn)行氨酰化分析。用引物CA279和CA511(5′-CATTGGAATTCGAGTAAGTTGGCAGCATCAC-3′)通過PCR從pKQ-PhKep上擴(kuò)增這個(gè)基因，然后亞克隆到pBAD-Myc/HisA的NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間，使其與C末端Myc/His標(biāo)記處于同一個(gè)閱讀框架內(nèi)。利用Ni-NTA層析技術(shù)純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3用四堿基密碼子和非天然氨基酸擴(kuò)充遺傳密碼雖然除了幾個(gè)例子之外幾乎所有已知有機(jī)體的遺傳密碼都編碼相同的20個(gè)氨基酸，但是需要加到新構(gòu)筑模塊內(nèi)的所有組分就是獨(dú)特的tRNA/氨酰-tRNA合成酶對(duì)、氨基酸原料和氨基酸特異性的獨(dú)特密碼子(Wang等，(2001)Expanding the genetic code.Science 292498-500)。以前的研究已經(jīng)表明琥珀型無(wú)義密碼子TAG和正交詹氏甲烷球菌及大腸桿菌tRNA/合成酶對(duì)一起可被用于在大腸桿菌(Wang等，(2003)Additionof the keto functionnal group to the genetic code of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10056-61；Santoro等，(2002)An efficient system for the evolution ofaminoacyl-tRNAsynthetase specificity.Nat.Biotechnol.201044-8；Chin等，(2002)Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9911020-11024；Mehl等(2003)Generation of a bacterium witha 21 amino acid genetic code.J.Am.Chem.Soc.125935-9)和酵母(Chin等(2003)Anexpand edeukaryotic genetic code.Science301964-7)內(nèi)制備各種具有新特性的氨基酸。然而，有限數(shù)目的非編碼三聯(lián)密碼子大大限制了有機(jī)體編碼的氨基酸的最終數(shù)目。我們?cè)诒景l(fā)明中描述了利用古細(xì)菌tRNALys序列制備新型正交合成酶/tRNA對(duì)的方法，這種正交對(duì)可響應(yīng)四堿基密碼子AGGA而將氨基酸高谷氨酰胺(hGln)有效而特異地插入到肌紅蛋白內(nèi)。HGln所產(chǎn)生的移碼校正抑制不會(huì)明顯影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)率或細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，與TAG的抑制作用互相正交。這個(gè)研究結(jié)果表明可用三聯(lián)密碼子的數(shù)目和翻譯系統(tǒng)本身都不再成為進(jìn)一步擴(kuò)充遺傳密碼的重要障礙。
有許多天然的+1移碼校正抑制子，其中包括Su7編碼谷氨酰胺UAGN(N＝A、G、C或T)抑制子(Curran和Yarus(1987)Reading frame selection and transfer RNAanticodon loop stacking.Science2381545-50)、編碼蘇氨酸的sufJ來(lái)源的ACCN抑制型密碼子(Bossi和Roth(1981)Four-base codons ACCA，ACCU and ACCC arerecognized by frameshift suppressor sufJ.Cell25489-96)和tRNALys和tRNAGln來(lái)源的CAAA抑制子(O′Connor(2002)Insertions in the anticodon loop of tRNA(l)(Gln)(sufG)and tRNA(Lys)promote quadruplet decoding of CAAA.Nucleic Acids Res.301985-1990)。另外，遺傳篩選已被用于從突變tRNA大文庫(kù)中鑒定有效的四堿基和五堿基抑制型tRNA，其中包括大腸桿菌tRNAUCCUSer抑制子(Magliery等，(2001)Expanding thegenetic codeselection of efficient suppressors of four-base codons and identification of″shifty″four-base codons with a library approach in Escherichia coli.J.Mol.Biol.307755-769；Anderson等，(2002)Exploring the limits of codon and anticodon size.Chem.Biol.9237-244；Hohsaka等，(1999)Incorporation of two nonnatural amino acids intoproteins through extension of the genetic code.Nucleic Acids Symp.Ser.4279-80；Hohsaka等，(2001)Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids intoproteins.Nucleic Acids Res.293646-51；Hohsaka和Sisido(2002)Icorporation ofnon-natural amino acids intoproteins.Curr.Opin.Chem.Biol.6809-15)。
為了在體內(nèi)用四聯(lián)密碼子編碼非天然氨基酸，我們必需制備出一種能特異性識(shí)別這種密碼子的tRNA和一種只能用目的非天然氨基酸特異性地氨酰化這種tRNA的相應(yīng)合成酶。由于以前所制備的正交詹氏甲烷球菌琥珀抑制型tRNA的反密碼子環(huán)是同源合成酶JYRS的關(guān)鍵識(shí)別元件，因此要改造這個(gè)tRNA使其解碼四堿基密碼子是很困難的。雖然也有可能降低JYRS的反密碼子結(jié)合特異性，但是要構(gòu)建出用一個(gè)反密碼子序列就可以區(qū)別琥珀型抑制子和四堿基抑制子的互相正交的對(duì)可能是很困難的。因此，最可能的情況是一個(gè)系統(tǒng)利用兩個(gè)不同來(lái)源的正交對(duì)將兩個(gè)不同的非天然氨基酸同時(shí)插入到多肽內(nèi)，這樣就需要設(shè)計(jì)出另一個(gè)新的正交tRNA-合成酶對(duì)。
我們一開始將目光集中在古細(xì)菌超嗜熱古菌(PhKRS)的賴氨酰合成酶/tRNA對(duì)上，將其作為候選的正交對(duì)，因?yàn)?)這個(gè)對(duì)可能是正交的，因?yàn)樗谠松镏械谋Ｊ貕A基是A73，在古細(xì)菌中的保守堿基是G73(Ibba等(1999)Substrate recognition byclass I lysyl-tRNA synthetasea molecular basis for gene displacement.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96418-423)，2)PhKRS允許tRNA反密碼子環(huán)上發(fā)生堿基替代以便于加載抑制型tRNA(Terada等(2002)Functional convergence of two lysyl-tRNA synthetase withunrelated topologie.Nat.Struct.Biol.9257-262)，以及3)PhKRS的晶體結(jié)構(gòu)是已知的(Terada等(2002)Functional convergence of two lysyl-tRNA synthetase with unrelatedtopologie.Nat.Struct.Biol.9257-262)，這樣有利于改變其氨基酸特異性。但不幸的是，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)PhKRS進(jìn)行組成型表達(dá)時(shí)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞是有毒性的。但是，在突變型XL-1-red內(nèi)經(jīng)過系列培養(yǎng)以后可分離出一個(gè)非毒性的突變株P(guān)hΔAD，該突變株因?yàn)椴迦肓艘粋€(gè)被稱為insAcp1的778bp的元件，使其在殘基S357的下游被截?cái)嗔?個(gè)氨基酸。因此，其反密碼子環(huán)結(jié)合區(qū)被刪除，使因反密碼子環(huán)替代而導(dǎo)致的活性丟失的可能性進(jìn)一步降低。
如實(shí)施例1所詳細(xì)描述的，為了確定這個(gè)截?cái)嗤蛔凅w在大腸桿菌內(nèi)是否有功能、是否是正交的，需要證明這個(gè)合成酶不能加載大腸桿菌的tRNA，但是要保留加載同源古細(xì)菌tRNA的活性?？寺hΔAD和EcKRS的基因并使其過量表達(dá)，純化所得到的蛋白使其成為均一的物質(zhì)。用古細(xì)菌鹽桿菌NRC-1或大腸桿菌來(lái)源的全tRNA進(jìn)行氨酰化分析試驗(yàn)。在20分鐘內(nèi)，PhΔAD加載的嗜鹽菌全tRNA的量比加載的大腸桿菌全tRNA的量要多很多(圖2；10μM[tRNA])。雖然PhΔAD也能少量加載大腸桿菌tRNA，但是，在相同濃度的大腸桿菌全tRNA存在的情況下，其加載速率比大腸桿菌合成酶低28倍，只是背景加載速率的7倍。另外，PhΔAD不能彌補(bǔ)PALΔSΔUTR(pMAKlysU)株在43℃下的生長(zhǎng)(Chen等，(1994)Properties of the lysyl-tRNA synthetase gene andproduct from the extreme thermophile Thermus thermophilus.J.Bacteriol.1762699-705)，這是一個(gè)大腸桿菌賴氨酰tRNA合成酶發(fā)生lysS/lysU雙缺陷的突變株。但是，EcKRS(克隆自大腸桿菌HB101株的lysU位點(diǎn))可使其正常生長(zhǎng)。因此，PhΔAD不能替代PhKRS，在體內(nèi)可能很難與內(nèi)源性的大腸桿菌合成酶競(jìng)爭(zhēng)加載大腸桿菌的tRNA。
為了證明PhΔAD在大腸桿菌內(nèi)是有功能的，我們利用正交琥珀抑制型tRNA進(jìn)行β半乳糖苷酶抑制試驗(yàn)來(lái)分析PhΔAD。這種方法還可以使我們利用以前設(shè)計(jì)的詹氏甲烷球菌正交對(duì)篩選試驗(yàn)方案。抑制型tRNACUA(AKCUA)是利用最近描述的共有序列抑制策略(Anderson和Schultz，P.G.(2003)Adaptation of an Orthogonal ArchaealLeucyl-tRNA and Synthetase Pair for Four-base，Amber，and Opal Suppression.Biochemistry429598-608)設(shè)計(jì)出來(lái)的。從現(xiàn)有的基因組序列中挑出所有的古細(xì)菌tRNALys序列進(jìn)行多序列排列，確定其共有序列。將反密碼子環(huán)序列改變成CUCUAAA從而形成一個(gè)琥珀抑制型tRNA(圖1)。合成AKCUA的基因，并將其插入質(zhì)粒pACKO-A 184TAG(Anderson和Schultz，P.G.(2003)Adaptation of an OrthogonalArchaeal Leucyl-tRNA and Synthetase Pair for Four-base，Amber，and Opal Suppression.Biochemistry429598-608)以確定其琥珀型抑制效率。這個(gè)質(zhì)粒含有β半乳糖苷酶的基因(bla)，該基因的允許位A184上是一個(gè)TAG密碼子。當(dāng)沒有tRNA時(shí)，檢測(cè)不到全長(zhǎng)β半乳糖苷酶的表達(dá)，對(duì)5μg/ml的氨芐青霉素敏感。當(dāng)AKCUA表達(dá)時(shí)，對(duì)氨芐青霉素的耐藥性沒有升高，說明tRNA沒有被大腸桿菌的合成酶加載。當(dāng)與PhΔAD共表達(dá)時(shí)，正交tRNA被加載，產(chǎn)生有效的琥珀型抑制，對(duì)氨芐青霉素的耐藥性升高到1000μg/ml。這些結(jié)果表明PhΔAD/AKCUA正交對(duì)是有效的正交琥珀型抑制系統(tǒng)。
以前的研究結(jié)果表明四堿基密碼子可被大腸桿菌的tRNAUCCUSer有效抑制。在這種情況下，四堿基密碼子的抑制可與稀有密碼子AGG競(jìng)爭(zhēng)，從而使抑制型tRNA的毒性消失。AGGA抑制型tRNA來(lái)源于AKCUA，是將其反密碼子環(huán)改變成CUUCCUAA，將AGGA抑制型tRNA插入到質(zhì)粒pACKO-A184AGGA中。與pACKO-A184TAG一樣，這個(gè)質(zhì)粒在A184位點(diǎn)上也含有AGGA密碼子，該密碼子可導(dǎo)致翻譯流產(chǎn)，對(duì)氨芐青霉素的耐藥性只有5μg/ml。不幸的是，這個(gè)tRNA不再與大腸桿菌的合成酶正交。含有這種tRNA的細(xì)胞無(wú)論是否存在PhΔAD都可以在200μg/ml的氨芐青霉素中存活。
為了鑒定正交變體，我們構(gòu)建了一個(gè)tRNA文庫(kù)，其中位于1-4位和69-72位的tRNA受體臂的最后四個(gè)堿基對(duì)都是隨機(jī)分布的(Anderson和Schultz，P.G.(2003)Adaptation of an Orthogonal Archaeal Leucyl-tRNA and Synthetase Pair for Four-base，Amber，and Opal Suppression.Biochemistry429598-608)。這些tRNA與PhΔAD共表達(dá)，細(xì)胞經(jīng)兩輪200μg/ml的氨芐青霉素篩選后得到一組有活性的AGGA抑制型tRNA。為了鑒定正交的變體，分離tRNA質(zhì)粒，挑出384個(gè)在不存在PhΔAD時(shí)對(duì)氨芐青霉素敏感的克隆。這些克隆中，活性最高的正交克隆在有PhΔAD時(shí)對(duì)氨芐青霉素的耐藥性達(dá)到700μg/ml，而在沒有PhΔAD時(shí)對(duì)氨芐青霉素的耐藥性只有5μg/ml。這個(gè)tRNA，AKUCCU，包含多個(gè)受體臂上的堿基替代，其中一個(gè)偶然發(fā)現(xiàn)的A37C突變的重要性是未知的(圖5)。
為了插入能響應(yīng)AGGA的高谷氨酰胺，下一步要做的是改變PhΔAD的特異性。選擇高谷氨酰胺作為起始靶位來(lái)確定突變的合成酶的保真度，因?yàn)樗c賴氨酸的大小一樣，既有氫鍵提供特性，也有氫鍵接受特性。經(jīng)過對(duì)PhKRS晶體結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)只有兩個(gè)殘基E41和Y268可以特異性地識(shí)別賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)。在構(gòu)建PhΔAD的小活性位點(diǎn)文庫(kù)時(shí)通過飽和突變使這兩個(gè)殘基隨機(jī)分布。為了篩選出hGln特異性的合成酶，我們使用了一個(gè)GFP報(bào)告質(zhì)粒pREP2-AKCUA(Santoro等，(2002)Anefficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity.Nat.Biotechnol.201044-8)，這個(gè)質(zhì)粒編碼AKCUA的基因、在M1和Q107位置含有兩個(gè)TAG密碼子的T7RNA聚合酶基因和位于T7啟動(dòng)子之下的GFPuv。當(dāng)pREP2-AKCUA和PhΔAD共同轉(zhuǎn)化時(shí)，T7RNAP上的琥珀型密碼子被抑制，導(dǎo)致GFPuv的表達(dá)，產(chǎn)生綠色熒光。在沒有合成酶時(shí)，細(xì)胞是白色的。因此，通過觀察是否能發(fā)熒光就可以鑒定出含活性合成酶的細(xì)胞。細(xì)胞用pREP2-AKCUA共轉(zhuǎn)化，然后在含hGln的培養(yǎng)板上培養(yǎng)文庫(kù)。分離出每一個(gè)綠色克隆，然后用含和不含非天然氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑出那些需要hGln才能發(fā)熒光的克隆。在挑出的15個(gè)克隆中，有5個(gè)能在含hGln的培養(yǎng)板上產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。在這些克隆中，除了一個(gè)之外其他都含有保守的Y268S替代；這些合成酶中特異性最高的合成酶hGlnRS具有I41和S268突變，對(duì)其做進(jìn)一步鑒定。與PhΔAD相比，5個(gè)克隆相應(yīng)的5個(gè)突變體具有如下的序列變化克隆 Y268(密碼子)E41(密碼子)
2號(hào)克隆Ser(TCT)Val(GTT)3號(hào)克隆Ser(TCG)Thr(ACG)4號(hào)克隆Ser(AGT)Ser(AGT)5號(hào)克隆Ser(TCG)Ile(ATT)6號(hào)克隆Gly(GGT)Pro(CCG)含有Gly24→AGGA突變的肌紅蛋白用正交hGlnRS/AKTCCT對(duì)表達(dá)以確定所觀察到的hGln依賴性表型是否是因?yàn)榉翘烊话被岬奶禺愋圆迦?。在hGlnRS不存在的情況下，突變的肌紅蛋白基因表達(dá)時(shí)，檢測(cè)不到蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。而與hGlnRS共表達(dá)時(shí)，可以分離出1.8mg/ml肌紅蛋白。與此相比，含野生型肌紅蛋白基因的質(zhì)粒pBAD-JYAMB表達(dá)時(shí)所產(chǎn)生的肌紅蛋白的量為3.8mg/ml。對(duì)純化蛋白的胰酶水解片段進(jìn)行基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽的分子量為1676.85Da，與預(yù)測(cè)的1676.88Da一致。沒有檢測(cè)到在24位上含賴氨酸或谷氨酰胺的多肽。另外，我們觀察到在為響應(yīng)AGGA而將hGln插入期間，幾乎沒有毒性。在無(wú)阿拉伯糖誘導(dǎo)的肌紅蛋白表達(dá)所使用的培養(yǎng)條件下，GeneHogs細(xì)胞在指數(shù)生長(zhǎng)期間的倍增時(shí)間是含hGln的細(xì)胞的兩倍。無(wú)論是否存在hGln都可以觀察到生長(zhǎng)速率的下降，這說明所產(chǎn)生的輕微毒性是合成酶和tRNA表達(dá)的結(jié)果，而不是AGGA抑制的結(jié)果。因此，AGGA抑制子和稀有AGG密碼子之間的交叉反應(yīng)并不會(huì)限制移碼抑制的實(shí)際使用。
圖7A說明了通過AGGA抑制而插入hGln殘基時(shí)肌紅蛋白的表達(dá)情況。這個(gè)圖是一個(gè)蛋白印跡雜交圖，所用探針為抗His C末端抗體。只有在AK514tRNA、hGlnRS(PhKRSΔ的一種hGln特異性變體)和hGln(2-5道)這三個(gè)組分都存在的情況下在G24位上含AGGA密碼子的肌紅蛋白基因(Myo24AGGA)才能表達(dá)出蛋白。只有在JYRS及其同源琥珀型tRNA存在的情況下在75位上為琥珀型抑制的肌紅蛋白(Myo75TAG)才有可能表達(dá)，這說明賴氨酰和酪氨酰對(duì)(6-9道)是互相正交的。
我們還觀察了使用PhΔAD/AKUCCU對(duì)和詹氏甲烷球菌酪氨酸合成酶JYRS在一條多肽鏈上同時(shí)進(jìn)行TAG和AGGA抑制的可能性。當(dāng)與質(zhì)粒pBK-JYRS上的JYRS共表達(dá)時(shí)，pMyo-AKUCCU不能表達(dá)肌紅蛋白。因此說明JYRS不能加載AKUCCU。反過來(lái)，我們通過用PhΔAD加載使質(zhì)粒pBAD/JYAMB-4TAG表達(dá)肌紅蛋白。這個(gè)表達(dá)質(zhì)粒包含4位為TAG密碼子的肌紅蛋白基因和正交tRNATyr，J17(Mehl等(2003)Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code.J.Am.Chem.Soc.125935-9)。與JYRS共表達(dá)時(shí)可產(chǎn)生3.8mg/ml的肌紅蛋白，但是用PhΔAD時(shí)沒有蛋白產(chǎn)生。這說明PhΔAD不能加載J17。因此，這些合成酶/tRNA對(duì)是互相正交的，能夠聯(lián)合使用而沒有交叉反應(yīng)。
為了在肌紅蛋白中插入兩個(gè)非天然氨基酸，將AKUCCU和J17一起插入到一個(gè)質(zhì)粒中，這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)含Gly24→AGGA和Ala75→TAG突變的肌紅蛋白。將JYRS來(lái)源的一個(gè)O-甲基-L-酪氨酸-特異性合成酶(OMeYRS)(Chin等，(2002)Addition of aphotocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9911020-11024)和hGlnRS共同插入到第二個(gè)質(zhì)粒內(nèi)。當(dāng)用這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含兩種氨基酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，可產(chǎn)生1.7mg/L肌紅蛋白。但是如果排除一個(gè)非天然氨基酸或一個(gè)合成酶，則沒有蛋白產(chǎn)生。
圖7B描述的是利用兩個(gè)正交tRNA系統(tǒng)同時(shí)插入兩個(gè)不同的非天然氨基酸的肌紅蛋白模型系統(tǒng)。這個(gè)圖是一個(gè)蛋白印跡圖，所用探針為抗His C末端抗體。在賴氨酰和酪氨酰正交對(duì)都存在的情況下，24位上含AGGA密碼子和75位上含TAG密碼子的肌紅蛋白基因(Myo24AGGA/75TAG)可表達(dá)出蛋白質(zhì)。利用hGlnRS和OmeTyrRS，24位上的AGGA抑制密碼子和75位上的琥珀抑制型密碼子分別將hGln和O-甲基-酪氨酸(OmeTyr)插入到一條多肽鏈上。如圖所示，只有在兩種非天然氨基酸、賴氨酰正交系統(tǒng)和酪氨酰正交系統(tǒng)都存在的條件下才能制備出蛋白來(lái)。
圖7A和7B的蛋白印跡結(jié)果被圖8和圖9的分析結(jié)果進(jìn)一步確證。圖8顯示的是如圖7A所示的野生型肌紅蛋白(MyoWT；據(jù)推測(cè)在24位上為賴氨酸)和突變的肌紅蛋白(24AGGA；據(jù)推測(cè)可能含有hGln)的胰酶水解片段的基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時(shí)間分析結(jié)果。通過對(duì)純化蛋白的胰酶水解肽片段的分析發(fā)現(xiàn)多肽的分子量為1,676.85Da，與預(yù)測(cè)的分子量1676.88Da一致。沒有觀察到在24位上為賴氨酸(用PhKRSΔ表達(dá)的蛋白質(zhì)的胰酶裂解肽的分子量為950.46Da，計(jì)算出的分子量為950.53Da，全長(zhǎng)肽的分子量為1,661.91Da)或谷氨酰胺(計(jì)算出的分子量為1661.87Da)的多肽。
圖9顯示的是全長(zhǎng)雙突變蛋白(如圖7B所示)的電噴霧質(zhì)譜(MS)分析結(jié)果。MS結(jié)果表明含兩個(gè)非天然氨基酸的肌紅蛋白的分子量為18,546.40Da(SD 0.11)，與預(yù)測(cè)的分子量18,546.60(SD 0.81)一致，含G24K和A75Y替代的肌紅蛋白的理論分子量為18,518.3Da。
總之，我們的試驗(yàn)結(jié)果證明了利用移碼抑制可在體內(nèi)進(jìn)行非天然氨基酸的位點(diǎn)特異性插入。另外，我們的試驗(yàn)結(jié)果還表明這個(gè)超嗜熱古菌(P.horikoshii)來(lái)源的tRNA合成酶和詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶來(lái)源的正交對(duì)是互相正交的，我們能夠在一條多肽鏈上同時(shí)插入兩個(gè)非天然氨基酸。篩選出能將互相正交的活性氨基酸甚至是熒光氨基酸插入的合成酶變體應(yīng)該也是可能的。利用這種材料就有可能將熒光對(duì)插入到多肽中用于在體內(nèi)進(jìn)行FRET研究。同樣，通過插入氨基酸之外的基序如α羥酸來(lái)制備非天然多聚物的核糖體產(chǎn)物也是可能的。其他的密碼子如CCCU或CUAG也可以被使用，這些密碼子在大腸桿菌內(nèi)都是被抑制的。另外，利用有限的密碼子的簡(jiǎn)并性來(lái)從新合成大腸桿菌的基因組，從而可以使可用的密碼子達(dá)到43個(gè)。
材料和方法合成酶基因的克隆和表達(dá)制備從美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心獲得的超嗜熱古菌(ATCC；#700860)的基因組DNA。通過PCR擴(kuò)增PhKRS，然后插入到質(zhì)粒pBAD/Myc-HisA(Invitrogen)的NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間，用于過量表達(dá)PhKRS。為了使其進(jìn)行組成型表達(dá)，將這個(gè)合成酶基因克隆到pGLN和pKQ內(nèi)(Anderson和Schultz，(2003)Adaptation of an Orthogonal Archaeal Leucyl-tRNA and Synthetase Pairfor Four-base，Amber，and Opal Suppression.Biochemistry429598-608)，處于谷氨酰胺啟動(dòng)子的控制之下。這些質(zhì)粒來(lái)源于pBAD/Myc-HisA，分別具有氨芐青霉素和卡那霉素抗性。同樣，從大腸桿菌HB101株的lysU位點(diǎn)中克隆出EcKRS。按照QiagenQIA表達(dá)試劑盒所描述的方法在SYT培養(yǎng)基中過量表達(dá)蛋白，然后用100mMTris-HCl，pH7.5；100mM NaCl和10％甘油透析。
體外氨酰化分析大腸桿菌全tRNA購(gòu)自Roche，嗜鹽菌tRNA用RNA/DNA提取試劑盒(Qiagen)從鹽桿菌NRC-1(ATCC；#700922)培養(yǎng)物中提取。反應(yīng)總體系為20μl，其中含有50mM Tris-HCl，pH7.5；30mM KCl；20mM MgCl2；3mM谷胱甘肽；0.1mg/mL BSA；10mMATP；1μM[3H]賴氨酸(Amersham)；750nM合成酶和0、2、10或40μM全tRNA，37℃反應(yīng)20分鐘。
補(bǔ)償分析PALΔSΔUTR(pMAKlysU)細(xì)胞用pGLN衍生物轉(zhuǎn)化以表達(dá)PhΔAD、EcKRS、或不表達(dá)合成酶，在30℃、含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞。在不含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板或液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行合成酶缺失生長(zhǎng)缺陷突變株P(guān)ALASAUTR的補(bǔ)償分析，試驗(yàn)溫度為43℃。GeneHogs的生長(zhǎng)狀況以為陽(yáng)性對(duì)照以消除合成酶表達(dá)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)的可能性。對(duì)于液體培養(yǎng)基來(lái)說，飽和培養(yǎng)物用新鮮培養(yǎng)基稀釋1000倍，在600nm處監(jiān)測(cè)其8小時(shí)的生長(zhǎng)情況。
文庫(kù)構(gòu)建通過合成寡核苷酸(Genosys)的重疊延伸構(gòu)建tRNA的基因，亞克隆到pACKO-A184TAG或pACKO-A184AGGA的EcoRI和PstI位點(diǎn)之間。這些pACYC184來(lái)源的報(bào)告質(zhì)粒含有p15A復(fù)制起點(diǎn)、氯霉素耐藥基因和一個(gè)強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子來(lái)控制tRNA基因的表達(dá)。PhΔAD來(lái)源的文庫(kù)用質(zhì)粒pKQ通過EIPCR構(gòu)建(Stemmer和Morris，S.K.(1992)Enzymatic inverse PCRa restriction site independent，single-fragment method for high-efficiency，site-directed mutagenesis.Biotechniques13214-20)。在寡核苷酸合成過程中用預(yù)先混合的亞磷酸胺來(lái)構(gòu)建文庫(kù)。文庫(kù)的差異度比理論差異度高900倍，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)沒有序列偏向性。
抑制效率的確定通過在添加25μg/ml卡那霉素和氯霉素以及從5到1000μg/ml之間不同濃度的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)接種來(lái)確定抑制效率。抑制效率定義為細(xì)胞能存活并形成克隆的一系列培養(yǎng)板中的最高濃度，其次高或次低的濃度應(yīng)該在該值的20％以內(nèi)。
含hGln的肌紅蛋白的表達(dá)和特性鑒定為了進(jìn)行單位點(diǎn)插入試驗(yàn)，構(gòu)建含p15A復(fù)制起點(diǎn)和編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶AKUCCU和抹香鯨肌紅蛋白的基因的質(zhì)粒pMyo-AKUCCU。肌紅蛋白的基因被置于阿拉伯糖啟動(dòng)子的控制之下，在其24位是AGGA密碼子。為了進(jìn)行雙位點(diǎn)插入，通過在質(zhì)粒pMyo-AKUCCU的肌紅蛋白基因的A74位上引入TAG密碼子來(lái)構(gòu)建另一個(gè)質(zhì)粒。將正交tRNALys-j17置于第二lpp啟動(dòng)子的控制之下。合成酶hGlnRS和AzPheRS用質(zhì)粒pQK表達(dá)，受谷氨酰胺獨(dú)立啟動(dòng)子的控制。含有合適合成酶和肌紅蛋白表達(dá)質(zhì)粒的GeneHogs細(xì)胞在37℃培養(yǎng)，使之生長(zhǎng)到OD600＝0.7，所用的培養(yǎng)基為GMML培養(yǎng)基，其中添加了除賴氨酸之外的其他19種氨基酸，每種0.4mg/ml，1mg/ml hGln(Sigma)，用0.02％的阿拉伯糖誘導(dǎo)，然后使其生長(zhǎng)到飽和狀態(tài)。超聲裂解細(xì)胞，用Qiagen QIA表達(dá)試劑盒純化肌紅蛋白。其胰酶水解片段用TSRI Proteomics Facility進(jìn)行MALDI-MS分析。
實(shí)施例4示例性賴氨酰O-RS和賴氨酰O-tRNA示例性O(shè)-tRNA見于實(shí)施例和/或表1中。示例性O(shè)-RS也見于實(shí)施例和/或表1中。因此，編碼O-RS或其片段的典型多核苷酸也包括實(shí)施例和/或表1中所列的那些多核苷酸。
本發(fā)明的其他細(xì)節(jié)，特別是特殊試驗(yàn)的細(xì)節(jié)，見于Anderson，John Christopher，″Pathway Engineering of the Expanding Genetic Code″，Ph.D.Dissertation，The ScrippsResearch Institute的描述。
應(yīng)當(dāng)理解的是本文所描述的實(shí)施例和實(shí)施方式只是為了說明的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)這些實(shí)施例和實(shí)施方式進(jìn)行各種修改或改變，這些經(jīng)修改的實(shí)施例或?qū)嵤┓绞揭舶ㄔ诒旧暾?qǐng)的精神和范圍之內(nèi)以及本發(fā)明附屬權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
雖然為了便于理解本發(fā)明，在上文已經(jīng)對(duì)本發(fā)明做了某種程度的詳細(xì)描述，但是應(yīng)該清楚的是，只要不偏離本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀本說明書就可以對(duì)本發(fā)明的形式和細(xì)節(jié)作出各種修改。例如，上面所描述的各種技術(shù)方法和裝置都可以不同組合的方式加以使用。出于所有目的，本申請(qǐng)所引用的所有文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)和/或其他文獻(xiàn)都已完整納入本文作為參考，這就好比各個(gè)文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)和/或其他文獻(xiàn)都被單獨(dú)納入本文作為參考。
表1
權(quán)利要求
1.一種翻譯系統(tǒng)，該翻譯系統(tǒng)包括正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或其修飾變體；正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)，其優(yōu)先將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加載于正交賴氨酰tRNA或其修飾變體；或正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或其修飾變體以及優(yōu)先將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加載于賴氨酰O-tRNA或其修飾變體的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)。
2.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述翻譯系統(tǒng)包含細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基酸是非天然氨基酸。
5.如權(quán)利要求4所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述非天然氨基酸是高谷氨酰胺。
6.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述賴氨酰O-tRNA或其修飾變體、O-RS或者二者都來(lái)源于超嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii(PhKRS)。
7.如權(quán)利要求6所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述O-RS是PhKRS、E444G、PhΔAD、或是PhΔAD的I41和/或S268突變體。
8.如權(quán)利要求6所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，當(dāng)所述O-RS在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)時(shí)，它所具有的毒性等于或低于PhΔAD的I41和/或S268突變體。
9.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述賴氨酰O-tRNA或其修飾變體包含四堿基密碼子或琥珀密碼子的識(shí)別序列。
10.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述賴氨酰O-tRNA或其修飾變體包含AGGA的識(shí)別序列。
11.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述賴氨酰O-tRNA或其修飾變體包含一個(gè)含有CU(X)nXXXAA序列的反密碼子環(huán)。
12.如權(quán)利要求11所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述CU(X)nXXXAA序列包括CUCUAAA或CUUCCUAA。
13.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述賴氨酰O-tRNA或其修飾變體包括SEQ ID NO24或SEQ ID NO26。
14.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述O-RS和賴氨酰O-tRNA或其修飾變體抑制終止或移碼選擇者密碼子的效率至少相當(dāng)于E444G、PhΔAD或PhΔAD的I41和/或S268突變體與SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的O-tRNA聯(lián)合時(shí)的50％。
15.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括其它O-RS和其它O-tRNA，其中所述其它O-RS和其它O-tRNA所抑制的移碼選擇者密碼子不同于賴氨酰O-tRNA或其修飾變體和優(yōu)先加載賴氨酰O-tRNA或其修飾變體的O-RS所抑制的移碼選擇者密碼子。
16.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述翻譯系統(tǒng)對(duì)靶多肽編碼靶核酸中的四堿基選擇者密碼子和終止選擇者密碼子均抑制。
17.如權(quán)利要求16所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述四堿基選擇者密碼子包括序列AGGA，且終止選擇者密碼子包括序列TAG或UAG。
18.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括含四堿基選擇者密碼子的靶核酸。
19.如權(quán)利要求18所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括靶核酸編碼的蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求19所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)含有高谷氨酰胺。
21.如權(quán)利要求1所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括含有四堿基選擇者密碼子和終止選擇者密碼子的靶核酸。
22.如權(quán)利要求21所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括由靶核酸編碼的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)含有至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
23.一種翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括能識(shí)別四堿基選擇者密碼子的第一正交tRNA(O-tRNA)；能用第一非天然氨基酸優(yōu)先加載O-tRNA的第一正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)；能識(shí)別終止選擇者密碼子的第二O-tRNA；以及能用第二非天然氨基酸優(yōu)先加載第二O-tRNA的第二O-RS。
24.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述四堿基選擇者密碼子是AGGA。
25.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述終止密碼子是UAG。
26.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述翻譯系統(tǒng)包含細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述第一或第二O-tRNA是正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或其修飾變體。
28.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述第一O-tRNA是正交賴氨酰tRNA(賴氨酰O-tRNA)或其修飾變體，且所述第二O-tRNA是正交酪氨酰tRNA(酪氨酰O-tRNA)或其修飾變體。
29.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包括含有至少一個(gè)四堿基選擇者密碼子和一個(gè)終止選擇者密碼子的核酸。
30.如權(quán)利要求29所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述四堿基選擇者密碼子是AGGA，且所述終止選擇者密碼子是TAG或UAG。
31.如權(quán)利要求29所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸是表達(dá)的RNA。
32.如權(quán)利要求29所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述翻譯系統(tǒng)包含由核酸編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
33.如權(quán)利要求32所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)含有高谷氨酰胺。
34.如權(quán)利要求32所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)與肌紅蛋白同源。
35.如權(quán)利要求23所述的翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含高谷氨酰胺。
36.一種組合物，該組合物包含PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體、或其保守變體。
37.一種編碼PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體、或其保守變體的核酸。
38.一種包含或編碼相應(yīng)于SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的tRNA或其保守變異的核酸。
39.一種包含正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)的組合物，其特征在于，所述O-RS優(yōu)先用高谷氨酰胺使O-tRNA氨?；?。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述O-RS包括PhΔAD的I41和/或S268突變體或其保守變異。
41.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述O-RS優(yōu)先氨?；疧-tRNA，其效率至少是PhΔAD的I41和/或S268突變體效率的50％。
42.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述O-RS來(lái)源于超嗜熱古菌。
43.如權(quán)利要求39所述的組合物，該組合物包含O-tRNA，其中所述O-tRNA識(shí)別四堿基選擇者密碼子。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述四堿基選擇者密碼子包括AGGA序列。
45.如權(quán)利要求39所述的組合物，該組合物包含細(xì)胞，其中所述O-RS被細(xì)胞內(nèi)的一種或多種核酸編碼。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
47.如權(quán)利要求39所述的組合物，該組合物包含翻譯系統(tǒng)。
48.如權(quán)利要求39所述的組合物，該組合物包含細(xì)胞，其中所述O-RS被細(xì)胞內(nèi)的一種或多種核酸編碼，該細(xì)胞還包含正交-tRNA(O-tRNA)；和高谷氨酰胺；其中，所述O-tRNA識(shí)別第一選擇者密碼子，且所述O-RS優(yōu)先用第一高谷氨酰胺使O-tRNA氨?；?br> 49.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞包含編碼目的多肽的靶核酸，其中所述靶核酸包含能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。
50.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，所述O-tRNA包含SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中所列出的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列，或由上述序列編碼，其中所述O-RS包含相應(yīng)于E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體、或其保守變異的氨基酸序列。
51.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，所述O-RS和O-tRNA抑制終止選擇者密碼子或移碼選擇者密碼子的效率至少相當(dāng)于E444G、PhΔAD或PhΔAD的I41和/或S268突變體聯(lián)合序列為SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的O-tRNA時(shí)的50％。
52.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞還包括其它不同的O-tRNA/O-RS對(duì)和其它不同的非天然氨基酸，其中所述O-tRNA識(shí)別第二選擇者密碼子，且所述O-RS優(yōu)先用第二非天然氨基酸氨?；疧-tRNA。
54.如權(quán)利要求53所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞包含含有第一和第二選擇者密碼子的靶核酸。
55.如權(quán)利要求54所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞含有由靶核酸編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
56.一種含蛋白質(zhì)的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)含有高谷氨酰胺。
57.如權(quán)利要求56所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)含有與野生型治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)用酶的氨基酸序列或其部分至少75％相同的氨基酸序列。
58.如權(quán)利要求56所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體。
59.一種篩選能將高谷氨酰胺加載到正交tRNA(O-tRNA)上的活性正交-氨酰-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該方法包括以一群細(xì)胞為篩選對(duì)象，其中所述細(xì)胞都包含1)O-tRNA，其中所述O-tRNA與細(xì)胞群中含O-tRNA的成員正交；2)一組O-RS，其包含的一個(gè)或多個(gè)活性O(shè)-RS成員可在細(xì)胞群中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)將高谷氨酰胺加載到O-tRNA上；3)編碼可選擇標(biāo)記的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有至少一個(gè)能被O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子；以及4)高谷氨酰胺；其中，所述細(xì)胞群內(nèi)含有活性O(shè)-RS的靶細(xì)胞是通過其對(duì)可選擇標(biāo)記的抑制效率相對(duì)于缺少RS群但含有O-tRNA的對(duì)照細(xì)胞的抑制效率的增強(qiáng)而被識(shí)別的；以及篩選靶細(xì)胞，從而篩選出活性O(shè)-RS。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞還經(jīng)進(jìn)一步篩選以去除那些含有非靶O-RS的細(xì)胞，這些非靶O-RS用高谷氨酰胺之外的其它氨基酸加載O-tRNA。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述篩選包括正篩選，且所述可選擇標(biāo)記包括正選擇標(biāo)記。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述一組RS包含突變的RS、第一物種之外的一個(gè)或多個(gè)物種來(lái)源的RS、或者同時(shí)含有突變的RS和第一物種之外的物種來(lái)源的RS。
63.一種用權(quán)利要求59所述方法識(shí)別出的正交氨酰-tRNA合成酶。
64.一種在細(xì)胞內(nèi)制備特定位置上為高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含含有至少一個(gè)選擇者密碼子并編碼蛋白質(zhì)的核酸；以及提供高谷氨酰胺；其中，所述細(xì)胞還包含能識(shí)別選擇者密碼子的正交-tRNA(O-tRNA)；以及優(yōu)先用高谷氨酰胺氨?；疧-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)；以及根據(jù)選擇者密碼子而將高谷氨酰胺插入到特定位置上，從而制備出所述蛋白質(zhì)。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述O-RS含有相應(yīng)于E444G、PhΔAD、PhΔAD的I41和/或S268突變體或其保守變異的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備蛋白生物合成機(jī)組分的組合物和方法，所述蛋白生物合成機(jī)包含正交賴氨酰tRNA、正交賴氨酰－氨酰tRNA合成酶和賴氨酰－tRNA/合成酶正交對(duì)，該生物合成機(jī)可將高谷氨酰胺插入到蛋白質(zhì)中以響應(yīng)四堿基密碼子。本發(fā)明還提供了鑒定這些正交對(duì)的方法以及利用這些正交對(duì)制備含高谷氨酰胺的蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101076598SQ200480019464
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日
發(fā)明者J·C·安德森, N·吳, S·桑托羅, P·G·舒爾茨 申請(qǐng)人:斯克利普斯研究院