專利名稱：B細胞疾病的聯(lián)合治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療B細胞惡性疾病以及自身免疫病的新的聯(lián)合療法。
背景技術：
淋巴細胞是白細胞地數(shù)個群體之一；它們特異性識別并應答于外來抗原。三種主要的淋巴細胞是B淋巴細胞(B細胞)，T淋巴細胞(T細胞)和自然殺傷(NK)細胞。B淋巴細胞是負責抗體產(chǎn)生的細胞，其提供體液免疫。B細胞在骨髓中成熟，離開骨髓并在它們的細胞表面表達與抗原結合的抗體。當天然B細胞首次與其膜結合抗體特異的抗原相遇時，該細胞開始迅速分裂，其子代分化成記憶B細胞和稱為“漿細胞”的效應細胞。記憶B細胞壽命很長，并繼續(xù)表達與其親代細胞具有相同特異性的膜結合抗體。漿細胞不產(chǎn)生膜結合抗體，而代之產(chǎn)生可分泌型的抗體，可分泌的抗體是體液免疫的重要效應分子。
CD20抗原(也稱為人B淋巴細胞限制性分化抗原Bp35)是前B細胞和成熟B淋巴細胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大約35kD(Valentine等生物學化學雜志264(19)11282-11287(1989)；和Einfeld等，歐洲分子生物學組織雜志7(3)711-717(1988))。該抗原也在大于90％的B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(Anderson等，血液63(6)1424-1433(1984))，但在造血干細胞，原B細胞，正常漿細胞或其它正常組織中未發(fā)現(xiàn)(Tedder等，免疫學雜志135(2)973-979，1985)。CD20在細胞周期啟動和分化的活化過程早期階段起調(diào)節(jié)作用(Tedder等，同上)，并可能發(fā)揮鈣離子通道的功能。(Tedder等，細胞生物學雜志14D195(1990))。
由于CD20在B細胞淋巴瘤中表達，該抗原成為治療所述淋巴瘤的有用的治療靶。在美國有超過300,000人患有B細胞NHL，每年診斷超過56,000的新發(fā)病例。例如，rituximab(RITUXAN)抗體被用于治療患有復發(fā)性或頑固性低程度或濾泡樣CD20陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤的患者，所述rituximab抗體經(jīng)遺傳改造成為針對人CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體(可購自Genentech，Inc.，South San Francisco，Califoria，U.S.)。Rituximab是1998年4月7日公開的美國專利5,736,137中稱為″C2B8″的抗體。對其作用機制的體外研究證實了RITUXAN結合人補體并通過補體依賴的細胞毒溶解淋巴樣B細胞(CDC)(Reff et al.Blood 83(2)435-445(1994))。此外，其在抗體依賴性細胞毒(ADCC)的實驗中具有明顯活性。體內(nèi)臨床前研究顯示，RITUXAN消耗獼猴(cynomolgus monkey)外周血、淋巴結以及骨髓的B細胞，推定是通過補體以及細胞介導的過程(Reff etaL.Blood 83(2)435-445(1994))。其它可用于NHL治療的抗-CD20抗體包括連接于放射性同位素釔-90(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)的鼠抗體ZevalinTM，偶聯(lián)于I-131的另一完整鼠抗體Bexxar(Corixa，WA)。
BLyS(也已知為BAFF，TALL-1，THANK，TNFSF13B，或zTNF4)是TNF1配體超家族成員，其對于B細胞存活以及成熟是必不可少的。BLyS在轉(zhuǎn)基因小鼠中的過表達導致B細胞增生以及嚴重自身免疫病的進展(Mackay，etal.(1999)J.Exp.Med.190，1697-1710；Gross，et al.(2000)Nature 404，995-999；Khare，et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，3370-33752-4)。BLyS水平在患有各種自身免疫病的人患者中升高，所述自身免疫病諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風濕性關節(jié)炎，以及干燥綜合征(Cheema，G.S，et al.，(2001)ArthritisRheum.44，1313-1319；Groom，J.，et al，(2002)J.Clin.Invest 109，59-68；Zhang，J.，et al.，(2001)J.Immunol.166，6-10)。此外，BlyS水平與疾病嚴重性相關，提示BlyS在這些疾病的發(fā)病機理中起直接作用。BlyS通過與TNF受體超家族的三個成員TACI，BCMA和BR3(也已知為BAFF-R)結合作用于B細胞(Gross，et al.，同上；8.Thompson，J.S.，et al.，(2001)Science 293，2108-2111；Yan，M.，et al.，(2001)Curr.Biol.11，1547-1552；Yan，M.，et al.，(2000)Nat.Immunol.1，37-41；Schiemann，B.，et al.，(2001)Science 293，2111-2114)。這三個成員中，僅BR3特異于BLyS；其它兩個成員也與相關TNF家族成員APRIL結合。BLyS與受體敲除或突變小鼠的表型的比較提示，通過BR3的信號轉(zhuǎn)導介導BLyS的B細胞生存功能(Thompson，et al.，同上；Yan，(2002)，同上；Schiemann，同上)。反之，TACI顯示起抑制性受體的作用(Yan，M.，(2001)Nat.Immunol.2，638-643)，而BCMA的作用不明(Schiemann，同上)。
BR3是B細胞表面表達的184-殘基III型跨膜蛋白(Thompson，et al.，同上；Yan，(2002)，同上)。其細胞內(nèi)結構域與已知的結構域或蛋白-蛋白相互作用基序沒有序列相似性。然而，BLyS-誘導的信號經(jīng)由BR3導致轉(zhuǎn)錄因子NF-B2/p100被加工成p52(Claudio，E，et al.，(2002)Nat.Immunol.3，958-965；Kayagaki，N.，et al.，(2002)Immunity 10，515-524)。BR3的細胞外結構域(ECD)也是分叉的(divergent)。TNFR家族成員的特征通常為其細胞外區(qū)中存在多個富含半胱氨酸的結構域(CRDs)；每個CRD通常由～40殘基組成，其由三個二硫鍵中的六個半胱氨酸穩(wěn)定化。該家族的常規(guī)成員通過兩個CDR與配體表面的兩個不同小區(qū)域發(fā)生相互作用而與所述配體接觸(綜述見Bodmer，J.-L，et al.，(2002)Trends Biochem.Sci.27，19-26)。然而，BR3 ECD含有僅僅四個半胱氨酸殘基，至多能夠形成部分CRD，引發(fā)了這樣的小受體如何進行高親和力配體結合的問題。
過去已知BR3的BLyS-結合區(qū)位于26個殘基的核心區(qū)域中(Kayagaki，etal.，同上)。當六個BR3殘基被構建在β-發(fā)夾肽(bhpBR3)中時，其足以賦予BLyS結合能力并阻斷BR3介導的信號。其他人報道了據(jù)稱與BLyS作用的多肽(例如，WO 02/24909，WO 03/035846，WO 02/16312，W002/02641)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了來自消耗混合細胞群體的B細胞的方法，包括將混合的細胞群體與BLyS拮抗劑以及CD20結合抗體接觸。該方法可用于商業(yè)化體外實驗以有效或選擇性消耗來自混合細胞群體的B細胞，所述方法通過將B細胞與BLyS拮抗劑以及CD20結合抗體接觸來進行。前述B細胞消耗方法的另一方面是特異性消耗特定B細胞亞群(subset)，諸如生發(fā)中心B細胞以及邊緣帶B細胞。在具體實施方案中，所述生發(fā)中心B細胞位于脾以及派爾結(Peyer’s patch)中。本發(fā)明另一方面是通過將B細胞與BLyS拮抗劑以及CD20結合抗體接觸在體外或體內(nèi)消耗B細胞的方法。
本發(fā)明還提供消耗脾內(nèi)所有B細胞群體的方法，所述方法通過將可有效消耗所有B細胞群體的量的BLyS拮抗劑以及抗-CD20抗體給藥哺乳動物來進行。具體實施方案中，所述方法可有效消耗脾、淋巴結以及派爾結內(nèi)的邊緣帶以及生發(fā)中心B細胞。
本發(fā)明還提供了治療以表達CD20的B細胞為特征的B細胞腫瘤或惡性疾病的方法，包括給藥患有所述腫瘤或惡性疾病的患者治療有效量的CD20結合抗體以及BLyS拮抗劑。一個實施方案中，所述CD20結合抗體與BLyS拮抗劑同時給藥。一個不同的實施方案中，所述CD20結合抗體與BLyS拮抗劑序貫給藥。一個具體實施方案中，所述BLyS拮抗劑在所述CD20結合抗體之前給藥。具體實施方案中，所述B細胞腫瘤是非霍奇金淋巴病(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)，小淋巴細胞(SL)NHL，淋巴細胞優(yōu)勢型霍奇金病(lymphocyte predominant Hodgkin’s disease)(LPHD)，濾泡中心細胞(follicular center cell)(FCC)淋巴瘤，急性淋巴細胞白血病(ALL)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)和毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)。在該治療方法中，BR3-Fc和Rituxan以“劑量”部分中公開的劑量給藥。其它實施方案中，所述BLyS拮抗劑與所述CD20結合抗體與化療聯(lián)合用藥。
本發(fā)明另一方面是緩解B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫病的方法，包括給藥患有所述疾病的患者治療有效量的CD20結合抗體以及BLyS拮抗劑。一個實施方案中，所述自身免疫病選自以下疾病組成的組類風濕性關節(jié)炎，幼年類風濕性關節(jié)炎(juvenile rheumatoid arthritis)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，韋格納病(Wegener’s disease)，炎性腸病(inflammatory bowel disease)，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，多發(fā)性硬化，銀屑病，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病，重癥肌無力，血管炎(vasculitis)，糖尿病，雷諾綜合征(Reynaud’s syndrome)，干燥綜合征(Sjorgen’s syndrome)和腎小球腎炎。其中所述自身免疫病是類風濕性關節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。一個實施方案中，所述BLyS拮抗劑以及所述CD20結合抗體與利用選自下組的藥物的療法聯(lián)合用藥非類固醇抗炎藥(NSAIDs)，糖皮質(zhì)激素，潑尼松(prednisone)，或改善疾病型抗風濕藥物(disease-modifying antirheumatic drug)(DMARD)。
在任何將CD20結合抗體以及BLyS拮抗劑給藥患者以治療或緩解疾病的方法中，所述CD20結合抗體與BLyS拮抗劑可同時或序貫給藥。在具體實施方案中，所述BLyS拮抗劑在所述CD20結合抗體之前給藥。
提供了包含CD20結合抗體和BLyS拮抗劑的組合物。
本發(fā)明還提供了制品，其包含CD20結合抗體，aBLyS拮抗劑，和標簽，其中所述標簽顯示所述組合物可用于治療B細胞腫瘤或B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫病。
本發(fā)明的方法、組合物以及制品的任何實施方案中，所述抗-CD20抗體包括嵌合以及人源化抗體?？?CD20抗體的具體實例包括rituximab(RITLTXANO)，m2H7(鼠2H7)，hu2H7(人源化2H7)以及其所有功能變體，hu2H7.v16(v代表版本)，v31，v96，vl14，vl15，其具有所述氨基酸序列。完整hu2H7.v16具有SEQ ID NO.15的成熟L鏈序列以及SEQ IDNO.16的H鏈。
本發(fā)明的方法、組合物以及制品的任何實施方案中，所述BLyS拮抗劑在一個實施方案中為免疫粘附素。具體實施方案中，所述免疫粘附素選自包含BR3細胞外結構域的BR3免疫粘附素，包含TACI細胞外結構域的TACI免疫粘附素，以及包含BCMA細胞外結構域的BCMA免疫粘附素組成的組。其它實施方案中，所述BLyS拮抗劑是抗-BLyS抗體，具體為，與BLyS在包含殘基162-275的BLyS的區(qū)域中結合的抗-BLyS抗體。另一實施方案中，所述BLyS拮抗劑是抗-BR3抗體，包括與BR3在包含人BR3的殘基23-38的區(qū)域中結合的抗體。權利要求所述人BR3的氨基酸位置根據(jù)人BR3或本文公開的”BR3”定義中的可選人BR3的序列進行編號。
在具體實施方案中，BLyS拮抗劑選自具有以下序列的17-mer多肽ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ IDNO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，或ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQID NO 9)以及這些17mer的PEG化形式；
具有以下序列的多肽MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO.10)；
具有以下序列的hBR3-Fc免疫粘附素MSALLILALVGAAVASTRRGPSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQSITCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKITVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.2)。
在本發(fā)明前述任何方法中，一個實施方案中，所述BLyS拮抗劑與抗-CD20抗體協(xié)同作用以消耗B細胞。
附圖簡述


圖1A-1B顯示多核苷酸序列，其編碼天然序列人TACI(SEQ ID NO_)及其氨基酸序列(SEQ ID NO_)。
圖2顯示多核苷酸序列，其編碼天然序列人BCMA(SEQ ID NO_)及其氨基酸序列(SEQ ID NO_)。
圖3顯示多核苷酸序列，其編碼天然序列人BLyS(SEQ ID NO_氨基酸序列(SEQ ID NO)。
圖4A-4B顯示多核苷酸序列，其編碼天然序列人APRIL(SEQ ID NO_)及其公知的氨基酸序列(SEQ ID NO-)。
圖5A顯示多核苷酸序列(起始和終止密碼子加下劃線)，其編碼天然序列人TACIs(SEQ ID NO_)，圖5B顯示其氨基酸序列(SEQ ID NO_)。
圖6A顯示多核苷酸序列(起始和終止密碼子加下劃線)，其編碼天然序列人BR3(SEQ ID NO_)，圖6B顯示其氨基酸序列(SEQ ID NO_)；圖6C顯示多核苷酸序列(起始和終止密碼子加下劃線)，其編碼鼠BR3(SEQ IDNO_)，圖9A顯示其氨基酸序列(SEQ ID NO_)。
圖7A-7B顯示計算稱為“比較蛋白”的氨基酸序列與稱為“PRO”的氨基酸序列的％氨基酸序列同一性的示例性方法。為本文目的，所述″PRO″序列可為TACI，BCMA，TALL-1，APRIL，TACIs，或BR3序列，參見本發(fā)明附圖。
圖8顯示TACI受體″hTACI(265)″(SEQ ID NO_)，其據(jù)信是剪接變體，與″hTACI″的氨基酸序列，也參見圖1A-1B(SEQ ID NO)的比對。
圖9顯示人(SEQ ID NO-)與鼠BR3(SEQ ID NO)的序列比對，相同氨基酸用字母表示出，保守氨基酸用下方的加號示出。
圖10顯示人CD20的氨基酸序列，顯示預測的跨膜(加框的)和細胞外(加下劃線的)區(qū)。可能的結構域為1-63胞質(zhì)；64-84跨膜；85-105跨膜；106-120胞質(zhì)；121-141跨膜；142-188細胞外；189-209跨膜；210-297胞質(zhì)；81-167二硫鍵。
圖11顯示人CD20的核苷酸序列。
圖12是鼠2H7(SEQ ID NO_)，，人源化2H7v16變體(SEQ IDNO_)，，以及人kappa輕鏈亞組I(SEQ ID NO_)的輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列比對。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下CDR1(SEQ ID NO_)，，CDR2(SEQ ID NO_)，，CDR3(SEQ ID NO_)。
圖13是鼠2H7(SEQ ID NO_)，人源化2H7vl6變體(SEQ ID NO_)，，以及重鏈亞組III的人共有序列的VH序列的比對。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDR1(SEQ ID NO_)，，CDR2(SEQ ID NO_)，，CDR3(SEQ IDNO_)。
圖12和13中，每條鏈中的CDR1，CDR2和CDR3包含在方括號內(nèi)，側(cè)接框架區(qū)FR1-FR4，如圖所示。兩行序列之間的星號表示兩條序列中不同的位置。殘基編號根據(jù)Kabat etal.，Sequences of Immunological Interest.5thEd.Pubblic Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)所述進行，插入顯示為a，b，c，d和e。
圖14顯示hCD20 BAC Tg+小鼠的小鼠B220+細胞(B細胞)中人CD20轉(zhuǎn)基因的表達。
圖15顯示hCD20 BAC Tg小鼠中B細胞成熟過程中人CD20的表達。圖15-19中，紅線顯示陰性對照，利用抗-hCD20 mAb對轉(zhuǎn)基因陰性(Tg-)同窩幼仔細胞的染色。綠色線顯示Tg+小鼠中人CD20的染色。Tg+小鼠指hC20 BAC轉(zhuǎn)基因小鼠。
圖16顯示FACS圖，證實了Tg+小鼠骨髓中不同成熟/分化階段B細胞(成熟B細胞，前-B細胞和未成熟B細胞，原-B細胞以及祖B細胞)中人CD20的表達。
圖17顯示FACS圖，證實了人CD20在Tg+小鼠脾B細胞中的表達。細胞門控為B220+以獲得B細胞。IgM和CD21允許分成T2/濾泡，邊緣帶和T1的各種B細胞亞群。
圖18顯示FACS圖，證實了人CD20在Tg+小鼠腸系膜淋巴結(LN)中的表達。
圖19顯示FACS圖，證實了人CD20在Tg+小鼠派爾結中的表達。細胞門控在B220+。CD38標記使得成熟B細胞與生發(fā)中心B細胞區(qū)分開。
圖20描述了抗-hCD20 mAb在人CD20 Tg+小鼠中的效應。第0天，小鼠中注入1.0mg[等同于50mg/kg]抗-CD20抗體(水平線上的黑色箭頭)，細胞在水平線下方的紅色箭頭所指示的日子進行分析。對外周血、脾、淋巴結、骨髓和派爾結進行FACS分析。監(jiān)測血清抗-hCD20 mAb水平。
圖21顯示FACS圖，證實了用抗-hCD20mAb消耗外周血B細胞。左圖顯示IgG對照，即用非特異性、同種型匹配的抗體處理的動物。
圖22顯示FACS圖，證實了右圖中抗-hCD20 mAb對成熟外周LN B細胞的消耗。左圖顯示IgG對照，即用非特異性、同種型匹配的抗體處理的動物。對于所有B細胞門控在CD21+CD23+。
圖23顯示FACS圖，證實了抗-hCD20 mAb對脾T2 B細胞而不是邊緣帶B細胞的消耗。
圖24顯示FACS圖，證實了抗-hCD20 mAb對再循環(huán)成熟B細胞而不是未成熟/前-B或原-B細胞的消耗。紅色表示IgG-處理的的小鼠，而綠色表示抗-hCD20 mAb處理的小鼠，所述小鼠表達hCD20。IgG處理的小鼠(紅)保持表達hCD20的成熟B細胞，抗-hCD20 mAb消耗攜帶hCD20的細胞。監(jiān)測人CD20表達來檢測未結合以及Ab-結合的CD20。
圖25顯示FACS圖，證實了派爾結生發(fā)中心B細胞對抗-hCD20mAbs的抵抗。左圖顯示來自對照IgG處理的小鼠的細胞。右圖顯示來自抗-CD20mAb處理的Tg+小鼠的細胞。
圖26顯示FACS圖，證實了用抗-hCD20 mAb處理Tg+小鼠后外周血B細胞的消耗和恢復。上面一排圖顯示來自對照mAb處理的小鼠的細胞的染色。第一天給藥小鼠抗體。隨時間，不表達hCD20的前體B細胞發(fā)育成CD20+成熟B細胞(見第6和14周的染色)。
圖27顯示FACS圖，證實了脾生發(fā)中心B細胞對短期(單次注射)抗-CD20 mAb處理的抵抗。綿羊紅細胞免疫來誘導生發(fā)中心形成之后第8天，一組小鼠用人CD20的m2H7 mAb處理。對照組小鼠用mIgG2a同種型對照抗體處理。小鼠脾細胞在第12天分析。對生發(fā)中心進行PNA(花生凝集素(peanut agglutinin))染色。在用抗-CD20的處理中沒有檢測到生發(fā)中心B細胞的消耗。
圖28顯示FACS圖，證實了非-消耗的邊緣帶(MZ)和B1 B細胞對T-非依賴型抗原的保護作用。在右側(cè)的三個圖中，對脾細胞進行鏈球菌多糖磷脂酰膽堿(streptococcus polysaccharide-phosphatidyl choline)(TI抗原)染色。CD138是漿細胞標記。
圖29顯示BLyS拮抗劑，BR3-Fc和抗-CD20 mAb即m2H7的聯(lián)用在如實施例4所示動物模型中進行治療的明顯生物效果。FACS分析在脾，血液，淋巴結-B細胞(門控在CD21+CD23+)上分析。所述聯(lián)合治療在消耗B細胞方面產(chǎn)生顯著協(xié)同作用，尤其是對于脾的邊緣帶，T2和濾泡B細胞。
圖30顯示在人CD20 Tg+小鼠中聯(lián)用抗-hCD20 mAb和BR3-Fc對B細胞消耗的協(xié)同作用，如實施例4所示。小鼠用對照IgG2a，BAFFR/BR3-Fc(100μg/小鼠IP每天，持續(xù)12天)，抗-hCD20 mAb(100μg/小鼠IP，第9天)以及BAFFR/BR3-Fc和抗-hCD20 mAb的組合(與單一治療組劑量相同)處理。B220+脾細胞在第13天分離并對CD21和CD23染色。N＝5小鼠/組。
圖3 1顯示B220+總脾B細胞(MZ+FO+T1+T2的所有亞組)消耗的定量，hCD20 Tg+小鼠的邊緣帶(MZ)和濾泡(FO)B細胞如實施例4以及圖30所述，除了小鼠用單劑的0.1mg對照IgG2a，BAFF/BR3-Fc或抗-hCD20 mAb處理。脾細胞在的4天分析。N＝5小鼠/組。
圖32A-C顯示選自用于高親和力BlyS結合的噬菌體展示文庫的17mer的氨基酸序列。
優(yōu)選實施方案詳述
雖然抗-CD20 Mab處理消耗特定亞群的B細胞，我們以前觀察到邊緣帶B細胞，生發(fā)中心B細胞以及漿細胞被保留。反之，用BR3-Fc阻斷B細胞生存信號也消耗B細胞或調(diào)節(jié)B細胞數(shù)目，但是程度不同。據(jù)信BR3影響所有B細胞的生存。本文所述試驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合給藥抗-CD20抗體與BLyS拮抗劑產(chǎn)生令人驚奇的B細胞體內(nèi)消耗協(xié)同效果。聯(lián)用抗-CD20抗體和針對BlyS通路的療法提供了治療B細胞介導的疾病的新方法，所述疾病包括基于B細胞的惡性疾病以及B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病。聯(lián)用抗-CD20抗體和BLyS拮抗劑可提供具體疾病的現(xiàn)存療法的有效且低毒性的替代，所述疾病例如，慢性淋巴細胞白血病(CLL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)。
本文中“自身免疫病”是一種源自個體自身組織或直接針對個體自身(自體)抗原和/或組織的非惡性疾病。
本文術語″B細胞消耗″指藥物或抗體治療后動物或人中B細胞水平與治療前的水平相比而言降低。B細胞水平可利用已知的試驗諸如通過獲得全血細胞計數(shù)，通過對已知B細胞標記物的FACS分析染色，以及通過諸如試驗實施例中所述的方法來測定。B細胞消耗可以是部分或完全的。在一個實施方案中，表達CD20的B細胞的消耗是至少25％。在接受B細胞消耗藥物的患者中，B細胞通常在藥物于患者體內(nèi)循環(huán)的持續(xù)時間中以及回收B細胞的時間中消耗。
“CD20”抗原是在90％以上來自外周血或淋巴器官的B細胞表面發(fā)現(xiàn)的一種～35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細胞發(fā)育階段表達，并保持到漿細胞分化；其不見于人干細胞、淋巴樣祖細胞和正常血漿細胞上。CD20存在于正常B細胞以及惡性B細胞上。文獻中CD20亦稱為“B淋巴細胞限制性抗原”或“Bp35”。例如CD20抗原在Clark和Ledbetter，Adv.Can.Res.5281-149(1989)和Valentine et al.J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)中描述。
CD20結合抗體和抗-CD20抗體在本文可互換使用并包括以足夠的親和力與CD20結合的所有抗體，使得所述抗體可用作靶向表達所述抗原的細胞的治療劑，并且不與其它蛋白質(zhì)諸如以下試驗中所述的陰性對照蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應。有一個臂結合CD20的雙特異性抗體也包含在本發(fā)明內(nèi)。CD20結合抗體的定義還包含前述抗體的功能片段。所述CD20結合抗體將以Kd＜10nM結合CD20。在優(yōu)選實施方案中，所述結合的Kd＜7.5nM，更優(yōu)選＜5nM，更優(yōu)選在1-5nM之間，最優(yōu)選＜1nM。
與CD20抗原結合的抗體包括“C2B8”現(xiàn)在被稱為“rituximab”(“RITUXAN”)(美國專利5,736,137，引入作為參考)；釔-[90]-標記的2B8鼠抗體“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN(美國專利5,736,137，引入作為參考)；鼠IgG2a“B1”，也稱為“Tositumomab”，(Beckman Coulter)，任選用131I標記產(chǎn)生“131I-B1”抗體(BEXXARTM)(美國專利5,595,721，引入作為參考)；鼠單克隆抗體“1F5”(Press等Blood 69(2))584-591(1987))和其變體，包括“框架嵌入的”或人源化的“1F5”(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏號為HB-96450)；小鼠2H7抗體和“嵌合2H7”抗體(美國專利5,677,180，引入作為參考)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，Denmark)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；A20抗體或其變體，如嵌合或人源化A20抗體(分別為cA20，hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；和可從國際白細胞分型小組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得的單克隆抗體L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentine等，在《白細胞分型III》(McMichael編，第440頁，Oxford University Press(1987))。
本文中術語“rituximab”或“RITUXAN”指經(jīng)遺傳工程改造的、針對CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137(引入作為參考)中命名為“C2B8”，包括其保持與CD20結合的能力的片段。
一個具體實施方案中，所述抗-CD20抗體結合人以及靈長類CD20。具體實施方案中，結合CD20的抗體是人源化或嵌合的。CD20結合抗體包括rituximab(RITUXAN)，m2H7(鼠2H7)，hu2H7(人源化2H7)以及其所有功能變體，包括但不限于，hu2H7.v16(v表示版本)，v31，v73，v75，以及巖藻糖缺陷的變體。一些hu2H7變體抗體的序列如下所示，其中以粗體表示的N末端為在成熟多肽中被去除的前導序列
hu2H7.v16 L鏈[232 aa](SEQ ID NO.3)
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu2H7.v16 H鏈[471 aa](SEQ ID NO.4)
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFIYSKITVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu2H7.v31 H鏈[471 aa]SEQ ID NO.11
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
v31的L鏈與上述v16的相同，即為SEQ ID NO.3。
為本發(fā)明的目的，″人源化2H7v.16″指完整抗體和抗體片段，包含可變輕鏈序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO13)；
以及可變重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO14)
其中人源化2H7v.16抗體是完整抗體，優(yōu)選其包含v16輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO15)；以及
v16重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKF KGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO16)。
所有其它基于版本16的變體的V區(qū)具有v16的氨基酸序列，但除外在氨基酸取代的位置，所述位置在下表顯示。除非另有說明，2H7變體具有與v16的相同的L鏈。
前述人源化2H7 mAb的變體是2H7v.31，其具有上述SEQ ID NO15所示的L鏈，H鏈氨基酸序列為EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSSWTVPSSSLGTQIYICNVNHKPSNIKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.17)。
鼠抗-人CD20抗體，m2H7，具有VH序列QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTV S(SEQ ID NO23)
以及VL序列QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO24)
除非指出，本發(fā)明公開的人源化2H7v.16及其變體的序列為成熟多肽的序列，即沒有前導序列。
涉及CD20抗體的專利以及專利出版物包括美國專利5,776,456，5,736,137，5,843,439，6,399,061和6,682,734，以及美國專利申請US2002/0197255A1，US2003/0021781A1，US2003/0082172A1，US2003/0095963A1，US 2003/0147885 A1(Anderson et aL)；美國專利6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky et al.)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO01/10460(White和Grillo-Lopez)；US2001/0018041A1，US2003/0180292A1，WO01/34194(Hanna和Hariharan)；美國專利申請US2002/0006404和W002/04021(Hanna和Hariharan)；美國專利申請US2002/0012665 A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美國專利申請US 2002/0058029 A1(Hanna，N.)；美國專利申請US2003/0103971 A1(Hariharan和Hanna)；美國專利申請US2002/0009444A1和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/9785(White，C.)；美國專利申請US2002/0128488A1和WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky etal.)；WO2/096948(Braslawsky et al.)；WO02/079255(Reff和Davies)；美國專利6,171,586B1，和WO98/564518(Lam et al.)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美國專利6,194,551B1，美國專利6,242,195B1，美國專利6,528,624B1和美國專利6,538,124(Idusogie etal.)；WO/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd et al.)；WO01/03734(Grillo-Lopez et al.)；美國專利申請US2002/0004587A1和WO01/77342(Miller和Presta)；美國專利申請US2002/0197256(Grewal，I.)；美國專利申請US2003/0157108 A1(Presta，L.)；美國專利6,565,827B1，6,090,365B1，6,287,537B1，6,015,542,5,843,398，和5,595,721，(Kaminski et al.)；美國專利5,500,362，5,677,180,5,721,108，6,120,767,6,652,852B1(Robinsonet al.)；美國專利6,410,391B1(Raubitschek et al)；美國專利6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；美國專利申請US 2003/0133930 A1和WO00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO00/76542(Golay etal.)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美國專利6,368,596B1(Ghetie et al.)；美國專利6,306,393和美國專利申請US2002/0041847A1(Goldenberg，D.)；美國專利申請US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；W002/102312(Engleman，E.)；美國專利申請2003/0068664(Albitar et al.)；WO03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694，US2002/0009427A1和US2003/0185796 A1(Wolin et al.)；WO03/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818A1(Bohen et al.)；US2003/0219433 A1和WO 03/068821(Hansen etal.)；US2003/0219818A1(Bohen et al.)；US2002/0136719A1(Shenoy et al.)；WO2004/032828(Wahl et al.)，每篇均包含在本文作為參考。也見美國專利5,849,898和EP申請330,191(Seed et al.)；美國專利4,861,579和EP332,865A2(Meyer和Weiss)；USP 4,861,579(Meyer et al.)；WO95/03770(Bhat et a1.)；US2003/0219433 A1(Hansen et al.)。
所述CD20抗體可以是裸露的抗體和與細胞毒化合物諸如放射性同位素和毒素偶聯(lián)。所述抗體包括與放射性同位素Yttrium-90(IDECPharmaceuticals，San Diego，CA)偶聯(lián)的抗體ZevalinTM，以及與I-131(Corixa，WA)偶聯(lián)的BexxarTM。所述人源化2H7變體包括那些具有位于FR中的氨基酸取代的變體以及在移植的CDR中有改變的親和力成熟的變體。CDR或FR中取代的氨基酸不限于受體和供體抗體中存在的那些。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗-CD20抗體進一步包含在Fc區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基改變，其導致效應器功能改善，包括增強的CDC和/或ADCC功能以及B-細胞殺傷(也稱為B-細胞消耗)。具體地，可鑒定改善CDC和ADCC活性的三種突變S298A/E333A/K334A(本文也稱為三聯(lián)Ala突變體或變體；Fc區(qū)中的編號根據(jù)EU編號系統(tǒng)；如Kabat et al.，同上(Idusogie et al.，同上(2001)；Shields et al.，同上)。
本發(fā)明其它抗-CD20抗體包括具有改善穩(wěn)定性的特定改變的那些抗體。一個實施方案中，嵌合抗-CD20抗體具有鼠V區(qū)以及人C區(qū)。一種所述特異性嵌合抗-CD20抗體是Rituxan(Rituximab；Genentech，Inc.)。Rituximab和hu2H7可通過補體介導的細胞毒(CDC)以及抗體依賴的細胞毒(ADCC)來介導B細胞的裂解。美國專利6,194,551B1和WO99/51642中描述了具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列和增加或降低的Clq結合能力的多肽變體。那些專利公開的內(nèi)容包含于本文中作為參考。也見等J.Immunol.1644178-4184(2000)。
WO00/42072(Presta)描述了與FcRs的結合增強或降低的多肽變體。該專利公開的內(nèi)容包含于本文中作為參考。也見Shields等J.Biol.Chem.9(2)6591-6604(2001)。
IgG中的N糖基化位點在CH2區(qū)中的Asn297。本發(fā)明還包括具有Fc區(qū)的人源化CD20-結合抗體，其中組合物中約80-100％(優(yōu)選約90-99％)的抗體包含缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構，所述結構附著于糖蛋白的Fc區(qū)。所述抗體可改善與FcyRIIIA(F158)的結合，后者與人IgG的作用不如FcyRIIIA(V158)有效。
術語“抗體”是指最廣義上的抗體，并具體包括例如單克隆抗體，多克隆抗體，多特異抗體，單鏈抗體以及抗體片段。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的多肽融合于抗體框架，例如在可變區(qū)或CDR中融合，使得所述抗體結合并抑制BLyS與BR3的結合或BLyS信號。包含本發(fā)明多肽的抗體可為嵌合的、人源化的或人的。包含本發(fā)明多肽的抗體可以是抗體片段。該抗體或產(chǎn)生該抗體的方法以下詳述?？蛇x，本發(fā)明的抗體可通過用本發(fā)明的多肽免疫動物來制備。因此，針對本發(fā)明多肽的抗體包含在本發(fā)明內(nèi)。
本文中術語“單克隆抗體”指從實質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個抗體除了可能自然發(fā)生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對抗原上的單個決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優(yōu)勢還在于，它們是通過雜交瘤培養(yǎng)而合成的，無其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆的”指抗體獲自實質(zhì)上均一的抗體群的特征，不應理解為限定由任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制備，或用重組DNA法(如美國專利4,816,567)來制備?！皢慰寺】贵w”還可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志，222581-597(1991)所述技術從噬菌體抗體庫中分離得到。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應序列，鏈的其余部分等同于或同源于來自其它物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應序列，以及所述抗體的片段，只要它們展示所需生物學活性(見美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學院學報，816851-6855(1984))。制備嵌合抗體的方法是本領域已知的。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段諸如(Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，或抗體的其它抗原結合片段。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的高變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進一步優(yōu)化抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個、通常兩個可變區(qū)的全部，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些，但FR區(qū)可包括一或多種提高結合親和力的氨基酸取代。Fc中這些氨基酸取代的數(shù)目在H鏈中通常不超過6個，在L鏈中不超過3個。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)、通常為人免疫球蛋白的至少一部分。祥見Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。所述人源化抗體包括PRIMATIZED抗體，其中抗體的抗原結合區(qū)來自通過例如用目的抗原免疫獼猴制備的抗體。制備人源化抗體的方法是本領域已知的。
人抗體可利用本領域已知的技術制備，并包括噬菌體展示文庫。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole et al.和Boerner et al.的技術可用于制備人單克隆抗體。Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)。
本發(fā)明CD20結合抗體的“功能片段”是這樣的片段，其保持以與其所來源的完整全長鏈分子基本上相同的親和力與CD20結合并能夠如本文所述體外和體內(nèi)試驗所測定的那樣來消耗B細胞。
抗體“效應器功能”指導致抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的生物活性的那些，并隨抗體同種型不同而改變?？贵w效應器功能(effector function)的實例包括Clq結合和補體依賴的細胞毒；Fc受體結合；抗體-依賴的細胞介導的細胞毒(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)下調(diào)；和B細胞活化。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用”和“ADCC”指一種細胞毒形式，其中結合于一些細胞毒細胞(如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞，和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)的分泌型Ig使得這些細胞毒效應細胞能特異性結合于攜有抗原的靶細胞，然后用細胞毒素殺死靶細胞?？贵w“武裝”細胞毒細胞并且這對于所述殺傷而言是絕對需要的。介導ADCC的主要細胞即NK細胞僅表達FcγR III，而單核細胞表達FcγRI，F(xiàn)cγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學年鑒9457-92(1991)，464頁的表3中總結了造血細胞上的FcR表達。為評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC試驗，如美國專利5,500,362號或5,821,337號中所述。這類試驗中有用的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。選擇性地，或附加地，目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評估，例如在Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)中公開的動物模型中。
“補體依賴性細胞毒作用”或“CDC”是指在補體存在時靶細胞的裂解。傳統(tǒng)的補體活化途徑由補體系統(tǒng)第一個成分(Clq)與和其相應抗原結合的抗體(屬適當亞種類)的結合來啟動。為評價補體活化，可如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202163(1996)所述進行CDC試驗。
“分離的”抗體是指從其天然環(huán)境成份中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成份是可能干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，且可能包括酶，激素，和其它蛋白型或非蛋白型溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，該抗體可純化成(1)按勞里(Lowry)方法測定的抗體重量超過95％，且最優(yōu)選重量超過99％，(2)其純化程度足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列，或(3)在還原型或非還原型條件下，使用考馬斯藍或者優(yōu)選銀染進行SDS-PAGE測定為具有同質(zhì)性。該分離的抗體包括在重組細胞內(nèi)的原位抗體，因為該抗體天然環(huán)境中的至少一種成份不存在。然而，一般來說，分離的抗體由至少一個純化步驟制備。
本文術語″BLyS，″″BLyS多肽，″″TALL-1″或″TALL-1多肽，″″BAFF″包括″天然序列BLyS多肽″和″BLyS變體″?！錌LyS″是由以下任意氨基酸序列以及圖3中及其同源物、片段及變體編碼的多肽
人BLyS序列(圖3；SEQ ID NO._)
1 mddstereqsrltsclkkreemklkecvsilprkespsvr sskdgkllaa tlllallscc
61 ltvvsfyqva alqgdlaslr aelqghhaek lpagagapka gleeapavta glkifeppap
121 gegnssqnsr nkravqgpee tvtqdclqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee
181 kenkilvket gyffiygqvl ytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl
241 pnnscysagi akleegdelq laiprenaqi sldgdvtffg alkll
小鼠BLyS序列(SEQ ID NO._)
1 mdesaktlpp pclcfcsekg edmkvgydpi tpqkeegawf gicrdgrlla atlllallss
61 sftamslyql aalqadlmnl rmelqsyrgs atpaaagape ltagvklltp aaprphnssr
121 ghrnrrafqg peeteqdvdl sappapclpg crhsqhddng mnlrniiqdc lqliadsdtp
181 tirkgtytfv pwllsfkrgn aleekenkiv vrqtgyffiy sqvlytdpif amghviqrkk
241 vhvfgdelsl vtlfrciqnm pktlpnnscy sagiarleeg deiqlaipre naqisrngdd
301 tffgalkll
其具有天然序列BLyS多肽的生物活性。BLyS的生物活性可選自以下活性組成的組促進B細胞生存，促進B細胞成熟以及與BR3結合。BLyS變體將優(yōu)選具有與BLyS多肽天然序列的至少80％或直到100％的任何連續(xù)整數(shù)，包括，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的氨基酸序列同一性?！疤烊恍蛄小盉lyS多肽包括具有與自然界衍生的相應BLyS有相同氨基酸序列的多肽。例如，BLyS在通過弗林蛋白酶類型(furin-type proteases)的蛋白酶從細胞表面裂解以后以可溶形式存在。這樣的天然序列BLYS可以從自然界分離，也可以通過重組和/或合成手段制備。術語“天然序列BLyS多肽”具體包括天然截短或分泌形式(例如細胞外結構域序列)，天然變體形式(例如旁路剪接形式)，以及所述多肽的天然等位變體。術語“BLyS”包括Shu等，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；GenBank登記號AF136293；1998年5月7日公開的WO98/18921；1998年10月7日公開的EP86/9180；1998年6月25日公開的WO98/27114；1999年3月18日公開的WO99/12964；1999年7頁8日公開的WO99/33980；Moore等，Science，285260-263(1999)；Schneider等，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay等，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999)中所述的那些。
本文術語“BLyS拮抗劑”以最廣義的含義使用，包括任何具有以下性質(zhì)的分子(1)與天然序列BLyS多肽結合或與天然序列BR3多肽結合以部分或完全阻斷BR3與BLyS多肽的作用，和(2)部分或完全阻斷，抑制，中和天然序列BLyS信號。天然序列BLyS多肽信號促進B細胞生存和成熟等。BLyS信號的抑制、阻斷和中和導致例如B細胞數(shù)目減少。本發(fā)明的BLyS拮抗劑將在體外和體內(nèi)部分和完全阻斷、抑制和中和BLyS多肽的一或多種生物活性。一個實施方案中，生物活性BLyS在體外和體內(nèi)增強以下事件的任何一種或其組合促進B細胞生存，IgG和/或IgM水平升高，漿細胞數(shù)目增加，以及在脾B細胞中將NF-κb2/100加工成p52 NF-κb(例如，Batten，M et al.，(2000)J.Exp.Med.1921453-1465；Moore，et al.，(1999)Science 285260-263；Kayagaki，et al.，(2002)10515-524)。本發(fā)明描述了數(shù)種可用于檢測本發(fā)明BLyS拮抗劑的試驗。
如上所述，BLyS拮抗劑可以以直接或間接方式來在體外或體內(nèi)部分或完全阻斷、抑制或中和BLyS信號。例如，所述BLyS拮抗劑可直接結合BLyS。本發(fā)明涉及這樣的抗BLyS抗體，其例如，在包含殘基162-275的人BLyS的區(qū)域內(nèi)結合和/或選自以下位置殘基的鄰近殘基結合人BLyS的162，163，206，211，231，233，264和265，使得所述抗體在空間上阻止BLyS與BR3的結合。另一實施例中，直接結合物是包含BLyS受體細胞外結構域的多肽，所述受體諸如TACI，BR3和BCMA。另一實施例中，BLyS拮抗劑包括這樣的多肽，其具有式I，式II，式III所示的序列，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQID NO5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO9)，和圖32中所示序列，如本文所述。可選，所述BLyS拮抗劑可與天然序列BR3的細胞外結構域在其BLyS結合區(qū)結合，以在體外、原位或體內(nèi)部分或完全阻斷、抑制和中和BLyS與BR3的結合。例如，所述間接拮抗劑是抗BR3抗體，所述抗體在包含人BR3的殘基23-38的BR3的區(qū)域結合或所述殘基的鄰近區(qū)域結合，使得人BR3與BLyS的結合發(fā)生空間位阻。
一些實施方案中，本發(fā)明的BLyS拮抗劑包括抗-BLyS抗體，免疫粘附素以及小分子。另一實施方案中，所述免疫粘附素包括BLyS受體的BLyS結合區(qū)(例如，BR3，BCMA和TACI的細胞外結構域)。另一實施方案中，所述免疫粘附素是BR3-Fc，或具有以下序列的多肽式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ IDNO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，或圖32所示序列，其可選融合或偶聯(lián)于免疫球蛋白的Fc部分。
根據(jù)一個實施方案，所述BLyS拮抗劑以結合親和力為100nM或更低的親和力結合BLyS多肽或BR3多肽。根據(jù)另一實施方案，所述BLyS拮抗劑以10nM或更低的親和力結合BLyS多肽或BR3多肽。根據(jù)另一實施方案，所述BlyS拮抗劑以1nM或更低的結合親和力與BLyS多肽或BR3多肽結合。
術語″BR3″，″BR3多肽″或″BR3受體″用于本文中包括″天然序列BR3多肽″和″BR3變體″(其在本文中進一步定義)?！錌R3″指包含任意以下氨基酸序列的那些多肽以及其同源物
(a)人BR3序列(SEQ ID NO_)
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRTPRPKP AGASS PAPRTALQPQ
61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD
121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
181 PEQQ
(b)可選人BR3序列(SEQ ID NO_)
1 MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGAAS SPAPRTALQP
61 QESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLR GASSAEAPDG
121 DKDAPEPLDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTA
181 GPEQQ
(c)鼠BR3序列(SEQ ID NO_)
1 MGARRLRVRS QRSRDSSVPTQCNQTECFDP LVRNCVSCEL FHTPD TGHTS SLEPGTALQP
61 QEGSALRPDVALLVGAPALLGLILALTLVGLVSLVSWRWRQQLRTASPDTSEGVQQESLE
121 NVFVPSSETPHASAPTWPPLKEDAD SALP.RHSVPVPATELGSTELVTTKTAGPEQ
(d)大鼠BR3序列(SEQ ID NO_)
1 MGVRRLRVRSRRSRDSPVST QCNQTECFDPLVRNCVSCEL FYTPE TRHAS SLEPGTALQP
61 QEGSGLRPDV ALLFGAPALLGLVLALTLVGLVSLVGWRWRQQRRTASLDTSEGVQQESLE
121 NVFVPPSETLHASAPNWPPFKEDADNILSCHSIPVPATELGSTELVTTKTAGPEQ和其變體或片段。本發(fā)明的BR3多肽可分離自多種來源，諸如人組織類型或其它來源，或通過重組和/或合成方法制備。術語BR3，包括WO 02/24909和WO 03/14294中描述的BR3多肽。
“天然序列”BR3多肽包含與從天然衍生的相應BR3多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。此種天然序列BR3多肽可從自然分離或通過重組和/或合成方法產(chǎn)生。術語“天然序列BR3多肽”具體包括該多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如可替換的剪接形式)和天然等位變體。本發(fā)明的BR3多肽包括包含人BR3的氨基酸殘基1-84的連續(xù)序列(contiguous sequence)或由人BR3的氨基酸殘基1-84的連續(xù)序列組成的BR3多肽。
BR3“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜和胞漿結構域的BR3多肽。BR3的ECD形式包括那些包含BR3的1至77位，2至62位，2至71位，1至61位，或2至63位氨基酸的多肽。
Mini-BR3是BR3的BLyS-結合結構域的26個殘基的核心區(qū)
TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR(SEQ ID_)
“BR3變體”指與天然序列全長BR3或BR3 ECD的氨基酸序列具有至少約80％的氨基酸序列同一性并與天然BLyS多肽結合的BR3多肽。任選地，BR3變體包括單一的半胱氨酸富集區(qū)。此種BR3變體多肽包括，例如，在全長氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個內(nèi)部結構域內(nèi)，添加或缺失一或多個氨基酸殘基的BR3多肽。也涉及與天然序列BlyS多肽結合的BR3 ECD的片段。通常，BR3變體多肽與人BR3多肽或其特定片段具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。BR3變體多肽不包括天然BR3多肽序列。一般，BR3變體多肽為至少大約10個氨基酸長度，通常至少大約20個氨基酸長度，更通常至少大約30個氨基酸長度，更通常至少大約40個氨基酸長度，更通常至少大約50個氨基酸長度，更通常至少大約60個氨基酸長度，更通常至少大約70個氨基酸長度，更通常至少大約80個氨基酸長度，更通常至少大約90個氨基酸長度，更通常至少大約100個氨基酸長度，更通常至少大約150個氨基酸長度，更通常至少大約200個氨基酸長度，更通常至少大約250個氨基酸長度，更通常至少大約300個氨基酸長度，或更多。
本文所用術語“TACI”或“TACI多肽”或“TACI受體”包括“天然序列TACI多肽”和“TACI變體”(在本文會繼續(xù)限定)?！癟ACI”是指由包含圖1A-1B所示的氨基酸序列，圖5B所示氨基酸1-246以及圖8所示氨基酸序列，包含圖1A-1B以及5A所示多核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽及其同系物，變體和片段，包含圖1A-1B和5A所示序列的核酸分子及其變體以及上述片段。本發(fā)明的TACI多肽可從各種來源，如從人組織類型或從其它來源分離，或用重組和/或合成方法制備。
“天然序列”TACI多肽包含與從天然衍生的相應TACI多肽相同的氨基酸序列的多肽。此種天然序列TACI多肽可從自然分離或通過重組和/或合成方法產(chǎn)生。術語“天然序列TACI多肽”具體包括該多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如可替換的剪接形式)和天然等位變體。本發(fā)明的TACI多肽包括但不限于von Bulow等，見上文和W098/39361，公開于1998年11月11日中所述的多肽，剪接變體(以上稱”hTACI(265)”并顯示于圖8中)，以及包含圖8所示第1-293位氨基酸殘基的連續(xù)序列的TACI多肽。
TACI“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜和胞漿結構域的TACI多肽。TACI的ECD形式包括yon Bulow等見上文、WO98/39361、WO00/40716、WO 01/85782、WO 01/87979、WO 01/81417所述的多肽，圖1的氨基酸殘基1-166，圖1的氨基酸殘基1-165，圖1的氨基酸殘基1-154，圖1的氨基酸殘基1-114，圖5B的氨基酸殘基1-119，圖5B的氨基酸殘基1-120，圖5B的氨基酸殘基1-126。
“TACI”變體指與天然序列全長TACI或TACI ECD的氨基酸序列具有至少約80％的氨基酸序列同一性并與天然序列BLyS結合的TACI多肽。此種TACI變體多肽包括，例如，在全長氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個內(nèi)部結構域內(nèi)，添加或缺失一或多個氨基酸殘基的TACI多肽。也涉及與天然序列BLyS多肽結合的TACI ECD片段。通常，TACI變體多肽與圖1A所示的核酸分子或其具體片段編碼的TACI多肽具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。TACI變體多肽不包括天然TACI多肽序列。一般，TACI變體多肽為至少大約10個氨基酸長度，通常至少大約20個氨基酸長度，更通常至少大約30個氨基酸長度，更通常至少大約40個氨基酸長度，更通常至少大約50個氨基酸長度，更通常至少大約60個氨基酸長度，更通常至少大約70個氨基酸長度，更通常至少大約80個氨基酸長度，更通常至少大約90個氨基酸長度，更通常至少大約100個氨基酸長度，更通常至少大約150個氨基酸長度，更通常至少大約200個氨基酸長度，更通常至少大約250個氨基酸長度，更通常至少大約300個氨基酸長度，或更多。
本文所用術語“BCMA”或“BCMA多肽”或“BCMA受體”包括“天然序列BCMA多肽”和“BCMA變體”(在本文會繼續(xù)限定)?！癇CMA”是指由以下物質(zhì)所編碼的多肽包含圖2所示的多核苷酸序列的核酸分子，其變體，包含圖2所示序列的核酸分子，其變體，及上述物質(zhì)的片段。本發(fā)明的BCMA多肽可從各種來源，如從人組織類型或從其它來源分離，或用重組和/或合成方法制備。
“天然序列”BCMA多肽包含與從天然衍生的相應BCMA多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。此種天然序列BCMA多肽可從自然分離或通過重組和/或合成方法產(chǎn)生。術語“天然序列BCMA多肽”具體包括天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如可替換的剪接形式)和天然等位變體。本發(fā)明的BCMA多肽包括在Laabi等，EMBO J.，113897-3904(1992)；Laabi等，Nucleic Acids Res.，221147-1154(1994)；Gras等，Int.Immunology，71093-1106(1995)；Madry等，Int.Immunology，101693-1702(1998)中所述多肽；和包含圖2(SEQ ID NO4)第1-184位氨基酸殘基所示連續(xù)序列的BCMA多肽。
BCMA“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜和胞質(zhì)結構域的BCMA多肽。的ECD形式包括Laabi等，EMBO J.，113897-3904(1992)；Laabi等，Nucleic Acids Res.，221147-1154(1994)；Gras等，Int.Immunology，71093-1106(1995)；Madry等，Int.Immunology，101693-1702(1998)所述的多肽，圖2的氨基酸殘基4-55，圖2的氨基酸殘基1-48，圖2的氨基酸殘基8-41，圖2的氨基酸殘基4-51，或圖2的氨基酸殘基21-53。
“BCMA變體”指與天然序列BCMA或BCMA ECD的氨基酸序列具有至少大約80％的氨基酸同一性并與天然序列BLyS結合的BCMA多肽。此種BCMA變體多肽包括，例如，在全長氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個內(nèi)部結構域內(nèi)，添加或缺失一或多個氨基酸殘基的BCMA多肽。也考慮與天然序列BLyS結合的BCMA ECD片段。通常，BCMA變體多肽與圖2所示的核酸分子或其特定片段編碼的BCMA多肽具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。BCMA變體多肽不包括天然BCMA多肽序列。通常，BCMA變體多肽為至少大約10個氨基酸長度，通常至少大約20個氨基酸長度，更通常至少大約30個氨基酸長度，更通常至少大約40個氨基酸長度，更通常至少大約50個氨基酸長度，更通常至少大約60個氨基酸長度，更通常至少大約70個氨基酸長度，更通常至少大約80個氨基酸長度，更通常至少大約90個氨基酸長度，更通常至少大約100個氨基酸長度，更通常至少大約150個氨基酸長度，更通常至少大約200個氨基酸長度，更通常至少大約250個氨基酸長度，更通常至少大約300個氨基酸長度，或更多。
BAFF在脾，淋巴結，PBL，單核細胞，巨噬細胞，DC，T細胞，K562，HL-60和G361中表達。APRIL通常在脾，胰腺，結腸中微弱表達。APRIL在PBL以及各種腫瘤細胞系和組織中表達。BCMA在脾，淋巴結，胸腺，PBL，肝，腎上腺和B細胞中表達。TACI在脾，胸腺，PBL，小腸，B細胞以及活化的T細胞中表達。BAFF-R在脾，淋巴結，胸腺，PBL，B細胞中表達。BAFF-R在靜息T細胞中低水平表達(Mackay和Browning，July 2002，Nature Reviews，Immunology，2465-475)。
氨基酸可根據(jù)它們側(cè)鏈性質(zhì)的相似性如下分組(在A.L.Lehniger，Biochemistry，第二版，73-75頁，Worth Publishers，New(1975))
(1)非極性氨基酸Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)
(2)不帶電極性氨基酸Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)
(3)酸性氨基酸Asp(D)，Glu(E)
(4)堿性氨基酸Lys(K)，Arg(R)，His(H-)
可選，天然存在的殘基基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)分組
(1)疏水氨基酸正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性親水氨基酸Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性氨基酸Asp，Glu；
(4)堿性氨基酸His，Lys，Arg；
(5)影響鏈方向的殘基Gly，Pro；
(6)芳香族氨基酸Trp，Tyr，Phe。
本文術語“保守”氨基酸取代意指取代功能等同氨基酸的氨基酸取代。保守氨基酸改變導致所得肽的氨基酸序列的沉默改變。例如，一或多種極性相似的氨基酸作為功能等同物并導致該肽的氨基酸序列中的沉默改變。通常一個組中的取代被認為在結構和功能上保守。然而，本領域技術人員認識到具體殘基的作用通過其在其所出現(xiàn)的分子的三維結構中的背景決定。例如Cys殘基可以以氧化(二硫化物)形式出現(xiàn)，該形式比還原(硫醇)形式的極性要小。Arg側(cè)鏈的長脂肪族部分可構成其結構和功能作用的重要性質(zhì)，并且這可通過非極性而不是其它堿性殘基的取代而最好地得以保守。此外，還認識到含有芳香族基團(Trp，Tyr，和Phe)的側(cè)鏈可參與非離子-芳香族或“陽離子-pi”反應。在這些情況中，用酸性或不帶電的極性基團成員取代這些側(cè)鏈之一可在結構和功能上保守。殘基諸如Pro，Gly，和Cys(二硫化物形式)對于主鏈構型有直接作用，并通常在取代時發(fā)生變形。
在此鑒定的配體或受體多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為在比對序列及必要時引入缺口以獲得序列同一性的最大百分比，且不考慮作為序列同一性的部分的任何保守取代時，候選序列中與在此鑒定的配體或受體序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。旨在確定氨基酸序列同一性百分比的比對可以通過本領域技術人員所掌握的多種途徑完成，例如使用公開的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員已知用于測定比對所需的適合參數(shù)，包括能獲得對全長比對序列的最大比對所需的任意算法。為此目的，氨基酸序列同一性百分比可通過使用序列比對的計算機程序ALIGN-2得到，ALIGN-2程序的完全源代碼由下表提供。ALIGN-2序列比對計算機程序由Genentech，Inc.授權，其源代碼已連同用戶手冊提交美國版權局，華盛頓特區(qū)，20559，在美國版權局注冊號碼TXU5 10087。該ALIGN-2程序可從Genetech，Inc.，South San Francisco，CA公開得到，或自下表中提供的源代碼編輯。ALIGN-2程序應以用于UNIX操作系統(tǒng)的方式編輯，優(yōu)選digital UNIX V4.0D。所有序列比對參數(shù)由ALIGN-2程序設定，沒有改變。
一種鑒別蛋白質(zhì)中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點引入進一步的或其他的變體而改進。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但突變本身不必是預定的。例如，為分析在指定位點處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機誘變，并篩選所表達的具有預期活性的變體。
術語″二面角″指鍵的旋轉(zhuǎn)。見例如，Creighton，T.E.，(1993)ProteinStructures和Molecular Properties，2 ed.，W.H.Freeman和Company，New York，NY。
術語″phi，″是二面角，表示氨基酸N-Cα鍵的旋轉(zhuǎn)。見例如，Creighton，T.E.，(1993)ProteinStructures和Molecular Properties，2 ed.，W.H.Freeman和Company，New York，NY。
I型β轉(zhuǎn)角在Hutchinson，例如&Thornton，J.M.(1994)A revised set ofpotentials for beta turn formation in proteins.Protein Science 3，2207-2216中描述。
″融合蛋白″和″融合多肽″指具有兩個共價連接的部分的多肽，其中每個部分都是具有不同性質(zhì)的多肽。所述性質(zhì)可以是生物性質(zhì)，諸如體外或體內(nèi)活性。所述性質(zhì)可以是簡單的化學或物理性質(zhì)，諸如與靶分子結合，催化反應等。所述兩部分可通過單個肽鍵直接連接或通過含有一或多個氨基酸殘基的肽接頭連接。通常，所述兩個部分和接頭位于相同的讀框中。
“偶聯(lián)物”指任何雜合分子，包括融合蛋白以及含有氨基酸或蛋白質(zhì)部分以及非蛋白質(zhì)部分的分子。偶聯(lián)物可通過本領域已知各種技術合成，例如，重組DNA技術，固相合成，溶液相合成，有機化學合成技術，以及這些技術的組合。合成的選擇有賴于將被產(chǎn)生的具體分子。例如，性質(zhì)上不完全是“蛋白質(zhì)”的雜合分子可通過重組技術以及溶液相技術的組合來合成。
在本文中術語“免疫粘附素”定義為抗體樣分子，其將異源“粘附素”蛋白的結合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應器功能組合。結構上，免疫粘附素包括具有所需結合特異性之粘附素氨基酸殘基與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合，所述粘附素氨基酸不同于抗體的抗原識別和結合位點(即“異源性的”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是包括受體或配體的至少一個結合位點的鄰接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。例如，本發(fā)明中有用的免疫粘附素是包含BLyS受體的BLyS結合部分而不含有BLyS受體的跨膜或胞質(zhì)序列的多肽。一個實施方案中，BR3，TACI或BCMA的細胞外結構域融合于免疫球蛋白序列的恒定區(qū)。例如，本發(fā)明的小鼠BR3-Fc免疫粘附素和人BR3-Fc免疫粘附素可由下式表示
mBR3-Fc(SEQ ID NO.1)
MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHH TEKSLSHSPGK
hBR3-hIgGl Fc(SEQ ID NO.2)
MSALLILALVGAAVASTRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
“化療制劑”是在腫瘤治療中使用的化學化合物?；熤苿嵗ㄍ榛瘎?，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，道諾紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(氨基glutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(氨基levulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；elliptinium acetate；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；nitracrine；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；navelbine；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-1l；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。
本文中術語“細胞毒制劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術語旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和镥的放射性同位素)，化療制劑例如氨甲蝶呤，阿霉素，長春花生物堿(長春新堿(vincristine)，長春堿(vinblastine)，依托泊苷(etoposide)，阿霉素(doxorubicin)，美法侖(melphalan)，絲裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑，酶及其片段諸如核酸裂解酶，抗生素，以及毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括它們的片段和/或變體，以及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌藥。其它細胞毒藥劑在下文描述。
本文中“生長抑制劑”是指在體內(nèi)或體外抑制細胞(具體是表達CD20的癌癥細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期PSCA表達細胞百分比的藥物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期(在除S期以外的階段)進展的藥物，例如誘導G1停滯和M期停滯的藥物。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新堿和長春花堿)，紫杉烷類(taxanes)和topo II抑制劑如阿霉素、柔紅菌素、依托泊甙和博來霉素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶(spill over)使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強的松、達卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見“癌癥的分子基礎”Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為“細胞周期調(diào)節(jié)，腫瘤和抗腫瘤藥物”的文章(WBSaundersPhiladephia，1995)，尤其見第13頁。紫杉烷類(taxanes)(紫杉醇(paclitaxel)和多兩紫杉醇(docetaxel))都是來源于紅豆杉(yew tree)的抗癌藥。多西紫杉醇l(TAXOTERE(E)，Rhone-Poulenc Rorer)，來源于歐洲紅豆杉(Europeanyew)，是紫杉醇的半合成類似物(TAXOL，Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西紫杉醇促進微小管自微管蛋白二聚體的聚集并通過防止解聚作用來穩(wěn)定微小管，其導致細胞中的有絲分裂被抑制。
術語“哺乳動物”是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人類，馴養(yǎng)動物和農(nóng)場動物，以及動物園動物，競技動物，或?qū)櫸飫游?，例如狗，馬，貓，牛等，優(yōu)選的是，該哺乳動物是人類。
術語“治療有效量”指有效“緩解”或“治療”個體或哺乳動物的疾病的藥物的量。對于癌癥，此藥物治療有效量可減少癌細胞的數(shù)量；減小腫瘤體積；抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)癌細胞對周圍器官的浸潤；抑制(例如減慢到一定程度并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與癌癥相關的一種或多種癥狀。見下文定義“治療的”。根據(jù)阻止癌細胞的生長和/或殺死已有癌細胞的程度，該藥物可以是抑制細胞生長和/或細胞毒作用的。
本發(fā)明的抗-CD20抗體可通過瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核宿主細胞諸如CHO細胞來制備。
本文使用的“載體”包括對于以所用劑量和濃度與其接觸的細胞或哺乳動物無毒的可藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑。通常生理學上可接受的載體是含水的pH緩沖溶液。生理學上可接受的載體的例子包括諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽，和其它有機酸在內(nèi)的緩沖液；包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(不超過10個殘基)多肽；諸如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體；諸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸等氨基酸；單糖，二糖，和包括葡萄糖，甘露糖，或糊精等其它糖類；諸如EDTA等螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇等糖醇；諸如鈉等成鹽反離子；和/或諸如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICSTM等非離子表面活性劑。
1.多肽BLyS拮抗劑
可用作BLyS拮抗劑的多肽包括，例如，稱為TALL-112-3的多肽，如WO 02/092620中的SEQ ID No.123，其氨基酸序列如下
MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWIDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.10)
該多肽結合BLyS并抑制BR3與BLyS的結合。
一些實施方案中，17-mer肽是可溶的(優(yōu)選不是膜結合的)，并可用作核心序列或與多種下述的結構結合或偶聯(lián)。所述17-mer多肽中的一些氨基酸被隨機化，并篩選其中的保守和非保守取代。如本領域技術人員所理解以及本文所述，添加和取代可在有限基礎上實現(xiàn)而不會損害BLyS與所得17mer肽以及包含所得17mer肽的構建體的結合。允許產(chǎn)生BLyS結合功能的取代的指南在下文以及實施例中提供。在一些實施方案中，結構或結合親和力中涉及的殘基是保守的，意思是氨基酸同一性被保持或進行了保守殘基取代，如下文結構式以及說明書中所述。
本發(fā)明的BLyS多肽拮抗劑包含選自以下序列組成的組的序列式I，式II，式III，圖32所示序列，
ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQID NO 9)，及其混合物。
本發(fā)明一個方面中，所述多肽包括式I
X1-CN-X3-D-X5-L-X7-X8-X9-X10-X11-X12-CT-X14-X15-X16-X17(式I)的氨基酸序列，
其中X1，X3，X5，X7，X8，X9，X10，X11，X12，X14，X15和X17是除半胱氨酸以外的氨基酸；和
其中X16是選自下組的氨基酸L，F(xiàn)，I或V；其中所述多肽不包含位于式I中N末端至CN(半胱氨酸N末端)以及C末端至CT(半胱氨酸C末端)的7個氨基酸殘基中的半胱氨酸。
一些實施方案中，包含式I的序列的多肽具有通過二硫鍵連接的CN和CT；X5LX7X8形成具有位于L和X7之間的轉(zhuǎn)角中心的I型β轉(zhuǎn)角結構；并且X8的phi的二面角值為正的。
一些實施方案中，X10選自W，F(xiàn)，V， L，I，Y，M以及非極性氨基酸組成的組。一些實施方案中，X10是W。一些實施方案中，X3是選自M，V，L，I，Y，F(xiàn)，W和非極性氨基酸組成的組。一些實施方案中，X5選自V，L，P，S，I，A和R組成的組。一些實施方案中，X7選自V，T，I和L組成的組。一些實施方案中，X7不是T或I。一些實施方案中，X8是選自R，K，G，N，H和D氨基酸組成的組中的任意氨基酸。一些實施方案中，X9選自H，K，A，R和Q組成的組。一些實施方案中，X11是I或V。一些實施方案中，X12選自P，A，D，E和S組成的組。一些實施方案中，X16是L。
具體實施方案中，式I的序列是選自下組的序列ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ IDNO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)。
本發(fā)明另一方面中，所述多肽包含式II的氨基酸序列
X1-CN-X3-D-X5-L-V-X8-X9-W-X11-X12-CT-X14-X15-L-X17(式II)(
其中X1，X3，X5，X8，X9，X11，X12，X14，X15和X17是除半胱氨酸以外的任意氨基酸；其中所述多肽不包含位于式II中N末端至CN(半胱氨酸N末端)的以及C末端至CT(半胱氨酸C末端)的7個氨基酸殘基中的半胱氨酸。
一些實施方案中，包含式II的序列的多肽具有通過二硫鍵連接的CN和CT；X5LX7X8形成具有位于L和X7之間的轉(zhuǎn)角中心的I型β折疊結構；并且X8的phi的二面角值為正的。
式II的一些實施方案中，X3是選自M，A，V，L，I，Y，F(xiàn)，W和非極性氨基酸組成的組。式II的一些實施方案中，X5選自V，L，P，S，I，A和R組成的組。式II的一些實施方案中，X8選自R，K，G，N，H和D-氨基酸組成的組。式II的一些實施方案中，X9選自H，K，A，R和Q組成的組。式II的一些實施方案中，X11選自I和V組成的組。式II的一些實施方案中，X12選自P，A，D，E和S組成的組。
其它方面，所述多肽包含選自圖32所示序列中的任意序列。
本發(fā)明另一方面包括含有式III的氨基酸序列的多肽
E-CN-F-D-X5-L-V-X8-X9-W-V-X12-CT-X14-X15-X16-X17(式III)(
其中X5，X8，X9，X12，X14，X15和X17是除外半胱氨酸的任何氨基酸；
其中X16是選自L，F(xiàn)，I和V組成的組的任何氨基酸；其中所述多肽在式III的N末端至CN(半胱氨酸N末端)以及C末端至CT(半胱氨酸C末端)的7個氨基酸殘基中不包含半胱氨酸；其中CN和CT通過二硫鍵鍵合。
式III的一些實施方案中，包含式III的毗連序列(contiguous sequence)的多肽具有位于CN和CT之間的二硫鍵，并形成I型β轉(zhuǎn)角結構，轉(zhuǎn)角中心位于X5LVX8的L和V之間；并且X8的二面角phi為正值。
式III的一些實施方案中，X5，X8，X9，X12，X14，X15和X17選自L，P，H，R，I，T，N，S，V，A，D，和G組成的組。式III的一些實施方案中，Xs是L，X8是R。式III的一些實施方案中，X9選自H，K，A，S，R和Q組成的組。式III的一些實施方案中，X12選自P，A，D，E和S組成的組。式III的一些實施方案中，X12是P。式III的一些實施方案中，X16是L。
具體實施方案中，式III的序列選自ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ IDNO.5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO.6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO.7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQID NO.8)和ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO.9)組成的組。
還包括含有選自下組的毗連多肽序列的多肽ECFDLLVRAWVPCSVLK，ECFDLLVRHWVPCGLLR，ECFDLLVRRWVPCEMLG ECFDLLVRSWVPCHMLR和ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO.5-9)。本發(fā)明還涉及含有選自圖32所示序列之一的多肽。含有圖32所示序列之一的多肽優(yōu)選通過二硫鍵連接序列的半胱氨酸。一些實施方案中，所述序列的第5和第8個殘基之間的序列形成I型β轉(zhuǎn)角結構，轉(zhuǎn)角中心為與L和X7之間，并且第八個殘基的二面角phi具有正值。
一些實施方案中，本發(fā)明的BlyS多肽是毗連序列(contiguous sequence)。本發(fā)明還涉及包含與選自下組的毗連17mer多肽序列具有至少88％序列同一性的多肽ECFDLLVRAWVPCSVLK，ECFDLLVRHWVPCGLLR，ECFDLLVRRWVPCEMLG，ECFDLLVRSWVPCHMLR和ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NOs 5-9)。其它實施方案中，經(jīng)比對，序列同一性至少64％，以及直到100％的每個連續(xù)整數(shù)，以提供最大同源性。為提供最大同源性的比對后，同源性由于序列缺口以及短于本發(fā)明17mer的序列而降低。N或C末端延長或插入都不應被理解成降低同源性。
根據(jù)本發(fā)明一些實施方案，所述多肽長度小于50個氨基酸，小于25個氨基酸，或為17-mer。
一些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含向式I，式II，式III的序列的N-末端，C-末端或序列的N-末端以及C-末端添加的多肽序列，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQID NO 9)，或圖32所示序列。所述添加的多肽序列與天然序列BR3多肽異源，并包括例如免疫球蛋白Fc部分。
本發(fā)明另一方面中，所述BlyS拮抗劑多肽包含至少一種，并更優(yōu)選超過一種含有序列式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQID NO 7)， ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，或圖32所示序列的多肽。相連在一起的多肽可具有相同或不同序列。一些實施方案中，這些多肽可選通過利用接頭相互連接。所述接頭作為間隔物并可由各種化合物組成。一些實施方案中，所述接頭多肽具有大約1-50個氨基酸，更優(yōu)選約1-30個氨基酸。接頭序列是本領域技術人員已知的。例如，接頭序列包括GGGKGGGG和GGGNSSGG等。具體實施方案中，所述連接在一起的多肽包含相同序列并含有式PP1-L1-PP1-L2-PP1，其中PP1包含選自以下序列組成的組的氨基酸序列序列式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，和圖32所示序列，L1和L2是序列不同的接頭序列。
BLyS的與BR3結合的拮抗劑，諸如本發(fā)明所述多肽，優(yōu)選以等同或高于天然BR3序列的親和力與BLyS結合，諸如SEQ ID NO的BR3 ECD或SEQ ID NO的微-BR3。一些實施方案中，具有以下序列的多肽與BLys的結合親和力為大約100nM或更低，優(yōu)選10nM或更低，或1nM或更低式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO8)；ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQID-NO 9)，或圖32所示序列。一種測定結合親和力的方法在實施例中提供。
本發(fā)明所用發(fā)現(xiàn)BLyS拮抗劑的方法包括鑒定，修飾和選擇性隨機化BR3的17個殘基的核心序列。所用具體技術在下文以及實施例中描述。一些實施方案中，位置X2的N末端半胱氨酸殘基(CN)以及位置X13的C-末端半胱氨酸(CT)是保守的并優(yōu)選形成二硫橋。一些實施方案中，CN和CT通過10個毗連氨基酸分離。優(yōu)選，所述17mer序列在位置X2和X13以外不含有任何半胱氨酸殘基。此外，如果所述17mer包含在較大結構中，側(cè)接該17mer的序列優(yōu)選在CN或CT的7個氨基酸中不包括任何半胱氨酸殘基。X10用除外半胱氨酸的任何非極性氨基酸取代；例如W，F(xiàn)，V，L，I，Y或M。一些實施方案中，X10是W。
一些實施方案中，基序D-Xs-L-X7是保守的，這是由于證實了其對BLys結合的貢獻。一些實施方案中，位于CN和CT之間的β-轉(zhuǎn)角在X4和X7之間形成。一些實施方案中，β-轉(zhuǎn)角的中心位于L-X7之間。一些實施方案中，本發(fā)明17mer肽的結構通常為I型β-轉(zhuǎn)角連接的兩條β鏈，形成由CN和CT之間的二硫鍵連接的β-發(fā)夾結構。此外，一些實施方案中，殘基X8的二面角phi為正值，以適應β發(fā)夾結構中的I型β-轉(zhuǎn)角。
其它結構信息表明X4處的D和X6處的L埋在BLyS-BR3復合體的BLyS-BR3界面中。一些實施方案中，這些殘基是保守的。X7處的殘基也包埋在BLyS-BR3界面中。一些實施方案中，X7選自V，T，I和L組成的組。一些實施方案中，X7優(yōu)選是V。一些實施方案中，X4-X7的基序是DLLV。
一些實施方案中，所述BLyS拮抗劑的結合區(qū)長度為17個氨基酸。一些實施方案中，所述多肽BLyS拮抗劑是17個氨基酸。一些實施方案中，四氨基酸，X14-X17，在C-末端的CT之后。一些實施方案中，當17mer是結合的并且是保守的時，X16與BLyS形成疏水接觸。一些實施方案中X16是L。
2.多核苷酸，載體，宿主細胞
根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的BLyS拮抗劑多肽選自以下物質(zhì)組成的組本文所述17mer肽，納入一或多個17mer肽作為核心區(qū)域的多肽，以及所述17mer肽和多肽的共價修飾的形式(例如，免疫粘附素，標記的多肽，保護的多肽，偶聯(lián)的多肽，融合蛋白等)。各種用于制備這些形式的多肽的技術在本文描述。標記多肽以及將分子與多肽偶聯(lián)的方法是本領域已知的。
本發(fā)明的組合物可利用本領域已知的重組技術制備。以下說明涉及制備所述多肽的方法，所述方法通過培養(yǎng)用含有所述編碼核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，從細胞培養(yǎng)回收所述多肽來進行(見，例如，Sambrook etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)；Dieffenbach et al.，PCR PrimerA LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995))。
編碼所需多肽的核酸(例如，cDNA或基因組DNA)可插入可復制載體進行進一步克隆(DNA的擴增)或表達。各種載體可公開得到。所述載體成分通常包括，但不限于，以下一或多種信號序列，復制起點，一或多種標記基因，增強子元件，啟動子以及轉(zhuǎn)錄終止序列，其中每一種都在下文描述?？墒褂玫目蛇x信號序列，復制起點，標記基因，增強子元件以及轉(zhuǎn)錄終止序列是本領域已知的并進一步在WO97/25428中詳細描述。
表達和克隆載體通常含有宿主細胞識別的啟動子，并與編碼核酸序列可操作地連接。啟動子是位于結構基因(通常為約100-1000bp)的起始密碼子上游(5′)的非翻譯序列，其控制與其可操作連接的具體核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。所述啟動子通常分成兩類，可誘導型和構成型?？烧T導型啟動子是這樣的啟動子，其應答于培養(yǎng)條件的某些改變例如營養(yǎng)成分的存在或缺失或者溫度的改變而啟動在它們的控制下的增加的DNA轉(zhuǎn)錄水平。此時，各種潛在宿主細胞識別的大量啟動子是已知的。這些啟動子通過限制酶消化從源DNA去除所述啟動子并將該啟動子序列插入所述載體，從而與編碼DNA可操作相連。
包含上述一或多個組分的合適載體的構建可以利用標準連接技術。分離的質(zhì)?；駾NA片段經(jīng)過切割，修剪(tailored)，并重新連接為所需形式，以便產(chǎn)生所需質(zhì)粒。為了通過分析來證實所構建的質(zhì)粒中的正確序列，可用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31，446)，并用相應的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇成功的轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切核酸酶消化來分析，和/或用Messing等，Nucleic Acids Res.，9309(1981)所述方法或Maxam等，Methods in Enzymology，65499(1980)所述方法測序。
可采用提供編碼DNA在哺乳動物細胞中的瞬時表達的表達載體。通常，瞬時表達涉及利用能夠在宿主細胞中有效復制的表達載體，使得所述宿主細胞聚集許多拷貝的表達載體，并由此合成高水平的該表達載體編碼的所需多肽[Sambrook et al.，同上]。包含適宜表達載體和宿主細胞的瞬時表達系統(tǒng)允許方便地陽性鑒定克隆的DNA編碼的多肽，以及快速篩選所述多肽的所需生物或生理特性。
其它適合用于在重組脊椎動物細胞培養(yǎng)物中合成所需多肽的方法，載體和宿主細胞在Gething etal.，Nature，293620-625(1981)；Mantei etal.，Nature，28140-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058中描述。
克隆或表達本文所述載體中DNA的適宜宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬(Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266，710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠菌假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈霉菌(Streptomyces)。優(yōu)選，所述宿主細胞應分泌最小量的蛋白水解酶。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于載體的克隆或表達宿主。適宜表達糖化多肽的宿主細胞來自多細胞生物體。所述宿主細胞的實例在WO 97/25428中進一步描述。
宿主細胞用上述表達或克隆載體轉(zhuǎn)染或優(yōu)選轉(zhuǎn)化，并培養(yǎng)在經(jīng)改造適于誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需序列的基因的培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)染是指由宿主細胞攝取表達載體，而不論事實上是否表達了任何編碼序列。多種轉(zhuǎn)染方法是本領域普通技術人員已知的，例如，CaPO4沉淀和電穿孔。成功的轉(zhuǎn)染一般在宿主細胞中出現(xiàn)關于該載體運行的任何征兆時可以予以識別。
轉(zhuǎn)化是指，將DNA引入生物體，使DNA能夠作為染色體外元件或以染色體整合體的形式復制。根據(jù)所用的宿主細胞，用適合于所述細胞的標準技術進行轉(zhuǎn)化。利用氯化鈣進行鈣處理的方法(見Sambrook等，出處同上)或電穿孔常用于包含堅固的細胞壁屏障的原核細胞或其它細胞。用根癌土壤桿菌進行的感染可以用于轉(zhuǎn)化一些植物細胞，參見Shaw等，Gene，23315(1983)以及1989年6月29日公開的WO 89/05859。此外，植物可以用1991年1月10日公開的WO 91/00358中所述的超聲處理方法進行轉(zhuǎn)染。
對于沒有所述細胞壁的哺乳動物細胞，優(yōu)選Graham等，Virology，52456-457(1978)所述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的綜述見1983年8月16日公布的美國專利4,399,216。酵母轉(zhuǎn)化通常根據(jù)Van Solingen等，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763829(1979)所述方法進行。但也可使用將DNA引入細胞中的其它方法，如核顯微注射、電穿孔、使細菌原生質(zhì)體與完整無損的(intact)細胞融合，或聚陽離子如polybrene，聚鳥氨酸等。哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化的各種技術可參見Keown等，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour等，Nature，336348-352(1988)。
真核細胞可以在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通常在Sambrook等見上文描述。市售培養(yǎng)基的實例包括Ham′s F10(Sigma)，基本必需培養(yǎng)基((MEM)Sigma)，RPMI-1640(Signma)，和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于培養(yǎng)所述宿主細胞。任何上述培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長因子(如胰島素，運鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸腺嘧啶)，抗生素(如GentamycinTM)，痕量元素(定義為通常以微摩爾水平的終濃度出現(xiàn)的無機化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以包括本領域技術人員已知的適當濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng)條件，如溫度，pH等，都是前面在選定的表達宿主上用到的那些，并且對本領域技術人員而言也是顯而易見的。
通常，使哺乳動物細胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)能力最大化的原則、方案、以及具體技術可以參見Mammalian Cell Biotechnologya Practical Apprcach，M.Butler，編(IRL Press，1991)。
所表達的多肽可從培養(yǎng)基中作為分泌的多肽回收，但當直接產(chǎn)生而沒有分泌信號時也可從宿主細胞裂解物回收。如果所述多肽是膜結合的，其可利用適宜的洗滌溶液(例如Triton-X 100)從膜釋出，或其細胞外區(qū)域可通過酶裂解來釋放。
當多肽是在重組細胞中產(chǎn)生而不是從人源產(chǎn)生時，其完全不含人源蛋白或多肽。但必需從重組細胞蛋白或多肽純化所述多肽，以獲得本質(zhì)上均一的制劑。第一步，可以使培養(yǎng)基或裂解物離心以除去微粒狀細胞殘渣。然后以下舉例說明的適宜純化方法在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅或諸如DEAE的陽離子交換樹脂上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如Sephadex G-75進行凝膠過濾；和蛋白ASepharose柱以除去污染物如IgG。
噬菌體展示
根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的多肽選自以下物質(zhì)組成的組式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ IDNO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，以及圖32所示序列，其可用于噬菌體展示。
利用噬菌體展示技術允許產(chǎn)生較大的蛋白質(zhì)變體文庫，其可用于迅速分選與靶分子高親和力結合的那些序列。編碼變體多肽的核酸融合于編碼病毒外殼蛋白的核酸序列，諸如基因III蛋白質(zhì)或基因VIII蛋白質(zhì)。其中編碼蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列與編碼部分基因III蛋白質(zhì)的核酸序列融合的單價噬菌體展示系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)。(Bass，S.，Proteins，8309(1990)；Lowman和Wells，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，3205(1991))。在單價噬菌體展示系統(tǒng)中，基因融合低水平表達并且野生型基因III蛋白質(zhì)也表達使得保持所述顆粒的感染性。產(chǎn)生肽文庫以及篩選所述文庫的方法在許多專利中公開(例如美國專利5,723,286，美國專利5,432,018，美國專利5,580,717，美國專利5,427,908和美國專利5,498,530)。
一些實施方案中，式I，式II或式III作為肽文庫在噬菌體上表達。隨后基于BLys結合篩選表達式I，式II或式III的多肽的文庫的噬菌體。一些實施方案中，所述選擇步驟包括允許一些噬菌體與生物素化的BLys結合，所述BLys隨后與neutravidin板結合。通過BLyS-生物素-neutravidin的結合，與該板結合的噬菌體被回收并增殖。一些實施方案中，對所述噬菌體進行7輪選擇。一些實施方案中，所述噬菌體與BLyS-生物素保溫，然后加入非生物素化的BLyS作為競爭結合物。噬菌體展示在本發(fā)明中的應用的其它指導在實施例中給出。
融合或偶聯(lián)異源多肽的多肽
還涉及包含本發(fā)明多肽的免疫粘附素分子在本發(fā)明方法中的用途。一些實施方案中，所述分子包含本發(fā)明的多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白具體區(qū)域的融合物。對于二價形式的免疫粘附素，所述融合物通常包含IgG分子的Fc區(qū)。在另一實施方案中，所述Fc區(qū)來自人IgG1分子。一些實施方案中，所述免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的鉸鏈區(qū)，CH2和CH3，或鉸鏈區(qū)，CH1，CH2和CH3區(qū)。關于制備免疫球蛋白融合物，也參見美國專利5,428,130，1995-6-27公開以及Chamow et al.，TIBTECH，1452-60(1996)。
最簡單和最直接的免疫粘附素設計通常將本發(fā)明粘附素(例如本發(fā)明的拮抗劑多肽)的結合結構域和免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)結合。例如，包含序列式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ IDNO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，或圖32所示序列的多肽可共價連接于免疫球蛋白的Fc部分。此外，這些多肽中的一或多種可相互連接并連接于免疫球蛋白Fc部分。
通常，制備本發(fā)明的免疫粘附素時，編碼粘附素結合結構域的核酸將以C末端與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列的N末端的核酸融合，而N末端融合也是可能的。
典型地，在所述融合中，所編碼的嵌合多肽會保留至少具有功能活性的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的鉸鏈，CH2和CH3區(qū)。也可產(chǎn)生與恒定區(qū)Fc部分的C-末端，或重鏈CH1的臨近N-末端或輕鏈的對應區(qū)域的融合物。融合所在的精確位置是不嚴格的；特別的位點是眾所周知的并可選以最優(yōu)化免疫粘附素的生物活性，分泌或結合特性。
在優(yōu)選方案中，將粘附素序列融合到免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc區(qū)域的N-末端?？蓪⒄麄€重鏈恒定區(qū)融合到粘附素序列。然而，更優(yōu)選地，在融合物中應用開始于鉸鏈區(qū)，剛好位于化學限定IgG Fc的木瓜蛋白酶剪切位點上游的序列(即殘基216，將重鏈恒定區(qū)的第一個殘基作為114)或其它免疫球蛋白的類似位點。在特別優(yōu)選實施方案中，將所述粘附素氨基酸序列融合到IgG重鏈的(a)鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)，或(b)鉸鏈區(qū)，CH1，CH2和CH3區(qū)。
對于雙特異性免疫粘附素，該免疫粘附素作為多聚體，特別作為異源二聚體或異源四聚體組裝。一般，這些組裝的免疫球蛋白會具有已知的單位結構?；镜乃逆溄Y構單位是IgG，IgD和IgE存在的形式。在較高分子量的免疫球蛋白中重復一種四鏈單位；IgM通常以四個基本單位通過二硫鍵抱團的五聚體存在。IgA球蛋白，偶爾是IgG球蛋白，也會以血清中的多聚體形式存在。在多聚體情況下，每個四單位可相同或不同。
本文范圍內(nèi)多個舉例組裝的免疫粘附素見如下圖表示意
(a)ACL-ACL；
(B)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；
(C)ACL-ACH-(ACL-ACH，ACL-VHCH，VLCL-ACH，或VLCL-VHCH)；
(D)ACL-VHCH-(ACH，或ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；
(E)VLCL-ACH-(ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；和
(F)(A-Y)N-(VLCL-VHCH)2，
其中每個A代表同一或不同的多肽，其包含氨基酸序列式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR者(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，或圖32所示序列，或其組合；
VI為免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；
VH為免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；
CL為免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)；
CH為免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)；
N為大于1的整數(shù)；
Y命名的是共價交聯(lián)劑的殘基。
為簡短起見，前述結構只表現(xiàn)出主要性質(zhì)；它們不表示免疫球蛋白的連接區(qū)(J)或其它結構域，也不顯示二硫鍵。然而，當所述結構域?qū)Y合活性所必需時，它們將被構建在免疫球蛋白分子中其所占據(jù)的常規(guī)(ordinary)位置。
可選地，該粘附素序列可被插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，因而可獲得包含嵌合重鏈的免疫球蛋白。在此實施方案中，所述粘附素序列被融合到免疫球蛋白每條臂上的免疫球蛋白重鏈的3′末端，或者在鉸鏈和CH2結構域之間，或者在CH2和CH3結構域之間。相似構建體已被Hoogenboom等，Mol.Immuno1.，281027-1037(1991)報道。
盡管本發(fā)明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白輕鏈的存在，免疫球蛋白輕鏈可以共價連接到粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽，或直接融合到粘附素的方式存在。在前者的情況下，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達。一旦分泌，雜交重鏈和輕鏈可共價連接以提供包含兩個二硫鍵-連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的類免疫球蛋白結構。適合制備此種結構的方法，在例如美國專利4,816,567(發(fā)表于1989年3月28日)中公開。
通過將編碼粘附素部分的cDNA序列在讀框內(nèi)與免疫球蛋白cDNA序列融合來非常方便地構建免疫粘附素。然而，也可用與基因組免疫球蛋白片段的融合(見例如，Aruffo等，Cell，611303-1313(1990)；和Stamenkovic等，Cell，661133-1144(1991))。后一種類型的融合需要Ig表達調(diào)控序列的存在?；谠醋云⒒蛲庵苎馨图毎腸DNA文庫的公布序列，用雜交或聚合酶鏈式反應(PCR)技術，分離編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA。將編碼“粘附素”的cDNA和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA串聯(lián)插入到在所選宿主細胞中指導有效表達的質(zhì)粒載體中。
這些分子的亮氨酸拉鏈形式也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明術語“亮氨酸拉鏈”指富含亮氨酸的序列，其增強，促進或驅(qū)動其融合配偶體(例如與亮氨酸拉鏈融合或相連的序列或分子)的二聚化或三聚化。各種亮氨酸拉鏈多肽在本領域中已有描述。見，例如，Landschulz et al.，Science，2401759(1988)；US Patent 5,716，805；WO 94/10308；Hoppe et al.，F(xiàn)EBS Letters，3441991(1994)；Maniatis et al.，Nature，34124(1989)。本領域技術人員將理解亮氨酸拉鏈序列可與本發(fā)明多肽的5′或3′末端融合。
本發(fā)明多肽也可通過將所述多肽與另一種異源多肽或氨基酸序列融合來修飾以形成嵌合分子。根據(jù)一些實施方案，所述異源多肽或氨基酸序列是使得所述嵌合分子寡聚化的物質(zhì)。一些實施方案中，所述嵌合分子包含所述多肽與標記多肽的融合物，所述標記多肽提供抗標記抗體可選擇性結合的表位。所述表位標記通常位于所述多肽的氨基或羧基末端。所述多肽的表位標記的形式的存在可利用抗所述標記多肽的抗體來檢測。所述表位標記還能使得所述多肽可利用抗標記抗體或另一類與所述表位標記結合的親和基質(zhì)通過親和純化輕易得以純化。各種標記多肽及其分別的抗體是本領域已知的。實例包括聚組氨酸(poly-his)或聚組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標記；flu HA標記多肽及其抗體12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc標記以及其8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗體[Evan et al.，Molecular和Cellular Biology，53610-3616(1985)]；以及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標記及其抗體[Paborsky etal.，Protein Engineering，3(6)547-553(1990)]。其它標記多肽包括Flag-肽[Hopp et al.，BioTechnology，61204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin etal.，Science，255192-194(1992)]；″-微管蛋白表位肽[Skinner et al.，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991)]；以及T7基因10蛋白肽標記[Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.SciUSA，876393-6397(1990)]。
構建肽-聚合物偶聯(lián)物
一些實施方案中，偶聯(lián)合成肽的聚合物的策略(例如PEG化)包括通過在溶液中形成偶聯(lián)連接來結合肽與PEG部分，它們每個都具有特定功能，并相互有反應性。所述肽可通過常規(guī)固相合成輕易制備。所述肽利用適宜的功能基團在特異性位點“預活化”。所述前體在與PEG部分反應以前經(jīng)過純化并完全表征。所述肽與PEG的連接通常在液相中進行并可通過逆相分析HPLC輕易監(jiān)測。PEG化的肽可通過制備型HPLC輕易純化并通過分析性HPLC、氨基酸分析以及激光解吸質(zhì)譜法來表征。
a.肽反應位點
一些實施方案中，肽通過其一或多個氨基酸殘基與聚合物上的末端反應基團共價相連，所述連接主要有賴于反應條件，聚合物分子量等。具有反應基團的聚合物在本文稱為活化的聚合物。所述反應基團與肽上的游離氨基或其它反應基團選擇性反應?？赡艿姆磻晕稽c包括N-末端氨基，賴氨酸殘基上的epsilon氨基，以及其它氨基，亞氨基，羧基，巰基，羥基，和其它親水基團。但是，將理解，為了獲得最佳結果，所選反應基團的類型和量，以及所用聚合物的類型有賴于所用具體肽以防止所述反應基團與所述肽上過多的具體反應基團發(fā)生反應。一些實施方案中，反應殘基，(例如，賴氨酸(K)，修飾的，非天然氨基酸，或其它小分子)可在適于偶聯(lián)的位置被取代。
一些實施方案中，所述肽包含序式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ IDNO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SFQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)，或圖32所示序列，其具有末端反應基團。一些實施方案中，所述肽包含至少一種并更優(yōu)選一種以上含有以下序列的多肽式I，式II，式III，ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ IDNO 6)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)，ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ IDNO 9)，或圖32所示序列。連接在一起的多肽可具有相同的序列或不同的序列以及末端反應性基團。一些實施方案中，這些多肽可相互連接，可選通過利用接頭。
雖然偶聯(lián)可出現(xiàn)在多肽的任何反應性氨基酸，一些實施方案中，所述反應性氨基酸是賴氨酸，其與活化的聚合物通過其游離epsilon-氨基相連，或這所述反應性氨基酸是谷氨酸或天冬氨酸，其通過酰胺鍵與聚合物相連。一些實施方案中，所述肽的反應性氨基酸不是位置X2和X12的半胱氨酸。
聚合物與每種肽偶聯(lián)的程度有賴于所述肽上的活性位點的數(shù)目，所述聚合物的分子量，親水性以及其它性質(zhì)，以及所選具體肽衍生化位點。一些實施方案中，所述聚合物具有的最終摩爾比為1-10個聚合物分子每個肽分子，但是與本發(fā)明的肽相結合的也可以是更多數(shù)目的聚合物分子。一些實施方案中，每個偶聯(lián)物含有一個聚合物分子。衍生化的所需量可通過利用試驗基質(zhì)輕易獲得，其中時間、溫度和其它反應條件可根據(jù)取代程度的不同而改變，此后，偶聯(lián)物的聚合物取代水平通過大小排阻層析或本領域已知的其它方法測定。
b.活化的聚合物
一些實施方案中，所述聚合物僅僅含有單一反應性基團。這有助于避免蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)。然而，本發(fā)明還包括最大化反應條件以減少交聯(lián)，或通過凝膠過濾或離子交換層析來純化反應產(chǎn)物以回收基本均質(zhì)的衍生物。其它實施方案中，所述聚合物含有兩個或更多反應性基團以將多個肽連接于聚合物主鏈。再次利用凝膠過濾和離子交換層析來回收基本均質(zhì)形式的所需衍生物。一些實施方案中，所述聚合物與肽直接鍵合而無需利用多功能(通常為雙功能)交聯(lián)劑。一些實施方案中，PEG鏈與肽的摩爾比為1∶1。
所述共價修飾反應可通過通常用于將生物活性物質(zhì)與惰性聚合物反應的任何適宜方法來進行，優(yōu)選在約pH 5-9，如果肽上的反應基團是賴氨酸則pH更優(yōu)選7-9。通常，所述方法包括制備活化的聚合物(通常至少有一個末端羥基將被活化的聚合物)，從該聚合物制備活性基質(zhì)，然后將所述肽與活性基質(zhì)反應以制備適于配制的肽。上述修飾反應可通過數(shù)種方法進行，其包括一或多個步驟。可用于在一步反應中制備活化的聚合物的修飾劑的實例包括氰尿酸氯化物(cyanuric acid chloride)(2，4，6-三氯-S-三嗪)和氰尿酸氟化物。
一些實施方案中，所述修飾反應在兩個步驟中發(fā)生，其中所述聚合物首先與酸酐諸如琥珀酸或戊二酸酸酐反應以形成羧酸，所述羧酸隨后與能同羧酸反應的化合物反應，形成具有能夠同肽反應的反應性酯基團的活化聚合物。所述化合物的實例包括N-羥基琥珀酰亞胺，4-羥基-3-硝基苯磺酸等，優(yōu)選使用N-羥基琥珀酰亞胺或4-羥基-3-硝基苯磺酸。例如，單甲基取代的PEG可在升高的溫度與戊二酸酸酐反應，優(yōu)選在約100-110C反應4小時。由此產(chǎn)生的單甲基PEG戊二酸隨后與N-羥基琥珀酰亞胺在碳化二亞胺試劑諸如雙環(huán)己基碳化二亞胺或異丙基碳化二亞胺存在的條件下發(fā)生反應以產(chǎn)生活化的聚合物，甲氧基聚乙二醇基(methoxypolyethylene glycolyl)-N-琥珀酰亞胺基戊二酸酯(succinimidyl glutarate)，其隨后與GH反應。所述方法在Abuchowski etal.，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)中詳述。另一實施例中，單甲基取代的PEG可與戊二酸酸酐反應然后與4-羥基-3-硝基苯磺酸(HNSA)在雙環(huán)己基碳化二亞胺的存在下反應以產(chǎn)生活化的聚合物。HNSA在Bhatnagar等，PeptidesSynthesis-Structure-Func-tion.Proceedings ofthe Seventh American Peptide Symposium，Rich et al.(eds.)(Pierce Chemical Co.，RockfordIll.，1981)，p.97-100，以及Nitecki等，High-Technology Route toVirus Vaccines(American Society for Microbiology1 986)entitled″Novel Agentfor Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications.″中有所描述。
一些實施方案中，與氨基的共價結合通過已知的化學方法進行，所述方法基于氰尿酰氯，羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)，醛反應基團(PEG的醇鹽加溴化乙醛的二乙基縮醛；PEG加DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物加4-羥基苯甲醛的苯氧化物，活化的琥珀酰亞胺基酯，活化的二硫代碳酸鹽PEG，2，4，5-三氯苯基氯甲酸酯(trichlorophenylcloroformate)或P-硝基苯基氯甲酸酯(nitrophenylcloroformate)活化的PEG)。羧基通過利用碳化二亞胺偶聯(lián)PEG-胺來衍生化。巰基基團通過與馬來酰亞胺基取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽)偶聯(lián)來衍生化，如1997年3月27日公開的WO97/10847所述，或PEG-馬來酰亞胺，其可購自Nektar Technologies，San Carlos，CA(formerlyShearwaterPolymers，Inc.)。可選，肽上的游離氨基(例如賴氨酸殘基上的epsilon氨基)可偶聯(lián)于N-羥基琥珀酰亞胺基取代的PEG(PEG-NHS，可購自Nektar Technologies；)或可用2-亞氨基-硫雜環(huán)戊烷(thiolane)(Traut′s試劑)硫醇化，然后如Pedley et al.，Br.J.Cancer，701126-1130(1994)所述與PEG的含馬來酰亞胺的衍生物偶聯(lián)。
許多惰性聚合物，包括但不限于PEG，適于用在藥物中。見，例如，Daviset al.，Biomedical PolymersPolymeric Materials和Pharmaceuticals forBiomedical Use，pp.441-451(1980)。本發(fā)明一些實施方案中，使用非蛋白性聚合物。所述非蛋白性聚合物通常是親水的合成的聚合物，即在自然中不被發(fā)現(xiàn)的聚合物。然而，存在于自然中并通過重組或體外方法制備的聚合物也可像天然來源分離的聚合物那樣使用。親水聚乙烯聚合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。尤其有用的是聚烷撐醚，諸如聚乙二醇(PEG)；聚氧化烯諸如聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；carbomers；支化或非支化的多糖，包括糖單體D-甘露糖，D-和L-半乳糖，海藻糖，果糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，D-葡糖醛酸，唾液酸，D-半乳糖醛酸，D-甘露糖醛酸(例如聚甘露糖醛酸，或褐藻酸)，D-葡糖胺，D-半乳糖胺，D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸，包括同多糖和異多糖諸如乳糖，支鏈淀粉，淀粉，羥乙基淀粉，直鏈淀粉，硫酸葡聚糖，葡聚糖，糊精，糖原，或酸性粘多糖的多糖亞基，例如透明質(zhì)酸，糖醇諸如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或heparon。
偶聯(lián)前聚合物無需但優(yōu)選是水溶性的，但是最終的偶聯(lián)物優(yōu)選是水溶性的。優(yōu)選，所述偶聯(lián)物顯示至少約0.01mg/ml的水溶解度，但更優(yōu)選至少約0.1mg/ml，更優(yōu)選至少約1mg/ml的水溶性。此外，所述聚合物在偶聯(lián)物形式中應當不是高度免疫原性的，其也不應具有與靜脈內(nèi)輸注、注射或吸入不相容的粘度(如果所述偶聯(lián)物意圖通過所述途徑給藥的話)。
所述聚合物的分子量范圍可達約100,000D，優(yōu)選至少約500D，或至少約1,000D，或至少約5,000D。一些實施方案中，PEG或其它聚合物的分子量范圍為5000-20,000D。分子量的選擇有賴于待獲得偶聯(lián)物的有效大小，聚合物的性質(zhì)(例如結構，諸如線性或支化的)，衍生化程度，即每個肽的聚合物分子數(shù)目，以及聚合物在肽上的附著位點。一個實施方案中，支化PEG可用于誘導所述肽的有效大小的較大增加。PEG或其它聚合物偶聯(lián)物可用于增加半壽期，增加溶解度，使得對蛋白水解攻擊穩(wěn)定化，以及降低免疫原性。
用于修飾本發(fā)明的肽的功能化PEG聚合物可得自Nektar Technologiesof San Carlos，CA(以前為Shearwater聚合物，Inc.)。所述可購得的PEG衍生物包括，但不限于，氨基-PEG，PEG氨基酸酯。PEG-N-羥基琥珀酰胺化學(NHS)，PEG-酰肼，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸鹽(酯)，羧甲基化PEG，PEG-丙酸，PEG氨基酸，PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯，PEG琥珀酰亞胺丙酸酯，羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺酯，PEG的琥珀酰亞胺碳酸酯，氨基酸PEG的琥珀酰亞胺酯，PEG化羰基咪唑(PEG-xycarbonylimidazole)，PEG-硝基苯碳酸酯，PEGtresylate，PEG-甘氨酰醚，PEG-醛，PEG乙烯砜(vinylsulfone)，PEG-馬來酰亞胺，PEG-正吡啶基(orthopyridyl)-二硫化物，異功能(heterofunctional)PEG，PEG乙烯基衍生物，PEG硅烷，和PEG磷脂(phospholides)。偶聯(lián)這些PEG衍生物的反應條件根據(jù)蛋白質(zhì)，所需PEG化程度以及所利用的PEG衍生物而不同。涉及PEG衍生物的選擇的一些因素包括所需附著的位點(諸如賴氨酸或半胱氨酸R-基團)，衍生物的水解穩(wěn)定性和反應性，連接的穩(wěn)定性，毒性以及抗原性，對分析的適宜性等。使用任何具體衍生物的具體說明由生產(chǎn)商提供。
c.偶聯(lián)物的定性
偶聯(lián)物可通過SDS-PAGE，凝膠過濾，NMR，胰蛋白酶圖譜，液相色譜質(zhì)譜測定法(liquid chromatrography-mass spectrophotometry)，以及體外生物學測定法來定性。例如，PEG偶聯(lián)物的含量可通過SDS-PAGE和凝膠過濾顯示，然后通過NMR分析，其對PEG的亞甲基氫具有特異性諧振峰值。每個分子上的PEG基團數(shù)目通過NMR色譜或質(zhì)譜法計算。10％SDS中的聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜地在洗脫緩沖液10mMTris-HCI pH 8.0，100mMNaCI中進行。為證實哪個殘基被PEG化，可進行胰蛋白酶繪圖。因此，PEG化的肽利用胰蛋白酶以蛋白/酶比例為100∶l(基于mg)在37℃、100mM乙酸鈉，10mMTris-HCI，1mM氯化鈣，pH 8.3中消化4小時，酸化到pH＜4以停止消化然后在HPLC Nucleosil C-18(4.6mm乘150mm，5.mu.，100A)上分離。層析譜與非PEG化的起始物質(zhì)比較。每個峰隨后利用質(zhì)譜分析以證實峰內(nèi)片段的大小。攜帶PEG基團的片段在注射后通常不保持在HPLC柱上，并從層析圖中消失。所述從層析圖的消失表明具體片段的PEG化，所述片段應含有至少一個賴氨酸殘基。隨后通過常規(guī)方法分析PEG化的肽與BLyS結合的能力。
一些實施方案中，通過離子交換層析(例如離子交換HPLC)來純化偶聯(lián)物。許多親電子活化的PEG的化學導致PEG化的產(chǎn)物的氨基電荷降低。因此，高分辨率離子交換層析可用于分離游離與偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，并分辯具有不同PEG水平的種類。實際上，不同種類(例如含有一個或兩個PEG殘基)的分辯也由于未反應的氨基酸的離子特性不同而成為可能。一個實施方案中，具有不同PEG化水平的種類的分辯根據(jù)WO 96/34015(InternationalApplication No.PCT/US96/05550，公開于1996-10-31)所述的方法進行。偶聯(lián)物的異源種類以相同的方式自彼此純化。
一些實施方案中，PEG-N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)與伯胺(例如賴氨酸以及N末端)反應。一些實施方案中，PEG-NHS與多肽的C-末端賴氨酸(K)反應。一些實施方案中，賴氨酸殘基被加入17-mer多肽的C末端，而在其它實施方案中，X17被賴氨酸取代。一些實施方案中，所述聚合物與N末端反應。一個優(yōu)選實施方案中，所述偶聯(lián)物通過利用下文實施例中所述的衍生化和純化方法來產(chǎn)生。
一個方面，本發(fā)明提供了上述任何偶聯(lián)物，其通過它的組分部分形成，即一或多個肽與一或多個聚合物分子共價相連，而在該偶聯(lián)物的共價分子結構中沒有任何外來物質(zhì)。
抗體制備
本發(fā)明的方法和制品，利用或包含與CD20結合的抗體。因此，產(chǎn)生所述抗體的方法將在這里和實施例中描述。
用于制備或篩選抗體的CD20可以是，例如抗體或其部分的可溶形式，其含有所需表位。人CD20的序列是已知的，見圖10和1l。人CD20的克隆和測序至少可參見以下文獻StamenkovicI.，Seed B.，J.Exp.Med.167，1975-1980，1988.Analysis of twocDNA clones encoding the B lymphocyteantigen CD20(B1，Bp35)，a type III integral membraneprotein.″；Tedder T.F.，Streuli M.，Schlossman S.F.，Saito H.，Proc.Nail.Acad.Sci.U.S.A.85，208-212，1988.″Isolation和structure of acDNA encoding the B1(CD20)cell-surfaceantigen of human B lymphocytes″；Tedder T.F.，Klejman G.，Schlossman S.F.，Saito H.，J.Immuno1.142，2560-2568，1989.″Structure of the gene encoding thehuman B lymphocyte differentiation抗原CD20(B1)″；Einfeld D.A.，Brown J.P.，Valentine M.A.，Clark E.A.，Ledbetter J.A.，EMBO J.7，711-717，1988.″Molecular cloning of the human B cell CD20 receptor predicts ahydrophobic protein with multiple transmembrane domains″。細胞外結構域(ECD)的肽片段可用作免疫原?；谶@些已知序列和結構域的描述，本領域技術人員可表達CD20多肽以及其片段以用于制備抗體。
為生成人CD20抗體，細胞外結構域氨基酸殘基142-188以及長度6個或更多個殘基的肽片段可用作免疫原以在嚙齒類(包括小鼠，倉鼠，以及大鼠)，兔子，山羊或其它適宜動物中激發(fā)抗體。可溶CD20多肽或其免疫原片段可在適宜宿主細胞諸如細菌或真核細胞中表達。一個實施方案中，人和鼠洗滌劑溶解的全長CD20在大腸桿菌中產(chǎn)生(見以下實施例)并用于免疫以及篩選產(chǎn)生抗-CD20抗體的雜交瘤。
可選，或此外，在其細胞表面表達CD20的B細胞或細胞系可用于產(chǎn)生和/或篩選抗體。一種所述細胞系是人淋巴母細胞樣細胞系SB(ATCC保藏號ATCC CCL 120，得自ATCC，Rockville，Md)。所述抗體針對人CD20產(chǎn)生以治療人。用于產(chǎn)生抗體的CD20的其它形式對與本領域技術人員而言是明顯的。
噬菌體展示法可用于制備CD20結合抗體。
與CD20結合的抗體可為嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體。所述抗體以及制備它們的方法在下文詳述。
(i)多克隆抗體
多克隆抗體優(yōu)選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關抗原和佐劑而產(chǎn)生。用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲酰基硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，將所述相關抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)進行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內(nèi)注射該溶液。1個月后，多位點皮內(nèi)注射起始量的1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物加弗氏完全佐劑來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優(yōu)選給動物加強注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強免疫應答。
(ii)單克隆抗體
單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動物如倉鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結合的抗體的淋巴細胞。另外，可體外免疫淋巴細胞。然后用適當融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理及應用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞接種至適當培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細胞和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術及應用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))
可在含有生長的雜交瘤細胞培養(yǎng)基中分析直接針對所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀或通過體外結合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
單克隆抗體的結合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來測定。
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可作為腹水中腫瘤的形式在動物體內(nèi)生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述見Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術10779-783(1992))，以及用于構建大規(guī)模噬菌體文庫的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術來分離克隆抗體。
DNA也可通過用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來修飾(美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學院學報816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結合來修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個抗原結合點的可變區(qū)，形成二價嵌合抗體，其中一個抗原結合位點特異于一種抗原而另一個抗原結合位點特異于另一種抗原。
(iii)人源化抗體
本領域已有關于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優(yōu)選人源化抗體中已導入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)包括重鏈和輕鏈的選擇，對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應”方法，針對已知人類可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國國家科學院學報，894285(1992)；Presta等，免疫學雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技術人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選候選免疫球蛋白序列可能的三維構象的計算機程序。通過觀察這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加?？傊?，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結合的影響。
(iv)人類抗體
除了進行人源化以外還可制備人類抗體。例如現(xiàn)在已能產(chǎn)生如下轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，它們通過免疫能產(chǎn)生人類抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導致因抗原攻擊而誘導人類的抗體產(chǎn)生。見Jakobovits等，美國國家科學院學報，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Brμggermann等，Year in Immuno.733(1993)；和美國專利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌體展示技術(McCafferty等，自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成(repertoires)而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點進行的選擇也導致對顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進行選擇。因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行；這些綜述見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結構生物學的最新觀點(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)。可使用V基因片段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的隨機組合小文庫中分離了抗-惡唑酮抗體的一個多樣性陣列?？苫救鏜arks等，分子生物學雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構建未免疫人類供者的V基因所有組成，并分離針對抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利5565332和5573905。
人類抗體也可通過體外激活的B細胞而產(chǎn)生(見美國專利5,567,610和5,229,275)。
(v)抗體片段
已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學和生物物理學方法雜志(Journal of Biochemical和Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab′-SH片段，并經(jīng)化學連接形成F(ab′)2片段(Carter等，生物/技術10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)中分離F(ab′)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458。抗體片段也可以是“線性化抗體”，如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體
雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結合特異性的抗體。如雙特異性抗體可以與B細胞表面標志物的兩種不同表位結合。其它這類抗體可以結合第一個B細胞表面標志并再結合第二個B細胞表面標志?；蛘撸蓪⒖笲細胞標志物的結合臂與結合白細胞上引發(fā)分子的臂結合，從而集中針對B細胞的細胞防御機制，所述引發(fā)分子如T細胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγR I(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細胞毒制劑定位至B細胞。這些抗體具有B細胞標志物結合臂和結合細胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(quadroma)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構建的實施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結構有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)，見Suresh等，酶學方法，121210(1986)。根據(jù)美國專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫細胞導向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當?shù)慕宦?lián)方法制備。適當?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術為本領域已知，可在美國專利4676980號中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學連接制備。Brennan等，科學22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實驗醫(yī)學雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，還能引發(fā)人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。
直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學院學報，906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學雜志，14760(1991)。
本發(fā)明還涉及對本文所述蛋白質(zhì)或肽類拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，需要改進拮抗劑的結合親和力和/或其它生物學特性。拮抗劑的氨基酸序列變體可通過在拮抗劑核酸中導入適當?shù)暮塑账岣淖?，或通過肽合成法來制備。所述修飾包括，如該拮抗劑的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代?？蓪θ笔А⒉迦?、和取代進行任意組合以獲得最終構建體，只要該最終構建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變拮抗劑的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。
一種鑒別拮抗劑中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點引入進一步的或其他的變體而改進。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但突變本身不必是預定的。例如，為分析在指定位點處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機誘變，并篩選所表達的具有所需活性的拮抗劑變體。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包括100個或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或與細胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括在酶或多肽的拮抗劑的N-或C-末端進行融合，以增加拮抗劑在血清中的半衰期。
另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使拮抗劑分子中至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代?？贵w拮抗劑分子中最有興趣進行取代誘變的位點包括高變區(qū)，也可以改變FR。保守取代見表1的“優(yōu)先取代”欄。如果這些取代引起生物學活性的改變，則可引入表1中“取代舉例”欄的更實質(zhì)性改變，或進一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。
表1
對拮抗劑的生物學特性的實質(zhì)性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結構，例如片層結構或螺旋構象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為
(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸
(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸
(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸
(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸
(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸
(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
與維持拮抗劑正確構象無關的任何半胱氨酸殘基也可被取代，如被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在拮抗劑中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當拮抗劑為抗體片段如FV片段時)。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體高變區(qū)的一或多個殘基。通常，所選用于進一步開發(fā)的變體相對于其親本抗體應具有改進的生物學活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合作出主要貢獻的高變區(qū)殘基。此外，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以確定抗原與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術進行取代的候選位點。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對它們?nèi)窟M行篩選，選出在一或多個相關實驗中具有優(yōu)勢特性的抗體以便進一步開發(fā)。
拮抗劑的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉拮抗劑中的一或多個碳水化合物部分，和/或添加一或多個原本不存在于該拮抗劑中的糖基化位點。
多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在拮抗劑分子中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個上述三肽序列(在添加N-連接糖基化位點的情況下)而實現(xiàn)。這種改變也可通過在原始的拮抗劑序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(xiàn)(在添加O-連接的情況下)。
編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子由本領域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對早期制備的拮抗劑變體或未變異的拮抗劑進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。
也需要修飾拮抗劑的效應物功能，如以此增強拮抗劑的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)。這可以通過在抗體拮抗劑FC區(qū)引入一或多個氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強補體介導的細胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實驗醫(yī)學雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學雜志1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備。或者，可通過工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強的補體裂解效應及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設計(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。
為了提高拮抗劑的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑(尤其抗體片段)上摻入一個補救受體結合表位，如美國專利5,739,277所述。本文中術語“補救受體結合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負責延長該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。
測定法
外周B-細胞濃度通過FACS法測定，其計數(shù)CD3-/CD40+細胞。樣品總淋巴細胞中CD3-CD40+B細胞的百分比可通過以下門控策略來獲得。淋巴細胞群體在正向散射/側(cè)向散射散射圖(forward scatter/side scatter scattergram)以定義區(qū)1(R1)。利用R中的事件，展示CD40和CD3標記物的熒光強度點圖。熒光標記的同種型對照用于測定CD40和CD3陽性各自的截留點(cutoff point).
FACS分析
洗滌50萬個細胞并懸浮于100μl FACS緩沖液，其是含有1％BSA的磷酸鹽緩沖的鹽水，并含有5μl染色或?qū)φ湛贵w。所有染色抗體，包括同種型對照，獲自PharMingen，San Diego，CA。人CD20表達通過用RITUXAN以及FITC-偶聯(lián)的抗-人IgG1第二抗體染色。FACS分析利用FACScan和Cell Quest(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)進行。所有淋巴細胞都在正向/側(cè)向光散射中定義，而所有B淋巴細胞利用B220在細胞表面的表達來定義。
B細胞消耗以及回收通過分析外周B細胞計數(shù)以及利用FACS分析脾、淋巴結以及骨髓中的hCD20+B細胞來評估，對于注射后第一周每天一次，隨后每周一次。注射的2H7變體抗體的血清水平受到監(jiān)測。
藥用制劑
根據(jù)本發(fā)明使用的拮抗劑的藥用制劑通過將具有所需純度的拮抗劑與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(Remington＇s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存?？伤幱幂d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復合物(例如鋅-蛋白復合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
抗CD20抗體制劑的實例如WO98/56418所述，其已引入本文作為參考。其描述了一種液體多劑制劑，該制劑包含40mg/ml rituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酸酯(polysorbate)20，pH 5.0，在2-8℃至少可保存2年。另一種抗CD20目標制劑在9.0mg/ml氯化鈉，7.35mg/ml二水檸檬酸鈉，0.7mg/ml聚山梨酸酯80，注射用無菌水，pH6.5中包含10mg/ml抗體。適于皮下給藥的凍干劑見WO97/04801所述。這種凍干劑可用適當稀釋劑重新恢復至高蛋白濃度，所重建的制劑可皮下給藥至這里所治療的哺乳動物。
一種用于人源化2H7變體的配制劑是抗體，所述抗體濃度12-14mg/mL，包含在10mM組氨酸，6％蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH 5.8中。在具體實施方案中，2H7變體具體是2H7.v16以20mg/mL抗體配制在10mM組氨酸硫酸酯，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨醇酯20，以及無菌注射用水，pH5.8中。
所述制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補活性但相互無負面影響的那些。例如，優(yōu)選還提供細胞毒試劑，化療試劑，細胞因子或免疫抑制劑(如作用于T細胞的那些，如環(huán)孢菌素或結合T細胞的抗體，如結合LFA-1的抗體)。所述其它試劑的有效量取決于該制劑中拮抗劑的量，疾病或病癥或治療的類型，及上述其它因素。通常應用上文所述劑量和給藥方式，或迄今所用劑量的約1-99％。
活性成分也可容納在通過凝聚技術或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質(zhì)的藥物運送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術見雷氏藥學，第16版Osol，A.編(1980)。
也可制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當實例包括含有拮抗劑的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊?？蒯屩苿嵗ň埘?、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。
疾病治療
疾病
本發(fā)明的CD20結合抗體以及BLyS拮抗劑可用于治療B細胞惡性疾病以及B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病。
B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病包括關節(jié)炎(類風濕性關節(jié)炎，幼年類風濕性關節(jié)炎，骨關節(jié)炎，鱗屑病關節(jié)炎)，銀屑病，皮炎包括特應性皮炎；慢性自身免疫性風疹(chronic autoimmune urticaria)，多發(fā)性肌炎/皮肌炎，毒性表皮壞死溶解(toxic epidermal necrolysis)，系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥(systemicscleroderma和sclerosis)，與炎性腸病(IBD)(克隆氏病，潰瘍性結腸炎)相關的反應，呼吸窘迫綜合征，成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎，過敏性鼻炎，腦炎，葡萄膜炎，結腸炎，腎小球腎炎，過敏性疾病，濕疹，哮喘，與T細胞浸潤以及慢性炎性反應相關的疾病，動脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡(包括腎炎，非腎，盤狀紅斑(discoid)，以及脫發(fā))，幼年發(fā)病型糖尿病(juvenile onset diabetes)，多發(fā)性硬化，過敏性腦脊膜炎，與細胞因子和T淋巴細胞介導的急性和延遲的超敏反應相關的免疫反應，結核病，結節(jié)病，肉芽腫病包括韋格納肉芽腫，粒細胞缺乏癥，血管炎(包括ANCA)，再生障礙性貧血，Coombs陽性貧血，Diamond Blackfan貧血，免疫溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血，純紅細胞缺乏癥(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性中性粒細胞減少，全血細胞減少，白細胞減少，與白細胞滲出相關的疾病，CNS炎性疾病，多器官損傷綜合征，重癥肌無力，抗原-抗體復合物介導的疾病，抗腎小球基底膜疾病，抗磷脂抗體綜合征，過敏性神經(jīng)炎，白塞病，Castleman綜合征，Goodpasture綜合征，Lambert-Eaton肌無力綜合征，雷諾綜合征，干燥綜合征，Stevens-Johnson綜合征，實體器官移植排斥(solid organtransplant rejection)(包括對高panel反應性抗體滴度的預處理，組織IgA沉積等)，移植物抗宿主疾病(GVHD)，類天皰瘡，天皰瘡(均包括vulgaris，foliaceus)，自身免疫性多內(nèi)分泌疾病(autoimmune polyendocrinopathies)，Reiter病，僵人綜合征(stiff-man syndrome)，巨細胞動脈炎，免疫復合物腎炎，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導的腎病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic throbocytopenic purpura)(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，睪丸和卵巢的自身免疫疾病，包括自身免疫性睪丸炎以及卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺機能減退癥；自身免疫性內(nèi)分泌疾病，包括自身免疫性甲狀腺炎，慢性甲狀腺炎(Hashimoto′s甲狀腺炎)，亞急性甲狀腺炎，特發(fā)性甲狀腺機能減退癥，Addison氏病，Grave病，自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)，I型糖尿病，也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和席漢綜合征；自身免疫性肝炎，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(Lymphoidinterstitial pneumonitis)(HIV)，閉塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans)(非-移植物)VS NSIP，格林-巴利綜合征(Guillain-Barre Syndrome)，大血管(LargeVessel)血管炎(包括類風濕性多肌痛(Polymyalgia Rheumatica)和巨細胞(Takayasu′s)動脈炎)，中血管血管炎(包括Kawasaki病和結節(jié)性多動脈炎(Polyarteritis Nodosa))，強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，Berger病(IgA腎病)，迅速進展的(rapidly progressive)腎小球腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis)，脂肪便癥(Celiac sprue)(谷蛋白腸病)，冷球蛋白血癥，ALS，冠狀動脈疾病。
B細胞腫瘤包括CD20-陽性霍奇金病，包括淋巴細胞占優(yōu)勢型(lymphocyte predominant)霍奇金病(LPHD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞白血病(ALL)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；毛細胞白血病。非霍奇金淋巴瘤包括低級/濾泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)，小淋巴細胞(SL)NHL，中級/濾泡NHL，中級彌散型NHL，高級免疫母細胞NHL，高級淋巴母細胞NHL，高級小無裂細胞(small non-cleavedcell)NHL，bulky disease NHL，漿細胞樣淋巴細胞淋巴瘤(plasmacytoidlymphocytic lymphoma)，套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，AIDS-相關的淋巴瘤和Waldenstrom巨球蛋白血癥。這些癌癥復發(fā)的治療也包含在本發(fā)明內(nèi)。LPHD是一類霍奇金病，其傾向于即使在放療和化療的情況下也頻繁復發(fā)，并且特征為CD20陽性惡性T細胞。CLL是四種主要類型的白血病之一。稱為淋巴細胞的成熟B-細胞的癌癥，CLL通過血、骨髓和淋巴組織中細胞的逐漸累積來表征。不活躍的(Indolent)淋巴瘤是生長緩慢，不可治愈的疾病，其中數(shù)個緩解和復發(fā)期之后，患者的平均存活期為6-10年。
具體實施方案中，所述BLyS拮抗劑和CD20結合抗體用于治療非霍杰金淋巴瘤(NHL)，淋巴細胞優(yōu)勢型霍奇金病(LPHD)，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)，其為一種非霍奇金淋巴瘤(NHL)，類風濕性關節(jié)炎和幼年類風濕性關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡腎炎，韋格納病，炎性腸病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，多發(fā)性硬化，銀屑病，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病，重癥肌無力，血管炎，糖尿病，雷諾綜合征，干燥綜合征和腎小球腎炎。
所需B細胞消耗水平將有賴于疾病。為治療CD20陽性癌癥，需要最大化作為本發(fā)明抗CD20抗體的靶的B細胞的消耗。因此，為治療CD20陽性B細胞腫瘤，需要B細胞消耗足以至少防止疾病進展，其可通過本領域熟練醫(yī)師評估，例如通過監(jiān)測腫瘤生長(大小)，癌細胞類型的增殖，轉(zhuǎn)移，其它特定癌癥指征以及癥狀。優(yōu)選，B細胞消耗足以防止疾病進展至少2個月，更優(yōu)選3個月，甚至更優(yōu)選4個月，更優(yōu)選5個月，甚至更優(yōu)選6個月或更長時間。在更為優(yōu)選的實施方案中，B細胞消耗足以延長緩解期至少6個月，更優(yōu)選9個月，更優(yōu)選1年，更優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年，更優(yōu)選5年或更長時間。最優(yōu)選的實施方案中，B細胞消耗足以治愈所述疾病。優(yōu)選實施方案中，癌癥患者中的B細胞消耗為治療前基線水平的至少約75％，更優(yōu)選，80％，85％，90％，95％，99％甚至100％。
為治療自身免疫疾病，需要根據(jù)個體患者中的疾病和/或疾病嚴重性，通過調(diào)節(jié)CD20結合抗體的劑量來調(diào)節(jié)B細胞消耗的程度。因此，B細胞消耗但不必是完全的?；蛘?，總B細胞消耗在初始治療中可以是所需的，但在隨后的治療中，所述劑量可調(diào)節(jié)到僅僅實現(xiàn)部分消耗。一個實施方案中，B細胞消耗為至少20％，即，與治療前的基線水平相比保留80％或更少的CD20陽性B細胞。一個實施方案中，B細胞消耗為25％，30％，40％，50％，60％，70％或更高。優(yōu)選，B細胞消耗足以使疾病進展停止，更優(yōu)選緩解治療下具體疾病的病癥和癥狀，更優(yōu)選治愈所述疾病。
涉及Rituximab的公開出版物包括Perotta和Abuel″Response of chronicrelapsing ITP of 10 years duration to Rituximab″Abstract#3360 Blood10(1)(part 1-2)p.88B(1998)；Stashi et al″Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura″Blood 98(4)952-957(200 1)；Matthews，R.″MedicalHeretics″New Scientist(7 April，2001)；Leandro et al.″Clinical outcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion″AnnRheum Dis 61833-888(2002)；Leandro et al.″Lymphocyte depletion inrheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and dose response.Arthritis and Rheumatism 44(9)S370(2001)；Leandro et al.″An open study of Blymphocyte depletion in systematic lupus erythematosus″，Arthritis &Rheumatism 46(1)2673-2677(2002)；Edwards and Cambridge″Sustainedimprovement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete Blymphocytes″Rheumatology 40205-211(2001)；Edwards et al.″B-lymphocytedepletion therapy in rheumatoid arthritis and otherautoimmunedisorders″Biochem.Soc.Trans.30(4)824-828(2002)；Edwards etal.″Efficacy and safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonalantibodyA randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoidarthritis.Arthritisand Rheumatism 46(9)S197(2002)；Levine and Pestronk″IgMantibody-related polyneuropathiesB-cell depletion chemotherapy usingRituximab″Neurology 52170l-1704(1999)；DeVita et al.″Efficacy of selectiveB cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis″Artlaritis & Rheum 462029-2033(2002)；Hidashida et al.″Treatment of DMARD-Refractoryrheumatoid arthritis with rituximab.″Presented at the Annual Scientific Meetingof the American College of Rheumatology；Oct 24-29；New Orleans.LA 2002；Tuscano，J.″Successful treatment ofInfliximab-refractory rheumatoid arthritiswith rituximab″Presented at the Annual Scientific Meeting of the AmericanCollege of Rheumatology；Oct 24-29；New Orleans，LA 2002。
對于治療應用，本發(fā)明的抗-CD20抗體和BLyS拮抗劑組合物可與例如化療劑、激素、抗血管生成劑、放射標記的化合物以及手術，低溫療法和/和放療聯(lián)用。前述治療方法可于其它形式的常規(guī)治療聯(lián)用給予，其與所述常規(guī)治療序貫使用或在常規(guī)治療前或后使用。所述抗-CD20抗體和BLyS拮抗劑可與治療有效量的化療劑在一起給藥。另一實施方案中，所述抗-CD20抗體和BLyS拮抗劑與化療聯(lián)用給藥以提高該化療劑的活性和效力。ThePhysicians′Desk Reference(PDR)公開了用于治療各種癌癥的化療劑的劑量。前述這些化療劑的治療有效給藥方案和劑量有賴于被治療的具體癌癥，疾病程度以及本領域醫(yī)師所熟悉的其它因素，并可由醫(yī)師決定。
可通過本發(fā)明的方法而緩解或成功治療患者的B細胞腫瘤或B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫病，條件是給藥本發(fā)明的組合物之后與治療前相比，有可測定的癥狀或其它可應用的指標的改善。治療效果在給藥本發(fā)明組合物后3-10周之內(nèi)變得明顯。每種疾病的可應用指標是適宜領域技術人員已知的。例如，醫(yī)師可監(jiān)測被治療患者疾病的臨床或血清學證據(jù)，諸如疾病的血清學標記物，完全血細胞計數(shù)包括B細胞計數(shù)，以及血清免疫球蛋白水平。IgG和IgM血清水平在BR3-Fc處理的小鼠中降低。預計應答于BR3-Fc和/或抗-CD20抗體治療的人患者同樣顯示血清IgG和IgM水平降低。所述患者可顯示一或多種以下情形的可觀察和/或可測定的減輕或消失癌細胞減少或消失；腫瘤體積減??；癌細胞對器官的內(nèi)部浸潤的抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選終止)；腫瘤轉(zhuǎn)移抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選終止)；對腫瘤生長的一定程度的抑制，和/或在一定程度上，緩解與具體癌癥相關的一或多種癥狀；降低的發(fā)病率和病死率，以及生活質(zhì)量的改善。優(yōu)選，給藥本發(fā)明的組合物之后，所述改善超過采取本發(fā)明方法治療前的具體癥狀或標準的基線至少20％，更優(yōu)選，25-30％，更優(yōu)選30-35％，最優(yōu)選40％或更高。
評估腫瘤治療有效性和成功的參數(shù)是熟悉適宜疾病的醫(yī)師所已知的。通常，熟練醫(yī)師將尋求減少具體疾病的病征或癥狀。參數(shù)包括疾病進展中值時間(median time)，疾病緩解以及穩(wěn)定時間。對于B細胞腫瘤，可測定的指標可包括，例如疾病進展時間，總體生存期和/或無進展生存期的延長。在白血病的情況中，可進行骨髓活檢來測定緩解程度。完全緩解定義為治療30天以后，白血病細胞占患者骨髓中發(fā)現(xiàn)的所有細胞的5％以下。
以下對比文件描述了淋巴瘤和CLL，它們的診斷，治療和測定治療有效性的標準醫(yī)學方法。Canellos GP，Lister，TA，Sklar JLTheLymplzomas.W.B.Saunders Company，Philadelphia，1998；van Besien K and Cabanillas，F(xiàn)ClinicalManifestations，Staging and Treatment of Non-Hodgkin′s Lymphoma，Chap.70，pp 1293-1338，inHematology，Basic Principles and Practice，3rd ed.Hoffman etal.(editors).Churchill Livingstone，Philadelphia，2000；Rai，K and Patel，DChronic Lymphocytic Leukemia，Chap.72，pp 1350-1362，inHematology，BasicPrinciples and Practice，3rd ed.Hoffman et al.(editors).Churchill Livingstone，Philadelphia，2000。
評估自身免疫或自身免疫相關疾病的治療的有效性以及成功的參數(shù)是熟悉適當疾病的醫(yī)師已知的。通常，熟練醫(yī)師尋求具體疾病病癥和癥狀的減少。以下是具體實例。
類風濕性關節(jié)炎(RA)是病源學未知的自身免疫病。大多數(shù)RA患者患有慢性疾病的病程，甚至即使有治療，也導致漸進性關節(jié)破壞，變性，殘疾甚至在幼年死亡。RA治療的目的是預防或控制關節(jié)破壞，防止功能喪失以及減少疼痛。RA的初始治療通常涉及給藥一或多種以下藥物非類固醇抗炎藥(NSAID)，糖皮質(zhì)激素(經(jīng)由關節(jié)注射)，和低劑量潑尼松。見″Guidelinesfor the management of rheumatoid arthritis″Arthritis & Rhemmatism 46(2)328-346(February，2002)。大多數(shù)剛被診斷患有RA的患者在診斷的3個月之內(nèi)開始改善疾病型抗風濕藥物(disease-modifying antirheumatic drug)(DMARD)的治療。通常用于RA的DMARD是羥氯喹(hydroxylcloroquine)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，甲氨喋呤，來氟米特(leflunomide)，依那西普etanercept)，英夫利昔單抗(infliximab)(加口服和皮下甲氨喋呤)，脒唑硫嘌呤(azathioprine)，D-青霉胺，金(Gold)(口服)，金(肌內(nèi))，二甲胺四環(huán)素(minocycline)，環(huán)孢霉素(cyclosporine)，葡萄球菌蛋白A免疫吸附劑。
由于RA過程中機體產(chǎn)生腫瘤壞死因子alpha(TNFα)，TNFα抑制物被用于治療所述疾病。Etanercept(ENBRE)是在美國獲準的活動性RA治療的可注射藥物。Etanercept與TNFα結合，并從關節(jié)以及血液中去除大部分TNFα，由此防止TNFα促進類風濕性關節(jié)炎的炎癥和其它癥狀。Etanercept是″免疫粘附素″融合蛋白，其包括與人IgG1的Fc部分連接的人75 kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細胞外配體結合部分。Infliximab，出售的商品名為REMICADEO，是用于治療RA和克隆氏病的免疫抑制藥物。Infliximab是嵌合單克隆抗體，其與TNFα結合并通過靶向并結合導致炎癥的TNF來減輕機體內(nèi)的炎癥。
Adalimumab(HUMIRATM，Abbott實驗室)，以前已知為D2E7，是人單克隆抗體，其與TNFα結合，并獲準用于減輕體征和癥狀，以及抑制患有中度到嚴重活動性RA的成人中的結構破壞的進展，所述成人對一或多種常規(guī)的改善疾病型DMARD的反應不充分。
給藥抗-CD20抗體和BLyS拮抗劑治療類風濕性關節(jié)炎可與利用一或多種前述RA藥物的治療聯(lián)用。
對于類風濕性關節(jié)炎，例如，疾病中的進展測定指標可包括腫脹和觸痛關節(jié)的數(shù)目以及晨僵持續(xù)時間。通過利用X線以及已知為Sharp評分的評分系統(tǒng)來檢測患者手和腳中有多少關節(jié)被侵蝕。另一評分系統(tǒng)基于美國風濕病學會(American College of Rheumatology)的治療反應評估標準。
評估RA中的治療有效性的一種方法基于美國風濕病學會(ACR)標準，其測定觸痛以及腫脹關節(jié)中的改善百分比等。RA患者可在例如與沒有抗體治療(例如治療前的基線)或利用安慰劑的治療相比的ACR 20(20％改善)評分。其它評估抗體治療效力的方法包括X線評分諸如Sharp X-線評分，其用于對諸如骨侵蝕和關節(jié)間隙變窄等結構損傷進行評分。也可評估患者的殘疾改善，所述評估基于健康評估調(diào)查問卷(Health AssessmentQuestionnaire)[HAQ]得分，AIMS得分，治療中或治療后各個時期的SF-36。ACR 20標準可包括觸痛(疼痛)關節(jié)計數(shù)以及腫脹關節(jié)計數(shù)中均改善20％加上5個其它測定標準中至少3個的20％的改善
1.通過目測模擬量表(visual analog scale)(VAS)的患者疼痛評估，
2.患者的疾病活動(disease activity)總體評估(VAS)，
3.醫(yī)師的疾病活動總體評估(VAS)，
4.患者通過健康評估調(diào)查問卷進行的自我評估殘疾狀況，和
5.急性期反應物，CRP或ESR。
ACR 50和70類似定義。優(yōu)選，給藥患者有效獲得至少為ACR20的得分，優(yōu)選至少ACR 30，更優(yōu)選至少ACR50，更優(yōu)選至少ACR70，最優(yōu)選至少ACR 75或更高的得分的量的本發(fā)明所述CD20結合抗體。
銀屑病關節(jié)炎具有獨特且不同的射線照相特征。對于銀屑病關節(jié)炎，關節(jié)侵蝕和關節(jié)間隙狹窄也可通過Sharp得分來評估。本發(fā)明公開的人源化CD20結合抗體可用于防止關節(jié)損傷以及減輕疾病體征和癥狀。
本發(fā)明另一方面是通過給藥患有SLE的患者治療有效量的本發(fā)明所述人源化CD20結合抗體來治療狼瘡或SLE。SLEDAI得分提供疾病活動的數(shù)量定量。SLEDAI是已知與疾病活動相關的24種臨床和實驗室參數(shù)的加權系數(shù)，數(shù)量范圍是0-103。見BryanGescuk & John Davis，″Novel therapeuticagent for systematic lupus erythematosus″in Current Opinion in Rheumatology2002，14515-521。雙鏈DNA抗體據(jù)信導致狼瘡腎病以及其它表現(xiàn)?？呻S時間監(jiān)測接受抗體治療的患者的腎病(renal flare)，所述疾病定義為血清肌酐、尿蛋白或尿中的血液的明顯的重復性增加?？蛇x或此外，可監(jiān)測患者的抗核抗體以及雙鏈DNA抗體的水平。SLE治療包括高劑量皮質(zhì)類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。
脊柱關節(jié)病是一組關節(jié)疾病，包括強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，銀屑病關節(jié)炎(psoriatic arthritis)和克隆氏病。治療成功可通過有效的患者和醫(yī)師全面評估測定工具來測定。
對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡，監(jiān)測患者的抗核抗體以及雙鏈DNA抗體水平。
各種藥物可用于治療銀屑??；治療直接根據(jù)疾病嚴重度而不同?；加休p度銀屑病的患者通常利用局部治療，諸如局部類固醇，蒽三酚(anthralin)，卡泊三烯(calcipotriene)，氯氟美松(clobetasol)和他扎羅汀(tazarotene)，以控制疾病，而中度和中度銀屑病患者更有可能接受系統(tǒng)(甲氨喋呤，類維生素A，環(huán)孢霉素，PLTVA和UVB)療法。也利用Tars。這些療法具有安全性考慮，耗時的方案和治療過程不便的一組問題。而且，一些需要昂貴的設備和辦公室環(huán)境中的專用空間。系統(tǒng)藥物可產(chǎn)生嚴重副作用，包括高血壓，高血脂，骨髓抑制，肝臟疾病，腎疾病，以及胃腸不適。利用光療法也可增加皮膚癌的患病率。除了與利用局部療法有關的不便以及不適，光療法和系統(tǒng)療法需要對患者進行治療與不治療的循環(huán)，并由于所述療法副作用而監(jiān)測終身對其的使用。
銀屑病的治療有效性通過疾病的臨床體征和癥狀評估，包括與基線情況相比，醫(yī)師的全面評估(PGA)改變以及銀屑病面積和嚴重度指標(PASI)得分，銀屑病癥狀評估(PSA)?；颊呖赏ㄟ^用于表明具體時間點的搔癢程度的目測模擬量表在整個治療中定期檢測。
劑量方案
根據(jù)待處理的指征和與本領域熟練醫(yī)師所熟悉的與劑量相關的因素，本發(fā)明的BLyS拮抗劑和CD20結合抗體將以有效用于治療所述指征同時最小化毒性和副作用的劑量給藥。對于治療B細胞腫瘤諸如非霍奇金淋巴瘤的患者，在具體實施方案中，本發(fā)明的抗-CD20抗體將以1mg/kg-20mg/kg體重，優(yōu)選2.5mg/kg-10mg/kg給藥人患者。在優(yōu)選實施方案中，抗-CD20抗體以10mg/kg和375mg/m2給藥。對于治療NHL，一種劑量方案為375mg/m2抗-CD20抗體每隔一周給藥持續(xù)2-4劑，或在治療第一周一個劑量的抗體組合物，然后間隔2周，然后給藥第二個劑量的同樣量的抗體。通常，NHL患者在一年之內(nèi)接受所述治療一次，但一旦淋巴瘤復發(fā)，所述治療可以重復。在NHL的治療中，抗-CD20抗體加BLyS拮抗劑療法可與諸如利用CHOP的化療聯(lián)用。另一實施方案中，為治療B細胞腫瘤諸如CLL和SLL，患者可在給藥BR3-Fc之后和之前(對于復發(fā)的CLL)接受四次每周一次的375mg/m2 Rituxan。對于CLL，利用抗-CD20抗體和BLyS拮抗劑的療法可以與化療例如利用氟達拉濱和環(huán)磷酰胺(cytoxan)的化療聯(lián)用。
為治療類風濕性關節(jié)炎，一個實施方案中，嵌合抗體RituxanTM以500mg每劑每隔一周給藥，總共2劑。人源化抗-CD20抗體，例如，本發(fā)明公開的hu2H7v.16和hu 2H7的任何其它變體，可以以低于500mg每劑諸如約200-500mg每劑，約250mg-450mg，或300-400mg每劑，每隔一周或每個第3周給藥，共2-4劑。
BR3-Fc可以0.5mg/kg-10mg/kg，優(yōu)選1mg/kg至5mg/kg，更優(yōu)選，1.5mg/kg-2.5mg/kg給藥。一個實施方案中，BR3-Fc以5mg/kg在治療第1天到第12天內(nèi)每隔一天給藥。還涉及以約2-5mg/kg每2-3天給藥共2-5劑。
本發(fā)明的治療方法包括同時和序貫給予抗-CD20抗體和所述BLyS拮抗劑(本文均稱為藥物)的組合。在序貫給藥中，所述藥物可以以任何順序給藥，即先給予BLyS拮抗劑然后給予抗-CD20抗體。所述患者用一種藥物治療然后在用一種藥物治療之前監(jiān)測其有效性。例如，如果BLyS拮抗劑產(chǎn)生部分反應，可隨后用抗-CD20抗體治療以獲得完全反應或反之。免疫粘附素BR3-Fc與全長抗-CD20抗體相比具有較短的半衰期。為治療自身免疫病諸如類風濕性關節(jié)炎，如果抗-CD20抗體是Rituxan且BLyS拮抗劑是BR3-Fc，在優(yōu)選實施方案中，需要它們的患者在用Rituxan治療前接受BR3-Fc?？蛇x，開始可給藥所述患者兩種藥物，然后隨后可給藥僅僅一種或另一種藥物。
為調(diào)節(jié)患者使其耐受藥物和/或降低副作用的發(fā)生率諸如輸注相關的癥狀，其源自初始和隨后的治療性化合物的給藥，對需要它的哺乳動物可給藥一或所有兩種藥物的第一個或初始調(diào)節(jié)劑量，然后接受至少第二種治療有效劑量的一或所有兩種藥物，其中所述第二個和任何隨后的劑量可高于第一個劑量。第一個劑量用于調(diào)節(jié)哺乳動物以耐受更高的第二治療劑量。由此，哺乳動物能夠耐受高于初始給藥劑量的治療化合物的劑量?！罢{(diào)節(jié)劑量(conditioning dose)”是減少或降低與給藥治療化合物相關的第一個劑量的副反應的頻率或嚴重性的劑量。所述調(diào)節(jié)劑量可為治療劑量，亞治療劑量，癥狀劑量或亞癥狀劑量。治療劑量是對患者顯示治療效果的劑量，亞治療劑量是對所治療患者不顯示治療效果的劑量。癥狀劑量是誘導至少一種給藥副反應的劑量，亞癥狀劑量是不誘導副反應的劑量。一些副反應是發(fā)熱，頭痛，惡心，嘔吐，呼吸困難，肌痛，以及寒戰(zhàn)。
給藥途徑
BLyS拮抗劑和抗-CD20抗體根據(jù)已知方法給予人患者，諸如通過靜脈內(nèi)給藥，例如作為藥團或在一段時間內(nèi)連續(xù)輸注，經(jīng)皮下，肌內(nèi)，腹腔內(nèi)，腦脊髓內(nèi)(intracerobrospinal)，關節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，鞘內(nèi)，或吸入途徑。抗-CD20抗體將通常通過靜脈內(nèi)或皮下途徑給藥。所述藥物可通過相同或不同途徑給藥。
制品和試劑盒
本發(fā)明另一實施方案是制品，其包含BLyS拮抗劑和抗-CD20抗體，用于治療本文所述基于B細胞的惡性疾病或B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫病。一個具體實施方案中，所述制品含有SEQ ID 2所示BR3-Fc，和hu2H7v.16抗體，用于治療非霍奇金淋巴瘤。
所述制品包括容器和位于該容器表面的或與該容器相關的標簽或包裝插頁。適當?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內(nèi)含一種能有效治療目標疾病或紊亂的組合物，并具有無菌存取口(例如該容器可以是點滴袋(intravenous solution bag)或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。所述組合物中至少一種活性試劑是本發(fā)明的CD20結合抗體諸如RituxanTM或hu2H7v.16，另一種活性劑是BLyS拮抗劑諸如BR3-Fc。標簽或包裝插頁將指明，所述組合物是用于治療具體疾病，例如，非霍奇金淋巴瘤或類風濕性關節(jié)炎。所述標簽或包裝插頁還包含向患者給藥所述組合物的指導說明。所述制品還可包含第二個容器，該容器中含有可藥用緩沖液，如細菌抑制性注射用水(BWFI)，磷酸鹽緩沖液，Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。還可包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，和注射器。
也提供了可用于多種目的的試劑盒，例如用于B細胞殺傷試驗的試劑盒。與制品一樣，所述試劑盒包含容器和位于該容器表面的或與該容器相關的標簽或包裝插頁。所述容器含有包含至少一種本發(fā)明所述抗-CD20抗體和至少一種BLyS拮抗劑的組合物。還可包括其它容器，其含有例如稀釋劑和緩沖液，對照抗體。所述標簽和包裝插頁提供所述組合物的描述以及意圖的體外或診斷用途的說明。
試驗實施例
實施例1
開發(fā)CD20單克隆抗體
在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中，對6只Balb/c小鼠，3只Lewis大鼠(Charles River Laboratories，Hollister，CA)以及3只Armenian倉鼠(CytogenResearch和Development，Inc.，Boston，MA)用瞬時表達鼠CD20(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)的腺病毒感染的人293細胞進行超免疫。包含表達內(nèi)源水平鼠CD20的鼠細胞，和在大腸桿菌中表達的純化重組mCD20(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)在融合前強化，在融合前3天給藥。利用類似于已知方法的改良方法(Kohler和Milstein，1975；Hongo etal.，1995)，將來自所有動物的B細胞與骨髓瘤細胞(X63.Ag8.653；美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)融合。10-14天后，收獲小鼠和倉鼠融合物的上清液并通過直接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)篩選抗-鼠CD20和抗-人CD20抗體制備。mCD20 ELISA篩選從倉鼠融合物鑒定了59種陽性雜交瘤(2種與hCD20交叉反應)，從小鼠融合物中鑒定了1中陽性雜交瘤(與hCD20交叉反應)。亞克隆后經(jīng)有限稀釋顯示最高免疫結合的陽性克隆被注入Pristane激發(fā)的小鼠(Freund和Blair，1982)以便在體內(nèi)制備Mab或在體外培養(yǎng)。將腹水液和/或上清液收集在一起并通過親和層析來純化(Pharmacia fastprotein liquid chromatography[FPLC]；Pharmacia，Uppsala，Sweden)，如前所述(Hongo et al.，1995)，或利用前述方案的改良版本。純化的抗體制備物經(jīng)無菌過濾(0.2μm孔徑；Nalgene，Roch酯NY)保存在4℃、PBS中。
直接ELISA用于評估免疫血清
微量滴定板(NUNC)用100μl/孔鼠或人CD20(1μg/ml；Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)在0.05M碳酸鹽緩沖液，pH 9.6中包被。包被的板用ELISA洗滌緩沖液(PBS/0.05％Tween 20)洗滌3次，并用含有0.5％牛血清白蛋白和0.05％Tween 20的PBS(PBS/BSA/T20)封閉至少1小時。隨后去除封閉緩沖液并加入100μl稀釋樣品和對照物在室溫保溫1小時。隨后洗滌所述板并加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的物種特異性抗-IgG偶聯(lián)物(Sigma，St.Louis，MO或ICN Cappel，Durham，NC)(100μl/孔)，在室溫保溫1小時。所述板經(jīng)洗滌并與N四甲聯(lián)苯胺底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)一同保溫5-10分鐘，然后加入終止溶液(100μl/孔；BioFX Laboratories)。所述板隨后用自動讀板儀讀數(shù)(EL808，BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT)。
參考文獻
Hongo，J.S.，Mora-Worms，M.，Lucas，C.Fendly，B.M.Development andcharacterization of murine monoclonal antibodies-the latency-associated peptideoftransforming growth factor β1.Hybridoma 1995；14253-260.
Kohler，G.Milstein，C.Continuous cultures of fused cells secretingantibody of redefined specificity.Nature 1975；256495-497.
Freund YR Blair PBDepression of natural killer activity and mitogenresponsiveness in mice treated with pristane.J Immunol 1982；1292826-2830.
實施例2
2H7抗-CD20鼠單克隆抗體的人源化
鼠抗-人CD20抗體，2H7(也稱為m2H7，m指鼠)的人源化在一系列定點誘變步驟中進行。2H7的CDR殘基通過比較鼠2H7可變區(qū)的氨基酸序列(公開于U.S.5,846,818)以及已知抗體的序列(Kabat et al.，Sequences of proteinsof immunological interest，Ed.5.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991))來鑒定。輕鏈和重鏈的CDR區(qū)基于序列高變性來定義(Kabat et al.，同上)，并分別顯示于圖12和圖13中。利用合成寡核苷酸(表2)，定點誘變(Kunkel，Proc.NatL.Acad.Sci.82488-492(1985))被用于將所有6個鼠2H7 CDR區(qū)導入完整人Fab框架，其對應包含于質(zhì)粒pVX4中的共有序列VκI，VHIII(VL kappa亞組I，VH亞組III)。噬粒pVX4用于誘變以及在大腸桿菌中表達F(ab)s?；谑闪b0720，pB0475的衍生物(Cunningham et al.，Science 2431330-1336(1989))pVX4含有編碼人源化共有序列κ-亞組I輕鏈(VLκI-CL)和人源化共有序列亞組III重鏈(VHIII-CH1)抗-IFN-α(干擾素α)抗體的DNA片段。pVX4和具有堿性磷酸酶啟動子以及Shine-Dalgarno序列，它們都來源于另一前述基于pUC119的質(zhì)粒，pAK2(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992))。唯一的Spel限制位點被導入編碼F(ab)輕鏈和重鏈的DNA之間。抗-IFN-α重鏈和輕鏈中的頭23個氨基酸是StII分泌信號序列(Chang et al.，Gene 55189-196(1987))。
為構建2H7(2H7.v2)的CDR-交換(swap)版本，對pVX4的含脫氧尿苷模板進行定點誘變；抗-IFN-α的所有6個CDR被交換為鼠2H7 CDR。產(chǎn)生的分子稱為人源化2H7版本2(2H7.v2)，或2H7的″CDR-交換版本″；其具有m2H7 CDR殘基以及共有序列人FR殘基，見圖12和13。人源化2H7.v2用于進一步人源化。
表2顯示用于產(chǎn)生H和L鏈中每個鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苷酸序列。例如，CDR-H1寡核苷酸用于重新產(chǎn)生m2H7 H鏈CDR1。CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3分別指H鏈CDR1，CDR2和CDR3；類似地，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3指每個L鏈的CDR。CDR-H2中的取代在兩個步驟中利用兩種寡核苷酸CDR-H2A和CDR-H2B進行。
表2.用于將鼠2H7 CDR的CDR交換構建進入pVX4中的人框架的寡核苷酸序列。每種寡核苷酸中改變的殘基加下劃線。
基于鼠2H7框架殘基與人VκI，VHIII共有序列框架(圖12和13)與前述人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-4289(1992))的序列比較，數(shù)種框架突變通過定點誘變導入2H7.v2 Fab構建體。這些突變導致具體人共有序列框架殘基改變成鼠2H7框架中所見的那些，在可能影響CDR構象或抗原接觸的位置上。版本3含有VH(R71V，N73K)，版本4含有VH(R71V)，版本5含有VH(R71V，N73K)和VL(L46P)，版本6含有VH(R71V，N73K)和VL(L46P，L47W)。
m2H7抗體的人源化和嵌合Fab版本在大腸桿菌中表達并如下純化。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌株XL-1 Blue(Stra標記ene，San Diego，CA)用于制備雙鏈和單鏈DNA。對于每種變體，輕鏈和重鏈都利用脫氧核糖核苷酸法(Sequenase，U.S.Biochemical Corp.)進行完全測序。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株16C9(MM294的衍生物)，其鋪于含有5μg/ml羧芐青霉素的板上，并選單個集落用于蛋白表達。該單個集落在37℃生長于5ml LB-100μg/ml羧芐青霉素中5-8h。將5ml該培養(yǎng)物加入500mlAP5-100μg/ml羧芐青霉素并允許在37℃、帶障板的4L燒瓶中生長16小時。AP5培養(yǎng)基由以下組成1.5g葡萄糖，11.0 Hycase SF，0.6g酵母提取物(certified)，0.19g無水MgSO4，1.07gNH4Cl，3.73g KCL，1.2g NaCl，120ml 1M三乙醇胺，pH 7.4，加水到1L，然后通過0.1μm Sealkeen濾紙無菌過濾。
細胞通過在1L離心瓶中(Nalgene)于3000xg離心來收獲，去除上清。冷凍1h后，沉淀重懸于25ml冷10mM MES-10mM EDTA，pH 5.0(緩沖液A)。將250μl 0.1M PMSF(Sigma)加入來抑制蛋白水解，并加入3.5ml母液10mg/ml雞蛋白溶菌酶(Sigma)以輔助細菌細胞壁的水解。在冰上輕輕震搖1h后，將樣品在40,000Xg離心15min。上清液用緩沖液A補至50ml并加樣于2ml DEAE柱上，所述柱用緩沖液A平衡。流出物加于蛋白質(zhì)G-Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱(0.5ml床體積)，所述柱用緩沖液A平衡。該柱用10ml緩沖液A洗滌并用3ml 0.3M甘氨酸，pH 3.0，洗滌入1.25ml 1M Tris，pH 8.0。隨后利用Centricon-30(Amicon)將F(ab)緩沖液交換到PBS中，濃縮到終體積0.5ml。對所有F(ab)s進行SDS-PAGE凝膠電泳以確定純度，每種變體的分子量通過電噴質(zhì)譜(electrospray mass spectrometry)來證實。
用于表達全長IgG的質(zhì)粒通過將嵌合Fab的VL和VH結構域以及hu2H7抗體的人源化Fab亞克隆進入前述pRK載體以在哺乳細胞中表達來構建(Gorman et al.，DNA Prot.Eng.Tech.23-10(1990))。簡而言之，每種Fab構建體利用EcoRV和BlpI消化以切除VL片段，其被亞克隆入質(zhì)粒pDR1的EcoRV/BlpI位點用于表達完整輕鏈(VL-CL結構域)。此外，每種Fab構建體利用PvuII和ApaI消化以切除VH片段，其被亞克隆入質(zhì)粒pDR2的PvuII/ApaI位點以表達完整重鏈(VH-CH1-CH2-CH3結構域)。對于每種IgG變體，瞬時轉(zhuǎn)染可通過將輕鏈表達質(zhì)粒和重鏈表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細胞系293來進行(Graham et al.，J.Geh.Virol.，3659-74，(1977))。簡而言之，293細胞在轉(zhuǎn)染前一天分離(split)，并鋪于含有血清的培養(yǎng)基中。第二天，將作為磷酸鈣沉淀物制備的雙鏈DNA加入，然后加入pAdVAntageTM DNA(Promega，Madison，WI)，在3 7℃將細胞保溫過夜。細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在4天后收獲。抗體利用蛋白質(zhì)A-SepharoseCL-4B純化自培養(yǎng)物上清，然后將緩沖液交換入10mM琥珀酸鈉，140mMNaCl，pH 6.0，并利用Centricon-10(Amicon)濃縮。蛋白質(zhì)濃縮物通過定量氨基酸分析測定。
實施例3
該實施例描述人CD20 BAC轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的產(chǎn)生以及研究單獨的抗-CD20抗體或BLyS拮抗劑在hCD20+小鼠中的作用。
人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生自人CD20 BAC DNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。小鼠基于人CD20表達的FACS分析篩選。如從圖14的FACS圖中所見，轉(zhuǎn)基因雜合(Tg+/-)和純合(Tg+/+)小鼠在它們的B220+B細胞上表達人CD20。圖15顯示各種細胞表面標記物(CD43，IgM，IgD)在B細胞分化和成熟過程中的表達。在Tg+小鼠中，hCD20在前B和未成熟B細胞中表達，并且在大部分成熟B細胞上表達。篩選Tg+小鼠中人CD20在骨髓、脾、腸系膜LN和派爾結B細胞中的表達；結果示于圖16-19。將細胞門控在B220和CD43允許描述(delineation)各種B細胞群體。隨后，用抗-CD20 mAb處理Tg+小鼠(1mg總量＝50mg/kg，對于70kg的人等同于3.5mg)，以觀察對B細胞的影響，如圖20所示。對外周血、脾、淋巴結、骨髓和派爾結進行FACS分析。監(jiān)測血清抗-CD20 mAb水平。在小鼠中，B細胞消耗出現(xiàn)在用抗-CD20抗體治療的3-4天內(nèi)。不受任何理論限制，B細胞死亡似乎由ADCC和/或凋亡介導。用單獨的抗-hCD20 mAb(m2H7)治療Tg+小鼠導致外周血、成熟外周淋巴結B細胞、脾中的T2和濾泡B細胞中的B細胞消耗(見圖21-24)。然而，觀察到某些B細胞亞群對抗-CD20抗體的殺傷作用，盡管細胞表面存在非常高，很可能飽和水平的抗體。這些抗性B細胞是脾中的邊緣帶B細胞(圖23)，派爾結(圖25)和脾(圖27)中的生發(fā)中心B細胞。一個試驗中(圖27)，用第一個劑量的抗-CD20 mAb以100μg在第一天對小鼠進行注射，然后在第3天第二次注射100μg的劑量(很可能單個劑量50μg足以飽和B細胞)；T2/濾泡B細胞被消耗但派爾結的生發(fā)中心B細胞與抗-CD20mAb結合但對抗殺傷作用。
抗-CD20抗體治療后B細胞恢復。在第1天給藥小鼠抗體。圖26顯示，抗體治療后第6天，外周血中的B細胞是不可檢出的。在第6周，一旦清除抗體，hCD20+細胞開始被檢出，到第14周，B細胞似乎恢復正常水平。恢復來自不表達CD20的前體B細胞發(fā)育成CD20+成熟B細胞。
圖27顯示FACS圖，證實了脾生發(fā)中心B細胞對短期(單次注射)抗-CD20 mAb治療的抗性。小鼠未被免疫或用綿羊血紅細胞(SRBC)通過在第1天進行腹腔內(nèi)注射免疫來誘導脾內(nèi)的生發(fā)中心。生發(fā)中心自第7天出現(xiàn)。第8天，一組小鼠用人CD20的m2H7 mAb處理。小鼠對照組用mIgG2a同種型對照抗體處理。小鼠脾細胞在第12天分析。生發(fā)中心用PNA(花生血凝素)染色。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒有可檢測的生發(fā)中心細胞，而免疫的小鼠的脾顯示0.3％PNA染色細胞。T2/濾泡B細胞用抗-CD20抗體處理消耗，脾中的邊緣中心B細胞對抗體抵抗。
隨后，確定是否一旦B細胞消耗，小鼠就能產(chǎn)生T細胞非依賴性反應。在第0天，小鼠用m2H7或同種型對照抗體mIgG2a處理。第3-7天，B細胞消耗出現(xiàn)。第7天，對小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)注入肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonias)IV以誘導對多糖的反應。T細胞非依賴性反應在11天達到高峰。圖28所示結果證實了利用抗-CD20(2H7或Rituxan)的治療不影響來自脾邊緣帶和生發(fā)中心的B細胞反應，即非消耗的MZ和B1 B細胞賦予對T細胞非依賴性抗原的保護作用。該數(shù)據(jù)證實，盡管利用抗-CD20 mAb處理，人體液免疫特異性T細胞非依賴性B細胞反應的一些方面(在該情況下)是被保存的。
實施例4
該實施例證實抗-CD20 mAb和BLys拮抗劑治療對B細胞調(diào)節(jié)/消耗的協(xié)同作用。
BAFF/BLyS/TALL-1(TNF超家族成員)在未成熟T2，F(xiàn)O和MZ B細胞的存活和成熟中起重要作用，并促進自身反應性B細胞的競爭性存活(S.Mandala et al.，Science 296，346-9(2002)；F.Mackay，P.Schneider，P.Rennert，J.Browning，Annu Rev Immunol 21，231-64(2003)；P.A.Moore et al.，Science285，260-3(1999))。小鼠中可溶形式BAFF/BLyS/TALL-1的過表達導致B細胞增生，高γ球蛋白血癥和自身免疫性狼瘡樣綜合征(S.A.Marsters et al.，CurrBiol 10，785-8(2000))。反之，用中和BAFF/BLyS的BAFFR/BR3-Fc融合蛋白治療易患狼瘡的小鼠導致自身免疫血清學、腎疾病和死亡率的改善(R.Lesley et al.，Immunity 20，441-53(2004))。
材料和方法
在試驗實施例中，所用BR3-Fc或BAFFR/BR3-Fc是SEQ ID.NO.2所示hBR3-Fc。圖29所示，表達編碼人CD20的細菌人工染色體的FVB小鼠(稱為hCD20+小鼠)通過腹腔內(nèi)注射用抗-CD20 mAb(在第9天單次注射100微克)，BR3-Fc(從第1天到第12天每隔一天注射100微克)，或抗-CD20 mAb和BR3-Fc聯(lián)合治療。每組包含4只小鼠。最后一次注射后兩天，處死小鼠并分析hCD20+B細胞。對脾、血液、淋巴結和派爾結進行B細胞標記物CD21+CD23+)的FACS分析。
對于圖30中所示的試驗，hCD20 Tg+小鼠用對照IgG2a，BAFFR/BR3-Fc(100μg/小鼠IP每天一次，共12天)，抗-hCD20 mAb(100μg/小鼠IP在第9天)或BAFFR/BR3-Fc和抗-hCD20 mAb(與單次治療組相同的劑量)聯(lián)合來治療。B220+脾細胞在第13天分離并染色CD21和CD23。N＝5只小鼠/組。圖30顯示抗-hCD20 mAb和BR3-Fc組合在人CD20 Tg+小鼠中對B細胞消耗的協(xié)同作用。圖31顯示B220+總脾B細胞，邊緣帶(MZ)和濾泡(FO)B細胞從hCD20 Tg+小鼠消耗的定量。所述小鼠用單劑量的0.1mg對照IgG2aBAFF/BR3-Fc或抗-hCD20 mAb處理。脾細胞在第4天分析。N＝5小鼠/組。
結果
這些結果顯示在圖29、30和31中。
1.抗-CD20 mAb療法消耗血液和淋巴結中＞99％成熟循環(huán)B細胞。
2.BR3-Fc減少血液和淋巴結中的成熟循環(huán)B細胞。
3.抗-CD20 mAb療法消耗脾內(nèi)的T2和濾泡B細胞而非邊緣帶B細胞。
4.BR3-Fc減少脾內(nèi)的T2/濾泡和邊緣帶B細胞。
5.抗-CD20 mAb和BR3-Fc的聯(lián)合協(xié)同消耗脾內(nèi)所有B細胞的群體。
用BAFFR/BR3-Fc治療hCD20+小鼠2周導致MZ和T2/FO B細胞(圖30，小圖3)明顯降低。令人吃驚的是，BAFFR/BR3-Fc和抗-hCD20 mAb的聯(lián)合治療導致所有脾B細胞亞群(圖30，小圖4)的消耗。為進一步研究BAFF中和與抗-hCD20 mAb的潛在協(xié)同作用，定量用單劑量抗-hCD20 mAb和BAFFR/BR3-Fc治療后第4天的B細胞損失程度。雖然利用單劑量抗-hCD20mAb或BAFFR/BR3-Fc的治療導致MZ B細胞損失40-50％，F(xiàn)O B細胞損失33-70％，抗-hCD20 mAb和BAFFR/BR3-Fc聯(lián)用導致MZ和FO B細胞損失＞90％(圖31)。由此，存活因素在決定對抗-hCD20 mAb介導的B細胞消耗的敏感性中也起重要作用。
實施例5
BlyS拮抗劑的制備
BlyS82-285制備
編碼人BAFF(殘基82-285)的DNA片段被克隆入pET15b(Novagen)表達載體，產(chǎn)生具有N-末端His-標記和隨后的凝血酶切割位點的融合體。大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)培養(yǎng)物在37℃含有50mg/L羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長到中對數(shù)階段，然后在16℃冷卻，用1.0mM IPTG進行誘導。進一步生長12小時后，通過離心收獲細胞，保存在-80℃。細胞重懸于50mMTris，pH 8.0，和500mM NaCl，并在冰上進行超聲處理。離心后，將上清加載于Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)。該柱用50mM Tris，pH 8.0，500mM NaCl，和20mM咪唑洗滌，然后在含有250mM咪唑的相同緩沖液中梯度洗脫。將含有BAFF的級分收集在一起，加入凝血酶，用20mM Tris，pH 8.0，和5mMCaCl2在4℃對樣品透析過夜。蛋白質(zhì)進一步在monoQ(Pharmacia)柱，最后在S-200大小排阻柱上、在20mM Tris，150mM NaCl，和5mM MgCl2中純化。所得BLyS蛋白質(zhì)如下述使用。
BR3細胞外結構域制備
人BR3(殘基1-61)的細胞外結構域被亞克隆入pET32a表達載體(Novagen)，產(chǎn)生與N-末端硫氧還蛋白(TRX)-His-標記然后是腸激酶蛋白酶位點的融合體。大腸桿菌BL21(DE3)細胞(Novagen)在30℃生長，并用IPTG誘導蛋白表達。TRX-BR3用Ni-NTA柱(Qiagen)純化，用咪唑梯度洗脫，并用腸激酶(Novagen)切割。BR3在S-瓊脂糖柱上純化，在PBS、pH 7.8中于3mM氧化的和1mM還原的谷胱甘肽存在下再折疊過夜，用PBS透析，在MonoS柱上再純化，濃縮，并透析入PBS。
肽合成
MiniBR3作為C末端酰胺在Pioneer肽合成儀(PE Biosystems)上利用標準Fmoc化學合成。半胱氨酸19和32的側(cè)鏈巰基作為三氟乙酸(TFA)-穩(wěn)定acetamidomethyl(Acm)衍生物保護。通過用TFA中的5％三異丙基硅烷(triisopropyl silane)在室溫處理1.5-4hr從樹脂切除肽。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除TFA以后，通過加入乙醚沉淀肽，通過逆向HPLC(乙腈/H2O/0.1％TFA)純化。通過電噴質(zhì)譜鑒定肽。凍干以后，氧化的肽利用HPLC純化。含有還原的miniBR3的HPLC級分用NH4OH調(diào)節(jié)到pH 9；隨后通過加入微過量的K3Fe(CN)6形成半胱氨酸24和35之間的二硫鍵，通過HPLC純化的氧化的肽。通過用少量過量的I2處理HPLC洗脫物超過4小時，去除Acm基團(同時形成第二種二硫化物)。氧化進程通過分析型HPLC監(jiān)測，終產(chǎn)物再次通過HPLC純化。MiniR3的氨基末端通過與10倍摩爾過量的磺基-NHS-生物素(Pierce Chemical，Co.)反應以在樹脂上進行氨基末端生物素化。生物素化的miniBR3隨后從樹脂上切割下來并如上對非生物素化的miniBR3進行純化。
以下肽序列ECFDLLVRHWVACGLLR(BLyS0027)(SEQ ID NO9)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(BLyS0048)(SEQ ID NO6)和ECFDLLVRAWVPCSVLK(BLyS0051)(SEQ ID NO5)通常如下合成。肽在RaininSymphony肽合成儀系統(tǒng)上利用Rink酰胺樹脂和三倍過量的9-芴基甲氧基羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)(Fmoc)保護的氨基酸用2-(1H-苯并三嗪酮(Benzotriazone)-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲陽離子六氟磷酸酯(tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HBTU)活化，在存在5倍過量的二異丙基乙胺(diisopropylethylamine)(DIPEA)的條件下合成。氨基酸在每個位置偶聯(lián)兩次，然后用二甲基甲酰胺(DMF)20％哌啶溶液去保護，移動到下一個殘基。偶聯(lián)步驟之間的洗滌利用二甲基乙酰胺(DMA)進行。將最后的氨基酸偶聯(lián)到肽上并用DMF中的20％哌啶去保護以后，所述肽在其氨基末端利用3當量的乙酸酐和5個當量的在DMA中的DIPEA對其氨基末端?；?。可選，所述氨基末端通過用5-羧基熒光素或(+)-生物素酰化，或通過與另一熒光團或報道分子反應來修飾。隨后通過用含有2.5％水和2.5％三異丙基硅烷的95％三氟乙酸(TFA)溶液處理90分鐘從樹脂裂解所述肽。揮發(fā)物減壓去除，加入二乙醚并濾出固體。產(chǎn)生的沉淀物再次利用二乙醚洗滌，棄去混合的有機物。經(jīng)洗滌的固體隨后用乙酸，乙酸和乙腈的1∶1混合物，乙酸、乙腈和水的1∶1∶1混合物，以及乙酸、乙腈、水的1∶1∶8混合物連續(xù)洗滌，最后用水洗滌。組合的洗滌物經(jīng)凍干，產(chǎn)生的粗肽利用C18反向高效液體層析利用30分鐘含有0.1％三氟乙酸的10％-70％乙腈梯度水溶液在每種溶劑中以流速15ml每分鐘進行純化。含有所需多肽的級分通過向乙酸中加入碘飽和溶液直到溶液保持顏色來氧化。該溶液隨后被凍干。最后，在相同條件下第二次純化凍干的粗氧化肽，并且包含所需肽的級分再凍干。一些肽在相同條件下合成，但所述合成在PerSeptive Pioneer自動合成儀上利用4倍過量的氨基酸進行，每個殘基僅僅偶聯(lián)一次。
實施例6
17mer的噬菌體展示
文庫構建
編碼STII分泌信號序列(″STII ss″)的噬菌粒，接頭(GGGSGGG，SEQ IDNO)，和編碼M13噬菌體小蛋白III的C-末端殘基(例如，殘基267-421)(此后稱，″cP3″)的序列用作文庫構建的模板。兩種文庫利用Kunkel誘變技術和寡核苷酸構建，所述寡核苷酸導入了具有C32W突變的對應人BR3的殘基23-39的片段，也已知為″17-mer C32W″，還編碼17mer C32W區(qū)中的突變。具體地，文庫1編碼位于殘基31，34和36-39的取代密碼子(取代密碼子NNS＝任何密碼子)，文庫2編碼殘基27，30，31，34和36-39的取代密碼子(取代密碼子VNC＝編碼氨基酸L，P，H，R，I，T，N，S，V，A，D和G)。在取代密碼子中N是25％A，25％C，25％G，25％T；S是50％G/50％C；V是33％G/33％A/33％C；C是100％C。文庫1編碼1.1×109個成員，文庫2編碼4.3×108個成員。
文庫分選
噬菌體接受4輪選擇。通常，對于第一輪(固相分選)每輪的噬菌體輸入為1014噬菌體，對于其它輪(溶液相分選)為3×1012噬菌體。
噬菌體選擇 第一輪選擇是固相分選法。Maxisorp免疫板(96-孔)用如上制備的BLyS82-285在4℃包被(100μl，2μg/ml 50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中)過夜。隨后用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中的0.2％(w/v)BSA封閉所述孔1小時，并用PBS，0.05％Tween20洗滌3-5次。將噬菌體顆粒((100μl/孔，ELISA緩沖液(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween20)中)加入孔中。2小時后，所述孔用PBS，0.05％Tween20洗滌數(shù)次。結合于孔的噬菌體用0.1N HCl在室溫洗脫10min。洗脫的噬菌體通過加入1/20體積的2M Tris pH 11.0來中和。
為滴定噬菌體，對數(shù)相XL-1(OD600nm～0.3)用洗脫的噬菌體在37℃感染30分鐘。隨后，感染的細胞2YT中以10倍增量連續(xù)稀釋。感染細胞的10μl等分試樣鋪于每個羧芐青霉素板。來自每個文庫的約108噬菌體得自第一輪選擇。
為使噬菌體增殖，用洗脫的噬菌體在37℃感染對數(shù)相XL-1(OD600nm～0.3)30分鐘。將輔助噬菌體KO7，和羧芐青霉素在37℃加入感染物，終濃度1×1010pfu/ml KO7和50μg/ml羧芐青霉素另外保持30分鐘。培養(yǎng)物在終體積25ml的含有羧芐青霉素50μg/ml和25μg/ml卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中、37℃培養(yǎng)過夜。
所述噬菌體通過在10000rpm旋轉(zhuǎn)離心10分鐘純化。收集上清，將20％PEG/2.5M NaCl加入1/5的上清體積，混合并允許在室溫保持5分鐘。將噬菌體在10000rpm旋轉(zhuǎn)沉淀10分鐘。棄去上清，將噬菌體沉淀物再次5000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。該沉淀重懸在0.7ml的PBS中，在13000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘以除去碎片。在268nm讀取重懸的噬菌體沉淀的OD值。
第二輪和第四輪選擇利用溶液分選法。對于第二輪，將5μg/mlneutravidin(Pierce)于4℃包被Maxisorp Nunc 96-孔板過夜。隨后，所述板用200μl/ml Superblock(Pierce)在PBS中在室溫包被過夜。將Tween 20加入每個孔到終濃度0.2％(v/w)，并在室溫再封閉30分鐘。來自第一輪選擇的擴增的、純化的噬菌體與50nM生物素化的BLyS(終濃度)在含有Superblock0.5％和0.1％Tween20的150μl緩沖液中在室溫保溫1h。隨后用PBS/0.05％Tween稀釋所述混合物5-10倍，并以100μl/孔加入neutravidin包被的板。所述板在室溫輕搖5分鐘，允許噬菌體與生物素化的BLyS結合以便在孔中被捕獲。所述孔隨后用PBS/0.05％Tween20洗滌數(shù)次。結合的噬菌體用0.1NHCl洗脫10分鐘，如上述進行中和，滴定，擴增和純化。每個文庫的～3×106個噬菌體獲自第二輪選擇。
第三輪選擇與第二輪選擇類似，除了在稀釋并加入各個孔之前將2nM生物素化的BLyS與噬菌體一同保溫。結合的噬菌體用0.1N HCl洗脫10min，如上述進行中和，滴定和擴增。每個文庫的～104個噬菌體獲自第三輪選擇。
隨后在第四輪選擇中，對來自第三輪選擇的噬菌體進行兩種不同的選擇方法。方法4a類似于第二和第三輪選擇，除了噬菌體在0.5nM生物素化的BLyS存在下在室溫保溫1小時?；旌衔镫S后在室溫在存在1000倍過量(500nM)的非生物素化BLyS的條件下再保溫15分鐘，然后進行稀釋并加入包被的孔中。方法4b也類似于第二和第三輪選擇，除了將0.2nM BLyS與噬菌體一同保溫然后稀釋并加入每個孔。第四輪選擇的每輪中的結合噬菌體用0.1N HCl洗脫10min，如上述進行中和，滴定和擴增。每個文庫的～103個噬菌體獲自第四輪(4a和4b)選擇的每個文庫。
克隆分析
第四輪選擇以后，單個克隆在96孔板的400μl 2YT培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基補充了羧芐青霉素和KO7輔助噬菌體。這些培養(yǎng)物的上清用于噬菌體ELISA。對于噬菌體ELISA，Nunc Maxisorp 96-孔板用100μl含2μg/mlBLyS溶液的碳酸鹽緩沖液，pH 9.6在4℃包被過夜。所述板用PBS洗滌，并用含0.5％BSA的PBS封閉2小時。噬菌體上清以1∶4在ELISA結合緩沖液(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween20)中、在存在或不存在50nM BLyS的條件下稀釋，并在室溫保溫1小時。隨后將100μl稀釋的噬菌體上清液轉(zhuǎn)移到包被的板并允許其輕柔震搖以捕獲噬菌體20分鐘。所述板隨后用PBS/0.05％Tween20洗滌數(shù)次。將在PBS/0.05％Tween20(1∶5000)中的每孔100μl HRP-偶聯(lián)的抗-M13抗體隨后轉(zhuǎn)移到所述板并保溫20分鐘。用PBS/0.05％Tween洗滌然后用PBS洗滌之后，所述板與含有0.8mg/mlOPD(Sigma)和0.01％H2O2的100μl PBS底物溶液保溫5min。反應用100μl/孔的1M H3PO4猝滅，并在490nm讀板。檢測的克隆隨后如前所述進行測序(Weiss，G.A.，Watanabe，C.K.，Zhong，A.，Goddard，A.，和Sidhu，S.S.(2000)Proc.NatLAcad.Sci.U.S.A.97，8950-8954)。質(zhì)量可接受的序列被翻譯并進行比對。17mer的氨基酸序列見于圖32。
在BlyS結合測定中進一步分析14個克隆以測定它們的IC50值。在第四輪中，克隆2和7具有高數(shù)目的同胞(具有相同序列的克隆)。根據(jù)噬菌體ELISA測定，克隆13，19，22，26，32，39和44與板的結合受到50nM BLyS的極大抑制(圖11)。克隆35，45，68，82和90的結合在噬菌體ELISA測定中也極大地受到抑制(圖11)。來自這14個克隆的噬菌體上清用于感染對數(shù)相的XL-1，其如上述進行擴增和純化。
為相對于展示和噬菌體產(chǎn)量進行標準化并確定IC50測定的適宜稀釋度，來自各個克隆的純化噬菌體的連續(xù)稀釋物在ELISA結合緩沖液(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween20)中在室溫保溫1小時。將100μl每種稀釋物轉(zhuǎn)移到BlyS包被的板，并如上所述輕搖該板以捕獲噬菌體20分鐘。結合的噬菌體通過HRP偶聯(lián)的抗M13抗體檢測，然后是OPD/H2O2底物反應，如上述猝滅并在490nm讀數(shù)。通過該方法，在490nm產(chǎn)生大約1O.D.的每種克隆的稀釋度被測定并用于IC50測定中。
為測定14種克隆中每種的IC50值，在4℃用100μl含2μg/ml BLyS溶液的碳酸鹽緩沖液pH 9.6包被Nunc Maxisorp 96-孔板過夜。14種克隆中每種的擴增的、純化的噬菌體的稀釋物在范圍在0.003-1000nM的系列BlyS濃度存在下，在130μl ELISA結合緩沖液(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween20)中于室溫保溫1小時。將100μl每種這些濃度系列轉(zhuǎn)移到BlyS包被的板，捕獲，洗滌，用HRP-偶聯(lián)的抗-M13抗體檢測，并如上述進行加工。通過對14種克隆中的每一種的ELISA信號進行4參數(shù)擬合測定IC50值。IC50值的范圍為0.4(克隆44)-11nM(克隆22)。
競爭性取代(competitive displacement)ELISA
以下的17-mer，Ac-ECFDLLVRHWVACGLLR-NH2(SEQ ID NO9)(″BLyS0027″)，Ac-ECFDLLVRHWVPCGLLR-NH2(SEQ IDNO6)(″BLyS0048″)，Ac-ECFDLLVRAWVPCSVLK-NH2(SEQ IDNO5)(″BLyS0051″)如上述合成。Nunc Maxisorp 96-孔板在4℃用100μl含2μg/ml BlyS溶液的碳酸鹽緩沖液pH 9.6包被過夜。所述板用PBS洗滌并用含1％脫脂奶的PBS封閉。BR3 ECD(殘基1-61)和上述17-mer肽的連續(xù)稀釋物在含有3ng/ml生物素化的miniBR3的PBS/0.05％Tween 20中制備。用PBS/0.05％Tween洗滌后，將100μl/孔每種稀釋物轉(zhuǎn)移，并在室溫保溫1小時。所述板用PBS/0.05％Tween洗滌，并與100μl/孔的0.1U/ml鏈霉抗生物素-POD(Boehringer Mannheim)在PBS/0.05％Tween中保溫15min。用PBS/0.05％Tween洗滌然后PBS洗滌之后，所述板與含有0.8mg/mlOPD(Sigma)和0.01％H2O2的100μl PBS底物溶液一起保溫5分鐘。所述反應用100μl/孔的1M H3PO4猝滅，并在490nm讀板。IC50值通過競爭性取代ELISA信號的四參數(shù)擬合測定。初始miniBR3和BR3細胞外結構域母液的濃度通過定量氨基酸分析測定。
利用這種測定法測定BR3 ECD，BLyS0027，BLyS0048和BLyS0051的IC50值。所有17-mer肽對BlyS的親和力都超過62-mer BR3 ECD。
實施例4
肽-PEG偶聯(lián)物
BLyS82-285制備和肽合成 如以上實施例5所述。
聚合物與肽的偶聯(lián)
PEG化的17-mer肽通過利用N-羥基琥珀酰亞胺化學(NHS)修飾的線性PEG與伯氨反應(賴氨酸和N末端)制備。所有PEG-NHS(PEG-SPA)試劑均購自Nektar Therapeutics，San Carlos，CA并保存在-70℃液氮中。所述肽以1mg/mL溶解在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中。向0.4mL肽溶液等分試樣加入固體2KPEG-SPA，SKPEG-SPA，或20KPEG-SPA。加入足夠的固體以使PEG-SPA與肽的摩爾比為3∶1。這些溶液在室溫保溫1小時然后通過逆向分析HPIC對50μl部分溶液進行反應進程的分析。PEG的加入和保溫重復兩次直到所有肽被修飾。檢測PEG化的肽的BlyS結合而不進行進一步純化。純化的偶聯(lián)產(chǎn)物中PEG∶肽的比例大約為1∶1。
競爭性取代ELISA
17-mer，Ac-ECFDLLVRHWVPCGLLR-NH2(SEQ ID NO_)(″blys0048″)如上所述合成。ECFDLLVRHWVPCGLLK(lys0095)(SEQ ID NO_)如上所述合成并與2K，5K和20K PEG-NHS中的每一種偶聯(lián)。Nunc Maxisorp 96-板在4℃與100μl含2μg/ml Blys溶液的碳酸鹽緩沖液pH9.6包被過夜。所述板用PBS洗滌并用含1％脫脂奶的PBS封閉。mini-BR3(SEQ.ID.)和上述17-mer肽以及PEG-肽偶聯(lián)物的連續(xù)稀釋物在含有3ng/ml生物素化的miniBR3的PBS/0.05％Tween 20中制備。用PBS/0.05％Tween洗滌后，將100μl/孔的每種稀釋物轉(zhuǎn)移，并在室溫保溫1小時。所述板用PBS/0.05％Tween洗滌，并與100μl/孔的0.1U/ml鏈霉抗生物素-POD(BoehringerMannheim)在PBS/0.05％Tween中保溫15分鐘。用PBS/0.05％Tween然后用PBS洗滌后，將所述板與含有0.8mg/ml OPD(Sigma)和0.01％H2O2的100μl PBS底物溶液一同保溫5分鐘。所述反應用100μl/孔1M H3PO4猝滅并在490nm讀板。IC50值通過競爭性取代ELISA信號的四參數(shù)擬合測定。公式為y＝m1+(m2-m1)/(1+m0/m4)^m3，其中m1是無限競爭物濃度的吸光度，m2是沒有加入競爭物時的吸光度，m3是接近中點的曲線斜率，m4是IC50值m0是競爭物(在本發(fā)明中為肽)濃度。生物素化的miniBR3的濃度為約10pM。初始miniBR3母液的濃度通過定量氨基酸分析測定。
結果
利用該測定法，競爭性取代ELISA信號的四參數(shù)擬合為以下物質(zhì)提供了IC50值19nM的blys0095，14nM的blys0048和43nM的blys0095-2kPEG偶聯(lián)物，51nM的blys0095-5kPEG偶聯(lián)物。類似地，分離試驗的競爭性取代ELISA信號的擬合提供了99nM的blys0095-20kPEG偶聯(lián)物和15nM的blys0048的IC50值。
17-mer肽-PEG偶聯(lián)物(2k，5k和20k)證實了與Blys的結合能力。PEG與blys0095的偶聯(lián)物與類似的未偶聯(lián)肽相比沒有明顯降低其親和力。
結論
本發(fā)明的試驗證實了令人吃驚的結果，即聯(lián)用抗-CD20 mAb和BR3-Fc對消耗所有B細胞亞群具有很高的協(xié)同作用。
參考文獻
本發(fā)明中所引用的參考文獻，包括專利，公開的申請以及其它公開出版物，包含在本文中作為參考。
權利要求
1.從混合的細胞群體消耗B細胞的方法，包括將細胞的混合群體與BLyS拮抗劑及CD20結合抗體接觸。
2.權利要求1的方法，其中所述B細胞是人B細胞，且所述混合的細胞群體與BLyS拮抗劑及CD20結合抗體在體內(nèi)接觸。
3.權利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗劑是免疫粘附素。
4.權利要求的方法3，其中所述免疫粘附素選自包含BR3細胞外結構域的BR3免疫粘附素，包含TACI細胞外結構域的TACI免疫粘附素，以及包含BCMA細胞外結構域的BCMA免疫粘附素組成的組。
5.權利要求4的方法，其中所述BR3免疫粘附素是SEQ ID No.2的BR3-Fc。
6.權利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗劑是抗-BLyS抗體。
7.權利要求6的方法，其中所述抗-BLyS抗體與BLyS在含有殘基162-275的BLyS的區(qū)域中結合。
8.權利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗劑是抗-BR3抗體。
9.權利要求8的方法，其中所述抗-BR3抗體與BR3在包含人BR3的殘基23-38的區(qū)域中結合。
10.權利要求1的方法，其中所述抗-CD20抗體是RituxanTM。
11.權利要求1的方法，其中所述抗-CD20抗體是hu2H7v.16，其具有SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16分別所示的輕鏈和重鏈序列。
12.權利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗劑與抗-CD20抗體協(xié)同作用以消耗B細胞。
13.治療特征在于表達CD20的B細胞的B細胞腫瘤和惡性疾病的方法，包括給藥患有腫瘤和惡性疾病的患者治療有效量的CD20結合抗體以及治療有效量的BLyS拮抗劑。
14.權利要求13的方法，其中所述CD20結合抗體與BLyS拮抗劑同時給藥。
15.權利要求13的方法，其中所述CD20結合抗體與BLyS拮抗劑序貫給藥。
16.權利要求13的方法，其中所述BLyS拮抗劑在給藥CD20結合抗體之前給藥。
17.權利要求13的方法，其中所述B細胞腫瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，小淋巴細胞(SL)NHL，淋巴細胞優(yōu)勢型霍奇金病(LPHD)，濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤，急性淋巴細胞白血病(ALL)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)和毛細胞白血病。
18.權利要求17的方法，其中所述B細胞腫瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴細胞(SL)NHL。
19.權利要求13的方法，其中所述BLyS拮抗劑是免疫粘附素。
20.權利要求19的方法，其中所述免疫粘附素選自包含BR3細胞外結構域的BR3免疫粘附素，包含TACI細胞外結構域的TACI免疫粘附素，以及包含BCMA細胞外結構域的BCMA免疫粘附素組成的組。
21.權利要求20的方法，其中所述BR3免疫粘附素是SEQ ID NO.2的hBR3-Fc。
22.權利要求13的方法，其中所述BLyS拮抗劑是抗-BLyS抗體。
23.權利要求14的方法，其中所述抗-BLyS抗體與BLyS在含有殘基162-275的BLyS的區(qū)域內(nèi)結合。
24.權利要求13的方法，其中所述BLyS拮抗劑是抗-BR3抗體。
25.權利要求8的方法，其中所述抗-BR3抗體與BR3在包含人BR3的殘基23-38的區(qū)域中結合。
26.權利要求13的方法，其中所述CD20結合抗體是嵌合抗體，其包含與人抗體恒定區(qū)融合的鼠抗體可變區(qū)。
27.權利要求的方法26，其中所述嵌合抗體是RituxanTM。
28.權利要求13的方法，其中所述CD20結合抗體是人源化抗體。
29.權利要求28的方法，其中所述人源化抗體是具有分別由SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16顯示的輕鏈和重鏈序列的hu2H7v.16。
30.權利要求21的方法，其中所述CD20結合抗體是RituxanTM或hu2H7v.16，其具有分別由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16顯示的輕鏈和重鏈序列。
31.權利要求30的方法，其中BR3-Fc以約2-5mg/kg的劑量，Rituxan以約375mg/m2的劑量給藥。
32.權利要求13的方法，其中所述BLyS拮抗劑以及CD20結合抗體的給藥產(chǎn)生協(xié)同效果以消耗B細胞。
33.權利要求13的方法，其中所述BLyS拮抗劑以及CD20結合抗體與化療聯(lián)合給藥。
34.緩解B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病的方法，包括給藥患有所述疾病的患者治療有效量的CD20結合抗體以及治療有效量的BLyS拮抗劑。
35.權利要求34的方法，其中所述CD20結合抗體與BLyS拮抗劑序貫給藥。
36.權利要求的34方法，其中所述BLyS拮抗劑的給藥在CD20結合抗體之前給藥。
37.權利要求34的方法，其中所述自身免疫疾病選自以下疾病組成的組類風濕性關節(jié)炎，幼年類風濕性關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，韋格納病，炎性腸病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，多發(fā)性硬化，銀屑病，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病，重癥肌無力，血管炎，糖尿病，雷諾綜合征，干燥綜合征和腎小球腎炎。
38.權利要求37的方法，其中所述自身免疫病是類風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
39.權利要求的34方法，其中所述BLyS拮抗劑是免疫粘附素。
40.權利要求39的方法，其中所述免疫粘附素選自包含BR3細胞外結構域的BR3免疫粘附素，包含TACI細胞外結構域的TACI免疫粘附素，以及包含BCMA細胞外結構域的BCMA免疫粘附素組成的組。
41.權利要求40的方法，其中所述BR3免疫粘附素是SEQ ID NO.2的BR3-Fc。
42.權利要求34的方法，其中所述BLyS拮抗劑是抗-BLyS抗體。
43.權利要求34的方法，其中所述BLyS拮抗劑是抗-BR3抗體。
44.權利要求34的方法，其中所述CD20結合抗體是嵌合抗體，其包含融合于人抗體恒定區(qū)的鼠抗體可變區(qū)。
45.權利要求44的方法，其中所述嵌合抗體是RituxanTM。
46.權利要求34的方法，其中所述CD20結合抗體是人源化抗體。
47.權利要求28，的方法，其中所述人源化抗體是具有分別由SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16顯示的輕鏈和重鏈序列的hu2H7v.16。
48.權利要求41的方法，其中所述CD20結合抗體是RituxanTM或hu2H7v.16，其具有分別由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16顯示的輕鏈和重鏈序列。
49.權利要求48的方法，其中BR3-Fc以約2-5mg/kg的劑量給藥，Rituxan以約2.5-10mg/kg的劑量給藥。
50.權利要求34的方法，其中所述BLyS拮抗劑以及所述CD20結合抗體的給藥產(chǎn)生協(xié)同作用以消耗B細胞。
51.權利要求38的方法，其中所述BLyS拮抗劑以及所述CD20結合抗體與利用選自以下物質(zhì)組成的組的藥物的療法聯(lián)用非類固醇抗炎藥(NSAIDs)，糖皮質(zhì)激素，潑尼松，和改善疾病型抗風濕藥物(DMARD)。
52.消耗患有B細胞腫瘤和B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病的患者中的邊緣區(qū)和生發(fā)中心B細胞的方法，包括給予需要的患者治療有效量的CD20結合抗體以及治療有效量的BLyS拮抗劑。
53.權利要求1，13，34和52之一的方法，其中所述BLyS拮抗劑選自具有序列SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的多肽。
54.組合物，其包含CD20結合抗體和BLyS拮抗劑。
55.制品，其包含CD20結合抗體，BLyS拮抗劑，以及標簽，其中所述標簽表明所述組合物用于治療B細胞腫瘤和B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫病。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用抗－CD20抗體以及BLyS拮抗劑的聯(lián)合療法來治療基于B細胞的惡性疾病以及B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病的方法。
文檔編號C07K7/00GK1835972SQ20048002224
公開日2006年9月20日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權日2003年6月5日
發(fā)明者安德魯·錢, 龔謙, 弗萊維厄斯·馬丁 申請人:健泰科生物技術公司