專利名稱：獲得氨酯保護的α－氨基酸N－羧酸酐的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐的新方法。使用這種新方法，可以在催化量的三乙撐二胺的存在下，由α-氨基酸N-羧酸酐合成氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐，而不加入顯著量的叔胺型堿。
任選受保護的α-氨基酸N-羧酸酐(以首字母縮略詞NCA表示)是通常用于形成高分子量聚α-氨基酸和用于制備二肽的?；瘎?。NCA是化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷幕衔?，其不形成任何不希望的副產(chǎn)物，尤其是通過重排作用，其唯一的反應(yīng)副產(chǎn)物是二氧化碳。只要NCA與氨基酸的自由氨基官能團反應(yīng)，就會立即釋放出二氧化碳并形成二肽，所述二肽本身也含有自由氨基官能團。該氨基將與NCA反應(yīng)并形成三肽等。因此NCA可以用于形成聚α-氨基酸，但是它們不能容易地用于連續(xù)合成多肽，因為難以控制多重縮合次級反應(yīng)如低聚反應(yīng)。
文獻中已經(jīng)描述了氨酯基團取代的α-氨基酸N-羧酸酐，它們用于肽的合成。氨酯取代基提供高程度的保護并允許在偶聯(lián)反應(yīng)期間使聚合反應(yīng)最小化。氨酯保護的NCA，下文中簡稱為UNCA，具有未取代NCA的所有優(yōu)點而沒有未取代NCA的缺點。
UNCA允許可控合成多肽，而不需要對羧基進行任何預(yù)活化，也不需要加入任何添加劑如N-羥基苯并三唑。因此，在溶液中制備的肽的提純得以簡化，因為該肽合成反應(yīng)的唯一副產(chǎn)物是二氧化碳。
UNCA還是激素或抗AIDS藥物合成中非常有用的原料。
室溫和常壓條件下為結(jié)晶狀態(tài)的UNCA在標準的實驗室操作和儲存條件以及肽合成條件下是穩(wěn)定的。
由NCA合成UNCA的兩條主要路線如下1)可以通過烷基或芳烷基氯甲酸酯如Fmoc-Cl(9-芴基甲氧羰基氯甲酸酯)或氯甲酸芐酯與NCA在至少是化學(xué)計量量的叔胺的存在下進行縮合而合成UNCA。所述叔胺傳統(tǒng)上是N-甲基嗎啉，其通過加入鹽酸而除去。由此將NCA加入到惰性溶劑如THF的溶液中，并冷卻。一次性加入1.1-1.3倍當量的烷基或芳烷基氯甲酸酯，然后緩慢加入至少1.5倍當量的叔胺，例如N-甲基嗎啉。所得懸浮液在-25至-5℃的溫度下靜置1-2小時。接下來，緩慢加入溶解于二氧六環(huán)中的鹽酸，直至獲得約4-5的pH值。過濾除去由此形成的叔胺鹽酸鹽，濃縮UNCA并使其結(jié)晶。
該方法的所有步驟均在惰性氣體(N2)保護下進行，所有溶劑均在使用前用4分子篩進行干燥(William D.Fuller et al.，Urethane-protected-alpha-amino acidN-carboxyanhydrides and peptide synthesis，Biopolymers，1996，40，183-205)。
該合成路線不是非常適用于制備特定保護的α-氨基酸N-羧酸酐，尤其是叔丁氧羰基(t-butoxylcarbonyl)保護的那些，氯甲酸叔丁酯在-20℃以上或在叔胺存在下非常不穩(wěn)定。
2)還可以通過重碳酸二烷基酯與NCA的縮合來合成UNCA。該反應(yīng)釋放醇分子和二氧化碳分子。該合成必須絕對在大量、至少是相對于所用NCA摩爾量為50％摩爾量的叔胺如N-甲基嗎啉以及催化量的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)或吡啶的存在下進行(William D.Fuller et al.，Urethane-protected-alpha-amino acidN-carboxyanhydrides and peptide synthesis，Biopolymers，1996，40，183-205)。該合成路線尤其適用于利用重碳酸二叔丁酯合成被叔丁氧羰基保護的α-氨基酸N-羧酸酐。
申請WO89/08643描述了具有氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐和α-氨基酸N-硫代羧酸酐，其化學(xué)式如下 其中，R和R′代表氫原子、烷基、環(huán)烷基、由取代烷基所取代的環(huán)烷基、芳基或取代芳基，并且至少一個R或R’基團不代表氫原子；R″代表烷基、芳基、取代烷基或取代芳基；Z代表氧或硫原子，n是0、1或2。
這些化合物通過在無水條件下，在過量加入的叔胺型堿的存在下，使NCA與鹵甲酸酯在惰性溶劑如甲苯中反應(yīng)而制備。
合成UNCA的現(xiàn)有方法并不令人滿意。實際上，上述最好的方法即相對于所用NCA的量使用至少等于50％摩爾量的叔胺型堿的方法僅僅提供約60％的產(chǎn)率，前提是溶劑用4分子篩干燥，并且在-20至-15℃之間進行操作。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用非常低催化量即相對于所用NCA的摩爾量為少于5摩爾％的三乙撐二胺(TEDA)，而不加入任何叔胺型堿，得到非常好的結(jié)果。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，首字母縮略詞NCA是指α-氨基酸N-羧酸酐，UNCA是指氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐。在本發(fā)明的意義上，催化量是指顯著少于化學(xué)計量所需量的量，更具體而言是指少于50％的化學(xué)計量所需量的量。本發(fā)明涉及獲得氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐(UNCA)的方法，所述UNCA具有化學(xué)式I， 化學(xué)式I其中R1和R2相同或不同，一起或各自獨立地代表氫原子或者天然或合成的α-氨基酸側(cè)鏈，所述側(cè)鏈任選具有根據(jù)需要的保護官能團；R3代表線型或支化的、飽和或不飽和的C1-C10烷基或者具有7-14個碳原子的芳烷基或烷芳基，該方法的特征在于具有化學(xué)式II的α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)， 化學(xué)式II其中R1和R2具有與化學(xué)式I中相同的意義，與相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量為至少1倍當量的化學(xué)式III的重碳酸鹽， 化學(xué)式III其中R3具有與化學(xué)式I中相同的意義，在相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量而言為催化量的1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷、也稱作三乙撐二胺(TEDA)的存在下，在熔點低于約-20℃的惰性有機溶劑中進行反應(yīng)。
天然或合成α-氨基酸是在鏈的第一個碳上具有氨基官能團和羧酸官能團的氨基酸。α-氨基酸的其余部分稱作α-氨基酸的側(cè)鏈。
R1和R2根據(jù)需要由目前用于氨基酸和肽領(lǐng)域的保護基團所保護(Bodansky，Principle of peptide synthesis，Springer-Verlag，1984；Alpha amino-acidN-carboxyanhydrides and related heterocycles，Hans R.Kricherdorf)。
R1和R2相同或不同，有利地代表氫原子、線型或支化C1-C8烷基，所述烷基任選地包含一個或多個氨基酸和肽領(lǐng)域中常用的取代基。所述取代基具體選自O(shè)H、SH、NH2、NHC(NH)NH2、CONH2、O-(C6-C10芳基)、S-(C1-C6烷基)、COO-(C1-C6烷基)、COO-(C5-C8芳烷基)、尤其是芐酯基。
基團R1和R2可以有利地代表C5-C7環(huán)烷基，所述環(huán)烷基任選地由一個或多個氨基酸和肽領(lǐng)域中常用的基團所取代。所述取代基具體選自鹵素、OH、O-(C1-C6烷基)、O-(C6-C10芳基)、C1-C6烷基。
R1和R2基團可以有利地代表苯基、萘基、5或6元雜芳基或吲哚基，其任選地被一個或多個氨基酸和肽領(lǐng)域中常用的基團取代。所述取代基具體選自鹵素、OH、O-(C1-C6烷基)、O-(C6-C10芳基)、C1-C6烷基。
由于顯而易見的立體位阻原因，R1和R2不能同時代表環(huán)狀基團。環(huán)狀基團是指所述C5-C7環(huán)烷基以及所述苯基、萘基、5或6元雜芳基或吲哚基。
R1和R2還可以一起形成任選地被一個或多個氨基酸和肽領(lǐng)域中常用的基團取代的C5-C7環(huán)烷基。所述基團具體選自鹵素、OH、O-(C1-C6烷基)、C1-C6烷基、O-(C6-C10芳基)。
如果R1和R2不一起形成C5-C7環(huán)烷基，那么有利的是，R1和R2基團中的至少一個如前所述代表氫原子。
在化學(xué)式II的化合物中，官能團有利地被合適的保護基團所保護。
根據(jù)本發(fā)明的有利替代方案，R3代表甲基、乙基、叔丁基、苯甲基、烯丙基、9-芴基甲基。事實上，盡管有許多氨酯可以用作保護基團，但是這些氨酯中僅有少數(shù)廣泛用于肽的合成。尤其可以提及的是叔丁氧羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。因此，由這些取代基所保護的α-氨基酸N-羧酸酐尤其受到關(guān)注。
使用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以避免使用相對于所用NCA的摩爾量而言為50-200摩爾％的非常大量的叔胺?，F(xiàn)有技術(shù)中所用的叔胺即N-甲基嗎啉和吡啶，實際上存在許多問題。尤其是，它們的應(yīng)用涉及高度稀釋、額外產(chǎn)物的形成、附加的分離步驟、難以重復(fù)利用，而且成本很高。
使用根據(jù)本發(fā)明的方法，還可以顯著縮短反應(yīng)時間，從而少于24小時，并且有利地為約1-4個小時，而對于現(xiàn)有技術(shù)的方法來說，反應(yīng)時間為30小時-5天。
使用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以獲得UNCA，其純度利用GPC(氣相色譜法)測得為大于90％，有利的是大于95％，并且具有大于60質(zhì)量％的非常令人滿意的產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明的有利替代方案，溶劑選自環(huán)狀或線型C4-C10醚和氯代C1-C5烷烴。有利的是，溶劑為THF(四氫呋喃)。
當反應(yīng)溶劑為THF時，對于所用1摩爾化學(xué)式II的NCA，所加入的溶劑量通常包含500g-2kg溶劑。
根據(jù)本發(fā)明方法的有利替代方案，TEDA的加入量為0.1-5摩爾％的TEDA，相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量。更有利的是，TEDA的加入量為0.2-1摩爾％，相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量。
化學(xué)式II的NCA有利地與1.1-1.5倍當量的化學(xué)式III的重碳酸鹽在TEDA的存在下、尤其是在相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量為0.2-1摩爾％的TEDA的存在下反應(yīng)。
化學(xué)式III的重碳酸鹽有利的是加入到部分溶劑中，有利的是相對于所用重碳酸鹽的總重量為0.5-2.0重量份數(shù)的溶劑中形成溶液，再加入到反應(yīng)介質(zhì)中，所述反應(yīng)介質(zhì)包含溶劑的其它所需部分、通常是待轉(zhuǎn)化的化學(xué)式II的NCA和TEDA。加入重碳酸鹽時，反應(yīng)介質(zhì)的溫度保持在-20至5℃之間，有利的是在-15至5℃之間，甚至更有利的是在-10至0℃之間。根據(jù)本發(fā)明的有利替代方案，反應(yīng)在惰性氣氛中進行。
TEDA的催化作用使得向反應(yīng)介質(zhì)中逐漸加入重碳酸鹽的技術(shù)成為可能，利用這種技術(shù)可以通過停止加入來控制放熱，從而避免任何危險反應(yīng)失控的風(fēng)險。
使用該方法，可以在濃度高得多的介質(zhì)中進行反應(yīng)，這與縮短的反應(yīng)時間相結(jié)合，提供生產(chǎn)率的顯著提高，并且極大地限制聚合風(fēng)險。
化學(xué)式III的重碳酸鹽加入完成時，有利的是在-5至10℃的溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)介質(zhì)至少30分鐘。
化學(xué)式III的重碳酸鹽加入完成時，任選地使反應(yīng)介質(zhì)處于攪拌狀態(tài)中的同時，過濾反應(yīng)介質(zhì)，然后通過減壓蒸發(fā)除去至少80％、有利的是約90％的溶劑。接下來，如果需要則在除去所述合適的保護基團后，優(yōu)選加入等于通過蒸發(fā)除去的反應(yīng)溶劑量的非溶劑化合物，以使得化學(xué)式I的UNCA沉淀，隨后通過過濾回收。
根據(jù)本發(fā)明的一個替代方案，在15至30℃、有利的是在室溫溫度下通過減壓蒸發(fā)除去溶劑。
UNCA的非溶劑化合物有利的是C5-C10線型或支化烷烴，尤其是庚烷B。
根據(jù)本發(fā)明的替代方案，隨后在低于30℃的溫度下真空干燥沉淀物。
下列實施例說明本發(fā)明并且是非限制性的。
實施例1制備Boc-Val-NCA首字母縮略詞Val代表α-氨基酸纈氨酸。因此Val-NCA代表具有下列化學(xué)式的化合物 在裝配有低溫恒溫器、漏斗、氮氣流系統(tǒng)、機械攪拌和溫度計探頭的1升雙層夾套反應(yīng)器中，在用氮氣惰性化并冷卻至-5±2℃之后加入-204g THF，-37.5g(0.26mol)Val-NCA，-0.15g(1.3mmol)TEDA。
將反應(yīng)介質(zhì)攪拌1/2小時，然后通過滴液漏斗用2個小時向其中緩慢加入69g(0.316mol)(Boc)2O在50g THF中的溶液，同時將溫度控制在-5℃±2℃。產(chǎn)生少量氣體。
完成(Boc)2O的滴加后繼續(xù)攪拌反應(yīng)介質(zhì)1小時。
于0℃，在惰性預(yù)濾層(inert pre-layer)上用THF過濾反應(yīng)介質(zhì)，并用50ml THF清洗反應(yīng)器和惰性預(yù)濾層。
將濾出液再次在氮氣下加入到雙層夾套反應(yīng)器中，在140-160mbar的壓力下，在18-26℃的反應(yīng)介質(zhì)溫度下，蒸餾出300ml THF。
在25℃的溫度下，加入300ml(215g)庚烷B。纈氨酸UNCA產(chǎn)物沉淀。然后在25℃和900-100mbar的條件下蒸餾出300ml THF/庚烷B混合物，直至反應(yīng)介質(zhì)的體積達到約100ml。隨后在約25℃的溫度下加入200ml庚烷B。將反應(yīng)介質(zhì)冷卻到-10℃，再保溫1小時。在氮氣氣氛下，于-10℃，在燒結(jié)的N°3過濾器上進行過濾。在25±5℃的溫度下，在真空烘箱中干燥產(chǎn)物。
由此得到51.6g(產(chǎn)率80.8％)白色粉末，旋光度為59.1°(C＝1，THF)，經(jīng)GPC測得純度為100％。
實施例2制備Boc-Ile-NCA首字母縮略詞Ile代表α-氨基酸異亮氨酸。因此Ile-NCA代表具有下列化學(xué)式的化合物 利用-200.9g THF，-40.0g(0.255mol)Ile-NCA，-0.14g(1.3mmol)TEDA和66g(0.302mol)(Boc)2O在66g THF中的溶液進行如實施例1中的反應(yīng)。
過濾并干燥之后，回收51.5g(產(chǎn)率78.6％)期望產(chǎn)物，熔點為107.6℃，旋光度為60.3°(C＝1，THF)。經(jīng)GPC測得純度為99.3％。
實施例3制備Boc-D-Phe-NCA首字母縮略詞Phe代表α-氨基酸苯丙氨酸。因此Phe-NCA代表具有下列化學(xué)式的化合物 利用-427g THF，-25g(0.131mol)D-Phe-NCA，-0.07g(0.65mmol)TEDA和34.2g(0.157mol)(Boc)2O在21.5g THF中的溶液進行如實施例1中的反應(yīng)，但是溫度設(shè)定在-17±1℃。
過濾并干燥之后，回收24.1g(產(chǎn)率63％)與期望的1H NMR結(jié)構(gòu)一致的產(chǎn)物，經(jīng)GPC測得純度為95.2％。
實施例4制備N-乙氧羰基-纈氨酸-N-羧酸酐(EtOC-Val-NCA)在裝配有低溫恒溫器、滴液漏斗、氮氣流系統(tǒng)、機械攪拌和溫度計探頭的1升雙層夾套反應(yīng)器中，在用氮氣惰性化并冷卻至-5±2℃之后加入-204g THF，-20.0g(0.141mol)Val-NCA，-0.078g(0.7mmol)TEDA。
將反應(yīng)介質(zhì)攪拌30分鐘，然后通過滴液漏斗用1個小時向其中緩慢加入27.1g(0.167mol)重碳酸二乙酯[(EtOC)2O]，同時將溫度控制在-5°±2℃。產(chǎn)生少量氣體。
(EtOC)2O滴加完成后繼續(xù)攪拌反應(yīng)介質(zhì)1小時。
在140-160mbar的壓力下，在18-26℃的反應(yīng)介質(zhì)溫度下，濃縮THF。
在25℃的溫度下，加入220ml庚烷B，并倒入大量冰水中。產(chǎn)物沉淀。在氮氣氣氛下，在燒結(jié)的N°3過濾器上進行過濾。在25±5℃的溫度下，在真空烘箱中干燥產(chǎn)物。
由此得到20.1g(產(chǎn)率67％)白色粉末，其1H NMR和13C NMR譜與期望結(jié)構(gòu)一致。
權(quán)利要求
1.獲得由氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐(UNCA)的方法，所述氨酯保護的α-氨基酸N-羧酸酐(UNCA)具有化學(xué)式I， 化學(xué)式I其中R1和R2相同或不同，一起或各自獨立地代表氫原子或者天然或合成的α-氨基酸側(cè)鏈，所述側(cè)鏈任選具有根據(jù)需要的保護官能團；R3代表飽和或不飽和的、線型或支化的C1-C10烷基或者具有7-14個碳原子的芳烷基或烷芳基，該方法的特征在于具有化學(xué)式II的α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)， 化學(xué)式II其中R1和R2具有與化學(xué)式I中相同的意義，與相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量為至少1倍當量的化學(xué)式III的重碳酸鹽， 化學(xué)式III其中R3具有與化學(xué)式I中相同的意義，在相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量為催化量的1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷、也稱作三乙撐二胺(TEDA)的存在下，在熔點低于約-20℃的有機溶劑中進行反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于R1和R2相同或不同，代表氫原子、任選被取代的C1-C8線型或支化烷基、任選被取代的C5-C7環(huán)烷基、任選被取代的苯基、萘基、5或6元雜芳基或吲哚基，前提是R1和R2不同時代表環(huán)狀基團；或者R1或R2一起形成任選被取代的C5-C7環(huán)烷基，所述任選的取代基是氨基酸和肽領(lǐng)域中常用的取代基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述任選的取代基選自O(shè)H、SH、NH2、NHC(NH)NH2、CONH2、O-(C1-C6芳基)、S-(C1-C6烷基)、COO-(C1-C6烷基)、COO-(C5-C8芳烷基)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于R3代表甲基、乙基、叔丁基、苯甲基、烯丙基或9-芴基甲基。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述溶劑選自C4-C10醚和氯代C1-C5烷烴。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述溶劑是THF。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于TEDA的量為0.1摩爾％-5摩爾％，相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于TEDA的量為0.2摩爾％-1摩爾％，相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于化學(xué)式II的NCA與相對于化學(xué)式II的NCA所用摩爾量為1.1-1.5倍當量的化學(xué)式III的重碳酸鹽進行反應(yīng)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于將化學(xué)式III的重碳酸鹽加入到相對于所用重碳酸鹽的重量為0.5-2重量份數(shù)的溶劑中形成溶液，再將該溶液加入到反應(yīng)介質(zhì)中，所述反應(yīng)介質(zhì)包含溶劑的其它所需部分即待轉(zhuǎn)化的化學(xué)式II的NCA和TEDA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于在加入重碳酸鹽期間，反應(yīng)介質(zhì)的溫度保持在-20至5℃之間，有利的是在-10至0℃之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于該方法隨后包括下列連續(xù)步驟i)過濾反應(yīng)介質(zhì)；ii)通過減壓蒸發(fā)除去至少80％、有利的是約90％的溶劑；隨后iii)加入等于通過蒸發(fā)除去的反應(yīng)溶劑量的非溶劑化合物，以使得化學(xué)式I的UNCA沉淀；和iv)根據(jù)需要，在除去所述保護基團后，通過過濾回收化學(xué)式I的UNCA。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于在15至30℃的溫度下通過減壓蒸發(fā)除去溶劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于所述非溶劑化合物是線型或支化的C5-C10烷烴。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或14的方法，其特征在于隨后在低于30℃的溫度下真空干燥沉淀物。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備氨酯保護的α－氨基酸N－羧酸酐的方法。本發(fā)明的方法使得能夠在催化量的三乙撐二胺的存在下，不加入叔胺型堿而合成氨酯保護的α－氨基酸N－羧酸酐。
文檔編號C07D263/44GK1839123SQ200480024157
公開日2006年9月27日 申請日期2004年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者埃爾夫·萊爾米特, 朱利安·格里馬, 安托萬·帕里斯 申請人:伊索凱姆公司