專利名稱：用于端粒酶抑制的改性寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于端粒酶抑制的化合物。更具體地，本發(fā)明提供了靶向端粒酶RNA成分的并具有提高的細胞吸收特性的改性寡核苷酸。
背景用于治療應用的寡核苷酸的發(fā)展在核酸的醫(yī)藥用途方面存在很大興趣。例如，在潛在的治療應用方面，反義、核糖酶、核糖適體(aptamer)和RNA干擾(RNAI)技術全部得到了發(fā)展。核酸尤其是寡核苷酸用于體內傳送的設計需要考慮各種因素包括結合強度、目標特異性、血清穩(wěn)定性、對核酸酶的抗性和細胞吸收。為了生產具有適于體內使用特征的寡核苷酸，已經提出了多種方法，如改性的主鏈化學(modified backbone chemistry)、傳送載體中的配方以及與各種其它部分的共軛。具有適于全身傳送特征的療用寡核苷酸特別有益。
具有改性化學主鏈的寡核苷酸評述于Micklefield，Backbonemodification of nucleic acidssynthesis，structure and therapeuticapplications，Curr.Med.Chem.，8(10)1157-79，2001和Lyer等，Modifiedoligonucleotides--synthesis，properties and applications，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(3)344-358，1999。
改性的主鏈化學的實例包括-肽核酸(PNA)(參見Nielsen，Methods Mol.Biol.，2083-26，2002)，-封閉的核酸(LNA)(參見Petersen & Wengel，TrendsBiotechnol.，21(2)74-81，2003)，-硫代磷酸酯(參見Eckstein，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10(2)117-21，2000)，-甲基膦酸酯(參見Thiviyanathan等，Biochemistry，41(3)827-38，2002)
-氨基磷酸酯(參見Gryaznov，Biochem.Biophys.Acta，1489(1)131-0，1999；Pruzan等，Nucleic Acids Res.，30(2)559-68，2002)，和-硫代氨基磷酸酯(參見Gryaznov等，Nucleosides NucleotidesNucleic Acids，20(4-7)401-10，2001；Herbert等，Oncogene，21(4)638-42，2002)。
已經報道了這些類型寡核苷酸中每種的優(yōu)點和缺點。例如，肽核酸(PNA)呈現(xiàn)良好的核酸酶抗性和結合強度，但是在測試培養(yǎng)物中細胞吸收有所降低；硫代磷酸酯展示了良好的核酸酶抗性和可溶性，但是通常作為P-手性混合物合成并顯示出幾種序列非特異性的生物效應；甲基膦酸酯顯示了良好的核酸酶抗性和細胞吸收，但是通常也作為P-手性混合物合成并具有降低的雙鏈體穩(wěn)定性。N3′→P5′氨基磷酸酯核苷酸間鍵合顯示了良好的結合特性、核酸酶抗性和可溶性(Gryaznov和Letsinger，Nucleic Acids Research，203403-3409，1992；Chen等，Nucleic Acids Research，232661-2668，1995；Gryaznov等，Proc.Natl.Acad.Sci.，925798-5802，1995；Skorski等，Proc.Natl.Acad.Sci.，943966-3971，1997)。然而，相對于天然氨基磷酸酯對應物，它們還顯示出升高的酸不穩(wěn)定性(Gryaznov等，Nucleic Acids Research，241508-1514，1996)。寡核苷酸的酸穩(wěn)定性對于理想使用寡核苷酸試劑來作為口服治療劑是一個重要性質。將硫原子加入N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸主鏈提供了升高的酸穩(wěn)定性。
和許多其它療用化合物一樣，寡核苷酸的多陰離子性質會降低化合物穿過脂質膜的能力，限制細胞吸收的效率。已經提出各種解決方法來提高治療劑的細胞吸收，包括配制于脂質體中(對于評述，參見Pedroso de Lima等，Curr Med Chem，10(14)1221-1231，2003和Miller，Curr Med Chem.，10(14)1195-211，2003)以及與親脂部分共軛。后一方法的實例包括U.S.專利No.5,411,947(Method of converting a drug to anorally available form by covalently bonding a lipid to the drug)；U.S.專利No.6,448,392(Lipid derivatives of antiviral nucleosidesliposomalincorporation and method of use)；U.S.專利No.5,420,330(Lipo-phosphoramidites)；U.S.專利No.5,763,208(Oligonucleotides andtheir analogs capable of passive cell membrane permeation)；Gryaznov &Lloyd，Nucleic Acids Research，215909-5915，1993(Cholesterol-conjugated oligonucleotides)；U.S.專利No.5,416,203(Steroid modified oligonucleotides)；WO90/10448(Covalent conjugatesof lipid and oligonucleotide)；Gerster等，Analytical Biochemistry，262177-184(1998)(Quantitative analysis of modified antisenseoligonucleotides in biological fluids using cationic nanoparticles forsolid-phase extraction)；Bennett等，Mol.Pharmacol.，411023-1033(1992)(Cationic lipids enhance cellular uptake and activity of phophorothioateantisense oligonucleotides)；Manoharan等，Antisense and Nucleic AcidDrug Dev.，12103-128(2002)(Oligonucleotide conjugates as potentialantisense drugs with improved uptake，biodistribution，targeted deliveryand mechanism of action)；和Fledler等，Langenbeck’s Arch.Surg.，383269-275(1998)(Growth inhibition of pancreatic tumor cells bymodified antisense oligodeoxynucleotides)。
作為治療劑目標的端粒酶端粒酶是催化端粒重復序列添加至染色體末端的核糖蛋白。參見Blackburn，1992，Ann.Rev.Biochem.，61113-129。存在大量描述端粒、端粒酶、細胞衰老和癌癥之間關聯(lián)的文獻(對于綜述，參見，Oncogene，21卷，2002年1月，其是聚焦于端粒酶雜志的完整文獻)。因此端粒酶已經鑒定為癌癥治療劑的極佳目標(target)(參見Lichsteiner等，Annals New York Acad.Sci.，8861-11，1999)。
編碼人端粒酶的蛋白質和RNA部分的基因已經得到了克隆和測序(各自參見U.S.專利No.6,261,836和5,583,016)并在研究端粒酶抑制劑中花費了許多努力。迄今為止鑒定的端粒酶抑制劑包括小分子化合物和寡核苷酸。各種出版物描述了靶向編碼端粒酶蛋白質部分的mRNA(其的人形式稱為人端粒酶逆轉錄酶和hTERT)或端粒酶全酶的RNA部分(其的人形式稱為人端粒酶RNA或hTR)，來使用寡核苷酸抑制端粒酶。通常認為靶向hTERT mRNA的寡核苷酸作為常規(guī)反義藥物，因為它們與mRNA結合，導致mRNA的降解，并因此防止了hTRET蛋白質的產生(參見，例如，U.S.專利No.6,444,650)。設計靶向hTR的特定寡核苷酸來結合存在于端粒酶全酶中的hTR分子，并因此破壞酶的功能(參見，例如，U.S.專利No.6,548,298)。描述設計來降低或消除端粒酶活性的各種寡核苷酸的出版物實例包括U.S.專利No.6,444,650(Antisense composition for detecting andinhibiting telomerase reverse transcriptase)；U.S.專利No.6,331,399(Antisense inhibition of tert expression)；U.S.專利No.6,548,298(Mammalian telomerase)；Van Janta-Lipinski等，Nucleosides Nucleotides，18(6-7)1719-20，1999(Protein and RNA of human telomerase as targets for modifiedoligonucleotides)；Gryaznov等，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，20401-410，2001(Telomerase inhibitors-oligonucleotide phosphoramidates as potentialtherapeutic agents)；Herbert等，Oncogene，21(4)638-42，2002(Oligonucleotide N3′→P5′phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors)；Pruzan等，Nucleic Acids Research，30(2)559-568，2002(Allostericinhibitors of telomeraseoligonucleotide N3′-P5′phosphoramidates)；PCT申請WO011/18015(Oligonucleotide N3′-P5′thiophosphoramidatestheir synthesis and use)；和Asai等，Cancer Research，633931-3939，2003(A novel telomerasetemplate antagonist(GRN 163)as a potential anticancer agent)。
發(fā)明概述本發(fā)明的組合物和方法涉及端粒酶抑制化合物，包括寡核苷酸和至少一個共價共軛的脂質基團。與未改性的寡核苷酸相比較，本發(fā)明的化合物具有優(yōu)良的細胞吸收特性。這意味著與未改性的形式相比較，使用較小量的共軛寡核苷酸就能獲得相等的生物效應。當應用于人的治療情況時，這可以轉換成降低的毒性風險和成本節(jié)約。本發(fā)明的化合物抑制細胞(包括癌細胞)中的端粒酶，其所得到的效果抑制了細胞的增殖。因此，本發(fā)明化合物的主要應用是作為癌癥治療劑，和本發(fā)明提供了可以如此使用的化合物的藥物制劑。
本發(fā)明的化合物可以通過以下通式進行表示O-(x-L)n其中O表示寡核苷酸，x是任意的連接物(linker)基團，L表示脂質部分和n是1-5的整數(shù)。通常，n＝1或2，但當n＞1時，每個脂質部分L是可獨立選擇的。脂質部分通常在3′和5′端之一(或如果n＝2，每個)共價連接寡核苷酸，但也可以連接于其它的位點，包括一個或多個堿基。
脂質基團L通常是脂族烴或脂肪酸，包括烴和脂肪酸的衍生物，實例是具有14-20個碳的飽和直鏈化合物，如肉豆蔻酸(C14，也稱為十四酸)、棕櫚酸(C16，也稱為十六酸)和硬脂酸(C18，也稱為十八酸)及其相應的脂族烴形式，十四烷、十六烷和十八烷，以及衍生物如胺和酰胺衍生物?？梢允褂玫钠渌线m脂質基團的實例是固醇，如膽固醇，和取代的脂肪酸和烴，尤其是這些基團的多-氟化形式。寡核苷酸成分O可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸或其改性形式，和連接核酸堿基的鍵合可以由任何合適的化學物質形成，包括但不限于磷酸二酯；磷酸三酯；甲基磷酸酯；P3′→N5′氨基磷酸酯；N3′→P5′氨基磷酸酯；N3′→P5′硫代氨基磷酸酯；和硫代磷酸酯連接物。優(yōu)選N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。寡核苷酸部分O的序列包括至少一個與端粒酶RNA部分序列的選定“靶向”片段互補(優(yōu)選精確互補(exactly complementary))的序列片段。在特定實施方案中，寡核苷酸O部分的序列含有與人端粒酶RNA部分，hTR(提供于SEQ IDNO1中的序列)的以下片段之一中的序列互補的序列片段46-56，137-196，290-319和350-380。O部分中與hTR片段精確互補的序列長度優(yōu)選至少為5個堿基，更優(yōu)選至少8個堿基，甚至更優(yōu)選至少10個堿基。可以將不與hTR精確互補，卻可以提供額外有利功能的額外序列片段加入O部分。
本發(fā)明的實例化合物包括以下結構中所示的那些，其中O部分具有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯核苷酸間鍵合且與hTR(SEQ ID NO1)的堿基42-54精確互補。在第一個實例結構中，L，脂質部分是棕櫚酰胺(源自棕櫚酸)，通過氨基甘油連接物與寡核苷酸O的5′硫代磷酸酯基團共軛 在第二個實例結構中，L通過寡核苷酸的3′氨基與棕櫚酰胺共軛 與相應的未改性寡核苷酸相比較，本發(fā)明的化合物(包括這些實例化合物)顯示出具有優(yōu)良的細胞吸收特性，因此是細胞端粒酶活性的更有效抑制劑。作為這些特性的結果，本發(fā)明的化合物是癌細胞增殖的高效抑制劑。
本發(fā)明的化合物還可以用于抑制端粒酶酶活性的方法。這樣的方法包括使端粒酶與本發(fā)明的化合物接觸。本發(fā)明的化合物還可以用于抑制可表達端粒酶的細胞中的端粒酶，從而抑制這樣細胞的增殖。這樣的方法包括使具有端粒酶活性的細胞與本發(fā)明的化合物接觸。如此處理的細胞(可以是體外的細胞或體內的細胞)，通常會使端?？s短并停止增殖。因為癌細胞需要端粒酶活性來用于長期增殖，因此本發(fā)明的化合物對于抑制癌細胞的生長尤其有用，且可以用于治療應用中來治療癌癥。
因此本發(fā)明包括將在此所述的化合物用于醫(yī)學中，尤其是用于治療癌癥中。
本發(fā)明還提供了藥物組合物，包括與藥物學上可接受的賦形劑一起配制的根據本發(fā)明的寡核苷酸軛合物。


圖1顯示了本發(fā)明化合物中各種脂質L基團與寡核苷酸連接的實施例。
圖2顯示了本發(fā)明化合物實例合成方法的示意圖。圖2A、2B和2C顯示了用于生產其中脂質部分共軛寡核苷酸3′端的化合物的合成方法。圖2C中所示的圖解是從脂質醛開始的還原性胺化；這在脂質基團和寡核苷酸之間產生了胺鍵(以下的參見示意圖B)，與圖2A中所示的相反，其中起始原料是脂肪酸的羧酸、酸酐或?；刃问?，導致氨鍵的形成(參見以下的示意圖A)。圖2B顯示了適于生產3′-硫代氨基磷酸酯鍵的圖解。該實施例中，顯示了氨基甘油連接物序列(O-CH2CH2CH2-NHC(O))-，但是將認識到可以使用該合成而不需要這樣的連接物，或使用可替換的連接物序列。圖2D顯示了可以用于產生其中脂質部分通過磷酸酯基團(或硫代磷酸酯基團，當X＝S時)共軛寡核苷酸5′端化合物的合成方法。這些示意圖中，寡核苷酸的3＇顯示為氨基，與優(yōu)選的硫代氨基磷酸酯(X＝S)和氨基磷酸酯(X＝O)化學物質的寡核苷酸鍵一致。圖2E顯示了脂質基團改性的被護堿基的實例(該情況中，通過共軛十四烷基來改性鳥苷)，其可以用于標準寡核苷酸合成方法中來制備其中一個或多個脂質基團共價連接一個或多個核酸堿基的寡核苷酸。圖2中，使用以下縮寫i＝Cl-C(O)-R″/(i-Pr)2NEt，或HO-C(O)-R″/C.A，或[C(O)-R″]2O/(i-Pr)2NEtii＝DMTO-CH2CHO(CEO-P[N(i-Pr)2]-CH2-NHC(O)-R″/Tetriii＝寡核苷酸鏈延伸iv＝R″-HC＝O+[H]R＝5′-CPG-支持的P，N-被護的寡核苷酸R′＝去保護的NP-或NPS-寡核苷酸R″＝脂質部分，L(如果需要，其可以與連接物共軛，參見R共軛氨基甘油連接物的實例)R＝-O-CH2(CHOH)CH2-NHC(O)-R″X＝O、S；Y＝H，或C(O)-R″，Z＝O或NH圖3和4是曲線圖，顯示了本發(fā)明的化合物各自抑制U251和DU145細胞中端粒酶活性的能力(對于全部描述參見實施例3)。在這些和以下的圖中，A、B和C是描述于實施例3中并顯示于圖9中的化合物。
圖5是凝膠圖像，顯示了在人腫瘤異種移植模型小鼠中解剖的人腫瘤細胞上進行的，隨后使用或未使用本發(fā)明化合物處理后的TRAP測試結果(對于全部描述參見實施例4)。
圖6是圖表，顯示了異種移植后，使用或未使用本發(fā)明化合物處理的具有人骨髓瘤小鼠中骨髓瘤蛋白質的血漿含量，(對于全部描述參見實施例5)。
圖7和8是圖表，顯示了使用或未使用本發(fā)明的化合物對具有人骨髓瘤異種移植小鼠中的腫瘤體積、端粒酶活性和端粒長度的影響(對于全部描述參見實施例6)。
圖9描繪了實施例3-7中所用化合物A、B和C的結構，其中寡核苷酸部分含有硫代氨基磷酸酯連接物。
序列表附隨序列表的SEQ ID NO1提供了人端粒酶RNA部分(hTR)的序列(還參見Feng等，Sciences 269(5228)1236-1241，1995，和基因庫登錄號No.U86046)。通過參照與SEQ ID NO1中序列位置是互補的這些公開文件來涉及各種其序列與SEQ ID NO1中所含片段互補的寡核苷酸。
發(fā)明詳述A.定義“烷基”指的是具有1至20個碳的烷基和取代烷基，如甲基、乙基、丙基等等。低級烷基通常指的是C1至C5。典型地，中級烷基指的是C6至C10?！磅；敝傅氖蔷哂薪Y構RCO的基團，其中R是烷基。低級?；瞧渲蠷是低級烷基的?；?。
“烷基胺”指的是帶有連接的氮的烷基，例如，1-甲基1-丁胺(CH3CHNH2CH2CH2CH3)。
“芳基”指的是具有5-20個碳原子的芳族環(huán)基團，如苯基、萘基、蒽基或取代的芳基，如烷基-或芳基-取代如甲苯基、乙苯基、二苯基，等。還包括環(huán)中具有一個或多個氮、氧或硫原子的雜環(huán)芳族環(huán)基團。
“寡核苷酸”指的是具有約2至約200個相連亞基的核糖和/或脫氧核糖核苷亞基聚合物。核苷亞基可以通過各種亞基間鍵合來連接，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯和硫代磷酸酯鍵合(linkage)。此外，“寡核苷酸”包括本領域技術人員已知的糖(例如，2′取代)、堿基(參見以下“核苷”的定義)以及3′和5′端的改性。在其中寡核苷酸部分包括多個亞基間鍵合的實施方案中，可以使用相同的化學物質來形成每個鍵合或可以使用鍵合化學物質的混合物。如在此所用的術語“多核苷酸”，具有和“寡核苷酸”相同的意思，并與“寡核苷酸”交替使用。
不管什么時候通過字母的序列來表示寡核苷酸，如“ATGUCCTG”，將理解為核苷酸是從左到右5′→3′的次序。如此寡核苷酸堿基序列的表示并不是暗示在寡核苷酸中使用任何特定類型的核苷酸間亞基。
如此處所用的“核苷”包括天然核苷，包括2′-脫氧和2′-羥基形式，例如如Komberg和Baker，DNA Replication，第2版(Freeman，SanFrancisco，1992)中所述的，和類似物。關于核苷的“類似物”包括具有改性核酸堿基部分(參見以下“核酸堿基”的定義)和/或改性糖部分的合成核苷，例如，由Scheit概述的，Nucleotide Analogs(JohnWiley，New York，1980)。這樣的類似物包括設計來提高結合特性(如穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷，如Uhlmann和Peyman所述的(ChemicalReviews，90543-584，1990)。
在此廣泛使用的術語“脂質”包括溶于有機溶劑，但在水中溶解不足，甚至根本不溶的物質。術語脂質包括但不限于烴、油、脂肪(如脂肪酸、甘油)、固醇、類固醇以及這些化合物的衍生形式。優(yōu)選的脂質是脂肪酸及其衍生物，烴及其衍生物，和固醇如膽固醇。如在此所用的，術語脂質還包括含有脂質和親水部分的兩性化合物。
脂肪酸通常在直鏈中含有偶數(shù)碳原子(通常為12-24個碳)并可以是飽和的或不飽和的，以及可以含有或可以通過改性來含有各種取代基。為了簡單，術語“脂肪酸”還包括脂肪酸衍生物，如通過圖2A所示的合成示意圖產生的脂肪酰胺(參見例如，圖1A-1E中所示的化合物)。
如在此所用的術語“烴”包括僅有氫和碳，通過共價鍵連接而構成的化合物。術語包括開鏈(脂族)烴，包括直鏈和支鏈烴，和飽和的以及單-和多-不飽和烴。術語還包括含有一個或多個芳環(huán)的烴。
術語“取代的”指的是已經通過一個原子交換另一個原子而改性的化合物。尤其是，所用的術語涉及鹵代烴和脂肪酸，尤其是其中氟取代了一個或多個氫原子的那些。
如在此所用的“核酸堿基”包括(i)典型的DNA和RNA核酸堿基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶)，(ii)改性的核酸堿基或核酸堿基類似物(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或次黃嘌呤)和(iii)核酸堿基類似物。核酸堿基類似物是分子結構模擬典型DNA或RNA堿基的化學物質。
如在此所用的，“嘧啶”意思是天然核苷中產生的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶及其類似物，如含有氧、甲基、丙基、甲氧基、羥基、氨基、硫、鹵素和取代基的那些。如在此所用的術語進一步包括具有連接的保護基團的嘧啶，如N4-苯甲酰胞嘧啶。更多的嘧啶保護基團由Beaucage和Iyer所公開(Tetrahedron 48223-2311，1992)。
如在此所用的，“嘌呤”意思是天然核苷中產生的嘌呤，包括腺嘌呤和鳥嘌呤和次黃嘌呤及其類似物，如含有氧、甲基、丙基、甲氧基、羥基、氨基、硫、鹵素和取代基的那些。如在此所用的術語進一步包括具有連接的保護基團的嘌呤，如N2-苯甲酰鳥嘌呤、N2-異丁酰鳥嘌呤、N6-苯甲酰腺嘌呤，等等。更多的嘌呤保護基團由Beaucage和Iyer所描述(以上所引用的)。
如在此所用的，術語“被護的”作為化學物質名稱的部分指的是本領域已知的用于化合物特定部分的保護基團，例如，關于核苷“5′-被護-羥基”包括三苯基甲基(即，三苯甲基)，對茴香基二苯甲基(即，單甲氧基三苯甲基或MMT)，二-對茴香基苯甲基(即，二甲氧基三苯甲基或DMT)，等等。本領域已知的保護基團包括描述于以下參考文獻中的那些Gait，編輯，Oligonucleotide SynthesisA Pratical Approach(IRL Press，Oxford，1984)；Amarnath和Broom，Chemical Reviews，77183-217，1977；Pon等，Biotechniques，6768-775，1988；Ohtsuka等，Nucleic Acids Research，106553-6570，1982；Eckstein，編輯，Oligonucleotides and AnaloguesA Pratical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，(John Wiley & Sons，New York，1991)；Narang，編輯，Synthesis andApplications of DNA and RNA(Academic Press，New York，1987)；Beaucage和Iyer(以上所引用的)，等等參考文獻。
術語“鹵素”或“鹵”以其常規(guī)意思來使用，指的是氯、溴、氟或碘取代基。在此所描述和所要求的化合物中，鹵素取代基通常是氟、溴或氯，優(yōu)選氟或氯。
B.本發(fā)明化合物的設計本發(fā)明的化合物可以通過通式來表示O-(x-L)n，其中O表示寡核苷酸，x是任意的連接物基團，L表示脂質部分和n是1-5的整數(shù)。
因此化合物的設計需要兩個部分O和L的選擇，和這些實體之間結構鍵合的確定，該鍵合可以包括任意連接物基團x。
O的選擇寡核苷酸成分O可以認為是化合物的“效應物”部分，因為該部分通過結合端粒酶的RNA部分來影響端粒酶的抑制。因此，選擇O的序列使其包括與SEQ ID NO1中所示的端粒酶RNA序列互補的片段。與端粒酶RNA部分互補的片段在理論上可以靶向端粒酶RNA的任何部分，但端粒酶RNA的特定片段是用于抑制寡核苷酸的優(yōu)選目標。一個優(yōu)選的目標片段是跨越SEQ ID NO1的核苷酸30-67的片段，其包括“模板片段”，跨越SEQ ID NO1的核苷酸46-56的序列5′-CUAACCCUAAC-3′的11個核苷酸片段。模板片段用來限定端粒酶加入染色體末端的端粒重復序列且對于端粒酶活性是必要的(參見Chen等，Cell 100503-514，2000；Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA98(14)7982-7987，2001)。因此特別優(yōu)選含有包括與模板片段全部或部分互補的序列的寡核苷酸部分的本發(fā)明化合物。另一優(yōu)選目標片段是跨越hTR的核苷酸137-179的片段(參見Pruzan等，Nucl.AcidsResearch，30559-568，2002)。該片段中，跨越141-153的序列是優(yōu)選目標。PCT公開WO98/28442描述了使用至少7個核苷酸長的寡核苷酸來抑制端粒酶，其中將寡核苷酸設計成與hTR序列的模板片段外的易接近部分互補，包括hTR的核苷酸137-196，290-319，和350-380。
優(yōu)選靶向hTR序列的O的片段與相應的hTR序列精確互補。雖然在特定情況中錯配是允許的，但期望它們會降低所得到寡核苷酸軛合物的特異性和活性。在特定實施方案中，因此選擇寡核苷酸O的堿基序列來包括至少5個與端粒酶RNA精確互補的核苷酸的序列，并且如果使用增加長度的互補序列，如至少8個，至少10個，至少12個，至少13個或至少15個與端粒酶RNA精確互補的核苷酸，那么可以獲得增強的端粒酶抑制。在其它實施方案中，寡核苷酸的序列包括至少5至20個，至少8至20個，至少10至20個或至少10至15個與端粒酶RNA序列精確互補的核苷酸的序列。當選擇寡核苷酸O的全長與端粒酶RNA互補時，可以獲得最佳的端粒酶抑制活性。然而，全長寡核苷酸部分與目標序列的精確互補不是必需的，寡核苷酸序列可以包括與目標序列不互補的片段。例如，可以加入這樣的片段來給予化合物其它特性，如有助于純化的序列。如果寡核苷酸成分O包括與目標序列不互補的片段，通常將這樣的片段放置于5′或3′端的一端或兩端。在其中精確互補的片段靶向模板片段的情況中，可以用與連接在5′端的端粒酶樣(富含G)序列精確互補的短(5-8個核苷酸)片段獲得有效的端粒酶抑制。
與人端粒酶RNA互補且可以包括其作為寡核苷酸部分O的一部分或其可以用作整個寡核苷酸部分O的實例序列包括以下


用于O部分合成中的核苷酸間鍵合類型的選擇可以由任何可獲得的寡核苷酸化學物質構成，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯和硫代磷酸酯鍵合。
在優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸部分O具有至少一個N3′→P5′氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代磷酸酯鍵合，該鍵合可以通過以下結構來表示3′-[-NH-P(＝O)(-XR)-O-]5′，其中X是O或S，且R選自氫、烷基或芳基；或其藥物學上可接受的鹽。
通常，但不是必需的，寡核苷酸O內的所有核苷酸間鍵合是相同類型的，盡管可以使用不同鍵合的混合物來合成寡核苷酸部分。其中脂質部分共軛至寡核苷酸的3′端，通過寡核苷酸上的3′氨基極大地有助于軛合物的合成。因此，即使沒有選擇優(yōu)選的化學物質之一，3′氨基的加入也是有利的。
L的選擇與沒有和脂質部分共軛的寡核苷酸相比，本發(fā)明的化合物在細胞中產生端粒酶抑制更有效?？梢韵嘈胖|部分L用來提高化合物的細胞吸收，尤其是有助于穿過細胞膜。雖然還沒有完全闡明該發(fā)生的機理，一個可能性是脂質部分可以幫助化合物以單個分子或聚合體(膠束的)形式與細胞膜結合，隨后內在化。然而，使用本發(fā)明不需要對準確機理的理解。
脂質部分可以是與未改性寡核苷酸相比較提供升高的細胞吸收的任何脂質或脂質衍生物。優(yōu)選的脂質是烴、脂肪(例如，甘油、脂肪酸和脂肪酸衍生物，如脂肪酰胺)和固醇。其中脂質部分是烴時，L部分可以是取代或未取代的環(huán)烴或脂族直鏈或支鏈烴，其可以是飽和的或不飽和的。優(yōu)選實例是全部飽和或多飽和的直鏈未分支的烴。烴鏈的長度為C2-C30，但使用C8-C22的碳鏈可以獲得最佳的端粒酶抑制效果。飽和烴(烷烴)的優(yōu)選實例如下學名碳鏈十四烷 C14H30十五烷 C15H32十六烷 C16H34十七烷 C17H36十八烷 C18H38十九烷 C19H40二十烷 C20H42還可以選擇單-和多-不飽和形式的烴(烯烴和多烯，如二烯烴和三烯烴)，優(yōu)選具有一個至三個雙鍵的化合物，盡管可以使用具有多個雙鍵的化合物。也可以使用炔(含有一個或多個三鍵)和alkenyne(三鍵和雙鍵)。可以使用的常見單-和多-不飽和烴的實例包括圖1M、1L和1O中所示的那些。
本發(fā)明的化合物中可以使用取代形式的烴，優(yōu)選使用在體內和體外為惰性的取代基。特別優(yōu)選的取代基是氟。多氟代烴的實例通式結構包括CF3(CF2)n-(CH2)m-，其中m至少是1，優(yōu)選至少是2，且n＝1-30，如氟代十三烷CF3(CF2)9(CH2)3；和CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c-，其中a、b和c獨立地為1-30。
圖1W顯示了共軛寡核苷酸5′端的多氟代烴的實例。
其它合適的脂質部分包括簡單的脂肪酸和脂肪酸衍生物，甘油和更復雜的脂質如固醇，例如膽固醇。脂肪酸及其衍生物可以是全部飽和的或單-和多-不飽和的。碳鏈的長度為C2-C30，但是用C8-C22的碳鏈可以獲得最佳的端粒酶抑制效果。飽和脂肪酸的優(yōu)選實例如下學名 俗名碳鏈十四烷酸 肉豆蔻酸14∶0十六烷酸 棕櫚酸 16∶0
十八烷酸 硬脂酸18∶0二十烷酸 花生酸20∶0還可以使用單-和多-不飽和形式的脂肪酸，優(yōu)選具有一個至三個雙鍵的化合物，盡管還可以使用具有多個雙鍵的化合物?？梢允褂玫某Ｒ妴?和多-不飽和脂肪酸的實例包括學名 俗名 碳鏈順-9-十六酸棕櫚油酸 16∶1(n-7)順-9-十八酸巖芹酸18∶1(n-12)順-9-十八酸油酸 18∶1(n-9)9，12-十八碳二烯酸 亞油酸18∶2(n-6)6，9，12-十八碳三烯酸 γ-亞油酸 18∶3(n-6)9，12，15-十八碳三烯酸 α-亞油酸 18∶3(n-3)5，8，11，14-二十碳四烯酸 花生四烯酸20∶4(n-6)本發(fā)明的化合物中也可以使用碳鏈中具有一個或多個三鍵的脂肪酸，以及支鏈脂肪酸。本發(fā)明的化合物中可以使用取代形式的脂肪酸。和烴基團一樣，優(yōu)選體內和體外為惰性的取代基，特別優(yōu)選氟。適用于本發(fā)明的脂肪酸多氟代衍生物的實例通式結構是CF3(CF2)n-(CH2)mCO-，其中m至少是1，優(yōu)選至少是2，且n＝1-30，和CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO-，其中a、b和c獨立地為1-30。
本發(fā)明具有脂肪酸多氟代衍生物的實例化合物顯示于圖1U和1V中。
通常一至五個L部分(n＝1-5)與O部分共價連接，任意地通過連接物。更常見使用1或2個L部分。其中多于一個L部分與O部分連接時，每個L部分是可獨立選擇的。
將認識到描述為具有如L部分的特定烴的本發(fā)明化合物和描述為具有特定脂肪酸(與特定烴具有相同數(shù)目的碳原子)的本發(fā)明化合物是最相關的，區(qū)別僅在于連接L部分與寡核苷酸的鍵的性質，其依次是用來生產化合物的合成方法的結果。例如，和以下更詳細描述的，當合成具有共軛寡核苷酸3′-氨基端的L部分的化合物(具有氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯核苷酸間鍵合)時，使用脂肪酸的醛形式(脂肪醛)作為起始原料，來在脂質鏈和寡核苷酸之間形成胺鍵，使得脂質基團看起來像烴。相反，使用相同脂肪酸的羧酸、酸酐或?；刃问降难苌?，導致形成酰胺鍵，使得脂質基團看起來象脂肪酸衍生物，尤其在脂肪酰胺這樣的情況中(如以上定義部分所述的，為了簡單的緣由，術語“脂肪酸”當描述在此廣泛使用的共軛的L基團時包括脂肪酸衍生物，包括脂肪酰胺)。這在以下的示意圖(和圖2A和2C中)中說明了，其描繪了連接C14脂質部分的氨基磷酸酯寡核苷酸的3′-氨基端。示意圖A中，L是十四酸(肉豆蔻酸)，其中L和O基團之間的連接是酰胺。示意圖B中，L是十四烷烴，L和O基團之間的連接是胺。
示意圖A 示意圖BO和L成分的連接O和L部分之間的鍵合可以是直接鍵合，或可以通過任意的連接物部分，x。連接物基團可以用來幫助化合物的化學合成(在以下的合成部分中討論)。不管連接物基團是否用于介導O和L部分的共軛，寡核苷酸部分O上都會存在多個L部分可以方便共軛的位點。合適的連接位點包括5′和3′端，一個或多個糖環(huán)，核苷間主鏈和寡核苷酸的核酸堿基。通常，L部分連接寡核苷酸的3′或5′端。
如果L部分連接3′端，可以直接連接3′取代基，在氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的優(yōu)選情況中是3′氨基(實例顯示于圖1A-C中)，在其它情況中，如常見的磷酸二酯寡核苷酸是3-羥基?；蛘?，L部分可以通過3′連接的磷酸酯基團來連接(實例顯示于圖1Z中，其中十四烷烴通過O-烷基連接物連接硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的3’磷酸酯。如果L部分連接5′端，通常通過5′連接的磷酸酯基團來連接(參見圖1F，其顯示了使用氨基甘油連接物，和圖1G，其顯示了使用二氨基甘油連接物)?？梢酝ㄟ^任何合適的原子連接O部分上的堿基，例如鳥苷的N2氨基(參見圖1Q-R)。當n＞1時使得多個脂質部分連接O部分，獨立選擇的L部分可以連接于任何合適的位點上。例如，一個L基團可以連接每一端，各種L基團可以連接堿基，或兩個或多個L基團可以連接于一端(參見圖1E、1J、1K)。
可以使用任意的連接物部分x來連接化合物的O和L部分。如果使用連接物，如以上圖2圖例中所述的將其引入合成方法中。合適連接物基團的實例包括氨基甘油和O-烷基甘油型連接物，其各自可以通過通式結構來圖示 其中R′＝H、OH、NH2或SH；Y＝O、S或NR；R＝H或烷基，且n和m獨立地為1-18的整數(shù)。
合適連接物的特定實例是氨基甘油連接物，其中R′＝OH，Y＝O，且n和m各自為1 二氨基甘油連接物，其中R′＝OH，Y＝NH，且n和m各自為1
和O-烷基甘油連接物，其中R＝H。
C.本發(fā)明化合物的實例本發(fā)明化合物的實例顯示于圖1中。為了簡單，只顯示了寡核苷酸的一個堿基，用圖示的通式堿基，B，和R表示寡核苷酸剩余部分的連接點。連接3′端的化合物用3′氮來說明，與優(yōu)選的硫代氨基磷酸酯和氨基磷酸酯寡核苷酸化學物質一致。圖1A-1L說明了具有連接5′或3′端的飽和脂質基團的化合物。圖1M-1P說明了具有單-或多-不飽和脂質基團的化合物。圖1Q-1R說明了具有通過堿基(該情況中，是鳥苷)共軛寡核苷酸的脂質基團的化合物。圖1S和1CC各自說明了3′-和5′-共軛的膽固醇脂質部分。圖1U和1V說明了5′-共軛的多氟代脂肪酸衍生物，和圖1W說明了5′共軛的多氟代烴。圖1X-Z說明了含有氧的脂質部分。在此所用的每個脂質基團的名稱說明如下圖1A3′-肉豆蔻酰胺圖1B3′-棕櫚胺圖1C3′-硬脂酰胺圖1D3′-棕櫚酰胺-丙基-硫代磷酸酯圖1E3′-賴氨酰-二-硬脂酰胺圖1F5′-棕櫚酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1G5′-棕櫚酰胺-二-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1H5′-硬脂酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1I3′-十二烷基圖1J3′-二-十二烷基圖1K3′-二-癸基圖1L3′-二十烷基酰胺圖1M3′-油基酰胺圖1N3′-亞麻酸酰胺圖1O3′-亞油酸酰胺圖1P3′-三苯甲基圖1QN2-十四烷基鳥苷圖1RN2-十八烷基鳥苷圖1S3′-膽固醇酰胺-氨基丙三醇-硫代磷酸酯圖1T5′-(12-OH)-硬脂酰-硫代磷酸酯圖1U5′-C11-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯圖1V5′-C13-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯圖1W5′-OH-C10-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯圖1X5′-OH-棕櫚酰-硫代磷酸酯圖1Y5′-十八烷基-硫代磷酸酯圖1Z3′-十八烷基-硫代磷酸酯圖1AA3′-棕櫚酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1BB3′-thioctylamide圖1CC5′-膽固醇酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1DD5′-(2-OH)-十六醇-硫代磷酸酯D.本發(fā)明化合物的合成可以使用用于所選化學物質類型的標準實驗方案來合成本發(fā)明化合物的寡核苷酸部分。具有優(yōu)選N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯化學物質的寡核苷酸的合成方法各自描述于McCurdy等，(1997)Tetrahedron Letters，38207-210和Pongracz & Gryaznov，(1999)Tetrahedron Letters，497661-7664。
根據所選鍵合物的性質，包括描述于Mishra等，(1995)Biochemicaet Biophysica Acta，1264229-237，Shea等，(1990)Nucleic Acids Res.183777-3783，和Rump等，(1998)Bioconj.Chem.9341-349的方法，可以使用各種合成方法來共軛脂質部分和寡核苷酸。其中脂質部分共軛于寡核苷酸5′或3′端的本發(fā)明化合物的合成，可以通過在合適的末端使用合適的官能團來實現(xiàn)，最常見為氨基，其可以與羧酸、酸酐和醛以及活性酯反應。硫醇基團也適于作為官能團(參見Kupihar等，(2001)Bioorganic and Medicinal Chemistry 91241-1247)?？少彽糜糜诠押塑账岷铣傻牟煌滈L的氨基-和硫醇-改性劑。具有N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯鍵合的寡核苷酸含有3′-氨基(而不是最常見寡核苷酸化學物質中發(fā)現(xiàn)的3′-羥基)，因此這些寡核苷酸提供了用于共軛脂質基團和寡核苷酸3′-端的獨特優(yōu)勢。
可以使用各種方法，用優(yōu)選的N3′→P5′氨基磷酸酯和N3′→P5′硫代氨基磷酸酯化學物質來連接脂質基團和寡核苷酸的末端。產生本發(fā)明軛合化合物的合成示意圖的實例顯示于圖2中。為了連接3′端，通過使全部被護的固體載體束縛的寡核苷酸的游離3′-氨基與相應的酸酐反應，接著用氨去保護并純化來合成軛合化合物?；蛘?，使用偶合劑(如碳化二亞胺)偶合脂質的羧酸和載體束縛(support bound)的寡核苷酸的3′-氨基，HBTU或2-氯-1-甲基吡啶碘可以用于共軛脂質基團。這兩種方法將在脂質和寡核苷酸之間形成酰胺鍵。還可以使用鏈延伸過程中連接寡核苷酸的脂質的氨基磷酸酯衍生物將脂質連接寡核苷酸鏈。該方法產生了連接脂質和寡核苷酸的氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯鍵合(通過丙基-棕櫚?；?-羥基-丙基-棕櫚?；衔飦硎纠?。再一方法包括全部被護的載體束縛的寡核苷酸的游離3′-氨基和合適的脂質醛反應，接著用氰基硼酸鈉還原，其產生胺鍵。
為了連接5′端，使用改性的、含有脂質的固體載體來合成寡核苷酸，接著以5′-至3′的方向合成寡核苷酸，如Pongracz & Gryaznov(1999)中所述的。改性載體的實例提供于以下的示意圖C中。在其中n＝14的情況中，脂肪酸是棕櫚酸3′-氨基-1，2-丙二醇和棕櫚酰氯反應，接著二甲氧基三苯甲基化和琥珀?；峁┝擞糜谂己瞎腆w載體的中間產物。R是長鏈烷基胺控制的多孔玻璃。
示意圖c E.端粒酶抑制測試本發(fā)明的軛合物可以用于抑制或降低端粒酶的酶活性和/或具有端粒酶活性的細胞增殖。這些內容中，酶活性或細胞增殖的抑制或降低指的是比其中酶或細胞沒有用軛合物處理的對照實驗所測量的活性水平低。特定實施方案中，所測量活性的抑制或降低至少為10％的降低或抑制。本領域技術人員將認識到對于特定應用優(yōu)選測量活性的降低或抑制為至少20％、50％、75％、90％或100％?？梢栽跓o細胞測試(稱為生化測試)和細胞中測定本發(fā)明化合物抑制端粒酶活性的能力。
測量端粒酶活性的方法，以及使用這樣的方法來測定化合物的端粒酶抑制活性是公知的。例如，TRAP測試是用于測量細胞提取物系統(tǒng)中端粒酶活性的標準測試方法并已經廣泛用于端粒酶抑制化合物的研究中(Kim等，Science 2662011，1997；Weinrich等，Nature Genetics17498，1997)。TRAP測試測量了引入延伸產物(多核苷酸)中的放射性核苷酸含量，該延伸產物是通過將核苷酸添加至端粒酶底物或引物而形成的?？梢酝ㄟ^檢測屏(例如，Phosphorimager屏)上，曝光于分離放射性產物的凝膠的條帶強度來測量引入的放射性。TRAP測試還詳細地描述于U.S.專利No.5,629,154，5,837,453和5,863,726中，其在測試端粒酶抑制化合物活性中的用途描述于各種出版物中，包括WO01/18015。此外，對于測量端粒酶活性的研究目的，以下所試劑盒是可購得的TRAPezeXK端粒酶檢測試劑盒(Cat.s7707；Intergen Co.，Purchase NY)；和Telo TAGGG端粒酶PCR ELISA陽性(Cat.2，013，89；Roche Diagnostics，Indianapolis IN)。
測量生化測試中化合物抑制端粒酶能力的優(yōu)選實驗方案是直接的(非基于PCR的)無細胞端粒酶測試，稱為“Flashplate測試”，描述于Asai等，Cancer Research，633931-3939(2003)中。
可以用表達端粒酶的細胞在限定的時間段培養(yǎng)化合物，然后測定細胞提取物中的端粒酶活性來測定本發(fā)明化合物在細胞中抑制端粒酶的能力?；诩毎麥y試的優(yōu)選實驗方案是描述于Asai等(2003)中的細胞基端粒酶測試。適于這樣測試的表達端粒酶的腫瘤細胞系包括HME50-5E人乳房上皮細胞(由Dr.Jerry Shay提供，University of TexasSouthwestern Medical Center)、卵巢腫瘤細胞系OVCAR-5(MIISB，Millan)和SK-OV-3(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)、人腎癌Caki-1細胞(日本生物來源研究中心，JCRB)、人肺癌1549細胞(ATCC)、人表皮樣癌A431細胞(JCRB)和人前列腺癌DU145細胞(ATCC)。
F.細胞增殖測試本發(fā)明化合物的關鍵治療應用是抑制表達端粒酶的細胞尤其是腫瘤細胞的生長。抑制細胞中端粒酶活性的本發(fā)明化合物將和其他已知的抑制端粒酶的化合物一樣，誘導端粒酶陽性細胞的驟退，從而導致細胞生長停止并死亡。然而，重要地，在沒有表達端粒酶的正常人細胞中，如成纖維來源的BJ細胞，沒有由本發(fā)明化合物處理而誘導的驟退或其它毒性?？梢允褂皿w外腫瘤細胞系或在體內的異種移植動物模型中測試化合物特異性抑制腫瘤細胞生長的能力。
用于這樣生長曲線測試的優(yōu)選實驗方案是描述于Asai等(2003)中的短期細胞生活力測試。選擇用于治療應用的本發(fā)明化合物中，優(yōu)選化合物在低于約10μM的濃度下在沒有表達端粒酶的正常細胞中沒有產生顯著的細胞毒性效應。
可以使用建立的人腫瘤異種移植模型來證實本發(fā)明化合物體內抑制腫瘤細胞生長的能力，其中將測試化合物直接給藥于腫瘤部位或全身給藥，接著通過物理測量腫瘤的生長。期望用本發(fā)明化合物治療的動物在開始給藥時會平均增長一段時間，但隨著繼續(xù)治療，腫瘤塊開始縮小。相反，未治療的對照小鼠如預料地，腫瘤塊會繼續(xù)增長。合適的體內腫瘤移植測試的優(yōu)選實例描述于Asai等(2003)中。其它實例描述于Scorski等，Proc.Natl.Sci.USA，943966-3971(1997)和Damm等，EMBO J.，206958-6968(2001)中。
G.本發(fā)明化合物的配制本發(fā)明提供了可以特定地并有效地抑制端粒酶活性的化合物，因此其可以用于抑制端粒酶陽性細胞如腫瘤細胞的增殖。很多種類癌細胞已經顯示為端粒酶陽性，包括皮膚癌、結締組織、脂肪、乳房、肺、胃、胰腺、卵巢、子宮頸、子宮、腎、膀胱、結腸、前列腺、中樞神經系統(tǒng)(CNS)、視網膜和血液腫瘤(如骨髓瘤、白血病和淋巴瘤)的細胞。
因此，在此提供的化合物可以廣泛用于治療多種惡性腫瘤中。更重要地，本發(fā)明的化合物有效將區(qū)分惡性和正常細胞的治療提升了一個高度，避免了依靠不區(qū)分地殺滅分裂細胞試劑的最常用化療方案存在的許多有害副作用。此外，本發(fā)明的化合物比等量的未軛合寡核苷酸更有效，這意味著可以以較低量給藥，提供提高的安全性和明顯降低的治療成本。因此本發(fā)明的一個方面是治療患者癌癥的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明化合物給藥于患者。包括本發(fā)明的化合物的端粒酶抑制劑可以結合其它癌癥治療方法(包括原發(fā)腫瘤的手術切除、化療劑和放射治療)來進行使用。
為了治療應用，將本發(fā)明的化合物以治療有效量和藥物學上可接受的載體配制。任何給定的制劑中可以包括一種或多種(例如，具有不同的L或O部分)本發(fā)明的化合物。藥物學上可接受的載體可以是固體或液體的。液體載體可以用于溶液、乳濁液、懸浮液和加壓組合物的制備中。將化合物溶解或懸浮于藥物學上可接受的液體賦形劑中。用于寡核苷酸制劑非腸道給藥的液體載體的合適實例包括水(其可以含有添加劑，例如，纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)、醇(包括單氫醇和多氫醇，例如甘油)及其衍生物，和油(例如，分餾的可可脂和花生油)。液體載體可以含有其它合適的藥物學添加劑，包括但不限于以下增溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩沖劑、增稠劑、色素、粘度調節(jié)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和滲透壓調節(jié)劑。
為了化合物的非腸道給藥，載體還可以是油脂如乙基油酸酯和異丙基肉豆蔻酯。無菌載體可以用于非腸道給藥的無菌液體形式組合物中。
可以通過例如腹膜內注射、皮下注射，靜脈內或局部地來使用無菌液體藥物組合物、溶液或懸浮液。還可以通過血管內或通過血管斯滕特固定模給藥寡核苷酸。
用于加壓組合物的液體載體可以是鹵代烴或其它藥物學上可接受的推進劑。這樣的加壓組合物還可以是脂質密封的來用于通過吸入的傳送。為了通過鼻內或支氣管內吸入或吹入給藥，可以將寡核苷酸配制于水溶液或部分水溶液中，然后可以用于氣物劑形式中。
可以通過與含有活性化合物的藥物學上可接受的載體進行配制，以溶液、霜劑或洗劑來局部給藥化合物。
本發(fā)明的藥物組合物可以以任何可接受的劑型口服給藥，包括但不限于，膠囊制劑、片劑、粉末或顆粒，和作為水或非水介質中的懸浮液或溶液。包括本發(fā)明寡核苷酸的藥物組合物和/或制劑可以包括載體、潤滑劑、稀釋劑、增稠劑、調味劑、乳化劑、分散助劑或結合劑。在口服使用片劑的情況中，通常使用的載體包括乳糖和淀粉糖漿。通常還加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。對于膠囊形式的口服，有用的稀釋劑包括乳糖和干淀粉糖漿。當口服使用需要含水懸浮液時，將活性成分與乳化劑和懸浮劑結合。如果需要，還可以加入特定的甜味劑、調味劑或色素。
雖然本發(fā)明的化合物對于細胞和組織滲透具有優(yōu)良的特征，但將它們配制于例如脂質體載體中會提供更大的益處。使用脂質體來幫助細胞吸收描述于例如U.S.專利No.4,897,355和U.S.專利No.4,394,448中。多種出版物描述了脂質體的制劑和制備。還可以通過混合其他的滲透促進劑來配制化合物，如上述未軛合形式的脂質部分，包括脂肪酸及其衍生物。實例包括油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、recinleate、甘油一油酸酯(又名1-單油?；?rac-丙三醇)、甘油二月桂酸酯、辛酸、arichidonic acid、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-單、?；舛緣A、?；憠A、單-和二-甘油酯及其藥物學上可接受的鹽(即，油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)。
可以使用含有一種或多種滲透促進劑的復合制劑。例如，可以結合脂肪酸使用膽汁鹽來制得復合制劑。示例性混合物包括與癸酸鈉或月桂酸鈉(通常以約0.5至2％的濃度使用)結合的鵝脫氧膽酸(CDCA)(通常以約0.5至5％的濃度使用)。
含有本發(fā)明寡核苷酸的藥物組合物和/或制劑還可以包括螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑。螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉，5-甲氧基水楊酸鹽和homovanilate)、膠原的N-?；苌铩⒃鹿?9和β-雙酮的N-氨基?；苌?烯胺)。表面活性劑包括，例如，月桂酸磺基酸鈉、多氧乙烯-9-月桂酰酯和多氧乙烯-20-十八烷基酯；和多氟代化學乳化劑，如FC-43。非表面活性劑包括，例如，不飽和環(huán)脲、1-烷基-和1-烯基氮雜環(huán)-烷酮衍生物，和非固醇消炎劑如二氯苯胺苯乙酸鈉、消炎痛和苯丁唑酮。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了配制藥物組合物的方法，該方法包括提供在此所述的化合物，并將化合物與藥物學上可接受的賦形劑結合。優(yōu)選以下述藥物學純度提供化合物。該方法進一步包括在加入賦形劑之前或之后，將滲透促進劑加入化合物中。
典型地，藥物組合物遵守藥物純度標準。對于用作藥物制劑中的活性成分，通常純化本發(fā)明的化合物，使其與存在于制備它們的混合物中的其它反應性的或潛在的免疫原性成分中分離。典型地，為了獲得其中核酸堿基化合物是活性成分的藥物學純度，以通過功能測試、色譜或凝膠電泳測定的至少約50％的均一性，更優(yōu)選60％、70％、80％或90％的均一性來提供活性成分。然后將根據通常使用的制備藥物制劑的方法將活性成分混入藥物中。因此，本發(fā)明提供在藥物學純度方面化合物需要提供至少約50％均一性，更優(yōu)選至少80％或90％的均一性的化合物。
典型地，還將藥物組合物等分并以單劑量或多劑量單位進行包裝。寡核苷酸化合物治療需要的劑量隨所用的特定組合物、給藥途徑、現(xiàn)有癥狀的嚴重程度、化合物的形式和待治療的特定患者而改變。
可以以有效獲得臨床理想結果的制劑和含量將本發(fā)明的藥物組合物給藥于患者。對于癌癥的治療，理想的結果包括腫瘤塊的縮小(通過觸診或圖像測定的例如通過放射線照相、放射核苷酸掃描、CAT掃描或MTI)、腫瘤生長率的降低、轉移瘤形成的降低(如通過活體解剖樣本的組織化學分析測定的)生化標記的降低(包括一般標記如ESR，和腫瘤特異性標記如血清PSA)和生命質量的改善(如通過臨床測試測定的，例如，Karnofsky分值)、進展的延長時間、無疾病生存和全部存活。
得到這些效果所需的每劑中化合物的含量和劑量將根據許多因素而改變，包括疾病跡象、待治療患者的特征和給藥方式。典型地，給藥的劑型和途徑提供了疾病部位1μM至1nM化合物的局部濃度。
通常，以給予有效結果而沒有導致任何有害或不利副作用的濃度給藥化合物?？梢酝ㄟ^給藥單個單位劑量或通過整天以合適間隔給藥分成方便的亞單位劑量來得到這樣濃度。
實施例以下實施例說明了本發(fā)明化合物的合成和活性，其中使用優(yōu)選的硫代氨基磷酸酯或氨基磷酸酯化學物質合成寡核苷酸部分O。特定實施例中，脂質部分共軛3′或5′端，或兩端，使用或未用連接物。這些化合物的通式結構可以表示為 其中R1和R2獨立地為H或脂質部分(L)，Y是O(氨基磷酸酯寡核苷酸)或S(硫代氨基磷酸酯寡核苷酸)，n是整數(shù)，通常為4至49，和B表示堿基(對每個核苷亞基為可獨立選擇的)。該結構中沒有描繪任意的連接物。
實施例1化合物的合成A.一般方法在ABI 394合成儀上使用amidite轉移反應以1μmol的規(guī)模合成寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯(NP)和硫代氨基磷酸酯(NPS)，各自根據McCurdy等(1997)Tetrahedron Letters，38207-210和Pongracz &Gryaznov，(1999)Tetrahedron Letters，497661-7664所述的方法。全部被護的單體結構阻斷(blocks)是3′-氨基三苯甲基-核苷酸-5′-(2-氰基乙基-N，N-二異丙基氨基)核苷氨基磷酸酯，尤其是3′-脫氧-胸苷，2′，3′-二脫氧-N2-異丁酰-鳥苷，2′，3′-二脫氧-N6-苯甲酰-腺苷，和2′3′-二脫氧-N4-苯甲酰-胞苷，從Transgenomic，Inc.購買的(Omaha，Nebraska)。3′-氨基三苯甲基-5′-琥珀酰-核苷與含有氨基的長鏈控制多孔玻璃(LCAA-CPG)偶合并用作固體載體。以5′到3′的方向進行合成。使用標準1μM(ABI Perkin Elmer)方法用碘/H2O氧化步驟合成具有NP主鏈的寡核苷酸，而使用硫實驗方案制備具有NPS主鏈的寡核苷酸，其中乙腈∶2，6-二甲基吡啶為1∶1混合物的0.1M苯乙酰二硫化物(PADS)溶液用作硫化劑。用于制備兩種類型主鏈的偶合時間為25秒。THF∶異丁酸酐∶2，6-二甲基吡啶的18∶1∶1混合物用作封端劑。使用三種方法來結合脂質部分和寡核苷酸方法(i)在合成儀上使用氨基磷酸酯試劑將脂質部分引入3′端進行偶合；方法(ii)使用改性的固體載體(示例于上述的示意圖C中)，在產生5′軛合物的延伸合成開始之前將脂質基團共軛于其上；和方法(iii)游離3′-氨基的反應，并且隨后在固體載體上去保護。以下提供了這些方法的更多詳細內容。對于連接于3′端或核酸堿基的脂質基團，用濃縮的氨，或對于連接于5′端的脂質基團，用1∶1的乙醇∶濃縮氨的混合物，將寡核苷酸去保護，在55℃進行6-8小時。在Pharmacia NAP-25凝膠過濾柱上將粗制產物脫鹽或用乙醇從1M氯化鈉中沉淀粗制產物，然后真空凍干。
隨后使用Beckman Ultrasphere C18(5μ)250×10mm柱通過反相HPLC將寡核苷酸產物純化。用線性梯度的50mM三乙胺醋酸鹽中的乙腈以2ml/分鐘的流速洗脫產物并用純凈的冷乙醇將其從1M氯化鈉中沉淀出來，轉化成鈉鹽。通過使用上述溶劑系統(tǒng)的分析RP HPLC和通過來測定PAGE化合物的純度。記錄VARIAN Unity Plus 400MHz設備上的1H和31P質譜并使用WATERS Micromass ZMD質譜儀獲得電噴霧離子質譜(EMI MS)。
B.脂質基團和寡核苷酸的共軛如上所述，可以使用各種方法來共軛脂質部分和寡核苷酸。特定方法的詳細內容如下方法(i)在該方法中，在寡核苷酸合成過程中作為3′核苷加入含有共軛的脂質基團的氨基磷酸酯試劑，致使脂質基團與寡核苷酸的3′端共軛。該方法舉例說明了含有兩個脂肪酸的氨基磷酸酯的合成和隨后的偶合。
(i/a)3-棕櫚酰氨基-丙烷-1-O-(2-氰基乙基-N，N-二異丙基氨基磷酸酯)的合成和偶合。
向溶解于1∶4的乙腈-二氯甲烷混合物中的1.0g(13.3mmol)3-氨基-丙醇中，加入10ml的二異丙基乙胺和4.06ml(13.3mmol)的棕櫚酰氯。攪拌反應過夜后，加入更多的二氯甲烷，然后依次用飽和的碳酸氫鈉、鹽水和水洗滌混合物。通過硫酸鈉干燥有機相并蒸發(fā)至干。將獲得的500mg(1.6mmol)白色固體通過與干乙腈共蒸發(fā)來進行共沸，并溶解于50ml二氯甲烷中。在加入1.1ml二異丙基乙胺(4eq.)后，逐滴加入390μl(1.7mmol)的2-氰乙基二異丙基氯代氨基磷酸酯。將反應混合物攪拌1小時來得到澄清的溶液。依次用飽和的碳酸氫鈉和鹽水洗滌反應混合物，通過硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜使用45∶45∶10v/v的乙酸乙酯∶二氯甲烷∶三乙胺溶劑系統(tǒng)來純化產物。在用于DNA合成儀之前，通過干燥器中的P2O5來干燥0.7g(90％)蠟狀固體。31P NMR(CDCl3)148.45ppm，ES MS(MH+)514。為了在DNA合成儀上進行偶合，在無水乙腈-二氯甲烷9∶1的混合物中制備0.1M的溶液。該合成形成用于生產圖1D中所示軛合寡核苷酸的反應物。
(i/b)3-棕櫚酰氨基-1-羥基-丙烷-2-O-(2-氰基乙基-N，N-二異丙基氨基磷酸酯)的合成和偶合將1g(10.97mmol)3-氨基-丙二醇懸浮于10ml的吡啶中，逐滴加入3.017g(10.97mmol)棕櫚酰氯的2ml DMF溶液并強烈攪拌。攪拌15分鐘后，將凝膠過濾并空氣干燥。從熱乙醇和熱2-丙醇中以白色粉末再結晶固體。將白色固體與吡啶共蒸發(fā)，然后溶解于30ml干吡啶中。加入2.89g(8.55mmol)DMT-氯化物并將反應混合物攪拌30分鐘，反應后進行TLC。用甲醇淬火后，將吡啶蒸發(fā)并由二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉逐步進行反應。使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑，將所得到的油通過硅膠柱色譜純化。用吡啶共沸所得到的2.4g(3.64mmol)黃色油，溶于100ml二氯甲烷和4eq二異丙基乙胺(2.5ml)中。向攪拌的溶液中逐滴加入920μl(4mmol)2-氰乙基二異丙基氯代氨基硫酸酯。反應后進行TLC并發(fā)現(xiàn)2小時后完成并如上逐步進行。使用45∶45∶10的乙酸乙酯∶二氯甲烷∶三乙胺溶劑系統(tǒng)，通過硅膠色譜純化產物。在用于DNA合成儀上之前在干燥器中干燥獲得的固體(0.1M乙腈溶液)。31P NMR(CDCl3)149.9，150.2ppm，ES MS(MNa+)854.57。該合成形成用于生產圖1AA中所示軛合寡核苷酸的反應物。
方法(ii)在該方法中，共軛脂質部分的改性固體載體用作寡核苷酸5′至3′合成的起始點，形成5′軛合物。該方法舉例說明了兩種改性固體載體的合成和使用。
(ii/a)3-棕櫚酰氨基-1-二甲氧基三苯甲基氧-2-琥珀酰氧-丙烷的合成將1g(10.97mmol)3-氨基-1，2-丙二醇懸浮于10ml吡啶中。并逐滴加入3.017g(10.97mmol)棕櫚酰氯的2ml DMF溶液并強烈攪拌。攪拌15分鐘后，將凝膠過濾并空氣干燥。從熱乙醇和熱2-丙醇中以白色粉末再結晶固體。將白色固體與吡啶共蒸發(fā)，然后溶解于30ml干吡啶中。加入3.2g(9.46mmol)DMT-氯化物并將反應混合物攪拌30分鐘，反應后進行TCL。用甲醇淬火后，將吡啶蒸發(fā)并由二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉逐步進行反應。將所得到的油通過硅膠柱色譜純化，使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑。用吡啶共沸所得到的2.5g(3.65mmol)黃色油，然后加入475mg琥珀酸酐和483mg二甲基氨基吡啶并將反應混合物攪拌1小時。通過TLC監(jiān)控反應，且如果需要加入更多的琥珀酸酐。用冷的檸檬酸鈉緩沖液(pH＝4)來洗滌二氯甲烷溶液并通過硫酸鈉干燥有機相，然后蒸發(fā)至干。獲得的終產物為2.0g(24.9％)。
(ii/b)3-硬脂酰氨基-1-二甲氧基三苯甲基氧-2-琥珀酰氧-丙烷的合成將1g(10.97mmol)3-氨基-丙二醇懸浮于10ml吡啶中，并逐滴加入3.32g(10.97mmol)硬脂酰氯的10ml DMF溶液并強烈攪拌。攪拌15分鐘后，將凝膠過濾并空氣干燥。從熱乙醇和熱2-丙醇中以白色粉末再結晶固體。將白色固體與吡啶共蒸發(fā)，然后溶解于30ml干吡啶中。加入2.89g(8.55mmol)DMT-氯化物并將反應混合物攪拌30分鐘，反應后進行TLC。用甲醇淬火后，將吡啶蒸發(fā)并由二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉逐步進行反應。將所得到的油通過硅膠柱色譜純化，使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑。將所得到的2.4g(3.64mmol)黃色油溶解于30ml二氯甲烷中，然后加入475mg琥珀酸酐和483mg二甲基氨基吡啶并將反應混合物攪拌1小時。通過TLC監(jiān)控反應，且如果需要加入更多的琥珀酸酐。用冷的檸檬酸鈉緩沖液(pH＝4)來洗滌二氯甲烷溶液并通過硫酸鈉干燥有機相，然后蒸發(fā)至干。獲得的終產物為1.2g(14.4％)。
然后將(ii/a)和(ii/b)中合成的產物共軛長鏈氨基控制的多孔玻璃(LCAA-CPG)來產生改性的固體載體，如下在100ml肽合成容器中，用干二甲基甲酰胺洗滌20g的LCAA-CPG(Transgenomic，Inc.，～200mmol/g-HN2裝載)。在分開的燒瓶中，將上述(ii/a)和(ii/b)中所述的5.55mmol產品溶解于40ml氯仿、3ml二異丙基乙胺中，并加入2.13g(8.3mmol)2-氯-1-甲基吡啶碘。將該懸浮液倒過肽合成容器(具有活塞開口)中的干CPG直至通過CPG吸收約一半的溶液。然后關閉活塞和上端蓋子將容器搖晃直至溶液完全覆蓋CPG。(如果需要可以加入更多的氯仿，但是體積必需保持最小)。然后將容器放置于搖床上使反應在室溫下過夜進行。過濾CPG，然后用二氯甲烷、甲醇和乙腈洗滌。使用18∶1∶1THF-2，6-二甲基吡啶-異丁酸酐和Cap B的1∶1(N-甲基咪唑/THF)溶液在搖床上于室溫下1小時將未反應的氨基封端。進一步過濾后，用甲醇、二氯甲烷和乙腈洗滌珠子。通過測量使用甲醇高氯酸去封閉的樣品在498nm的二甲氧基三苯甲基陽離子吸收的標準方法確定裝載并發(fā)現(xiàn)為50-60μmol/g。
一旦產生改性的固體載體，將它們用于上述的寡核苷酸合成中。該方法產生的寡核苷酸軛合物的實例顯示于圖1F、1G和1H中。
方法(iii)在該方法中，完成寡核苷酸的合成而且其保持全部被護并束縛固體載體，3′端與脂質基團的酸酐(iii/a)、酸酐(iii/b)、酸(iii/c)或醛(iii/d)形式進行反應，如下。
(iii/a)將含有游離3′-氨基的固體載體束縛的全部被護的寡核苷酸(4μmol)真空干燥并懸浮于3ml無水氯仿中。加入140μl(0.8mmol)二異丙基乙胺和0.4mmol合適的?；?例如122μl棕櫚酰氯)后，混合物振蕩2分鐘并快速過濾，然后用氯仿、甲醇和乙腈洗滌。將干珠子懸浮于1-2ml濃縮的氫氧化銨中并在55℃下加熱5小時。然后將冷卻的氫氧化銨溶液過濾并蒸發(fā)。通過HPLC分離脂質軛合產物。使用上述條件將產物洗脫約40分鐘。蒸發(fā)后，將產物從1M氯化鈉和乙醇中沉淀出來來獲得鈉鹽。
(iii/b)向干的固體載體束縛的全部被護的寡核苷酸(1μmol)中，加入0.1mmol合適的酐和170μl溶解于2ml氯仿中的二異丙基乙胺，并將含有混合物的小瓶放置于搖床上過夜。過濾后，如上用氯仿、甲醇和乙腈洗滌珠子，并將共軛的寡核苷酸去封閉并純化。
(iii/c)在搖床上將1μmol固體載體束縛的全部被護的寡核苷酸和0.1mmol合適酸的溶液、25mg 2-氯-1-甲基吡啶碘(0.1mmol)和2ml氯仿中的170μl二異丙基乙胺反應過夜。如上所述的進行洗滌、去封閉和純化。
(iii/d)將0.3mmol所需酐的溶液、31.5mg氰基硼酸鈉和100μl0.5M醋酸鈉的2ml四氫呋喃加入到1μmol固體載體束縛的全部被護的寡核苷酸中并放置于搖床上30分鐘。如上所述進行洗滌、去封閉和純化。
方法(iv)在該方法中，不將脂質基團共軛寡核苷酸的末端，而是共軛鏈上的核酸堿基，例如鳥苷。使用常規(guī)寡核苷酸鏈延伸實驗方案合成這些化合物，如上所述，但是引入用共價軛合脂質基團改性的堿基，如圖2E中所示的，其中脂質基團共軛核酸堿基的化合物實例顯示于圖1Q和R中。
實施例2化合物在生化和細胞基測試中的活性在生化Flashplate測試和細胞基測試中測試如在此所述的軛合寡核苷酸抑制端粒酶的能力，如上所述和Asai等(2003)中所述的。結果顯示于下表中。該表中，使用以下的縮寫寡核苷酸序列1＝TAGGGTTAGACAA，與hTR，SEQ ID NO1的堿基42-54互補2＝CAGTTAGGGTTAG，與hTR，SEQ ID NO1的堿基38-50互補化學物質NP表示具有氨基磷酸酯核苷酸間鍵合的寡核苷酸NPS表示具有硫代氨基磷酸酯核苷酸間鍵合的寡核苷酸軛合物5′表示脂質部分共軛寡核苷酸的5′端3′表示脂質部分共軛寡核苷酸的3′端人癌細胞類型(所有都來自ATCC)HT-3和A431宮頸癌U-251多形性膠質母細胞瘤DU145和LNCaP前列腺癌Caki腎透明細胞癌NCIH522肺腺癌Ovcar卵巢癌Hep3B肝細胞癌




實施例3比較效用和生物利用率研究選擇本發(fā)明的兩種化合物，和非軛合寡核苷酸一起，分別進行詳細研究。所選的化合物，圖示于圖9中，如下化合物A(未軛合)序列TAGGGTTAGACAA的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(該序列與hTR，SEQ ID NO1的堿基42-54互補)(圖9A)。
化合物B共軛3′棕櫚酰胺的化合物A的寡核苷酸(圖9B)化合物C共軛5′棕櫚酰胺-甘油-硫代磷酸酯的化合物A的寡核苷酸(圖9C)這個和以下的實施例中記載了對這些化合物的研究。
下表顯示了當與配對的RNA相結合時，這三種化合物中每種的熔化溫度(使用標準方法測定)，使用生化測試所測定的端粒酶抑制的IC50值，使用細胞基(使用HT-3細胞)的測試所測定的端粒酶抑制的IC50，如上所述。

如表中所示的，未軛合寡核苷酸A對其目標顯示出非常高的親和性，熔化溫度為70℃，生化測試中端粒酶抑制的IC50為0.15nM(其中細胞吸收不是問題)。盡管化合物A具有良好的完整細胞吸收，以及在多個不同的腫瘤細胞系中(該實驗HT-3細胞中1.6μM)具有端粒酶抑制的低微摩爾IC50，這反映了相對于生化效能，在完整細胞中約有10,000倍的效用丟失。脂質基團加入寡核苷酸的5′或3′端(各自化合物C和B)適度地降低了Tm，其在65.5-66.5℃下仍然保持非常高，并與未軛合化合物A相比較降低了生化效用6至11倍。然而，非常重要的是，與這些化合物的生化效用相比較，脂質綴合化合物B和C在完整細胞中的效用僅降低～100倍。更強細胞吸收的結果是，與未軛合寡核苷酸(化合物A)相比較，化合物B和C證明了HT-3細胞中效用至少提高了10倍。
用其它類型的人癌細胞觀察到相似的結果。圖3和4，顯示了用化合物A、B和C各自在完整U251(人多形性膠質母細胞瘤)細胞和DU145(人前列腺癌)細胞中獲得的數(shù)據。在U251細胞中化合物C(5′-脂質化形式)的IC50比化合物A的約低10倍，在DU145細胞中約低38倍，證實了化合物C治療效率的提高。
實施例4動物模型的人腫瘤中端粒酶活性的抑制以下的實驗中比較了非軛合寡核苷酸化合物A和脂質軛合的寡核苷酸化合物C抑制動物腫瘤生長中端粒酶的能力。在兩側用DU-145腫瘤細胞接種無胸腺(nu/nu)小鼠。當腫瘤達到50-100mm3大小時(兩個腫瘤/小鼠)，小鼠接受單尾靜脈注射PBS、FITC-標記的化合物A，或FITL-標記的化合物C(以40mg/kg給藥兩種化合物)。IV注射后24小時小鼠犧牲；收集一個腫瘤用于熒光顯像和另一個腫瘤用于通過TRAP測試的端粒酶活性分析。
兩個治療組中的熒光水平是可比較的。然而，如圖5中所示，化合物C導致高于化合物A的端粒酶活性抑制。泳道中對應于0.75ug腫瘤溶解產物的垂直箭頭表示這些樣品含有可比較含量的內標(通過水平箭頭來表示)。血液含有血色素和其它非特異性標記聚合物抑制劑(用于端粒酶產物的PCR擴增中)，如通過凝膠左邊泳道中內標丟失來表示。然而，可以通過連續(xù)稀釋將這些非特異性抑制劑稀釋(降低反應混合物中的腫瘤溶解產物)。在腫瘤溶解產物的最低濃度(右邊的三個泳道)，其中在全部三個處理條件下內標是可比較的，清楚的是化合物C抑制端粒酶活性的程度比可比較劑量的化合物A高。
實施例5動物模型中骨髓瘤蛋白含量的降低骨髓瘤患者的血漿含有特有的高含量(檢測為“骨髓瘤峰值”或M-蛋白)癌細胞產生的抗體。M-蛋白含量的降低與疾病的緩解一致。該實驗中，比較非軛合寡核苷酸化合物A和脂質共軛的寡核苷酸化合物C注射入骨髓瘤細胞的動物中后降低M-蛋白含量的能力。照射的NOD/SCID小鼠注射106CAG骨髓細胞然后通過腹膜內(IP)注射PBS，化合物A的PBS或化合物C的PBS來進行治療?；衔顰的劑量為25mg/kg/天(175mg/kg周×5周)；化合物C的劑量為頭2周25mg/kg/天，第三周停止，然后劑量為每周三天25mg/kg/天，持續(xù)兩周(五周內平均劑量為100mg/kg/周)。治療的最后(培養(yǎng)后35天)，小鼠犧牲，并收集每組中的血漿(4-5只小鼠/組)用于測定骨髓瘤蛋白。如圖6中所示的，盡管化合物C的劑量低40％(累積劑量為500mg對化合物A的875mg)，化合物C組證明了較低含量的骨髓瘤蛋白(將每只小鼠的值規(guī)格化)。
實施例6動物模型中人腫瘤生長的抑制以下實驗中比較了非軛合寡核苷酸化合物A和軛合脂質的寡核苷酸化合物C抑制動物中腫瘤生長的能力。照射的NOD/SCID小鼠皮下接種CAG骨髓瘤細胞，腫瘤生長14天后用IP注射PBS、化合物A(25mg/kg/天M-F，或125mg/kg/周)或化合物C(25mg/kg MWF，或75mg/kg/周)。如圖7所示，盡管劑量低40％，但化合物C證明了比化合物A高的抗腫瘤效率。(該研究中，以之前該模型中與抗腫瘤效率相關的劑量低30％的劑量來給藥化合物A，175mg/kg/周)。
作為該研究的一部分，犧牲后研究了兩側CAG骨髓瘤，并分析端粒酶活性(通過TRAP測試)和通過DNA印跡分析TRF長度。如圖8中所示的，盡管以低40％的劑量給藥，但化合物C證明了腫瘤細胞中明顯更高的抑制端粒酶活性(降低83％)和端粒縮短的誘導(2.85Kb平均TRF)。較高劑量的化合物A給予了較低的端粒酶抑制(41％)，并且隨著研究過程的流逝并沒有致使明顯的端?？s短。
* * * * * * * * * *上述公開文本中提供的主題可以作為常規(guī)最佳化的主題來進行改變，而沒有脫離本發(fā)明的精神或所附權利要求的范圍。
序列表SEQ ID NO1ggguugcgga gggugggccu gggaggggug guggccauuu uuugucuaac ccuaacugag aagggcguag 70gcgccgugcu uuugcucccc gcgcgcuguu uuucucgcug acuuucagcg ggcggaaaag ccucggccug 140ccgccuucca ccguucauuc uagagcaaac aaaaaauguc agcugcuggc ccguucgccc cucccgggga 210ccugcggcgg gucgccugcc cagcccccga accccgccug gaggccgcgg ucggcccggg gcuucuccgg 280aggcacccac ugccaccgcg aagaguuggg cucugucagc cgcgggucuc ucgggggcga gggcgagguu 350caggccuuuc aggccgcagg aagaggaacg gagcgagucc ccgcgcgcgg cgcgauuccc ugagcugugg 420gacgugcacc caggacucgg cucacacaug c 45權利要求
1.一種化合物，包括結構O-(x-L)n，其中O是包括至少5個與人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO1)互補的堿基的寡核苷酸；x是任意的連接物；L是脂質部分；且n是1-5的整數(shù)，其中如果n＞1，每個(x-L)成分是可獨立選擇的。
2.根據權利要求1所述的化合物，其中O包括至少10個與人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO1)互補的堿基。
3.根據權利要求2所述的化合物，其中L是選自取代的或未取代的脂肪酸或固醇的脂質。
4.根據權利要求3所述的化合物，其中L是氟取代的脂肪酸。
5.根據權利要求2所述的化合物，其中L是取代的或未取代的烴。
6.根據權利要求5所述的化合物，其中L是氟取代的烴。
7.根據權利要求1所述的化合物，其中n＝1且x-L部分共價共軛寡核苷酸O的5′端。
8.根據權利要求1所述的化合物，其中n＝1且(x-L)部分共價共軛寡核苷酸O的3′端。
9.根據權利要求1所述的化合物，其中n＝2，一個獨立選擇的(x-L)部分共價共軛5′端以及一個獨立選擇的(x-L)部分共價共軛3′端。
10.根據權利要求1所述的化合物，其中n＝1且(x-L)部分共價共軛寡核苷酸O的核酸堿基。
11.根據權利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸的核苷酸間鍵合是N3′→P5′氨基磷酸酯鍵合。
12.根據權利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸的核苷酸間鍵合是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯鍵合。
13.根據權利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸O包括至少10個與人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO1)互補的堿基。
14.根據權利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸的核苷酸間鍵合是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯鍵合；O的序列包括至少12個與人端粒酶RNA序列(SEQ ID NO1)互補的堿基；n＝1；(x-L)共價共軛O的5′或3′端；和L是脂肪酸。
15.根據權利要求14所述的化合物，其中x是甘油或氨基甘油連接物。
16.根據權利要求15所述的化合物，其中化合物的結構是
17.根據權利要求14所述的化合物，其中L通過酰胺鍵直接連接寡核苷酸L的3′端。
18.根據權利要求17所述的化合物，其中化合物的結構是
19.一種抑制端粒酶酶活性的方法，該方法包括使端粒酶與根據權利要求1所述的化合物接觸。
20.一種抑制細胞中端粒酶酶活性的方法，該方法包括使細胞與根據權利要求1所述的化合物接觸。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。
22.一種抑制癌細胞增殖的方法，該方法包括使細胞與根據權利要求1所述的化合物接觸。
23.一種藥物組合物，包括配制于藥物學上可接受的賦形劑中的根據權利要求1所述的化合物。
24.根據權利要求1所述的化合物在醫(yī)學中的用途。
25.根據權利要求1所述的化合物用于治療癌癥的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了包括共價共軛脂質部分的寡核苷酸部分的化合物。寡核苷酸部分包括與人端粒酶的RNA成分互補的序列。該化合物高效抑制細胞中的端粒酶活性并具有優(yōu)良的細胞吸收特性。
文檔編號C07H21/02GK1849069SQ200480025975
公開日2006年10月18日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權日2003年9月9日
發(fā)明者S·格里亞茲諾夫, K·蓬格拉茨 申請人:杰龍公司