專利名稱：苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物以及炎癥反應的調節(jié)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種包含苯并環(huán)庚三烯酚酮部分的化合物，它們作為抗氧化劑和消炎劑的應用，以及制備這種化合物的新方法。
背景技術：
已經研制出許多作為抗氧化劑和消炎劑的藥劑。這些藥劑，尤其是消炎劑具有副作用，如嗜睡、腸胃不適問題，并且連續(xù)長期服用會出現(xiàn)問題。由于這些副作用，有強烈需求需要研制一種來自天然產物的抗氧化劑和消炎劑，其可以長期安全服用，并且不會產生副作用。
茶(Camellia sinensis(L.)Kuntze)是世界上最受歡迎的飲料之一。已知茶葉富含類黃酮(包括兒茶酚)及其衍生物，它們是多酚類化合物(由一個芳環(huán)(包含至少一個羥基)組成的化合物稱為單酚，因此多酚由多個芳環(huán)組成，并且具有兩個以上羥基)。
許多研究表明綠茶和紅茶中的多酚類具有消炎、抗腫瘤和抗心血管疾病的效果(Vinson，2000，Biofactors 13127-132；Weisburger等，2002，F(xiàn)ood & Chemical Toxicology，401145-1154)。這些生物活性被認為是來自其抗氧化活性，通過清除活性氧(ROS)和自由基來發(fā)揮作用。茶黃素被認為是紅茶中一種重要的生物活性化合物，而綠茶中的兒茶酚也具有類似的重要作用。實際上，已經有許多報道公開了茶黃素混合物的生物活性。但是盡管茶世界范圍內被每天大量地消費，涉及單獨茶組分的生物活性或其作為藥劑的用途的信息極其有限。
有許多現(xiàn)有技術資料公開了具有本發(fā)明所述化學通式的化合物(Coxon等，1970，Tetrahedron Letters，605241-5246；Leung等，2001，The Journal of Nutrition，2248-2251；Lewis等，1998，Phytochemistry，492511-2519；Lin等，1999，European Journal of Pharmacology，376379-388；Miller等，1996，F(xiàn)EBS Letters，39240-44；Obanda等，2001，F(xiàn)ood Chemistry，75395-404；Shiraki等，1994，Mutat.Res.，32329-34；Tanaka等，2001，J.Agric.Food Chem，495785-5789；Tanaka等，2002，J.Agric.Food Chem，502142-2148；Wan et.al.，1997，J.Sci.Food Agric.，74401-408；Wiseman等，1997，Critical Reviews in Food Science andNutrition，37705-718；Yang等，1997，Carcinogenesis，182361-2365)。這些現(xiàn)有技術資料公開了從茶中分離得到的多酚化合物的化學性質。其中一些化合物包含苯并環(huán)庚三烯酚酮部分。
本發(fā)明人致力于發(fā)現(xiàn)具有抗氧化和消炎活性的藥劑，及鑒別用于治療炎癥的必需制劑。本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)了具有苯并環(huán)庚三烯酚酮主要部分的本發(fā)明化合物具有消炎活性，并且本發(fā)明的化合物可以用簡單和獨特的合成方法來制備。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于清除自由基和炎癥的治療和預防藥劑，其長期服用的安全性高，并且能夠作為日常使用的食物、飲料和/或化妝品。
一方面，本發(fā)明公開了其結構中具有苯并環(huán)庚三烯酚酮部分的各種化合物，這些化合物呈現(xiàn)出潛在的消炎活性。此外，一個驚奇的發(fā)現(xiàn)是在H2O2存在下，使用過氧化酶來氧化耦合包含焦棓酚單元的分子(如表兒茶酸或表兒茶酸沒食子酸酯)和包含兒茶酚單元的分子(如表兒茶酚或表兒茶酚沒食子酸酯)可以高產率地合成基本上純的該化合物。
具體地說，本發(fā)明公開了以下通式所示的包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物以及苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物 在本發(fā)明中，術語“包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物”指一大類化合物，即本領域已知的以及本領域未知的化合物。在本發(fā)明中，術語“苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物”僅指本發(fā)明公開的和/或本領域未知的那些新化合物，本領域技術人員可以在本發(fā)明公開內容的教導下制得這些化合物。因此，苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物是本發(fā)明所預測大類化合物中的一個小類。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其可用于調節(jié)炎癥和/或用作哺乳動物用抗氧化劑，其含有一種或多種苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物和任選的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明所述包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物可以從天然產物中提取或者合成制得；所述組合物可以是一種藥物成分或者營養(yǎng)成分，或者是這些成分的組合，它們作為生物活性成分用于調節(jié)炎癥和/或用作哺乳動物的抗氧化劑。
在另一實施方式中，提供了通過服用含有包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的組合物來治療或緩解哺乳動物炎癥惡化的方法。
本發(fā)明所述包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物可以制成適于口服或非口服遞送(例如，局部給藥)的形式。在口服給藥時，服用包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的本發(fā)明化合物能夠維持足夠的血藥濃度而顯示其藥理學效果，并且每天的口服次數(shù)可以根據(jù)需求設定，尤其是鑒于使本發(fā)明化合物的毒性(若有的話)最小化時。
在另一個實施方式中，提供了一種簡單易控且能過重復合成苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物的方法。其中，所述合成方法涉及在過氧化酶和H2O2存在下使包含焦棓酚單元的分子與包含兒茶酚單元的分子反應。
附圖簡要說明

圖1顯示茶黃素混合物(TF)、EGCCa和EGCGCa對CD-1小鼠耳部中TPA-誘發(fā)炎癥的效果。
圖2顯示TF、EGCCa和EGCGCa對CD-1小鼠耳部中TPA-誘發(fā)炎癥以及白細胞介素-6(IL-6)形成的效果。
圖3顯示TF、EGCCa和EGCGCa對CD-1小鼠耳部中TPA-誘發(fā)炎癥以及白細胞三烯B4(LTB4)形成的效果。
優(yōu)選實施方式詳述根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及含有包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物(即具有苯并環(huán)庚三烯酚酮環(huán)結構的化合物)的組合物。苯并環(huán)庚三烯酚酮是許多天然產物的主要部分。例如，在茶中發(fā)現(xiàn)的茶黃素包含苯并環(huán)庚三烯酚酮核。從紅茶中獲得的四種主要茶黃素化合物是茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3′-沒食子酸酯和茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯。從紅茶中獲得的其它包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物是表茶黃酸(epitheaflaVic acid)、表茶黃酸-3′-O-沒食子酸酯、異茶黃素、茶典烷酸酯(theaflavate)A、茶典烷酸酯B、異茶黃素-3′-O-沒食子酸酯和新茶典烷酸酯。
茶黃素可以通過將其母體黃酮醇類(即，兒茶酚或二羥基化B環(huán)單元以及焦棓酚或三羥基化B環(huán)單元)酶催化氧化成其醌類，之后進行縮合來制備。例如，茶黃素是一類化合物，該化合物是(-)-表兒茶酚和(-)-表兒茶酸的氧化和縮合產物。下表1是本發(fā)明一些包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的母體黃酮醇類。
表1茶黃素類和表茶黃酸類的母體黃酮醇類
本發(fā)明包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物是從茶提取物中分離的和/或通過化學氧化具體的前體化合物(如包含焦棓酚單元的分子和包含兒茶酚單元的分子)來合成的。
用于本發(fā)明的包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的優(yōu)選化合物是第一組茶黃素類(紅茶茶黃素的一般結構)化合物1、2、3、4、5、61.茶黃素2.茶黃素-3-沒食子酸酯3.茶黃素-3′-沒食子酸酯4.茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯5.新茶黃素6.新茶黃素-3-沒食子酸酯 (EC，EGC)茶黃素R1＝R2＝H (C，EGC)新茶黃素R＝H(EC，EGCG)茶黃素-3-沒食子酸酯 (C，EGCG)新茶黃素-3-沒食子酸R1＝沒食子?；?；R2＝H 酯R＝沒食子酰基(EGC，ECG)茶黃素-3′-沒食子酸酯R1＝H；R2＝沒食子?；?ECG，EGCG)茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯R1＝R2＝沒食子酰基第二組茶典烷酸酯(苯并環(huán)庚三烯酚酮結構含有酯基)化合物7、8、97.茶典烷酸酯A8.茶典烷酸酯B9.新茶典烷酸酯(neotheaflavate)B (ECG)茶典烷酸酯A (C，ECG)(EC，ECG)茶典烷酸酯B第三組茶黃酸(苯并環(huán)庚三烯酚酮結構含有羧基)化合物10、11、12、1710.茶黃酸(CGA)11.表茶黃酸12.表茶黃酸-3-沒食子酸酯17.紅棓酚羧酸
(EC，沒食子酸)表茶黃酸R＝H (C，沒食子酸)茶黃酸(ECG，沒食子酸)表茶黃酸-3′-沒食子酸酯R＝沒食子?；?(沒食子酸)紅棓酚羧酸第四組衍生自兒茶酚的苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物13、14、15、1613.EGCCa14.EGCGCa15.GACa16.紅棓酚 (兒茶酚，EGC)EGCCaR＝H (兒茶酚，沒食子酸)GACa
(兒茶酚，EGCG)EGCGCaR＝沒食子酸 (焦棓酚)紅棓酚第五組焦棓酚和茶兒茶酸類、兒茶酚和咖啡酸的反應產物化合物18、19、20、21、22 (EC，焦棓酚)18R＝H(C，焦棓酚)20(ECG，焦棓酚)19R＝沒食子?；?(兒茶酚，焦棓酚)21(咖啡酸，焦棓酚)22第六組綠原酸或咖啡酸和兒茶酸的反應產物化合物23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33
(綠原酸，焦棓酚)23R＝H (綠原酸，EGC)25R＝H(綠原酸，沒食子酸)24R＝COOH (綠原酸，EGCG)26R＝沒食子?；?(綠原酸，ECG)27R＝H (咖啡酸，ECG)29R＝H(綠原酸，EGCG)28R＝OH (咖啡酸，EGCG)30R＝OH (咖啡酸，EGC)31R＝H(咖啡酸，沒食子酸)33(咖啡酸，EGCG)32R＝沒食子酰基第七組紅棓酚、紅棓酚羧酸和GACa或其它苯并環(huán)庚三烯酚酮分子的衍生物(OH基團中的H被乙酸根、甲基、乙基、丙基或高級烷基取代)，如化合物34、35、36 在以上所列化合物中，一些化合物已經記錄在文獻中并為本領域技術人員所知；而一些則是新的，并且不為本領域技術人員所知。例如，化合物9(第2組)或化合物14(第4組)或第5-7組所列化合物是新的化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種獨特簡單、容易控制且可重復的制備方法，該方法能高產高效地制備基本上純的包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物。例如，按照本發(fā)明所述方法以最簡單的形式已經能使茶黃素類產率達到至少與用本領域已知方法所得產率相符。例如，對于茶黃素-3-沒食子酸酯，當原料(母體黃酮醇類)各為1克時(EC和EGCG各1克)，通過本發(fā)明可以使茶黃素-3-沒食子酸酯的產率至少為0.2克。所述方法涉及在H2O2存在下，用過氧化酶催化耦合包含焦棓酚單元的分子和/或包含兒茶酚單元的分子。
例如，為了按照本發(fā)明的方法制備上述第1-4組中的化合物1-17，將母體黃酮醇類溶解于包含過氧化酶的合適緩沖液。將所述酶底物、H2O2加入所述混合物，并通過合適的溶劑來提取所述反應混合物。將所述提取物進行柱分離，并用合適的溶劑系統(tǒng)進行洗提，從而高產率地制得包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物。有關合成這些化合物的細節(jié)如本說明書所述?；谶@些實施例，本領域技術人員應知道如何選擇母體化合物(或母體黃酮醇)和合適的反應試劑以及反應條件來合成本發(fā)明所述各種包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物或苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
例如，為了制備以上所述化合物18-23，可以使用以下所述的方法第一，將合適的母體黃酮醇類溶解在丙酮與pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(1∶10，體積比，50mL)的混合物中，所述混合物包含山葵過氧化酶和1.0ml的3.13％H2O2。然后，在攪拌過程中逐滴加入用冰冷卻過的焦棓酚水溶液約45分鐘。用乙酸乙酯(50ml×3)提取反應混合物。濃縮之后，將殘留物進行Sephadex LH 20柱處理，并用丙酮-水溶劑體系(40％)來洗提。在各種情況下合適的母體化合物如下EC(針對化合物18)、ECG(針對化合物19)、兒茶酸(針對化合物20)、兒茶酚(針對化合物21)、咖啡酸(針對化合物22)和綠原酸(針對化合物23)。
類似地，例如為了制備以上所述化合物24-33，可以使用以下所述方法第一，將合適的母體黃酮醇類溶解在丙酮與pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(1∶10，體積比，50mL)的混合物中，所述混合物包含山葵過氧化酶。然后，在攪拌過程中在45分鐘內加入2.0ml 3.13％H2O2四次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取反應混合物。濃縮之后，將殘留物進行SephadexLH 20柱處理，并用丙酮-水溶劑體系(40％)來洗提。
在各情況下合適的母體化合物如下綠原酸和沒食子酸(針對化合物24)、綠原酸和EGC(針對化合物25)、綠原酸和EGCG(針對化合物26)、綠原酸和ECG(針對化合物27)、綠原酸和EGCG(針對化合物28)、咖啡酸和ECG(針對化合物29)、咖啡酸和EGCG(針對化合物30)、咖啡酸和EGC(針對化合物31)、咖啡酸和EGCG(針對化合物32)、和咖啡酸和沒食子酸(garlic acid)(針對化合物33)。
為了制備以上所述化合物34，首先要在室溫下、在吡啶中使紅棓酚與乙酸酐反應過夜。然后，在真空蒸發(fā)所述溶劑之后，將殘留物進行Sephadex LH 20柱處理，并用丙酮-水溶劑體系(40％)洗提，制得所述化合物。
為了制備以上所述化合物35，首先要用濃鹽酸酸化GACa的甲醇溶液。然后，攪拌所述混合物并加熱回流30分鐘，然后用乙酸乙酯提取。蒸發(fā)后，殘留物在室溫下、在吡啶中與乙酸酐反應過夜。在真空蒸發(fā)所述溶劑之后，將殘留物進行Sephadex LH 20柱處理，并用丙酮-水溶劑體系(40％)洗提，制得所述化合物。
為了制備以上所述化合物36，首先要用濃鹽酸酸化紅棓酚的甲醇溶液。然后，攪拌所述混合物并加熱回流30分鐘，然后用乙酸乙酯提取。在蒸發(fā)之后，殘留物在室溫下、在吡啶中與乙酸酐反應過夜。在真空蒸發(fā)所述溶劑之后，將殘留物進行Sephadex LH 20柱處理，并用丙酮-水溶劑體系(40％)洗提，制得所述化合物。
本發(fā)明一方面公開了含有可用于治療或預防疾病或其癥狀(例如，炎癥)的藥物制劑或營養(yǎng)制劑的組合物。本發(fā)明所述組合物也可以用作抗氧化劑。所述組合物中的藥物制劑或營養(yǎng)制劑包括至少一種作為生物活性劑的苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物或其衍生物。所述組合物可以配成液體、固體或粉末形式，并按需施用到哺乳動物(包括人)上。
在本文中，藥物是一種合成制備的生物活性化合物，不存在與合成的生物活性化合物結構類似且天然產生的類似物?；蛘?，藥物是一種來自自然資源(例如植物和植物產品)的生物活性化合物，但它不是食物、食物添加劑或者飲食補充物。本文中所述營養(yǎng)是指食物、食物添加劑或者飲食補充物，它們提供改善健康或體格的效果，包括預防和/或治療疾病。飲食補充物是一種用于補充一種或多種飲食(食物)成分的物質，包括礦物質、維生素、草本植物、草藥提取物、碳水化合物、脂肪、蛋白質或這些成分的組合。
除了在組合物中作為生物活性化合物的苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物或其衍生物以外，本發(fā)明組合物中所用的藥物制劑或營養(yǎng)制劑還包含用于治療或預防特定疾病的常用化合物(例如，布洛芬、阿司匹林、NSAIDA、維生素E和/或橙皮提取物或其它草藥提取物，見WO01/21137，其內容參考引用于此)。而且，本發(fā)明所用藥物和營養(yǎng)物包括包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的等價鹽，它可以獲得與所述藥物或營養(yǎng)物基本相同的效果。在本發(fā)明一個實施方式中，所述組合物可以任選地使用營養(yǎng)制劑，以提高組合物中藥物制劑用于治療或預防指定疾病的功效。類似地，所述組合物可以任選地使用藥物制劑，以提高組合物中營養(yǎng)制劑用于治療或預防指定疾病的功效?；蛘撸鏊幬锖蜖I養(yǎng)物可以混合在一起，加工成合適的制劑。
如上所述，本發(fā)明組合物包含有效量的作為生物活性劑的至少一種苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物或其衍生物。在一個實施方式中，所述組合物可以使用一種以上的苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物或其衍生物，它們可以從零有效量到完全有效量，或者到小于完全有效量的比例或量存在，前提是至少一種苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物或其衍生物的量能夠有效治療或預防炎癥。例如，組合物可以含有有效量的EC、焦棓酚(即上述化合物18)，作為包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物或其衍生物。此外，例如，所述組合物可以含有新茶典烷酸酯B和/或EGCGCa，作為其它包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物或衍生物。所述其它包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物或衍生物可以從零有效量到部分或到完全有效量存在，作為消炎化合物或抗氧化劑。而其它包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的存在不會影響所述組合物的有效性，它們可以提高(或促進)所述組合物中包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物或其衍生物的功效。
另一方面，本發(fā)明也公開了含有本文所述化合物的組合物的抗氧化活性，該化合物包含苯并環(huán)庚三烯酚酮。氧自由基的吸收能力(ORAC)檢測是一種自由基清除能力的測量方法，它是測量氧自由基吸收能力的一種簡單和靈敏的方法，其已廣泛地用于測量食物和營養(yǎng)組分的抗氧化活性。ORAC檢測由Cao等發(fā)明(1993，F(xiàn)ree Radical Biol.Med.14303-311)。在該檢測中，用β-藻紅蛋白(β-PE)作為熒光指示蛋白，用二鹽酸2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)(AAPH)作為過氧化自由基形成劑。β-PE是在紅藻中發(fā)現(xiàn)的光合蛋白。β-PE已經因其具有不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長(激發(fā)波長540nm；發(fā)射波長565nm)而被用作熒光探針。但是，使用β-PE作為熒光探針存在某些缺陷。當活性氧攻擊β-PE時，它容易喪失熒光性。而且，多酚類和蛋白質之間可能的相互作用會影響ORAC值。最近，Ou等(2001，J.Agric.Food Chem.494619-4626)報道了一種使用熒光素代替β-PE作為熒光探針的改進ORAC方法。因此，在ORAC檢測中使用熒光素作為熒光探針來檢測本發(fā)明化合物的抗氧化活性。
在本發(fā)明另一方面中，本發(fā)明涉及一種使用本文所述含有包含苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物的組合物來預防和/或治療動物炎癥的方法。對大量流行病學證據(jù)的研究表明綠茶和紅茶多酚類具有消炎活性。本發(fā)明包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的消炎活性(或抗腫瘤)可以使用12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)誘導的炎癥皮膚水腫檢測方法來進行測定。將TPA施用到皮膚上會導致在施用位點上產生鳥氨酸脫羧酶活性(提高了多胺水平和表皮增生)、炎癥、早期炎癥細胞因子(例如，IL-1β)和產生前列腺素(前列腺素E2)。所述包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物可以在將TPA局部施涂到皮膚組織(例如，小鼠耳部)之前、或之后、或同時施加。
實際上，最近已經研究了某些紅茶多酚類(包括茶黃素，茶黃素-3-沒食子酸酯和茶黃素-3′-沒食子酸酯的混合物，茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯)以及綠茶多酚(-)-表兒茶酸-3-沒食子酸酯(EGCG)對12-O-四癸?；鸩ù?13-乙酸酯(TPA)誘導水腫和鳥氨酸脫羧酶(OCD)活性的抑制效果(Liang等，2002，Nutrition and Cancer 42(2)217-223)。將這些多酚類局部施涂到試驗小鼠身上后，對TPA誘導的耳部腫瘤和皮膚表皮ODC活性產生抑制作用。
為了解釋三種茶黃素與消炎活性之間結構-活性關系，本領域存在兩種通行的假說。
(a)由于TF-3分子具有13個OH(酚)基團，TF-2具有10個OH基團，而TF-1具有7個OH基團，因此，OH基團越多，則消炎活性越強。
(b)由于TF-3包含兩個沒食子酸酯基團，TF-2包含一個沒食子酸酯基團，而TF-1不含沒食子酸酯，因此，沒食子酸酯基團越多則消炎活性越強。
但是，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)這些解釋并不正確，重要的是存在包含苯并環(huán)庚三烯酚酮單元或部分，它的存在甚至能過提供消炎性能。例如，已經發(fā)現(xiàn)OH基團的數(shù)量和消炎活性之間并沒有什么關系。沒有沒食子酸基團的許多化合物如EGCCa顯示出與茶黃素單沒食子酸酯相當?shù)幕钚浴⒁娨韵聦嵤├齎。在本發(fā)明的消炎劑中，優(yōu)選苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
用于本發(fā)明方法的組合物可以使用任意合適的裝置或途徑施用于動物(尤其是哺乳動物，優(yōu)選是人)。優(yōu)選口服，但是也可以使用其它給藥途徑，如非腸道給藥和局部給藥。本發(fā)明所述化合物可以單獨給藥，或者可以根據(jù)給藥方式與藥物可接受的載體或稀釋劑混合。例如對于口服，本發(fā)明化合物可以按照標準醫(yī)藥實踐以純的粉末形式或者以片劑、膠囊劑、錠劑、糖漿劑、酏劑、溶液劑、懸浮劑等形式給藥。
含有本發(fā)明化合物和衍生物的組合物的有效性(不論口服還是局部遞送)通過使用本領域公認的動物模型系統(tǒng)得以證實(Sala等，2003，European Journal of Pharmacology 461(1)53-61；Ukiya等，2001，Journalof Agricultural and Food Chemistry 49(7)3187-3197；Huang等，2003，ProtectiVe effect of dibenzoylmethane on chemically-and UV light-inducedskin，inflammation，sunburn lesions，and skin carcinogenesis in mice，InFood Factors in Health Promotion and Disease Prevention，F(xiàn).Shahidi，C.-T.Ho，S.Watanabe和T.Osawa.Washington，D.C，American ChemicalSociety196-207；Huang等，1988，Cancer Research.485941-5946)。涉及包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的消炎活性的詳細描述見下述實施例部分。如以下實施例所示，本發(fā)明包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的確在體內有效。
苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物或衍生物的日劑量可以按情況確定，沒有什么特殊限制。但是在大多數(shù)情況下，待治療患者所需的有效劑量為每天每千克體重0.1-300毫克。在任何情況下，本發(fā)明活性化合物以達到接受治療的患者所需治療效果，而不會出現(xiàn)任何嚴重的副作用治療有效量給藥。對于各種活性化合物，所述治療有效量隨如下因素變化而變化包括但不限于所用化合物的活性、要消除癥狀的嚴重程度、要治療患者的年齡和敏感性等，這些對于技術人員來說是顯而易見的。所述給藥量根據(jù)一定時間內各種因素的變化而調整。
實施例以下實施例進一步說明了本發(fā)明。除非另有詳述，以下實施例使用本領域技術人員熟知和慣用的標準技術來實施。所述實施例是示例性的，對本發(fā)明不產生任何限定作用。
I.合成茶黃素混合物使用酶催化氧化方法從其母體黃酮醇類合成茶黃素混合物。
特別地，在過濾之后，直接將粗制綠茶多酚(1.8g，包含80％兒茶酸的市售樣品)加入到Sephadex LH-20柱中，首先用95％乙醇洗提，除去非兒茶酸類黃酮，然后，用丙酮洗提所述柱，得到茶兒茶酸混合物(1.34g)。將所述茶兒茶酸溶解在pH5緩沖液(50mL)中，該緩沖液包含4mg山葵過氧化酶。在攪拌時，在1小時內加入3.0ml 3.13％的H2O25次。在氧化反應過程中，包含兒茶酸和粗制過氧化酶的酶催化反應溶液變成微紅色溶液。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。在濃縮之后，將殘留物(0.97g)加入到Sephadex LH-20柱中，用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(35-50％)洗提。制得350mg茶黃素混合物。
II.制備茶兒茶酸過濾之后，直接將粗制綠茶多酚(10g)加入到Sephadex LH-20柱中，用95％乙醇洗提，制得三種兒茶酸，即表兒茶酸沒食子酸酯(ECG)、表兒茶酸(EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。各兒茶酸還通過RPC-18柱進行洗提，并用甲醇-水溶劑系統(tǒng)洗提。
III.合成純的包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物使用山葵過氧化酶或多酚氧化酶，在H2O2存在下通過酶催化氧化耦合包含焦棓酚單元的分子(如表沒食子兒茶素)和包含兒茶酚單元的分子(如表兒茶酸)來合成各種包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物。
使用以下分析程序在Sigma-Aldrich硅膠TLC板(250微米厚度，2-25微米粒度)上進行薄層色譜法，并通過UV照度檢測斑點，并噴涂5％(體積)的硫酸乙醇溶液。在Varian 600設備(Varian Inc.，Palo Alto，CA)上得到1H NMR光譜。按照內部標準在具有TMS的CH3OH-d4中分析所述化合物。在配置有Digital DECPC XL 560計算機(用于數(shù)據(jù)分析)的Micromass Platform II系統(tǒng)(Micromass Co.，Beverly，MA)上記錄APCI-質譜。
A.使用過氧化酶催化合成包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物在H2O2存在下，使用山葵過氧化酶通過使包含焦棓酚單元的分子和包含兒茶酚單元的分子反應，合成以下17種包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物。
1.茶黃素將EC(1g)和EGC(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。使用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(40％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得250mg的茶黃素。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 7.97 1H s，7.85 1H s，7.34 1H s，6.021H d，J＝2.4Hz，5.99 1H d，J＝2.4Hz，5.97 1H d，J＝2.4Hz，5.96 1H d，J＝2.4Hz，5.64 1H brs，4.91 1H brs，4.45 1H d，J＝2.4Hz，4.32 1H brs，2.98 1H dd，J＝4.8，16.8Hz，2.94 1H dd，J＝4.8，16.8，2.841H brd，J＝16.8Hz，2.82 1H brd，J＝16.8Hz；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 185.1，158.1，158.0，157.6，157.5，157.3，156.6，155.1，150.9，146.1，134.4，131.2，129.0，126.6，123.7，121.9，118.3，100.3，99.8，96.8，96.1，96.0，81.2，77.1，66.7，65.6，30.0，29.4ppm。
2.茶黃素-3-沒食子酸酯將EC(1g)和EGCG(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。使用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得220mg的茶黃素-3-沒食子酸酯。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 7.91 1H s，7.80 1H s，7.38 1H s，6.802H s，6.02 1H d，J＝1.8Hz，6.00 1H d，J＝2.4Hz，5.99 2H s，5.78 1H brs，5.55 1H brs，5.11 1H s，4.16brd，J＝2.4Hz，3.07dd，J＝4.8，16.8Hz，2.99dd，J＝4.2，16.8，2.91brd，J＝16.8Hz，2.83brd，J＝16.8Hz；13CNMR(CD3OD，150MHz)δC 185.6，167.4，158.0，157.9，157.8，157.3，156.4，156.3，155.4，151.2，146.4，146.3，139.9，133.5，131.3，128.7，125.7，123.8，121.9，121.0，117.0，110.1，100.2，99.3，96.9，96.8，96.2，95.8，79.8，77.0，69.0，65.7，30.1，27.1ppm。
3.茶黃素-3′-沒食子酸酯將ECG(1g)和EGC(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得110mg的茶黃素-3′-沒食子酸酯。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 7.88 1H s，7.87 1H s，7.37 1H s，6.842H s，6.06d，J＝2.4Hz，6.00 1H d，J＝2.4Hz，5.98 1H d，J＝2.4Hz，5.97d，J＝2.4Hz，5.87brs，5.81 1H brd J＝3.0Hz，4.94 1H brs，4.33 1H brs，3.09 1H dd，J＝4.8，17.4Hz，2.96 1H dd，J＝4.8，16.8，2.88 1H brd，J＝17.4Hz，2.86dd，J＝2.4，16.8Hz；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 185.6，167.2，158.0，157.9，157.8，157.7，157.0，156.6，156.0，155.5，151.1，146.2，139.7，134.8，130.3，128.8，125.9，123.0，121.9，120.9，118.3，99.8，99.6，96.8，96.7，95.8，95.7，81.2，75.8，68.3，66.5，29.3，27.2ppm。
4.茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯將ECG(1g)和EGCG(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得100mg的茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 7.79 1H s，7.76 1H s，7.47 1H s，6.882H s，6.80 2H s，6.07 1H d，J＝2.4Hz，6.03 2H d，J＝2.4Hz，6.00 1H d，J＝2.4Hz，5.86 1H brs，5.76 1H m，5.67 1H m，5.21 1H s，3.17 1H dd，J＝4.8，16.8Hz，3.09 1H dd，J＝4.8，17.4，2.912H m。
5.新茶黃素將C(兒茶酸，0.8g)和EGC(0.8g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得120mg的新茶黃素。
1H NMR((CD3)2CO，600MHz)δH 8.26 1H s，7.46 1H s，7.63 1H s，6.06d，J＝2.4Hz，6.03d，J＝2.4Hz，5.96d，J＝2.4Hz，5.95d，J＝2.4Hz，5.62d，J＝7.8Hz，5.01 1H s，4.39 1H m，4.15 1H m，2.97dd，J＝5.4，15.6Hz，2.91dd，J＝4.2，16.8，2.84dd，J＝1.2，16.8Hz，2.66dd，J＝9.6，15.6Hz；13C NMR((CD3)2CO，150MHz)δC 184.8，157.6，157.5，157.4，157.0，156.7，156.6，154.4，150.5，146.2，134.8，132.2，130.8，128.6，122.3，121.6，119.2，100.7，99.2，96.4，96.3，95.6，95.4，81.5，79.1，69.5，66.6，30.0，29.3ppm。
6.新茶黃素3-沒食子酸酯將C(1g)和EGCG(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得170mg的新茶黃素3-沒食子酸酯。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 8.04 1H s，7.59 1H s，7.49 1H s，6.922H s，6.01 2H d，J＝2.4Hz，5.98 1H d，J＝2.4Hz，5.97 1H d，J＝2.4Hz，5.67 1H brs，5.56 1H brd，J＝6.6Hz，5.11 1H s，4.22 1H m，3.03 1H dd，J＝4.8，17.4Hz，2.92 1H brd，J＝16.8Hz，2.83 1H dd，J＝4.8，16.8，2.66dd，J＝8.4，16.8；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 185.8，167.4，158.0，157.9，157.8，156.7，156.5，155.3，151.6，146.9，146.2，139.9，134.0，132.0，130.4，127.7，122.3，121.0，117.6，110.2，100.6，99.2，96.9，96.7，95.9，95.6，80.5，77.1，69.9，68.8，28.5，27.0ppm。
7.茶典烷酸酯A將ECG(0.85g)溶解在pH5緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)中，該緩沖液含有2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在30分鐘內加入1.5ml3.13％的H2O23次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得60mg茶典烷酸酯A，并回收600mg的ECG。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 8.33 1H s，7.81 1H s，7.65 1H s，6.871H dd，J＝1.8，7.8Hz，6.85 1H d，J＝1.8Hz，6.80 2H，s，6.53 1H d，J＝7.8Hz，6.15 1H d，J＝2.4Hz，6.11 1H d，J＝2.4，6.09 1H d，J＝2.4Hz，5.981H，d，J＝2.4Hz，5.69 1H brs，5.64 1H brs，5.52 1H，brd，J＝3.6Hz，5.11 1H s，3.32dd，J＝4.8，18.0Hz，3.10dd，J＝4.8，18.0Hz，3.05dd，J＝1.8，16.8Hz，2.91d，J＝16.8；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 186.8，167.8，167.3，158.2，158.1，158.0，157.9，157.2，157.1，155.3，149.5，146.4，146.3，146.0，140.0，133.5，131.2，126.6，124.8，122.9，122.6，121.0，119.0，116.4，115.8，114.2，110.2，100.0，99.4，97.3，97.2，96.5，96.4，78.0，75.6，72.1，68.9，27.3，26.7ppm。
8.茶典烷酸酯B將EC(0.5g)和ECG(0.5g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得200mg的茶典烷酸酯B。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 8.26 1H s，7.88 1H s，7.59 1H s，6.871H dd，J＝1.8，7.8Hz，6.86 1H d，J＝1.8Hz，6.55 1H d，J＝7.8Hz，6.161H d，J＝2.4Hz，6.08 1H d，J＝2.4，6.05 1H d，J＝2.4Hz，5.98 1H，d，J＝2.4Hz，5.66 1H brs，5.46 1H brs，5.08 1H s，4.14 1H brs，3.34dd，J＝4.8，16.8Hz，3.21dd，J＝4.8，16.8Hz，3.17dd，J＝3.6，16.2Hz，2.88d，J＝16.8；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 186.4，167.8，158.3，158.0，157.9，157.7，157.4，157.1，154.9，151.8，149.5，146.3，146.0，134.8，132.3，131.3，126.5，124.4，123.7，122.4，119.2，116.3，115.8，114.4，100.7，99.5，97.2，97.1，96.6，96.5，78.1，77.0，72.1，66.7，30.0，26.7ppm。
9.新茶典烷酸酯B將C(0.5g)和ECG(0.5g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。在濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得90mg的新茶典烷酸酯B。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 8.77 1H s，7.64 1H s，7.61 1H s，6.881H d，J＝1.8Hz，6.82 1H dd，J＝1.8，8.4Hz，6.64 1H d，J＝8.4Hz，6.031H d，J＝2.4Hz，5.98 1H d，J＝2.4，5.96 2H brs，5.58 1H brs，5.38 1H brd，J＝7.2Hz，5.04 1H s，4.07 1H m，3.03dd，J＝4.8，16.8Hz，2.95brd，J＝16.8，2.91dd，J＝4.8，16.8Hz，2.66dd，J＝3.6，16.2Hz；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 186.6，167.7，157.9，157.7，157.3，157.0，156.8，154.7，152.3，149.8，146.0，145.8，135.0，134.3，131.2，128.8，124.0，122.5，119.0，116.2，115.8，114.4，101.2，99.2，97.0，96.8，96.1，95.9，79.7，78.0，72.0，69.6，29.6，26.6ppm。
10.茶黃酸將C(0.5g)和沒食子酸(0.5g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得60mg茶黃酸和20mg紅棓酚羧酸。
1HNMR(CD3OD，600MHz)δH 9.00 1H s，7.82 1H s，7.66 1H s，5.981H d，J＝2.4Hz，5.91 1H d，J＝2.4，5.43 1H brd，J＝7.2Hz，4.21 1H，m，2.94dd，J＝4.8，16.2Hz，2.64dd，J＝4.8，16.2Hz；13C NMR(CD3OD，150MHz)8c 186.6，170.3，157.9，157.6，156.6，154.7，152.2，149.3，139.5，134.4，132.2，128.9，125.0，122.7，116.5，100.7，96.8，96.1，80.0，69.1，29.3ppm。
11.表茶黃酸將表兒茶酸(EC，0.5g)和沒食子酸(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得70mg表茶黃酸和25mg紅棓酚羧酸。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 8.60 1H s，7.95 1H s，7.80 1H s，6.091H s，6.00 1H s，5.88 1H s，5.77 1H m，3.17 1H dd，J＝4.8，17.4Hz，2.94 1H d，J＝17.4Hz；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 186.5，170.1，158.2，157.7，157.2，155.0，151.6，149.2，134.2，132.2，126.7，125.2，123.4，122.6，116.2，99.2，96.8，96.1，77.0，66.4，30.0ppm。
12.表茶黃酸-3-沒食子酸酯將ECG(0.5g)和沒食子酸(1g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得20mg表茶黃酸-3-沒食子酸酯、40g茶典烷酸酯A和10mg紅棓酚羧酸。
1H NMR(CD3OD，600MHz)δH 8.64 1H s，7.84 1H s，7.83 1H s，6.832H s，6.02 1H d，J＝2.4Hz，5.98 1H d，J＝2.4，5.61 1H s，4.37 1H，m，3.03 1H dd，J＝4.8，16.8Hz，2.87d，J＝16.8Hz；13C NMR(CD3OD，150MHz)δC 186.5，170.1，167.1，158.0，156.9，155.1，151.7，148.9，146.2，139.8，132.8，131.6，126.8，122.6，122.5，120.8，116.3，110.0，99.3，96.9，96.0，75.7，68.6，27.2ppm。
13.EGCCa將EGC(1g)和兒茶酚(1.5g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得226mg EGCCa。
1H NMR(C5D5N，600MHz)δH 8.15 1H s，7.99 1H s，7.66 1H d，J＝8.4Hz，7.41 1H d，J＝8.4Hz，6.75 1H brs，6.74 1H brs，5.23 1H s，4.76 1H，s，3.67d，J＝16.2Hz，3.44dd，J＝3.6，16.2Hz；13C NMR(C5D5N，150MHz)δC 184.9，158.8，157.2，151.8，151.4，147.8，134.6，134.5，132.0，126.4，123.3，121.2，119.9，119.8，99.9，97.1，96.0，81.8，66.6，30.3ppm。
14.EGCGCa將EGCG(1g)和兒茶酚(1.5g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得230mg EGCGCa(表沒食子兒茶素兒茶酚沒食子酸酯(epigallo-catechinocatechol gallate))。
1H NMR(C5D5N，600MHz)δH 8.01 1H s，7.97 1H s，7.54 1H d，J＝8.4Hz，7.29 1H d，J＝8.4Hz，6.74 1H d，J＝2.4Hz，6.70 1H d，J＝2.4，6.181H s，5.38 1H，s，3.71d，J＝17.4Hz，3.51dd，J＝3.0，17.4Hz；13C NMR(C5D5N，150MHz)δc 185.0，166.8，159.0，158.8，156.9，155.4，151.9，148.1，147.7，141.4，134.5，133.0，131.6，126.4，123.2，121.2，120.8，118.8，110.4，98.9，97.5，96.0，80.1，69.1，27.5ppm。
15.GACa將沒食子酸(2g)和兒茶酚(2g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含4mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得400mg GACa。
1H NMR(C5D5N，600MHz)δH 8.08 1H brs，7.68 1H dd，J＝1.2，8.4Hz，7.56 1H d，J＝8.4Hz，7.19 1H s；13C NMR(C5D5N，150MHz)δC 186.0，169.6，154.8，152.6，150.5，140.0，130.2，128.8，125.6，123.0，121.6，117.9ppm。
16.紅棓酚將焦棓酚(1g)和兒茶酚(1.5g)溶解在丙酮-pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液(1∶10，體積/體積，50mL)的混合物中，所述混合物包含2mg的山葵過氧化酶。在攪拌時，在45分鐘內加入2.0ml 3.13％的H2O24次。用乙酸乙酯(50ml×3)提取所述反應混合物。濃縮之后，將殘留物用丙酮-水溶劑系統(tǒng)(45％)在Sephadex LH-20柱中進行洗提。制得300mg紅棓酚。
1H NMR(C5D5N，600MHz)δH 7.35 1H d，J＝11.4Hz，7.29 1H s，7.241H d，J＝9.6Hz，6.66 1H dd，J＝9.6，11.4Hz；13C NMR(C5D5N，150MHz)δc 183.4，156.3，154.0，153.3，137.1，135.1，134.4，123.8，116.8，116.2，112.0ppm。
17.紅棓酚羧酸1HNMR(CD3OD，600MHz)δH 8.17 1H s，7.66 1H s，6.94 1H s；13CNMR(CD3OD，150MHz)δC 184.0，170.0，156.6，154.4，153.2，152.2，137.8，134.2，125.9，123.0，116.3，114.5ppm。
在以上17種化合物中，新茶典烷酸酯B(化合物9)和EGCGCa(化合物14)是本領域未知的新化合物。其它化合物是本領域已知的，即化合物1-8、10-12在紅茶中已經得到鑒定，化合物13和15-17已經通過化學氧化方法制得，但是已有技術已知的化合物可以通過過氧化酶催化氧化反應以外的其它方法合成。
因此，17種包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物通過過氧化酶/H2O2系統(tǒng)來合成。
B.通過多酚氧化酶(PPO)催化合成包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物從香蕉(從當?shù)厥袌鲑彽?中分離粗制的多酚氧化酶(PPO)。簡而言之，用800mL冷的100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0，4℃)均化新鮮的香蕉(400g)。將該均勻溶液在4℃下離心分離20分鐘(10,000g)。將透明的上清液小心收集到燒瓶中，并將燒瓶置于冰浴中。然后，在攪拌條件下將相同體積的冷丙酮(置于冷卻器中過夜)緩慢加入到所述收集的溶液中。在4℃下通過離心分離(10,000g，20分鐘)來收集所得蛋白質沉積物。在離心分離之后，將上清液丟棄，并用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)小心洗滌所得顆粒物三次。然后，將所述顆粒物溶解在相同的緩沖液中，并凍干。
通過比色法測量酶的活性。所述酶反應溶液由2mL的0.1M兒茶酚溶液和1mL的磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)和20μL酶溶液組成。在420nm下根據(jù)吸收光度的增大來測量酶活性5分鐘(25℃)。PPO活性定義為每分鐘吸光度增大0.001的酶量。
對于PPO催化氧化反應，如以下所述合成了9種化合物。在該段落中所述化合物編號對應實施例中第三(A)部分的化合物編號。
1.茶黃素的酶催化氧化和分離將EC(1g，3.5mmol)和EGC(1g，3.3mmol)與2g的粗制PPO酶溶解在200mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(50mM，pH5.0)中。在攪拌條件下，所述酶催化氧化反應在室溫下進行6小時。然后，用相同體積的乙酸乙酯分餾所述反應溶液三次。然后，將有機層在減壓條件下濃縮。所得殘留物加入到Sephadex LH-20色譜柱中，用乙醇到20％丙酮的乙醇溶液的梯度進行洗提。在收集的14個餾分(各自為90mL)中，將8-10號餾分混合，并在減壓條件下濃縮。所得殘留物在RP-18硅膠柱中進一步純化，并用40-50％的甲醇水溶液梯度進行洗提。在洗提過程中，收集38個餾分(分別約13mL)。其中，將10-17號餾分混合，并在減壓條件下濃縮，進行凍干。它形成深-微紅色的化合物1(280mg)。
按照相同的酶反應和分餾步驟，由EC和EGCG反應制得化合物2。EGC和ECG、ECG和EGCG的酶催化氧化反應分別制得化合物3和化合物4。
2.茶兒茶酸(EC和ECG)和沒食子酸的酶催化反應將EC(1.160g，4.0mmol)和沒食子酸(0.520g，4.0mmol)溶解在100mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(50mM，pH5.0)中，并在攪拌過程中將1.2g粗制PPO酶加入所述反應溶液中。在室溫下進行酶催化氧化反應3.5小時。在反應之后，用相同體積的乙酸乙酯提取所述溶液三次。然后，所述乙酸乙酯提取物在真空條件下濃縮。所得殘留物加入到Sephadex LH-20色譜柱中，用乙醇到20％丙酮的乙醇溶液的梯度進行洗提。在收集的168個餾分(分別為15mL)中，將47-52號餾分混合，并在減壓條件下濃縮。所得殘留物加入到RP-18硅膠柱中，并用20-50％的甲醇水溶液梯度進行洗提，制得化合物5。然后將分離自Sephadex LH-20的72-85號餾分混合，加入到RP-18硅膠柱中，用10-50％的甲醇水溶液梯度進行洗提，制得化合物6。
將ECG(0.66g)和沒食子酸(0.26g)溶解在50mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(50mM，pH5.0)中，并將1.2g粗制的PPO酶溶解在反應溶液中。在室溫下進行酶催化氧化反應5小時。然后，用乙酸乙酯提取所述反應溶液三次。然后，所述有機層在減壓條件下濃縮。所得殘留物加入到SephadexLH-20色譜柱中，用乙醇到20％丙酮的乙醇溶液的梯度進行洗提。在收集的128個餾分(各自為15mL)中，將18-20號餾分混合，并在減壓條件下濃縮。所得殘留物在RP-18硅膠柱中進一步純化，并用20-50％的甲醇水溶液梯度進行洗提，制得化合物7。將37-48號餾分混合，并在RP-18硅膠柱中進一步純化，用10-30％的甲醇水溶液梯度進行洗提，制得化合物8。將90-108號餾分混合，在RP-18硅膠柱中進一步純化，用40-50％的甲醇水溶液梯度進行洗提，制得化合物9。
IV.氧自由基吸收能力(ORAC)檢測進行氧自由基吸收能力(ORAC)檢測，以測定單獨的茶黃素和表茶黃酸的抗氧化活性。在75mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)中制備所有試劑。所述反應混合物包括3mL熒光溶液(8.16×10-5mM)、500μL AAPH(153mM)和500μL樣品溶液或空白樣。一旦加入了AAPH，使用Hitachi F-3010型熒光色譜計(發(fā)射波長515nm，激發(fā)波長493nm)每隔1分鐘測量熒光量。以試驗化合物存在下熒光素的熒光延遲曲線下的面積為基準，計算所述ORAC值，將該值與使用標準Trolox和空白樣形成的面積進行比較。通過Cao等(Cao等，1993)列出的方程式計算曲線下的凈面積和ORAC值。
用以下方程式計算相對ORAC值(Trolox等價值)相對ORAC值＝[(AUC樣品-AUC空白樣)/(AUCTrolox-AUC空白樣)]×(Trolox的摩爾濃度/樣品的摩爾濃度)
根據(jù)以下方程式計算曲線下面積(AUC)AUC＝1+f1/f0+f2/f0+f3/f0+f4/f0……+f119/f0+f120/f0f0是在0分鐘時起始熒光讀數(shù)，fi是在時間點i處熒光讀數(shù)。
抑制曲線代表了在各種濃度(0-4μM)下Trolox的過氧化氫自由基吸收能力，將該曲線用作標準線(數(shù)據(jù)未顯示)。抑制曲線的凈面積隨Trolox濃度的增量成比例增大。檢查茶黃素和EGCG的抑制曲線(數(shù)據(jù)未顯示)。在相同的測試濃度(0.5μM)下，所述ORAC值(表2)顯示茶黃素的抗氧化活性比EGCG高。也測定表茶黃酸和EGCG的抑制曲線(數(shù)據(jù)未顯示)。表茶黃酸的ORAC值顯示這些化合物的抗氧化活性比EGCG稍高。
表2兒茶酸、表茶黃酸和EGCG的相對ORAC值
數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，an＝3V.包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的消炎活性在皮膚炎癥模型中進行所述TPA(12-O-四癸酰基佛波醇佛波醇-13-乙酸酯)誘導耳水腫檢測，以證實包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物的消炎活性。在局部施用20微升丙酮或溶解在20微升丙酮中的TPA(1nmol)之前20分鐘時，用20微升的丙酮和溶解在20微升丙酮中的包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物局部處理雌性CD-1小鼠(年齡24-25天)。然后，5小時后，使頸部錯位來殺死小鼠，取下耳沖孔片(punch)(直徑6mm)，并稱重。
所得結果顯示于下表3中。所述各種包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物顯示出強抑制效果。
表3茶黃素型化合物對小鼠耳部的TPA誘導水腫的抑制效果
這些結果是最近Liang等(2002，Nutrition and Cancer 42(2)217-223)報道的出乎意料的假定情況。Liang比較了紅茶中三種茶黃素的消炎活性。他們研究的三種化合物是TF-1(即，茶黃素，以上實施例中的化合物1)、TF-2(即，茶黃素3-沒食子酸酯和茶黃素3′-沒食子酸酯的混合物、以上實施例中的化合物2和化合物3的混合物)、TF-3(即，茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯，以上實施例中化合物4)。Liang中所用的消炎測驗方法與本發(fā)明所用方法相同。從Liang等的報道來看(見Liang等的公報表1)，TF-3的消炎活性明顯強于TF-2，而TF-2應強于TF-1。
也在皮膚炎癥模型中進行TPA誘導耳水腫檢測，證明包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物對長期炎癥(刺激性慢性炎癥)的效果。從Charles RiverBreeding Laboratories(Kingston，NY)購得雌性CD-1小鼠(年齡3-4周)。如上所述制備茶黃素相關化合物。所述茶黃素混合物基本上由茶黃素(約33重量％)、茶黃素-3-沒食子酸酯(約17重量％)、茶黃素-3′-沒食子酸酯(約17重量％)和茶黃素-3，3′-二沒食子酸酯(約33重量％)組成。丙酮、12-O-四癸酰基佛波醇佛波醇-13-乙酸酯和其它化學試劑可以從SigmaChemicals(St.Louis，MO)購得。使用每毫升中包含0.4M NaCl、0.05％的Tween-20、0.5％牛血清蛋白、0.1mM苯基甲基磺酰氟、0.1mM苯甲乙氧銨、10mM EDTA和20KI抑肽酶的磷酸鹽緩沖液鹽水均化小鼠耳部組織樣品。
將小鼠分成6組，每組6-7只動物。將所有試驗化合物溶解在丙酮中。丙酮起到溶劑(陰性)對照樣的作用，它不會引起炎癥。也保持一組TPA對照組，以表示小鼠耳部中誘發(fā)的最大炎癥。
在將丙酮(溶劑對照樣)或0.4nmol TPA局部施用到小鼠耳部上之前20分鐘，用20微升的丙酮(溶劑對照組)、TPA(TPA對照組)或溶解在20微升丙酮中的試驗化合物處理CD-1小鼠的兩只耳朵。這種處理每天進行兩次，持續(xù)3.5天(總共7次)。在處理周期結束時，使頸部錯位來殺死小鼠，將耳部沖孔。分別將耳沖孔片稱重，測定小鼠耳部中炎癥水平。
將各組的耳沖孔片組合，并用磷酸鹽緩沖鹽水均化。將所得均化物離心分離，施用酶聯(lián)免疫吸收劑檢測法(ELISA)檢測上清液，測出各種炎癥生物標記化合物的濃度。
通過測量各沖孔片的重量、炎癥的重要生物標記化合物如白細胞三烯B4(LTB4)和白細胞介素(IL-6)來量化炎癥的程度。如各耳沖孔片重量(圖1)以及炎癥生物標記化合物，IL-6(圖2)和LTB4(圖3)所示，所述茶黃素混合物(EGCCa和RGCGCa)抑制了耳部中的炎癥。所述數(shù)據(jù)針對TPA誘發(fā)小鼠耳部水腫(TPA處理)進行了歸一化。
在本說明書中提到的所有公開、專利和專利申請說明了本發(fā)明相關領域技術人員的水平。所有公開、專利和專利申請的內容均參考引用于此，如同單獨參考引用各公開、專利或專利申請一樣。
雖然為了便于理解，通過說明例和實施例詳細描述了以上發(fā)明，明顯地，各種改變和改進均涵蓋在附帶權利要求書的范圍之內。
權利要求
1.通式所示的苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物 式中，R1是氫原子、羥基、烷氧基、烷基、芳基，或者是選自吲哚基、苯基、芐基、吡啶基、吡咯基和苯硫基的雜環(huán)基團；R2是氫原子、羥基、烷氧基、烷基、芳基，或者是選自吲哚基、苯基、芐基、吡啶基、吡咯基和苯硫基的雜環(huán)基團；和R3是氫原子、羥基、烷氧基、烷基、芳基，或者是選自吲哚基、苯基、芐基、吡啶基、吡咯基和苯硫基的雜環(huán)基團。
2.如權利要求1所述的苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物，其特征在于，所述衍生物是新茶典烷酸酯B或其鹽或酯。
3.如權利要求1所述的苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物，其特征在于，所述衍生物是EGCGCa(表沒食子兒茶素兒茶酚沒食子酸酯)或其鹽或酯。
4.一種包含藥物或營養(yǎng)物或其組合的組合物，其特征在于，所述藥物或營養(yǎng)物是一種有效的消炎劑或抗氧化劑，其中，所述藥物、營養(yǎng)物或其組合包含有效量的作為活性成分的權利要求1所述的苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述藥物或營養(yǎng)物包含新茶典烷酸酯B或EGCGCa，或它們的鹽或酯，前提是所述苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物不是新茶典烷酸酯B或EGCGCa。
6.如權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述藥物或營養(yǎng)物包含新茶典烷酸酯B或其鹽或酯。
7.如權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述藥物或營養(yǎng)物包含EGCGCa或其鹽或酯。
8.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述新茶典烷酸酯B或EGCGCa作為消炎劑或抗氧化劑以完全有效量存在。
9.一種消炎劑，其包含有效量的作為活性成分的權利要求1所述的苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物或其藥物可接受的鹽。
10.一種治療炎癥的方法，所述方法包括給需要的受試者施用包含治療炎癥有效量的純苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物的組合物。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所施用組合物中苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物的劑量約為每天每千克體重0.5-1000毫克。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所施用組合物中苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物的劑量約為每天每千克體重1-500毫克。
13.如權利要求10所述的方法，其特征在于，局部施用所述苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，口服所述苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
15.如權利要求10所述的方法，其特征在于，非腸道施用所述苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
16.一種治療或緩解炎癥惡化的方法，該方法包括給需要的受試者施用包含苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物和載體的組合物，所述載體選自藥物可接受的載體、獸醫(yī)學可接受的載體、飲食補充載體和食物，其中，所述受試者是人或獸類動物。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述載體是藥物可接受的載體。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述受試者是人。
19.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述載體是食物。
20.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述組合物是飲食補充物。
21.一種用于中和患者的自由基的方法，該方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的包含藥物或營養(yǎng)物的組合物，所述藥物或營養(yǎng)物包含苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物或者至少一種選自茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3，3′-沒食子酸酯、表茶黃酸、表茶黃素沒食子酸酯和EGCG的化合物，其中，所述化合物是純的，濃度至少約為0.5％。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物的濃度至少約為0.5％。
23.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含尚未被選擇使用的第二種苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物。
24.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述第二種苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物是新茶典烷酸酯B或EGCGCa，或它們的鹽或酯。
25.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述組合物是藥物。
26.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述組合物是營養(yǎng)物。
27.一種合成苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物的方法，包括在過氧化酶和H2O2存在下，將包含焦棓酚單元的分子與包含兒茶酚單元的分子反應。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是表茶黃素(EC)和表棓茶黃素(EGC)。
29.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是表茶黃素(EC)和表棓茶黃素沒食子酸酯(EGCG)。
30.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是表茶黃素沒食子酸酯(ECG)和表棓茶黃素(EGC)。
31.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是表茶黃素沒食子酸酯(ECG)和表棓茶黃素沒食子酸酯(EGCG)。
32.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是茶黃素(C)和表棓茶黃素(EGC)。
33.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是茶黃素(C)和表棓茶黃素沒食子酸酯(EGCG)。
34.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是表茶黃素沒食子酸酯(ECG)。
35.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是EC和ECG。
36.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是C和ECG。
37.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是C和沒食子酸。
38.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是EC和沒食子酸。
39.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是ECG和沒食子酸。
40.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是EGC和兒茶酚。
41.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是EGCG和兒茶酚。
42.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是沒食子酸和兒茶酚。
43.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是焦棓酚和兒茶酚。
44.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述反應的分子是焦棓酚。
全文摘要
本發(fā)明涉及以下通式所示的新型苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物，其包括新茶典烷酸酯B和EGCGCa。本發(fā)明所述苯并環(huán)庚三烯酚酮衍生物是有效的抗氧化劑和消炎劑。本發(fā)明也提供一種高產率合成苯并環(huán)庚三烯酚酮化合物的新方法以及使用包含苯并環(huán)庚三烯酚酮的化合物治療炎癥的方法。
文檔編號C07D311/78GK1852881SQ200480027064
公開日2006年10月25日 申請日期2004年8月30日 優(yōu)先權日2003年8月29日
發(fā)明者何志騰, 吉薩·哥亥, 桑生民, 胡智友, 黃謀團, 羅伯特·T·羅森, 斯萊維克·杜什科夫 申請人:維爾金有限公司, 新澤西州立拉特格斯大學