專利名稱：用于疾病免疫干預(yù)的合成多糖抗原的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更特別地涉及免疫調(diào)節(jié)。本發(fā)明通過(guò)采用具有免疫調(diào)節(jié)特性的合成多糖抗原(SPAs)為疾病的免疫干預(yù)提供新的化合物和方法。這些SPAs可用于人類以及其他動(dòng)物，以提供炎性病變的防御保護(hù)和/或治療，或誘導(dǎo)可控的炎性應(yīng)答，以治療其中免疫應(yīng)答具有治療益處的疾病狀態(tài)或病情，例如抗病毒治療、抗癌治療或作為疫苗佐劑相關(guān)領(lǐng)域的說(shuō)明微生物抗原是已知的最強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)劑。其中最常見(jiàn)的例子有來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)、以及來(lái)自革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)菌細(xì)胞壁糖肽、也稱為胞壁質(zhì)或肽聚糖(PG)。細(xì)菌的PG被充分確認(rèn)為有效的炎性劑(Wahl等人(1986)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)165884)。
許多微生物抗原，包括PG在內(nèi)，據(jù)認(rèn)為是通過(guò)活化稱之為Toll樣受體(TLRs)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面受體之一來(lái)發(fā)揮它們的促炎效果的。TLR的活化觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)路徑，導(dǎo)致誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，其依次誘導(dǎo)編碼炎性調(diào)節(jié)劑(趨化因子和某些細(xì)胞因子)的基因表達(dá)。PG自身?yè)?jù)認(rèn)為是通過(guò)TLR2活化的(Takeuchi等人(1999)《免疫》(Immunity)11443)。
近來(lái)，cDNA陣列技術(shù)為我們理解PG誘發(fā)的促炎調(diào)節(jié)劑提供了甚至更高級(jí)的解決方案(Wang等人，(2000)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)27520260)。被最高度活化的基因是表達(dá)趨化因子(IL-8和MIP-1β)的那些基因，而僅居其次被最高活化的基因是表達(dá)細(xì)胞因子(TNF-α、IL1和IL6)的那些基因。不考慮機(jī)制細(xì)節(jié)，細(xì)菌PG對(duì)宿主的下游效應(yīng)是強(qiáng)有效的炎性應(yīng)答。事實(shí)上，PG已被長(zhǎng)期用來(lái)誘發(fā)動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)炎(Cromartie等人(1977)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1461585)。從化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中部分純化的PG目前可以商購(gòu)獲得(LeeLaboratories，亞特蘭大，GA)而用于此目的。
低分子量的PG片斷，通稱為胞壁肽(muropeptides)，也在動(dòng)物中表現(xiàn)出炎性效應(yīng)，并且這些效應(yīng)取決于胞壁肽結(jié)構(gòu)(Tuomanen等人，(1993)《臨床研究雜志》(J.Clin Invest.)92297)。即使是最小的稱之為胞壁酰二肽(MDP)以及葡萄糖胺基胞壁酰二肽(GMDP)的PG片斷，還有它們的衍生物，在動(dòng)物中都表現(xiàn)出炎性效應(yīng)(Kohashi等人，(1980)《傳染性免疫》(Infect.Immun)2970)。盡管高分子量的PG通過(guò)位于細(xì)胞表面的TLR2誘導(dǎo)促炎應(yīng)答，但低分子量的PG片斷通過(guò)稱之為Nod1和Nod2的胞內(nèi)受體誘導(dǎo)它們的促炎活性(Girardin等人，《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，于2003年7月18日網(wǎng)上公開(kāi)，原稿為M307198200)。
Kasper和Tzianabos證實(shí)，在炎癥模型如腹內(nèi)膿腫形成、腹內(nèi)敗血以及術(shù)后粘連模型中測(cè)試時(shí)，純化自細(xì)菌細(xì)胞表面的某些多糖表現(xiàn)出體內(nèi)保護(hù)效應(yīng)(美國(guó)專利5,679,654和5,700,787；PCT國(guó)際公開(kāi)WO 96/07427、WO 00/59515和WO 02/45708)。這些研究者證實(shí)當(dāng)從整個(gè)莢膜(capsule)純化時(shí)，源于脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的某些多肽具有獨(dú)特的特征，這使得它們有別于許多的多糖抗原。前述分子在本質(zhì)上是高分子量、螺旋狀和兩性離子性的(Wang等人，(2000)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9713478-13481，以及其中的參考文獻(xiàn)5-9)。大多數(shù)細(xì)菌多糖是中性或帶負(fù)電荷的，并被認(rèn)為是T細(xì)胞依賴性抗原(Abbas等人，(2000)《細(xì)胞和分子免疫生物學(xué)》(Cellularand Molecular Immunobiology)W.B.Saunders，費(fèi)城)。Kasper和Tzianabos提出這些多糖的兩性離子性質(zhì)在它們與CD4+T細(xì)胞的相互作用中起作用(Tzianabos等人，(1993)《科學(xué)》262416-419；Tzianabos等(2001)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展》(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)989365-9370)。這個(gè)小組近來(lái)更多的工作提示這些分子中有些可以介由它們的兩性離子特征而與抗原提呈細(xì)胞(APCs)相互作用，并且，這些多糖抗原對(duì)CD4+T細(xì)胞的刺激有賴于攜帶MHC II的APCs(Kalka-Moll等人，(2002)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1696149-6153)。有待于準(zhǔn)確測(cè)定的是兩性離子多糖與APCs之間的這些相互作用可以怎樣刺激CD4+T細(xì)胞。這些研究者證明兩性離子多糖在體外活化CD4+T細(xì)胞，這由增殖刺激以及細(xì)胞因子IL2、INFγ和IL10的產(chǎn)生得到證明，并且這種保護(hù)在體內(nèi)可通過(guò)多糖刺激過(guò)的T細(xì)胞而過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移(PCT國(guó)際公開(kāi)WO00/59515；Kalka-Moll等人，(2000)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)164719-724；Tzianabos等人，(2000)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2756733-6738)。在這個(gè)小組早期的研究中，CD4+細(xì)胞的刺激并不一定依賴于APCs的存在，并且這些分子對(duì)來(lái)源于大鼠和小鼠物種的T細(xì)胞的促有絲分裂特性是不同的大鼠脾細(xì)胞響應(yīng)CP1處理而增殖，而小鼠脾細(xì)胞并不這樣(Tzianabos等人，(1995)《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)962727-2731；Brubaker等人，(1999)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1622235-2242)。
然而，總的說(shuō)來(lái)，他們的觀察令這個(gè)小組假設(shè)多糖對(duì)CD4+T細(xì)胞的活化導(dǎo)致產(chǎn)生防御炎性應(yīng)答的細(xì)胞因子如IL2或IL10(PCT國(guó)際公布WO00/59515；Kalka-Moll等人，(2000)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)164719-724；Tzianabos等人，(2000)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol. Chem.)2756733-6738；Tzianabos等人，(1999)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)163893-897)。然而，究竟這些分子是怎樣活化T細(xì)胞的或它們是怎樣發(fā)揮它們的保護(hù)效果的仍不清楚。使得對(duì)這些多糖的理解更為混亂的是，這個(gè)組發(fā)表的其他論文表明相同的兩性多糖在曾觀察到這些分子保護(hù)作用的同樣的體內(nèi)模型中能誘發(fā)膿腫形成(Tzianabos等人，(1993)《科學(xué)》262416-419；Tzianabos等人，(1994)《傳染性免疫》(Infect.Immun.)623590-3593)。因此，根據(jù)這群文獻(xiàn)難以確定這些兩性多糖在體內(nèi)如何作為免疫系統(tǒng)的抑制性調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用的機(jī)理。
另一個(gè)組研究人員描述了分離自橄欖壓榨廢水的革蘭氏陽(yáng)性菌，Paenibacillus jamilae的外多糖(莢膜樣)的免疫調(diào)節(jié)效果(Ruiz-Bravo等人，(2001)《臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)》(Clin.Diag.Lab.Immunol.)8706-710)。盡管作者未公開(kāi)此多糖的結(jié)構(gòu)特征，他們的結(jié)果與上述Kasper和Tzianabos的工作類似。該分子稱為CP-7，刺激培養(yǎng)物的淋巴細(xì)胞增殖以及IFNγ和GMCSF的顯著表達(dá)。另外，這個(gè)小組報(bào)道該化合物使得小鼠對(duì)單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)感染有抵抗力。這些研究者認(rèn)為機(jī)理可能是通過(guò)刺激炎性Th1應(yīng)答。
根據(jù)上文所討論的大量研究，人們可以推斷多糖抗原可能取決于目前尚未完全理解的結(jié)構(gòu)特征而誘發(fā)促炎或抗炎應(yīng)答。
考慮到文獻(xiàn)中報(bào)道的有關(guān)大量免疫調(diào)節(jié)多糖的混亂的而且有時(shí)是矛盾的效果，本領(lǐng)域需要理解多糖促炎以及抗炎免疫調(diào)節(jié)的潛在的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。也需要另外的治療分子，既包括促炎的也包括抗炎的，它們以安全和有效的方式調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。這樣的領(lǐng)悟以及另外的分子將促進(jìn)開(kāi)發(fā)甚至更為有效的用于疾病預(yù)防和治療的免疫治療策略。
發(fā)明概述相應(yīng)地，本發(fā)明提供式I的線性非交聯(lián)免疫調(diào)節(jié)聚合化合物 式I其中下標(biāo)n表示聚合物中式Y(jié)m單體單元的數(shù)目，是從2至375范圍內(nèi)的單個(gè)整數(shù)；上標(biāo)m表示聚合物中特定Ym單體單元的位置，從左至右順次為一組從1至n的整數(shù)；X1和X2獨(dú)立地為H或端基；式Y(jié)m的每一個(gè)單體單元獨(dú)立地為(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIa的基團(tuán)； 式IIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIb的基團(tuán)
式IIb；每一個(gè)R11、R21...Rn-11和Rn1獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；每一個(gè)R12、R22...Rn-12和Rn2獨(dú)立地為-OH、-NH2、氨基酸殘基、或含有2至10個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(a)每一個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(b)每一個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(a)所述氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合；或其藥學(xué)上可接受的鹽，只要所述線性聚合物不是(a)下式的均聚物，其中n為75至375
(b)或含下式的單體單元的均聚物 在一個(gè)實(shí)施方案中，其中R11、R21...Rn-11和Rn1中的一個(gè)或多個(gè)是甲基。優(yōu)選地，R11、R21...Rn-11和Rn1每一個(gè)都是甲基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，X1和X2每一個(gè)都是H。
在另一實(shí)施方案中，n為75至375、或2至10、或2至3。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)是二肽、三肽、四肽或五肽。優(yōu)選地，R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都是二肽、三肽、四肽或五肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，式Y(jié)m的一個(gè)或多個(gè)單體單元是(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIIa的基團(tuán)； 式IIIa
或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIIb的基團(tuán) 式IIIb其中每一個(gè)R13、R23...Rn-13和Rn3獨(dú)立地為-OH或-NH2；每一個(gè)R14、R24...Rn-14和Rn4獨(dú)立地為-OH或-NH2、氨基酸殘基、或含有2至8個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(a)每一個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(b)每一個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(c)所述氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合。
優(yōu)選地，式Y(jié)m的每一個(gè)單體單元，除了Yn之外，為式IIIa的基團(tuán)；并且Yn為式IIIb的基團(tuán)。這些化合物在文中稱之為式V的化合物。優(yōu)選地，這些化合物是基本上純的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，式Y(jié)m的任何一個(gè)單體單元都不是(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIIa的基團(tuán)；
式IIIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIIb的基團(tuán) 式IIIb其中每一個(gè)R13、R23...Rn-13和Rn3獨(dú)立地為-OH或-NH2；每一個(gè)R14、R24...Rn-14和Rn4獨(dú)立地為-OH或-NH2、氨基酸殘基或者含有2至8個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(c)每一個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(d)每一個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(e)所述氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合；這些化合物在文中稱之為式VI的化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)帶凈電荷，優(yōu)選負(fù)凈電荷。優(yōu)選地，R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都帶凈電荷，優(yōu)選負(fù)凈電荷。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)帶凈中性電荷。優(yōu)選地，R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都帶凈中性電荷。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述線性聚合物是均聚物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述線性聚合物是隨機(jī)共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物。優(yōu)選地，所述線性聚合物是隨機(jī)共聚物。所述線性聚合物可含有2至375種不同的單體單元。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其含有任一前述化合物或其鹽，連同緩沖劑、稀釋劑、賦形劑或載體。所述組合物還可含有分散劑，如聚乙二醇、甘油或蔗糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有任一前述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，連同藥學(xué)上可接受的緩沖劑、稀釋劑、賦形劑或載體。所述藥學(xué)組合物還可含有分散劑，如聚乙二醇、甘油或蔗糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備治療對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑治療敏感的疾病或紊亂的藥物的用途。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式V的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備疫苗佐劑的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于治療對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑治療敏感的疾病或紊亂的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是炎性的，并且所述化合物是式V的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是抗炎性的，并且所述化合物是式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制抗原提呈細(xì)胞成熟的方法，所述方法包括將所述抗原提呈細(xì)胞和有效量的式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在體外和有效抑制所述抗原提呈細(xì)胞成熟的條件下接觸一段時(shí)間。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制哺乳動(dòng)物抗原提呈細(xì)胞成熟的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物給藥有效量的式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽而抑制所述抗原提呈細(xì)胞成熟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要的哺乳動(dòng)物中抑制炎性應(yīng)答的方法，包括(a)從所述哺乳動(dòng)物中分離外周血單核細(xì)胞或其含單核細(xì)胞的級(jí)分；(b)將所述分離的外周血單核細(xì)胞或單核細(xì)胞和含有有效量的使單核細(xì)胞分化為未成熟樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞因子的組合物在體外和有效產(chǎn)生未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞的條件下接觸一段時(shí)間；(c)將所述未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞和有效量的式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在體外和有效阻止未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞成熟的條件下接觸一段時(shí)間；和(d)向所述哺乳動(dòng)物給藥所述未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞，降低所述哺乳動(dòng)物的樹(shù)突細(xì)胞驅(qū)動(dòng)與T細(xì)胞同源性相互作用的能力，并抑制所述哺乳動(dòng)物的炎性應(yīng)答。
在文中公開(kāi)的這種及其他離體方法中，經(jīng)處理細(xì)胞的給藥可以通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或介由心間(intercardiac)路徑實(shí)施。
可經(jīng)由上述和下述方法治療的炎性應(yīng)答包括膿腫和術(shù)后粘連、敗血癥；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；重癥肌無(wú)力；炎性腸?。唤Y(jié)腸炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；多發(fā)性硬化癥；冠狀動(dòng)脈疾??；糖尿??；肝纖維化；銀屑?。粷裾?；急性呼吸窘迫綜合癥；急性炎性胰腺炎；內(nèi)窺鏡逆行膽管胰造影術(shù)誘導(dǎo)的胰腺炎；燒傷；冠狀、腦及外周動(dòng)脈粥樣化形成；闌尾炎；膽囊炎；憩室炎；內(nèi)臟纖維變性紊亂；創(chuàng)傷愈合；皮膚瘢痕形成紊亂；肉芽腫紊亂；哮喘；壞疽性膿皮癥；急性發(fā)熱性中性白細(xì)胞增多性皮病性膿皮??；貝切特氏病；原發(fā)硬化性膽管炎以及細(xì)胞、組織或器官移植。
又在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要的哺乳動(dòng)物中抑制炎性應(yīng)答的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的式VI的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，以阻止所述哺乳動(dòng)物的樹(shù)突細(xì)胞或其他抗原提呈細(xì)胞成熟，從而使得它們不能刺激T細(xì)胞活化，由此抑制所述哺乳動(dòng)物中所述的炎性應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要的哺乳動(dòng)物中抑制炎性應(yīng)答的方法，包括(a)從所述哺乳動(dòng)物中分離外周血單核細(xì)胞或其含單核細(xì)胞的級(jí)分；(b)將所述分離的外周血單核細(xì)胞或單核細(xì)胞和含有有效量的使單核細(xì)胞分化為未成熟樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞因子的組合物在體外和有效產(chǎn)生未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞的條件下接觸一段時(shí)間；(c)將所述未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞和有效量的式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在體外和有效阻止未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞成熟的條件下接觸一段時(shí)間；
(d)將所述未成熟的樹(shù)突細(xì)胞和幼稚T細(xì)胞在體外接觸以產(chǎn)生T調(diào)節(jié)細(xì)胞；和(e)向所述哺乳動(dòng)物給藥抑制T效應(yīng)細(xì)胞的所述T調(diào)節(jié)細(xì)胞，由此抑制所述炎性應(yīng)答。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要的哺乳動(dòng)物中抑制炎性應(yīng)答的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，產(chǎn)生抑制T效應(yīng)細(xì)胞并抑制所述炎性應(yīng)答的T調(diào)節(jié)細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測(cè)量式VI的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的免疫學(xué)活性的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥所述化合物；向所述哺乳動(dòng)物給藥Candin(白色念珠菌皮試抗原)；和測(cè)量對(duì)由所述Candin引發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚病變的抑制，其中，與未接受所述化合物的未治療對(duì)照哺乳動(dòng)物的病變大小相比，所述哺乳動(dòng)物病變大小的下降表明所述化合物能有效抑制局部炎性應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了活化抗原提呈細(xì)胞toll樣受體的方法，所述方法包括將所述抗原提呈細(xì)胞和有效量的式V的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在有效活化所述toll樣受體的條件下接觸一段時(shí)間。所述toll樣受體可以是toll樣受體2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要的哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療病毒感染或癌癥的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的式V的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物炎性應(yīng)答的方法，包括向哺乳動(dòng)物給藥有效量的下式的線性均聚物，其中n為2至375 本發(fā)明涵蓋文中公開(kāi)的實(shí)施方案的所有組合。
本發(fā)明更多的應(yīng)用范圍將會(huì)由下面提供的詳細(xì)說(shuō)明而變得顯而易見(jiàn)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明和具體實(shí)施例，雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅僅是作為舉例說(shuō)明而提供的，這是因?yàn)楦鶕?jù)此種詳細(xì)說(shuō)明，在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)進(jìn)行各種變化和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
附圖的簡(jiǎn)短說(shuō)明根據(jù)下面的詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖，將會(huì)更好地理解本發(fā)明的上述和其他方面、實(shí)施方案、特征以及優(yōu)點(diǎn)，所有這些僅作為舉例說(shuō)明而提供，而不是限制本發(fā)明，其中


圖1為示意圖，顯示了當(dāng)樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用導(dǎo)致炎癥或過(guò)繼性免疫時(shí)發(fā)生的正常事件。
圖2為示意圖，顯示了本發(fā)明的T調(diào)節(jié)細(xì)胞假說(shuō)。
圖3顯示了經(jīng)化合物1處理的來(lái)自人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的細(xì)胞因子的圖型。培養(yǎng)的人PBMCs用0.6微克/毫升的化合物1處理，并且在為期8天的時(shí)間內(nèi)測(cè)量細(xì)胞因子的表達(dá)。以未處理的對(duì)照培養(yǎng)基校正結(jié)果。數(shù)據(jù)表達(dá)為一式三份3個(gè)孔的平均值±所表現(xiàn)的細(xì)胞因子濃度的標(biāo)準(zhǔn)誤差。結(jié)果顯示化合物1處理的主要應(yīng)答是IL10的表達(dá)。
圖4顯示經(jīng)FITC-葡聚糖(FITC-Dx、大小40kDa；圖表A)或Oregon綠標(biāo)記的化合物1(OG-Cpd 1、大小150kDa；圖表B)處理2分鐘的人iDCs的共聚焦顯微圖像。與聚合物孵育后，徹底洗滌細(xì)胞以除掉任何外部的聚合物，以2分鐘的間隔追蹤被內(nèi)在化的物質(zhì)。使用任一化合物都能觀察聚合物在內(nèi)吞液泡中的分布，并且在照片暗視野的細(xì)胞中熒光顯現(xiàn)為白點(diǎn)物質(zhì)。
圖5分別顯示了37℃或0℃下人單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞對(duì)FITC-葡聚糖(圖表A)或Oregon綠標(biāo)記的化合物1(圖表B)的攝取的流式細(xì)胞分析。每一個(gè)柱形圖顯示了在所示的時(shí)間間隔內(nèi)熒光信號(hào)相對(duì)于細(xì)胞數(shù)目的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示對(duì)每種分子的攝取是相似的，并且這種攝取在0℃當(dāng)細(xì)胞新陳代謝失活時(shí)被抑制。
圖6顯示化合物1并不誘導(dǎo)培養(yǎng)物中PBMCs的分裂。分離的PBMCs與100μg/ml的化合物1()、25μg/ml的植物凝集素(PHA)(■)孵育，或者在所示的天數(shù)內(nèi)留置不處理(●)。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)前18小時(shí)向培養(yǎng)物中加入放射性胸苷[3H]-Thy，并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量摻入細(xì)胞的放射標(biāo)記的量。放射性測(cè)量為每分鐘的計(jì)數(shù)。
圖7顯示化合物1抑制抗-CD3抗體介導(dǎo)的人PBMCs的增殖。PBMCs在包被多種濃度的抗-CD3抗體的組織培養(yǎng)板上孵育48小時(shí)(圖表A)或72小時(shí)(圖表B)之前，先與100μg/ml化合物1預(yù)孵育24小時(shí)。使用3H-胸苷摻入測(cè)定接著通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量細(xì)胞增殖。
圖8為示意圖，顯示了當(dāng)化合物2、樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用導(dǎo)致炎癥或過(guò)繼性免疫時(shí)可能發(fā)生的事件。
發(fā)明詳述提供如下的發(fā)明詳述以幫助技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。雖然如此，如下的詳述不能理解為對(duì)本發(fā)明不合理的限制，因?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)Ρ疚挠懻摰膶?shí)施方案進(jìn)行修飾和變動(dòng)而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
特此將文中所引用的每一篇參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全文并入以作參考。
定義如文中所用，縮寫(xiě)詞“h”或“hr”表示小時(shí)?？s寫(xiě)詞“min”表示分鐘。
如文中所用，除非另行指出，如下術(shù)語(yǔ)具有如下含義″Ac″是指CH3C(O)-。
″烷基″是指脂肪烴基團(tuán)，其可以是直鏈或支鏈的，鏈中具有大約1到大約20個(gè)碳原子。優(yōu)選烷基基團(tuán)鏈中有1到大約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選是如文中所定義的低級(jí)烷基。支鏈表示一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基基團(tuán)如甲基、乙基或丙基連接在線性烴鏈上。“低級(jí)烷基”是指可以是直鏈或支鏈的鏈中的大約1到大約4個(gè)碳原子。
“氨基酸”是指選自如文中定義的天然和非天然氨基酸的氨基酸。氨基酸也旨在包括在α-碳上有左旋或右旋立體化學(xué)的氨基酸。優(yōu)選的氨基酸是擁有α-氨基基團(tuán)的那些。取決于側(cè)鏈上的取代基，所述氨基酸可以是中性的、陽(yáng)性的或陰性的?！爸行园被帷笔侵负胁粠щ姾傻膫?cè)鏈取代基的氨基酸。典型的中性氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸?！瓣?yáng)性氨基酸”是指在生理pH下側(cè)鏈取代基帶正電荷的氨基酸。典型的陽(yáng)性氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。“陰性氨基酸”是指在生理pH下側(cè)鏈取代基攜帶凈負(fù)電荷的氨基酸。典型的陰性氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸。優(yōu)選的氨基酸是α-氨基酸。典型的天然氨基酸是異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸?！胺翘烊话被帷笔侵笡](méi)有核酸密碼子的氨基酸。例如，典型的非天然氨基酸包括如上所述的天然α-氨基酸的D-異構(gòu)體；Aib(氨基丁酸)、βAib(3-氨基-異丁酸)、Nva(正纈氨酸)、β-Ala、Aad(2-氨基己二酸)、βAad(3-氨基己二酸)、Abu(2-氨基丁酸)、Gaba(γ-氨基丁酸)、Acp(6-氨基己酸)、Dbu(2，4-二氨基丁酸)、α-氨基庚二酸、TMSA(三甲基硅基丙氨酸)、aIle(別-異亮氨酸)、Nle(正亮氨酸)、叔-Leu、Cit(瓜氨酸)、鳥(niǎo)氨酸、Dpm(2，2’-二氨基庚二酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸)、α-或β-Nal、Cha(環(huán)己基-丙氨酸)、羥基脯氨酸、Sar(肌氨酸)等等；環(huán)狀氨基酸；Na-烷基化氨基酸如MeGly(Na-甲基甘氨酸)、EtGly(Na-乙基甘氨酸)和EtAsn(Na-乙基天門冬酰胺)；以及α-碳原子攜帶兩個(gè)側(cè)鏈取代基的氨基酸。文中使用的天然和非天然氨基酸及其殘基的命名是由IUPAC有機(jī)化學(xué)命名委員會(huì)和IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)根據(jù)命名大會(huì)如“a-氨基酸的命名(推薦，1974)”生物化學(xué)，14(2)，(1975)中所示建議的。就本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所采用的氫基酸及其殘基的名稱和縮寫(xiě)與上面所指出的那些不同而言，變換不同名稱和縮寫(xiě)將得以闡明。
“氨基酸殘基”是指通過(guò)酰胺鍵摻入到肽或分子的肽部分的單個(gè)氨基酸單元。
術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志”表示與藥物給藥有關(guān)的特定活性的標(biāo)志。非限制的生物標(biāo)志實(shí)例包括細(xì)胞表面受體、可溶性調(diào)節(jié)劑、mRNA信使、或受調(diào)節(jié)且可測(cè)量的體內(nèi)應(yīng)答。
“有效量”是指本發(fā)明的化合物或組合物有效產(chǎn)生期望的或所示的免疫或治療效果的量。
“IL10”是內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，常參與炎性應(yīng)答的下調(diào)。IL10的定向內(nèi)源產(chǎn)生可以最大化功效并最小化毒性作用。
“免疫細(xì)胞”是指能夠在整個(gè)宿主免疫系統(tǒng)內(nèi)響應(yīng)或起始應(yīng)答的任何細(xì)胞。通常這些細(xì)胞被稱作“白細(xì)胞”，但是并非必然限于此類細(xì)胞。免疫細(xì)胞的實(shí)例包括T和B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞和多形核白細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“炎癥”、“炎性應(yīng)答”、“促炎應(yīng)答”等是指有內(nèi)源或外源組織損傷起始的復(fù)雜機(jī)體過(guò)程。這類損傷的炎性應(yīng)答包括可溶性因子如細(xì)胞因子(包括但不限于白介素(IL)1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α)以及趨化因子(包括但不限于IL-8、干擾素.-γ和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)蛋白(MIP)-1β)的誘導(dǎo)。幾種免疫細(xì)胞群也參與炎性應(yīng)答，包括但不限于噬中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。盡管炎癥是作為保護(hù)功能進(jìn)化并且可能是作為保護(hù)功能而誘發(fā)的，但是可能遇到眾多炎性病變的實(shí)例(如，炎性腸病，術(shù)后粘聯(lián)的過(guò)度形成以及膿腫形成，等等)。
術(shù)語(yǔ)“抗炎癥”、“抗炎性”等是指削弱或逆轉(zhuǎn)炎性應(yīng)答的任何過(guò)程。該過(guò)程包括但不限于可溶性調(diào)節(jié)劑如IL-10的誘導(dǎo)或細(xì)胞群如調(diào)節(jié)T(Treg)細(xì)胞的誘導(dǎo)。
“免疫應(yīng)答”是指免疫系統(tǒng)的促炎或抗炎應(yīng)答。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控”或“調(diào)節(jié)”等是指選定參數(shù)的上升或下降。
“凈電荷”是指離子性物質(zhì)電荷的算術(shù)總數(shù)，如存在凈負(fù)電荷時(shí)具有(-)電荷的肽；存在凈負(fù)電荷時(shí)具有(+，-，-)電荷的肽；存在凈正電荷時(shí)具有(+，+，-)電荷的肽；存在凈負(fù)電荷時(shí)具有(-，-)的肽；存在凈正電荷時(shí)具有(+)的肽等。特別要注意，在具有(+，-)電荷的肽中不存在凈電荷。
“非免疫細(xì)胞”是指通常不參與免疫應(yīng)答、但是具有受免疫系統(tǒng)產(chǎn)物調(diào)節(jié)的能力的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”是指哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物，包括人和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物；陪伴動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物及農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，包括但不限于貓、狗、嚙齒動(dòng)物、馬、牛、綿羊、豬、山羊；禽類等等。
“肽”是指含有通過(guò)酰胺鍵連接起來(lái)的氨基酸殘基的聚合物。
“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物相對(duì)無(wú)毒的無(wú)機(jī)和有機(jī)酸式加成鹽以及堿式加成鹽。這些鹽可在化合物最終的分離和純化期間原位制備。具體地，酸式加成鹽可如此制備，即將游離堿形式的純化化合物分別與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸反應(yīng)，并分離這樣形成的鹽。典型的酸式加成鹽包括氫溴酸鹽、氫氯酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月硅酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘鹽(naphthylate)、甲磺酸鹽、葡萄糖酸鹽、lactiobionate、氨基磺酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、亞甲基-雙-β-羥基萘甲酸鹽、龍膽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、對(duì)甲基二苯甲酰酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯?；撬猁}、環(huán)己基磺酸鹽和奎尼酸十二烷醇基磺酸鹽(quinateslaurylsulphonate salts)等等。例如，參見(jiàn)S.M.Berge等人，“藥學(xué)鹽”J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)，特此并入作為參考。堿式加成鹽也可如此制備，即將酸形式的純化化合物分別與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)堿反應(yīng)，并分離這樣形成的鹽。堿式加成鹽包括藥學(xué)上可接受的金屬和氨基鹽。合適的金屬鹽包括鈉、鉀、鈣、鋇、鋅、鎂和鋁鹽。優(yōu)選鈉鹽和鉀鹽。合適的無(wú)機(jī)堿式加成鹽是由金屬堿制備的，這包括氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅。合適的氨基堿式加成鹽是由具有足夠堿性以形成穩(wěn)定鹽的氨制備的，優(yōu)選包括那些在藥物化學(xué)領(lǐng)域中因其低毒性和藥用可接受性而頻繁使用的氨。氨、乙二氨、N-甲基-葡糖氨、賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苯甲基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)-氨基甲烷、四甲基氫氧化胺、三乙胺、二芐胺、ephenamine，脫氫樅胺、N-乙基哌啶、芐胺、四甲基胺、四乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、堿性氨基酸，如賴氨酸和精氨酸，以及二環(huán)己基胺等等。
“基本上純的”是指純度在約90％到約100％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選從約95％到約100％，并且甚至更優(yōu)選從約97％到約100％，包括90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的個(gè)體值或其中的任何范圍。本發(fā)明化合物可以基本上純的或分離的形式獲得，不含大量的生物污染物(包括具有免疫調(diào)節(jié)活性的其他分子)，它們通常出現(xiàn)在分離自天然細(xì)菌源的肽聚糖制品中。
如文中定義的“合成多糖抗原”或“SPA”是合成產(chǎn)生的基本上純的線性非交聯(lián)N-乙酰葡萄糖胺基-β-[1，4]-N-乙酰胞壁?；牡木酆衔?。所述肽可含有兩個(gè)或多個(gè)天然或非天然結(jié)構(gòu)的D或L構(gòu)型的氨基酸。如文中所公開(kāi)的純合成多糖抗原基本上沒(méi)有天然存在的細(xì)菌細(xì)胞壁污染物。這種抗原不能由任何已知的化學(xué)或酶法從自然界得到。注意這種定義包括但不限于天然的非交聯(lián)細(xì)菌肽序列。文中公開(kāi)的化合物1和2是合成肽聚糖(PGs)，它們是特殊的SPAs。SPAs可通過(guò)全合成產(chǎn)生。
“端基”本發(fā)明的合成聚合物終止于具有游離還原型異頭醇的胞壁酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到所述結(jié)構(gòu)為吡喃型葡萄糖基的N-乙酰胞壁?；┒丝捎煞及被幚硇纬蒀-1N-芳基衍生物，以及由芳肼基處理形成C-1腙。此外，用溶解性轉(zhuǎn)糖基酶(如，Dijkstra等人(1994)《結(jié)構(gòu)生物學(xué)當(dāng)代意見(jiàn)》(Curr.Opin.Struct.Biol.)4810)限制性消化合成聚合物將產(chǎn)生具有胞壁?；?[1，6]-酐鍵的末端，這可用于所得異頭碳的化學(xué)修飾。
“T調(diào)節(jié)細(xì)胞”或“Tregs”是指獨(dú)特譜系的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其在體內(nèi)和體外有效地抑制炎性效應(yīng)T細(xì)胞。Tregs特征在于表達(dá)某些細(xì)胞表面標(biāo)志，例如，包括CD4和CD25(CD4+/CD25+)。
“兩性離子”是指每個(gè)多糖重復(fù)單元為單分子偶極離子或多極離子，例如，包括具有(+，-)、(+，-，-)等電荷的分子。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑本發(fā)明的式I的化合物是線性非交聯(lián)聚合物，并包括多種類型的均聚物和共聚物。這些聚合物可通過(guò)化學(xué)-酶促全合成得到，例如由N-乙酰-葡糖胺獲得。此外，取決于其結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的化合物可以是炎性或抗炎性的。
如下所示的化合物1，一種式VI的化合物，為抗炎性免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例。它是所示重復(fù)單元的均聚物，呈以150千道爾頓為中心的分子量分布。所述聚合物為吸濕性白色粉末，溶于水或鹽。
化合物1細(xì)菌細(xì)胞壁中的天然的肽聚糖是單一的共價(jià)閉合高分子，其在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)精確限定了細(xì)菌細(xì)胞的形狀。它是由聚合的肽聚糖聚糖鏈的平行剛性軸組成的，其中重復(fù)單元是β-[1，4]-交聯(lián)N-乙酰葡萄糖胺基-β-[1，4]-N-乙?；?胞壁?；咫摹＞厶擎湷拭咳ν暾菪s4個(gè)重復(fù)單元的螺旋狀。更為柔性的五肽軸從胞壁酸殘基的乳酸羧基自N向C延伸。該肽一般是H2N-丙氨酸-D-異-谷氨酸(或異-谷氨酰氨)-賴氨酸(或二氨基庚二酸鹽DAP)-D-丙氨酸-D-丙氨酸-COOH。該肽可在來(lái)自供體鏈的賴氨酸(或DAP)與受體鏈倒數(shù)第二個(gè)D-丙氨酸的羰基之間交聯(lián)?；罴?xì)胞中的實(shí)際交聯(lián)度隨種屬而變，一般低于100％。與之相比，本發(fā)明的化合物是線性的，也就是說(shuō)，在肽中沒(méi)有交聯(lián)。
如下文所示，化合物1在腹膜內(nèi)膿腫和術(shù)后粘連模型中防御炎癥誘導(dǎo)。如下文所示實(shí)施例所證明的那樣，對(duì)由此分子誘導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制的研究揭示其可能抑制樹(shù)突細(xì)胞[免疫細(xì)胞所有成員中最為強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(APCs)]的成熟。未成熟APCs不能活化T細(xì)胞，這是因?yàn)槠錈o(wú)力通過(guò)共刺激向T細(xì)胞傳遞信號(hào)。用化合物1處理人PBMCs不能刺激T細(xì)胞的活化或增殖。用式VI的其他分子處理人PBMCs應(yīng)當(dāng)也不能刺激T細(xì)胞的活化或增殖?？紤]到早先所討論的有關(guān)兩性離子多糖以及天然存在的肽聚糖的文獻(xiàn)，這完全是預(yù)料之外的。業(yè)已報(bào)道兩性離子多糖以及天然存在的肽聚糖都是T細(xì)胞活化的有絲分裂原(PCT國(guó)際公開(kāi)WO 00/59515；Kalka-Moll等人(2000)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)164719-724；Tzianabos等人(2000)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2756733-6738；Levinson等人(1983)《感染免疫學(xué)》(Infect.Immun.)39290-296)。此外，化合物1不能刺激體外受體細(xì)胞中的Toll樣受體或者刺激PBMC培養(yǎng)物中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，而如果APCs成熟通過(guò)刺激TLR2或其他TLRs發(fā)生(Schwander等人(1999)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)27417406-17409；Medzhitov等人(2001)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)6135-145)，隨后在抗原的存在下通過(guò)兩類細(xì)胞之間預(yù)期的同源相互作用活化T細(xì)胞的話，這些都將是預(yù)期事件。預(yù)期式VI的其他化合物將不是TLR2或其他TLRs的配體。本發(fā)明人也推測(cè)在繼式VI的分子處理之后，PBMC培養(yǎng)物中存在的CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)目增加，表明用這類分子處理產(chǎn)生了未成熟APCs群，其驅(qū)動(dòng)刺激培養(yǎng)物內(nèi)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞。這種假說(shuō)進(jìn)一步得到如下功能觀察的支持，即繼化合物1處理之后，用抗-CD3抗體刺激抑制PBMC培養(yǎng)物中T細(xì)胞的增殖。
最后，發(fā)明人也令人驚訝地發(fā)現(xiàn)當(dāng)用化合物1體外處理人PBMCs時(shí)，應(yīng)答最為顯著的是IL10的表達(dá)。觀察到可忽略不計(jì)的IL2、IFN-γ、TNF-α、IL6或IL12的表達(dá)。IL10為具有多形效果的II型細(xì)胞因子(Moore等人(2001)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)19683-765)。已經(jīng)證明其具有強(qiáng)抗炎活性，下調(diào)效應(yīng)T細(xì)胞(Morel等人(2002)《免疫學(xué)》(Immunol.)106229-236)、樹(shù)突細(xì)胞(Martin等人(2003)《免疫》(Immunity)18155-167)及其他抗原提呈細(xì)胞(Williams等人(2002)《白細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.Leuko.Biol.)72800-809)的炎性應(yīng)答。IL10由多種細(xì)胞類型生產(chǎn)，包括T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞(Moore等人(2001)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)19683-765)以及稱之為調(diào)節(jié)T(Treg)細(xì)胞的特化T細(xì)胞亞型(Suri-Payor等人(2001)《自身免疫雜志》(J.Autoimmun.)16115-123)。此細(xì)胞因子以許多方式幫助維持免疫系統(tǒng)內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。IL10起壓制未經(jīng)校驗(yàn)的炎性應(yīng)答的作用，否則它們對(duì)宿主將是有害的(Moore等人(2001)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)19683-765)。
這些結(jié)果與表征免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌肽聚糖的識(shí)別的大量文獻(xiàn)形成直接對(duì)照。此外，考慮到上文討論的表明細(xì)菌肽聚糖是強(qiáng)致炎劑的當(dāng)前大量有關(guān)天然肽聚糖的證據(jù)，本文公開(kāi)的式VI的化合物對(duì)抗炎應(yīng)答的刺激是全新的并且是預(yù)料之外的。從而，盡管天然肽聚糖是強(qiáng)致炎性的，但本文公開(kāi)的VI的化合物是抗炎性的。發(fā)明人令人驚訝的VI的化合物應(yīng)表現(xiàn)出體外抗炎活性的發(fā)現(xiàn)與先前公開(kāi)的有關(guān)純化的細(xì)菌肽聚糖的結(jié)果形成鮮明對(duì)照，從而促使在動(dòng)物炎癥模型中測(cè)試化合物1的活性。如下文所證明的那樣，該合成肽聚糖在以炎癥為基礎(chǔ)的病變動(dòng)物模型中表現(xiàn)出保護(hù)性的治療效果。
化合物2是本發(fā)明式V的代表性化合物，為炎性免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例。
化合物2該分子活化TLR2(數(shù)據(jù)未顯示)，并且如下文所示，誘導(dǎo)人PBMCs適度產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α?；衔?適度的促炎活性與分離自細(xì)菌來(lái)源的天然肽聚糖的強(qiáng)致炎活性形成對(duì)照。這種差異很可能是因分離自細(xì)菌的異質(zhì)物質(zhì)中存在著的眾多生物學(xué)污染物的存在和活性所致。
式I的線性非交聯(lián)聚合物 式I包含n個(gè)獨(dú)立的式Y(jié)m的單體單元。下標(biāo)n表示聚合物中式Y(jié)m單體單元的數(shù)目，為從2到的375范圍中的單個(gè)整數(shù)。例如，當(dāng)n＝2時(shí)，存在兩個(gè)單體單元Y1和Y2。當(dāng)n＝3時(shí)，存在三個(gè)單體單Y1、Y2和Y3。當(dāng)n＝375時(shí)，存在375個(gè)單體單元Y1、Y2、Y3...Y374和Y375。
上標(biāo)m表示聚合物中順次從左到右特定單體單元Ym的位置，是從1到n的系列整數(shù)。Y1直接連接于X1，而Yn直接連接于X2。序列的闡釋性實(shí)例包括如下nm式I的聚合物n1、2、3...n-1和n X1-Y1-Y2-Y3-...-Yn-1-Yn-X221和2 X1-Y1-Y2-X231、2和3X1-Y1-Y2-Y3-X241、2、3和4 X1-Y1-Y2-Y3-Y4-X2375 1、2、3...374和375 X1-Y1-Y2-Y3-Y4-...-Y374-Y375-X2每個(gè)單體單元Ym(即Y1、Y2...Yn-1和Yn中的每一個(gè))獨(dú)立選擇，從而它們可以全部相同、全部不同或者是它們的任意組合。從而，本發(fā)明包括均聚物(即所有單體都相同)和共聚物(即兩個(gè)或多個(gè)不同單體)。共聚物可以是隨機(jī)共聚物、嵌段共聚物或交替共聚物。例如，如果Y1和Y2表示兩個(gè)不同的式Y(jié)m單體單元，則聚合物類型可闡釋如下聚合物類型闡釋性實(shí)例均聚物X1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-Y1-X2隨機(jī)共聚物X1-Y1-Y2-Y1-Y1-Y2-Y2-Y2-Y1-Y2-Y1-Y1-Y2-Y1-X2嵌段共聚物X1-Y1-Y1-Y1-Y2-Y2-Y2-Y1-Y1-Y1-Y2-Y2-Y2-X2交替共聚物X1-Y1-Y2-Y1-Y2-Y1-Y2-Y1-Y2-Y1-Y2-Y1-Y2-X2在式I的聚合物中，式Y(jié)m的每個(gè)單體單元獨(dú)立地為(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIa的基團(tuán)；
式IIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIb的基團(tuán) 式IIb。
式Y(jié)m的每個(gè)單體單元包含如下所述的獨(dú)立的變量組Rm1和Rm2單體單元YmYm變量Rm1和Rm2YmRm1和Rm2Y1R11和R12Y2R21和R22Y3R31和R32Y375R3751和R3752從而，包含n個(gè)單體Ym單元(即Y1、Y2、Y3...Yn-1和Yn)的聚合物將具有兩組變量組1R11、R21、R31...Rn-11和Rn1組2R12、R22、R32...Rn-12和Rn2
在每一組中，變量獨(dú)立選擇，全部相同、全部不同，或者是它們的任意組合。也就是說(shuō)，R11、R21、R31...Rn-11和Rn1中每一個(gè)都獨(dú)立選擇。同樣地，R12、R22、R32...Rn-12和Rn2中每一個(gè)也都獨(dú)立選擇。
當(dāng)n＝2時(shí)，式I的聚合物的實(shí)例如下所示 其中，R11和R21獨(dú)立選擇，并且R12和R22也獨(dú)立選擇。
類似地，當(dāng)n＝3時(shí)，式I的聚合物如下所示 其中，R11、R21和R31獨(dú)立選擇，并且R12、R22和R3也獨(dú)立選擇。
具有如下結(jié)構(gòu)的二糖單體GMDP(N-乙酰葡萄糖胺基-N-乙酰胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺)和GMDP-A(N-乙酰葡萄糖胺基-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨?；?D-谷氨酸) 據(jù)報(bào)道誘導(dǎo)炎性應(yīng)答(例如參見(jiàn)美國(guó)專利4,395,399)。類似地，商業(yè)上可得的聚合細(xì)菌肽聚糖樣品(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，Sigma；釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，Lee Laboratories)是強(qiáng)致炎性的(釀膿鏈球菌＞鏈球菌)。盡管這些物質(zhì)在組成上是異質(zhì)的，業(yè)已HPLC純化和表征了更小的二糖片斷(其中一些具有肽交聯(lián))，并且也是致炎性的。這些物質(zhì)的致炎能力據(jù)報(bào)道取決于結(jié)構(gòu)(Tuomanen等人(1993)《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)92297)。據(jù)報(bào)道具有生物學(xué)活性的最小肽聚糖片斷為胞壁酰二肽或MDP，并且其生物學(xué)活性在本質(zhì)上是致炎性的(Chedid(1983)《微生物學(xué)免疫學(xué)》(Microbio.Immunol.)27723)。事實(shí)上，如下所示的MDP和MDP-A基序是已知致炎化合物的共同特征 MDP基序 MDP-A基序申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)至少式I的化合物必須包括如下基序之一，以誘導(dǎo)炎性應(yīng)答 GMPD基序 GMDP基序如果這些基序缺失或被修飾，則聚合物將誘導(dǎo)抗炎應(yīng)答。如果第二氨基酸(D-異-Glu或D-異-Gln)缺少側(cè)羧基，或者所述側(cè)羧基為L(zhǎng)構(gòu)型，則促炎活性消除(Girardin等人(2003)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol Chem.)2788869)。剩余的三個(gè)氨基酸(Lys-D-Ala-D-Ala)中增加一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致活性保留。我們?cè)谙挛淖C明化合物2由人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生促炎應(yīng)答。其聚合結(jié)構(gòu)為-[NAG-NAM]n-三肽，其中n為整數(shù)，其分布值中在大約135左右，而三肽為天然細(xì)菌序列(Ala-D-異-Glu-Lys)。此外，我們?cè)谙挛淖C明化合物1在許多生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生抗炎應(yīng)答。除了第二氨基酸缺少側(cè)羧基之外，該分子與化合物2相同。
某些式I的化合物也誘導(dǎo)炎性應(yīng)答，例如，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)式Y(jié)m的單體單元為以下時(shí)(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIIa的基團(tuán)； 式IIIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIIb的基團(tuán)，
式IIIb其中R13、R23...Rn-13和Rn3中的每一個(gè)獨(dú)立地為-OH或-NH2；R14、R24...Rn-14和Rn4中的每一個(gè)獨(dú)立地為-OH或-NH2、氨基酸殘基或者含有2-8個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(f)每個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(g)每個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(b)氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合。
這些炎性化合物在文中稱之為式V的化合物。實(shí)例包括如文中所述的化合物2以及GMDP和GMDP-A的聚合物。
相反，有些式I的化合物誘導(dǎo)抗炎應(yīng)答，例如，當(dāng)任何式Y(jié)m的單體單元都不是如下時(shí)(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIIa的基團(tuán)；

式IIIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIIb的基團(tuán) 式IIIb其中R13、R23...Rn-13和Rn3中的每一個(gè)獨(dú)立地為-OH或-NH2；R14、R24...Rn-14和Rn4中的每一個(gè)獨(dú)立地為-OH或-NH2、氨基酸殘基或者含有2-8個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(h)每個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(i)每個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(c)氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合。
這些抗炎化合物在文中稱之為式VI的化合物。雖然并非本發(fā)明的化合物，化合物1是包含式IIIa和IIIb的基團(tuán)的抗炎化合物的實(shí)例。
應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)例僅用于闡釋目的，而并不旨在縮小本發(fā)明的范圍。
細(xì)菌肽聚糖和合成多糖抗原與樹(shù)突細(xì)胞的相互作用多數(shù)微生物抗原通過(guò)稱之為抗原相關(guān)的微生物模式(PAMPs)的高度保守的結(jié)構(gòu)基序向免疫系統(tǒng)傳遞信號(hào)(Medzhitov(2001)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)135-145)。PAMPs與存在于多種抗原提呈細(xì)胞上的Toll樣受體(TLRs)相互作用，以起始信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如IL12和IL6以及多種趨化因子的表達(dá)(Janeway等人(2002)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)20197-216)?？乖岢始?xì)胞通過(guò)TLRs特別是樹(shù)突細(xì)胞的活化引起了以表面MHC II類分子和共刺激分子如CD80和CD86表達(dá)增加為特征的成熟過(guò)程(Chakraborty等人(2000)《臨床免疫學(xué)》(Clin.Immunol.)9488-98)。這種級(jí)聯(lián)是設(shè)計(jì)用于集合先天免疫系統(tǒng)的早期防御者，以立即對(duì)入侵作出應(yīng)答，并構(gòu)成了通過(guò)抗原提呈細(xì)胞將長(zhǎng)期存在的過(guò)繼性免疫與T細(xì)胞聯(lián)系起來(lái)的基礎(chǔ)(Keller(2001)《免疫學(xué)通訊》(Immunol.Lett.)78113-122)(見(jiàn)圖1)。由于化合物1模仿天然細(xì)菌細(xì)胞壁來(lái)源的肽聚糖，可是為單鏈，人們可能預(yù)期該聚合物將擁有能夠通過(guò)TLRs傳遞信號(hào)的PAMPs。的確，業(yè)已證明天然肽聚糖為TLR2配體(Schwandner等人(1999)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)27417406-17409)。令人驚訝的是，如本文所示，化合物1為式VI的代表性化合物，似乎并不活化在人或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)試的TLR2或任何其他TLR。這進(jìn)一步通過(guò)用此化合物刺激的PBMC培養(yǎng)物中缺乏IL12、IL6或其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)而得到證明。另外，人類單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞并不因此化合物刺激而驅(qū)動(dòng)成熟。在用化合物1處理后，未成熟樹(shù)突細(xì)胞并不表現(xiàn)出其表面特有的MHC II、CD80或CD86的上調(diào)，盡管事實(shí)上認(rèn)為這些細(xì)胞是最有效的抗原提呈細(xì)胞，而且熱衷于內(nèi)在化這些分子并將它們集中在內(nèi)吞液泡中。
細(xì)菌脂多糖(LPS)是強(qiáng)大的TLR4激動(dòng)劑(Beulter(2002)《當(dāng)代高端微生物學(xué)免疫學(xué)》(Curr.Top Microbiol.Immunol.)270109-120)，并常用作為未成熟樹(shù)突細(xì)胞的成熟信號(hào)(Ardavin等人(2001)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(Trends Immunol.)22691-700)。LPS特異性上調(diào)樹(shù)突細(xì)胞上的共刺激分子如CD80和CD86(Michelsen等人(2001)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)27625680-25686)。這些表面分子對(duì)于信號(hào)傳遞T細(xì)胞細(xì)調(diào)其效應(yīng)細(xì)胞功能如炎性應(yīng)答是至關(guān)重要的。當(dāng)未成熟樹(shù)突細(xì)胞與化合物1和LPS共培養(yǎng)時(shí)，CD80和CD86并不上調(diào)，表明式VI的化合物應(yīng)當(dāng)抑制樹(shù)突細(xì)胞的成熟。
樹(shù)突細(xì)胞樹(shù)突細(xì)胞(DCs)是見(jiàn)于幾乎每一器官中的專職抗原提呈細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞亞型已被很好地確定，并且已經(jīng)證明這些細(xì)胞類型在其整個(gè)生命周期種通過(guò)幾種水平的分化和成熟進(jìn)化(Jonuleit等人(2001)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(Trendsin Immunol.)22394-400)。未成熟樹(shù)突細(xì)胞以低水平表達(dá)的MHC II類分子以及有限表達(dá)的共刺激分子CD80和CD86為特征。這些表面分子的表達(dá)響應(yīng)炎性刺激物如IFNγ或通過(guò)與細(xì)菌抗原相互作用的TLR活化而顯著上調(diào)。在功能上，外周的未成熟DCs特別擅長(zhǎng)于捕獲和加工抗原。成熟DCs下調(diào)這些活性，并通過(guò)介由MHCII呈遞抗原以及通過(guò)CD80/86的共刺激而顯著上調(diào)其刺激幼稚T細(xì)胞的能力。(Banchereau等人(2000)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)18767-811)。這些總結(jié)于圖1之中。
在無(wú)炎癥情況下，多數(shù)外周DCs處于未成熟狀態(tài)，并認(rèn)為這些細(xì)胞在維持外周T細(xì)胞耐受(識(shí)別自身)、誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能以及防御自身免疫性方面起著主要作用(Jonuleit等人(2001)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(Trends inImmunol.)22394-400)。
如本文所示，盡管存在強(qiáng)效的炎性刺激物(LPS)，用化合物1處理未成熟樹(shù)突細(xì)胞抑制其成熟的能力。通過(guò)未成熟或半成熟(低水平CD80和CD86表達(dá))樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的重要性才剛剛被充分認(rèn)可(Lutz等人(2002)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(Trends in Immunol.)23445-449)。業(yè)已表明對(duì)抗耐受或炎癥抑制的過(guò)繼免疫的誘導(dǎo)可由外周未成熟或半成熟DCs與完全成熟DCs的比率決定(Jonuleit等人(2001)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(Trends in Immunol.)22394-400；Garza等人(2000)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1912021-2028)。通過(guò)用式VI的化合物處理化療維持未成熟DC群應(yīng)當(dāng)能夠抑制T細(xì)胞和DCs之間的同源性相互作用，從而防止抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞響應(yīng)炎性刺激物克隆擴(kuò)增。然而，考慮到本文提出的所有證據(jù)，很可能通過(guò)式VI的化合物處理產(chǎn)生的未成熟DCs將誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞群，它們直接抑制炎性效應(yīng)T細(xì)胞的活性，從而提供抗炎性病變保護(hù)。文獻(xiàn)中越來(lái)越多的證據(jù)表明未成熟DCs在體內(nèi)誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞，此外，業(yè)已由特異性保護(hù)動(dòng)物免受流感病毒感染并在移植模型中防止排斥的未成熟DCs誘導(dǎo)了T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Jonuleit等人(2001)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(Trends in Immunol.)22394-400；Dhodapkar等人(2001)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)193233-238；Thomson等人(1999)《移植進(jìn)展》(Transplant.Proc.)312738-2739)。在這些研究中，離體擴(kuò)增未成熟DCs，然后給予動(dòng)物。式VI的化合物能夠提供獨(dú)特的治療，其中通過(guò)離體處理使得自體或免疫學(xué)相容的DCs長(zhǎng)期地不成熟，然后重新引入患者體內(nèi)，以刺激T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。
T調(diào)節(jié)細(xì)胞最近來(lái)自若干實(shí)驗(yàn)室的研究證明未成熟樹(shù)突細(xì)胞在T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tregs)的產(chǎn)生中是至關(guān)重要的組分(Jonuleit等人(2001)《免疫學(xué)趨勢(shì)》(TrendImmunol.)22394-400)。T調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)揮作用，以維持外周耐受，防御自身免疫性，并參與炎癥調(diào)節(jié)，以允許對(duì)微生物入侵進(jìn)行適當(dāng)?shù)膽?yīng)答，同時(shí)還保護(hù)宿主免受有害的副作用(Maloy等人(2001)《天然免疫學(xué)》(Nat.Immunol.)2816-822)。
最近深入研究的Treg表型以表面標(biāo)志CD4和CD25的組成型表達(dá)為特征(Shevach(2002)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)2389-400)。在嚙齒動(dòng)物(Taylor等人(2001)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1931311-1317)和人(Jonuleit等人(2001)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1931285-1294)中均已鑒定到具有此表型的T調(diào)節(jié)細(xì)胞。CD4+CD25+T細(xì)胞以大約2-10％的頻率天然地存在于外周循環(huán)中(Shevach(2002)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)2389-400)。在CD4+CD25-靶細(xì)胞和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的共培養(yǎng)中，盡管存在著強(qiáng)效增殖信號(hào)如抗-CD3抗體或異源APCs，T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制CD4+CD25-靶細(xì)胞的增殖(Pasare等人(2003)《科學(xué)》(Science)2991033-1036)。迄今為止，尚沒(méi)有報(bào)道說(shuō)明在體內(nèi)產(chǎn)生T調(diào)節(jié)細(xì)胞的明確的化學(xué)手段。文獻(xiàn)中報(bào)道的早期研究顯示CD4+CD25+Treg細(xì)胞在體外表達(dá)少許IL10(2002)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)2389-400)。此外，在炎性模型中，CD4+CD25+細(xì)胞不能抑制IL10敲除動(dòng)物的炎癥(Shevach(2002)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)2389-400)。這些研究導(dǎo)致了普遍相信T調(diào)節(jié)細(xì)胞抗炎活性的機(jī)制是介由IL10的表達(dá)。在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的精細(xì)研究(Jonuleit等人(2001)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1931285-1294；Levings等人(2001)J.Exp.Med.1931295-1302；Dieckman等人(2001)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1931303-1310)已證明雖然CD4+CD25+T細(xì)胞的確表達(dá)IL10和/或其他細(xì)胞因子，但它們抑制炎性T細(xì)胞的機(jī)制取決于細(xì)胞-細(xì)胞接觸。在CD4+CD25+T細(xì)胞與其靶標(biāo)之間最初的相互作用中，細(xì)胞因子表達(dá)并不起作用。最近，這組看似荒謬的觀察結(jié)果因Diekman等人的工作而澄清((2002)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)196247-253)。該研究組還證明CD4+CD25+T細(xì)胞與炎性T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸相互作用。盡管由這種接觸傳導(dǎo)的信號(hào)的確切性質(zhì)尚不知曉，這些工作者證明接觸的一個(gè)重要意義在于靶細(xì)胞即CD4+CD25-T細(xì)胞變得無(wú)能，并開(kāi)始表達(dá)高水平的IL10。既然T調(diào)節(jié)細(xì)胞就整個(gè)免疫系統(tǒng)而言相對(duì)稀少，這提供了擴(kuò)大抗炎效果的機(jī)制，并解釋了顯示IL10在由CD4+CD25+T細(xì)胞介導(dǎo)的系統(tǒng)性抗炎反應(yīng)中的作用的廣大數(shù)據(jù)。
如下文所示，當(dāng)與用多克隆有絲分裂原如植物凝集素(PHA)或超抗原如金色葡萄球菌腸毒素A(SEA)處理的對(duì)照培養(yǎng)物相比時(shí)，用化合物1處理的人PBMC培養(yǎng)物并不通過(guò)增殖應(yīng)答。此外，當(dāng)化合物1處理的PBMC培養(yǎng)物用抗-CD3抗體刺激時(shí)，與未處理對(duì)照相比，存在著顯著的培養(yǎng)物增殖能力的抑制。微陣列分析進(jìn)一步揭示用化合物1和抗-CD3抗體處理的PBMC培養(yǎng)物選擇性上調(diào)CD3+T細(xì)胞群中IL10和IL19(IL10旁系同源物)信息的表達(dá)，而下調(diào)多種炎性細(xì)胞因子信息如IL17和TNFβ。
綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明式VI的化合物，以化合物1為例，抑制樹(shù)突細(xì)胞的成熟。未成熟樹(shù)突細(xì)胞具有驅(qū)使產(chǎn)生T調(diào)節(jié)細(xì)胞的獨(dú)特能力。Treg細(xì)胞可隨之通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及通過(guò)在炎癥部位刺激無(wú)能化T細(xì)胞表達(dá)IL10而參與炎性應(yīng)答的抑制。
IL10的治療應(yīng)用使用重組IL10作為免疫治療劑的概念廣為接受(Madsen(2002)《腸胃病學(xué)》(Gastroenterol.)1232140-2144；Barnes(2001)《過(guò)敏癥臨床免疫學(xué)當(dāng)代意見(jiàn)》(Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.)1555-560；Bremeanu等人(2001)《國(guó)際免疫學(xué)評(píng)論》(Int.Rev.Immunol.)20301-331；St.Clair(2000)Curr.Dir.Autoimmun.2126-149)。存在著眾多已證明IL10有效的動(dòng)物炎癥模型，如炎性腸病(IBD)、Crohn’s病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自體免疫性糖尿病以及變應(yīng)性病(Madsen(2002)《腸胃病學(xué)》(Gastroenterol.)1232140-2144；Barnes(2001)《過(guò)敏癥臨床免疫學(xué)當(dāng)代意見(jiàn)》(Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.)1555-560；Bremeanu等人(2001)《國(guó)際免疫學(xué)評(píng)論》(Int.Rev.Immunol.)20301-331；St.Clair(2000)Curr.Dir.Autoimmun.2126-149)?？墒?，使用重組IL10治療炎性腸病的臨床試驗(yàn)取得了各種各樣混雜的結(jié)果。重復(fù)高劑量方案的需求以及某些產(chǎn)生的毒性妨礙了這些努力的成功。控制個(gè)體免疫系統(tǒng)，以介由T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性選擇性產(chǎn)生內(nèi)源性IL10可能提供更好的免疫治療路徑。受宿主整個(gè)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的內(nèi)源性IL-10的表達(dá)可能提供了獲得功效的合適環(huán)境，而沒(méi)有重復(fù)劑量給藥的需求或細(xì)胞因子毒性的問(wèn)題。此外，細(xì)胞群的選擇性增強(qiáng)可能證明是這種強(qiáng)效細(xì)胞因子理想的遞送系統(tǒng)。全體免疫細(xì)胞所固有的性質(zhì)是在體內(nèi)輸送到炎癥部位的能力。已介由式VI化合物耐受的樹(shù)突細(xì)胞給予特定輸送信號(hào)的免疫細(xì)胞群可能遷往特定部位并局部誘導(dǎo)IL10表達(dá)。這種治療途徑將避免與系統(tǒng)性給藥強(qiáng)效細(xì)胞因子相關(guān)的問(wèn)題，并更好地模擬此免疫調(diào)節(jié)劑天然的局部性的作用。
腹內(nèi)膿腫腹內(nèi)膿腫的形成是結(jié)腸細(xì)菌污染腹腔的結(jié)果。這通常發(fā)生在外傷或外科手術(shù)干預(yù)期間。細(xì)菌刺激強(qiáng)烈的炎性應(yīng)答，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞(PMNs)和淋巴細(xì)胞的募集，以及多種炎性調(diào)節(jié)劑如IL1β、TNFα、TNFβ、IL17還有許多趨化因子的釋放(Whal.等人(1986)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)163884-891；Tzianabos等人(2002)《微生物當(dāng)代意見(jiàn)》(Curr.Opin.Micro.)592-95)。這種應(yīng)答一個(gè)可能的結(jié)果是與沉積的血纖維蛋白交織的多種免疫細(xì)胞對(duì)入侵細(xì)菌的封裝。一旦形成，膿腫相對(duì)地抗抗生素治療，因此患者通常需要外科手術(shù)干預(yù)以排出膿腫。盡管向風(fēng)險(xiǎn)患者給予預(yù)防性抗生素，但這些干預(yù)并非完全成功。經(jīng)由T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和IL10表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)宿主應(yīng)答而預(yù)防膿腫的最初形成的方法代表了更好形式的治療，其能夠成為風(fēng)險(xiǎn)外科手術(shù)操作的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。
術(shù)后粘連術(shù)后粘連是腹部、婦產(chǎn)科、整形外科及心胸外科手術(shù)重大的并發(fā)癥。腹部和盆腔粘連與相當(dāng)高的發(fā)病率有關(guān)，并且可以是致命的。在預(yù)臨床模型中，外源給藥IL10已證明限制粘連的形成(Laan.等人(1999)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1622347-2352；Chung等人(2002)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1951471-1476)。然而，人類醫(yī)學(xué)現(xiàn)有療法旨在中斷外科手術(shù)損害后粘連的形成。這些產(chǎn)品涉及向外科手術(shù)部位引入凝膠或阻隔產(chǎn)品。這些裝置僅取得了有限的成功，這是因感染率增大、缺乏效力所致，因而在醫(yī)學(xué)界中使用率相對(duì)低。急需防止粘連形成的更好的方法。
同通膿腫形成一樣，現(xiàn)有證據(jù)表明粘連的形成也涉及炎性過(guò)程的活化，最突出的是一致的炎性調(diào)節(jié)劑IL17的表達(dá)以及血纖維蛋白和其他基質(zhì)蛋白的沉積?？偠灾@些過(guò)程定義了免疫系統(tǒng)與纖維蛋白原生成及創(chuàng)傷修復(fù)之間獨(dú)特的交叉點(diǎn)。
用作臨床研究生物標(biāo)志的延遲型超敏分析試驗(yàn)考慮到化合物1可能通過(guò)T調(diào)節(jié)細(xì)胞群對(duì)炎性刺激物的應(yīng)答而引發(fā)其保護(hù)效應(yīng)的假說(shuō)，需要建立特異性分析試驗(yàn)以測(cè)量用于臨床研究的這種活性。早期臨床試驗(yàn)典型地采用健康志愿者進(jìn)行安全性和劑量應(yīng)答評(píng)估，一種并非必要地包括特定炎癥病變的誘導(dǎo)或測(cè)量。因此有必要開(kāi)發(fā)替代性的這些化合物活性的生物標(biāo)志。數(shù)十年來(lái)已利用皮膚中的延遲型超敏(DTH)反應(yīng)評(píng)估人對(duì)結(jié)核分枝桿菌(Mycobaterium tuberculosis)(TB)的接觸，并且最近用于確定免疫受損情況下T細(xì)胞應(yīng)答性的狀態(tài)(Anderson等人(1968)《免疫學(xué)》(Immunology)15405-409；Gray等人(1994)《免疫學(xué)當(dāng)代意見(jiàn)》(Curr.Opin.Immunol.)6425-437；Kuby等人(2000)《免疫學(xué)》(Immunology)，W.H.Freeman and Co)。文獻(xiàn)研究業(yè)已證明DTH應(yīng)答主要地是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，并且所述炎癥活性可單獨(dú)通過(guò)DTH T細(xì)胞過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移給幼稚動(dòng)物(Elices等人(1993)《臨床實(shí)驗(yàn)風(fēng)濕病學(xué)》(Clin.Exp.Rheumatol.)11s77-s80)。如本文所公開(kāi)的那樣，已開(kāi)發(fā)了豚鼠DTH模型以評(píng)估式VI的化合物限制皮膚局部化炎性反應(yīng)的能力。DTH應(yīng)答的直觀測(cè)量可容易地在人和豚鼠中觀察和測(cè)量。在皮膚表面可觀察到并容易地定量測(cè)量紅腫、疹塊和/或硬結(jié)。在此分析試驗(yàn)中用于引發(fā)炎性T細(xì)胞活性的抗原來(lái)源于白色念珠菌(Candida albicans)(Candin)，普遍地在臨床上用于測(cè)量經(jīng)歷移植治療或患有AIDs的個(gè)體的免疫全能性。也認(rèn)為對(duì)于一般人群而言，此抗原比TB抗原更安全。因?yàn)槲墨I(xiàn)中業(yè)已報(bào)道CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞是針對(duì)白色念珠菌的記憶和保護(hù)性免疫性的重要組分(Montagnoli等人(2002)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1696298-6308)，這些結(jié)果將為式VI化合物的保護(hù)性效果來(lái)源于T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性提供進(jìn)一步的證據(jù)。
式VI的合成多糖抗原的作用機(jī)制T調(diào)節(jié)細(xì)胞假說(shuō)下文公開(kāi)的是關(guān)于免疫調(diào)劑分子如合成多糖抗原化合物1在哺乳動(dòng)物中指導(dǎo)和引發(fā)抗炎效果，包括誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞群的機(jī)制的詳細(xì)研究。根據(jù)這些結(jié)果，得到了如下總結(jié)于圖2中的附圖。
如圖2所示，以化合物1為例的式VI的合成免疫調(diào)節(jié)多糖抗原抑制樹(shù)突細(xì)胞成熟。未成熟(iDCs)表達(dá)低水平的CD80和CD86共刺激分子。在這種狀態(tài)下，iDCs具有與幼稚T細(xì)胞相互作用以及誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞(路徑B)的獨(dú)特能力。在面對(duì)炎性炎性應(yīng)答時(shí)，T調(diào)節(jié)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸與效應(yīng)T細(xì)胞相互作用，并抑制這些T炎性效應(yīng)細(xì)胞的增殖能力。此外，T調(diào)節(jié)細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞之間的接觸使得效應(yīng)細(xì)胞無(wú)能，并刺激這些細(xì)胞表達(dá)大量IL10。在所述炎性T效應(yīng)細(xì)胞中引發(fā)IL10表達(dá)起到放大直接的T調(diào)節(jié)細(xì)胞接觸的抑制效果的作用，并擴(kuò)大了對(duì)進(jìn)行中的炎性過(guò)程的防御。由本發(fā)明研究人員觀察到的樹(shù)突細(xì)胞成熟的抑制也能夠因兩類細(xì)胞之間同源性相互作用的缺乏而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增(路徑A)。然而，本文提供的數(shù)據(jù)更引入注目地支持了這樣的假說(shuō)，即T調(diào)節(jié)細(xì)胞最終是由本發(fā)明式VI的合成多糖抗原產(chǎn)生的，并提供了抗炎性病變的保護(hù)。
式V的合成多糖抗原的作用機(jī)制炎癥假說(shuō)以化合物2為例的式V的化合物似乎刺激炎性應(yīng)答，如通過(guò)TNF-α的產(chǎn)生所證明的那樣?；衔?可能以類似于完整細(xì)菌或細(xì)菌細(xì)胞壁抗原的方式與免疫細(xì)胞相互作用，最有可能是通過(guò)TLR2的活化。在這種情況下，式V的化合物與TLR2攜帶細(xì)胞之間的相互作用刺激特征性炎癥標(biāo)志。這將表明炎性細(xì)胞將開(kāi)始活動(dòng)，正如檢測(cè)到入侵病原體之后的情況那樣。這些概念總結(jié)于圖8之中。
藥物組合物及其配制取決于它們的結(jié)構(gòu)，本文公開(kāi)的式I的化合物可用于預(yù)防或治療炎性病變，或用于誘導(dǎo)與不同疾病狀態(tài)或狀況有關(guān)的炎癥，其中這種炎癥為人或其他動(dòng)物提供了有益的治療或預(yù)防效果。從而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了人用及獸醫(yī)用的藥物組合物，其包含式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，連同藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的緩沖劑、載體、賦形劑或稀釋劑，以及任選地，其他治療劑。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的化合物可單獨(dú)或者以包含兩個(gè)或多個(gè)化合物的混合物形式給藥。本發(fā)明也涵蓋式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽制備用于預(yù)防或治療炎性病變、或者其中炎性免疫應(yīng)答有益的疾病狀態(tài)或狀況的用途。用于這些用途的具有式V或VI的化合物的選擇取決于治療目的期望哪類免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的化合物可以藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的溶液的形式給藥，其可以含有藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容載體、賦形劑、分散劑等，以及任選地，其他治療成分。本文公開(kāi)的化合物1在中性pH下在水中可溶性達(dá)大約20mg/mL。此外，該化合物的水溶液可提供低(大約0.5到大約5)重量百分比的甘油、蔗糖及其他藥學(xué)上可接受的賦形劑物質(zhì)。因而本文公開(kāi)的化合物1及本發(fā)明的其他化合物可配制為多種標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)上可接受的腸胃外制劑。
凈電荷和聚集本發(fā)明的平衡電荷兩性離子分子每個(gè)重復(fù)單元具有等數(shù)目的正負(fù)電荷，隨著時(shí)間可以彼此聚集和/或由于電荷-電荷引力而發(fā)生分子內(nèi)壓縮。本文公開(kāi)的化合物1是代表性的平衡電荷兩性離子分子，如下文所示，其表現(xiàn)出期望的抗炎活性。藥物組合物中這類分子抗炎免疫調(diào)節(jié)活性隨著時(shí)間的保持可通過(guò)最小化聚集的配制技術(shù)優(yōu)化，例如納入表面活性劑或分散劑，如聚乙二醇、甘油、蔗糖等。
最好是，本發(fā)明的線形高分子因其肽部分保持電荷-電荷排斥，在生理pH下每個(gè)重復(fù)單元具有凈的正電荷或負(fù)電荷。這類分子因此表現(xiàn)出理想的溶液行為，即具有最低分子內(nèi)或分子間聚集的長(zhǎng)期溶液狀態(tài)，這些事件可隨著時(shí)間減小免疫學(xué)活性，特別是在低離子強(qiáng)度尤為如此。因此，每個(gè)重復(fù)單元具有凈的正電荷或負(fù)電荷的本發(fā)明的分子將表現(xiàn)得同聚合電解質(zhì)一樣，并具有表現(xiàn)出增強(qiáng)的溶解從而是貯存行為的優(yōu)勢(shì)。已經(jīng)直接通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)觀察到了聚(2-乙烯基吡啶)的聚合電解質(zhì)電荷-電荷排斥現(xiàn)象(Minko等人(2002)《美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Chem.Soc.)1243218)。此外，每個(gè)重復(fù)單元表現(xiàn)出凈的正電荷或負(fù)電荷的式V和VI的合成多糖抗原的免疫調(diào)節(jié)活性通過(guò)分子內(nèi)和分子間電荷-電荷排斥力得以顯著增大，這些排斥力防止這些分子聚集，促進(jìn)其結(jié)構(gòu)特征正確展示在細(xì)胞受體上。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有有效量的本發(fā)明公開(kāi)的化合物，任選地包含在藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的緩沖劑、載體、賦形劑或稀釋劑之中。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的緩沖劑、載體、賦形劑或稀釋劑”是指一個(gè)或多個(gè)相容的固體或液體填料、稀釋物質(zhì)或示于給予人或其他動(dòng)物的封裝物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“載體”表示自然或合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)成分，活性成分與之一起混合以易化應(yīng)用。藥物組合物的成分能夠與本發(fā)明的聚合物、以及與藥物組合物成分相互混合，從而不存在將會(huì)在實(shí)質(zhì)上削弱活性化合物期望的藥效的相互作用。
適于腸胃外給藥的組合物便利地包含無(wú)菌水制品，它們可以與受體血液等滲。在可接受的賦形劑和溶劑中，有水、林格氏溶液以及等滲氯化鈉溶液。另外，可便利地采用無(wú)菌不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可采用任何品牌的不揮發(fā)油，包括合成的單甘油酯或雙甘油酯。另外，脂肪酸如油酸可用于制備注射劑、適合于皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)脈內(nèi)等給藥的載體制劑可見(jiàn)于RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，(1995)。
組合物可便利地以單位劑量或劑量單位的形式提供，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備。所有方法包括使化合物與構(gòu)成一種或多種配合劑的載體結(jié)合的步驟。一般而言，組合物通過(guò)使化合物與液體載體、精細(xì)分離的固體載體或兩者均一密實(shí)地結(jié)合的步驟，然后，如果必要，使產(chǎn)品成形。本發(fā)明的化合物可以凍干貯存。
其他遞送系統(tǒng)可包括定時(shí)釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)。此類系統(tǒng)可避免重復(fù)給藥抗炎或致炎劑，增加受試者和醫(yī)師的方便。許多類型的釋放遞送系統(tǒng)可利用，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，包括基于聚合物的系統(tǒng)如聚(丙交酯-乙交酯)(poly(lactide-glycolide))、共聚草酸鹽(copolyoxalates)、聚己酸內(nèi)酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羥基丁酸和聚酸酐。
例如，含藥物的前述聚合物的微膠囊描述在美國(guó)專利5,075,109中。遞送系統(tǒng)液包括非聚合物系統(tǒng)如脂質(zhì)，包括固醇類如膽固醇、膽甾醇酯、以及脂肪酸或中性脂肪如單甘油酯、雙甘油酯和三甘油酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠系統(tǒng)；基于肽的系統(tǒng)；蠟質(zhì)包衣；使用常規(guī)膠粘劑和賦形劑壓制的片劑；部分融合的植入體；等等。具體實(shí)例包括但不限于(a)侵蝕系統(tǒng)，其中本發(fā)明的試劑以處于如美國(guó)專利4,452,775、4,675,189和5,736,152,所述的基質(zhì)內(nèi)的形式包含在內(nèi)，和(b)擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活性成分以可調(diào)速率自如美國(guó)專利3,854,480、5,133,974和5,407,686所述的聚合物中滲透。另外，也可以使用基于泵的硬件遞送系統(tǒng)，其中一些適合于植入。
本發(fā)明涵蓋包含與抗細(xì)菌劑或其他治療劑、以及藥學(xué)上可接受的緩沖劑、載體、賦形劑或稀釋劑聯(lián)合的本發(fā)明所述免疫調(diào)節(jié)聚合物的藥物組合物。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)聚合物可與其他抗細(xì)菌抗生素藥物分開(kāi)遞送，或者以抗細(xì)菌抗生素混合物的形式遞送?？辜?xì)菌抗生素混合物是本發(fā)明分子與抗細(xì)菌抗生素藥物和/或輔助增效劑的混合物。抗生素在細(xì)菌感染治療中的使用是本領(lǐng)域常規(guī)的。在這個(gè)實(shí)施方案中，常見(jiàn)給藥載體(如片劑、植入物、注射液等)可含有天然或合成多糖抗原和抗細(xì)菌抗生素藥物和/或輔助增效劑。備選地，抗細(xì)菌抗生素藥物可分開(kāi)劑量給藥。
可用于本發(fā)明的抗細(xì)菌抗生素藥物的非限制性實(shí)例包括青霉素G、青霉素V、氨芐青霉素、arnoxicillin、巴氨西林、環(huán)西林、依匹西林、海他西林、匹氨西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、羧芐西林、羧噻吩青霉素、avlocillin、美洛西林、哌拉西林、氮卓西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢呋肟酯、頭孢羥唑、頭孢羥芐磺唑、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢唑肟、cefmenoxine、頭孢曲松、moxalactarn、頭孢替坦、頭孢哌酮、ceftazidme、亞胺培南、克拉維酸、特美汀、舒巴坦、新霉素、奧利萬(wàn)星、紅霉素、甲硝唑、氯霉素、克林霉素、林可霉素、萬(wàn)古霉素、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲基異噁唑、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類和利福平。這方面請(qǐng)見(jiàn)Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，Hardman等人編，McGraw-Hill，New York，(1996)。與本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)聚合物聯(lián)合使用的治療劑的精確含量將取決于多種因素，包括聚合物本身、劑量和所選的劑量給藥時(shí)間、給藥方式、可予以考慮的任何外科手術(shù)的性質(zhì)、以及受試者的某些特征。當(dāng)進(jìn)行局部給藥時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解可能需要極小的量(納克或者可能是皮克)。所選的精確含量可無(wú)需過(guò)度試驗(yàn)確定，特別地是因?yàn)殚撝盗繉⑹怯欣卮龠M(jìn)期望的免疫應(yīng)答的任何含量。范圍在大約1皮克到大約1毫克的劑量可能是有效的，取決于遞送方式；范圍在大約1納克到大約1微克可能也是有用的。
劑量給藥、治療方案以及給藥適當(dāng)選擇的本發(fā)明的化合物可以這樣的有效量給藥，即誘導(dǎo)防御多種多樣的不同以炎癥為基礎(chǔ)的病變的有效量，所述病變包括術(shù)后粘連和與細(xì)菌感染相關(guān)的腹內(nèi)膿腫，或者誘導(dǎo)與各種疾病狀態(tài)或紊亂相關(guān)的炎癥的有效量，其中這種炎癥提供了有益的治療或預(yù)防效果。為此目的，有效量是本發(fā)明的抗炎或炎性化合物單獨(dú)或與其他劑量或附加的治療化合物一起時(shí)，將分別抑制、緩解或預(yù)防以炎癥為基礎(chǔ)的病變，或者刺激治療有益的炎性應(yīng)答的量。劑量范圍可以從大約1皮克/千克體重到大約1毫克/千克體重，或者從大約1納克/千克體重到大約1微克/千克體重。絕對(duì)量將取決于多種因素，包括待治療疾病或紊亂的性質(zhì)、給藥是否與所選的外科手術(shù)或急診相結(jié)合、協(xié)同治療、劑量給藥次數(shù)、個(gè)體患者參數(shù)包括年齡、身體條件、身高和體重、以及待治療疾病或紊亂的嚴(yán)重度，并且可由開(kāi)業(yè)醫(yī)生僅以常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。通常優(yōu)選使用最大劑量，即根據(jù)可靠醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。多劑量的本發(fā)明的藥物組合物也考慮在內(nèi)。
待給予需要預(yù)防或治療以炎癥為基礎(chǔ)的病變、或者得益于免疫系統(tǒng)刺激的疾病或紊亂的人或動(dòng)物患者的化合物的最佳量的確定，以及給藥包含此類化合物的治療劑或藥物組合物的方法落在藥學(xué)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。人或動(dòng)物患者的劑量給藥取決于以炎癥為基礎(chǔ)的病變或待治療的其他疾病或紊亂的性質(zhì)、患者的病情、體重、總體健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、周期和路徑、吸收率、化合物的分布、代謝和排泄、于其他藥物的聯(lián)合、以炎癥為基礎(chǔ)的病變或待治療的其他疾病或紊亂的嚴(yán)重度、以及所治療病變或疾病狀態(tài)的響應(yīng)，并且可容易地進(jìn)行優(yōu)化以獲得期望水平的效率。治療過(guò)程可持續(xù)數(shù)天到數(shù)周或數(shù)月，或者直到實(shí)現(xiàn)治愈，或者實(shí)現(xiàn)了疾病可接受的減輕或預(yù)防。最佳給藥方案可由患者體內(nèi)藥物累積的測(cè)量值結(jié)合治療效率來(lái)計(jì)算。普通技術(shù)人員能夠容易地確定最佳劑量、給藥方法學(xué)以及重復(fù)率。最佳劑量可根據(jù)免疫調(diào)節(jié)聚合化合物的效率而變，并且通?？梢曰谠隗w外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的ED50值估計(jì)。用于治療或預(yù)防以炎癥為基礎(chǔ)的病變或待治療的其他疾病或紊亂的本發(fā)明化合物的有效量、含這些化合物、激動(dòng)劑的遞送載體、以及治療方案可通過(guò)常規(guī)手段確定。例如，醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)從業(yè)者能夠以低劑量的化合物開(kāi)始對(duì)需要其的個(gè)體或患者進(jìn)行治療，然后增大劑量，或者系統(tǒng)性地改變劑量方案、監(jiān)測(cè)其對(duì)患者或個(gè)體的效果，并調(diào)整劑量或治療方案，以最大化期望的療效。劑量和治療方案有關(guān)的更多討論可參見(jiàn)Benet等人，Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，Hardman等人編，McGraw-Hill，New York，(1996)，第1章，第3-27頁(yè)，以及L.A.Bauer，Pharmacotherapy，A Pathophysiologic Approach，第4版，DiPiro等人編，Appleton & Lange，Stamford，Connecticut，(1999)，第3章，第21-43頁(yè)，以及其中所引述的參考文獻(xiàn)，讀者可以此作為參考。
多種給藥路徑可利用。所選的特定方式將取決于選取哪一種化合物，待治療的特定病情，以及療效所需的劑量。一般而言，本發(fā)明的方法可利用醫(yī)學(xué)上可接受的任何給藥方式實(shí)施，也就是產(chǎn)生有效水平的免疫應(yīng)答而不會(huì)導(dǎo)致臨床上無(wú)法接受的不利作用。優(yōu)選的給藥方式為腸胃外路徑，盡管也可以采用口服給藥。術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射或者輸注技術(shù)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“治療”、“治療用途”或“治療方案”在文中旨在涵蓋本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)聚合物的預(yù)防、緩解性以及治療性的給藥方式，并且包括本發(fā)明所主張化合物的任何和所有的用途，包括治療由以炎癥為基礎(chǔ)的病變或待治療的其他疾病或紊亂所致的疾病狀態(tài)、病情、癥狀、跡象或紊亂，或者預(yù)防、阻礙、延遲或逆轉(zhuǎn)與之相關(guān)的癥狀、跡象、病情或紊亂的進(jìn)程。從而，本發(fā)明涵蓋不良的與以炎癥為基礎(chǔ)的病變、或者得益于機(jī)體免疫應(yīng)答刺激的疾病或紊亂相關(guān)的疾病狀態(tài)、癥狀、病情、跡象或紊亂的任何預(yù)防、緩解、減輕、逆轉(zhuǎn)或完全消除。
特定的治療方案可持續(xù)一定時(shí)期，這可能取決于特定的以炎癥為基礎(chǔ)的病變或待治療的其他疾病或紊亂的性質(zhì)、其嚴(yán)重度以及患者的總體情況，并且可能包括每日一次或數(shù)次給藥含化合物的組合物數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或更長(zhǎng)時(shí)間。在治療之后，監(jiān)測(cè)患者病情的變化、以及紊亂或疾病狀態(tài)癥狀、跡象或情況的減輕。組合物的劑量可在患者對(duì)當(dāng)前劑量水平不顯著應(yīng)答的情況下增大，或者如果觀察到紊亂或疾病癥狀的減輕，或者紊亂或疾病已經(jīng)消除，則可降低劑量。
使用最佳給藥方案遞送治療有效量的本發(fā)明的化合物。為了本發(fā)明的目的，就本文公開(kāi)的化合物而言的術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”是指化合物有效地實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量，優(yōu)選沒(méi)有不良的副作用如毒性、刺激或過(guò)敏反應(yīng)。盡管個(gè)體患者的需要可能有變，但有效量藥物組合物的最佳范圍的確定落在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。人類劑量可由動(dòng)物研究反推(A.S.Katocs，RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，(1995)，第30章)。通常，為提供治療有效量的藥物組合物所需的劑量，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員調(diào)整，將取決于年齡、健康、身體情況、體重、受體疾病或紊亂的類型和程度、治療頻率、協(xié)同治療的性質(zhì)(如果有的話)、以及期望效果的性質(zhì)和范圍(Nies等人，Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，Hardman等人編，McGraw-Hill，New York，N.Y.，1996，第3章)。
高危個(gè)體預(yù)防療法也涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高危個(gè)體”是指已經(jīng)介由例如個(gè)體或家族病史或遺傳試驗(yàn)、生活或工作環(huán)境或病情等確定存在比正常概率顯著更高的容易受到以炎癥為基礎(chǔ)的病變、或相關(guān)疾病或紊亂的發(fā)作或復(fù)發(fā)、或?qū)⒌靡嬗跈C(jī)體免疫應(yīng)答刺激的疾病/紊亂的影響。例如，患者可能具有包括特定疾病或紊亂頻繁復(fù)發(fā)的個(gè)人和/或家族病史。作為另一個(gè)實(shí)例，患者這樣的易感性可能是通過(guò)按照本領(lǐng)域公知技術(shù)的遺傳曬查確定的(參見(jiàn)如美國(guó)國(guó)會(huì)技術(shù)評(píng)定局Genetic Monitoring andScreening in the Workplace，OTA-BA-455，第5章，U.S.GovernmentPrinting Office，Washington，D.C.，1990，第75-99頁(yè))。在病毒病的情況下，環(huán)境可能是誘病因素。作為高危給體治療方案的一部分，可預(yù)防性地治療個(gè)體以預(yù)防以炎癥為基礎(chǔ)的病變，或疾病、紊亂、跡象、癥狀或病情的發(fā)作或復(fù)發(fā)，或?qū)⒌靡嬗谠鰪?qiáng)的免疫應(yīng)答的疾病或紊亂。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防有效量”是指觀察到本發(fā)明藥物組合物產(chǎn)生效果的量，其中效果為預(yù)防感染或炎癥，或炎性疾病、癥狀、跡象、病情或紊亂的發(fā)作或復(fù)發(fā)，或者得益于機(jī)體免疫應(yīng)答刺激的疾病/紊亂。預(yù)防有效量的藥物組合物典型地是通過(guò)與當(dāng)下過(guò)那類似情況的個(gè)體給藥缺乏活性劑的第二藥物組合物時(shí)所觀察到的效果相比時(shí)其所具有的效果確定的。
對(duì)于治療用途，可以有效降低疾病癥候?qū)W、癥狀、跡象、病情或紊亂的量向懷疑患有以炎癥為基礎(chǔ)的病變或者患有將得益于增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的疾病或紊亂的患者給藥本文公開(kāi)的免疫抑制化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)常規(guī)方法確定用于這類治療的最佳劑量和治療方案。
在外科手術(shù)或外傷相關(guān)的膿腫和粘連的情況下，本發(fā)明的方法可通過(guò)在外科手術(shù)之前為期三周的時(shí)間內(nèi)、在外科手術(shù)之前為期兩周的時(shí)間內(nèi)、在外科手術(shù)之前為期一周的時(shí)間內(nèi)給藥多劑量實(shí)現(xiàn)，其中首劑量?jī)H在外科手術(shù)之前24小時(shí)給藥，并且甚至是在接觸細(xì)菌之后給予。還可以在外科手術(shù)之后給予另外的劑量?？墒褂萌魏螌?dǎo)致增強(qiáng)針對(duì)細(xì)菌感染/污染以及后續(xù)膿腫/粘連形成的免疫應(yīng)答的方案，盡管最佳劑量和給藥方案是不僅抑制膿腫和/或粘連形成、而且導(dǎo)致完全防御由特定菌體或多種菌體所致的膿腫或粘連形成的那些方案。遞送多劑量特定聚合物的期望的時(shí)間間隔可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅僅采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
從而，只要期望預(yù)防人或動(dòng)物個(gè)體細(xì)菌性膿腫或粘連的形成，本發(fā)明是可用的。這包括預(yù)防性治療以在規(guī)劃的外科手術(shù)操作中以及急診情況下預(yù)防這類病情。所選的外科手術(shù)包括如下腹內(nèi)外科手術(shù)右半結(jié)腸切除術(shù)、左半結(jié)腸切除術(shù)、乙狀結(jié)腸切除術(shù)、結(jié)腸次全切除術(shù)、全結(jié)腸切除術(shù)、腹腔鏡檢或開(kāi)腹膽囊切除術(shù)、胃切除術(shù)、剖腹產(chǎn)術(shù)等。急診手術(shù)包括矯正如下病情的手術(shù)穿孔性潰瘍(十二指腸或胃)、穿孔性憩室炎、梗阻性憩室炎、急性闌尾炎、穿孔性闌尾炎、腹部鈍器傷、腹部銳器傷、排出膿腫的二次手術(shù)等。本發(fā)明的方法涵蓋馬科動(dòng)物的結(jié)腸外科手術(shù)，伴侶動(dòng)物任何類型的外科手術(shù)，例如常規(guī)消毒、腸胃侵入式操作等。本發(fā)明的方法也可用于非腹內(nèi)外科手術(shù)，如心臟外科手術(shù)和矯正創(chuàng)傷感染的外科手術(shù)。本方法也可用于與易使個(gè)體形成膿腫如盆腔炎癥性疾病、炎性腸病、泌尿道感染和結(jié)腸癌有關(guān)的疾病。本方法因此可用于幾乎任何組織或器官的膿腫，具體包括但不限于真皮膿腫如痤瘡。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到本發(fā)明適用的病情和操作的范圍。
在另一方面，本發(fā)明包括誘導(dǎo)防御與許多常見(jiàn)類型的外科手術(shù)相關(guān)的術(shù)后外科手術(shù)粘連形成的方法。該方法包括向需要這種保護(hù)的個(gè)體給藥含有效量降低術(shù)后外科手術(shù)粘連形成的本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)聚合物的藥物制劑的步驟。完全可以預(yù)期在不同于手術(shù)部位的部位上給藥一種或多種這樣的聚合物將有效地誘導(dǎo)抗術(shù)后外科手術(shù)粘連形成的保護(hù)。如上文所討論的那樣，考慮到以前的觀察結(jié)果，這特別令人驚訝。
PCT國(guó)際公開(kāi)WO 00/59515教導(dǎo)向外科手術(shù)部位局部給藥某些聚合物可有效降低術(shù)后外科手術(shù)粘連的發(fā)生率。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在遠(yuǎn)離粘連有可能發(fā)生的外科手術(shù)部位的地方皮下給予免疫調(diào)節(jié)聚合物時(shí)是有效的。
可以給藥誘導(dǎo)防御術(shù)后外科手術(shù)粘連形成有效量的本發(fā)明公開(kāi)的化合物。此處所用的誘導(dǎo)防御術(shù)后外科手術(shù)粘連形成的有效量是本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)聚合物單獨(dú)或與其他劑量或附加治療化合物一起時(shí)將抑制或預(yù)防形成術(shù)后外科手術(shù)粘連的量。相信劑量范圍從大約1皮克/千克體重到大約1毫克/千克體重、或者從大約1納克/千克體重到大約微克/千克體重將是有效的，這取決于給藥方式。絕對(duì)量將取決于多種因素(包括給藥是否結(jié)合所選的外科手術(shù)或急診外科手術(shù)、協(xié)同治療、劑量給藥次數(shù)、以及個(gè)體患者參數(shù)，包括年齡、身體狀況、身高和體重)，并且可以經(jīng)由常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。通常優(yōu)選使用最大劑量，即依據(jù)可靠醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。
考慮多劑量的本發(fā)明的藥物組合物用于誘導(dǎo)防御術(shù)后外科手術(shù)粘連的形成。這樣的多劑量可以自外科手術(shù)前一天開(kāi)始為期三周的時(shí)間內(nèi)給藥。還可以在外科手術(shù)之后給予另外的劑量?？墒褂萌魏螌?dǎo)致降低術(shù)后外科粘連形成的方案，盡管最佳劑量和給藥方案是不僅抑制術(shù)后外科粘連形成的發(fā)展、而且導(dǎo)致完全防御術(shù)后外科粘連形成的那些方案。遞送多劑量的本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)聚合物之一的期望的時(shí)間間隔可由本領(lǐng)域普通技術(shù)僅僅采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
從而，無(wú)論何時(shí)期望預(yù)防人或動(dòng)物個(gè)體術(shù)后外科粘連的形成，本發(fā)明是可用的。這包括預(yù)防性治療以在規(guī)劃的外科手術(shù)操作之后以及急診手術(shù)之后預(yù)防粘連形成。所選的外科手術(shù)包括如下腹內(nèi)外科手術(shù)右半結(jié)腸切除術(shù)、左半結(jié)腸切除術(shù)、乙狀結(jié)腸切除術(shù)、結(jié)腸次全切除術(shù)、全結(jié)腸切除術(shù)、腹腔鏡檢或開(kāi)腹膽囊切除術(shù)、胃切除術(shù)、胰臟切除術(shù)、脾切除術(shù)、肝臟、胰臟、小腸或腎移植、粘連松解術(shù)等。急診腹內(nèi)外科手術(shù)包括矯正如下病情的手術(shù)穿孔性潰瘍(十二指腸或胃)、穿孔性憩室炎、梗阻性憩室炎、腸梗阻、急性闌尾炎、穿孔性闌尾炎、腹部鈍器傷、腹部銳器傷、排出膿腫的二次手術(shù)、腹主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤破裂等。本發(fā)明的方法涵蓋馬科動(dòng)物的結(jié)腸外科手術(shù)，伴侶動(dòng)物任何類型的外科手術(shù)，例如常規(guī)消毒、腸胃侵入式操作等。本發(fā)明的方法也可用于非腹內(nèi)外科手術(shù)的情況下，如心臟外科手術(shù)、開(kāi)腹和內(nèi)窺鏡矯形外科手術(shù)、神經(jīng)外科手術(shù)、婦產(chǎn)科手術(shù)、盆腔手術(shù)和矯正創(chuàng)傷感染的外科手術(shù)。本方法也可用于與易使個(gè)體自發(fā)形成粘連如盆腔炎癥性疾病、炎性腸病、泌尿道感染和結(jié)腸癌有關(guān)的疾病。本方法因此可用于幾乎任何組織或器官的炎性過(guò)程。
當(dāng)給藥異預(yù)防術(shù)后外科粘連形成時(shí)，本發(fā)明的化合物可以在遠(yuǎn)離手術(shù)部位的地方包括系統(tǒng)性地給藥，或者局部給藥到期望降低術(shù)后外科粘連形成的可能性的手術(shù)部位。本發(fā)明的化合物可作為水溶液、作為交聯(lián)凝膠、或作為水溶液和交聯(lián)凝膠形式的任何瞬間或物理上的聯(lián)合給藥。
本發(fā)明的制劑可與感染“結(jié)合”給藥，表示在時(shí)間上與導(dǎo)致宿主膿腫或粘連形成的外科手術(shù)、外傷或疾病足夠接近，從而獲得抗膿腫或粘連的保護(hù)性效果。在選取外科手術(shù)的情況下，制劑可在外科手術(shù)之前很長(zhǎng)時(shí)間給藥(即數(shù)周或者甚至數(shù)月)，優(yōu)選在接近于外科手術(shù)的時(shí)間(以及，甚至是手術(shù)之后)加強(qiáng)給藥。特別地在急診情況下，制劑可在外傷或外科手術(shù)前即刻(數(shù)分到數(shù)小時(shí))和/或之后給藥。唯一重要的是制劑給藥在時(shí)間上與外科手術(shù)足夠接近，從而增強(qiáng)個(gè)體抗細(xì)菌感染/污染的免疫應(yīng)答，由此提高成功宿主應(yīng)答的幾率并降低膿腫或粘連形成的可能性。
本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可應(yīng)用于廣大范圍的疾病、癥狀、病情、跡象、紊亂和操作。除了膿腫和粘連，本發(fā)明式VI的抗炎化合物、組合物和方法能夠適用的其他炎性過(guò)程和病變包括變應(yīng)性疾病如(全身性)過(guò)敏反應(yīng)、血清病、全身性藥物反應(yīng)、食物變態(tài)反應(yīng)、昆蟲(chóng)毒液變態(tài)反應(yīng)和肥大細(xì)胞增生??；氣道變態(tài)反應(yīng)如過(guò)敏性鼻炎、哮喘和超敏性肺炎；皮膚變應(yīng)性如蕁麻疹、血管性水腫、濕疹、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性接觸性皮炎、傳染性皮炎、多形性紅斑及斯-約二氏綜合征(Stevens-Johnson syndrome)；以及眼變態(tài)反應(yīng)性如變應(yīng)性結(jié)膜炎、特應(yīng)性角膜結(jié)膜炎、性病角膜結(jié)膜炎、巨乳頭性結(jié)膜炎以及接觸性變態(tài)反應(yīng)。
器官特異性自身免疫病如內(nèi)分泌系統(tǒng)(甲狀腺)Hashimoto氏甲狀腺炎、格雷夫斯病、伴隨甲狀腺功能亢進(jìn)的甲狀腺炎；I型自身免疫性多腺體綜合征、II型自身免疫性多腺體綜合征、胰島素依賴型糖尿病、免疫介導(dǎo)的不育癥以及自身免疫性青銅色皮病。
皮膚尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、副腫瘤性天皰瘡、大皰性類天皰瘡(bullus pemphigoid)、皰疹樣皮炎、線形IgA大皰病獲得性大皰性表皮松解癥、自身免疫性禿發(fā)癥、結(jié)節(jié)性紅斑、妊娠性類天皰瘡、疤痕性類天皰瘡以及慢性兒童大皰病。
血液系統(tǒng)自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜(特發(fā)性以及藥物相關(guān)的)和自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥。
神經(jīng)肌肉系統(tǒng)重癥肌無(wú)力、伊頓-蘭姆博特二氏重癥肌無(wú)力綜合征、強(qiáng)直人綜合征、急性播散性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化癥、格林-巴利綜合征、慢性脫髓鞘性神經(jīng)炎、多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病、伴隨傳導(dǎo)阻滯的多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病以及伴隨單克隆丙種球蛋白病的慢性神經(jīng)病。
副腫瘤性神經(jīng)紊亂眼陣攣-肌陣攣綜合征、小腦變性、腦脊髓炎、視網(wǎng)膜病變。
肝膽管系統(tǒng)自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、原發(fā)性膽管纖維硬化以及硬化性膽管炎。
胃腸道谷蛋白敏感性腸病、惡性貧血以及炎性腸病。
器官非特異性自身免疫病如結(jié)締組織疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性硬化癥(硬皮病)、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、干燥綜合癥(Sjgren’s syndrome)、混合性結(jié)締組織病、貝切特氏綜合癥以及銀屑病。
血管炎綜合征系統(tǒng)性壞死性血管炎，包括經(jīng)典的結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、過(guò)敏性脈管炎和肉芽腫病(Churg-Strauss氏病)以及多脈管炎重疊綜合征；高敏感性脈管炎，Wegener氏肉芽腫病，顳動(dòng)脈炎，Takayasu動(dòng)脈炎，Kawasaki病，孤立性中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎，血栓閉塞性脈管炎以及各種血管炎；肉狀瘤病，移植物抗宿主病和寒冷病。
本發(fā)明的抗炎化合物可用的其他疾病和病情包括敗血??；大腸炎；冠狀動(dòng)脈疾?。桓卫w維化；急性呼吸窘迫綜合征；急性炎性胰腺炎；內(nèi)窺鏡逆行膽管胰造影術(shù)誘導(dǎo)的胰腺炎；胰腺炎；燒傷；冠狀、腦及外周動(dòng)脈粥樣化形成；闌尾炎；膽囊炎憩室炎；內(nèi)臟纖維變性紊亂(肝、肺、腸)；創(chuàng)傷愈合；皮膚瘢痕形成紊亂(瘢痕瘤、化膿性汗腺炎)；肉芽腫紊亂(肉狀瘤病、原發(fā)性膽汁性肝硬變)；壞疽性膿皮癥；急性發(fā)熱性中性白細(xì)胞增多性皮病性膿皮??；細(xì)胞、組織或器官移植；阿爾茨海默氏?。慌两鹕喜?；動(dòng)脈粥樣硬化；肥胖癥和癌癥。
式V的炎性化合物、其組合物以及采用這些化合物和組合物的方法可適用的疾病和病變包括抗病毒治療，例如治療或預(yù)防乙肝病毒和丙肝病毒感染；抗癌治療；以及作為疫苗佐劑使用。
前述說(shuō)明提供了本發(fā)明許多方面的綜述。如下實(shí)施例闡釋了其各個(gè)方面，但它們并不旨在也不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1式I化合物的常規(guī)制備例如，可通過(guò)聚合式IV的脂質(zhì)II底物制備式I的化合物 式IV其中R5是脂質(zhì)載體，其他變量如本文所述。例如，合適的脂質(zhì)載體包括具有一個(gè)以上碳的飽和的和不飽和的烴鏈。鏈可以是直鏈的或支鏈的。烴也可以是取代的(例如，全氟化的)或者非取代的。優(yōu)選地，烴鏈含有5到55個(gè)碳以及1到11個(gè)異戊二烯單元，更優(yōu)選含25到55個(gè)碳以及5到11個(gè)異戊二烯單元，最優(yōu)選含40到55個(gè)碳以及8到11個(gè)異戊二烯單元。例如，可根據(jù)WO 01/79242A3、WO 02/085929 A1和US 6,461,829中所描述的方法制備式IV的脂質(zhì)II底物。例如，可根據(jù)文中所述的方法，采用單功能的轉(zhuǎn)糖基酶MgtA或者采用美國(guó)專利6,461,829中所描述的單或雙功能的轉(zhuǎn)糖基酶聚合脂質(zhì)II底物來(lái)生產(chǎn)式I的化合物。
式I均聚物的制備常規(guī)方法制備如文中所述式IV的脂質(zhì)II底物分子的20nM貯液。將PEG 8000(作為溶于水的50％貯液)用水稀釋到大約20％(w/w)。向PEG溶液中添加pH 7.0的0.5M HEPES、1M水性氯化鎂和脂質(zhì)II底物，終濃度分別達(dá)到20mM、25mM和2mM。通過(guò)徹底混合使得到的溶液均質(zhì)化。通過(guò)添加約120μM的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MtgA酶貯液引發(fā)反應(yīng)，從而終摩爾酶濃度是10μM(約200∶1＝底物∶酶)。將反應(yīng)液充分混合并使其靜置24小時(shí)。
在水性HCl中使反應(yīng)混合物調(diào)至約0.5M。添加酸后，系統(tǒng)變得均質(zhì)化。將水性酸液在37℃孵育4小時(shí)，其后用5M水性NaOH將溶液中和到pH為7-8。在接近pH7的點(diǎn)，均質(zhì)的溶液變得混濁。將混濁的溶液離心(1700xg，20分鐘)。沉淀用水沖洗并匯集上清液。添加5M水性NaOH使終濃度為0.5M。在室溫下使該溶液靜置2小時(shí)，然后用5M水性HCl中和到pH為7，在該點(diǎn)上溶液變得混濁。將混濁的溶液離心(1700xg，20分鐘)。沉淀用水沖洗并匯集上清液，用水2x稀釋并用氯仿抽提直到無(wú)PEG(Nag等.(1996)《生物化學(xué)分析》(Anal Biochem.)237224)。將輕微乳化的水層離心(1700xg，20分鐘)并取出澄清的水層。將最終的水溶液置于Amicon攪動(dòng)的細(xì)胞濃縮器中(10K NMWCO再生纖維素)，進(jìn)行濃縮/稀釋循環(huán)直到流出物電導(dǎo)接近零。然后將溶液盡可能濃縮，通過(guò)Millipore Steriflip過(guò)濾器(0.2μ)過(guò)濾，通過(guò)大小排阻層析(206nm處的UV吸收)估計(jì)式I化合物的濃度。
式I共聚物的制備常規(guī)方法式IV的各種脂質(zhì)II底物分子聚合的速率沒(méi)有顯著變化。所以，可聚合式IV的不同脂質(zhì)II底物分子的混合物，由此得到共聚物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，使用已知的方法，有可能制備在不同單體單元的數(shù)量和這些單元發(fā)生的頻率上都改變的共聚物。為了制備共聚物，貯液優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)是總脂質(zhì)II底物分子濃度為約20μM。
例如，可通過(guò)酶如MtgA對(duì)式IV的兩種不同脂質(zhì)II底物分子的混合物的作用，來(lái)制備式I化合物。共聚物內(nèi)這兩種不同單體單元相對(duì)發(fā)生率將主要地取決于它們?cè)谌芤褐械南鄬?duì)濃度，其次取決于它們的相對(duì)聚合速率。類似地，可通過(guò)酶如MtgA對(duì)式IV的多達(dá)375種不同脂質(zhì)II底物分子的混合物的作用，來(lái)制備式I化合物。同樣地，共聚物內(nèi)375種不同單體單元中的任何一種的相對(duì)發(fā)生率主要地取決于其相對(duì)于溶液中其他不同成分的濃度，其次取決于其相對(duì)于溶液中其他不同成分的聚合速率。
可制備式I的嵌段共聚物，例如，通過(guò)在限定的時(shí)間內(nèi)使酶如MtgA將式IV的單個(gè)脂質(zhì)II底物分子聚合；終止或停止該反應(yīng)，或者從反應(yīng)混合物中取出所形成的聚合物；將該聚合物在限定的時(shí)間內(nèi)置于含有式IV的不同單個(gè)脂質(zhì)II底物分子的第二酶液中等，這對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
可通過(guò)酶如MtgA對(duì)式IV的單個(gè)脂質(zhì)II底物分子溶液的作用，來(lái)制備式I的嵌段共聚物。共聚物內(nèi)兩者不同單體單元的相對(duì)發(fā)生率將主要地取決于溶液中它們的相對(duì)濃度，其次取決于它們的相對(duì)聚合速率。類似地，可通過(guò)酶如MtgA對(duì)式IV的多達(dá)375種不同脂質(zhì)II底物分子混合物的作用，來(lái)制備式I化合物。同樣地，共聚物內(nèi)375種不同單體單元中任何一種的相對(duì)發(fā)生率將主要地取決于其相對(duì)于溶液中其他不同成分的相對(duì)濃度，其次取決于其相對(duì)于溶液中其他不同成分的聚合速率。
式I化合物結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證常規(guī)方法通過(guò)基于葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)的大小排阻層析并通過(guò)D2O/CD3CN中1Hnmr光譜測(cè)定法確定式I化合物的結(jié)構(gòu)身份。所述物質(zhì)可由溶菌酶降解，并且所述二糖-肽溶菌酶降解產(chǎn)物可通過(guò)ES/MS來(lái)分析。
化合物1的制備 化合物3 化合物1通過(guò)將白色粉末(370mg)溶解于水(14.5mL)中，制備化合物3的20nM貯液。向水(79.7mL)中添加PEG 8000(28.8mL作為溶于水的50％貯液)。向該溶液中添加pH 7.0的0.5M磷酸鈉緩沖液(5.8mL)和1M水性氯化鎂(3.6mL)。將所得的溶液等分到3個(gè)錐形管中，并向各管中添加化合物3貯液(4.8mL)，徹底混合。通過(guò)添加金黃色葡萄球菌MtgA酶的貯液(美國(guó)專利5,922,540)(123μM；3.9mL)引發(fā)聚合反應(yīng)。將反應(yīng)液充分混合并使其靜置24小時(shí)。
隨著聚合物的形成，其聚集并沉淀到管的底部。取出上清液并離心(3500rpm，20分鐘)以回收隨上清液偶然除去的任何聚合物。將沉淀溶于0.2M水性HCl(5mL)中并以這種形式帶到下一步。
向每個(gè)傾出上清后仍剩余的粗糙聚合物懸液中添加5M水性HCl(2×100μL，每次添加后混勻)。添加酸后系統(tǒng)變得均質(zhì)化。向這樣獲得的淡黃色溶液中添加來(lái)自最初上清液加工后的酸化沉淀溶液(參見(jiàn)上面的描述)。將這些水性酸液在37℃過(guò)夜孵育，其后將管的內(nèi)容物匯集至終體積約30ml。使用約1.2ml 5M水性NaOH將溶液中和到pH7-8，在該點(diǎn)上均質(zhì)的溶液變得混濁。將混濁的溶液離心兩次(3500rpm，20分鐘)，沉淀每次都用水洗滌然后棄去(保留的上清液的終體積＝36ml)。
添加水性5M NaOH(3.6mL)使終濃度為0.5M。在室溫下使該溶液靜置2小時(shí)，然后用5M水性HCl中和到pH 6。將溶液分成8等份(8×5mL，1×3mL)，每份置于50ml錐形管中。向每管添加9倍體積的乙醇，將溶液在-20℃冰箱中過(guò)夜貯藏。將管離心(3500rpm，20分鐘)，小心地除去上清液。真空短暫干燥后，將沉淀溶于最小量的水性NaCl(100mM)溶液中并匯集至終體積16ml。再次添加9倍體積乙醇，重復(fù)沉淀過(guò)程。最后，進(jìn)行第三輪沉淀。
將最后的沉淀溶于水(40ml)，置于Amicon型8050攪動(dòng)的細(xì)胞濃縮器中，進(jìn)行濃縮/稀釋循環(huán)，直到流出物電導(dǎo)接近于零。然后將溶液盡可能濃縮，通過(guò)預(yù)洗滌的Millipore Steriflip過(guò)濾器過(guò)濾并凍干。如此將化合物1分離成白色固體(144mg，66％)。
化合物1結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證通過(guò)大小排阻層析、1H NMR光譜學(xué)、酶敏感性和質(zhì)譜分析法確定化合物1的結(jié)構(gòu)身份。大小排阻層析(3.2mm×30mm Pharmacia superose 6柱，pH＝7的20mM磷酸鈉緩沖液)顯示基于葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)，大小分布的中點(diǎn)是約150千道爾頓(范圍為從約75kD到約375kD)。1H NMR(400MHz，D20)δ4.45(br s，1H)，4.32(br s，1H)，3.50(br m，13H)，2.90(m，2H)，2.26(M，2H)，1.95(s，3H)，1.89(s，3H)，1.75(m，3H)，1.62(m，3H)，1.31(m，6H)。
化合物1被溶菌酶迅速降解。細(xì)菌細(xì)胞壁聚糖聚合物(肽聚糖的亞結(jié)構(gòu))是溶菌酶的天然底物。因此，溶茵酶的敏感性代表化合物l的聚糖結(jié)構(gòu)的確鑿證據(jù)。最后，通過(guò)ES/MS m/z 781.6[M+H]+，779.5 證實(shí)了化合物1的溶茵酶水解產(chǎn)物，即N-乙酰葡糖胺基-β-[1，4]-N-乙酰胞壁酰-[Ala-GABA-Lys]-肽。
化合物2的制備
化合物4 化合物2制備化合物4的20nm貯液。用水將PEG 8000(作為溶于水的50％貯液)稀釋到約20％(w/w)。向PEG溶液中添pH 7.0的0.5M HEPES緩沖液、1M水性氯化鎂和化合物4，終濃度分別達(dá)到20mM、25mM和2mM。通過(guò)徹底混合使所得溶液均質(zhì)化。通過(guò)添加約120μM金黃色葡萄球菌MtgA酶貯液引發(fā)反應(yīng)，從而終摩爾酶濃度為10μM(約200∶1＝底物∶酶)。將反應(yīng)液充分混合并使其靜置24小時(shí)。
將反應(yīng)混合物加到約0.5M水性HCl中。添加酸后系統(tǒng)變得均質(zhì)化。將水性酸液在37℃孵育4小時(shí)，其后將溶液用5M水性NaOH中和到pH7-8。在接近pH 8的點(diǎn)，均質(zhì)的溶液變得混濁。將混濁的溶液離心(1700xg，20分鐘)。將沉淀用水洗滌并匯集上清液。將混濁液離心(1700xg，20分鐘)。將沉淀用水洗滌并匯集上清液，用水2x稀釋并用8x氯仿提取。通過(guò)比色法分析沒(méi)有PEG。將輕微乳化的水層離心(1700xg，20分鐘)，并取出澄清的水層。將最終的水溶液置于Amicon攪動(dòng)的細(xì)胞濃縮器(10KNMWCO再生纖維素)中，并進(jìn)行濃縮/稀釋循環(huán)，直到流出物電導(dǎo)接近于零。然后將溶液盡可能濃縮，通過(guò)Millipore Steriflip過(guò)濾器(0.2μ)過(guò)濾，估計(jì)化合物2的濃度是2.6mg/mL(大小排阻層析、在206nm處的UV吸收)。
化合物2結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證在Superose 6分析層析柱(3.2mm×30cm)上通過(guò)大小排阻層析(SEC)分析化合物2注入25μL；20mM磷酸鈉流動(dòng)相，pH 7，流速為50μL/分，60分鐘(勻速)。并在206nm UV檢測(cè)。使用從25-270kD的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)用于校準(zhǔn)。
獲得的層析譜顯示集中在大約30分鐘的正態(tài)對(duì)稱的鐘形曲線(80-150kD)，并在約20分鐘(＞270kD)和約40分鐘(＜23.8kD)的界限以內(nèi)。
化合物4質(zhì)譜分析ES/MS m/z＝1264.1(M-H)，642.8[(M-2+Na)/2]，631.5[(M-2)/2]1265.7(M+H)，807.4(糖基陽(yáng)離子)，644.4[(M+H+Na)/2]，655.4[(M+2Na)/2]，633.5[(M+2)/2]實(shí)施例2式IV的化合物對(duì)人外周血單核細(xì)胞中IL 10表達(dá)的刺激由于已經(jīng)證明天然肽聚糖和細(xì)菌夾膜抗原在體外和體內(nèi)刺激炎性細(xì)胞因子，因此我們?cè)噲D測(cè)定由接觸了式VI的化合物，以化合物1為例，的人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)引起的細(xì)胞因子圖譜。
通過(guò)Eli Lilly和公司捐贈(zèng)計(jì)劃，從匿名供者中獲得了人PBMCs。通過(guò)Ficoll-hypaque(Stem Cell Technologies，溫哥華，加拿大)沉淀除去紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞來(lái)分離單核細(xì)胞。將由T、B和單核細(xì)胞構(gòu)成的單核細(xì)胞層在具有10％胎牛血清(Gibco，BRL，Carlsbad CA)的RPMI 1640中培養(yǎng)。將PBMCs(2×106細(xì)胞/孔)與幾種濃度的化合物1一起培養(yǎng)以測(cè)定最佳反應(yīng)。盡管對(duì)化合物1的反應(yīng)典型地隨著人供體不同而變，但是0.6μg/ml濃度的化合物1產(chǎn)生可重復(fù)的和一致的結(jié)果，因此在這些實(shí)驗(yàn)中使用(圖3)。分離后，將人PBMCs用化合物1(0.6μg/ml)處理并在培養(yǎng)物中維持8天。每天采集上清液樣本并使用多重酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Luminex，Linco Research，St.Charles，MO；目錄號(hào)HCYTO-60K)分析細(xì)胞因子的表達(dá)。在這些試驗(yàn)中使用人多重細(xì)胞因子試劑盒測(cè)量IL1、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、TNFα和INFγ。在另外的試驗(yàn)中，添加定制的IL12特異性抗體珠復(fù)合物以進(jìn)一步確定細(xì)胞因子反應(yīng)(Luminex，Linco Research，St.Charles，MO)。在所有試驗(yàn)中，將結(jié)果相對(duì)于未處理的培養(yǎng)基對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表達(dá)為一式三份3個(gè)孔的均值±所表現(xiàn)的細(xì)胞因子濃度的標(biāo)準(zhǔn)誤差。數(shù)據(jù)代表至少3個(gè)試驗(yàn)的典型結(jié)果。
如在圖3中所示，幾個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果揭示用化合物1處理人PBMCs僅導(dǎo)致試劑盒中所代表的多數(shù)炎性細(xì)胞因子的最低量表達(dá)。令人驚奇地是，占主導(dǎo)地位的反應(yīng)是抗炎性細(xì)胞因子IL10的表達(dá)。IL10的表達(dá)發(fā)生在晚期，在第5天可檢測(cè)，并持續(xù)升高，在第8天達(dá)到大約80pg/ml的濃度。IL2和INFγ僅在早期勉強(qiáng)可檢測(cè)到，而IL4、IL6、IL12或TNF的表達(dá)在任何時(shí)間點(diǎn)都不能檢測(cè)到。
這些結(jié)果提示式VI的化合物，以化合物1為例，將在PBMC細(xì)胞培養(yǎng)物中選擇性地誘導(dǎo)IL10的表達(dá)，而且它們?cè)趧?dòng)物炎癥模型中和各種類型的炎性病變的治療中將是有效的。
實(shí)施例3式VI的化合物與Toll樣受體2(TLR2)的相互作用Toll樣受體(TLRs)通過(guò)感知體內(nèi)出現(xiàn)的微生物，在對(duì)侵入的病原體的早期先天免疫中起著重要的作用(Akira等人(2001)《天然免疫學(xué)》(Nature Immunol.)2675-680)。這些受體識(shí)別僅由微生物病原體所表達(dá)的高度保守的結(jié)構(gòu)基序，稱之為病原體相關(guān)的微生物模式(PAMPs)(Medzhitov(2001)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)135-145)。PAMPs包括各種細(xì)菌細(xì)胞壁成分如脂多糖(LPS)、肽聚糖和脂肽，以及鞭毛蛋白、細(xì)菌DNA以及病毒雙鏈RNA。PAMPs對(duì)TLRs的刺激引發(fā)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的信號(hào)級(jí)聯(lián)，其誘導(dǎo)分泌指導(dǎo)過(guò)繼性免疫反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子和效應(yīng)細(xì)胞因子(Janeway等人(2002)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)20197-216)。由于天然肽聚糖是通過(guò)TLR-2活化細(xì)胞的PAMP(Iwaki等人(2002)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)27724315-24320)，因此我們?cè)噲D確定式VI，以化合物1為例，是否也可在體外活化NF-κB。
這些試驗(yàn)包括用兩個(gè)質(zhì)粒DNAs轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，馬納薩斯，弗吉尼亞)。第一個(gè)質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)含有人TLR-2基因。第二個(gè)質(zhì)粒pNF-κB-luc(Stratagene，La Jolla，CA)編碼與熒光素酶報(bào)告基因相連的NF-κB基因，其產(chǎn)物可作為NF-κB活化的直接衡量而在體外跟蹤。為了制備用于轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)的DNA，在OPTI-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中1∶6稀釋Fugene6(Roche，Basel Switzerland)轉(zhuǎn)染劑。接下來(lái)，向稀釋的Fugene6中添加75ngpNF-κB-luc和300ng pcDNA3.1/Hygro DNA，將混合物在37℃孵育30分鐘。向DNA/Fugene6混合物中添加106細(xì)胞/ml濃度的HEK293細(xì)胞。輕輕混合后，將細(xì)胞/DNA混合物以105細(xì)胞/孔的濃度等分到96孔組織培養(yǎng)板內(nèi)并在37℃、5％CO2環(huán)境中孵育24小時(shí)。孵育后，向細(xì)胞中添加濃度變化的測(cè)試化合物，使孵育再進(jìn)行24小時(shí)。通過(guò)從細(xì)胞中除去生長(zhǎng)培養(yǎng)并用100μl RLB裂解液(Promega，Madison，WI)替換，評(píng)估與化合物一起孵育所得的熒光素酶活性的量。通過(guò)在-80℃的單個(gè)凍/融循環(huán)完成裂解。根據(jù)生產(chǎn)商的指示在Victor發(fā)光計(jì)(Perkin Elmer Life Sciences，Shelton，CT)中，在25μl一份的細(xì)胞裂解液中測(cè)定每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的熒光素酶活性。HEK293細(xì)胞中NFκB活化的陽(yáng)性對(duì)照是將1ng/ml濃度的TNFα(Pharmingen，Palo Alto，CA)與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育。
表1顯示，使用可商購(gòu)的分離自金黃色葡萄球菌的濃度變化的天然肽聚糖(Fluka，St.Louis，MO)，觀察到NFκB活性與未刺激的培養(yǎng)物相比多達(dá)54.5倍的誘導(dǎo)。另一種可商購(gòu)的肽聚糖和多糖混合物制品(PG/PS；LeeLabs Inc.，Grayson，GA)在HEK293細(xì)胞中刺激誘導(dǎo)多達(dá)33.7倍的NF-κB。表1中的數(shù)據(jù)顯示在化合物1高達(dá)500μg/ml的濃度時(shí)缺乏NF-κB的活化。
表1用于測(cè)量HEK293細(xì)胞中TLR2活性的熒光素酶試驗(yàn)
陽(yáng)性刺激對(duì)照用1ng/ml TNFα孵育的培養(yǎng)物與未刺激的培養(yǎng)物相比，導(dǎo)致熒光素酶活性增加22.5倍。
這些結(jié)果證明不同于天然肽聚糖(其是PAMP)，化合物1，其代表式VI的化合物，并不通過(guò)TLR2誘導(dǎo)NFκB活化。
實(shí)施例4式VI的化合物與其他Toll樣受體(TLRs)的相互作用與調(diào)查化合物1與TLR2相互作用的研究并行地，我們使用上述實(shí)施例3(表1)中相同的NF-κB報(bào)告試驗(yàn)，也測(cè)試了化合物1與擴(kuò)大的TLR構(gòu)建物名單的相互作用。結(jié)果顯示于表2。
表2使用各種化合物通過(guò)NFκB活化TLR1的總結(jié)
1符號(hào)“+”的數(shù)目表示NFκB的相對(duì)陽(yáng)性活化，而符號(hào)“-”表示沒(méi)有活化。
如在表2中所示，0.001-100μg/ml濃度之間的化合物1不與任何其他TLR受體引起NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。在所有這些試驗(yàn)中，LPS作為TLR4活化的陽(yáng)性對(duì)照，而天然PG作為TLR2活化的陽(yáng)性對(duì)照。
這些試驗(yàn)證實(shí)了先前的觀察(實(shí)施例3)，即化合物1不活化TLR2，甚至在存在必需的適體分子CD14時(shí)(Janeway等(2002)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)20197-216)也是如此，并且將這種現(xiàn)象延伸至5種其他的TLRs。
實(shí)施例5式VI的化合物不刺激人樹(shù)突細(xì)胞(DCs)的成熟DCs通常被稱之為專職的抗原提呈細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的哨兵(Banchereau等人(2000)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)18767-811)。它們以未成熟的狀態(tài)(iDC)存在于幾乎所有外周組織中，這使得它們能夠吞噬(或吞沒(méi))抗原，從而使之可被加工并呈遞給免疫系統(tǒng)，尤其是幼稚T細(xì)胞(Shortman等人(2002)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)2151-161)。載著它們經(jīng)加工的抗原貨物，樹(shù)突細(xì)胞經(jīng)血液和淋巴循環(huán)遷移到淋巴結(jié)、脾以及其他淋巴組織中。在此旅行期間，它們成熟、失去它們攝取和加工抗原的能力，并且開(kāi)始在它們的表面展示抗原。當(dāng)它們到達(dá)它們目的地的時(shí)候，它們已成為T細(xì)胞的有效刺激物，憑借它們的多觸角(樹(shù)突狀)形狀，開(kāi)始與大量T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸(Banchereau等人(2000)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)18767-811)。
某些CD(分化蔟)標(biāo)志為暴露于表面的蛋白和糖蛋白，可用于追蹤樹(shù)突細(xì)胞的成熟狀態(tài)(Chakraborty等人(2000)《臨床免疫學(xué)》(Clin.Immunol.)9488-98)。表3列舉了用于此目的的通常所使用的CD標(biāo)志以及它們?cè)趩魏思?xì)胞、未成熟的樹(shù)突細(xì)胞(iDC)和成熟樹(shù)突細(xì)胞(mDC)上的相對(duì)表達(dá)水平(Chakraborty等人(2000)《臨床免疫學(xué)》(Clin.Immunol.)9488-98)。
表4A包含單鏈抗EpCAM4-7可變區(qū)的去免疫化抗人CD3構(gòu)建體氨基酸序列
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表4中。
表4與化合物1或LPS孵育后單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞的流式細(xì)胞分析
1數(shù)字代表10,000細(xì)胞/樣品中的細(xì)胞表面標(biāo)志的平均熒光強(qiáng)度。
如在表4中所示，在該實(shí)驗(yàn)中所用的表面標(biāo)志組進(jìn)一步證實(shí)CD14(+)單核細(xì)胞與GM-CSF和IL-4的4天孵育誘導(dǎo)細(xì)胞分化為未成熟的樹(shù)突細(xì)胞(比較表4中的結(jié)果與表3中所總結(jié)的預(yù)期的表型)。如在表4中所示，由于這些細(xì)胞與大腸桿菌LPS(成熟的陽(yáng)性對(duì)照)孵育顯著增加了它們細(xì)胞表面上的CD-83、CD-86和HLA-DR的染色，這是成熟DC的預(yù)期表型，因此這些未成熟的樹(shù)突細(xì)胞在功能上能夠達(dá)到成熟狀態(tài)。表4中數(shù)據(jù)顯示與化合物1的孵育不能改變iDC狀態(tài)的染色譜，表明該化合物，式VI的化合物的代表，能影響樹(shù)突細(xì)胞的成熟。
實(shí)施例6未成熟人樹(shù)突細(xì)胞(iDCs)對(duì)式VI的化合物的攝取由化合物1誘導(dǎo)的DCs成熟的抑制可能是由于這些細(xì)胞不能內(nèi)在地加工這些分子?？乖臄z取和加工(降解)是APCs的兩個(gè)基本屬性(Banchereau等人(2000)《免疫學(xué)年鑒評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)18767-811)。DCs是免疫系統(tǒng)的最有效的APCs，部分地是由于它們能強(qiáng)有力地從其環(huán)境中胞吞或采集物質(zhì)(Shortman等(2002)《免疫學(xué)自然評(píng)論》(Nat.Rev.Immunol.)2151-161)。為了確定iDCs是否能胞吞高分子量免疫調(diào)節(jié)性多糖抗原如以化合物1為例的式VI的化合物，我們制備了化合物1的熒光衍生物，在采用共聚焦顯微鏡的攝入研究中使用?？墒褂迷摮上窦夹g(shù)在細(xì)胞內(nèi)定位熒光探針，例如文中公開(kāi)的Oregon綠標(biāo)記的化合物1。在這些試驗(yàn)中，使用熒光標(biāo)記(FITC)的葡聚糖聚合物作為對(duì)照分子。葡聚糖(大小為40kDa)是胞吞試驗(yàn)中常用的高分子(Sallusto等人(1995)《(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)182389-400)。由于其是高分子量碳水化合物聚合物，因此其可用作化合物1的比較劑。
根據(jù)在PCT國(guó)際公開(kāi)WO 01/79242中所描述的方法制備Oregon綠標(biāo)記的化合物1。簡(jiǎn)要地，在MtgA聚合反應(yīng)中納入與未標(biāo)記的脂質(zhì)II的比例為1∶4的Oregon綠(Molecular Probes，Eugene，OR)綴合的脂質(zhì)II，產(chǎn)生25％Oregon綠標(biāo)記的聚合物。如前所述純化和處理聚合物物質(zhì)。對(duì)于攝取研究，在37℃將終濃度為50μg/ml的熒光化合物1或者1mg/ml的賴氨酸可固定的FITC綴合的葡聚糖(大小為40kDa，Molecular Probes，Eugene，OR)與根據(jù)在實(shí)施例5中所描述的方法制備的人單核細(xì)胞來(lái)源的iDC一起孵育2兩分鐘。孵育后，通過(guò)將細(xì)胞在冰凍的完全DC培養(yǎng)基(實(shí)施例5)中洗滌4次，除去胞外探針。然后將洗滌過(guò)的細(xì)胞在37℃培養(yǎng)，兩分鐘間隔后通過(guò)在流式洗滌液中稀釋的1％多聚甲醛固定液(其也含有代謝毒物疊氮化鈉；實(shí)施例5中描繪的方案)中洗滌停止染色。在每個(gè)時(shí)間間隔制備玻璃載玻片標(biāo)本，并用透明指甲油密封。將標(biāo)本避光貯藏在-20℃，直至使用Radiance 2100共聚焦顯微鏡(BioRad Laboratories，Hercules，CA)分析。
圖4顯示用FITC-葡聚糖(大小為40kDa)(圖表A)或Oregon-綠標(biāo)記的化合物1(大小為大約150kDa)處理2分鐘的人iDCs的黑白共聚焦圖象。與共聚物孵育后，將細(xì)胞徹底洗滌以除去任何外部的聚合物，并以兩分鐘的間隔追蹤內(nèi)在化的物質(zhì)。
與共聚物孵育兩分鐘后，F(xiàn)ITC-葡聚糖或化合物1的細(xì)胞內(nèi)定位顯示為細(xì)胞暗視野中的明亮區(qū)(圖4，分別是圖表A和B)。此外，內(nèi)在化的聚合物并不散布在整個(gè)胞漿中，相反卻局限于離散的體或囊中，這與內(nèi)吞噬泡中它們的存在一致。
這些結(jié)果證明iDCs能胞吞式VI的化合物，即，化合物1。
實(shí)施例7未成熟人樹(shù)突細(xì)胞(iDCs)對(duì)式VI化合物的攝取動(dòng)力學(xué)由于似乎存在著iDCs對(duì)化合物1的強(qiáng)勁攝取(圖4)，在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)中使用該分子的熒光形式，以觀察聚合物攝取的動(dòng)力學(xué)。
在這些實(shí)驗(yàn)中，人類單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞如實(shí)施例5中所述制備。將樹(shù)突細(xì)胞按5×105細(xì)胞/樣品重懸，并置于冰上37℃孵育。在各時(shí)段的起點(diǎn)，將細(xì)胞與50μg/ml終濃度的熒光化合物1或者1mg/ml的Lysine-可固定的FITC-綴合葡聚糖(40kDa大小，Molecular Probes，Eugene，OR)一起孵育。在孵育開(kāi)始后0、2、10、20、30、40和50分鐘時(shí)，通過(guò)洗滌終止攝取，即用冰凍流動(dòng)的洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞四次(實(shí)施例5)。也如實(shí)施例5所述將洗滌的細(xì)胞固定在多聚甲醛中。將染色的固定細(xì)胞4℃貯存，避光保護(hù)，直到利用FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Miami，F(xiàn)L)分析。一旦細(xì)胞被正確門控給出前向和側(cè)向散射圖，就對(duì)10,000細(xì)胞/樣品進(jìn)行群體平均熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)。
圖5(圖表B)顯示了隨著時(shí)間，Oregon綠標(biāo)記的化合物1在iDC胞漿中積累。對(duì)照分子FITC-葡聚糖也是如此(圖5，圖表A)。為控制分子對(duì)細(xì)胞表面的非特異性粘附(這在此試驗(yàn)中可被錯(cuò)誤地當(dāng)作陽(yáng)性)，也將細(xì)胞與熒光聚合物于0℃一起孵育。在此溫度下，iDCs是存活的，但不能那托物質(zhì)，即它們?cè)诖x上是無(wú)活性的(Sallusto等人(1995)J.Exp.Med.182389-400)。在此溫度下，來(lái)自對(duì)照分子(FITC-葡聚糖)或化合物1的信號(hào)都不隨時(shí)間增大(圖5，分別為圖表A和B)。這表明所見(jiàn)的攝取是細(xì)胞內(nèi)吞作用的結(jié)果。
這些結(jié)果證明iDCs能夠迅速內(nèi)吞以化合物1為例的熒光標(biāo)記的式VI的化合物，并且此分子無(wú)力使DCs成熟并非是因抵制其內(nèi)吞攝取而致。
實(shí)施例8式VI的化合物對(duì)LPS所誘導(dǎo)的iDCs成熟的干擾如上文表4中所示(實(shí)施例5)，50μg/ml的LPS能夠?qū)DCs轉(zhuǎn)化為以共刺激標(biāo)志(CD83和CD86)以及II類主要組織相容性(MHC)標(biāo)志(HLA-DR)的增加為特征的mDC表型(Chakraborty等人(2000)Clin.Immunol. 9488-98)。我們下一步研究了式VI的化合物，以化合物1為例，是否能夠干擾iDCs向的mDCs轉(zhuǎn)化。結(jié)果示于5。
表5在式VI化合物的存在下用大腸桿菌LPS成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析
1數(shù)字代表10,000細(xì)胞/樣品的平均熒光強(qiáng)度。
在這些實(shí)驗(yàn)中，CD14(+)單核細(xì)胞分離自人PBMCs，并如實(shí)施例5所示分化為iDCs。分化后，將iDCs與兩個(gè)已知的細(xì)胞成熟誘導(dǎo)劑中的任何一個(gè)一起孵育24小時(shí)大腸桿菌LPS(Matsunaga等人(2002)Scand.J.Immunol.56593-601)或細(xì)胞因子混合物含腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、前列腺素E2和IL-6(Dieckman等人(2002)J.Exp.Med.196247-253)。在添加LPS或細(xì)胞因子的同時(shí)，我們還向某些誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中添加了100μg/ml的化合物1。孵育后，如實(shí)施例5所示通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞CD1a、CD14、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)。
在細(xì)胞因子成熟的iDCs的情況下，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)證實(shí)發(fā)生了通過(guò)細(xì)胞因子混合物誘導(dǎo)的成熟；然后，與化合物1孵育對(duì)成熟表型沒(méi)有影響，如通過(guò)表面標(biāo)志分析所測(cè)定的那樣(數(shù)據(jù)未顯示)。與此相反，表5顯示化合物1能夠干擾LPS誘導(dǎo)的iDCs成熟。具體地，共刺激標(biāo)志CD86的表面表達(dá)在該分子存在下降低，而測(cè)試的其他標(biāo)志基本上未變。另外的實(shí)驗(yàn)也證明另一共刺激標(biāo)志CD80也降低(數(shù)據(jù)未顯示)。
DCs活化T細(xì)胞的強(qiáng)大能力與其組成型表達(dá)MHC和共刺激標(biāo)志如B7家族標(biāo)志(即CD80和CD86)兩者有關(guān)(Banchereau等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18767-811)。如果這些分子自DC細(xì)胞表面下降或缺失，則DCs不能參與和T細(xì)胞之間的刺激性同源相互作用。Schwartz((1990)Science 2481349-1356)第一個(gè)觀察到在缺乏共刺激分子時(shí)MHC分子上抗原的呈遞誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能。從而，DCs能夠?yàn)槊庖叻磻?yīng)提供刺激(通過(guò)作為APCs)和下調(diào)信號(hào)。
為充分理解上述發(fā)現(xiàn)的意義，理解DCs在免疫耐受中的作用很重要。耐受是免疫系統(tǒng)基本的性質(zhì)，藉此自身或自體抗原不再觸發(fā)免疫應(yīng)答(Belz等人(2002)Immunol.Cell Biol.80463-468)。他人已證明當(dāng)DCs經(jīng)歷不完全成熟(低水平的CD80和或CD86)，或者已經(jīng)由封閉B7家族共刺激標(biāo)志(即CD80和CD86)的抗體處理過(guò)的時(shí)候，這些細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗原特異性的體外不應(yīng)答和體內(nèi)T細(xì)胞無(wú)能(Lu等人(1996)J.Immunol.1573577-3586；Gao等人(1999)Immunology 98159-170)。目前已知未成熟DCs通過(guò)誘導(dǎo)人T調(diào)節(jié)細(xì)胞，即一組在體外體內(nèi)表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞，促成了外周耐受(Jonuleit等人(2000)J.Exp.Med.1921213-1222)。也已經(jīng)證明活化的T調(diào)節(jié)細(xì)胞通過(guò)自分泌表達(dá)或誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞而引發(fā)IL-10，一種抗原細(xì)胞因子的產(chǎn)生(Dieckmann等人(2002)J.Exp.Med.196247-253)。從而，式VI的代表性分子化合物1似乎影響DC表面共刺激標(biāo)志的表達(dá)，表明這類分子在誘導(dǎo)耐受原性DCs中的作用機(jī)制。這些無(wú)能DCs隨之能夠直接地或者通過(guò)T調(diào)節(jié)細(xì)胞群的活化而誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能。
實(shí)施例9式VI的分子并非多克隆有絲分裂原而且并不刺激人PBMC培養(yǎng)物中淋巴細(xì)胞的增殖有絲分裂原是非特異性誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞分裂的物質(zhì)。LPS為B細(xì)胞特異性有絲分裂原(Moller等人(1973)J.Infect.Dis.12852-56)，而植物凝集素(PHA)特異性地誘導(dǎo)T細(xì)胞分裂(Boldt等人(1975)J.Immunol.1141532-1536)。肽聚糖是另一種T細(xì)胞有絲分裂原(Levinson等人(1983)Infect.Immun.39290-296)。因此我們對(duì)確定以化合物1為例的的化合物是否能夠刺激培養(yǎng)物中人外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMCs)分裂感興趣，特別是因?yàn)榛衔?是完全的合成肽聚糖。在這些實(shí)驗(yàn)中通過(guò)增殖細(xì)胞將放射性標(biāo)記的核苷酸堿基攝入到DNA中來(lái)測(cè)量細(xì)胞分裂。由閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量的培養(yǎng)物的每分鐘放射性計(jì)數(shù)(cpm)是對(duì)細(xì)胞增殖的直接測(cè)量。
在這些實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)施例2所述，從健康人類志愿者中分離PBMCs。將分離的PBMCs以105細(xì)胞/孔的密度等分到圓底96孔組織培養(yǎng)板(Falcon Brand，Becton Dickinson，Palo Alto，CA)中。有些細(xì)胞還與100μg/ml化合物1或25μg/ml PHA(Sigma，St.Louis，MO)作為T細(xì)胞增殖的陽(yáng)性對(duì)照一起孵育。將細(xì)胞于37℃在5％CO2氣氛中孵育長(zhǎng)達(dá)4天。在接種后30、54和78小時(shí)，某些培養(yǎng)物用1μCi/孔的[3H]-胸苷(比活6.7Ci/mmol；ICN Inc，Costa Mesa，CA)脈沖，并返回到37℃再孵育18小時(shí)，之后使用Filtermate收集器(Packard Instruments，Shelton，CT)收集到過(guò)濾板(Packard Instruments，Shelton，CT)上。收集后在添加20μl/孔的Microscint-O閃爍混合物(Packard Instruments，Shelton，CT)之前對(duì)過(guò)濾板進(jìn)行干燥。閃爍計(jì)數(shù)用MicroBeta TriLux液閃計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer，Shelton，CT)進(jìn)行。
圖6顯示了人PBMCs對(duì)多克隆T細(xì)胞活化劑PHA的典型的增殖應(yīng)答。摻入到PHA處理細(xì)胞中的[3H]-胸苷在兩天接觸后接近于未處理細(xì)胞的100,000倍，且增殖速率提高長(zhǎng)達(dá)4天。與之形成對(duì)照，用化合物1處理的細(xì)胞并不通過(guò)DNA增殖及擴(kuò)增應(yīng)答(圖6)。因此，該化合物，式VI分子的代表，在人PBMC培養(yǎng)物中似乎并不表現(xiàn)出象多克隆有絲分裂原那樣的行為。
實(shí)施例10式VI的化合物抑制抗-CD3抗體誘導(dǎo)的人PBMC中淋巴細(xì)胞的增殖當(dāng)抗原(Ag)在抗原提呈細(xì)胞(APC)表面MHCII環(huán)境下被呈遞給幼稚T細(xì)胞時(shí)，T細(xì)胞表面上存在MHC-Ag復(fù)合物與T細(xì)胞受體(TCR)/CD3復(fù)合物的結(jié)合(Weiss等人(1986)Annu.Rev.Immunol.4593-619)。這種相互作用，與通過(guò)這兩類細(xì)胞上的CD28-B7(CD80，CD86)相互作用產(chǎn)生的擴(kuò)增信號(hào)一起，引起T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子刺激以及細(xì)胞分裂(Weiss等人(1986)Annu.Rev.Immunol.4593-619。在缺乏Ag或APC時(shí)，T淋巴細(xì)胞變的活化并在體外通過(guò)與結(jié)合在板上的抗-CD抗體孵育而增殖(van Lier等人(1989)Immunol.6845-50)。模擬通過(guò)抗原的活化，CD3抗體與T細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致活化酪氨酸激酶、胞內(nèi)鈣離子濃度上升、產(chǎn)生甘油二酯、并活化蛋白激酶C。鈣離子以及蛋白激酶C都作為胞內(nèi)信使起誘導(dǎo)基因活化的作用(van Lier等人(1989)Immunol.6845-50)?？?CD3抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖也可通過(guò)將[3H]-胸苷摻入到分裂細(xì)胞的DNA中來(lái)測(cè)量，如圖6中所舉例說(shuō)明的那樣。
由于在用化合物1處理后未觀察到PBMCs的增殖(圖6)，我們假設(shè)此類分子可刺激T調(diào)節(jié)細(xì)胞。進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以研究化合物1是否誘導(dǎo)抑制淋巴細(xì)胞增殖。
在該實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)施例2所述分離和培養(yǎng)人PBMCs，并以106cell/ml涂板到T-25組織培養(yǎng)瓶(Corning Inc.，Corning，NY)中于37℃在5％CO2氣氛中培養(yǎng)24h。在此期間，使培養(yǎng)物接觸100μg/ml的化合物1。在抗體包被板上孵育細(xì)胞的前一天，將抗-人CD3抗體(Clone UCHT1，Pharmingen，Palo Alto，CA)或同種型匹配的對(duì)照抗體(Pharmingen，PaloAlto，CA)在Dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液(DPBS)(Gibco，BRL，Carlsbad，CA)中稀釋，并用100μl等份的稀釋抗體包被96-孔組織培養(yǎng)板的孔。板于4℃過(guò)夜包被，用前在DPBS中洗滌三次。將接觸化合物1或不接觸該化合物的人PBMCs以105細(xì)胞/孔的密度涂板到抗體包被的孔中。組織培養(yǎng)板于37℃在5％CO2氣氛中培養(yǎng)30或54小時(shí)，之后向各孔加入1μCi/孔的[3H]-胸苷(比活6.7Ci/mmol；ICN Inc，Costa Mesa，CA)。然后使細(xì)胞返回37℃孵育另外18h，之后如實(shí)施例9所述收集細(xì)胞。液閃計(jì)數(shù)操作也如實(shí)施例9所述。此實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)計(jì)算為每分鐘未加工計(jì)數(shù)(cpm)的放射性和刺激指數(shù)(SI)(未顯示)，此為抗-CD3抗體包被孔中細(xì)胞cpm與同種型(對(duì)照)抗體包被孔中細(xì)胞cpm之比。
圖7顯示了接觸抗-CD3抗體48或72小時(shí)都導(dǎo)致人PBMCs增殖，如[3H]-胸苷(圖7，閉環(huán))攝取所示。此外，增殖量與孔中抗-CD3抗體的量直接相關(guān)，最高增殖見(jiàn)于接觸0.4μg/ml抗-CD3抗體的細(xì)胞。圖7也顯示，在與抗-CD3抗體孵育之前，人PBMCs與100μg/ml化合物1預(yù)孵育24h導(dǎo)致后續(xù)增殖量的下降(圖7，開(kāi)環(huán))。
這些結(jié)果證明化合物1，式VI化合物的代表，抑制抗-CD3抗體誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。
實(shí)施例11用式VI的化合物和抗-CD3抗體處理后人CD3+細(xì)胞的微陣列分析利用微陣列技術(shù)通過(guò)測(cè)量細(xì)胞因子調(diào)節(jié)確證和延伸了圖3所示的證明細(xì)胞因子表達(dá)的結(jié)果。
如實(shí)施例2所述分離PBMCs，并添加到6-孔組織培養(yǎng)板中含RPMI和10％胎牛血清(Gibco BRL，Carlsbad，CA)、50Mβ-巰基乙醇和500μg/ml青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中。T細(xì)胞密度為2.5×106細(xì)胞/孔。向合適板的各孔中加入100μg/ml化合物1和完全培養(yǎng)基。孵育于37℃進(jìn)行24小時(shí)。同時(shí)地，用5ml/孔的0.2μg/ml抗-CD3抗體的無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS，Gibco BRL，Carlsbad，CA)或者等體積的無(wú)菌PBS處理6-孔組織培養(yǎng)板。未接種的板于4℃過(guò)夜孵育。孵育后，將用化合物1處理的細(xì)胞或未處理的對(duì)照細(xì)胞輕輕地重懸，并添加到已經(jīng)或沒(méi)有包被抗-CD3抗體的板中，并于37℃繼續(xù)孵育另外48小時(shí)。
然后用Pan T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，cat.#130-053-001；Auburn，CA)基本上按照制造商的說(shuō)明加工PBMCs。該試劑盒為設(shè)計(jì)用于從外周血中分離未活化T細(xì)胞的磁標(biāo)系統(tǒng)。使用autoMACS(MiltenyiBiotec Inc，Auburn，CA)從未標(biāo)記的CD3+細(xì)胞中通過(guò)磁分離去除非T細(xì)胞。將分離的T細(xì)胞貯存在-80℃。
依據(jù)制造商說(shuō)明的操作，利用Trizol(GibcoBRL，Carlsbad，CA)從細(xì)胞中分離總RNA，接著進(jìn)行氯仿抽提和后續(xù)的乙醇沉淀。通過(guò)分光光度法定量RNA，并通過(guò)凝膠分析評(píng)估其完整性。所有的RNA制劑貯存在-80℃?zhèn)溆谩?br> 總RNA作為模板用于合成生物素標(biāo)記的cDNA。此標(biāo)記的cDNA隨后用作為商購(gòu)定向微陣列的探針。具體地，采用了GEArray Q系列人常見(jiàn)細(xì)胞因子試劑盒cat.#HS-003N(SuperArray Bioscience Corporation，F(xiàn)rederick，MD)。探針合成和微陣列加工如制造商建議的那樣進(jìn)行。以化學(xué)發(fā)光模式使用Typhoon 8600成像儀(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)以捕獲和貯存圖像，隨會(huì)使用ImageQuant軟件(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分析。將數(shù)據(jù)輸出到Microsoft Excel，對(duì)圖象強(qiáng)度進(jìn)行背景校正，并使用GEArray Analyzer軟件(SuperArrayBioscience Corporation，F(xiàn)rederick，MD)在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
數(shù)據(jù)分析揭示了與如圖3所示的使用多元酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)所見(jiàn)到的一致的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)模式。接觸抗-CD3抗體的細(xì)胞被活化，因此表現(xiàn)出IL17、TNF-β及其他已知參與炎性過(guò)程的細(xì)胞因子的上調(diào)。認(rèn)為IL17主要是由活化T細(xì)胞表達(dá)的，并發(fā)揮作用以起始和維持炎性應(yīng)答?？?CD3抗體處理的細(xì)胞也表現(xiàn)出IL10和IL19的下降。當(dāng)將化合物1加至隨后接觸抗-CD3抗體的細(xì)胞時(shí)，IL10的水平顯著上升。
這些微陣列實(shí)驗(yàn)中化合物1所誘導(dǎo)的CD3+T細(xì)胞中IL10表達(dá)的上調(diào)驗(yàn)證了在實(shí)施例2以及在動(dòng)物模型中所觀察到的結(jié)果，并表明該細(xì)胞因子可用作為生物學(xué)標(biāo)志，以在體外體內(nèi)監(jiān)測(cè)以化合物1為例的式VI的分子的生物學(xué)/免疫學(xué)活性。該數(shù)據(jù)也表明定向微陣列不僅可用于監(jiān)測(cè)本發(fā)明化合物的生物學(xué)活性，而且可監(jiān)測(cè)衍生化合物的生物學(xué)活性，以確定結(jié)果差異對(duì)免疫調(diào)節(jié)潛能的作用。
實(shí)施例12式VI的化合物防御腹內(nèi)膿腫的形成由于化合物1誘導(dǎo)在體外具有抑制功能的T調(diào)節(jié)細(xì)胞以及人PBMCs中IL10的晚期生產(chǎn)(分別見(jiàn)實(shí)施例10和實(shí)施例2)，我們有興趣評(píng)估該合成聚合物抗原在體內(nèi)防止動(dòng)物炎性形成的能力。使用大鼠腹內(nèi)膿腫模型來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。
這些研究中所采用的大鼠膿腫形成模型是對(duì)Onderdonk等人((1977)J.Infect.Dis.13682-87)和Tzianabos等人((1993)Science 262416-419)所述的改進(jìn)。體重在135-175克之間的雄性Lewis大鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)用于所有實(shí)驗(yàn)。大鼠圈養(yǎng)在微型分離籠中，并任意給食(Ralston Purina，St.Louis，MO)和水。在剛來(lái)時(shí)，令動(dòng)物適應(yīng)24小時(shí)。腹內(nèi)膿腫是通過(guò)單次腹膜內(nèi)注射制備的接種物誘導(dǎo)的，所述接種物含有以1∶6稀釋度與含無(wú)菌大鼠盲腸內(nèi)容物的佐劑溶液混合的脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)(ATCC 23745；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)(每個(gè)動(dòng)物108集落形成單位)。脆弱擬桿菌于-80℃維持在腦心浸液中。培養(yǎng)物在腦心浸液中厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并稀釋與大鼠盲腸內(nèi)容物(rSCC)一起使用。rSCC是由溶解在腦心浸液中的大鼠盲腸沉淀制備的，高壓滅菌然后過(guò)濾。在接種后六天使動(dòng)物安樂(lè)死，并評(píng)估膿腫形成。具有一個(gè)或多個(gè)完全形成的膿腫的動(dòng)物評(píng)定為陽(yáng)性。沒(méi)有膿腫的動(dòng)物得出負(fù)分。評(píng)定結(jié)果的個(gè)體對(duì)于實(shí)驗(yàn)組的性質(zhì)不明。
動(dòng)物(10只大鼠/組)用三劑量的化合物1在脆弱擬桿菌/rSCC刺激之前1天、當(dāng)天和之后1天以24小時(shí)的間隔皮下給藥(Tzianabos等人《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)962727(1995))。接種物的刺激通過(guò)腹膜內(nèi)路徑進(jìn)行。按100、10和1μg(X3)/動(dòng)物向動(dòng)物給藥對(duì)數(shù)稀釋的化合物1。結(jié)果表達(dá)為保護(hù)百分比(無(wú)膿腫動(dòng)物數(shù)目/治療組)，并利用Fishers ExactProbability試驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
如表6所示，與鹽水對(duì)照相比，化合物1在100μg和10μg劑量時(shí)產(chǎn)生了可觀的抗膿腫形成保護(hù)。保護(hù)評(píng)估為與具有一個(gè)或多個(gè)膿腫的對(duì)照動(dòng)物相比的膿腫的完全消失。受保護(hù)動(dòng)物未表現(xiàn)出抗原給藥的有害作用，如果有的話，具有少許發(fā)燒或昏睡跡象，這是常見(jiàn)的炎癥癥狀。這些動(dòng)物也不表現(xiàn)出敗血癥癥狀。
表6大鼠膿腫模型中化合物1的活性
綜合考慮實(shí)施例2-11所示的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明該模型中防御響應(yīng)細(xì)菌刺激的膿腫形成所需的炎性過(guò)程的保護(hù)受到未成熟樹(shù)突細(xì)胞的存在的抑制，其可直接抑制T細(xì)胞活化，或者誘導(dǎo)產(chǎn)生T調(diào)節(jié)細(xì)胞群。通過(guò)T調(diào)節(jié)細(xì)胞接觸直接抑制炎性細(xì)胞可進(jìn)一步刺激表達(dá)IL-10。總而言這，一個(gè)或多個(gè)這些事件可能支配著體內(nèi)膿腫模型中所見(jiàn)的炎癥抑制。
實(shí)施例13式VI的化合物降低外科術(shù)后粘連的發(fā)生率和嚴(yán)重度業(yè)已證明外源IL10限制外科手術(shù)后粘連的形成(Holschneider等人(1997)J.Surg.Research 70138-143)。此外，T調(diào)節(jié)細(xì)胞具有強(qiáng)抗炎活性，并已經(jīng)證明限制體內(nèi)模型的炎癥(Maloy等人(2001)Nat.Immunol.2816-822；Shevach(2002)Nat.Rev.Immunol.2389-400)。T調(diào)節(jié)細(xì)胞也已經(jīng)證明引發(fā)由其靶標(biāo)炎性T細(xì)胞產(chǎn)生IL10(Diekman等人(2002)J.Exp.Med.196247-253)。如上文實(shí)施例2、10、11和12中不同地證明的那樣，化合物1刺激由PBMCs產(chǎn)生IL10，T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目增加并在體外發(fā)揮作用，并在體內(nèi)提供了抗膿腫形成保護(hù)。由于導(dǎo)致血纖維蛋白沉積和膿腫形成的炎性應(yīng)答類似于與粘連形成有關(guān)的病變，我們假定在粘連模型中用化合物1治療將同樣地刺激T調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性以及最終內(nèi)源IL10的生產(chǎn)，這可導(dǎo)致降低外科手術(shù)后粘連的形成。
為測(cè)試這種假說(shuō)，雄性Lewis大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)在外科手術(shù)誘導(dǎo)粘連之前1天、當(dāng)天以及之后1天，以24小時(shí)的間隔，通過(guò)三次注射化合物1皮下給藥(Tzianabos等人(1995)J.Clin.Invest.962727-2731)。按0.2ml 100μg、10μg和1μg(X3)鹽水/動(dòng)物向大鼠給藥對(duì)數(shù)稀釋的該化合物。以相同的給藥方案向?qū)φ战M給藥0.2ml體積的鹽水。腹膜粘連按照Kennedy等人((1996)Surgery 120866-871)和Tzianabos等人(PCT國(guó)際公開(kāi)WO 00/59515)的方法誘導(dǎo)，稍加改動(dòng)。簡(jiǎn)要地，大鼠用麻醉用溶于氧的2-5％異氟烷進(jìn)行外科手術(shù)平臺(tái)的麻醉。對(duì)腹腔進(jìn)行1到2cm的中線切割，以暴露盲腸。從腹腔中無(wú)菌取出盲腸，并用外科手術(shù)紗布摩擦以誘導(dǎo)可見(jiàn)的微量出血。然后將盲腸重新插入腹腔之中。無(wú)菌翻轉(zhuǎn)左側(cè)和右側(cè)腹壁，也以上述方式摩擦。在此操作后，將如實(shí)施例12所述制備的0.2-0.3ml大鼠無(wú)菌盲腸內(nèi)容物(rSCC)作為炎性佐劑添加到腹腔中(Onderdonk等人(1982)J.Clin.Invest.699-14)。用3-0絲線閉腹，接著用組織粘合劑(3M Animal Care Products，St.Paul，MN)封上皮膚。外科手術(shù)操作后一周處死動(dòng)物，并評(píng)價(jià)粘連的形成。使用如Kennedy等人((1996)Surgery 120866-871)所述的方法以0-5的等級(jí)計(jì)分0＝無(wú)粘連；1＝薄膜粘連；2＝不止一層薄粘連；3＝具有病灶點(diǎn)的厚粘連；4＝具有平面連接的厚粘連；and 5＝極厚血管粘連或不止一層平面粘連。這種計(jì)分系統(tǒng)接近于人類醫(yī)學(xué)上的系統(tǒng)，解釋了粘連的存在，并顯示了粘連病變的嚴(yán)重度；炎癥和粘連形成中較高的分值指示較大的嚴(yán)重度。結(jié)果示于表7。
表7大鼠粘連模型中化合物1的活性
表7所示數(shù)據(jù)證明與鹽水對(duì)照相比(中值＝4.0)，用100μg化合物1治療的大鼠中的粘連形成受到了顯著的限制(中值＝2.0)。這些數(shù)據(jù)證明這種多糖抗原有效地保護(hù)大鼠免于形成由嚴(yán)重外科手術(shù)操作所誘導(dǎo)的粘連，并表明式VI的化合物在體內(nèi)誘導(dǎo)抗炎效果。
實(shí)施例14式VI的化合物對(duì)豚鼠模型中延遲型超敏反應(yīng)的抑制的影響免疫調(diào)節(jié)劑如式VI的化合物，以化合物1為例，的安全性和有效性的臨床評(píng)價(jià)需要便利的生物標(biāo)志。這之所以必要，是因?yàn)榘踩院蛣┝看_定通常是在健康志愿者中確定的，其中并沒(méi)有測(cè)量到明確的炎性過(guò)程。此外，這樣的生物標(biāo)記將可用于后期試驗(yàn)，因?yàn)樵诿庖哒{(diào)節(jié)劑治療后，膿腫和/或粘連不能以非侵入的方式容易地觀察和進(jìn)行療效分級(jí)。所以，我們開(kāi)發(fā)了延遲型超敏(DTH)動(dòng)物模型(Gray等人(1994)Curr.Opin.Immunol.6425-437)。這種試驗(yàn)也可在人類中用作為生物標(biāo)志進(jìn)行使用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑的臨床療效研究。在臨床上，DTH皮試在總體評(píng)估人免疫能力方面具有重要價(jià)值(Gray等人(1994)Curr.Opin.Immunol.6425-437；Kuby等人(2000)Immunology，W.H.Freeman and Co)。包括如下所述給藥Candin(白色念珠菌皮試抗原)的這類測(cè)試常用于測(cè)試AIDS患者的免疫能力。
使用了豚鼠模型證明DTH應(yīng)答作為生物標(biāo)志的實(shí)用性。動(dòng)物模型中局域化的DTH應(yīng)答構(gòu)成了與T細(xì)胞功能有關(guān)的重要信息源。DTH應(yīng)答的直觀測(cè)量值可容易地在人類和動(dòng)物中觀察和測(cè)量到。在皮膚表面可觀察到并容易地定量測(cè)量紅腫、疹塊和/或硬結(jié)。
為此目的，體重250-299克的雌性Hartley豚鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)用于所有的DTH實(shí)驗(yàn)。豚鼠圈養(yǎng)在微型分離籠中，并任意給食(Ralston Purina，St.Louis，MO)和水。在剛來(lái)時(shí)，令動(dòng)物適應(yīng)24小時(shí)。從動(dòng)物后背剪去大約2×2英寸面積的毛。該區(qū)域用聚維酮碘(H&P Industries/Triad Medical Inc.，Mukwonago，WI)擦洗，接著以酒精擦洗。下一步，通過(guò)在背面頸部皮內(nèi)注射0.2ml白色念珠菌A26(ATCC 90234)生理鹽水懸液使動(dòng)物對(duì)白色念珠菌抗原致敏。白色念珠菌A26培養(yǎng)物于-80℃維持在甘油和乳糖冷凍液中，然后于35℃在Sabourauds和葡萄糖瓊脂斜面(DIFCO，Detroit，MI)上有養(yǎng)培養(yǎng)24小時(shí)。然后將培養(yǎng)物懸于無(wú)菌生理鹽水中，并在用前通過(guò)分光光度計(jì)調(diào)整至大約等于2.0×107細(xì)胞/ml的預(yù)定光密度。
致敏三天后，用以注射用無(wú)菌水(Abbott Laboratories，North Chicago，IL)配制的化合物1按100、10和1.0ng每0.2ml處理動(dòng)物。用0.2ml在背面頸部對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下注射。第三組動(dòng)物給藥水載體作為陽(yáng)性對(duì)照組。
致敏四天后，如上所述對(duì)動(dòng)物剃毛和擦洗。在剃毛區(qū)四個(gè)同等空白的區(qū)域上皮內(nèi)注射0.1ml Candin(Allermed Laboratories，Inc.，San Diego，CA)，其用作為先前已經(jīng)對(duì)白色念珠菌致敏的T細(xì)胞的回憶抗原。為時(shí)三天每日觀察動(dòng)物這四個(gè)部位上的紅斑、疹塊和硬結(jié)。記錄每個(gè)部位紅斑的兩個(gè)橫斷(垂直和水平)直徑。對(duì)其進(jìn)行平均，并計(jì)算紅斑面積(mm2)均值。將處理動(dòng)物與未處理對(duì)照進(jìn)行比較，以評(píng)估療效。
與對(duì)照動(dòng)物相比，化合物1處理動(dòng)物的紅斑面積下降，證明DTH皮膚試驗(yàn)對(duì)于臨床應(yīng)用和多糖免疫調(diào)節(jié)劑如式VI的化合物的評(píng)價(jià)來(lái)說(shuō)是合適的生物標(biāo)志。
實(shí)施例15式V和VI的化合物對(duì)人PBMCs中TNF-α的分化誘導(dǎo)式V和VI的化合物誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)生產(chǎn)促炎細(xì)胞因子TNF-α的能力如下測(cè)定。
來(lái)自人供體的PBMCs通過(guò)Ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)密度梯度離心分離，以1.0×106細(xì)胞/ml的密度涂布到含10％FBS的RPMI培養(yǎng)基(均來(lái)自Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中，并分別在存在或不存在化合物1和化合物2時(shí)于37℃在5％CO2氣氛中孵育18h。不同的對(duì)照細(xì)胞在如上相同的條件下與10ng/ml金黃色葡萄球菌肽聚糖(Sigma)一起孵育，這是強(qiáng)炎性肽聚糖。孵育后，通過(guò)沉淀從不同細(xì)胞中除去組織培養(yǎng)基，并使用商購(gòu)的利用了針對(duì)TNF-α的單克隆抗體夾心ELISA試劑盒(BD OptEIATMSet Human TNF，Catalog No.555212，Pharmingen，Inc.)測(cè)定其中存在的TNF-α的量。該ELISA試驗(yàn)具有7.8pg/ml TNF-α的檢測(cè)下限。
與500μg/ml、100μg/ml和1μg/ml化合物2孵育18h分別誘導(dǎo)產(chǎn)生64.0pg/ml、17.6pg/ml和1.82pg/ml TNF-α，而用這些供體細(xì)胞使用相同濃度的化合物1未觀察到可檢測(cè)的TNF-α。與10ng/ml金黃色葡萄球菌肽聚糖孵育在這些供體細(xì)胞中誘導(dǎo)26pg/ml TNF-α。
這些結(jié)果證明人PBMCs識(shí)別化合物2，它是式V化合物的代表，在所用濃度下生產(chǎn)促炎細(xì)胞因子TNF-α。相反，化合物1為式VI化合物的代表，并不在這些PBMCs中誘導(dǎo)TNF-α。這些觀察結(jié)果與實(shí)施例15中所述的那些一致。
盡管這樣描述了本發(fā)明，但顯然可以以多種方式對(duì)其加以改變。這樣的改變并不視為偏離本發(fā)明的精神和范圍，并且所有對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的這樣的改動(dòng)旨在囊括在如下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.式I的線性非交聯(lián)免疫調(diào)節(jié)聚合化合物 式I其中下標(biāo)n表示聚合物中式Y(jié)m單體單元的數(shù)目，是從2至375范圍內(nèi)的單個(gè)整數(shù)；上標(biāo)m表示聚合物中特定單體Ym的位置，從左至右順次為一組從1至n的整數(shù)；X1和X2獨(dú)立地為H或端基；式Y(jié)m的每一個(gè)單體單元獨(dú)立地為(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIa的基團(tuán)； 式IIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIb的基團(tuán) 式IIb；每一個(gè)R11、R21...Rn-11和Rn1獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；每一個(gè)R12、R22...Rn-12和Rn2獨(dú)立地為-OH、-NH2、氨基酸殘基、或含有2至10個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(j)每一個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(k)每一個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(d)所述氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合；或其藥學(xué)上可接受的鹽，只要所述線性聚合物不是(a)下式的均聚物，其中n為75至375 (b)或含下式的單體單元的均聚物
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R11、R21...Rn-11和Rn1中的一個(gè)或多個(gè)是甲基。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中R11、R21...Rn-11和Rn1每一個(gè)都是甲基。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物，其中X1和X2每一個(gè)都是H。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的化合物，其中n為75至375。
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其中n為2-10。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其中n為2或3。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)是二肽。
9.如權(quán)利要求8所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都是二肽。
10.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)是三肽。
11.如權(quán)利要求10所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都是三肽。
12.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中所述化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)是四肽。
13.如權(quán)利要求12所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都是四肽。
14.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)是五肽。
15.如權(quán)利要求14所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都是五肽。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物，其中式Y(jié)m的一個(gè)或多個(gè)單體單元是(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIIa的基團(tuán)； 式IIIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIIb的基團(tuán) 式IIIb其中每一個(gè)R13、R23...Rn-13和Rn3獨(dú)立地為-OH或-NH2；每一個(gè)R14、R24...Rn-14和Rn4獨(dú)立地為-OH或-NH2、氨基酸殘基、或含有2至8個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(d)每一個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(e)每一個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(f)所述氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合。
17.如權(quán)利要求16所述的化合物，其中(a)式Y(jié)m的每一個(gè)單體單元，除了Yn之外，為式IIIa的基團(tuán)；和(b)Yn為式IIIb的基團(tuán)。
18.如權(quán)利要求16或17所述的化合物，其中所述化合物是基本上純的形式。
19.如權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的化合物，其中式Y(jié)m的任何一個(gè)單體單元都不是(a)當(dāng)Ym不是Yn時(shí)，式IIIa的基團(tuán)； 式IIIa或者(b)當(dāng)Ym是Yn時(shí)，式IIIb的基團(tuán) 式IIIb其中每一個(gè)R13、R23...Rn-13和Rn3獨(dú)立地為-OH或-NH2；每一個(gè)R14、R24...Rn-14和Rn4獨(dú)立地為-OH或-NH2、氨基酸殘基或者含有2至8個(gè)氨基酸殘基的肽，其中(l)每一個(gè)氨基酸殘基獨(dú)立地為D或L構(gòu)型；(m)每一個(gè)氨基酸殘基未被取代，或用一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷基、羥基、烷氧基、苯氧基、CF3、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、-C(O)O烷基和-NO2的基團(tuán)取代；和(n)所述氨基酸殘基獨(dú)立地連接在γ羧基的α位上、α或ε氨基上、或者是它們的任意組合；
20.如權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)帶凈電荷。
21.如權(quán)利要求20所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都帶凈電荷。
22.如權(quán)利要求20或21所述的化合物，其中所述的凈電荷是負(fù)的。
23.如權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2中的一個(gè)或多個(gè)帶凈中性電荷。
24.如權(quán)利要求23所述的化合物，其中R12、R22...Rn-12和Rn2每一個(gè)都帶凈中性電荷。
25.如權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述線性聚合物是均聚物。
26.如權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述線性聚合物是隨機(jī)共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物。
27.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中所述線性聚合物是隨機(jī)共聚物。
28.如權(quán)利要求26或27所述的化合物，其中所述線性聚合物包含兩種不同的單體單元。
29.如權(quán)利要求26或27所述的化合物，其中所述線性聚合物包含兩種以上不同的單體單元。
30.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，連同藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
31.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，還包括分散劑。
32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述分散劑是聚乙二醇、甘油或蔗糖。
33.如權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備用于預(yù)防或治療對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑治療敏感的疾病或紊亂的藥物。
34.如權(quán)利要求16、17或18所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備疫苗佐劑的用途。
35.如權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于預(yù)防或治療對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑治療敏感的疾病或紊亂的用途。
36.一種在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的化合物。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的免疫應(yīng)答是炎性的，并且所述化合物是權(quán)利要求16、17或18的化合物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是抗炎性的，并且所述化合物是權(quán)利要求19的化合物。
39.一種預(yù)防或治療需要預(yù)防或治療的哺乳動(dòng)物的炎性疾病、病情或紊亂的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的權(quán)利要求19的化合物。
40.一種在需要預(yù)防或治療的哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑治療應(yīng)答的炎性疾病、病情或紊亂的方法，所述免疫調(diào)節(jié)劑刺激炎性免疫應(yīng)答，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的權(quán)利要求16、17或18的化合物。
41.一種在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效量的下式的線性均聚物，其中n為2至37全文摘要
本發(fā)明提供了根據(jù)其結(jié)構(gòu)而具有抗炎或炎性免疫調(diào)節(jié)特性的合成多糖抗原(SPAs)。本發(fā)明還提供了包含這些SPAs的組合物，以及使用這些SPAs和組合物通過(guò)利用合適的SPAs，預(yù)防或治療炎性病變、或者對(duì)炎性調(diào)節(jié)劑治療敏感的疾病或病情的方法。
文檔編號(hào)C07K9/00GK1867589SQ200480030122
公開(kāi)日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者L·C·布拉茨扎克, J·A·小克萊伍蘭德, K·A·泰勒, N·T·布萊克本, A·R·克拉夫特, C·E·科恩 申請(qǐng)人:伊萊利利公司