專利名稱：基于 Seneca Valley 病毒的組合物以及疾病的治療方法
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背景技術(shù)：
病毒治療給癌癥治療帶來巨大的希望。針對(duì)特異性結(jié)合以及殺傷癌細(xì)胞的腫瘤消解病毒，無論是天然的或者工程化的比諸如化療以及輻射的選擇性治療更有效并且毒性較低。此外，腫瘤消解病毒治療是已知可以擴(kuò)大藥理學(xué)目標(biāo)位點(diǎn)的治療的唯一治療手段。
癌癥治療的一個(gè)關(guān)鍵方面是與正常細(xì)胞相比實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的高效率殺傷。該目標(biāo)由于多種原因很難實(shí)現(xiàn)，包括所含有的寬范圍的細(xì)胞類型，由于轉(zhuǎn)移引起的癌細(xì)胞的全身性擴(kuò)散以及正常以及癌細(xì)胞之間較狹窄的生物差異。雖然已經(jīng)取得了進(jìn)展，但是仍然需要改進(jìn)目前的癌癥治療。
過去，外科醫(yī)生試圖通過手術(shù)除去腫瘤，而且不顯著傷害患者。即使完全除去原發(fā)腫瘤也不能確保存活，因?yàn)樵谏眢w內(nèi)未知位點(diǎn)的早期轉(zhuǎn)移常常不易被發(fā)現(xiàn)。還有一些研究暗示外科手術(shù)可能由于除去產(chǎn)生血管生成抑制劑的腫瘤細(xì)胞加強(qiáng)遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的生長。最終，在很多情況下，腫瘤在外科手術(shù)除去后在初始位點(diǎn)又重新生長。放射的目的在于以其它損傷為代價(jià)選擇性破壞最迅速增殖的細(xì)胞。然而，腫瘤細(xì)胞可能或者通過耐受或者通過在治療期間處于不分裂狀態(tài)逃避放射治療。此外，放射對(duì)于許多主動(dòng)分裂的正常細(xì)胞(胃腸細(xì)胞，毛囊等)并不總是選擇性的，切所述的正常細(xì)胞由于治療被殺傷。
與放射一樣，化療并不是完全選擇性的因此破壞許多正常細(xì)胞，并且由于耐藥性和/或細(xì)胞的分裂狀態(tài)而不殺傷所有的腫瘤細(xì)胞。因此，化療以及放療利用正常和癌細(xì)胞之間存在的較小的微分靈敏度，從而產(chǎn)生較窄的治療指數(shù)。較小的治療指數(shù)很明顯是任何癌癥治療方式不合需要的特性。因此，人們期望存在克服這些局限性的新的癌癥治療方法。
腫瘤消解病毒治療是一種這樣的新方法。最初，在試圖治療癌癥中使用攜帶細(xì)胞毒轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型病毒。然而，發(fā)現(xiàn)所述病毒在轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤中效率較低并且不足以選擇性針對(duì)癌癥。為了克服這種局限性，或者修飾該病毒用于在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行選擇性復(fù)制或者去發(fā)現(xiàn)具有天然腫瘤選擇性特性的病毒。通過對(duì)腫瘤塊局部注射病毒或者通過全身遞送病毒，這些腫瘤消解病毒因此具有選擇性復(fù)制，擴(kuò)散和殺傷腫瘤細(xì)胞的特性(圖1)。
盡管這些新近定義種類的抗癌治療很早就有治療希望，但是仍然有幾個(gè)局限性限制其作為癌癥治療的應(yīng)用。
因此，目前需要可用于癌癥治療的新的腫瘤消解病毒。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的微小RNA病毒(此后稱為Seneca Valley病毒(″SVV″))，其天然特性包括能夠選擇性殺傷一些類型的腫瘤。如以下實(shí)施例中所述，SVV選擇性殺傷具有親神經(jīng)特性的腫瘤系，在大多數(shù)情況下與正常細(xì)胞相比殺傷50％腫瘤細(xì)胞的所需病毒量(即，EC50值)具有大于10,000倍的差異。這個(gè)結(jié)果也適于體內(nèi)，其中小鼠中的腫瘤外植體被選擇性消除。此外，體內(nèi)結(jié)果顯示SVV對(duì)于正常細(xì)胞沒有毒性，因?yàn)槿硎┯酶哌_(dá)1×1014vp/kg(載體或者病毒粒子/kg體重)不引起免疫缺陷或者免疫活性小鼠的死亡并且沒有可見的臨床癥狀。
SVV在低達(dá)1×108vp/kg的劑量時(shí)仍有效力；因此，實(shí)現(xiàn)＞100,000的高治療指數(shù)。SVV的效力非常強(qiáng)，因?yàn)樾∈篌w內(nèi)100％的較大的預(yù)形成的腫瘤可被完全除去(參見實(shí)施例11)。該效力可以通過單一系統(tǒng)性注射SVV介導(dǎo)而無需任何附加治療。此外，SVV注射的小鼠在注射后至少200天既不顯示臨床癥狀又不顯示腫瘤的復(fù)發(fā)。SVV還可以被純化至高滴度并且可在允許細(xì)胞系中以每細(xì)胞＞200,000病毒粒子來產(chǎn)生?；赟VV的病毒治療因此顯示出作為對(duì)于選型癌癥治療的安全，有效以及新類型治療的重要前途。
此外，SVV具有較小并且容易操作的基因組，簡單和快速的生命周期，以及被充分了解的衣殼，并且因此易于修飾。這些特性，至少部分可以允許利用產(chǎn)生修飾的SVVs的方法，所述修飾的SVVs具有新的細(xì)胞或者組織特異性趨性，因此基于SVV的治療可由初始的SVV分離物導(dǎo)向耐受感染的新的腫瘤類型。
因此，本發(fā)明提供了包括與SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者這些至少50個(gè)核苷酸長度的序列的任何一個(gè)相鄰的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸序列，或者與至少10，15或者20個(gè)核苷酸長度的這些序列的任何一個(gè)的相鄰部分具有95％同一性的分離的核酸。本發(fā)明該分離的核酸可以是RNA或者DNA。
在其它的方面，本發(fā)明提供了在高，中等嚴(yán)格或者低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者至少50個(gè)核苷酸長度的這些序列的任何一個(gè)的相鄰部分雜交的分離的核酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括與SEQ ID NOs 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者至少50個(gè)核苷酸長度的這些序列的任何一個(gè)的相鄰部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸序列的載體。
本發(fā)明還提供了由包括與SEQ ID NOs 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者至少50個(gè)核苷酸長度的這些序列的任何一個(gè)的相鄰部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸編碼的分離的多肽。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括與SEQ ID NOs 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或者至少10個(gè)氨基酸長度的這些序列的任何一個(gè)的相鄰部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的氨基酸序列的分離的多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合包括與SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或者至少10個(gè)氨基酸長的這些序列的任何一個(gè)的相鄰部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的氨基酸序列的多肽的分離的抗體。該分離的抗體的產(chǎn)生可以使其結(jié)合于SEQ ID NO2的任一蛋白質(zhì)表位或者抗原。此外，該抗體可以是多克隆抗體，單克隆抗體或者嵌合抗體。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的SVV或者其具有包括與SEQ IDNO1有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的基因組序列的衍生物或者相關(guān)物。
在另一方面，本發(fā)明提供了具有美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)專利保藏號(hào)PTA一5343的所有鑒定特性以及核酸序列的分離的病毒。本發(fā)明的一些病毒涉及PTA-5343分離物，PTA-5343分離物的變體，同系物，相關(guān)物，衍生物以及突變體，以及根據(jù)被確定為決定其腫瘤消解特性的SVV的序列(野生型以及突變體)修飾的其它病毒的變體，同系物，衍生物以及突變體。
本發(fā)明還提供了包括下列特性的分離的SVV-7.5千堿基(kb)的單鏈RNA基因組(陽性(+)有義鏈)；-27毫微米(nm)的直徑；包括具有約31kDa，36kDa以及27kDa的分子量的至少3種蛋白的衣殼；在氯化銫(CsCl)梯度上大約1.34g/mL的浮力密度；以及腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力。在該方面，31kDa衣殼蛋白(VP1)可以包含與SEQ ID NO8具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列；36kDa衣殼蛋白(VP2)可以包含與SEQ ID NO4具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列；以及27kDa衣殼蛋白(VP3)可以包含與SEQ ID NO6具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括下列特性的分離的SVV衍生物或者相關(guān)物腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力，腫瘤-細(xì)胞趨性，以及正常細(xì)胞中缺少消解。在另一方面，病毒在具有神經(jīng)內(nèi)分泌特性的腫瘤細(xì)胞類型中具有復(fù)制能力。
在其它方面，本發(fā)明提供了包括有效量的本發(fā)明的病毒以及藥用載體的藥物組合物；包括本發(fā)明病毒的細(xì)胞；包含本發(fā)明的病毒抗原的病毒裂解物；以及獲自本發(fā)明的病毒的分離的以及純化的病毒抗原。
在另一方面，本發(fā)明提供了純化本發(fā)明病毒的方法，包括用病毒感染細(xì)胞；收獲細(xì)胞裂解物；將細(xì)胞裂解物進(jìn)行至少一輪的梯度離心；以及從梯度分離病毒。
在另一方面，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，包括施用有效量的病毒或者其衍生物，以便治療癌癥，其中所述病毒具有包括與SEQ IDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者SEQ ID NO1的一部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的基因組序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，包括施用有效量包括含有與SEQ ID NO3，5，7或者其相鄰部分有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的編碼衣殼的區(qū)域的病毒。本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法，包括施用有效量包括含有與SEQID NO4，6，8或者其相鄰部分有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的氨基酸序列的衣殼的病毒。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抑制癌癥進(jìn)展的方法，包括將癌細(xì)胞與病毒或者其衍生物接觸，其中病毒或者其衍生物特異性結(jié)合癌細(xì)胞，其中所述病毒具有包括與SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的基因組序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了殺傷癌細(xì)胞的方法，包括將癌細(xì)胞與有效量的病毒或者其衍生物接觸，其中所述病毒具有包括與SEQ IDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的基因組序列。
在這些針對(duì)癌癥的方法中，病毒可以是微小RNA病毒。微小RNA病毒可以是心臟病毒，erbovirus，口蹄疫病毒，kobuvirus，肝病毒，副腸孤病毒，teschovirus，腸道病毒或者鼻病毒。心臟病毒可以選自vilyuisk人腦脊髓炎病毒，Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒，腦心肌炎病毒以及SVV。腦心肌炎病毒可以選自如下分離物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695以及NC-88-23626。SVV可以是具有ATCC保藏號(hào)PTA-5343的病毒或者包括與SEQ ID NO1或者其相鄰的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的核酸序列的病毒。
本發(fā)明還提供了殺傷異常增殖細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與本發(fā)明的病毒接觸。在一個(gè)方面，異常增殖的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在該方法的其他方面，腫瘤細(xì)胞選自人小細(xì)胞肺癌，人成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，人成神經(jīng)細(xì)胞瘤，人成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤，維耳姆斯瘤以及人非小細(xì)胞肺癌。
本發(fā)明還提供了治療受試者腫瘤病癥的方法，包括給受試者施用有效量的本發(fā)明病毒至哺乳動(dòng)物。一個(gè)方面，腫瘤病癥是神經(jīng)內(nèi)分泌癌癥。在另一方面，受試者是哺乳動(dòng)物。在另一方面，受試者是人。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明病毒的方法，包括在可以使病毒復(fù)制的條件下溫育感染有病毒的細(xì)胞以及從細(xì)胞或者上清液回收病毒。在該方法的一個(gè)方面，細(xì)胞是PER C6細(xì)胞。在本方法的另一方面，細(xì)胞是H446細(xì)胞。在本方法的其它方面，該細(xì)胞可以每細(xì)胞產(chǎn)生超過200,000個(gè)的病毒粒子。
在另一方面，本發(fā)明提供了檢測本發(fā)明病毒的方法，包括從懷疑含有本發(fā)明病毒的試驗(yàn)材料分離RNA；標(biāo)記對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的至少15個(gè)相鄰核苷酸的RNA；用標(biāo)記的RNA探測試驗(yàn)材料；以及檢測標(biāo)記的RNA與分離自試驗(yàn)材料的RNA的結(jié)合，其中結(jié)合顯示病毒的存在。另一方面，本發(fā)明提供了包括對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1或者其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)相鄰核苷酸的核苷酸序列的核酸探針。
本發(fā)明還提供了制備腫瘤消解心臟病毒的方法，該方法包括(a)將SVV基因組序列與試驗(yàn)病毒基因組序列相比較；(b)至少鑒定由SVV基因組序列編碼的多肽以及由試驗(yàn)病毒基因組序列編碼的多肽之間第一個(gè)氨基酸的差異；(c)對(duì)試驗(yàn)的病毒基因組序列進(jìn)行突變使得由試驗(yàn)病毒基因組序列編碼的多肽與由SVV基因組序列編碼的多肽具有至少一個(gè)氨基酸的差異；(d)將突變的試驗(yàn)病毒序列轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞中；以及(e)確定腫瘤細(xì)胞是否被突變的試驗(yàn)病毒基因組序列消解性感染。在一個(gè)方面，在試驗(yàn)病毒中突變的氨基酸是結(jié)構(gòu)區(qū)域中諸如編碼衣殼的區(qū)域中的氨基酸。在另一方面，試驗(yàn)病毒中突變的氨基酸是非結(jié)構(gòu)區(qū)域中的氨基酸。
在制備腫瘤消解病毒方法的一個(gè)方面，SVV基因組序列獲自ATCC保藏號(hào)為PTA-5343的分離的SVV或者獲自包括與SEQ IDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相鄰的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的病毒。本方法的另一方面，使試驗(yàn)病毒基因組序列突變的步驟包括使具有試驗(yàn)病毒基因組序列的cDNA突變。該方法的另一方面，使突變的試驗(yàn)病毒基因組序列轉(zhuǎn)染的步驟包括轉(zhuǎn)染RNA，其中RNA由具有突變的試驗(yàn)病毒基因組序列的cDNA產(chǎn)生。
在制造腫瘤消解心臟病毒的方法的另一方面，試驗(yàn)病毒是微小RNA病毒。該試驗(yàn)的微小RNA病毒可以是teschovirus，腸道病毒，鼻病毒，心臟病毒，erbovirus，apthovirus，kobuvirus，肝病毒，副腸孤病毒或者teschovirus。在另一方面，試驗(yàn)病毒是心臟病毒。在另一方面，在制備腫瘤消解病毒方法中鑒定的氨基酸差異是在SVV衣殼蛋白以及試驗(yàn)的病毒衣殼蛋白序列之間。在制備腫瘤消解病毒的另一方面，試驗(yàn)病毒基因組序列選自Vilyuisk人腦脊髓炎病毒，Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒，以及腦心肌炎病毒。在另一方面，試驗(yàn)的病毒基因組序列選自腦心肌炎病毒。腦心肌炎病毒可以選自如下分離物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695以及NC-88-23626。在另一方面，腦心肌炎病毒或者任一其它的試驗(yàn)病毒可以選自具有包括與ATCC保藏號(hào)PTA-5343的SVV或SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相鄰的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％序列同一性的核酸序列的分離物。
在腫瘤消解心臟病毒制備方法的另一方面，試驗(yàn)病毒以及SVV之間的氨基酸差異是在SVV的衣殼蛋白區(qū)域，其中氨基酸差異與SVVSEQ ID NO4，6或者8對(duì)準(zhǔn)。
本發(fā)明還提供了制備改變細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的方法，所述方法包括(a)產(chǎn)生病毒突變體文庫，包括大量核酸序列；(b)將病毒突變體文庫轉(zhuǎn)染到允許的細(xì)胞中，由此產(chǎn)生大量的突變體病毒；(c)分離大量的突變體病毒；(d)用分離的大量突變體病毒溫育不允許的細(xì)胞；以及(e)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒，由此制備改變趨性的突變體病毒。在一個(gè)方面，該方法還包括如下步驟(f)在不允許的細(xì)胞中溫育回收的突變體病毒；以及(g)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒。在另一方面，該方法還包括反復(fù)重復(fù)步驟(f)以及(g)。在另一方面，病毒突變體的文庫由包括SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相鄰部分的親本序列產(chǎn)生。
在制備改變細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的方法的一個(gè)方面，在多孔高通量平臺(tái)中進(jìn)行溫育，其中該平臺(tái)在每一孔中包括不同類型的不允許的細(xì)胞。在該方面，所述方法可以更進(jìn)一步包含篩選平臺(tái)鑒定哪些孔包含殺傷細(xì)胞的突變體病毒。在另一方面，篩選由分析每一孔中的吸光度進(jìn)行。
在制備具有改變的細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的制備方法的另一方面，不允許的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
在制備改變細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的方法的另一方面，產(chǎn)生病毒突變體文庫的步驟包括(i)提供與病毒的基因組序列的一部分具有同一性的序列的多核苷酸；(ii)使多核苷酸突變以便產(chǎn)生大量不同的突變體多核苷酸序列；以及(iii)將大量的突變的多核苷酸連接到除步驟(i)中所含的多核苷酸的病毒的基因組序列的部分病毒的基因組序列的載體中，由此產(chǎn)生病毒突變體的文庫。在一個(gè)方面，病毒的基因組序列來自微小RNA病毒。在另一方面，病毒的基因組序列包括與SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相鄰的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的序列的病毒。在另一方面，在產(chǎn)生病毒突變體文庫的步驟中，步驟(ii)的突變由將核苷酸隨機(jī)插入多核苷酸進(jìn)行。在一個(gè)方面，核苷酸的隨機(jī)插入由三核苷酸-致誘變(TRIM)進(jìn)行。在另一方面，插入多核苷酸的至少一部分核苷酸編碼附加表位。另一方面，在產(chǎn)生病毒突變體文庫的步驟中，步驟(ii)的突變是在多核苷酸的編碼衣殼的區(qū)域進(jìn)行的。
本發(fā)明還提供了制備改變細(xì)胞類型趨性的突變體心臟病毒的方法，所述方法包括(a)產(chǎn)生心臟病毒突變體多核苷酸序列文庫，其中該產(chǎn)生包括提供編碼心臟病毒衣殼區(qū)域的多核苷酸；對(duì)多核苷酸突變以便產(chǎn)生大量編碼不同的突變體衣殼-多核苷酸序列；以及將大量突變的編碼衣殼的多核苷酸連接到除了編碼衣殼的區(qū)域的心臟病毒的基因組序列的載體中，由此產(chǎn)生心臟病毒的突變體多核苷酸序列的文庫；(b)將突變體多核苷酸序列的文庫轉(zhuǎn)染進(jìn)入允許的細(xì)胞，由此產(chǎn)生大量的突變體病毒；(c)分離大量的突變體病毒；(d)用分離的大量突變體病毒溫育不允許的細(xì)胞；以及(e)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒，由此制備改變趨性的突變體心臟病毒。在一個(gè)方面，該方法還包括如下步驟(f)在不允許的細(xì)胞中溫育回收的突變體病毒；以及(g)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒。在另一方面，該方法還包括反復(fù)重復(fù)步驟(f)以及(g)。在另一方面，該突變由將核苷酸隨機(jī)插入編碼衣殼的多核苷酸進(jìn)行。在另一方面，隨機(jī)插入編碼衣殼的多核苷酸的核苷酸的至少一部分編碼附加表位。在另一方面，核苷酸的隨機(jī)插入由TRIM進(jìn)行。在另一方面，大量不同突變體編碼衣殼的多核苷酸序列包括大于108或者109個(gè)不同的編碼衣殼的多核苷酸序列。
在一個(gè)方面，制備改變細(xì)胞類型的趨性的突變體SVV的方法包括(a)產(chǎn)生SVV突變體的cDNA文庫；(b)由SVV突變體的cDNA文庫產(chǎn)生SVV RNA；(c)將SVV RNA轉(zhuǎn)染入允許的細(xì)胞，由此產(chǎn)生大量突變體SVV；(d)分離大量的突變體SVV；(e)用分離的大量突變體SVV溫育不允許的腫瘤細(xì)胞；以及(f)回收消解性感染不允許的腫瘤細(xì)胞的突變體SVV，由此制備改變趨性的突變體SVV。在另一方面，該方法還包括如下步驟(f)在不允許的腫瘤細(xì)胞中溫育回收的突變體SVV；以及(h)回收消解性感染不允許的腫瘤細(xì)胞的突變體SVV。另一方面，該方法還包括反復(fù)重復(fù)步驟(f)以及(h)。一個(gè)方面，在多孔高通量平臺(tái)中進(jìn)行溫育，其中該平臺(tái)在每一孔中包括不同類型的不允許的腫瘤細(xì)胞。在另一方面，所述方法更進(jìn)一步包括篩選平臺(tái)鑒定哪些孔包括消解性感染細(xì)胞的突變體SVV。在另一方面，篩選由分析每一孔中的吸光度進(jìn)行。在一個(gè)方面，SVV突變體的cDNA文庫包括大量的突變體SVV衣殼多核苷酸序列。在另一方面，大量的突變體SVV衣殼多核苷酸序列由隨機(jī)插入核苷酸產(chǎn)生。在另一方面，隨機(jī)插入的至少一部分核苷酸的序列編碼附加表位。在另一方面，核苷酸的隨機(jī)插入由TRIM進(jìn)行。在另一方面，SVV突變體的cDNA文庫由ATCC保藏號(hào)PTA-5343的SVV產(chǎn)生。在另一方面，SVV突變體的cDNA文庫由包括與SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21具有至少99％，95％，90％，85％，80％，75％，70％，或者65％序列同一性的序列的SVV產(chǎn)生。在另一方面，不允許的腫瘤細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞系或者由患者分離的腫瘤細(xì)胞類型。
本發(fā)明還提供了制備體內(nèi)腫瘤細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生包括大量核酸序列的病毒突變體的文庫；(b)將病毒突變體的文庫轉(zhuǎn)染允許的細(xì)胞，由此產(chǎn)生大量的突變體病毒；(c)分離大量的突變體病毒；(d)將分離的大量突變體病毒施用給患有腫瘤的哺乳動(dòng)物，其中哺乳動(dòng)物不是突變體病毒的未突變形式的天然寄主；以及(e)回收在腫瘤中復(fù)制的病毒，由此制備具有體內(nèi)腫瘤細(xì)胞類型趨性的突變體病毒。在一個(gè)方面，產(chǎn)生病毒突變體文庫的步驟包括提供編碼病毒的衣殼區(qū)域的多核苷酸；對(duì)多核苷酸突變以便產(chǎn)生大量不同的編碼突變體衣殼的多核苷酸序列；以及將大量突變的編碼衣殼的多核苷酸連接至病毒除了編碼衣殼區(qū)域的基因組序列的載體，由此產(chǎn)生病毒突變體的文庫。在另一方面，步驟(e)中回收的病毒消解性感染腫瘤的細(xì)胞。在制備體內(nèi)腫瘤細(xì)胞類型趨性的突變體病毒方法的另一方面，腫瘤是異種移植，同系基因腫瘤，同位腫瘤或者轉(zhuǎn)基因腫瘤。在另一方面，哺乳動(dòng)物是小鼠。
對(duì)本發(fā)明的所有方法，病毒可以是微小RNA病毒。微小RNA病毒可以是心臟病毒，erbovirus，口瘡病毒，kobuvirus，肝病毒，副腸孤病毒，teschovirus，entrovirus，或者鼻病毒。心臟病毒可以是SVV。SVV可以是ATCC保藏號(hào)PTA-5343的SVV或者包括與SEQ ID NO1，3，6，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相鄰的部分具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或者99％同一性的序列的SVV。更進(jìn)一步，心臟病毒可以選自vilyuisk人腦脊髓炎病毒，Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒以及腦心肌炎病毒。在一個(gè)方面，腦心肌炎病毒選自如下分離物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695以及NC-88-23626。在另一方面，本發(fā)明包含任一選自與ATCC保藏號(hào)PTA-5343的SVV或者SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者其相鄰的部分具有至少99％，95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％序列同一性的分離物或者換句話說由序列同源性與SVV相關(guān)的任一病毒。
本發(fā)明還提供了由在這里公開的突變體病毒的任一制備方法制備的腫瘤消解病毒。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用腫瘤消解病毒治療患者的方法，該方法包括(a)滅活通過在這里公開的突變體病毒的任一制備方法制備的腫瘤消解，使得腫瘤消解病毒不具感染性并且腫瘤消解病毒的趨性是不受影響；以及(b)將輻射的腫瘤消解病毒施用給腫瘤患者。在另一方面，患者的治療方法更進(jìn)一步包括將毒素與滅活的腫瘤消解病毒連接。
在另一方面，本發(fā)明提供了用SVV治療腫瘤患者的方法，該方法包括(a)滅活SVV，使得病毒不具感染性并且趨性不受影響；以及(b)給腫瘤患者施用滅活的SVV。在另一方面，用SVV治療腫瘤患者的方法更進(jìn)一步包括將毒素與滅活的SVV連接。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括滅活的SVV的SVV組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了包括整合入衣殼區(qū)域的附加表位的SVV。
本發(fā)明還提供了用SVV治療腫瘤患者的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生包括在衣殼中編碼的附加表位的突變體SVV；(b)將毒素與附加表位連接；以及(c)給腫瘤患者施用具有連接的毒素的突變體SVV。在一個(gè)方面，該產(chǎn)生包括將編碼附加表位的寡核苷酸插入SVV的編碼衣殼的區(qū)域的多核苷酸致。在一個(gè)方面，突變體SVV不改變細(xì)胞的類型趨性。在另一方面，該方法更進(jìn)一步包括滅活突變體SVV，使得突變體SVV不具感染性。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中腫瘤細(xì)胞的方法，包括(a)由患者分離腫瘤樣品；(b)用已附加表位的SVV溫育腫瘤樣品；以及(c)通過檢測附加表位篩選結(jié)合SVV的腫瘤樣品。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了體內(nèi)檢測腫瘤細(xì)胞的方法，包括(a)給患者施用滅活的已附加表位的SVV，其中標(biāo)記與附加表位結(jié)合；以及(b)檢測患者體內(nèi)的標(biāo)記。在檢測本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞的方法中，SVV可以是由在這里公開的方法產(chǎn)生的突變體SVV。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的治療腫瘤病癥的方法，檢測腫瘤病癥的方法以及產(chǎn)生SVV的方法適用于野生型SVV，突變體(包括修飾的或者變體)SVV，SVV的相關(guān)物及其他本發(fā)明的腫瘤特異性病毒。
本發(fā)明的病毒，及其組合物可被用于生產(chǎn)用于治療在這里提到的疾病的藥物。更進(jìn)一步，本發(fā)明的病毒及其組合物可用于治療在這里提到的疾病。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了SVV(或者其突變體，衍生物，相關(guān)物以及組合物)在治療癌癥或者生產(chǎn)用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
保藏信息下列材料已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約對(duì)于國際承認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的規(guī)定保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，美國。在專利授權(quán)后對(duì)于保藏物的可利用性的所有限制均可不可逆地除去。材料SenecaValley病毒(SVV)。ATCC專利保藏號(hào)PTA-5343。保藏日期2003年7月25日。


圖1顯示了利用腫瘤消解病毒進(jìn)行病毒治療的示意圖。通過對(duì)腫瘤塊局部注射病毒或者通過全身遞送病毒，腫瘤消解病毒因此具有選擇性復(fù)制，擴(kuò)散和殺傷腫瘤細(xì)胞的特性。
圖2顯示了用乙酸雙氧鈾染色以及由透射電子顯微術(shù)試驗(yàn)的純化的SVV。球狀病毒粒子直徑為約27nm。
圖3是具有較大晶狀包涵體以及較大泡囊狀體的SVV-感染的PER.C6細(xì)胞的電子顯微照片。
圖4A顯示了SVV RNA的分析。SVV基因組RNA利用硫氰酸胍以及利用Trizol(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的苯酚提取法提取。RNA通過1.25％變性瓊脂糖凝膠溶解。由溴化乙錠(EtBr)染色以及照相目測條帶。在泳道2，觀察到SVV基因組RNA的一條主要條帶，顯示全長SVV基因組的大小為約7.5千堿基[確定]。
圖4B是顯示微小RNA病毒，包括SVV的基因組結(jié)構(gòu)以及由多蛋白加工產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物的示意圖。
圖5A-5E顯示了SVV的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。終止子由5671-3位的“*”表示。通常，在包括確定的核苷酸精確位置的序列公開中，這些位置由“n”表示。因此，具有“n”的密碼子中，相關(guān)氨基酸表示為“x”。
圖6A-6D顯示了SVV的全長基因組的大多數(shù)核苷酸序列(SEQ IDNO1)。核苷酸序列源自于ATCC專利保藏號(hào)PTA-5343的SVV分離物。保藏日期2003年7月25日。
圖7A-7B顯示了由SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖8顯示了SVV的部分1B或者VP2編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQID NO3)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸4-429相一致。
圖9顯示由SEQ ID NO3編碼的部分SVV VP2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。SEQ ID NO4中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸2-143相同。
圖10顯示了SVV的1C或者VP3編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO5)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸430-1146相一致。
圖11顯示由SEQ ID NO5編碼的SVV VP3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。SEQ ID NO6中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸144-382相一致。
圖12顯示了SVV的1D或者VP1編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO7)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸1147-1923相一致。
圖13顯示由SEQ ID NO7編碼的SVV VP1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。SEQ ID NO8中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸383-641相一致。
圖14顯示了SVV的2A編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸1924-1965相一致。
圖15顯示由SEQ ID NO9編碼的SVV 2A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。SEQ ID NO10中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸642-655相一致。
圖16顯示了SVV的2B編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸1966-2349相一致。
圖17顯示由SEQ ID NO11編碼的SVV 2B蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。SEQ ID NO12中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸656-783相一致。
圖18顯示了SVV的2C編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO13)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸2350-3315相一致。
圖19顯示由SEQ ID NO13編碼的SVV 2C蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。SEQ ID NO14中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸784-1105相一致。
圖20顯示了SVV的3A編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO15)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸3316-3585相一致。
圖21顯示由SEQ ID NO15編碼的SVV 3A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO16)。SEQ ID NO16中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸1106-1195相一致。
圖22顯示了SVV的3B編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO17)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸3586-3651相一致。
圖23顯示由SEQ ID NO17編碼的SVV 3B蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO18)。SEQ ID NO18中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸1196-1217相一致。
圖24顯示了SVV的3C編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO19)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸3652-4284相一致。
圖25顯示由SEQ ID NO19編碼的SVV 3C蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO20)。SEQ ID NO20中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸1218-1428相一致。
圖26顯示了SVV的3D編碼區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO21)。該序列與SEQ ID NO1的核苷酸4285-5673相一致。
圖27顯示由SEQ ID NO21編碼的SVV 3D蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO22)。SEQ ID NO22中列舉的序列與SEQ ID NO2的氨基酸1429-1890相一致。
圖28A-28H顯示SVV SEQ ID NO2以及不同成員的心臟病毒，諸如腦心肌炎病毒(EMCV；種腦心肌炎病毒)，Theiler氏鼠腦心肌炎病毒(TMEV；種Theilovirus)，大鼠TMEV-類介質(zhì)(TLV；種Theilovirus)，以及Vilyuisk人腦脊髓炎病毒(VHEV；種Theilovirus)之間的氨基酸序列比對(duì)。不同心臟病毒的特異性序列存在于SEQ IDNOs23(EMCV-R)，24(EMCV-PV21)，25(EMCV-B)，26(EMCV-Da)，27(EMCV-Db)，28(EMCV-PV2)，29(EMCV-Mengo)，30(TMEV/DA)，31(TMEV/GDVII)，32(TMEV/BeAn8386)，33(TLV-NGS910)以及34(VHEV/Siberia-55)。
圖28中的編號(hào)位置不對(duì)應(yīng)于序列表的編號(hào)。符號(hào)“/”顯示多蛋白被切割成其最終的功能性產(chǎn)物的切割位點(diǎn)。例如，1和157位之間的比對(duì)是在1A(VP4)區(qū)域中。159和428位之間的對(duì)比是在1B(VP2)區(qū)域中；430和668位之間的比對(duì)在1C(VP3)區(qū)域中；670和967之間的比對(duì)在1D(VP1)區(qū)域中；969和1111位之間的比對(duì)在2A區(qū)域中；1112和1276位之間的比對(duì)在2B區(qū)域中；1278和1609之間的比對(duì)在2C區(qū)域中；1611和1700位之間的比對(duì)在3A區(qū)域中；1702和1723之間的比對(duì)在3B區(qū)域中；1725和1946之間的比對(duì)在3C區(qū)域中；1948和2410之間的比對(duì)在3D區(qū)域中。比對(duì)也顯示可以由標(biāo)準(zhǔn)序列分析程序確定的病毒序列之間潛在保守或者相似性的區(qū)域。利用BioEdit 5.0.9和Clustal W1.81產(chǎn)生比對(duì)。
圖29列舉了SVV的最終的多肽產(chǎn)物，一些保守基序是粗體以及加下劃線2A/2B“裂解”(NPGP)；2C ATP-結(jié)合(GxxGxGKS/T以及hyhyhyxxD)；3B(VPg)/RNA連接殘基(Y)；3C(pro)活性位點(diǎn)殘基(H，C，H)；3D(pol)基序(KDEL/IR，PSG，YGDD，F(xiàn)LKR)。
圖30列舉了用于序列分析確定SVV和這些微小RNA病毒之間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微小RNA病毒種(參見實(shí)施例4)。
圖31顯示了SVV(SEQ ID NO4)及其他微小RNA病毒鑒于VP2序列分析的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。該圖顯示了模擬的鄰近連接樹(neighbor-joining tree)(參見實(shí)施例4)。
圖32顯示了SVV(SEQ ID NO6)及其他微小RNA病毒之間鑒于VP3的模擬的鄰近相連樹(參見實(shí)施例4)。
圖33顯示了SVV(SEQ ID NO8)及其他微小RNA病毒之間鑒于VP1的模擬的鄰近相連樹(參見實(shí)施例4)。
圖34顯示了SVV(即SEQ ID NO2的部分P1-氨基酸2-641)及其他微小RNA病毒之間鑒于P1(即1A，1B，1C以及1D)的模擬的鄰近-相連樹(參見實(shí)施例4)。
圖35顯示了SVV(SEQ ID NO14)及其他微小RNA病毒之間鑒于2C的模擬的鄰近相連樹(參見實(shí)施例4)。
圖36顯示了SVV(SEQ ID NO20)及其他微小RNA病毒之間鑒于3C(pro)的模擬的鄰近相連樹(參見實(shí)施例4)。
圖37顯示了SVV(SEQ ID NO22)及其他微小RNA病毒之間鑒于3D(pol)的模擬的鄰近相連樹(參見實(shí)施例4)。
圖38顯示了SVV(SEQ ID NO14)及其他微小RNA病毒之間VP2的實(shí)際的氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖39顯示了SVV(SEQ ID NO6)及其他微小RNA病毒之間VP3的實(shí)際的氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖40顯示了SVV(SEQ ID NO8)及其他微小RNA病毒之間VP1的實(shí)際氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖41顯示了SVV(SEQ ID NO2的部分衣殼或者P1-氨基酸2-641)及其他微小RNA病毒之間P1的實(shí)際氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖42顯示了SVV(SEQ ID NO14)及其他微小RNA病毒之間2C的實(shí)際氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖43顯示了SVV(SEQ ID NO20)及其他微小RNA病毒之3C(pro)的實(shí)際氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖44顯示了SVV(SEQ ID NO22)及其他微小RNA病毒之間3D(pol)的實(shí)際氨基酸百分比同一性(參見實(shí)施例4)。
圖45顯示了由SDS-PAGE分析的SVV的VP2(～36kDa)，VP1(～31kDa)以及VP3(～27kDa)蛋白。純化的SVV進(jìn)行SDS-PAGE并通過銀染目測蛋白。泳道“MWt”是分子量標(biāo)記；泳道“SVV”包含SVV的結(jié)構(gòu)的蛋白。還給出3個(gè)分子量標(biāo)記的大小以及病毒蛋白的名稱。
圖46A-46B顯示了系統(tǒng)施用后血液以及腫瘤中SVV的量(實(shí)施例7)。具有H446腫瘤的裸鼠用SVV以1×1012vp/kg的劑量通過尾部靜脈注射進(jìn)行處理。在注射后第0，1，3，6，24，48，72小時(shí)以及第7天對(duì)小鼠取血，聚集后立即從血液分離血漿，稀釋的在感染培養(yǎng)基中，并用于感染PER.C6細(xì)胞。注射后第6，24，48，72小時(shí)以及第7天收集腫瘤。將腫瘤切割成小切片并懸浮在1mL介質(zhì)中并制備CVL。
圖46C-46D顯示與體內(nèi)SVV清除有關(guān)的數(shù)據(jù)。該圖顯示SVV顯示出與類似劑量i.v.腺病毒(實(shí)施例7)相比在血液中顯著長的保留時(shí)間，因此SVV比腺病毒在體內(nèi)具有較慢的清除率。靜脈內(nèi)(i.v.)單劑量施用后，SVV保存于血液中高達(dá)6小時(shí)(圖46C；圖46C是圖46A的重復(fù)用于對(duì)比圖46D的目的)，而在約1小時(shí)中腺病毒被從血液中清除或者耗盡(圖46D)。
圖47顯示了H446異種移植切片的免疫組織化學(xué)以及蘇木精和曙紅(H&E)染色(實(shí)施例7)。具有H446腫瘤的裸鼠用Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)或者SVV以1×1012vp/kg的劑量通過尾部靜脈注射進(jìn)行處理。小鼠在注射后3天處死并收集腫瘤。腫瘤細(xì)胞中的病毒蛋白通過利用SVV-特異性小鼠抗體(上面的試驗(yàn)組)的免疫組織化學(xué)目測。由HBSS或者SVV處理的小鼠收集的H446腫瘤細(xì)胞的大概形態(tài)通過H＆E染料染色(下面的試驗(yàn)組)。
圖48顯示了初級(jí)人肝細(xì)胞中SVV介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(實(shí)施例9)。平板接種在膠原蛋白涂敷的12-孔板中的初級(jí)人肝細(xì)胞用每細(xì)胞1，10以及100和1000個(gè)粒子的SVV感染(ppc)。感染后3天，分別測定結(jié)合乳酸脫氫酶(LDH)的細(xì)胞以及溫育上清液中的LDH。細(xì)胞毒性百分比被測定為上清液中LDH的單位與最大細(xì)胞LDH加上清液LDH的比值。
圖49顯示了選擇的細(xì)胞系中SVV的病毒產(chǎn)量。為了評(píng)價(jià)SVV的復(fù)制能力，將選擇的正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞感染每細(xì)胞一個(gè)病毒粒子的SVV(ppc)(實(shí)施例9)。72小時(shí)后，收集細(xì)胞并分析CVL在PER.C6細(xì)胞上的滴度。對(duì)于每一細(xì)胞系，SVV復(fù)制的效力表示為每毫升的血小板形成單位(pfu/ml)。
圖50顯示了裸以及CD 1小鼠相對(duì)體重的毒性(實(shí)施例10)。病毒施用后不同天數(shù)測定每一處理組中的小鼠的平均體重。在第1天通過尾部靜脈給小鼠注射單劑量的SVV或者PBS。
圖51顯示了H446異種移植模型中的效力。H446腫瘤在裸鼠以及被分為組(n＝10)并經(jīng)尾部靜脈注射HBSS或者6種不同劑量的SVV處理的裸鼠以及小鼠中得以建立(實(shí)施例11)。在研究的第20天，來自具有較大腫瘤(平均腫瘤體積＝2000mm3)的HBSS組的5只小鼠注射1×1011vp/kg(顯示為箭頭)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。
圖52顯示未經(jīng)處理的或者用SVV處理的H446異種移植裸鼠的圖(實(shí)施例11)。SVV的效力非常強(qiáng)，因?yàn)?00％預(yù)形成的較大腫瘤被完全除去。SVV-處理的小鼠在-處理后至少200天既不顯示臨床癥狀又不顯示腫瘤的復(fù)發(fā)。
圖53顯示了與SVV腫瘤特異性以及體外效力有關(guān)的數(shù)據(jù)(實(shí)施例11)。該圖顯示H446人小細(xì)胞肺癌(SCLC)腫瘤細(xì)胞(上圖)或者正常人H460細(xì)胞(底部圖)的溫育后細(xì)胞的存活。SVV特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，每細(xì)胞的EC50為大約10-3個(gè)粒子。相比之下，正常人細(xì)胞在任一SVV濃度都沒有被殺傷。
圖54顯示了包含SVV的完全基因組的代表性質(zhì)粒(實(shí)施例15)。T7啟動(dòng)子在SVV序列的上游載體上的存在允許SVV序列的體外轉(zhuǎn)錄由此可以產(chǎn)生SVV RNA分子。
圖55顯示了用于構(gòu)建全長以及功能性基因組SVV質(zhì)粒以及隨后的SVV病毒產(chǎn)生的示意圖(實(shí)施例16)。為了獲得功能性基因組SVV克隆，SVV的完全基因組可以被克隆在具有T7啟動(dòng)子的載體中。這可以通過制備病毒的cDNA克隆，對(duì)其測序以及將相鄰的片段克隆進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒，產(chǎn)生表述為“pSVV”的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。具有SVV的全部基因組的質(zhì)?？杀荒孓D(zhuǎn)錄產(chǎn)生SVV RNA。然后將SVV RNA轉(zhuǎn)染允許的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后回收以及純化SVV病毒粒子。
圖56顯示了用于構(gòu)建包含SVV編碼衣殼的序列(即，1A-1D的編碼區(qū))載體(″pSVV衣殼″)的示意圖(實(shí)施例16)。pSVV衣殼可因此用來產(chǎn)生SVV衣殼突變體文庫。
圖57顯示了SVV衣殼的一個(gè)突變方法用于產(chǎn)生SVV衣殼突變體的文庫(實(shí)施例16)。該解了寡核苷酸序列插入質(zhì)粒的隨機(jī)位點(diǎn)。該寡核苷酸可以是隨機(jī)的寡核苷酸，具有已知序列的寡核苷酸或者編碼附加表位的寡核苷酸。在該圖中，限制性酶CviJI隨機(jī)切割pSVV衣殼DNA。在單個(gè)位點(diǎn)切割的線性化pSVV衣殼DNA分離并純化自凝膠，并且與寡核苷酸連接。
圖58顯示了產(chǎn)生包括編碼衣殼的區(qū)域中的序列突變的全長SVV突變體的文庫的示意圖(實(shí)施例16)。例如，來自pSVV衣殼突變體文庫的編碼衣殼的區(qū)域(根據(jù)圖57中描述的流程圖產(chǎn)生的)是通過限制消化以及凝膠純化分離的。包含全長SVV序列的載體也被消化由此切下編碼衣殼的區(qū)域。然后將來自pSVV衣殼突變體文庫的編碼衣殼的區(qū)域連接到失去其野生型衣殼序列的pSVV載體，由此產(chǎn)生在編碼衣殼的區(qū)域具有大量突變的全長SVV突變體的文庫(“pSVVFL”載體)。
圖59顯示了產(chǎn)生包括衣殼突變文庫的SVV病毒粒子的一般方法(實(shí)施例16)。將pSVVFL載體被逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生SVV RNA。將SVV RNA轉(zhuǎn)染允許的細(xì)胞，其中產(chǎn)生SVV突變體病毒粒子。病毒粒子消解細(xì)胞以及包括大量衣殼變體的SVV病毒粒子群，分離“SVV衣殼文庫”。
圖60顯示了篩選可以特異性感染腫瘤細(xì)胞而不能感染非腫瘤細(xì)胞的SVV衣殼突變體的一般方法。用腫瘤細(xì)胞系或者所考慮的組織培養(yǎng)SVV衣殼文庫。最初培育期后，洗滌細(xì)胞使得不能進(jìn)入細(xì)胞的SVV病毒粒子被排除。然后保持細(xì)胞培養(yǎng)直到觀察到病毒消解。然后收集溫育上清液分離能夠消解性感染腫瘤細(xì)胞的SVV衣殼突變體。然后這些病毒可以在反篩選之前通過感染已知的允許的細(xì)胞-系進(jìn)行溫育。通過用正常細(xì)胞培養(yǎng)能夠感染腫瘤細(xì)胞的SVV衣殼突變體病毒進(jìn)行反篩選。只收集那些在上清液中保持未結(jié)合的病毒，由此分離具有腫瘤特異性的突變體SVV病毒?？梢灾貜?fù)本方法更進(jìn)一步提純SVV腫瘤-特異性病毒的分離。
圖61顯示了用于試驗(yàn)病毒突變體是否可以結(jié)合和/或感染細(xì)胞系的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)方法使用的常常是溫育細(xì)胞系的低效率方法，即瓶溫育，因此大量篩選與大量不同的細(xì)胞系相關(guān)的病毒突變體文庫變成繁重的工作。
圖62顯示了本發(fā)明用于篩選能夠特異性感染不同細(xì)胞系的病毒突變體的高通量方法(實(shí)施例16)。在該圖中，大量不同的腫瘤細(xì)胞系成長在384孔板中。向每一孔中，添加病毒樣品(例如，SVV衣殼文庫的樣品)。從那些顯示細(xì)胞病變效應(yīng)的孔收集培養(yǎng)基，由此可以通過感染溫育瓶或者大組織培養(yǎng)板的允許細(xì)胞系(例如，SVV，H446或PER.C6)擴(kuò)增培養(yǎng)基中的病毒。溫育病毒由此分離RNA并且對(duì)序列進(jìn)行分析確定由寡核苷酸插入致衣殼突變插入的編碼的肽序列。然后可以檢測肽本身確定肽是否可以與腫瘤細(xì)胞類型特異性結(jié)合。
圖63顯示了另一高通量篩選示意圖(實(shí)施例16)。腫瘤以及正常細(xì)胞系溫育在多孔板中。將病毒添加入每一孔試驗(yàn)細(xì)胞是否被病毒介導(dǎo)的消解殺傷?？梢酝ㄟ^讀取每一孔中的吸光度迅速分析細(xì)胞病變效應(yīng)。溫育來自顯示細(xì)胞病變效應(yīng)的孔的病毒并更進(jìn)一步地在體外(腫瘤以及正常細(xì)胞系的再試驗(yàn))以及體內(nèi)模型(試驗(yàn)病毒是否可以殺傷小鼠的移植的腫瘤)中試驗(yàn)。
圖64顯示了可以分析具有新的腫瘤特異性趨性的SVV衣殼突變體產(chǎn)生腫瘤選擇性肽。對(duì)那些能夠特異性感染腫瘤細(xì)胞系的SVV衣殼突變體進(jìn)行測序以確定通過寡核苷酸插入序列編碼的肽。由此可以由成功的衣殼突變體確定氨基酸共有序列。然后可以檢測具有共有序列的肽以確定它們是否可以與所查詢的腫瘤細(xì)胞類型特異性結(jié)合。因此腫瘤-選擇性的肽可以與毒素或者藥物連接以便作為腫瘤-特異性靶介質(zhì)。
圖65圖解了可以被首先體內(nèi)試驗(yàn)的SVV衣殼文庫。小鼠(包括正常，去胸腺，裸，CD-1轉(zhuǎn)基因，等)可以一移植有特異性腫瘤。然后給這些小鼠注射SVV衍生物文庫，諸如SVV衣殼文庫。在某些時(shí)間點(diǎn)，從小鼠回收腫瘤細(xì)胞，因此在那些顯示腫瘤消除的小鼠中，將從最初的腫瘤樣品分離病毒并在允許細(xì)胞系中生長。
圖66顯示了用于本發(fā)明SVV衍生物的臨床試驗(yàn)方案。
圖67圖解了編碼衣殼中的附加表位的SVV衍生物(具有新的腫瘤趨性)可用于多種目的。它們可以被用作通過分析表位的存在檢測特異性腫瘤細(xì)胞是否存在于組織樣品中的篩選試劑。或者，毒素或者其它治療劑可以連接附加表位，然后將病毒施用于患者。更進(jìn)一步地，可以輻射或者滅活野生型SVV或者SVV衍生物，由此病毒粒子本身被用作治療裝置。病毒粒子由于存在細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，或者粒子可以具有附著的毒素或者其它治療劑，由此使病毒用作特異性靶向遞送裝置。
圖68顯示了微小RNA病毒的基本生活周期。
圖69顯示了與其它微小RNA病毒相比SVV的多肽長度。
圖70列舉了微小RNA病毒2A-類NPG/P蛋白的氨基酸比較。SVV的序列列舉在SEQ ID NO2的殘基635-656處。
圖71列舉了EMCV-R的氨基酸序列(SEQ ID NO23)。
圖72列舉了EMCV-PV21(登錄號(hào)CAA52361)的氨基酸序列(SEQID NO24)。
圖73列舉了EMCV-B(登錄號(hào)P17593)的氨基酸序列(SEQ IDNO25)。
圖74列舉了EMCV-Da(登錄號(hào)P17593)的氨基酸序列(SEQ IDNO26)。
圖75列舉了EMCV-Db的氨基酸序列(SEQ ID NO27)。
圖76列舉了EMCV-PV2(登錄號(hào)CAA60776)的氨基酸序列(SEQID NO28)。
圖77列舉了EMCV-mengo(登錄號(hào)AAA46547)的氨基酸序列(SEQID NO29)。
圖78列舉了TMEV/DA(登錄號(hào)AAA47928)的氨基酸序列(SEQ IDNO30)。
圖79列舉了TMEV/GDVII(登錄號(hào)AAA47929)的氨基酸序列(SEQID NO31)。
圖80列舉了TMEV/BeAn8386(登錄號(hào)AAA47930)的氨基酸序列(SEQ ID NO32)。
圖81列舉了TLV-NGS910(登錄號(hào)BAC58035)的氨基酸序列(SEQID NO33)。
圖82列舉了VHEV-Siberia-55(登錄號(hào)AAA47931)的氨基酸序列(SEQ ID NO34)。
發(fā)明詳述術(shù)語“病毒”，“病毒粒子”，“載體粒子”，“病毒載體粒子”以及“病毒子”可以互換使用并廣義上可以理解為當(dāng)例如本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞或者細(xì)胞系時(shí)形成的用于產(chǎn)生感染性粒子的感染性病毒粒子。
術(shù)語“衍生物”，“突變體”，“變體”以及“修飾的”可以互換使用，大體上顯示衍生物，突變體，變體或者修飾的病毒可以具有相對(duì)于模板病毒核酸或者氨基酸序列的核酸或者氨基酸序列差異。例如，SVV衍生物，突變體，變體或者修飾的SVV可以指與ATCC專利保藏號(hào)PTA-5343的野生型SVV核酸或者氨基酸序列具有核酸或者氨基酸序列差異的SVV。
在這里使用的術(shù)語“癌癥”，“癌細(xì)胞”，“贅生性細(xì)胞”，“腫瘤形成”，“腫瘤”以及“腫瘤細(xì)胞”可以互換使用并指顯示出相對(duì)自動(dòng)生長的細(xì)胞，因此顯示出由顯著失去細(xì)胞增殖控制表征的異常生長表型。贅生性細(xì)胞可以是惡性的或者良性的。根據(jù)本發(fā)明，一種優(yōu)選的腫瘤細(xì)胞類型是具有親神經(jīng)特性的那些。
術(shù)語兩個(gè)或更多核酸或者蛋白序列角度“同一的”或者百分比“同一性”是指當(dāng)使用序列比較算法諸如Protein-ProteinBLAST(Protein-Protein BLAST of GenBank databases(Altschul S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.＆Lipman，D.J.(1990)“Basic localalignment search tool.”J.Mol.Biol.215403-410))或者通過目測檢查測定的最大一致性的比較以及比對(duì)時(shí)相同或者具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或者核苷酸的兩個(gè)或更多序列或者子序列。BLAST算法描述在Altschul等人的J.Mol.Biol.，215403-410(1990)中，并且可公開獲得的BLAST軟件由National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供。
例如，在這里使用的術(shù)語“至少90％同一”是指相對(duì)于參比多肽(或者多核苷酸)從90到100的百分比同一性。90％或更高水平的同一性顯示出如下的事實(shí)假定所比較的用于例證目的100個(gè)氨基酸的試驗(yàn)以及參比多肽長度，在試驗(yàn)多肽中至多10％(即，100個(gè)中的10個(gè))氨基酸不同于參比多肽的氨基酸?？梢栽谠囼?yàn)以及參比多核苷酸之間進(jìn)行類似的比較。這種差異可以表示為全部長度的氨基酸序列上隨機(jī)分布其中的點(diǎn)突變或者可以簇集在改變長度以至最大可以在100個(gè)氨基酸中有10個(gè)氨基酸差異(90％的同一性)的一個(gè)或者多個(gè)位置。
差異被定義為核酸或者氨基酸取代，插入或者缺失。在約85-90％以上的同一性水平，結(jié)果應(yīng)該是獨(dú)立于程序以及缺口參數(shù)背景；這種高水平的同一性可以很容易評(píng)價(jià)，常常不依賴于軟件。
在本發(fā)明的上下文，術(shù)語“分離的”是指核酸分子，多肽，病毒或者細(xì)胞經(jīng)人類的手遠(yuǎn)離其天然的環(huán)境存在。分離的核酸分子或者多肽可以純化形成存在或者可以存在于非天然環(huán)境，諸如例如重組體寄主細(xì)胞中。分離的病毒或者細(xì)胞可以純化形成存在，諸如存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中，或者可以存在于非天然環(huán)境，例如重組體或者異基因生物體中。
術(shù)語“天然發(fā)生的”或者“野生型”用來描述可以從天然，不同于人類人工產(chǎn)生發(fā)現(xiàn)的實(shí)體。例如，存在于可從天然來源分離以及未經(jīng)人類在實(shí)驗(yàn)室中有意修飾的生物體(包括病毒)中的蛋白或者核苷酸序列是天然存在的。
術(shù)語“高嚴(yán)格性”，“中等嚴(yán)格性”或者“低嚴(yán)格性”是指核酸雜交條件。高嚴(yán)格性條件是指需要靶核酸序列以及探針核酸序列之間更高同一性以便在靶和探針之間發(fā)生退火或者雜交的條件。低嚴(yán)格性條件是指需要靶核酸序列以及探針核酸序列之間更低同一性以便在靶和探針之間發(fā)生退火或者雜交的條件。嚴(yán)格性條件可以由緩沖液的鹽濃度或者進(jìn)行雜交的溫度進(jìn)行控制，其中較高的鹽濃度產(chǎn)生較低的嚴(yán)格條件，而較高的溫度產(chǎn)生較高的嚴(yán)格條件。雖然嚴(yán)格性條件會(huì)跟據(jù)進(jìn)行雜交的序列的長度和核酸含量的改變而改變，高，中等和低嚴(yán)格性的特征條件描述在下列示范性條件中。通常使用的雜交緩沖液是具有20×對(duì)應(yīng)于0.3M檸檬酸三鈉和3M NaCl的母液濃度的SSC(氯化鈉檸檬酸鈉)。對(duì)于高嚴(yán)格性條件，SSC的工作濃度可以是0.1×-0.5×(1.5-7.5mM檸檬酸三鈉，15-75mM NaCl)，雜交溫度設(shè)在65℃。中等條件通常利用在55-62℃溫度下的0.5×-2×SSC濃度(7.5-30mM檸檬酸三鈉，75-300mM NaCl)。
在低嚴(yán)格性條件下進(jìn)行的雜交可以使用50-55℃溫度下的2×-5×SSC濃度(30-75mM檸檬酸三鈉，300-750mM NaCl)。注意這些條件僅僅是示范性的并且不能被認(rèn)為是限制。
Seneca Valley病毒(SVV)SVV是一種新的，迄今未被發(fā)現(xiàn)的RNA病毒，最緊密關(guān)聯(lián)于微小RNA病毒科的心臟病毒屬。因此，為了本發(fā)明的目的，SVV被認(rèn)為是心臟病毒屬以及微小RNA病毒科的成員。心臟病毒與其它微小RNA病毒的區(qū)別特征在于其基因組構(gòu)成，共同的病理學(xué)特征以及在0.1MNaCl中5以及7之間的pHs下其病毒子的分離性(Scraba，D.等人，“Cardioviruses(Picornaviridae)”Encyclopedia of Virology，第二版，R.G.Webseter and A.Granoff，編輯，1999)。SVV及其他心臟病毒之間序列分析的結(jié)果在下文論述。
SVV的基因組由一具有預(yù)測大小約7.5kb的單鏈(+)有義鏈RNA分子組成(參見圖4A)。因?yàn)镾VV是微小RNA病毒，在所有微小RNA病毒中具有大量保守的如下特征(i)基因組RNA是感染性的，因此可以轉(zhuǎn)染細(xì)胞回避病毒-受體結(jié)合并進(jìn)入病毒生活周期；(ii)基因組所5′末端的長(約600-1200bp)非翻譯區(qū)(UTR)以及較短的3′非翻譯區(qū)(約50-100bp)；(iii)5′UTR包含三葉草葉形二級(jí)結(jié)構(gòu)被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)；(iv)其余的基因組編碼單個(gè)多蛋白以及(v)基因組的兩個(gè)末端被修飾，5′末端共價(jià)連接小堿性蛋白“Vpg”，3′末端被聚腺苷酸化。
本發(fā)明提供了分離的SVV病毒(ATCC專利保藏號(hào)PTA-5343)以及其中的SVV的全基因組內(nèi)容物。目前，已經(jīng)測序的最大的SVV基因組片段是來源于PTA-5343分離物的分離的SVV核酸，包括大部分SVV基因組序列，并列在圖5A-5E以及圖6A-6D中，在這里具有SEQ ID NO1的命名。這種核苷酸序列的翻譯顯示SVV的大部分單個(gè)多蛋白是由SEQ ID NO1編碼的。由SEQ ID NO1的核苷酸1至5673編碼的氨基酸序列列在圖5A-E和圖7A-7B中并且在這里具有SEQ ID NO2的命名。因此本發(fā)明提供了SEQ ID NO1的分離的部分，包括SEQ IDNOs3，5，7，9，11，13，15，17，19以及21，其可被亞克隆表達(dá)載體中，由此可以分離由SEQ ID NO1的這些部分編碼的多肽。此外本發(fā)明還包括可以與SEQ ID NO1或者其任一部分在高，中等或者低嚴(yán)格性條件下雜交的分離的核酸。
本發(fā)明還提供了具有圖9(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸2-143)所列的SEQ ID NO4的氨基酸序列的分離的部分SVV VP2(1B)蛋白。部分SVV VP2蛋白的氨基酸序列由列在圖8中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸4-429)的SEQ ID NO3的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖11(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸144-382)所列的SEQ ID NO6的氨基酸序列的分離的SVV VP3(1C)蛋白。SVV VP3蛋白的氨基酸序列由列在圖10中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸430-1146)的SEQ ID NO10的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖13(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸383-641)所列的SEQ ID NO8的氨基酸序列的分離的SVV VP1(1D)蛋白。SVV VP1蛋白的氨基酸序列由列在圖12中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸1147-1923)的SEQ ID NO7的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖15(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸642-655)所列的SEQ ID NO10的氨基酸序列的分離的SVV 2A蛋白。SVV 2A蛋白的氨基酸序列由列在圖14中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸1924-1965)的SEQ ID NO9的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖17(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸656-783)所列的SEQ ID NO12的氨基酸序列的分離的SVV 2B蛋白。SVV 2B蛋白的氨基酸序列由列在圖16中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸1966-2349)的SEQ ID NO11的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖19(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸784-1105)所列的SEQ ID NO14的氨基酸序列的分離的SVV 2C蛋白。SVV 2B蛋白的氨基酸序列由列在圖18中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸2350-3315)的SEQ ID NO13的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖21(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1106-1195)所列的SEQ ID NO16的氨基酸序列的分離的SVV 3A蛋白。SVV 3A蛋白的氨基酸序列由列在圖20中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸3316-3585)的SEQ ID NO15的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖23(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1196-1217)所列的SEQ ID NO18的氨基酸序列的分離的SVV 3B(VPg)蛋白。SVV 3B蛋白的氨基酸序列由列在圖22中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸3586-3651)的SEQ ID NO17的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖25(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1218-1428)所列的SEQ ID NO20的氨基酸序列的分離的SVV 3C(“pro”或者“蛋白酶”)蛋白。SVV 3C蛋白的氨基酸序列由列在圖24中(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸3652-4284)的SEQ ID NO19的核酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了具有圖27(其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1429-1890)所列的SEQ ID NO22的氨基酸序列的分離的SVV 3D(“pol”或者“聚合酶”)蛋白。SVV 3C蛋白的氨基酸序列由圖24(其相當(dāng)于SEQID NO1的核苷酸4285-5673；核苷酸5671-5673，“tga”編碼終止子，在氨基酸序列表中描述為星號(hào)“*”)所列的SEQ ID NO19的核酸序列編碼。
本發(fā)明的核酸包括RNA以及DNA形式，并且暗含提供的序列表的互補(bǔ)序列。
因此，由SEQ ID NO1顯示的分離的SVV核酸具有5,752個(gè)核苷酸，其編碼由SEQ ID NO2顯示的氨基酸序列的多肽。SVV基因組序列被翻譯為被切割成多種下游“翻譯產(chǎn)物”的單個(gè)多蛋白。本發(fā)明包含SEQ ID NO1的所有核酸片段以及由這種片段編碼的所有多肽。
大部分全長SVV多蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO1的核苷酸1-5673編碼。多蛋白被切割成3個(gè)前體蛋白，P1，P2以及P3(圖4B)。P1，P2以及P3被更進(jìn)一步切割成較小的產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)區(qū)域P1的裂解產(chǎn)物(1ABCD；或者衣殼區(qū)域)為1ABC，VPO，VP4，VP2，VP3以及VP1。非結(jié)構(gòu)蛋白P2(2ABC)的裂解產(chǎn)物為2A，2BC，2B以及2C。非結(jié)構(gòu)區(qū)域P3多蛋白(3ABCD)的裂解產(chǎn)物為3AB，3CD，3A，3C，3D，3C′以及3D′。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如下成分的分離的核酸(i)2ABC(SEQ ID NO1的核苷酸1924-3315)的序列及其編碼的蛋白；(ii)2BC(SEQ NO1的核苷酸1966-3315)的序列及其編碼的蛋白；(iii)3ABCD(SEQ ID NO1的核苷酸3316-5673)的序列及其編碼的蛋白；(iv)3AB(SEQ ID NO1的核苷酸3316-3651)的序列及其編碼的蛋白；以及(v)3CD(SEQ ID NO1的核苷酸3652-5673)的序列及其編碼的蛋白。
微小RNA病毒的基本衣殼結(jié)構(gòu)由密集包裝的二十面體排列的60個(gè)前粒子組成，每個(gè)包括4種多肽，VP1，VP2，VP3以及VP4，所有均源于原始前粒子VPO的裂解。SVV病毒粒子直徑為約27nm(參見圖2)，其與其它直徑為約27-30nm的微小RNA病毒粒子的大小相符。
微小RNA病毒復(fù)制的很快速，完成的周期為約5-10小時(shí)(通常約8小時(shí))(參見圖68的微小RNA病毒復(fù)制循環(huán)的示意圖)。受體結(jié)合后，基因組RNA從粒子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。然后由多核糖體直接翻譯基因組RNA，但是感染后約30分鐘，細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成迅速下降至幾乎為零。這種現(xiàn)象被稱作“關(guān)閉”并且是細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)的根本原因。關(guān)閉似乎是由于寄主細(xì)胞220kDa帽-結(jié)合復(fù)合物(CBC)的裂解，所述復(fù)合物參與所有真核mRNA在翻譯起始期間m7G帽式結(jié)構(gòu)的結(jié)合。CBC的裂解似乎是由2A蛋白酶所引起。
5′UTR包含IRES。通常，當(dāng)核糖體與5′甲基化帽結(jié)合時(shí)引發(fā)真核翻譯然后沿著mRNA掃描尋找最初的AUG起始密碼子。IRES克服了該過程并可以使微小RNA病毒RNA在CBC降解后繼續(xù)被翻譯。
病毒多蛋白最初由2A蛋白酶裂解成多蛋白P1，P2和P3(參見圖4B)。然后由3C，主要的微小RNA病毒蛋白酶進(jìn)行更進(jìn)一步的裂解事件。由3C制成的一種裂解產(chǎn)物是病毒依賴于RNA的RNA聚合酶(3D)，其拷貝基因組RNA產(chǎn)生(-)鏈無義。(-)無義鏈形成用于(+)有義鏈(基因組)RNA合成的模板。一些(+)有義鏈被翻譯產(chǎn)生附加的病毒蛋白，一些(+)有義鏈被包裝到衣殼中形成新的病毒粒子。
(+)有義鏈RNA基因組被認(rèn)為被包裝到預(yù)形成的衣殼中，雖然尚不清楚基因組和衣殼之間的分子間相互作用。空衣殼是所有微小RNA病毒感染共通的。衣殼由P1多蛋白前體裂解成由VPO，VP3和VP1組成的前粒子進(jìn)行組裝，其連接在一起封入基因組。病毒粒子的成熟和感染性依賴于VPO內(nèi)部自動(dòng)催化裂解成VP2和VP4。當(dāng)消解時(shí)發(fā)生新近形成的病毒粒子的釋放。
本發(fā)明還提供了具有ATCC專利保藏號(hào)PTA-5343的所有鑒定特性和核酸序列的分離的病毒。本發(fā)明的病毒可以指PTA-5343分離物，PTA-5343分離物的變體，同系物，衍生物和突變體以及其它相對(duì)于SVV(在本文公開的野生型以及突變型)決定其腫瘤消解特性的序列進(jìn)行修飾的微小RNA病毒的變體，同系物，衍生物和突變體。
本發(fā)明此外提供了特異性抗如下成分的抗體ATTC專利保藏號(hào)PTA-5343的分離的SVV以及來自具有SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，14，16，18，20以及22的氨基酸序列的分離的SVV蛋白的表位。本發(fā)明還包括特異性針對(duì)來自由SEQ ID NO1的片段或者部分編碼的蛋白的表位的抗體。
來自多種心臟病毒分離物的RNA序列的比較分析顯示基因組之間＞45％的核苷酸同一性。心臟病毒可以被亞分成EMC-類病毒(“EMCV”-諸如，Mengo，B，R；以及MM，ME，Columbia-SK)，Theiler氏-類病毒(“TMEV”-諸如，BeAn，DA以及GD VII株)以及Vilyuisk病毒。
在對(duì)其它病毒分析SVV序列中，發(fā)現(xiàn)SVV是心臟病毒(參見實(shí)施例4以及其中引用的附圖)。如果EMCV和TMEV被作為標(biāo)準(zhǔn)的心臟病毒，顯而易見SVV不是典型的心臟病毒。然而，即使這2種病毒也具有差異，值得注意的是在5’UTR(Pevear等人，1987，J.Virol.，611507-1516)。SVV與EMCV和TMEV在其大量多蛋白(P1，2C，3Cpro和3Dpol區(qū)域；參見圖31-37)方面系統(tǒng)簇集，顯示SVV很可能是心臟病毒。
癌癥的治療方法本發(fā)明提供了使用鑒于SVV的腫瘤消解特性修飾的病毒，包括微小RNA病毒，其衍生物，變體，突變體或者同系物治療癌癥的方法。本發(fā)明顯示野生型SVV(即ATTC專利保藏號(hào)PTA-5343)能夠選擇性殺傷一些類型的腫瘤。例如，SVV可以選擇性殺傷具有親神經(jīng)或者神經(jīng)內(nèi)分泌特性的腫瘤細(xì)胞，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。預(yù)計(jì)由本發(fā)明的病毒治療的神經(jīng)內(nèi)分泌的腫瘤的其它實(shí)例包括但是不局限于腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，胃泌素瘤(引起卓-艾氏綜合征)，胰升血糖素瘤，胰島細(xì)胞瘤，髓樣癌(包括甲狀腺髓樣癌)，多發(fā)性內(nèi)分泌瘤綜合癥，胰腺內(nèi)分泌瘤，副神經(jīng)節(jié)瘤，VIPomas(血管活性腸多肽腫瘤)，胰島細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤。
本發(fā)明還包含4種神經(jīng)內(nèi)分泌肺腫瘤。最嚴(yán)重的類型的小細(xì)胞肺癌(SCLC)是所有癌癥最迅速生長和擴(kuò)散的癌癥。大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌是罕見的癌癥，除形成癌癥的細(xì)胞的大小之外在其預(yù)后以及如何治療病人方面非常類似于SCLC。類癌瘤又名類癌包含另2種肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌癥。這2個(gè)類型是典型的類癌以及非典型的類癌。
不希望受限于理論，SVV特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力可以包括但是不局限于經(jīng)腫瘤-選擇性細(xì)胞進(jìn)入，腫瘤選擇性翻譯，腫瘤選擇性蛋白水解，腫瘤選擇性RNA復(fù)制及其組合選擇性復(fù)制，細(xì)胞程序性死亡，消解細(xì)胞。
SVV具有許多優(yōu)于腫瘤消解病毒包括修飾的腺病毒有益特性，包括例如(i)SVV對(duì)具有神經(jīng)特性的癌癥，包括SCLC，維耳姆斯瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤具有很高的選擇性-例如，SVV顯示對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞大于10,000倍的選擇性；(ii)SVV比化療已經(jīng)顯示出好于1，000倍的細(xì)胞殺傷特異性；(iii)小鼠在系統(tǒng)施用每公斤高達(dá)1014病毒粒子后SVV沒有顯示明顯的毒性；(iv)SVV的效力非常強(qiáng)，因?yàn)樾∈蟮?00％的較大的預(yù)形成腫瘤可以被根除，沒有腫瘤生長的復(fù)發(fā)；(v)SVV可以被純化至高滴度并且可以在允許細(xì)胞系中以每細(xì)胞超過200,000個(gè)粒子產(chǎn)生；(vi)SVV具有比其它的腫瘤消解病毒能夠較好滲透以及擴(kuò)撒的小尺寸(SVV直徑小于30nm)，(vii)SVV復(fù)制迅速(小于12小時(shí))以及(viii)對(duì)于SVV用作特異性抗腫瘤劑無需修飾。
此外，最初的研究(參見實(shí)施例6)顯示一些附加因素使SVV成為用于腫瘤消解病毒治療的有利工具(i)人血清樣品不包含直接針對(duì)SVV的中和抗體；(ii)SVV被補(bǔ)體抑制；以及(iii)SVV不被血細(xì)胞凝集抑制。所有的這些因素使SVV顯示出比其它的腫瘤消解病毒較長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的事實(shí)(例如，參見實(shí)施例7)。
本發(fā)明提供了選擇性殺傷細(xì)胞群體中贅生性細(xì)胞的方法，包括將有效量SVV與所述細(xì)胞群體在病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體中的贅生性細(xì)胞的條件下接觸，復(fù)制以及殺傷贅生性細(xì)胞。除SVV體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的方法之外，本方法包含腫瘤可以被進(jìn)行如下操作的實(shí)施方案(1)當(dāng)被SVV感染時(shí)體外溫育；(2)非腫瘤細(xì)胞存在下溫育；以及(3)細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的細(xì)胞(腫瘤以及非腫瘤細(xì)胞)，包括細(xì)胞是人細(xì)胞。細(xì)胞的體外溫育以及由SVV感染可以具有多種應(yīng)用。例如，體外感染被用作產(chǎn)生大量SVV的方法，作為用于確定或者檢測贅生性細(xì)胞是否存在于細(xì)胞群體中的方法，或者作為篩選突變體SVV是否可以特異性靶向以及殺傷多種腫瘤細(xì)胞或者組織類型的方法。
本發(fā)明還提供了治療癌癥的離體方法，其中細(xì)胞分離自人癌癥患者，體外溫育的細(xì)胞，感染有選擇性殺傷癌細(xì)胞的SVV的細(xì)胞，并且非腫瘤細(xì)胞被導(dǎo)回患者?；蛘?，分離自患者的細(xì)胞可以感染SVV并被立即導(dǎo)回患者作為將SVV施用給患者的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是造血來源的。任選地，患者可以接受治療(例如化療或者放療)在將溫育細(xì)胞導(dǎo)回患者之前體內(nèi)破壞患者的腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療可用來破壞患者的骨髓細(xì)胞。
SVV對(duì)具有神經(jīng)特性的抗腫瘤細(xì)胞類型存在有效的抗腫瘤活性。SVV不顯示出抗正常人，大鼠小鼠，牛或者綿羊細(xì)胞系或者非神經(jīng)腫瘤細(xì)胞系的消解活性。此外SVV對(duì)初級(jí)人肝細(xì)胞無細(xì)胞毒性。下表1概括了已經(jīng)進(jìn)行的確定SVV對(duì)選擇的腫瘤細(xì)胞類型體外消解效力的研究。
表1SVV抗選擇的腫瘤細(xì)胞類型的消解效力

鼠的研究(參見實(shí)施例)顯示SVV可以高效力以及高特異性體內(nèi)殺傷腫瘤。這些體內(nèi)研究顯示SVV具有大量優(yōu)于其它腫瘤消解病毒的優(yōu)點(diǎn)。例如，影響腫瘤消解腫瘤病毒根除形成的腫瘤能力的一個(gè)重要因素是病毒滲透。在用腺病毒載體的研究中，基于Ad5的載體對(duì)無胸腺小鼠的SCLC腫瘤發(fā)育沒有影響。根據(jù)免疫組織化學(xué)的結(jié)果，腺病毒看起來不能滲透形成的腫瘤。相比之下，在單次系統(tǒng)施用后SVV能夠清除無胸腺裸鼠的H446SCLC腫瘤。SVV具有比其它病毒能夠良好滲透腫瘤組織并在其中擴(kuò)散的較小大小(直徑＜30nm)，這種小尺寸的SVV可以促進(jìn)其成功滲透并根除已形成腫瘤的能力。
化學(xué)抗性是那些接受化療作為癌癥治療的一個(gè)方面的任何患者面臨的主要爭論問題。產(chǎn)生化學(xué)抗性的患者即使不總是但也常常具有非常差的預(yù)后并且不能進(jìn)行選擇性治療。眾所周知，化學(xué)抗性的一個(gè)主要原因是被稱作多重耐藥蛋白(MRPs)家族的蛋白的表達(dá)，過表達(dá)或者活性增加。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)某些腫瘤細(xì)胞對(duì)于SVV的靈敏性也與癌細(xì)胞的化學(xué)抗性狀態(tài)和MRP表達(dá)相關(guān)。H69是對(duì)SVV具有體外抗性的化學(xué)敏感的(阿霉素)細(xì)胞系，而H69AR是過表達(dá)MRPs并且對(duì)SVV敏感(參見表1)的化學(xué)抗性的細(xì)胞系。證據(jù)顯示包括MDR的MRPs過表達(dá)與細(xì)胞對(duì)SVV殺傷的敏感性相關(guān)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了癌癥的治療方法，其中SVV殺傷過表達(dá)MRP的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了治療由于異常細(xì)胞諸如異常增殖細(xì)胞引起的疾病的方法。該方法包括將所述異常細(xì)胞與SVV以引起異常細(xì)胞部分或者全部破壞的方式接觸。SVV可用于治療多種由于異常細(xì)胞引起的疾病。這些疾病的實(shí)例包括但是不局限于腫瘤細(xì)胞顯示神經(jīng)內(nèi)分泌特征的癌癥以及神經(jīng)纖維瘤。
神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤可以通過多種方法進(jìn)行鑒定。例如，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤產(chǎn)生并分泌大量肽類激素以及胺。一些物質(zhì)引起特異性臨床綜合癥良性腫瘤，卓-艾氏綜合征，高血糖，胰升血糖素瘤以及WDHA綜合癥。這些綜合癥的特異性標(biāo)記分別是尿5-HIAA，血清或者血漿胃泌素，胰島素，胰高血糖素以及血管活性腸多肽的基礎(chǔ)和/或刺激水平。一些類癌瘤以及約三分之一的內(nèi)分泌胰腺腫瘤不表現(xiàn)任何臨床癥狀并稱作“無功能”腫瘤。因此，諸如嗜鉻粒蛋白A，胰多肽，血清神經(jīng)元-特異性烯醇酶以及糖蛋白激素亞基的常規(guī)腫瘤標(biāo)記物已經(jīng)被用于不具有明顯臨床的激素相關(guān)癥狀的患者的篩選目的。
在這些常規(guī)腫瘤標(biāo)記物之中，雖然嗜鉻粒蛋白A的確切功能尚不清楚，但是已經(jīng)顯示出可做為多種型式的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤很敏感并特異性的血清標(biāo)記。這是因?yàn)樗€可能在較差分化的不分泌已知激素的神經(jīng)內(nèi)分泌來源的腫瘤的很多情況下得以提高。目前，嗜鉻粒蛋白A被認(rèn)為是可用于診斷以及療效評(píng)價(jià)最好的常規(guī)神經(jīng)內(nèi)分泌血清或者血漿標(biāo)記以及對(duì)于具有不同神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的病人增加50-100％。嗜鉻粒蛋白A血清或者血漿水平反映了腫瘤的載量并且可能是患有中腸良性腫瘤的病人預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了包括SVV以及藥用載體的藥物組合物?？梢园行Я克幱幂d體中的SVV的這種組合物可適于以單位劑型，無菌腸胃外溶液或者懸浮液，無菌非腸胃外溶液或者口服的溶液或者懸浮液，水包油型或者油包水乳化液等形式局部或者系統(tǒng)施用給個(gè)體。用于腸胃外以及非腸胃外給藥的制劑是本領(lǐng)域已知的。組合物還包括凍干和/或重組形式的SVV?？山邮艿乃幬镙d體是例如，鹽溶液，硫酸精蛋白(Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，NJ)，水，水性緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖液以及Tris緩沖液或者聚凝胺(Sigma Chemical，St.Louis，MO)以及磷酸緩沖鹽水以及蔗糖。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)適合的藥物載體的選擇被認(rèn)為是對(duì)于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些溶液是無菌的并且通常不含除了SVV的粒子物質(zhì)。組合物可以包含生理?xiàng)l件所需的藥用助劑物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)以及緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如，乙酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，乳酸鈉等。加強(qiáng)由SVV感染細(xì)胞的賦形劑也包括在內(nèi)。
SVV以經(jīng)由病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制有效抑制，阻止或破壞腫瘤細(xì)胞生長的量施用于宿主或者受試者。利用SVV用于癌癥治療的方法包括以安全，可開發(fā)以及耐受的劑量系統(tǒng)，區(qū)域或者局部遞送病毒以便引發(fā)治療有效地破壞腫瘤細(xì)胞。甚至在系統(tǒng)施用后，SVV的治療指數(shù)為至少10，優(yōu)選至少100或更優(yōu)選至少1000。通常，SVV以1×108以及1×1014vp/kg之間的量施用。所施用的確切劑量依賴于多種因素，包括患者的年齡，體重，以及性別，以及所治療的腫瘤的大小以及嚴(yán)重程度。病毒可以施用一或者多次，取決于宿主的免疫應(yīng)答潛能。單次或者多次施用組合物可以治療醫(yī)師選擇的劑量水平以及模式進(jìn)行。如有必要，免疫應(yīng)答可以通過采用多種免疫抑制劑削弱，以便可以通過降低對(duì)病毒的免疫應(yīng)答反復(fù)性施用和/或加強(qiáng)復(fù)制。本發(fā)明的抗腫瘤病毒治療可以與其它的抗腫瘤方案組合。遞送可以多種方式實(shí)現(xiàn)，采用脂質(zhì)體，直接注入，導(dǎo)管，局部施用，吸入等等。此外，SVV基因組RNA或者其部分的DNA拷貝還可以作為遞送方法，其中隨后DNA由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生SVV病毒粒子或者特定的SVV多肽。
治療有效劑量是指引起患者癥狀的改善或者存活延長的病毒的量。病毒的毒性以及治療效能可以由細(xì)胞培養(yǎng)或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)方法確定，例如用于確定LD50(50％的動(dòng)物或者細(xì)胞群致死的劑量；對(duì)于病毒，該劑量是vp/kg的單位)以及ED50(50％動(dòng)物或者細(xì)胞群治療有效的劑量-vp/kg)或者EC50(50％動(dòng)物或者細(xì)胞群的有效濃度-vp/細(xì)胞(例如，參見表1)。毒性和治療治療之間的劑量比率是治療指數(shù)并且可以表示為LD50和ED50或者EC50之間的比率。優(yōu)選顯示出高治療指數(shù)的病毒。這些細(xì)胞培養(yǎng)分析以及動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的劑量范圍。病毒的劑量優(yōu)選處于包括沒有毒性的ED50或者EC50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以根據(jù)所采用的劑型以及所利用的給藥途徑在這個(gè)范圍內(nèi)變化。在另一方面，提供了治療具有腫瘤病癥的宿主生物體的方法，包括給所述宿主生物體施用治療有效量的本發(fā)明的病毒組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤組織異常增殖并且腫瘤組織可以是惡性腫瘤組織。優(yōu)選地，病毒由于其在腫瘤組織中的選擇性復(fù)制能力分布遍及組織或者腫瘤團(tuán)?？赡苡帽景l(fā)明方法治療的腫瘤病癥包括那些具有親神經(jīng)特性的腫瘤病癥。
產(chǎn)生本發(fā)明病毒的方法產(chǎn)生很高滴度以及產(chǎn)量的本發(fā)明病毒的是本發(fā)明的附加方面。如上所述，SVV可以被純化至高滴度并且可以在允許細(xì)胞系中每細(xì)胞產(chǎn)生超過200,000個(gè)粒子。能夠產(chǎn)生大量病毒的細(xì)胞包括但是不局限于，PER.C6(Fallaux等人，Human Gene Therapv，91909-1917，1998)，H446(ATCC#HTB-171)以及在表1中列舉的其它細(xì)胞系，其EC50值小于10。
例如，微小RNA病毒的溫育可以如下所述進(jìn)行。目的病毒經(jīng)噬斑純化一次并且在允許細(xì)胞系，諸如PER.C6中挑選以及擴(kuò)增充分分離的噬斑。來自受感染細(xì)胞的粗病毒裂解物(CVL)可由多循環(huán)的冷凍以及解凍產(chǎn)生并用于感染大量的允許細(xì)胞。允許細(xì)胞可以溫育在不同的組織培養(yǎng)瓶中，例如50×150cm2瓶，使用不同培養(yǎng)基，諸如包含10％胎牛血清(Biowhitaker，Walkersvile，MD)以及10mM氯化鎂(Sigma，StLouis，MO)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA)。可以在感染后24-48小時(shí)之間或者當(dāng)注意到完全的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí)收獲受感染細(xì)胞，并且由在1500rpm，4℃離心10分鐘收集。將細(xì)胞沉淀再懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中并進(jìn)行多循環(huán)的冷凍以及解凍。通過在1500rpm，4℃離心10分鐘對(duì)所產(chǎn)生的CVL進(jìn)行澄清化?？梢酝ㄟ^梯度離心純化病毒。例如，2輪CsCl梯度離心可以足以純化SVV一步梯度離心(CsCl的密度為1.24g/ml以及1.4g/ml)，繼之以一次連續(xù)梯度離心(CsCl的密度為1.33g/ml)。由分光光度計(jì)確定純化病毒的濃度，假定1A260＝9.5×1012個(gè)粒子(Scraba D.G.，以及Palmenberg，A.C.1999.Cardioviruses Picornaviridae)。InEncyclopediaof Virology.第二版，R.G.Webster and A Granoff Eds)。純化病毒的滴度也使用PER.C6細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)的酸菌斑法確定。PER.C6細(xì)胞的SVV的產(chǎn)量大于每細(xì)胞200,000個(gè)粒子，粒子與PFU的比率為約100。其它允許細(xì)胞(H446-ATCC#HTB-171)的SVV的產(chǎn)量可能至少這樣高或者更高。
此外，商業(yè)上的大規(guī)模的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的幾個(gè)步驟也適于純化SVV。本發(fā)明也包括基于純化腺病毒的方法純化SVV的方法。這些方法包括基于其密度分離SVV，因?yàn)镾VV與腺病毒具有非常類似的密度并且可以與腺病毒共純化。
檢測以及研究腫瘤的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的病毒檢測患者的腫瘤或者贅生性細(xì)胞的方法。細(xì)胞樣品可以獲自患者并通過用附加表位的SVV(或者由本發(fā)明提供的其它腫瘤特異性病毒，即腫瘤特異性突變體心臟病毒)溫育樣品，然后通過檢測附加表位篩選樣品與SVV的結(jié)合進(jìn)行篩選?；蛘呖梢酝ㄟ^檢測SVV是否引起任何的消解篩選樣品。如果SVV確實(shí)引起消解，或者如果SVV可以與樣品中的細(xì)胞特異性結(jié)合，將顯示樣品可能包含已知能夠結(jié)合或者被SVV感染的腫瘤或者腫瘤細(xì)胞。
另外，SVV可用于檢測體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的方法。在該方法中，附加表位的SVV可以首先以某種方式滅活，其中SVV可以仍然特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞但是不能復(fù)制。已經(jīng)結(jié)合SVV的腫瘤細(xì)胞可以通過分析附加表位進(jìn)行檢測。附加表位的檢測可以通過特異性結(jié)合表位的抗體實(shí)現(xiàn)，其中抗體或者被標(biāo)記(例如，熒光標(biāo)記)或者其中抗體能因此通過標(biāo)記的第二抗體檢測。
本發(fā)明的檢測方法包含檢測由本發(fā)明的任何病毒特異性靶向的任何類型的腫瘤或者贅生性細(xì)胞。特異性腫瘤類型包括例如，神經(jīng)內(nèi)分泌型腫瘤，諸如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，SCLC，成神經(jīng)細(xì)胞瘤成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。
本發(fā)明還提供了SVV作為研究腫瘤細(xì)胞的工具的應(yīng)用。SVV選擇性破壞一些腫瘤細(xì)胞類型，并且即使有已經(jīng)對(duì)非腫瘤細(xì)胞幾乎沒有毒性。因?yàn)檫@些特性，SVV可用于研究腫瘤并且可能發(fā)現(xiàn)了一種新的腫瘤特異基因和/或途徑。換句話說，腫瘤細(xì)胞有一些特性可以使SVV復(fù)制，其中正常細(xì)胞不顯示出所述特性。在鑒定了一種新的腫瘤特異基因和/或途徑后，然后可以設(shè)計(jì)或者篩選治療抗體或者小分子從而確定這些試劑是否是抗腫瘤劑。
本發(fā)明還提供了用于鑒定對(duì)SVV應(yīng)答的所有類型的癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于鑒定SVV-應(yīng)答的細(xì)胞的方法包括獲得細(xì)胞，將所述細(xì)胞與SVV接觸以及檢測細(xì)胞殺傷或者檢測病毒復(fù)制。細(xì)胞殺傷可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法進(jìn)行檢測(例如，MTS分析，參見本文的高通量部分)。檢測病毒復(fù)制的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，觀察CPE，噬菌斑法，DNA定量分析法，F(xiàn)ACS以檢測腫瘤細(xì)胞中的病毒量，RT-PCR分析以檢測病毒RNA等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是癌癥細(xì)胞。癌細(xì)胞的實(shí)例包括但是不局限于形成的腫瘤細(xì)胞系以及獲自哺乳動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。在另外的實(shí)施方案，細(xì)胞是獲自人類癌癥患者的癌細(xì)胞。
用于鑒定SVV-應(yīng)答的癌細(xì)胞的方法可用來發(fā)現(xiàn)允許用于SVV復(fù)制的腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織。此外，通過確定允許的腫瘤細(xì)胞的特性，將可以鑒定引起細(xì)胞被SVV選擇性殺傷的腫瘤細(xì)胞的特性。這些特性的發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生用于癌癥藥物的新靶。同樣，用于鑒定SVV應(yīng)答的癌細(xì)胞的方法可用作將受益于SVV治療的人類癌癥患者的篩子。
因?yàn)樯形创_定SVV的天然寄主，所以需要一種檢測SVV的方法。因此，本發(fā)明提供了檢測SVV的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測分析是基于特異于SVV多肽表位的抗體。在另一實(shí)施方案中，該檢測分析是基于核酸雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，從SVV分離RNA，標(biāo)記(例如，放射性，化學(xué)發(fā)光，熒光等)制備探針。然后從硝化纖維(或者類似或者功能等效的基材)結(jié)合的試驗(yàn)材料分離RNA，用標(biāo)記的SVV RNA探測并檢測結(jié)合的探針的量。此外，可以對(duì)病毒的RNA直接或者間接測序并基于序列開發(fā)PCR分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR分析是實(shí)時(shí)PCR分析。
制備改變趨性的病毒的方法本發(fā)明提供了用于構(gòu)建SVV突變體(或者變體或者衍生物)的方法，其中這些突變體具有改變的細(xì)胞類型趨性。具體地，選擇能夠特異性結(jié)合和/或殺傷已知抗野生型SVV結(jié)合的腫瘤或者贅生性細(xì)胞的SVV突變體。
天然或者野生型SVV具有可以使天然病毒修飾使其靶向其它癌癥指標(biāo)的簡單的基因組以及結(jié)構(gòu)。這些新的衍生物具有針對(duì)非神經(jīng)癌癥的延伸的趨性并且在天然的SVV中仍然保持較高的治療指數(shù)。靶向的一種可能的方式是將組織特異性肽或者配體包含在病毒上。
為了挑選癌癥靶向病毒候選物，本發(fā)明提供了用編碼天然SVV的衣殼區(qū)域中的隨機(jī)肽序列的遺傳插入子構(gòu)建以及篩選腫瘤消解病毒文庫的方法。具有108種的隨機(jī)的肽文庫被認(rèn)為是足夠的并且將產(chǎn)生將病毒特異性導(dǎo)向腫瘤組織的肽。
多種研究已經(jīng)顯示腫瘤細(xì)胞顯示出與正常細(xì)胞不同的特性(1)腫瘤細(xì)胞具有更可滲透的細(xì)胞膜；(2)腫瘤具有特異性基質(zhì)細(xì)胞類型諸如血管發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞，其先前已經(jīng)顯示可以表達(dá)細(xì)胞型特異性受體；以及(3)腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)某些受體，抗原以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Arap，W.等人，Nat.Med.，2002，8(2)121-127；Kolonin，M.等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2001，5(3)308-313；St.Croix，B.等人，Science，2000，289(5482)1997-1202)。這些研究顯示腫瘤以及正常組織在分子水平是不同的，并且靶向藥物遞送以及癌癥治療是可行的。具體地，通過小鼠模型的血管復(fù)位選擇的幾個(gè)肽已經(jīng)被用來靶向遞送細(xì)胞毒性藥物(Arap，W.等人，Science，1998，279(5349)377-380)，pro-apoptotic肽(Ellerby，H.M.等人，Nat.Med.，1999，17(8)768-774)，金屬蛋白酶抑制劑(Koivunen，E.等人，Nat.Biotechnol，1999，17(8)768-774)，細(xì)胞因子(Curnis，F(xiàn).等人，Nat.Biotechnol.，2000，18(11)1185-1190)，熒光團(tuán)(Hong.F.D.以及Cayman，G.L.，Cancer Res.，2000，60(23)6551-6556)以及基因(Trepel，M.等人，Hum.Gene Ther.，2000，11(14)1971-1981)。已經(jīng)證實(shí)腫瘤靶向肽可以提高母體藥物的效力并且降低其毒性。
SVV衍生物的文庫可以通過將隨機(jī)的肽序列插入病毒的衣殼區(qū)域產(chǎn)生。如圖57所示，首先產(chǎn)生包含SVV衣殼區(qū)域的載體，即“pSVV衣殼”。這種衣殼載體可被例如用在隨機(jī)位置切割DNA的限制性酶，即CviJI(一種鈍切割酶)切割載體進(jìn)行誘變處理。在多個(gè)位置切割載體，并且可以通過凝膠純化分離只被CviJI切割一次的DNA(參見圖57)。這種分離的DNA群包含大量已經(jīng)在衣殼區(qū)域不同位置被切割的DNA。然后用寡核苷酸以及連接酶溫育這個(gè)群，使得一定百分比的寡核苷酸連接到載體衣殼區(qū)域中的大量不同位置。以這種方式，可以產(chǎn)生突變體SVV衣殼的文庫。
被插入編碼衣殼的區(qū)域中的寡核苷酸可以是隨機(jī)的寡核苷酸，非隨機(jī)的寡核苷酸(即預(yù)確定的寡核苷酸的序列)，或者半隨機(jī)的(即預(yù)確定的一部分寡核苷酸以及具有隨機(jī)序列的部分)。所考慮的寡核苷酸的非隨機(jī)方面可以包含一個(gè)表位編碼區(qū)域。所考慮的表位包括，但是不局限于c-myc-人原癌基因myc的10氨基酸片段(EQKLISEEDL(SEQ IDNO35)；來自人流行性感冒血球凝集素蛋白的HA-凝血素蛋白(YPYDVPDYA(SEQ ID NO36))；以及His6-6個(gè)連續(xù)組氨酸的編碼序列。
然后可以用限制性酶消化突變體衣殼多核苷酸的文庫(例如，圖57中的“pSVV衣殼文庫”)，因此只切除了突變體編碼衣殼的區(qū)。然后將這個(gè)突變體編碼衣殼的區(qū)連接到包含全長基因組序列減去衣殼區(qū)域的載體中(例如，參見圖58)。該連接產(chǎn)生具有全長基因組序列的載體，其中載體群(或者文庫)包含大量突變體衣殼。在圖58中，包括不同衣殼的SVV突變體的這個(gè)文庫表示為“pSVVFL衣殼”。然后對(duì)pSVVFL衣殼載體文庫線性化并逆轉(zhuǎn)錄以便產(chǎn)生突變體SVV RNA(參見圖59)。然后將突變體SVV RNA轉(zhuǎn)入允許細(xì)胞系，使得寄主細(xì)胞翻譯那些在其衣殼中具有合格突變的SVV序列產(chǎn)生大量的突變體SVV粒子。在圖59中，大量的突變體SVV粒子表示為“SVV衣殼文庫”。
被插入編碼衣殼的區(qū)域的由寡核苷酸編碼的肽可以作為特異性病毒感染的靶向部分。靶向特異性癌癥的病毒將只選擇性感染那些具有肽的受體的癌細(xì)胞，在這些細(xì)胞中復(fù)制，殺傷這些細(xì)胞，并只擴(kuò)散那些相同類型的細(xì)胞。本方法可以鑒定新的腫瘤靶向肽和配體，腫瘤選擇性受體，治療的SVV衍生物及其他病毒衍生物，包括微小RNA病毒衍生物。
SVV突變體文庫的體外和體內(nèi)篩選具有優(yōu)于諸如肽珠文庫和噬菌體展示的其它技術(shù)相比的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。與其他的技術(shù)不同，可以原位復(fù)制本文的所希望的候選物，即選擇性結(jié)合癌細(xì)胞的SVV衍生物。這種基于復(fù)制的文庫方法比在先的發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合部分的方法諸如噬菌體展示具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，SVV文庫的篩選是基于復(fù)制。只可以在靶組織中，在這里為某些癌細(xì)胞中復(fù)制所期望的病毒衍生物。該篩選/選擇過程將產(chǎn)生具有靶向肽部分并且可能是癌癥治療本身的非常特異性的病毒候選物。相反，噬菌體展示篩選只會(huì)產(chǎn)生結(jié)合事件并只產(chǎn)生靶向肽候選物。因此，SVV文庫篩選提供了非?？焖僖约斑x擇性的方法。第二，在體外或者體內(nèi)噬菌體展示篩選期間，從靶細(xì)胞回收的噬菌體必須在細(xì)菌中擴(kuò)增，而SVV衍生物可以直接回收并純化自受感染細(xì)胞(或者消解性感染的細(xì)胞的溫育上清液)。第三，SVV具有可以很容易進(jìn)行操縱的較小基因組；因此可以將遺傳信息隨即插入衣殼區(qū)域確保最佳化插入。因此，SVV文庫的構(gòu)建以及篩選非常有可能產(chǎn)生高度有效的病毒衍生物。設(shè)計(jì)以及篩選這些衍生物從而特異性感染具有非神經(jīng)特性的癌癥。
將寡核苷酸插入編碼衣殼的區(qū)域?qū)a(chǎn)生一些缺陷突變株。突變體在在一定意義上有缺陷，以致寡核苷酸序列的插入可以產(chǎn)生終止密碼子，因此將不會(huì)產(chǎn)生病毒多蛋白。同時(shí)，突變體在一定意義上可能有缺陷，以致寡核苷酸序列的插入可能引起衣殼結(jié)構(gòu)的改變，使得衣殼不再能被組裝。為了減少寡核苷酸序列的插入可能引起終止密碼子或者不穩(wěn)定的衣殼結(jié)構(gòu)的幾率，可以使用諸如TRIM法設(shè)計(jì)隨機(jī)的寡核苷酸，使其不編碼終止密碼子或者某些氨基酸。
為了確定衣殼區(qū)域中是否有寡核苷酸的最佳插入點(diǎn)，可以產(chǎn)生RGD-SVV文庫(參見實(shí)施例16)。例如用CviJI隨機(jī)切割編碼SVV衣殼的多核苷酸。然后將隨機(jī)線性化的衣殼多核苷酸連接至至少編碼RGD氨基酸序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的寡核苷酸。然后將這些RGD-衣殼序列連接至缺失衣殼序列的SVV全長序列載體中。產(chǎn)生RGD-SVV衍生物病毒并試驗(yàn)其在某些表達(dá)整聯(lián)蛋白的細(xì)胞系中(因?yàn)镽GD肽已經(jīng)顯示可以將實(shí)體靶向整聯(lián)蛋白受體)感染以及復(fù)制的能力。然后分析成功感染表達(dá)整聯(lián)蛋白的細(xì)胞系的RGD-SVV衍生物以確定是否具有RGD寡核苷酸的主要插入位點(diǎn)。然后該位點(diǎn)可用于隨機(jī)，非隨機(jī)或者半隨機(jī)的寡核苷酸的位點(diǎn)定向插入。
此外，在比較SVV及其他微小RNA病毒的編碼衣殼的區(qū)域部分中(參見圖28)，在序列相似性最低的病毒之間有不同的沒有框出的區(qū)域。這些區(qū)域在促進(jìn)病毒之間不同趨性方面是非常重要的。因此，這些區(qū)域可能是寡核苷酸插入致SVV衣殼(以及其它的病毒衣殼)突變的候選位點(diǎn)。
滅活SVV用于腫瘤-特異性治療因?yàn)镾VV以及SVV-衣殼衍生物可以靶向特異性腫瘤細(xì)胞類型和/或組織，SVV粒子本身可用作治療的遞送介質(zhì)。在這種方法中，對(duì)SVV腫瘤消解能力的需要是任選的，因?yàn)檫f送的治療劑可以殺傷靶腫瘤細(xì)胞。
例如，可以滅活野生型SVV，使得病毒不再消解感染的細(xì)胞，但是其中病毒仍然可以特異性結(jié)合并進(jìn)入靶腫瘤細(xì)胞類型。存在許多本領(lǐng)域已知的病毒復(fù)制功能滅活的標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，由甲醛液或者β-丙內(nèi)酯滅活病毒疫苗，使病毒無法復(fù)制。野生型SVV本身可以包含引起細(xì)胞程序性死亡的肽。或者，可以輻射SVV。然而，應(yīng)該首先試驗(yàn)輻射的病毒以確保它們?nèi)匀荒軌蛱禺愋园邢蚰[瘤細(xì)胞，因?yàn)槟承┹椛錀l件可以引起蛋白以及衣殼的改變。此外，可以產(chǎn)生缺失包裝信號(hào)序列的突變體SVVs。這些SVV突變體能夠特異性結(jié)合并進(jìn)入靶細(xì)胞，但是復(fù)制的SVV基因組RNA不會(huì)包裝并組裝到衣殼中。然而，本方法已被證實(shí)有效，因?yàn)檫@些突變體SVVs的最初進(jìn)入將引起宿主蛋白質(zhì)合成關(guān)閉因此仍然實(shí)現(xiàn)了腫瘤-細(xì)胞死亡。
還可以滅活具有突變體衣殼的衍生物SVVs并用于殺傷癌癥細(xì)胞。被插入衣殼區(qū)域的具有寡核苷酸編碼附加表位的衍生物SVVs可用作將毒素遞送至腫瘤細(xì)胞的介質(zhì)。如本文所述，可以隨機(jī)誘變處理衍生物SVVs并篩選腫瘤特異性趨性。毒素可以附著于附加表位，由此病毒將毒素遞送至腫瘤細(xì)胞?；蛘?，可以使用特異性結(jié)合附加表位的治療抗體，由此病毒將治療抗體遞送至腫瘤細(xì)胞。
高通量篩選本發(fā)明包含用于篩選能夠特異性感染不同細(xì)胞系的病毒的高通量方法?？梢酝ㄟ^分析細(xì)胞病變效應(yīng)檢測感染的特異性。例如，可以將大量的不同腫瘤細(xì)胞系溫育在可用于高通量篩選的多孔板，例如384孔板的不同孔中。將病毒樣品添加入每一孔試驗(yàn)細(xì)胞是否被病毒介導(dǎo)的消解殺傷。從那些顯示細(xì)胞病變效應(yīng)的孔收集培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的任何病毒可以通過感染瓶或者大組織培養(yǎng)板中的允許細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)增。溫育病毒，由此分離RNA并進(jìn)行序列分析確定可能決定提供對(duì)于病毒的腫瘤細(xì)胞類型特異性趨性的序列突變。
多種比色和熒光法可以迅速分析細(xì)胞病變效應(yīng)，包括基于熒光染料的分析，基于ATP的分析，MTS分析以及LDH分析?；跓晒馊玖系姆治隹梢园ê怂崛旧珯z測死亡的細(xì)胞群，因?yàn)榧?xì)胞-不透核酸染色可以特異性檢測死亡的細(xì)胞群。如果希望同時(shí)檢測活的細(xì)胞以及死亡的細(xì)胞群，可以將核酸染色與胞內(nèi)酯酶底物，透膜核酸染料，膜電位感應(yīng)探針，細(xì)胞器探針或者其它的透膜指示物結(jié)合檢測活的細(xì)胞群。例如，Invitrogen(Carlsbad，CA)提供了只滲透具有平衡質(zhì)膜的細(xì)胞的不同的SYTOXTM核酸染劑。溴化乙錠以及碘化丙錠還可以用來檢測死亡的或者正在死亡的細(xì)胞。這些染劑是高親合性核酸染劑，可以通過任何-吸光度讀數(shù)器進(jìn)行檢測。
例如，消解可以基于對(duì)從破裂細(xì)胞釋放到上清液的細(xì)胞液的乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定。為了檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的存在，可以添加底物混合物，由此LDH將通過偶聯(lián)的酶促反應(yīng)將四唑鎓鹽INT還原至三苯基甲脂?？梢酝ㄟ^光學(xué)吸光度讀數(shù)器檢測三苯基甲脂染料?；蛘?，使用甲硫酸吩嗪(PMS)作為電子耦合試劑的MTS分析[3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-5(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽]也可用來檢測細(xì)胞毒性。Promega(Madison，WI)提供CellTiter 96；AQueous一種溶液細(xì)胞增殖分析試劑盒，其中將溶液試劑直接添加至溫育孔，溫育1-4小時(shí)然后在490nm記錄吸光度。由490nm吸光度的量測定的三苯基甲脂產(chǎn)物的量與溫育中活細(xì)胞的數(shù)目成正比。
有大量用于讀取吸光度的高通量裝置。例如，SpectraMax Plus 384Absorbance Platereader(Molecular Devices)以1nm的增量可以檢測190-1000nm的波長。該裝置可以在5秒中讀取96-孔微板，在16秒中可以讀取384-孔板，用于超快的試樣處理量。
還可以分析病毒復(fù)制作為成功感染的的指標(biāo)，并且這種檢測方法可被用于高通量的方式。例如，實(shí)時(shí)RT-PCR法可用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒轉(zhuǎn)錄本的存在。在將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，可以通過借助于雙鏈DNA-結(jié)合染料的PCR擴(kuò)增以及檢測cDNA(例如，SYBRGreen，Qiagen GmbH，德國)。然后可以使用熒光計(jì)直接測定PCR產(chǎn)物的量。
溫育來自顯示細(xì)胞病變效應(yīng)的孔的病毒并更進(jìn)一步地在體外(腫瘤以及正常細(xì)胞系的再試驗(yàn))以及體內(nèi)模型(試驗(yàn)病毒是否可以殺傷小鼠的移植的腫瘤)中試驗(yàn)。
抗體本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合本發(fā)明的病毒，包括病毒的蛋白的抗體。本發(fā)明的抗體包括天然存在的以及非天然存在的抗體，包括，例如單鏈抗體，嵌合抗體，雙功能抗體以及人源化抗體，及其抗原結(jié)合片段。這種非天然存在的抗體可以使用固相肽合成構(gòu)建，可以重組產(chǎn)生或者例如通過篩選由可變重鏈以及可變輕鏈組成的組合文庫獲得(Huse等人，Science 2461275-1281，1989)。這些及其它制備例如，嵌合，人源化，CDR-移植的，單鏈，以及雙功能抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Winter and Harris，Immunol.Todav 14243-246，1993；Ward etal.，Nature 341544-546，1989；Harlow and Lane，AntibodiesAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)；Hilyardet al.，Protein EngineeringA practical approach，IRL Press 1992；Borrabeck，Antibody Engineering，2d ed.，Oxford University Press 1995)。發(fā)明的抗體包括完整的分子以及片段，諸如能夠結(jié)合本發(fā)明多肽存在的表位決定簇的Fab，F(xiàn)(ab′)2，以及Fv。
本發(fā)明的SVV多肽的肽部分(即，SEQ ID NO2的任何肽片段)或者本發(fā)明用作抗體產(chǎn)生的免疫原的另一病毒多肽的肽部分是非免疫原性的，可以通過將半抗原與諸如牛血清白蛋白(BSA)或者鑰孔血藍(lán)素(KLH)的載體分子偶聯(lián)或者通過表達(dá)作為融合蛋白的肽部分產(chǎn)生免疫原性。多種其它的載體分子以及用于將半抗原與載體分子偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域公知的(例如，Harlow and Lane，supra，1988)。用于產(chǎn)生兔，山羊，小鼠或者其它哺乳動(dòng)物的多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，Green等人，“Production of Polyclonal Antisera”，inImmunochemical Protocols，Manson，ed.，Humana Press 1992，1-5頁；Coligan等人，“Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Miceand Hamsters，”，Curr.Protocols Immunol.(1992)，2.4.1部分)。
還可以使用本領(lǐng)域公知的方法獲得單克隆抗體(Kohler andMilstein，Nature 256495，1975；Coligan et al.，supra，1992，sections 2.5.1-2.6.7；Harlow and Lane，supra，1988)。例如，來自用病毒，病毒多肽或者其片段免疫的小鼠的脾細(xì)胞可以融合合適的骨髓瘤細(xì)胞系產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞?？梢允褂美鐦?biāo)記的SVV多肽篩選克隆的雜交瘤細(xì)胞系鑒定分泌具有合適的特異性的單克隆抗體的克隆，以及可以分離以及使用表達(dá)具有所希望的特異性以及親合性的抗體的雜交瘤作為抗體的連續(xù)來源。例如可以類似地從免疫動(dòng)物血清分離多克隆抗體。除了用于進(jìn)行本發(fā)明的方法，這種抗體還可用于例如制備標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒。例如表達(dá)單鏈抗體的重組噬菌體還提供了可用來制備標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒的抗體。例如可以從雜交瘤培養(yǎng)物通過多種沿用已久的技術(shù)分離以及純化單克隆抗體，所述技術(shù)包括例如用Protein-A瓊脂糖凝膠，篩析色譜法以及離子交換色譜法進(jìn)行親和層析(Barnes等人，in Meth.Mol.Biol.1079-104，Humana Press 1992)；Coligan等，上述，1992，參見2.7.1-2.7.12部分以及2.9.1-2.9.3部分)。
可以通過特定抗體的蛋白水解或者通過DNA編碼片段的表達(dá)制備抗體的抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法的全抗體的胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化獲得抗體片段。例如，可以通過用胃蛋白酶酶解抗體提供表示為F(ab′)2的5S片段產(chǎn)生抗體片段。這種片段可以使用硫醇還原劑，以及任選的源于二硫鍵裂解的巰基的保護(hù)基的更進(jìn)一步切割產(chǎn)生3.5S的Fab的單價(jià)片段?；蛘?，使用胃蛋白酶的酶解直接產(chǎn)生2個(gè)單價(jià)的Fab′片段以及一個(gè)Fc片段(參見，例如，Goldenberg，U.S.Pat.Nos.4，036，945以及4，331，647；Nisonhoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89230.1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman et al.，Meth.Enzymol.，1422(Academic Press 1967)；Coligan等人，上述，1992，參見2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4部分)。
抗體的抗原結(jié)合片段的另一實(shí)例是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽可以通過構(gòu)建編碼目的抗體的CDR的多核苷酸獲得。這種多核苷酸可以例如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備從而合成由從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞獲得的RNA編碼的可變區(qū)(例如，Larrick等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology 2106，1991)。
本發(fā)明的抗體可適用于例如，可用于液相中或者與固相載體結(jié)合的免疫分析中。此外，這些免疫分析中的抗體可以多種方式可檢測性的標(biāo)記?？梢岳帽景l(fā)明的抗體進(jìn)行免疫分析的實(shí)例是直接或者間接形式的競爭性以及非競爭性免疫分析。這種免疫分析的實(shí)例是放射免疫分析(RIA)以及三明治(免疫測量)分析。使用本發(fā)明的抗體檢測抗原可以利用以正向，逆向或者同時(shí)的方式進(jìn)行的免疫分析進(jìn)行，包括在生理樣品上的免疫組織化學(xué)分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或者可以不用過度的試驗(yàn)很容易地意識(shí)到其它的免疫分析形式。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種不同的標(biāo)記以及標(biāo)記抗體的方法。可被用于本發(fā)明的標(biāo)記類型的實(shí)例包括酶，放射性同位素，熒光化合物，膠態(tài)金，化學(xué)發(fā)光化合物，磷光化合物以及生物發(fā)光化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道其它用于結(jié)合抗體或者抗原的適合的標(biāo)記，或者利用常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌虼_定這種標(biāo)記。
可對(duì)上述方法以及組合物進(jìn)行多種改變，只要不背離上述的本發(fā)明的范圍以及精神，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到上述說明書中所含的，附圖中顯示的或者附屬權(quán)利要求限定的主題是說明性的，而非限制性的。
實(shí)施例下列實(shí)施例用來舉例說明本發(fā)明，并且本發(fā)明并不限于實(shí)施例。
實(shí)例1病毒的擴(kuò)增以及純化在PER.C6細(xì)胞中溫育SVVSVV經(jīng)噬斑純化一次并在PER.C6細(xì)胞中挑選以及擴(kuò)增充分分離的噬斑(Fallaux等人，1998)。來自SVV感染的PER.C6細(xì)胞的粗病毒裂解物(CVL)可由3循環(huán)的冷凍和解凍產(chǎn)生并用于感染PER.C6細(xì)胞。將PER.C6細(xì)胞使用包含10％胎牛血清(Biowhitaker，Walkersvile，MD，USA)以及10mM氯化鎂(Sigma，St Louis，MO，USA)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在50×150cm2的T.C瓶中進(jìn)行溫育。感染后30小時(shí)當(dāng)觀察到完全的CPE時(shí)收獲受感染細(xì)胞并在1500rpm，4℃離心10分鐘進(jìn)行收集。將細(xì)胞沉淀再懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中(30ml)并進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的冷凍以及解凍。在1500rpm，4℃離心10分鐘澄清所產(chǎn)生的CVL。經(jīng)2輪CsCl梯度純化SVV一步梯度離心(CsCl的密度為1.24g/ml以及1.4g/ml)，繼之以一次連續(xù)梯度離心(CsCl的密度為1.33g/ml)。由分光光度計(jì)確定純化病毒的濃度，假定1A260＝9.5×1012個(gè)粒子(Scraba D.G.，以及Palmenberg，A.C.1999.Cardioviruses Picornaviridae)。InEncyclopedia of Virology.第二版，R.G.Webster and A Granoff Eds)。純化病毒的滴度也使用PER.C6細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)的噬斑法確定。PER.C6細(xì)胞的SVV的產(chǎn)量大于每細(xì)胞200,000個(gè)粒子，粒子與PFU的比率為約100。其它允許細(xì)胞(H446-ATCC#HTB-171)的SVV的產(chǎn)量可能至少這樣高或者更高。
實(shí)例2電子顯微鏡檢查使用直接的施用法將SVV安放在聚醋酸甲基乙烯酯碳包被的網(wǎng)格上，用乙酸雙氧鈾染色并經(jīng)透射電子顯微鏡檢測。以高倍放大拍攝病毒的代表性顯微照片。對(duì)于透射電子顯微鏡，從包埋塊切割超薄型的SVV-感染的PER.C6細(xì)胞切片，并經(jīng)透射電子顯微鏡檢驗(yàn)所產(chǎn)生的切片。
純化的SVV粒子是球狀的并且直徑約為27nm，在網(wǎng)格上呈單個(gè)或者少量聚集。SVV的代表性圖像顯示在圖2中。在一些地方，還可見破裂的病毒粒子以及染料可以穿透的空衣殼。感染的PER.C6細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的研究顯現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)中的晶狀包涵體。SVV感染的PER.C6細(xì)胞的代表性圖像顯示在圖3中。病毒感染細(xì)胞顯示幾個(gè)大泡囊體(空泡)。
實(shí)例3SVV的核酸分離RNA分離使用硫氰酸胍以及使用Trizol(Invitrogen)的苯酚提取法提取SVV基因組RNA。根據(jù)廠商的說明書進(jìn)行分離。簡要地，將250μl的純化的SVV與3體積的TRIZOL以及240μl的氯仿混合。用600μl異丙醇沉淀包含RNA的水相。用70％乙醇洗滌RNA沉淀兩次，干燥并溶于DEPC-處理過的水中。由260nm的光密度測量估計(jì)提取的RNA的量。經(jīng)由1.25％變性瓊脂糖凝膠(Cambrex Bio SciencesRockland Inc.，Rockland，ME USA)溶解等分試樣的RNA并由溴化乙錠染色觀察并對(duì)條帶拍攝(圖4)。
cDNA合成由RT-PCR合成SVV基因組的cDNA。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用1μg的RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，以及隨機(jī)的14-聚體的寡核苷酸或者寡-dT進(jìn)行cDNA的合成。擴(kuò)增cDNA的片段，克隆到質(zhì)粒中，并對(duì)克隆測序。
實(shí)施例4SVV序列分析
分析SVV SEQ ID NO1的核苷酸序列確定其與其它病毒的進(jìn)化關(guān)系。該ORF的翻譯產(chǎn)物(SEQ ID NO2)是微小RNA病毒類的并且從VP2的中間達(dá)到3D聚合酶末端的終止密碼子并且是1890個(gè)氨基酸長(圖5A-5E以及7A-7B)。緊接ORF的3′非翻譯區(qū)(UTR)，核苷酸5671-5734是64個(gè)核苷酸(nt)長，包括終止密碼子并排除了提供了18個(gè)殘基的聚腺苷酸尾部(圖5E)。
SVV的3個(gè)部分基因組片段的初步比較(未顯示)顯示SVV是心臟病毒(微小RNA病毒科)最密切相關(guān)的成員。因此構(gòu)建了SVV、腦心肌炎病毒(EMCV；腦心肌炎病毒種)、Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒(TMEV；Theilovirus種)、Vilyuisk人腦脊髓炎病毒(VHEV；Theilovirus種)以及大鼠TMEV類介質(zhì)(TLV；Theilovirus種)的多蛋白序列(圖28)的比對(duì)。由此，SVV多蛋白加工與心臟病毒屬的最接近的相關(guān)成員多蛋白加工進(jìn)行比較。個(gè)體多肽之間的切割位點(diǎn)在圖28中通過“/”符號(hào)來區(qū)別。
在微小RNA病毒中，大多數(shù)多蛋白裂解是通過一或多種病毒-編碼的蛋白酶進(jìn)行的，盡管在心臟-，aphtho-，erbo-和teschoviruses中P1-2A和2B之間的裂解是通過未充分了解與2A序列本身相關(guān)并且精密地包括序列“NPG/P”的順式-作用機(jī)制來進(jìn)行的，其中“/”表示2A和2B多肽之間的斷裂(Donnelly等，1997，J.Gen.Virol.7813-21)。副腸孤病毒，Ljungan病毒中的一種，具有存在于典型的副腸孤病毒2A上游的序列(NPGP)并且是其它的2A或是P1衣殼區(qū)域的C-末端。在所有目前確認(rèn)的微小RNA病毒屬中，3Cpro具有除順式-作用自我裂解反應(yīng)外幾乎所有的作用(即2A在其腸-和鼻病毒的N-末端裂解且L在口蹄疫病毒和erboviruses的C-末端裂解)。衣殼多肽VPO裂解為VP4和VP2后裝配不通過3Cpro進(jìn)行，但是通過一種其可能涉及病毒RNAde未知機(jī)制進(jìn)行。VPO裂解在副腸孤病毒和kobuviruses中沒有出現(xiàn)。正常的心臟病毒3Cpro切割位點(diǎn)在-1位置具有谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)并且在+1位置具有甘氨酸(G)，絲氨酸(S)，腺嘌呤(A)或天冬酰胺(N)(表2)。SVV多蛋白的裂解遵照此模式，除了VP3/VP1位點(diǎn)其是組氨酸(H)/絲氨酸(S)(表2)；然而，在馬鼻炎A病毒(ERAV；口瘡病毒屬)至少一個(gè)毒株中，H/S可能存在3A和3BVPg之間的切割位點(diǎn)(Wutz等，1996，J.Gen.Virol.771719-1730)。
表2.SVV和心臟病毒的切割位點(diǎn)

*2A和2B之間的斷裂不是裂解作用。
SVV的初級(jí)裂解(P1/P2和P2/P3)這些初級(jí)裂解作用被預(yù)測在心臟-，aphtho-，erbo-和teschoviruses中以類似的方式發(fā)生，包括通過涉及序列NPG/P的新機(jī)制以及通過2BC和P3之間3Cpro的傳統(tǒng)的裂解作用將P1-2A與2B分離(表2)。
P1裂解通過用EMCV和TMEV的序列比對(duì)，SVV P1編碼衣殼的區(qū)內(nèi)的裂解是相對(duì)容易預(yù)測的(表2)。
P2裂解2C蛋白與RNA合成有關(guān)。SVV的2C多肽含有存在于推斷的螺旋酶和所有微小RNA病毒2Cs中的NTP-結(jié)合基序GxxGxGKS/T(功能域A)和hyhyhyxxD(其中hy是疏水性殘基；功能域B)(圖29)。
P3裂解P3切割位點(diǎn)的預(yù)測同樣也是相對(duì)簡單的。關(guān)于3A多肽的功能了解很少。然而，所有微小RNA病毒3A蛋白含有推斷的跨膜α-螺旋。SVV和心臟病毒之間蛋白初級(jí)序列的同一性是很低的(參見圖28的位置1612至1701之間)。
基因組-連接的多肽，VPg，其由3B區(qū)域編碼，其與其它心臟病毒共有很少的氨基酸，然而，第三個(gè)殘基是酪氨酸，此與其連接病毒基因組的5′端相符合。(Rothberg等，1978)。參見圖28位點(diǎn)1703和1724之間。
目前已經(jīng)確定四個(gè)微小RNA病毒3C半胱氨酸蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)并且鑒定了活性位點(diǎn)殘基(HAV，Allaire等，1994，Nature，36972-76；Bergmann等，1997，J.Virol.，712436-2448；PV-1，Mosimann等，1997，J.Mol.Biol.，2731032-1047；HRV-14，Matthews等.，1994，Cell，77761-771；以及HRV-2，Matthews等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611000-11007)。圖29中粗體表示的半胱氨酸為親核物質(zhì)，而第一個(gè)粗體組氨酸為常規(guī)堿基并且對(duì)于谷氨酰胺殘基的特異性主要通過第二個(gè)粗體組氨酸顯示；所有的三個(gè)殘基在SVV序列中(圖29)且其它已知的微小RNA病毒(圖28；3C序列比較參見1726和1946之間的位點(diǎn))是保守的。
3D多肽是RNA依賴的RNA聚合酶的主要組分且SVV含有在細(xì)小核糖核酸-類病毒RNA-依賴的RNA聚合酶中保守的基序即KDEL/IR，PSG，YGDD和FLKR(圖3；圖28的1948和2410之間的位點(diǎn))。
P1N-末端的十四?；诖蠖鄶?shù)微小RNA病毒中P1前體多肽通過酰胺鍵將其N-末端甘氨酸殘基共價(jià)結(jié)合(當(dāng)存在N-末端甲硫氨酸時(shí)被除去)于肉豆蔻酸的分子(Chow等，1987，Nature，327482-486)。因而裂解產(chǎn)物含有P1N-末端的VP0和VP4也被十四烷基化。通過識(shí)別從甘氨酸開始的八氨基酸信號(hào)的十四酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行十四酰化。在微小RNA病毒中，已經(jīng)鑒定了五個(gè)殘基共有序列基序，G-x-x-x-T/S(Palmenberg，1989，In Molecular Aspects of Picornavirus Infection andDetection，pp.211-241，Ed.Semler&Ehrenfeld，Washington D.C.，Amer.Soc.for Micro.)。沒有VP0的成熟裂解的副腸孤病毒(人副腸孤病毒和Ljungan病毒)顯然不被十四烷基化，然而，似乎某些類型的分子阻斷了這些病毒的VP0的N-末端。
個(gè)體SVV多肽與公眾序列數(shù)據(jù)庫的比較利用位于歐洲生物信息學(xué)學(xué)會(huì)(EBI；http//www.ebi.ac.uk/)的FASTA在線程序?qū)⒚恳籗VV多肽(SEQ ID NOs4，6，8，10，12，14，16，18，20和22)與公眾蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。這些比較的結(jié)果(最佳匹配)顯示于表3。衣殼多肽(VP2，VP3和VP1)與2C，3Cpro和3Dpol一起作為一個(gè)整體，與心病毒屬最緊密相關(guān)，然而，短的預(yù)測的2A序列與Ljungan病毒(副腸孤病毒屬)的較接近。SVV 2A核苷酸序列與類似序列的更具體的比較顯示于圖28中(參見圖70的2A類NPG/P蛋白比較)。
表3.Seneca Valley病毒的個(gè)體預(yù)測多肽的數(shù)據(jù)庫匹配

*光合的、厭氧的、綠色-硫細(xì)菌2-磷酸甘油酯脫水酶2)(2-磷酸-D-甘油酸酯水裂解酶2SVV 2B與溶脲脲原體多重條帶抗原或3A與Chlorobium tepiduna烯醇化酶2的匹配的顯著性不明確，然而，這些關(guān)系也許值得進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
SVV多肽與其它微小RNA病毒的系統(tǒng)發(fā)生比較可與心病毒屬(VP2，VP3，VP1，2C，3C和3D)比對(duì)的SVV多肽與每一微小RNA病毒種的相同蛋白的典型成員相比較(表4)。將程序BioEdit v5.0.9(Hall，1999，Nucl.Acids.Symp.Ser.，4195-98)和Clustal X vl.83(Thompson等，1997，Nucl.Acids Res.，254876-4882)用于進(jìn)行比對(duì)以及根據(jù)Saitou和Nei的算法(Satiou和Nei，1987，Mol.Biol.Evol.，4406-425)用于構(gòu)建距離矩陣和遷離的相鄰-連接樹。通過引導(dǎo)程序再取樣讀取分支上的置信限度(1000個(gè)假復(fù)制子)。利用TreeView 1.6.6(Page，1996)繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(圖31至37)。距離矩陣用于構(gòu)建多重取代校正的值所使用的系統(tǒng)樹，而圖38-44表明了實(shí)際的氨基酸同一性百分比。表4表明了微小RNA病毒的目前的分類以及在這些比較中使用的代表性病毒序列。
表4.用于與SVV比較的微小RNA病毒的系統(tǒng)分類

*目前的分類學(xué)將SV2和PEV-8分在腸道病毒屬，然而，其已經(jīng)表明它們可能被分在新屬中(Krumbholz等，2002；Oberste等，2003)。
個(gè)體衣殼蛋白(圖31至33)的系統(tǒng)發(fā)生樹并不全表示當(dāng)將所有的發(fā)生樹的多肽的數(shù)據(jù)組合時(shí)(圖34)產(chǎn)生的樹。這可能是因?yàn)殡y以對(duì)衣殼多肽進(jìn)行比對(duì)，尤其是不是全長時(shí)，和VP2的情況一樣(圖31)。然而，P1，2C，3CPro以及3DPol發(fā)生樹都同意并顯示SVV與EMCV和TMEV簇集。
作為心臟病毒成員的Seneca Valley病毒顯而易見SVV的3Dpol與心臟病毒相關(guān)，幾乎與EMCV和TMEV彼此接近(圖37；圖44)。在通常被認(rèn)為是在微小RNA病毒相對(duì)保守的其它多肽，2C和3C中，SVV也與心臟病毒最密切相關(guān)，雖然它并不向EMCV和TMEV彼此那樣的與EMCV和TMEV相關(guān)(分別圖42和圖43)。在外部的衣殼蛋白(作為一個(gè)整體來看)中，SVV也與心臟病毒最相關(guān)并與2個(gè)口蹄疫病毒種，口蹄疫病毒和馬鼻病毒A具有幾乎相同的關(guān)系(約33％)。SVV與心臟病毒在2B和3A多肽方面大大偏離并且與任何已知的微小RNA病毒沒有可檢測的關(guān)系。
然而，不是沒有前例；禽腦脊髓炎病毒與甲型肝炎病毒(HAV)在2A，2B和3A方面相當(dāng)不同(Marvil等人，1999，J.Gen.Virol.，80653-662)但是被暫時(shí)地與HAV一起分類在肝病毒屬內(nèi)。
如果EMCV和TMEV作為標(biāo)準(zhǔn)的話，Seneca Valley病毒顯而易見不是典型的心臟病毒。然而，這2種病毒甚至也具有差異，值得注意的是在5’UTR(Pevear等人，1987，J.Virol.，611507-1516)。然而，在很多蛋白(P1，2C，3Cpro和3Dpol區(qū)域)方面SVV與EMCV和TMEV系統(tǒng)性簇集。最終，SVV在微小RNA病毒內(nèi)的分類位置可能由國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)的執(zhí)行委員會(huì)(EC)，根據(jù)微小RNA病毒研究組和公布的證明材料的推薦決定。有兩個(gè)選擇i)將SVV納入在心臟病毒屬中作為新種；或者ii)將SVV指定為新屬。暫時(shí)為了本發(fā)明的目的，SVV被分在心臟病毒屬中。
實(shí)施例4SVV衣殼蛋白的SDS-PAGE和N-末端序列分析將純化的SVV使用NuPAGE預(yù)成形的Tris聚丙烯酰胺小凝膠電泳系統(tǒng)(Novex，San Diego，Ca，美國)進(jìn)行電泳。通過銀染觀測一半凝膠，而另一個(gè)半用來制備對(duì)衣殼蛋白N-末端氨基酸進(jìn)行測序的樣品。在轉(zhuǎn)移蛋白至膜之前，凝膠浸泡在10mM CAPS緩沖液中，pH11，1小時(shí)，并且在甲醇中潤濕PVDF膜(Amersham)。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移后，通過酰胺黑染色約1分鐘來觀察蛋白，并且用解剖刀切下目的條帶并風(fēng)干?？赏ㄟ^Edman降解法利用脈沖相位測序儀對(duì)N-末端自動(dòng)測定蛋白的序列。
純化的SVV的三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白顯示于圖45(約36kDa，31kDa，和27kDa)中。
實(shí)施例5分析人血清樣品中的SVV的中和抗體特定病毒載體的先前存在抗體可以限制這種載體在例如治療轉(zhuǎn)移性癌癥的系統(tǒng)遞送施用的應(yīng)用，因?yàn)橄惹按嬖诳贵w可以結(jié)合系統(tǒng)遞送的載體并在載體有機(jī)會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶組織或者器官之前將它們中和。因此，希望保證人不攜帶選擇用于系統(tǒng)遞送的病毒載體的中和抗體。為了確定人血清樣品是否包含SVV-特異性中和抗體，使用隨機(jī)收集的人血清樣品進(jìn)行中和分析。
組織培養(yǎng)半感染劑量實(shí)驗(yàn)之前一天，將包含1×104個(gè)細(xì)胞的180μl的PER.C6細(xì)胞懸液鋪板在96-孔組織培養(yǎng)皿中。在對(duì)數(shù)步驟將SVV的粗病毒裂解物(CVL)從10-0到10-11稀釋在DMEM培養(yǎng)基中(Dulbecco修飾的Eagle′s Medium)，并將20μl每一稀釋物轉(zhuǎn)入包含PER.C6細(xì)胞的Falcon 96-孔組織培養(yǎng)板的3個(gè)孔。在37℃，5％CO2中溫育平板并在第3天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的顯微鏡證據(jù)的，并計(jì)算組織培養(yǎng)半感染劑量(TCID50)。
中和分析首先將40μl的培養(yǎng)基置于所有的孔中，然后向第一孔添加40μl加熱滅活血清并由吸量管混合，制成用于篩選目的的1∶4的稀釋物。然后將40μl轉(zhuǎn)入下一孔進(jìn)行血清樣品的兩倍稀釋。將包含100TCID50的40μl的SVV病毒添加給包含稀釋的血清樣品的孔。在37℃溫育平板1小時(shí)。取40μl的混合物并轉(zhuǎn)入包含PER.C6細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞/160μl/孔)的平板中。在37℃溫育平板3天。此后次，顯微鏡下讀取培養(yǎng)物的CPE。
如上所述在進(jìn)行代表性中和分析中，檢驗(yàn)隨機(jī)從美國，歐洲以及日本收集的二十二份人血清樣品的SVV特異性中和抗體。連續(xù)稀釋血清樣品并與定量的包含100TCID50的SVV混合。然后將血清-病毒混合物用于感染PER.C6細(xì)胞并溫育24小時(shí)。中和抗體滴度確定為能阻斷CPE形成的血清的最高稀釋度的倒數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，阻斷CPE形成的血清的稀釋度沒有顯示人血清樣品不包含SVV中和抗體。
PER.C6的更進(jìn)一步SVV感染沒有受到與人血液溫育的抑制(參見實(shí)施例6)，顯示SVV感染不受補(bǔ)體或血細(xì)胞凝集的抑制。結(jié)果，SVV顯示出比其它的腫瘤消解病毒更長的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，其是使用腫瘤消解腺病毒的顯著問題。
實(shí)施例6SVV與人紅細(xì)胞的結(jié)合和血細(xì)胞凝集多種病毒血清型已經(jīng)顯示引起分離自多種動(dòng)物血液的紅細(xì)胞的體外血細(xì)胞凝集。血細(xì)胞凝集或者與紅細(xì)胞結(jié)合可能引起體內(nèi)毒性并也可能影響病毒載體的體內(nèi)分布和效力。因此，希望分析選擇用于系統(tǒng)施用治療轉(zhuǎn)移性癌癥的病毒載體的紅細(xì)胞凝集特性。
血細(xì)胞凝集分析為了確定SVV是否引起人紅細(xì)胞的凝集，在U型底96-孔板中進(jìn)行血細(xì)胞凝集分析。在25μl PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)中連續(xù)稀釋純化的SVV，一式兩份，并向每一孔添加等體積的1％紅細(xì)胞懸浮液。用肝素作為抗凝血?jiǎng)慕】档膫€(gè)體獲得被用來分離紅細(xì)胞的血樣。通過在冷PBS中洗滌血液3次除去血漿以及白血球制備紅細(xì)胞。最后洗滌后，將紅細(xì)胞懸浮在PBS中制備1％(V/V)的細(xì)胞懸液。溫和地混合病毒以及紅細(xì)胞并在室溫下溫育平板1小時(shí)并監(jiān)控血細(xì)胞凝集方式。
全血滅活分析為了排除SVV被血液組分的直接滅活，在室溫下分離血漿之前將等分試樣的病毒用屬于A，B，AB和O血型的肝素化人血液或者PBS溫育等分試樣的病毒，之后感染PER.C6細(xì)胞并計(jì)算滴度。
在如上所述進(jìn)行的代表性分析中，在SVV的任何試驗(yàn)的稀釋度沒有看見不同血型(A，B，AB和O)的人紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集。當(dāng)SVV與人血液樣品混合并溫育30分鐘和1小時(shí)觀測到病毒滴度的少量增加，顯示病毒沒有被血液組分滅活但是在試驗(yàn)條件下更具感染性。
實(shí)施例7體內(nèi)清除血循環(huán)時(shí)間為了確定病毒在腫瘤中的血循環(huán)時(shí)間和量，用SVV在1×1012vp/kg由尾部靜脈注射處理具有H446腫瘤的裸鼠。在注射后0，1，3，6，24，48，72小時(shí)和7天(189小時(shí))對(duì)小鼠取血并在聚集之后立即將血漿與血液分離，稀釋在感染培養(yǎng)基中并用于感染PER.C6細(xì)胞。在注射后6，24，48，72小時(shí)以及7天處死注射的小鼠并收集腫瘤。將腫瘤切成小切片并懸浮在1ml的培養(yǎng)基中，并進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的冷凍以及解凍從受感染的細(xì)胞釋放病毒。連續(xù)的對(duì)數(shù)稀釋上清液并分析PER.C6細(xì)胞上的滴度。SVV滴度表示為pfu/ml。腫瘤切片也進(jìn)行H&E染色以及免疫組織化學(xué)分析來檢測腫瘤中的病毒衣殼蛋白。
基于7.3％的小鼠體重為血液的假設(shè)確定血液中病毒粒子的循環(huán)水平。在基本上如上所述進(jìn)行的代表性分析中，病毒施用6小時(shí)內(nèi)，SVV的循環(huán)水平降低為0個(gè)粒子并且在隨后的時(shí)間點(diǎn)沒有檢測到SVV(圖46A)。在腫瘤中，注射后6小時(shí)可檢測到SVV，之后病毒的量以2倍對(duì)數(shù)穩(wěn)定地增加(圖46B)。只在注射后7天才在腫瘤中檢測到病毒(圖46B)。進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的腫瘤切片顯示了腫瘤細(xì)胞中的SVV蛋白(圖47，上面)。當(dāng)由H&E染色時(shí)，腫瘤切片顯示幾個(gè)圓形的腫瘤細(xì)胞(圖47，下面)。
SVV也顯示出與類似劑量i.v.的腺病毒相比在血液中顯著延長的駐留時(shí)間。單次i.v.劑量后，SVV保存在血液中高達(dá)6小時(shí)(圖46C；圖46C是與圖46D相比的圖46A的重復(fù))，而在約一個(gè)小時(shí)腺病毒被從血液清除(圖46D)。
實(shí)施例8腫瘤細(xì)胞選擇性SVV的體外細(xì)胞殺傷活性為了確定敏感度，從不同的來源獲得人，牛，豬以及小鼠細(xì)胞，正常以及腫瘤細(xì)胞并且感染SVV。所有的細(xì)胞型被培養(yǎng)在培養(yǎng)基中并在廠商推薦的條件下培養(yǎng)。初級(jí)人肝細(xì)胞可以購自In Vitro Technologies(Baltimore，MD)并溫育在Hepatocye培養(yǎng)基中(HCMTM，BioWhittaker/Clonetics公司，圣迭戈，CA)。
體外細(xì)胞病理分析為了確定哪些類型的細(xì)胞對(duì)SVV感染敏感，用純化SVV的系列稀釋感染單層增殖正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。監(jiān)控細(xì)胞的CPE并與未感染的細(xì)胞相比較。感染后3天，進(jìn)行MTS細(xì)胞毒性測定并計(jì)算每細(xì)胞粒子中半致死劑量百分比(LD50)值。參見以下的表5和6
表5.EC50值小于100的細(xì)胞系

表6.EC50值超過1000的細(xì)胞系

根據(jù)廠商的說明書進(jìn)行MTS分析(CellTiter 96；AQueousAssay byPromega，Madison，WI)。Cell Titer 96；AQueousAssay優(yōu)選地使用四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽；MTS)和電子耦合試劑，甲硫酸吩嗪(PMS)。研究中評(píng)價(jià)的接觸-抑制的正常人細(xì)胞包括HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，HAEC(人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，Clonetics/BioWhittaker#CC-2535)，Wi38(正常人胚胎肺成纖維細(xì)胞，ATCC#CCL-75)，IMR90(人正常肺成纖維細(xì)胞，ATCC CCL-186)，MRC-5(人正常肺成纖維細(xì)胞，ATCC#CCL-171)和HRCE(人腎皮層上皮細(xì)胞，Clonetics/BioWhittaker#CC-2554)。
SVV在任意上述接觸-抑制的正常細(xì)胞中不產(chǎn)生CPE。在下列人腫瘤細(xì)胞系中沒有觀察到病毒-誘導(dǎo)的CPEHep3B(ATCC#HB-8064)，HepG2(人肝細(xì)胞癌，ATCC#HB-8065)，LNCaP(人前列腺癌，ATCC#CRL-10995)，PC3M-2AC6，SW620(人結(jié)腸直腸腺癌，ATCC#CCL-227)，SW 839(人結(jié)腸直腸腺癌，ATCC#HTB-49)，5637(人膀胱癌，ATCC#HTB-9)，DMS-114(小細(xì)胞肺癌，ATCC#CRL-2066)，DMS153(人小細(xì)胞肺癌，ATCC#CRL-2064)，A549(人肺癌，ATCC#CCL-185)，HeLa S3(人子宮頸癌，ATCC#CCL-2.2)，NCI-H460(人大細(xì)胞肺癌，ATCC#HTB-177)，KK(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)以及U-118MG(人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，ATCC#HTB-15)。注意-表6中具有EC50值大于1000的細(xì)胞系很可能不允許SVV復(fù)制和/或病毒粒子產(chǎn)生；盡管可能性依然是SVV可結(jié)合和進(jìn)入這些細(xì)胞但是沒有觀察到CPE因?yàn)镾VV復(fù)制不能在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)或復(fù)制不發(fā)生但是沒有觀察到CPE，因?yàn)橛心承┢渌倪M(jìn)入后阻斷(即，沒有復(fù)制的SVV基因組包裝到病毒粒子中)。然而，考慮到CPE在這些細(xì)胞系中的缺乏，這些細(xì)胞-系，及其潛在的腫瘤型，是試驗(yàn)細(xì)胞和腫瘤型是SVV復(fù)制允許或不允許的良好的候選物。盡管野生型SVV是腫瘤-特異性的，且已顯示靶向神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，包括小細(xì)胞肺癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤，可能存在單獨(dú)的病人其具有多種類型的病因使得SVV不允許為其神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的形式。因此本發(fā)明預(yù)期可殺死由其中腫瘤不是野生型SVV的個(gè)別病人分離的腫瘤細(xì)胞類型的SVV衍生物的產(chǎn)生，且由此個(gè)體分離的腫瘤型可包括，例如，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，淋巴瘤，小細(xì)胞肺癌，大細(xì)胞肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，肝癌，結(jié)腸癌，腎癌，結(jié)腸癌，膀胱癌，直腸癌和鱗狀上皮細(xì)胞肺癌。
通過LDH釋放分析(CytoTox96非放射性的細(xì)胞毒性分析，Promega，#G1780)測定SVV-介導(dǎo)的對(duì)初級(jí)人肝細(xì)胞(InVitroTechnologies)的細(xì)胞毒性。用以1，10和100和1000個(gè)粒子每細(xì)胞(ppc)的SVV感染在骨膠原包被的12-孔板中鋪板的初級(jí)人肝細(xì)胞。感染3小時(shí)后，將感染培養(yǎng)基替換為2ml的生長培養(yǎng)基并在CO2恒溫箱中溫育3天。分別測定溫育上清液中的細(xì)胞相關(guān)的乳酸脫氫酶(LDH)和LDH。測定細(xì)胞毒性百分比作為上清液中的LDH單位與最大的細(xì)胞LDH加上清液LDH的比。
圖48中的數(shù)據(jù)說明在所有試驗(yàn)的多重感染中缺乏SVV介導(dǎo)的肝臟毒性。
實(shí)施例10病毒產(chǎn)生分析為評(píng)價(jià)SVV的復(fù)制能力，用SVV以每細(xì)胞一個(gè)病毒粒子(ppc)感染若干選擇的接觸-抑制的正常細(xì)胞和積極分裂的腫瘤細(xì)胞。72小時(shí)后，將細(xì)胞和培養(yǎng)基用于三個(gè)凍融循環(huán)并離心來收集上清液。制備上清液的系列對(duì)數(shù)稀釋并分析PER.C6細(xì)胞的滴度。對(duì)每一細(xì)胞系而言，SVV復(fù)制的效率表示為pfu/ml(圖49)。
實(shí)施例10毒性最大耐受劑量(MTD)定義為動(dòng)物(例如小鼠)用SVV治療后表現(xiàn)出緊接劑量限制毒性(DLT)之前的劑量。DLT定義為動(dòng)物在研究的全部期間由于施用SVV顯示出體重減少，病癥和死亡率的劑量。在基線，第15天和第21天評(píng)價(jià)SVV的中和抗體。如早先描述的進(jìn)行中和分析。
將逐步升高劑量(1×108-1×1014vp/kg)的SVV靜脈內(nèi)施用于購自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN，USA)的免疫缺陷和CD-1遠(yuǎn)系繁殖的免疫活性小鼠來測定每一劑量水平10個(gè)小鼠的MTD。病毒在所有試驗(yàn)的劑量水平較好的耐受，沒有顯示出任何臨床癥狀且沒有體重減少(圖50)。在第15天和第21天對(duì)小鼠取血并在中和試驗(yàn)中監(jiān)控血清的SVV-特異性中和抗體的存在。SVV注射的CD1小鼠產(chǎn)生中和抗體且滴度從1/1024到大于1/4096的范圍。
對(duì)免疫活性的小鼠株(A/J)進(jìn)行另一毒性研究。已經(jīng)證明SVV顯示出細(xì)胞殺死活性且在N1E-115細(xì)胞中復(fù)制(參見表1)。鼠細(xì)胞系N1E-115(成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，即，神經(jīng)內(nèi)分泌癌)獲自A/J小鼠株。因此，建立同基因的小鼠模型，其中在A/J小鼠中皮下植入N1E-115細(xì)胞來形成腫瘤，且用SVV處理小鼠來研究其效力和毒性。
在A/J研究中，小鼠i.v注射SVV來測定A/J小鼠是否可耐受系統(tǒng)性施用的SVV。獲得血液結(jié)果學(xué)結(jié)果來尋找毒性的信號(hào)，且還可以獲得血清化學(xué)作用的結(jié)果。研究設(shè)計(jì)顯示于下表7中表7A/J研究設(shè)計(jì)

A/J小鼠為獲自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，Maine)的8-10周齡的雌性小鼠。在-80℃儲(chǔ)存分離的病毒粒子直至使用，備用SVV。在冰上解凍新近制備SVV并用HBSS稀釋(Hank′s平衡鹽溶液)。對(duì)于組2將SVV稀釋到107粒子/mL的濃度，對(duì)于組3為1010粒子/mL，對(duì)于組4為1013粒子/mL。HBSS用作組1的介質(zhì)對(duì)照。所有劑量給藥的溶液維持在潤濕的冰上直至用于配制。
通過尾部靜脈將SVV以10mL/kg體重的劑量體積靜脈注射施用于動(dòng)物。在給藥當(dāng)天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重并根據(jù)體重調(diào)整劑量體積(即，0.0200kg小鼠使用0.200mL的劑量給藥溶液)。每天兩次監(jiān)控小鼠的發(fā)病率和死亡率。每周稱重小鼠兩次。立即記錄垂死動(dòng)物和顯示出任意異常病癥(身體上或行為上)的動(dòng)物的信息。
完成的觀察和測定需要在處死時(shí)收集所有存活動(dòng)物的血液用于標(biāo)準(zhǔn)的血液學(xué)和血清化學(xué)作用(AST，ALT，BUN，CK，LDH)。在處死時(shí)收集下列器官腦，心臟，肺，腎，肝和生殖腺。將每一器官樣品的一半在干冰上快速冷凍且將另一半置于福爾馬林中。
SVV注射兩周后獲得最初的血液結(jié)果(CBC，微分)且結(jié)果概括在下表8中。將來自每一試驗(yàn)組的5只小鼠用于試驗(yàn)(參見表7)表8A/J毒性結(jié)果-血液學(xué)


這些結(jié)果表明獲自用低的、中和高劑量的SVV處理的小鼠的分布圖與獲自未處理小鼠的血液學(xué)分布圖比較沒有異常。由這些研究，其可斷定SVV系統(tǒng)性給藥之后沒有可檢測的毒性信號(hào)，此表明SVV被i.v注射的A/J小鼠耐受。
實(shí)施例11效力在效力研究中使用購自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)的6-7周齡的無胸腺雌性裸鼠(nu/nu)。利用人工保定將5×106H446細(xì)胞皮下注射到小鼠右側(cè)。定期測定腫瘤大小，并利用公式π/6x W x L2計(jì)算體積，其中L＝腫瘤的長度且W＝腫瘤的寬度。當(dāng)腫瘤達(dá)到約100-150mm3時(shí)，將小鼠(n＝10)隨機(jī)分組。將逐步升高劑量的SVV以10mL/kg體重的劑量體積尾部靜脈注射施用于小鼠。用等體積的HBSS注射小鼠的對(duì)照組。劑量由每公斤體重1×107增加到1×1013粒子。通過每周兩次測定SVV給藥后的腫瘤體積測定抗癌效力。完全應(yīng)答定義為異種移植物的完全消失；部分應(yīng)答為腫瘤體積的衰退等于或大于50％；且無應(yīng)答為腫瘤如在對(duì)照組中一樣繼續(xù)生長。
來自HBSS處理小鼠的腫瘤迅速生長且腫瘤體積在第20天達(dá)到超過2000mm3(圖51；參見具有空心菱形的線)。相比之下，進(jìn)行一次系統(tǒng)注射所有試驗(yàn)劑量的小鼠(除最低劑量外)在第20天變成無腫瘤的。在最低劑量組中，在第31天，有8個(gè)小鼠變成無腫瘤的，一個(gè)小鼠具有非常大的腫瘤且其它的具有小的可觸知的腫瘤(25mm3)。為評(píng)價(jià)SVV對(duì)大腫瘤的抗癌活性，在第20天用單劑量的1×1011vp/kg系統(tǒng)性注射來自具有腫瘤＞2000mm3的HBSS組的五只小鼠。在后續(xù)檢查(SVV注射后第11天)期間，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積急劇減小(圖51)。
圖52顯示了用SVV“未處理的”(即，用HBSS處理)或用SVV“處理”的小鼠照片。如可觀察到的，未處理的小鼠具有非常大的腫瘤且處理的小鼠沒有顯示可見的腫瘤信號(hào)。此外，對(duì)于用SVV處理的未處死的小鼠，在200天的研究期間沒有觀察到腫瘤再生長。
SVV對(duì)于特異性腫瘤細(xì)胞系的體外效力數(shù)據(jù)顯示于表1和5中。該數(shù)據(jù)表明SVV特異性感染特定的腫瘤細(xì)胞類型且不感染正常的成年細(xì)胞，優(yōu)于任意其它腫瘤消解病毒的顯著的優(yōu)點(diǎn)。SVV已顯示具有比化療高1,000倍的細(xì)胞殺傷特異性(SVV的細(xì)胞殺傷特異性值已被證明大于10,000，而化療的細(xì)胞殺傷特異性值在10左右)。
在H446人SCLC細(xì)胞中證明了SVV的特異性細(xì)胞毒性活性。用增加濃度的SVV溫育兩天后，測定細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示于圖53中。圖53顯示了SVV用H446SCLC腫瘤細(xì)胞(上圖)或正常人H460細(xì)胞(下圖)溫育后的細(xì)胞存活。SVV特異性殺死腫瘤細(xì)胞，具有約10-3粒子每細(xì)胞的EC50。相反，正常人細(xì)胞不會(huì)被任意濃度的SVV殺死。此外，如表1-3所概括的，SVV對(duì)大量的其它腫瘤細(xì)胞系也具有細(xì)胞毒性，包括SCLC-多重耐受性腫瘤細(xì)胞。對(duì)于其它腫瘤細(xì)胞系的SVV細(xì)胞毒性的EC50值為10-3到大于每細(xì)胞20,000粒子的范圍。SVV對(duì)其它非-神經(jīng)腫瘤和正常人組織是無細(xì)胞毒性的。另外，SVV對(duì)初級(jí)人肝細(xì)胞是無細(xì)胞毒性的，如通過LDH以每細(xì)胞釋放高達(dá)1000粒子所測定的(參見圖48)。
實(shí)施例12對(duì)嚙齒動(dòng)物進(jìn)行的生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)研究通過正常小鼠和具有H446 SCLC腫瘤的無免疫應(yīng)答無胸腺裸鼠進(jìn)行SVV的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布研究。此研究評(píng)價(jià)了單一靜脈注射給藥后，正常和無免疫應(yīng)答的有腫瘤小鼠的SVV的生物分布，消除和保留時(shí)間。小鼠組各接受單i.v劑量的對(duì)照緩沖液或三個(gè)劑量(108，1010或1012vp/kg)的SVV之一且監(jiān)控臨床指標(biāo)。給藥1，6，24和48小時(shí)后以及給藥后第1，2，4，和12周由5個(gè)小鼠的組獲取血樣。劑量水平包括已知低有效劑量和兩個(gè)高劑量水平來測定病毒消除的線性關(guān)系。給藥后24小時(shí)和2，4和12周處死小鼠組。選擇的組織，包括肝，心臟，肺，脾臟，腎，淋巴結(jié)，骨髓，大腦和脊髓組織被無菌收集并利用有效的RT-PCR試驗(yàn)用于檢驗(yàn)SVV RNA的存在。
在處死時(shí)，給藥后24小時(shí)和第2，4以及12周獲得尿液和糞便的樣品并檢查感染性病毒的存在。此實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)顯示于下表9中
表9CD-1小鼠和具有SCLC腫瘤的無胸腺裸鼠的SVV的生物學(xué)分布

通過正常小鼠和具有H446SCLC腫瘤的無免疫應(yīng)答無胸腺裸鼠進(jìn)行急性的i.v.毒理學(xué)研究。對(duì)正常和SCLC腫瘤小鼠進(jìn)行的初步i.v.研究表明SVV劑量的安全性高達(dá)1014vp/kg。沒有觀察不利的臨床指標(biāo)且單一i.v.劑量的1014vp/kg后直至2周沒有體重減輕。
實(shí)施例13對(duì)正常成年和懷孕小鼠進(jìn)行的病毒擴(kuò)散研究此實(shí)施例的目的是測定在未感染的正常小鼠與用高濃度SVV注射的小鼠共處之后SVV是否感染小鼠。因?yàn)镾VV在正常的，無腫瘤小鼠中不復(fù)制，腫瘤小鼠還可以用高濃度SVV注射且隨后暴露于正常的，健康的動(dòng)物來較好的模擬臨床方案。第二個(gè)目的是評(píng)價(jià)SVV由感染的雌性感染至未感染懷孕的DAM且隨后感染發(fā)育的胎兒的傳染可能性。
將三組五只天然雌雄CD-1小鼠暴露于用108，1010或1012vp/kg感染的同性單個(gè)小鼠，并且通過血樣監(jiān)控SVV的存在。
類似地，將暴露SVV的雌性與大量懷孕的雌性混合，并且測定病毒由感染的雌性傳遞給未感染的懷孕雌性，以及隨后傳遞給發(fā)育的胎兒的能力。
實(shí)施例14非-人的靈長類動(dòng)物研究同樣也測定SVV在非-人靈長類中的安全性，毒性和毒物動(dòng)力學(xué)。在一個(gè)劑量范圍確定階段，單個(gè)猴接受108vp/kg的單i.v.劑量的SVV并且密切監(jiān)控感染或毒性的臨床指標(biāo)。如果這個(gè)劑量被較好的耐受，其它的動(dòng)物用高i.v.劑量處理直至獲得1012vp/kg的劑量。隨后，主要的研究包括三個(gè)雌性和雄性猴的組，并且每只猴被每周用單獨(dú)載體或三個(gè)SVV劑量之一給藥一次持續(xù)六周時(shí)間并監(jiān)控毒性的信號(hào)。每一性別的其它兩只猴用單獨(dú)載體給藥以及用高劑量水平的SVV給藥持續(xù)六周時(shí)間，并且允許在處死之前另外恢復(fù)4周時(shí)間。
在第1周和第6周過程中給藥后獲取血樣。在首次給藥以及在處死之前獲得臨床病理學(xué)和血液學(xué)血樣。在每次給藥之后獲得另外的血樣用于評(píng)價(jià)對(duì)SVV的中和抗體的存在。
對(duì)存活的猴實(shí)施安樂死，用于完全尸體解剖并由主要研究收集完全組織列表以及回收猴。評(píng)價(jià)對(duì)照和高劑量組的組織的組織病理學(xué)。在第1周和第6周給藥后收集尿液和糞便樣品并用于評(píng)價(jià)感染性SVV的存在。此實(shí)施例的總體設(shè)計(jì)顯示于下表10中。
表10靈長類中SVV的多劑量毒理學(xué)研究

*劑量可根據(jù)劑量范圍確定階段的結(jié)果的變化而變化實(shí)施例15全長和功能性基因組SVV質(zhì)粒的構(gòu)建迄今為止，僅僅SVV的約1.5-2Kb的5′基因組序列被測序，代表包括5′UTR，1A(VP4)和1B(VP2)的一部分的核苷酸區(qū)域。由ATCC保藏號(hào)PTA-5343的分離SVV制備其它的SVV cDNAs。SVV粒子感染允許的細(xì)胞系，諸如PER.C6中，以及分離病毒。然后由病毒粒子回收病毒RNA使得由此制備cDNA拷貝。對(duì)單獨(dú)的cDNA克隆測序，使得選擇的cDNA克隆在具有SVV序列5′末端的T7啟動(dòng)子上游的質(zhì)粒中合成為一個(gè)全長克隆。通過利用T7聚合酶和體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)由此質(zhì)粒得到的全長SVV逆轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生全長RNA(參見圖55)。全長RNA轉(zhuǎn)染到允許的細(xì)胞系中來試驗(yàn)全長克隆的感染性(參見圖55)。
操作如下。RNA分離利用硫氰酸胍和利用Trizol(Invitrogen)的苯酚提取法提取SVV基因組RNA。簡而言之，將250μl的純化SVV與3體積Trizol和240μl氯仿混合。用600異丙醇沉淀含有RNA的水相。用70％乙醇沖洗RNA沉淀兩次，干燥并溶于DEPC-處理的水中。通過在260nm測定光密度來評(píng)價(jià)提取的RNA的量。溶解等分的RNA進(jìn)行1.25％變性瓊脂糖凝膠(Cambrex Bio Sciences Rockland，，ME USA)電泳并通過溴化乙錠染色對(duì)條帶進(jìn)行觀察并照相。
cDNA合成通過RT-PCR合成SVV基因組的cDNA。在標(biāo)準(zhǔn)條件下利用1μg的RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)14-聚體或寡-dT進(jìn)行cDNA的合成。擴(kuò)增cDNA片段，克隆到質(zhì)粒中并對(duì)克隆進(jìn)行測序。可能更廣泛測定對(duì)于基因組的5′極末端的測序是必需的。
全長基因組的克隆一旦序列已知，則常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)能夠構(gòu)建T7聚合酶啟動(dòng)子的SVV下游的全長克隆(例如，參見圖54)。
SVV的回收具有SVV全長基因組的質(zhì)粒按照標(biāo)準(zhǔn)的方案逆-轉(zhuǎn)錄。病毒RNA(100ng)用于轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞，細(xì)胞系已知是允許用于天然SVV的，但是用于病毒RNA轉(zhuǎn)染的最有效的細(xì)胞系可憑經(jīng)驗(yàn)在各種細(xì)胞系中確定。
實(shí)施例16RGD展示SVV文庫的構(gòu)建為了發(fā)現(xiàn)用編碼隨機(jī)肽序列的寡核苷酸隨機(jī)產(chǎn)生的SVV衣殼突變構(gòu)建體的最佳插入位點(diǎn)，采用了簡單的模式系統(tǒng)(RGD)。RGD(精氨酸，甘氨酸，天冬氨酸)是結(jié)合于整合素的短肽配體。成功的RGD-SVV衍生物應(yīng)該包含下列特性(1)遺傳插入不應(yīng)該改變?nèi)我坏腟VV的獨(dú)特的和理想的特性；以及(2)成功的RGD衍生物病毒應(yīng)該具有對(duì)含有aVb5整聯(lián)蛋白的細(xì)胞的趨性。
剛好含有鄰近的衣殼區(qū)域的SVV質(zhì)粒將在任意位置被單獨(dú)地裂解且短模式肽序列，稱為RGD，將在各位置被插入。病毒SVV-RGD文庫將利用圖56和57中描述的常規(guī)技術(shù)由這些質(zhì)粒文庫來構(gòu)建。
實(shí)施cRGD寡核苷酸隨機(jī)插入到衣殼區(qū)域中。簡言之，構(gòu)建質(zhì)粒使其剛好編碼SVV的鄰近的2.1Kb的衣殼區(qū)域(參見圖56，“pSVVcapsid”)。如下所述通過利用CviJI或核酸內(nèi)切酶V法在pSVVcapsid中部分降解質(zhì)粒來產(chǎn)生單一的隨機(jī)裂解(參見圖57)。分離單個(gè)的裂解質(zhì)粒后，RGD寡核苷酸將被插入來產(chǎn)生pSVV衣殼-RGD文庫。
限制性酶CviJI具有優(yōu)于其它隨機(jī)裂解法的若干優(yōu)點(diǎn)諸如超聲處理或剪切。首先，CviJI是鈍末端剪切，不需要修復(fù)。其次，CviJI已被證明在隨機(jī)位置裂解因此不會(huì)出現(xiàn)熱點(diǎn)。該方法同樣是簡單和快速的。簡而言之，CviJI的濃度和/或降解的時(shí)間是日益降低的直至大多數(shù)裂解的DNA是線性化質(zhì)粒，即單一裂解的。這些可如圖57描述的通過標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳觀察到。然后分離條帶，純化以及與RGD寡核苷酸連接。
可利用的隨機(jī)裂解DNA的另一方法是核酸內(nèi)切酶V法(Kiyazaki，K.，Nucleic Acids Res.，2002，30(24)e139)。
核酸內(nèi)切酶V在尿嘧啶位點(diǎn)的第二或第三磷酸二酯鍵3′裂解含尿嘧啶的DNA。此方法同樣預(yù)期隨機(jī)裂解DNA，通過調(diào)整聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的dUTP濃度很容易測定其頻率。盡管切割位點(diǎn)總是胸腺嘧啶(由尿嘧啶替換)位點(diǎn)下游的兩個(gè)或三個(gè)堿基，此方法被預(yù)期產(chǎn)生比其它方法少的多熱和冷點(diǎn)。
將隨機(jī)線性化質(zhì)粒與cRGD寡核苷酸連接。然后擴(kuò)增生成的pSVV衣殼文庫，因此可純化具有隨機(jī)插入的cRGD區(qū)域并編碼衣殼區(qū)域的多核苷酸群體(參見圖57和58)。然后將衣殼多核苷酸的群體亞克隆到含有全長SVV序列減去衣殼區(qū)域的載體中，由此產(chǎn)生全長SVV序列的文庫(其中文庫顯示衣殼區(qū)域中的序列多樣性，因?yàn)閏RGD序列是隨機(jī)插入的)。然后將這些文庫逆轉(zhuǎn)錄到RNA中，且將RNA轉(zhuǎn)染允許的細(xì)胞系中來產(chǎn)生具有不同衣殼的SVV粒子的群體(參見圖59)。一旦回收到這些病毒粒子的RGD-SVV群(″RGD-SVV文庫″)，將隨機(jī)挑選大量的病毒(即，10或更多)來證實(shí)RGD序列的插入以及插入位點(diǎn)的多樣性。
RGD-展示SVV文庫的體外選擇。篩選SVV-RGD文庫來測定哪些插入位點(diǎn)能夠擴(kuò)大SVV的趨性。RGD-SVV文庫被允許感染αvβ5整聯(lián)蛋白-表達(dá)NSCLC系(非-小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，即，A549表達(dá)αvβ5)。僅僅含有功能性和正確展示RGD基序的這些SVV衍生物可感染這些細(xì)胞并復(fù)制。
通過能夠液體處理的高通量自動(dòng)系統(tǒng)(TECAN)進(jìn)行體外篩選，共同溫育20個(gè)細(xì)胞系并在384-孔板中進(jìn)行測定(參見圖62和圖63)。感染30小時(shí)后當(dāng)觀察到完全CPE時(shí)收獲細(xì)胞然后通過在4℃以1500rpm離心10分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀然后再懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中并用于三個(gè)循環(huán)的冷凍和解凍。通過在4℃以1500rpm離心10分鐘來澄清產(chǎn)生的懸浮液。通過兩輪CsCl梯度純化病毒一步梯度(CsCl密度1.24g/ml和1.4g/ml)然后時(shí)一個(gè)連續(xù)梯度離心(CsCl密度1.33g/ml)。分光光度滴定測定純化的病毒濃度，假定1A260＝9.5×1012粒子(Scraba，D.G.和Palmenberg，A.C.，1999)?？芍貜?fù)該過程多次直至由αvβ5細(xì)胞回收到足夠量的病毒。
對(duì)所回收的RGD-SVV衍生物的分析。分析少量的單獨(dú)的RGD-展示SVV衍生物(約10-50個(gè)不同的衍生物)。稀釋病毒混合物并擴(kuò)大單個(gè)的病毒粒子用于分析。試驗(yàn)各衍生物來測定是否它們已經(jīng)獲得有效和特異性感染-表達(dá)αvβ5的細(xì)胞的能力。然后對(duì)具有這些特性的各衍生物的衣殼區(qū)域進(jìn)行測序來測定RGD插入的位點(diǎn)?；厥盏膃RGD-展示SVV衍生物應(yīng)該具有下列特性(1)病毒的原始特性仍然是完整的；和(2)衍生物已經(jīng)獲得感染高水平表達(dá)結(jié)合于RGD的整聯(lián)蛋白的細(xì)胞的能力。此方法目的是用RGD插入鑒定一或多個(gè)能夠擴(kuò)大趨性的位點(diǎn)，使得隨機(jī)寡核苷酸可插入到這些位點(diǎn)來產(chǎn)生改變趨性的SVV衍生物。
對(duì)測序的cRGD SVV衍生物進(jìn)行編號(hào)并通過它們與整聯(lián)蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行排序。為測定結(jié)合活性，將重組的β2整聯(lián)蛋白固定在PBS中的96-孔滴定板上，用PBS沖洗兩次，用3％BSA的PBS溶液封閉，然后用獨(dú)特的RGD-展示病毒溫育。沒有肽插入的天然病毒用作陰性對(duì)照。溫育1-5小時(shí)后，用PBS沖洗孔至少三次。然后，由抗-SVV抗體檢測結(jié)合于板的病毒。RGD肽或抗整聯(lián)蛋白的抗體將能夠與RGD-SVV衍生物和結(jié)合板的整聯(lián)蛋白的結(jié)合競爭。
分析強(qiáng)烈結(jié)合于整聯(lián)蛋白的cRGD-SVV衍生物(20)來測定cRGD寡核苷酸插入“成功的”位點(diǎn)。插入位點(diǎn)提供了對(duì)SVV趨性的觀察。根據(jù)對(duì)插入位點(diǎn)及其它已知結(jié)構(gòu)的分析，可測定放置隨機(jī)肽文庫的理想位點(diǎn)(此方法為任選的用于產(chǎn)生SVV衍生物的方法，其中寡核苷酸(已知序列或隨機(jī)序列)被插入到衣殼中的隨機(jī)位點(diǎn))。按照如上所述的用于RGD-SVV文庫的大體上相同的方法構(gòu)建用隨機(jī)序列寡核苷酸產(chǎn)生的SVV衍生物，除此之外，還有兩個(gè)其它的新方法。為了避免在目的編碼區(qū)內(nèi)不必要的終止密碼子和有害的氨基酸插入(例如半胱氨酸或脯氨酸)，可利用Morphosys(Munich，Germany)發(fā)展的TRIM(三核苷酸-致突變)來產(chǎn)生用于衣殼插入的隨機(jī)寡核苷酸。TRIM利用僅僅編碼目的位置氨基酸的三-核苷酸(Virnekas，B等，Nucleic Acids Res，1994，22(25)5600-5607)。具有108種多樣性的隨機(jī)-肽展示SVV被認(rèn)為是足夠的且預(yù)期產(chǎn)生特異性將病毒導(dǎo)向靶腫瘤組織的肽。如上所述體外測定隨機(jī)-肽展示SVV，或利用患有腫瘤的小鼠體內(nèi)測定。
權(quán)利要求
1.分離的核酸，包括與SEQ ID NOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者這些序列任一個(gè)中的至少20個(gè)核苷酸長的相鄰部分具有至少95％的序列同一性的核酸序列。
2.在高嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的核酸雜交的分離的核酸。
3.在中等嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的核酸雜交的分離的核酸。
4.在低嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的核酸雜交的分離的核酸。
5.載體，包括與SEQ ID Nos 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者這些序列任一個(gè)中的至少20個(gè)核苷酸長的相鄰部分具有至少95％的序列同一性的核酸序列。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中核酸是RNA或者DNA。
7.分離的多肽，由與包括SEQ ID Nos 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或者這些序列任一個(gè)中的至少10個(gè)核苷酸長的相鄰部分的核酸序列具有至少95％的序列同一性的核酸編碼。
8.分離的多肽，包括與SEQ ID Nos 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或者這些序列任一個(gè)中的至少10個(gè)氨基酸長的相鄰部分具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
9.分離的抗體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求8的多肽或者權(quán)利要求11的分離的病毒。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中的抗體是多克隆抗體，單克隆抗體或者嵌合抗體。
11.分離的Seneca Valley病毒或者其衍生物，包括ATCC專利保藏號(hào)PTA-5343的鑒定特性。
12.分離的Seneca Valley病毒或者其衍生物或者相關(guān)物，具有包括與SEQ ID NO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的基因組。
13.分離的Seneca Valley病毒或者其衍生物或者相關(guān)物，包括下列特性約7.5kb的單鏈RNA基因組；～27nm的直徑；包括具有約31kDa，約36kDa以及約27kDa的分子量的至少3種蛋白的衣殼；CsCl梯度上大約1.34g/ml的浮力密度；以及在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力。
14.分離的Seneca Valley病毒或者其衍生物或者相關(guān)物，包括下列特性在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力，腫瘤-細(xì)胞趨性，以及在正常細(xì)胞中不能消解細(xì)胞。
15.權(quán)利要求12或者13的病毒，其中所述病毒在具有神經(jīng)內(nèi)分泌特性的腫瘤細(xì)胞類型中是有復(fù)制能力的。
16.權(quán)利要求12的病毒，其中31kDa蛋白包含與SEQ ID NO8具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求12的病毒，其中36kDa蛋白包含與SEQ ID NO4具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求12的病毒，其中27kDa蛋白包含與SEQ ID NO6具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的氨基酸序列。
19.藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒以及藥用載體。
20.細(xì)胞，包含權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒。
21.病毒裂解物，包含權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒的抗原。
22.分離的病毒抗原，獲自權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒。
23.用于治療癌癥的方法，包括施用有效量的病毒或者其衍生物，以便治療癌癥，其中病毒具有包含與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21有至少95％同一性的序列的基因組序列。
24.用于治療癌癥的方法，包括施用有效量的病毒，所述病毒具有包含與SEQ ID NO3，5或者7有至少95％同一性的序列的編碼衣殼的區(qū)域。
25.用于抑制癌癥發(fā)展的方法，包括將癌細(xì)胞與病毒或者其衍生物接觸，其中病毒具有包含與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21有至少95％同一性的序列的基因組。
26.用于殺傷癌細(xì)胞的方法，包括將癌細(xì)胞與有效量的病毒或者其衍生物接觸，其中病毒具有包含與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19或者21有至少95％同一性的序列的基因組。
27.權(quán)利要求23，24，25或者26的方法，其中的病毒是微小RNA病毒。
28.權(quán)利要求27的方法，其中的微小RNA病毒是心臟病毒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中心臟病毒選自vilyuisk人腦脊髓炎病毒，Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒，腦心肌炎病毒以及Seneca Valley病毒。
30.權(quán)利要求29的方法，其中腦心肌炎病毒選自如下的分離物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695，以及NC-88-23626。
31.權(quán)利要求29的方法，其中的Seneca Valley病毒的ATCC保藏號(hào)為PTA-5343。
32.純化權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒的方法，包括a.用權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒感染細(xì)胞；b.收獲細(xì)胞裂解物；c.將細(xì)胞裂解物進(jìn)行至少一輪梯度離心；以及d.從所述梯度分離所述病毒。
33.殺傷異常增殖細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒接觸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中異常增殖細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中的腫瘤細(xì)胞選自人小細(xì)胞肺癌，人成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，人成神經(jīng)細(xì)胞瘤，人成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤，維耳姆斯瘤以及人非小細(xì)胞肺癌。
36.治療受試者腫瘤病癥的方法，包括給受試者施用有效量的權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒。
37.權(quán)利要求36的方法，其中的腫瘤病癥是神經(jīng)內(nèi)分泌癌癥。
38.權(quán)利要求36的方法，其中的受試者為人類。
39.產(chǎn)生權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒的方法，包括在允許病毒復(fù)制以及由細(xì)胞或者上清液回收病毒的條件下溫育用權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒感染的細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的方法，其中的細(xì)胞是PER.C6細(xì)胞。
41.權(quán)利要求39的方法，其中的細(xì)胞是H446細(xì)胞。
42.權(quán)利要求39的方法，其中的細(xì)胞產(chǎn)生每細(xì)胞超過200,000個(gè)病毒粒子。
43.檢測權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒的方法，包括從懷疑含有權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的病毒的試驗(yàn)材料分離RNA；標(biāo)記對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的至少15個(gè)相鄰核苷酸的RNA；用標(biāo)記的RNA探測試驗(yàn)材料；以及檢測標(biāo)記的RNA與分離自試驗(yàn)材料的RNA的結(jié)合，由此結(jié)合顯示病毒的存在。
44.核酸探針，包括對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的至少15個(gè)相鄰核苷酸的核苷酸序列。
45.制備腫瘤消解病毒的方法，該方法包括(a)將Seneca Valley病毒基因組序列與所試驗(yàn)的病毒基因組序列進(jìn)行比較；(b)鑒定由Seneca Valley病毒基因組序列編碼的多肽與由試驗(yàn)的病毒基因組序列編碼的多肽之間至少第一個(gè)氨基酸的差異；(c)使試驗(yàn)的病毒基因組序列突變，以便由試驗(yàn)的病毒基因組序列編碼的多肽與由Seneca Valley病毒基因組序列編碼的多肽具有至少一個(gè)氨基酸的差異；(d)將突變的試驗(yàn)病毒基因組序列轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中；以及(e)確定腫瘤細(xì)胞是否由突變的試驗(yàn)病毒基因組序列消解性感染。
46.權(quán)利要求45的方法，其中Seneca Valley病毒基因組包括與SEQ ID NO1具有至少95％同一性的序列。
47.權(quán)利要求45的方法，其中的試驗(yàn)病毒是微小RNA病毒。
48.權(quán)利要求45的方法，其中的試驗(yàn)病毒是心臟病毒。
49.權(quán)利要求45的方法，其中的氨基酸差異是在Seneca Valley病毒衣殼蛋白和試驗(yàn)的病毒衣殼蛋白之間。
50.權(quán)利要求45的方法，其中使試驗(yàn)的病毒基因組序列突變包括使具有試驗(yàn)的病毒基因組序列的cDNA突變。
51.權(quán)利要求51的方法，其中轉(zhuǎn)染突變的試驗(yàn)病毒基因組序列包括轉(zhuǎn)染RNA，其中RNA由具有突變的試驗(yàn)病毒基因組序列的cDNA產(chǎn)生。
52.權(quán)利要求48的方法，其中心臟病毒基因組序列選自vilyuisk人腦脊髓炎腦病毒，Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒和腦心肌炎病毒。
53.權(quán)利要求52的方法，其中的心臟病毒基因組序列選自腦心肌炎病毒。
54.權(quán)利要求53的方法，其中的腦心肌炎病毒選自如下的分離物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695，以及NC-88-23626。
55.權(quán)利要求52方法，其中的心臟病毒選自其基因組包括與SEQID NO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的分離物。
56.權(quán)利要求45方法，其中氨基酸差異是在包含如下序列的多肽的范圍內(nèi)與SEQ ID NO4，6，8或者這些序列任一個(gè)中的至少10個(gè)氨基酸長的相鄰部分具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％的同一性的序列。
57.制備改變細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的方法，所述方法包括(a)產(chǎn)生包括大量核酸序列的病毒突變體的文庫；(b)將病毒突變體文庫轉(zhuǎn)染到允許的細(xì)胞中，由此產(chǎn)生大量突變體病毒；(c)分離大量的突變體病毒；(d)用分離的大量突變體病毒溫育不允許的細(xì)胞；以及(e)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒，由此制備改變趨性的突變體病毒。
58.權(quán)利要求57的方法，其中的病毒突變體文庫由包括與SEQ IDNO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的親本序列產(chǎn)生。
59.權(quán)利要求57的方法，進(jìn)一步包括(f)在不允許的細(xì)胞中溫育回收的突變體病毒；以及(g)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒。
60.權(quán)利要求59的方法，更進(jìn)一步包括反復(fù)重復(fù)步驟(f)和(g)。
61.權(quán)利要求57或者59的方法，其中的溫育是在多孔高通量平臺(tái)中進(jìn)行的，其中的平臺(tái)在每一孔中包括不同類型的不允許的細(xì)胞。
62.權(quán)利要求61的方法，更進(jìn)一步包括以篩選平臺(tái)鑒定哪些孔含有殺傷細(xì)胞的突變體病毒。
63.權(quán)利要求62的方法，其中通過分析每一孔中的吸光度進(jìn)行篩選。
64.權(quán)利要求57的方法，其中的不允許的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
65.權(quán)利要求57的方法，其中產(chǎn)生病毒突變體的文庫包括(i)提供具有與病毒的部分基因組序列相同序列的多核苷酸；(ii)使多核苷酸突變以便產(chǎn)生大量的不同的突變體多核苷酸序列；以及(iii)將大量的突變的多核苷酸連接到具有除了步驟(i)所含的那部分病毒基因組序列外的病毒基因組序列的載體中，由此產(chǎn)生病毒突變體文庫。
66.權(quán)利要求65的方法，其中病毒的基因組序列來自于微小RNA病毒。
67.權(quán)利要求65的方法，其中病毒的基因組序列包括與SEQ IDNO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列。
68.權(quán)利要求66的方法，其中的微小RNA病毒是心臟病毒。
69.權(quán)利要求68的方法，其中的心臟病毒選自vilyuisk人腦脊髓炎病毒，Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒，腦心肌炎病毒以及SVV。
70.權(quán)利要求69的方法，其中的腦心肌炎病毒選自如下的分離物CA-131395，LA-97-1278，IL-92-48963，IA-89-47752，NJ-90-10324，MN-88-36695，以及NC-88-23626。
71.權(quán)利要求57的方法，其中步驟(ii)的突變是通過將核苷酸隨機(jī)插入多核苷酸中進(jìn)行的。
72.權(quán)利要求57的方法，其中步驟(ii)的突變是在多核苷酸的編碼衣殼的區(qū)域中進(jìn)行的。
73.權(quán)利要求71的方法，其中核苷酸的隨機(jī)插入是由三核苷酸-致突變(TRIM)進(jìn)行的。
74.權(quán)利要求71的方法，其中至少一部分插入多核苷酸的核苷酸編碼附加表位。
75.制備改變細(xì)胞類型趨性的突變體心臟病毒的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生心臟病毒的突變體多核苷酸序列文庫，其中該產(chǎn)生包括-提供編碼心臟病毒衣殼區(qū)域的多核苷酸；-使多核苷酸突變以便產(chǎn)生大量的不同突變體編碼衣殼的多核苷酸序列；以及-將大量突變的編碼衣殼的多核苷酸連接到具有除了編碼衣殼的區(qū)域之外的心臟病毒的基因組序列的載體中，由此產(chǎn)生心臟病毒的突變體多核苷酸序列文庫；(b)將突變體多核苷酸序列的文庫轉(zhuǎn)染到允許的細(xì)胞中，由此產(chǎn)生大量的突變體病毒；(c)分離大量的突變體病毒；(d)用分離的大量突變體病毒溫育不允許的細(xì)胞；以及(e)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒，由此制備改變趨性的突變體心臟病毒。
76.權(quán)利要求75的方法，更進(jìn)一步包括(f)在不允許的細(xì)胞中溫育回收的突變體病毒；以及(g)回收在不允許的細(xì)胞中產(chǎn)生的突變體病毒。
77.權(quán)利要求76的方法，更進(jìn)一步包括反復(fù)重復(fù)步驟(f)和(g)。
78.權(quán)利要求75方法，其中的心臟病毒具有包括與SEQ ID NO1有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或者65％同一性的序列的基因組。
79.權(quán)利要求75的方法，其中的突變是通過將核苷酸隨機(jī)插入編碼衣殼的多核苷酸中進(jìn)行的。
80.權(quán)利要求80的方法，其中至少一部分隨機(jī)插入編碼衣殼的多核苷酸的核苷酸編碼附加表位。
81.權(quán)利要求80的方法，其中核苷酸的隨機(jī)插入是由三核苷酸-致突變(TRIM)進(jìn)行的。
82.權(quán)利要求75的方法，其中大量的不同突變體編碼衣殼的多核苷酸序列包括大于108個(gè)不同的編碼衣殼的多核苷酸序列。
83.權(quán)利要求75的方法，大量的不同突變體編碼衣殼的多核苷酸序列包括大于109個(gè)不同的編碼衣殼的多核苷酸序列。
84.制備改變腫瘤細(xì)胞類型趨性的突變體Seneca Valley病毒的方法，所述方法包括(a)產(chǎn)生Seneca Valley病毒突變體的cDNA文庫；(b)由Seneca Valley病毒突變體的cDNA文庫產(chǎn)生Seneca Valley病毒RNA；(c)將Seneca Valley病毒RNA轉(zhuǎn)染到允許的細(xì)胞中，由此產(chǎn)生大量突變體Seneca Valley病毒；(d)分離大量的突變體Seneca Valley病毒；(e)用分離的大量突變體Seneca Valley病毒溫育不允許的腫瘤細(xì)胞；以及(f)回收消解性感染不允許的腫瘤細(xì)胞的突變體Seneca Valley病毒，由此制備改變趨性的突變體Seneca Valley病毒。
85.權(quán)利要求84的方法，更進(jìn)一步包括(g)在不允許的細(xì)胞中溫育回收的突變體Seneca Valley病毒；以及(h)回收消解性感染不允許的腫瘤細(xì)胞的突變體Seneca Valley病毒。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，進(jìn)一步包括反復(fù)重復(fù)步驟(g)和(h)。
87.權(quán)利要求85的方法，其中在多-孔高通量平臺(tái)中進(jìn)行溫育，其中該平臺(tái)在每一孔中包括不同類型的不允許的腫瘤細(xì)胞。
88.權(quán)利要求87的方法，進(jìn)一步包括篩選平臺(tái)來鑒定哪些孔含有消解性感染細(xì)胞的突變體Seneca Valley病毒。
89.權(quán)利要求的88方法，其中通過分析每一孔中的吸光度進(jìn)行篩選。
90.權(quán)利要求84的方法，其中Seneca Valley病毒突變體的cDNA文庫包括大量突變體Seneca Valley病毒衣殼多核苷酸序列。
91.權(quán)利要求90的方法，其中大量的突變體Seneca Valley病毒衣殼多核苷酸序列通過將核苷酸隨機(jī)插入包括如下序列的編碼衣殼的區(qū)域中產(chǎn)生與SEQ ID NO3，5或7具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或65％的序列同一性的序列。
92.權(quán)利要求91的方法，其中至少部分隨機(jī)插入的核苷酸序列編碼附加表位。
93.權(quán)利要求91的方法，其中核苷酸的隨機(jī)插入由三核苷酸-致突變(TRIM)進(jìn)行。
94.權(quán)利要求84的方法，其中Seneca Valley病毒突變體的cDNA文庫由ATCC保藏號(hào)PTA-5343的Seneca Valley病毒或具有包括與SEQID NO1具有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％或65％同一性的序列的基因組的病毒產(chǎn)生。
95.權(quán)利要求84的方法，其中不允許的腫瘤細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞-系或分離自患者的腫瘤細(xì)胞類型。
96.權(quán)利要求95的方法，其中不允許的腫瘤細(xì)胞系選自M059K，KK，U118MG，DMS79，H69，DMS114，DMS53，H460，A375-S2，SK-MEL-28，PC3，PC3M2AC6，LNCaP，DU145，Hep3B，Hep2G，SW620，SW839，5637，HeLaS3，S8，HUVEC，HAEC，W138，MRC-5，IMR90，HMVEC，HCN-1A，HRCE，CMT-64，LLC-1，RM-1，RM-2，RM-9，MLTC-1，KLN-205，CMT-93，B16F0，Neuro-2A，C8D30，PK15，F(xiàn)BRC，MDBK，CSL503和OFRC。
97.權(quán)利要求95的方法，其中分離自患者的不允許的腫瘤細(xì)胞類型選自如下的腫瘤成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，淋巴瘤，小細(xì)胞肺癌，大細(xì)胞肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，肝癌，結(jié)腸癌，腎癌，結(jié)腸癌，膀胱癌，直腸癌和鱗狀上皮細(xì)胞肺癌。
98.制備具有體內(nèi)腫瘤細(xì)胞類型趨性的突變體病毒的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生包括大量核酸序列的病毒突變體的文庫；(b)將病毒突變體的文庫轉(zhuǎn)染到允許細(xì)胞中，由此產(chǎn)生大量的突變體病毒；(c)分離大量的突變體病毒；(d)給患有腫瘤的哺乳動(dòng)物施用分離的大量突變體病毒，其中的哺乳動(dòng)物不是突變體病毒未突變形式的天然寄主；以及(e)回收在腫瘤中復(fù)制的病毒，由此制備具有體內(nèi)腫瘤細(xì)胞類型趨性的突變體病毒。
99.權(quán)利要求98的方法，其中產(chǎn)生病毒突變體的文庫包括-提供編碼病毒衣殼區(qū)域的多核苷酸；-使多核苷酸突變以便產(chǎn)生大量的不同的突變體編碼衣殼的多核苷酸序列；以及-將大量的突變編碼衣殼的多核苷酸連接到具有除了編碼衣殼的區(qū)域之外的病毒的基因組序列的載體中，由此產(chǎn)生病毒突變體的文庫。
100.權(quán)利要求98的方法，其中步驟(e)中回收的病毒消解性感染腫瘤的細(xì)胞。
101.權(quán)利要求98的方法，其中的腫瘤是異種移植，同種基因的腫瘤，同位腫瘤或轉(zhuǎn)基因腫瘤。
102.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中的哺乳動(dòng)物是小鼠。
103.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中的病毒突變體是微小RNA病毒。
104.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中的微小RNA病毒是心臟病毒。
105.權(quán)利要求104的方法，其中的微小RNA病毒是Seneca Valley病毒或其相關(guān)物或者衍生物。
106.權(quán)利要求109的方法，其中Seneca Valley病毒是ATCC保藏號(hào)為PTA-5343的Seneca Valley病毒或其基因組序列包括與SEQ IDNO1有至少95％同一性的序列。
107.由權(quán)利要求45，57，75，84或98的方法制備的腫瘤消解病毒。
108.用腫瘤消解病毒治療患者的方法，該方法包括(a)滅活權(quán)利要求107的腫瘤消解病毒，使得腫瘤消解病毒不具感染性并且腫瘤消解病毒的趨性不受影響；以及(b)給腫瘤患者施用滅活的腫瘤消解病毒。
109.權(quán)利要求108的方法，進(jìn)一步包括將毒素與滅活的腫瘤消解病毒連接。
110.用Seneca Valley病毒治療腫瘤患者的方法，該方法包括(a)滅活Seneca Valley病毒，使得該病毒不具感染性并且該病毒的趨性不受影響；以及(b)給腫瘤患者施用滅活的Seneca Valley病毒。
111.權(quán)利要求110的方法，進(jìn)一步包括將毒素與滅活的SenecaValley病毒連接。
112.包括滅活的Seneca Valley病毒的Seneca Valley病毒組合物。
113.Seneca Valley病毒，含有整合到衣殼區(qū)域的附加表位。
114.用Seneca Valley病毒治療腫瘤受試者的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生含有在衣殼中編碼的附加表位的突變體Seneca Valley病毒；(b)將毒素與附加表位連接；以及(c)給患有腫瘤的受試者施用具有連接的毒素的突變體SenecaValley病毒。
115.權(quán)利要求114的方法，其中該產(chǎn)生含有-將編碼附加表位的寡核苷酸插入Seneca Valley病毒的編碼衣殼的區(qū)域的多核苷酸中。
116.權(quán)利要求115的方法，其中突變體Seneca Valley病毒與ATCC保藏號(hào)PTA-5343的Seneca Valley病毒相比不具有改變的細(xì)胞類型趨性。
117.權(quán)利要求116的方法，進(jìn)一步包括滅活突變體Seneca Valley病毒，使突變體Seneca Valley病毒不具感染性。
118.檢測樣品中腫瘤細(xì)胞的方法，包括(a)由患者分離腫瘤樣品；(b)用附加表位的Seneca Valley病毒溫育腫瘤樣品；以及(c)通過檢測附加表位篩選結(jié)合Seneca Valley病毒的腫瘤樣品。
119.體內(nèi)檢測腫瘤細(xì)胞的方法，包括(a)給患者施用接受輻射的附加表位的Seneca Valley病毒，其中標(biāo)記與附加表位結(jié)合；以及(b)檢測患者體內(nèi)的標(biāo)記。
120.權(quán)利要求118或119的方法，其中的Seneca Valley病毒是突變體，衍生物或相關(guān)物。
121.用SVV治療癌癥的方法，包括(a)制備包含缺失包裝信號(hào)序列的SVV突變體；以及(b)用SVV突變體感染腫瘤細(xì)胞，由此通過SVV-介導(dǎo)的宿主細(xì)胞關(guān)閉引起腫瘤細(xì)胞的死亡。
全文摘要
本發(fā)明涉及稱作Seneca Valley病毒(“SVV”)的新的微小RNA病毒。本發(fā)明提供了分離的SVV核酸以及由這些核酸編碼的蛋白。此外，本發(fā)明提供了抗SVV蛋白的抗體。因?yàn)镾VV具有選擇性殺死某些類型腫瘤的能力，本發(fā)明提供了利用SVV以及SVV多肽治療癌癥的方法。因?yàn)镾VV特異性靶向特定的腫瘤，本發(fā)明提供了利用SVV核酸以及蛋白檢測癌癥的方法。另外，由于SVV的腫瘤特異性機(jī)制提供的信息，本發(fā)明提供了制備新的腫瘤消解病毒衍生物以及改變病毒使其具有腫瘤特異性趨性的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1875028SQ200480030443
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2004年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者保羅·L·哈倫貝克, 卡爾·M·哈伊, 尚西·加內(nèi)什, 塞希達(dá)·雷迪·波利斯, 徐玲, 楊敬平, 程誠 申請(qǐng)人:諾瓦帝斯公司