專利名稱：BACE455,人β－分泌酶的可變剪接變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)、生物化學(xué)、藥物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明更尤其公開了參與神經(jīng)病理學(xué)病癥的人基因變體的鑒定，和用于所述疾病和相關(guān)病癥的診斷、預(yù)防和治療以及用于治療活性藥物篩選的方法。本發(fā)明涉及催化活性的β-分泌酶(Memapsin2，BACE)變體，和編碼其的核酸。本發(fā)明可用于鑒定抑制特定BACE異構(gòu)型的活性的試劑和影響神經(jīng)病理學(xué)病癥，包括阿爾茨海默氏病和癡呆的發(fā)生、發(fā)展或進(jìn)展的試劑和療法。
背景技術(shù)：
目前廣泛認(rèn)為遺傳多樣性的產(chǎn)生中可變RNA剪接的重要性為編碼超過一種mRNA轉(zhuǎn)錄本的單基因的最重要途徑中的一種(連同可變啟動(dòng)子和可變聚腺苷酸化的應(yīng)用)。產(chǎn)生于可變剪接的前mRNA或mRNA異構(gòu)型在穩(wěn)定性、翻譯能力或編碼的蛋白質(zhì)序列方面可能不同，每方面都可改變所編碼蛋白質(zhì)的功能。
這可在凋亡領(lǐng)域得到最好的例證(Jiang和Wu，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.22064-72(1999))?？勺兗艚拥母淖?，尤其是標(biāo)準(zhǔn)序列在內(nèi)含子/外顯子交界處的突變可能引起影響基因表達(dá)并且產(chǎn)生疾病的異常剪接模式。最近Cooper等(1998)表明至少10％的人遺傳疾病與產(chǎn)生RNA剪接缺陷的突變有關(guān)；參見例如，Cooper等.，Nucleic AcidsRes.26285-287(1998)。
在諸如癌癥、神經(jīng)變性病癥、炎癥/哮喘和其他新陳代謝病的廣泛病狀中觀察到共有剪接信號(hào)中的散發(fā)性突變。RNA剪接缺陷可包括外顯子遺漏(exon skipping)、內(nèi)含子保留和由于隱匿剪接位點(diǎn)的利用或新剪接共有序列的產(chǎn)生的新剪接事件(Lopez，Annu.Rev.Genet.32279-305(1998))。細(xì)胞剪接因子活性、水平或氨基酸序列的改變可影響剪接的效率或可變剪接的調(diào)控。例如，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(SMN)核苷酸序列中單核苷酸的存在調(diào)控該基因的剪接，并且引起脊髓性肌萎縮(Lorson等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，966307-6311(1999))。取自患有散發(fā)性阿爾茨海默氏病的病人的人腦中，包括a)由ps1基因的外顯子9缺失引起的蛋白質(zhì)早老素-1(PS1)氨基酸序列的改變，b)編碼早老素2(ps2基因)基因的外顯子5缺失，和c)(在散發(fā)性額顳癡呆的病例中)ps2基因外顯子5的異常剪接的剪接事件參與神經(jīng)病理病變(Isoe-Wada.等，Eur J Neurol，6，163-167(1999)；Sato等.J.Biol.Chem.2762108-2114(1991))。
阿爾茨海默氏病(AD)為腦中淀粉樣蛋白斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)的大量生成、神經(jīng)膠質(zhì)增生和神經(jīng)元損失的破壞退行性病癥(Hardy等.Nat.Neurosci 1355-358(1998)；Selkoe，D.J.InAlzheimer disease，Ed 2(Terry，R.D.，Katzman，R.，Bick，K.，Sisodia，S.S.，eds)，pp 293-310.PhiladelphiaLippincott Williams和Wilkins(1999))。大多數(shù)患部為皮層、海馬、腦下腳、海馬回和扁桃體。AD病人具有增進(jìn)的記憶損失、智力功能和技能、人格改變和精神分裂癥的問題。AD為老年人癡呆的主要原因并且沒有用于該神經(jīng)變性的有效的減輕或預(yù)防療法。
一些遺傳和后天因素已被認(rèn)為是產(chǎn)生AD的機(jī)制；其包括遺傳易感性、感染物、毒素、金屬、頭部損傷和血管癡呆。通常認(rèn)為，負(fù)責(zé)淀粉樣前體蛋白(APP)蛋白酶解加工的胞內(nèi)途徑的調(diào)節(jié)障礙導(dǎo)致稱為A-β1-42肽--A-β肽的一種形式形成的增加，所述A-β1-42肽尤其為致淀粉樣的，目前看來其是AD病理生理病變的關(guān)鍵(Selkoe，Neuron32177-180(2001))。
該A-β肽也為腦血管淀粉樣沉積物的主要蛋白質(zhì)組分。淀粉樣蛋白是以β-折疊排列的絲狀物質(zhì)。該A-β肽為包含高達(dá)43個(gè)氨基酸的疏水肽。已表明A-β肽以許多方式對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，包括通過活性氧(ROS)的誘導(dǎo)、改變的基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)，其引起對興奮毒性敏感性的增強(qiáng)，和其他通常與神經(jīng)變性病變相關(guān)的過程((Ramsden等.，J.Neurochem.79699-712(2001)；Shukla等.，J.Cell.Path.5241-249(2002)；Green和Peers，Neurochem.77953-956(2001)；Kowall等.，Neurobiol.Aging 13537-542(1992)；MacManus等.，J.Biol.Chem.2754713-4718(2000))。APP、早老素1和2(分別為PS1和PS2)中的突變大大改變了APP的加工，導(dǎo)致A-β1-42形成的增加。還在最多活至30歲的患有唐氏綜合癥的高齡病人中檢測到淀粉樣蛋白斑。唐氏綜合征中觀察到的APP表達(dá)的上調(diào)可能為唐氏綜合征病人中AD發(fā)展的病因(Rumble等.，N.Engl.J.Med.3201446-52(1989)；Mann，Neurobiol.Aging 10397-399(1989))。淀粉樣蛋白斑也存在于自然老化的腦中，雖然數(shù)量較少(Vickers等.，Exp.Neurol.1411-11(1996))。
目前已知人APP的不同構(gòu)型大小范圍為695-770個(gè)氨基酸，定位于細(xì)胞表面，并且具有單個(gè)C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域。已鑒定許多APPcDNA，包括三個(gè)最高豐度的構(gòu)型，由Kang等.(1987)Nature 325733-736描述的APP695，其被指定為″正常的″APP；由Tanzi等.(1988)Nature331528-530描述的751個(gè)氨基酸多肽(APP751)；和由Kitaguchi等.(1988)Nature 331530-532描述的770個(gè)氨基酸多肽(APP770)。這些構(gòu)型由單一前體RNA經(jīng)可變剪接產(chǎn)生。與APP三個(gè)剪接變體的每一個(gè)共同的A-β肽源自鄰近于并且包含一部分跨膜結(jié)構(gòu)域的APP區(qū)域。
三種不同的蛋白酶在體內(nèi)加工APP(Vassar和Citron，Neuron 27419-422(2000))。α-分泌酶裂解來自質(zhì)膜的腔(lumenal)表面的APP 12個(gè)氨基酸殘基；其不參與A-β的產(chǎn)生。通過APP經(jīng)β-分泌酶(BACE)，一種I型膜結(jié)合的天冬氨酰蛋白酶的裂解進(jìn)行Aβ產(chǎn)生的第一步。BACE裂解產(chǎn)生100-kD的可溶性胞外域構(gòu)型(sAPP)-突出細(xì)胞表面的APP部分-和12-kD包含Aβ多肽N末端的99個(gè)氨基酸的膜-關(guān)聯(lián)中間體肽(稱為C99)(Vassar等.，Science 286(5440)735-41(1999)。C99肽隨后經(jīng)蛋白酶γ-分泌酶加工而產(chǎn)生大小或末端修飾的多種Aβ多肽(40-42和43個(gè)氨基酸殘基為體內(nèi)最常發(fā)現(xiàn)的多肽)(綜述，參見Selkoe等.，Nature 399(6738Suppl)A23-31(1999)；Tekirian，J.Alzheimers.Dis.3(2)241-248.(2001))。緊鄰β分泌酶切割位點(diǎn)的APP序列為EVKM*DAE。
這些殘基在標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶命名中標(biāo)記為P4-P3-P2-P1*P1’-P2’-P3’，P1和P1’之間的切割位點(diǎn)經(jīng)*標(biāo)記。該區(qū)域中的突變，例如KM至NL的突變(稱作Swedish突變)，可將APP轉(zhuǎn)化為BACE更優(yōu)選的底物。因此，APP中氨基酸序列的改變，其導(dǎo)致經(jīng)BACE增進(jìn)的APP裂解，增加了阿爾茨海默氏病發(fā)展的可能性(Citron等.，Nature 360(6405)672-674(1992))。實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示APP加工是順序進(jìn)行的并且APP經(jīng)β-分泌酶的裂解為γ-分泌酶-介導(dǎo)的APP加工的前提。APP跨膜區(qū)經(jīng)γ-分泌酶的裂解產(chǎn)生40/42-殘基的Aβ肽，其在腦中產(chǎn)量和累積的增加是阿爾茨海默氏病發(fā)病的關(guān)鍵事件(Selkoe，.Nature 39923-31(1999))。此外，現(xiàn)在已經(jīng)清楚BACE可在γ-分泌酶后再次切割A(yù)β肽40-42而產(chǎn)生神經(jīng)毒性的Aβ34肽，消耗Aβ40-42(Fluhrer等.，J.Biol.Chem.278(8)5531-5538(2003))。
現(xiàn)有的許多AD治療策略集中于γ-分泌酶的抑制。然而，目前看來這種策略對于治療或預(yù)防AD未必足夠，或甚至合理。例如，目前清楚需要BACE而非γ-分泌酶裂解而產(chǎn)生，包括完整的Aβ多肽，并且當(dāng)在培養(yǎng)的細(xì)胞中評(píng)估時(shí)是神經(jīng)毒性的C99多肽本身還在AD腦中累積(Tekirian，J.Alzheimers.Dis.3(2)241-248.(2001))。此外，已表明γ-分泌酶抑制劑嚴(yán)重影響免疫系統(tǒng)并且導(dǎo)致C末端APP片段的累積，其自身是有毒的。此外，γ-分泌酶的抑制可能改變各種重要蛋白質(zhì)的加工(Doerfler，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9312-9317(2001)，Ni等.，Science 2942179-2181(2001)，Marambaud，等.，EMBO J 211948-1956(2002)，Kim，等.，J.Biol.Chem.277499976-499981(2002))。雖然子宮內(nèi)BACE活性的缺乏可避免致死，早老素1和2基因的雙-基因敲除(knock-out)證實(shí)確實(shí)如此(Herreman，等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611872-11877(1999))。該毒性主要是參與細(xì)胞-至-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的Notch信號(hào)途徑抑制的結(jié)果。實(shí)際上，Notch受體及其鋸齒狀同源配體以及Delta為已知的早老素的底物(DeStrooper，等.Nature 398518-522(1999))，并且由于Notch和其配體的裂解引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中活性蛋白水解片段的釋放(LaVoie和Selkoe，J.Biol.Chem.278(36)34427-34437(2003))。
相反，APP多肽β-分泌酶位點(diǎn)的體內(nèi)加工認(rèn)為是Aβ多肽產(chǎn)生的限速步驟(Sinha，S.&Lieberburg，Proc Natl Acad Sci USA.96(20)11049-53(1999)；Vassar，Adv.Drug Deliv.Rev.54(12)1589-1602(2002))。BACE似乎不參與其他生理學(xué)重要蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(Cai等.，Nat.Neurosci 4233-234(2001)；Luo等.，Nat.Neurosci 4231-232(2001))。因此，BACE似乎可作為最強(qiáng)的治療靶標(biāo)用于降低或抑制Aβ的產(chǎn)生。
BACE作為非活性的前酶合成。在分泌途徑中的成熟期間，BACE在4N-連接位點(diǎn)的3處糖基化并且與其前肽結(jié)構(gòu)域經(jīng)蛋白酶的原蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換酶家族的成員分離。此外，BACE還在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸殘基處進(jìn)行棕櫚?；⑶以谄銫末端進(jìn)行磷酸化。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中核糖基化后，BACE在靶向至核內(nèi)體系統(tǒng)之前快速而有效地運(yùn)輸至高爾基體(Fluhrer，R.等；J Biol Chem.278(8)5531-5538(2003))。
迄今為止，已分離了BACE的三種異構(gòu)型BACE476、BACE457和BACE432。所有這些異構(gòu)型是通過該基因外顯子3區(qū)域的選擇性利用而框內(nèi)缺失產(chǎn)生的，并且即使有的話，所有都表現(xiàn)出比BACE501更低的APP加工活性(Bodendorf，等.，J.Biol.Chem.276(15)12019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res.Mol.Brain Res.115(1)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci.Lett.307(1)9-12(2001))。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及有關(guān)人β-分泌酶(BACE)新異構(gòu)型鑒定的組合物和方法，其通過患有神經(jīng)病理學(xué)病癥的病人的腦組織選擇性地表達(dá)(例如，人AD腦)，其具有催化活性并且其在藥理學(xué)方面不同于現(xiàn)有的其他有活性的天然BACE異構(gòu)型BACE501。這種BACE的新的神經(jīng)病理學(xué)-特異性異構(gòu)型，稱為BACE455，已發(fā)現(xiàn)是因外顯子4的缺失以及存在于外顯子3和外顯子5接合處的新核苷酸和對應(yīng)的氨基酸序列的開發(fā)而產(chǎn)生。
在已公開的天然BACE晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可以預(yù)料本發(fā)明的新的異構(gòu)型BACE455具有和BACE類似的三維結(jié)構(gòu)，該蛋白酶活性部位內(nèi)的2個(gè)天冬氨酸殘基仍然彼此相對。然而，BACE455的活性部位更加敞開并且易于接近而因此相比天然的BACE分子可能產(chǎn)生顯著提高的Aβ多肽水平。此外，BACE455缺乏負(fù)責(zé)BACE的失活和天然分子中活性調(diào)控的內(nèi)部蛋白水解位點(diǎn)。因此，相比BACE和其他已知的BACE異構(gòu)型，BACE455缺乏翻譯后調(diào)控，具有改變的三維結(jié)構(gòu)，并且很可能產(chǎn)生提高水平的病理性Aβ肽。BACE455在抑制分布圖上明顯不同于BACE501。這可通過利用得到很好描述的抑制劑展現(xiàn)。因此，當(dāng)與其他已知的活性BACE異構(gòu)型相比時(shí)，BACE455中外顯子4的缺失產(chǎn)生了顯著的藥理學(xué)差異。
假設(shè)所觀察到的這種異構(gòu)型的使之與天然BACE區(qū)分開的功能和藥理學(xué)性質(zhì)可能促進(jìn)和選擇性地驅(qū)動(dòng)哺乳動(dòng)物，尤其是人受試者的病理性病癥。
分離的BACE455及其區(qū)別型的片段和對應(yīng)的核酸可用于與BACE455有關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)病癥的診斷和用于藥物，尤其是BACE455抑制劑的篩選，其在神經(jīng)型失調(diào)，尤其是包括神經(jīng)退行性失調(diào)和癡呆的神經(jīng)病理學(xué)病癥，更優(yōu)選目前已知的涉及Aβ生成或累積的病癥例如阿爾茨海默氏病和相關(guān)病癥的治療中具有治療活性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供了用于神經(jīng)病理學(xué)病癥治療的方法，包括將BACE455轉(zhuǎn)錄、翻譯或活性的抑制劑施用于受感染的組織。
″神經(jīng)病理學(xué)病癥″指一種或多種病癥，包括但不限于，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(ALS)、唐氏綜合征、帕金森綜合癥、多發(fā)性硬化、彌漫的大腦皮層萎縮癥、雷維小體(Lewy-body)癡呆、皮克病(Pickdisease)、中腦皮質(zhì)邊緣(mesolimbocortical)癡呆、丘腦退化、延髓麻痹、亨廷頓舞蹈病(Huntington chorea)、皮層-紋狀體-脊髓退化、皮層-基底神經(jīng)節(jié)退化、大腦小腦退化、伴隨痙攣下肢輕癱的家族性癡呆、葡聚糖小體病、香-德綜合征(Shy-Drager syndrome)、橄欖體腦橋小腦萎縮、進(jìn)行性核上麻痹、變形性肌張力障礙、哈斯二氏疾病(Hallervorden-Spatzdisease)、Meige綜合癥、家族性震顫、痙攣性抽搐(Gilles De LaTourettte)綜合癥、棘紅細(xì)胞舞蹈病、Friedreich共濟(jì)失調(diào)、Holmes家族性皮層小腦萎縮、AIDS相關(guān)的癡呆、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、進(jìn)行性脊髓性肌萎縮、進(jìn)行性延髓麻痹、黃斑病和視網(wǎng)膜變性，例如非-滲出性老化相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、滲出性老化相關(guān)性黃斑變性、原生性脊髓側(cè)索硬化、遺傳性肌肉萎縮、痙攣性截癱、腓骨肌肉萎縮、肥大間隙的多發(fā)性神經(jīng)病、多神經(jīng)炎型遺傳性運(yùn)動(dòng)失調(diào)、眼神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、阿爾茨海默氏病和眼肌麻痹。眼病癥的實(shí)例包括但不限于，青光眼，包括開角青光眼、高眼壓、黃斑病和視網(wǎng)膜變性，例如非-滲出性老化相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、滲出性老化相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、脈絡(luò)膜的新血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病、中樞性嚴(yán)重脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病、黃斑囊樣水腫、糖尿病斑點(diǎn)浮腫、近視視網(wǎng)膜變性、炎癥性疾病，例如急性多點(diǎn)板狀色素上皮病變、貝切特氏病、Birdshot視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病、傳染病(梅毒、Lyme、肺結(jié)核、弓形體病)、中間葡萄膜炎(ParsPlanitis)、多點(diǎn)脈絡(luò)膜炎、多個(gè)易消失性白點(diǎn)綜合癥(MEWDS)、眼結(jié)節(jié)病、后鞏膜炎、匐行脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜下纖維化和葡萄膜炎綜合癥、Vogt-Koyanagi-Harada綜合癥、點(diǎn)狀內(nèi)脈絡(luò)膜病、急性后部多點(diǎn)板狀色素上皮病變、急性視網(wǎng)膜色素上皮炎、急性斑點(diǎn)視神經(jīng)網(wǎng)膜??；血管和滲出性疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、中樞性視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞性疾病、中樞性視網(wǎng)膜靜脈閉塞、散發(fā)性血管內(nèi)凝血病、分枝視網(wǎng)膜靜脈閉塞、高血壓基底轉(zhuǎn)變、眼缺血性綜合癥、視網(wǎng)膜動(dòng)脈小動(dòng)脈瘤、Coat氏病、近窩區(qū)毛細(xì)血管擴(kuò)張、半視網(wǎng)膜靜脈閉塞、Papillophlebitis、中樞性視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞、分枝視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞、頸動(dòng)脈病(CAD)、凍傷分枝脈管炎、鐮狀細(xì)胞視網(wǎng)膜病及其他血紅蛋白病、血管樣紋、家族性滲出性Vitreoretinopathy、Eales病、外傷性的、外科手術(shù)的和環(huán)境性的病癥，例如交感性眼炎、眼色素層炎視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜脫離、創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜激光、光動(dòng)力療法、光致凝結(jié)、手術(shù)期間的灌注不足、放射療法視網(wǎng)膜病、骨髓移植視網(wǎng)膜??；增生性病癥，例如增生性玻璃體視網(wǎng)膜病和外視網(wǎng)膜；傳染性病癥，例如眼組織胞漿菌病、眼弓蛔蟲病、眼組織胞漿菌病綜合癥(POHS)、眼內(nèi)炎、弓形體病、與H1V感染有關(guān)的視網(wǎng)膜疾病、與HIV感染有關(guān)的脈絡(luò)膜病、與HIV感染有關(guān)的眼色素層炎病、病毒視網(wǎng)膜炎、急性視網(wǎng)膜壞死、進(jìn)行性外視網(wǎng)膜壞死、真菌視網(wǎng)膜疾病、眼梅毒、眼結(jié)核、彌漫性的單側(cè)近尖的視神經(jīng)網(wǎng)膜炎、蠅蛆?。贿z傳病癥，例如色素性視網(wǎng)膜炎、與視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良有關(guān)的全身性病癥、先天靜止夜盲、圓錐體營養(yǎng)不良、Stargardt病和基底Flavimaculatus、Best病、視網(wǎng)膜色素上皮的模式營養(yǎng)不良、X-關(guān)聯(lián)的視網(wǎng)膜分裂、Sorsby基底營養(yǎng)不良、良性的同軸黃斑病、Bietti晶狀體營養(yǎng)不良、彈力纖維性假黃瘤；視網(wǎng)膜損傷，例如斑點(diǎn)孔、巨大視網(wǎng)膜裂孔；視網(wǎng)膜腫瘤，例如與腫瘤有關(guān)的視網(wǎng)膜病、RPE的先天肥大、后眼色素層黑色素瘤、脈絡(luò)膜血管瘤、脈絡(luò)膜骨瘤、脈絡(luò)膜轉(zhuǎn)移、視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮的組合型錯(cuò)構(gòu)瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、眼底的血管增生性腫瘤、視網(wǎng)膜星形細(xì)胞瘤和眼內(nèi)淋巴瘤。
″分離的″指分子存在于和通常未經(jīng)人的介入而天然存在的環(huán)境不同的環(huán)境中。因此，例如″分離的BACE455″包括細(xì)胞裂解物中所含的天然-產(chǎn)生的BACE455、純化或部分純化的BACE455、重組的BACE455以及存在于異源宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中的BACE455，例如來自任何生物體(包括，不限于，人、大鼠、猴或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌或真菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)的組織培養(yǎng)細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，描述了參與BACE455蛋白質(zhì)活性選擇性抑制的方法。所述方法可治療性地用于抑制神經(jīng)病理學(xué)病癥的發(fā)展，所述病癥例如不限于，阿爾茨海默氏病、其他的癡呆、青光眼、帕金森氏癥、ALS和中風(fēng)的結(jié)果。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼BACE455的BACE455mRNA或其特有片段、BACE455蛋白質(zhì)，或BACE455蛋白質(zhì)的任一特有片段在篩選抑制Aβ肽產(chǎn)生的分子中的應(yīng)用。
優(yōu)選本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的片段包括至少含有10個(gè)連續(xù)氨基酸序列的氨基酸，更優(yōu)選至少含有9個(gè)連續(xù)氨基酸序列的氨基酸，更加優(yōu)選至少含有8個(gè)連續(xù)氨基酸序列的氨基酸，更加優(yōu)選至少含有7個(gè)連續(xù)氨基酸序列的氨基酸，更加優(yōu)選至少含有6個(gè)連續(xù)氨基酸序列的氨基酸，更加優(yōu)選至少含有5個(gè)連續(xù)氨基酸序列的氨基酸。
優(yōu)選本發(fā)明的核酸或多核苷酸的片段包括至少含有30個(gè)連續(xù)核苷酸序列的核苷酸，更優(yōu)選至少含有27個(gè)連續(xù)核苷酸序列的核苷酸，更加優(yōu)選至少含有24個(gè)連續(xù)核苷酸序列的核苷酸，更加優(yōu)選至少含有21個(gè)連續(xù)核苷酸序列的核苷酸，更加優(yōu)選至少含有18個(gè)連續(xù)核苷酸序列的核苷酸，更加優(yōu)選至少含有15個(gè)連續(xù)核苷酸序列的核苷酸。
″特有的″當(dāng)用于描述編碼BACE455蛋白質(zhì)或其片段的核酸時(shí)，指所述核酸的核苷酸序列包括非常接近源自BACE455DNA序列外顯子5的至少一個(gè)密碼子的源自外顯子3的至少一個(gè)密碼子，其編碼具有由所述核酸或片段編碼的相同氨基酸序列的一種蛋白質(zhì)或其片段，或者與所述核苷酸序列精確互補(bǔ)。在具體的實(shí)施方案中，特有的核酸包括含有存在于BACE455外顯子3和外顯子5接合處的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
″特有的″當(dāng)用于描述BACE455蛋白質(zhì)或其片段時(shí)，指包含由編碼BACE455蛋白質(zhì)或其片段的特有核酸編碼的氨基酸序列的肽、多肽或蛋白質(zhì)。
利用市售的軟件程序和有機(jī)化學(xué)和酶學(xué)領(lǐng)域熟知的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用BACE455蛋白質(zhì)、其特有的片段和編碼這些分子的核酸設(shè)計(jì)新的BACE455抑制劑。所述抑制劑可用于阿爾茨海默氏病及其他神經(jīng)病理學(xué)病癥的診斷和治療和/或預(yù)防。用于制備BACE455抑制劑的方法可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如不限于，組合的和其他化學(xué)文庫、化學(xué)文庫的高通量篩選中分離的BACE455蛋白質(zhì)或其特有片段的使用、利用基于構(gòu)效關(guān)系的藥物化學(xué)技術(shù)的合理藥物設(shè)計(jì)等等。本發(fā)明的多肽可用于常規(guī)的低容量篩選法以及高-通量篩選(HTS)形式中。所述HTS形式包括例如，96-和384-孔微量滴定板(參見Bennett，等.，J.Mol.Recognition，852-58(1995)；和Johanson，等.，J.Biol.Chem.，270(16)9459-9471(1995))?？捎糜谥苽銪ACE抑制劑的例證性方法已在WO9967221、WO9967220、WO9967219、WO9966934、WO9932453、WO9838177、WO9828268、WO9822494、WO9822493、WO9822441、WO9822433和WO9822430中公開。用于制備化合物組合文庫的方法在參考文獻(xiàn)例如Turner等.，Biochemestry 4010001-10006(2001)或Gruninger-Leicht等.，J.Biol.Chem.2774687-4693(2002)中公開。
BACE455抑制劑可選自小分子抑制劑、肽、反義寡核苷酸、iRNA和封閉抗體。因此，BACE455的抑制包括抑制BACE455轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯和/或體內(nèi)活性的試劑的使用。
本發(fā)明優(yōu)選，而不僅僅涉及相比其他已知的BACE異構(gòu)型，對BACE455的抑制選擇性地表現(xiàn)出2倍，或5倍，或10倍，或30倍，或100倍，或1000倍，或＞1000倍選擇能力的BACE455抑制劑。相比缺乏上述選擇能力，或優(yōu)選抑制天然的BACE而不是BACE455的化合物，所述抑制劑具有改善的效用。對抑制BACE455具有2倍、5倍、10倍或更大選擇能力的選擇性BACE455抑制劑擁有許多益處，包括對抑制病理性疾病發(fā)展的更大效力、由于非-病理性Aβ產(chǎn)生的更低抑制帶來的降低的副作用，和由于上述化合物提高的選擇能力帶來的改進(jìn)的安全性。
BACE455蛋白質(zhì)、核酸、這些分子的特有片段和BACE455抑制劑可用于神經(jīng)病理學(xué)病癥的診斷目的。特異性結(jié)合BACE455多肽或核酸，或其特有片段的化合物可幫助鑒定易于發(fā)生AD的個(gè)體。另外，可使用具有治療效果的BACE455抑制劑治療和/或預(yù)防阿爾茨海默氏病和與Aβ40或42肽升高的水平和淀粉樣蛋白斑肽的累積相關(guān)的病癥，以及其他神經(jīng)病理學(xué)病癥。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，新的外顯子4的缺失和新的外顯子3和5的接合可用于診斷和/或評(píng)估神經(jīng)病理學(xué)病癥的目前的或可能的發(fā)展。例如，基于體外核酸和/或抗體測定法的發(fā)展，包括人組織或液體的定量測定，可以確定病人是否或傾向于患上涉及BACE455的產(chǎn)生和表達(dá)的神經(jīng)病理學(xué)病癥。上述測定法可包括不限于，通過例如Northern印跡、基于寡核苷酸接合陣列的核酸檢測；例如RT-PCR、定量PCR和連接-PCR及其他方法的核酸擴(kuò)增方法。這些方法可包括能選擇性地或特異地檢測包括新剪接點(diǎn)的分析物區(qū)域的寡核苷酸探針的使用。BACE455還可利用其特定配體，例如特異性識(shí)別包括新剪接點(diǎn)的BACE455區(qū)域的抗體而直接檢測，作為一個(gè)例子，該區(qū)域包括BACE455蛋白質(zhì)190至235的氨基酸殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)菌、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)基因的非-人動(dòng)物，其特異性表達(dá)BACE455異構(gòu)型或其特有片段，而不是天然的BACE501或其他異構(gòu)型。優(yōu)選的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括小鼠胚胎培養(yǎng)的NIH3T3系(Jainchill等.J.Virol.4549-553(1969))、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人胚腎細(xì)胞系293或成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞系(Biedler等.Cancer Res.383751-3757(1978))。例如，特異表達(dá)BACE455異構(gòu)型的細(xì)胞系可通過(a)將BACE455表達(dá)載體，例如舉例來說，具有克隆入表達(dá)盒的BACE455全長cDNA的pCDNA3載體轉(zhuǎn)染入目的細(xì)胞類型和(b)利用對應(yīng)于由該表達(dá)載體編碼的抗性基因的抗生素或選擇試劑選擇所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而獲得。用于產(chǎn)生含有穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的克隆細(xì)胞系的方法例如在Wigler等.(Cell 11223-232(1977))；Kriegler(Gene Transfer and Expression.Stockton Press，New York，New York(1990))或Gramer&Goochee(Biotechnol.Prog.9(4)366-73(1993))中公開?；蛘撸D(zhuǎn)染的細(xì)胞可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的測定法中以在無進(jìn)一步選擇時(shí)監(jiān)測BACE455的活性。如本領(lǐng)域所知的，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過利用分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知方法的重組技術(shù)獲得，其在上述參考文獻(xiàn)如Sambrook等.(Molecular Cloninga LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))中描述。
上述細(xì)胞系代表用于阻止Aβ加工的化合物的初步篩選工具，而非-人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將可用于研究Aβ依賴的癡呆的發(fā)展和用于鑒定體內(nèi)抑制Aβ依賴的疾病發(fā)展的化合物。
附圖簡述

圖1BACE455的核酸(A，SEQ ID NO1)和氨基酸(B，SEQID NO2)序列以及與BACE501氨基酸序列的比對。
圖2BACE455(A、C)和BACE501(B、D)在用表達(dá)BACE455或BACE501的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞中的免疫定位。A、B在Triton X100-滲透的細(xì)胞上的BACE異構(gòu)型利用多克隆的抗-hBACE(481-501)(C-三個(gè)胞內(nèi)抗原表位)的胞內(nèi)染色。C、D在Triton X100未滲透的細(xì)胞上BACE異構(gòu)型利用多克隆的抗-hBACE(46-65)(N-三個(gè)胞外的抗原表位)的胞外染色。顯微照相表明BACE455呈現(xiàn)與BACE501類似的胞內(nèi)定位，有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，其在此表現(xiàn)出與BACE501相當(dāng)?shù)陌饽っ庖叻磻?yīng)性。
圖3BACE455和BACE501在熒光生成的測定法中利用市售的BACE抑制劑III呈現(xiàn)出不同的抑制特點(diǎn)。顯示的結(jié)果為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中活性±SEM的百分比。
圖4BACE455對來自在用空載體(Mock，M)或用表達(dá)BACE455(B)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)的APP異構(gòu)型的C99片段產(chǎn)生的效果。MW分子量。
圖5從在用表達(dá)BACE455的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)的APP異構(gòu)型產(chǎn)生C99肽由布雷菲德菌素A(BFA)和Gleevec抑制。
發(fā)明詳述在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括BACE455多肽所有或特有片段的多肽。BACE455氨基酸序列在圖1中描述。術(shù)語″BACE455″或″BACE455多肽″指任何BACE多肽(優(yōu)選人來源的)，其包括編碼野生型BACE肽基因的外顯子4的所有或部分缺失。
BACE455多肽特有片段優(yōu)選的實(shí)例為包括氨基酸序列IARIIG(SEQ ID NO3)的那些片段。所述片段另外的實(shí)例為包括氨基酸序列EIARIIG(SEQ ID NO4)，通常選自EIARIIGG(SEQ ID NO5)、AEIARIIG(SEQ ID NO6)、AEIARIIGG(SEQ ID NO7)、AEIARIIGGI(SEQ ID NO8)、YAEIARIIG(SEQ ID NO9)、YAEIARIIGG(SEQID NO10)和YAEIARIIGGI(SEQ ID NO11)序列的多肽。最優(yōu)選的片段為至少6、7、8、9或10個(gè)氨基酸長度。
包括特有的BACE455多肽片段的本發(fā)明多肽可包括BACE455或其變體的完整氨基酸序列。在這里的術(shù)語″變體″指包括BACE455多肽特有片段以及進(jìn)一步包括相比圖1中所述序列，具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸突變、取代和/或插入的經(jīng)修飾氨基酸序列的任何多肽。通常，所述BACE455變體缺乏全部的外顯子4。優(yōu)選的變體為天然-存在的變體，即源于多態(tài)性、剪接等等的BACE多肽，其缺乏外顯子4。本發(fā)明最優(yōu)選的多肽為人來源的和/或保留圖1中BACE455特性的，尤其為至少BACE455-選擇性的免疫特性和/或β分泌酶活性。
所述多肽可選擇性地包括另外的殘基或官能團(tuán)，例如不限于，另外的氨基酸殘基、化學(xué)或生物基團(tuán)，包括標(biāo)記、標(biāo)簽、穩(wěn)定劑、靶部分、純化標(biāo)簽、分泌肽、功能性反應(yīng)基團(tuán)等等。所述另外的殘基或官能團(tuán)可以是化學(xué)衍生的，以融合蛋白的氨基酸序列區(qū)域添加的，復(fù)合的或共價(jià)或非共價(jià)附著的。其還可包含天然的或非天然的氨基酸。多肽可以是可溶性形式，或附著(或復(fù)合或嵌入)至支持物，例如基質(zhì)、柱、珠、膜、細(xì)胞、脂類或脂質(zhì)體等等。
本發(fā)明的某些多肽可如此用于促使體外或體內(nèi)Aβ肽的產(chǎn)生。其還可用于設(shè)計(jì)特異性試劑例如肽、抗體(和其衍生物)、拮抗劑、激動(dòng)劑等等，其特異性地檢測、結(jié)合或影響上述定義的BACE455多肽的表達(dá)或活性。多肽還可作為免疫原用于疫苗組合物中或者產(chǎn)生或檢測或定量特異性抗體。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有編碼如上定義的BACE455多肽，包括其特有片段的核苷酸序列的多核苷酸。該多核苷酸優(yōu)選編碼包括哺乳動(dòng)物memapsin 2(BACE)蛋白片段的多肽，其中所述多肽缺乏全部的外顯子4(由全長BACE蛋白的氨基酸190至235編碼)。所述多肽的代表性實(shí)例包括圖1中所述核苷酸序列(SEQ ID NO2)的全部或特有片段。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案還包括含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下選擇性地雜交至BACE455RNA特有片段(或其精確的互補(bǔ)物)的核苷酸序列的任何多核苷酸。更優(yōu)選，所述選擇性雜交的多核苷酸編碼具有β-分泌酶活性的多肽。嚴(yán)謹(jǐn)條件指，例如，雜交濾膜在2×SSC/1％SDS中約42℃溫育約2.5小時(shí)，隨后濾膜在1×SSC/0.1％SDS中65℃洗滌15分鐘4次。所用的方案在上述參考文獻(xiàn)如Sambrook等.(Molecular CloningaLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))中描述。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所編碼的BACE多肽包括人BACE蛋白的特有片段。
本發(fā)明的核酸、寡核苷酸和多核苷酸可以是DNA或RNA，例如基因組DNA、互補(bǔ)DNA、合成的DNA、mRNA或其類似物，包括例如，經(jīng)修飾的核苷酸如3′烷氧基核糖核苷酸、甲基膦酸酯之類的，以及肽核酸(PNA)等等。多核苷酸可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，利用本申請所含的序列信息而產(chǎn)生，例如通過化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄或通過重組DNA方法。尤其，多核苷酸可通過化學(xué)寡核苷酸合成、文庫篩選、擴(kuò)增、連接反應(yīng)、重組技術(shù)和其組合產(chǎn)生。
本發(fā)明特定的實(shí)施方案屬于編碼包括具有如SEQ ID NO2所述氨基酸序列的BACE特有片段多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可包括另外的核苷酸序列，例如調(diào)控區(qū)，即，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、終止子等等，其可用于促進(jìn)或調(diào)控BACE455多肽的表達(dá)。
本發(fā)明的多核苷酸可用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組多肽。其還可用于設(shè)計(jì)特異性試劑例如引物、探針或反義分子(包括反義RNA、iRNA、適體、核酶等等)，其特異性地檢測、結(jié)合或影響編碼如上所定義BACE455多肽的多核苷酸的表達(dá)。其還可用作治療分子(例如，作為工程病毒的一部分，例如不限于，基因治療方案中的工程腺病毒或腺病毒相關(guān)病毒載體)或用于產(chǎn)生重組細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的非-人動(dòng)物，其例如在對化合物文庫篩選用于調(diào)節(jié)BACE455活性的試劑中是有用的。
本發(fā)明的另外一方面為載體，例如包含如上定義的BACE455多核苷酸的表達(dá)或報(bào)告載體。所述載體可選自質(zhì)粒、重組病毒、噬菌體、游離基因、人工染色體等等。許多上述載體為市售的并且可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的重組技術(shù)產(chǎn)生，例如在如Sambrook等.，Molecular Cloning(2ded.Cold Spring Harbor Press 1989)的手冊中所述的方法，其在此處整體引入作為參考。
本發(fā)明的另外一方面為用如上定義的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是經(jīng)遺傳修飾的并且優(yōu)選培養(yǎng)過的任何細(xì)胞。細(xì)胞可以是真核的或原核的，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母、真菌、細(xì)菌細(xì)胞等等。代表性實(shí)例包括哺乳動(dòng)物原代或所建立的細(xì)胞(3T3、CHO、Vero、Hela等等)以及酵母細(xì)胞(例如，酵母屬、克盧費(fèi)氏酵母屬等等)和細(xì)菌(例如，大腸桿菌)?？衫斫獾氖潜景l(fā)明不限于任何具體的細(xì)胞類型，并且根據(jù)公知常識(shí)可應(yīng)用于各種細(xì)胞。
核酸探針本發(fā)明多核苷酸的特定類型為核酸探針，其在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下選擇性雜交至編碼BACE455多肽特有片段的核酸或其片段。如本領(lǐng)域所熟知的，″嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件″取決于探針的長度和所得的雜交物中鳥嘌呤-胞嘧啶對與胸腺嘧啶(尿嘧啶)-腺嘌呤對的比率。
本發(fā)明上下文中，″探針″指具有多核苷酸序列的核酸或寡核苷酸，其能與BACE455RNA(或精確互補(bǔ)的核苷酸序列)的特有片段選擇性雜交，并且其適于檢測包括所述RNA或互補(bǔ)體的任何樣品中BACE455RNA(或具有其精確互補(bǔ)核酸序列的核酸)的存在。探針優(yōu)選與BACE455RNA的特有片段完全互補(bǔ)。探針通常包括8至1400個(gè)核苷酸長度之間，例如10和1000之間，更優(yōu)選15和800之間，典型地為20和600之間的單鏈核酸。應(yīng)當(dāng)理解的是也可使用較長的探針。本發(fā)明優(yōu)選的探針為8至600個(gè)核苷酸長度之間的單鏈核酸分子，其可特異性地雜交至BACE455RNA的特有片段。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案為選擇針對缺乏外顯子4的BACE異構(gòu)型的核酸探針、選擇性雜交至所述異構(gòu)型基因或RNA并基本上不雜交至至少一種包含全長外顯子4的其他BACE異構(gòu)型的核酸探針以及與這些精確互補(bǔ)的核酸探針。
本發(fā)明進(jìn)一步特定的實(shí)施方案為選擇針對BACE455RNA的核酸探針，即選擇性雜交至所述BACE455基因或RNA并基本上不雜交至至少一種其他BACE異構(gòu)型的核酸探針，以及與這些精確互補(bǔ)的核酸。
選擇能力，當(dāng)用于指示核酸雜交時(shí)，表示探針能雜交至靶序列而基本上不雜交至至少一種其他的BACE-編碼核酸。
本發(fā)明優(yōu)選的探針包括與BACE455RNA(或其精確互補(bǔ)體)的特有片段互補(bǔ)的序列。上述探針的特定實(shí)例包括核酸序列ATTGCCAGGATCATTGGASEQ ID NO12探針的序列可源自本申請?zhí)峁┑腂ACE455RNA的序列。可以進(jìn)行核苷酸的取代以及探針的化學(xué)修飾。如上所公開的，所述化學(xué)修飾可以用于提高雜交物的穩(wěn)定性(例如，插入基團(tuán)或經(jīng)修飾的核苷酸，如2′烷氧基核糖核苷酸)或標(biāo)志探針。標(biāo)記物的代表性實(shí)例包括不限于，放射性、熒光、發(fā)光、酶促標(biāo)記物等等。探針可雜交至溶液、懸浮液中的，或附著于固相支持物，例如不限于，珠、柱、平板、基底(以產(chǎn)生核酸陣列或芯片)的靶核酸。
在一個(gè)實(shí)施例中，與BACE455RNA特有片段精確互補(bǔ)的15bpBACE455-選擇性寡核苷酸探針用化學(xué)發(fā)光化合物例如Weeks等.，Clin.Chem.291474-1478(1983)，和Nelson等.，美國專利5,658,737通常所述的吖啶(例如，4-(2-琥珀酰亞氨基氧化羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶9-甲酯氟磺酸酯)的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯標(biāo)記，兩者此處合并作為參考。連接臂的伯胺反應(yīng)雜交探針與所選NHS-吖啶酯的偶聯(lián)如下進(jìn)行。寡核苷酸雜交探針如上所述合成的連接臂偶聯(lián)物在Savant SPEED-VAC干燥器中真空-干燥，隨后溶于8μl的50％(v/v)DMSO中0.125M的HEPES緩沖液(pH8.0)中。2μl 25mM所需的NHS-吖啶酯另外加入該溶液?；旌先芤翰⑶以?7℃溫育20分鐘。
另外3μl DMSO中的25mM NHS-吖啶酯加至該溶液并且溫和混合，隨后加入2μ10.1M HEPES緩沖液(pH8.0)，混合，并且使試管在37℃溫育另外的20分鐘。反應(yīng)用5μl的0.1M DMSO HEPES緩沖液(pH8.0)中0.125M賴氨酸的加入終止，其溫和混合入該溶液中。
標(biāo)記的寡核苷酸通過30μl 3M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)、245μl水和5μ140mg/ml糖原的加入而從溶液回收。640微升冷卻的100％乙醇加至試管，并且試管在干冰上保持5至10分鐘。所沉淀的標(biāo)記探針在冷凍微量離心機(jī)中利用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)頭15,000rpm沉降。吸去上清，而沉淀重溶于包含0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)的20μ10.1M的乙酸鈉(pH5.0)中。
11飛摩爾的標(biāo)記探針雜交至不同量(0.00、0.01、0.02、0.05、0.20、0.50、2、5、20、50、200、500、2000和5000飛摩爾)的靶BACE455RNA。每組由包含100mM琥珀酸鋰(pH5.0)、8.5％(w/v)十二烷基硫酸鋰、1.5mM EDTA和1.5mM EGTA的100μl雜交反應(yīng)液組成并且每一反應(yīng)混合物在50℃溫育50分鐘。300微升包含150mM Na2B4O7(pH8.6)和1％(v/v)TRITON.X-100的溶液加至每一反應(yīng)，并且混合物在50℃溫育11分鐘。反應(yīng)混合物隨后放入LEADER50光度計(jì)(Gen-Probe，Inc.)中，并且在200μl 0.1％(v/v)H2O2和1mM HNO3，接著200μl 1.5N NaOH的注射后在每一混合物中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。第二次注射后，化學(xué)發(fā)光在300至650納米的波長范圍讀數(shù)2秒，并且與陰性和陽性對照標(biāo)準(zhǔn)作比較。超過陰性對照的顯著的化學(xué)發(fā)光表明BACE455-選擇性雜交物的存在。
核酸引物本發(fā)明其他的選擇性多核苷酸為用于擴(kuò)增包括BACE455RNA或其精確互補(bǔ)體的特有片段區(qū)域的核酸引物。所述引物用來擴(kuò)增BACE455-選擇性核酸片段。
本發(fā)明特定的引物能選擇性地與BACE455RNA或其精確互補(bǔ)體的部分雜交，其位于異構(gòu)型-特異性核酸序列區(qū)域，更優(yōu)選源于外顯子3和外顯子5之間新建接合的BACE455RNA，或其精確互補(bǔ)體區(qū)域的側(cè)翼。術(shù)語″側(cè)翼″指所述部分應(yīng)該位于適合常規(guī)聚合酶活性的靶區(qū)域一定距離，例如，離新建接合處不超過300bp，優(yōu)選不超過200、150100或，更優(yōu)選離所述接合處上游50bp。所述引物的實(shí)例包括或與SEQ IDNO1中核苷酸區(qū)域567-704的側(cè)翼序列的部分互補(bǔ)。所述引物的特定實(shí)例包括下列序列AGGCATCCTG(SEQ ID NO13)、GGGCTGGCCT(SEQ ID NO14)、ATGCTGAGAT(SEQ ID NO15)、TGCCAG(SEQ ID NO16)、GATCAT(SEQ ID NO17)、TGGAGGTATC(SEQ ID NO18)、GACCACTCGC(SEQ ID NO19)、TGTACACAGG(SEQ ID NO20)或CAGTCTCTGG(SEQ IDNO21)。
本發(fā)明其他的特定引物能與包含BACE455RNA或其精確互補(bǔ)體特有片段，更具體源于外顯子3和外顯子5之間新建接合的BACE455區(qū)域的異構(gòu)型-特異性區(qū)域選擇性地雜交。上述引物在僅當(dāng)模板包含該異構(gòu)型-特異性改變時(shí)擴(kuò)增才發(fā)生這點(diǎn)上是有利的。通過利用上述引物，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測指示BACE455RNA的存在。相反，擴(kuò)增產(chǎn)物的缺乏指示樣品中不存在該特異性改變。上述引物的實(shí)例包括下列序列的全部或部分CAGGAT(SEQ ID NO22)、CCAGGATC(SEQ ID NO23)、GCCAGGATCA(SEQ ID NO24)或ATTGCCAGGATCATTGGA(SEQ ID NO25)。
本發(fā)明的另外方面還包括至少一對核酸引物，其中所述的一對引物包括正向和反向引物，并且其中所述的正向和反向引物允許BACE455RNA或其異構(gòu)型-特定部分，或精確互補(bǔ)序列的選擇性擴(kuò)增。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案為一對核酸引物，其中所述的對包括正向和反向引物，并且其中所述的正向和反向引物允許缺乏全部或部分外顯子4的BACE RNA異構(gòu)型的全部或異構(gòu)型-特異性部分的選擇性擴(kuò)增。
本發(fā)明代表性的引物為約5至60個(gè)核苷酸長度，更優(yōu)選約8至約35個(gè)核苷酸長度，進(jìn)一步優(yōu)選約10至25個(gè)核苷酸長度的單鏈核酸分子。其序列可從本申請中公開的BACE455核苷酸序列直接導(dǎo)出或推斷出。優(yōu)選完全互補(bǔ)，以確保高特異性。然而，可以允許一定的錯(cuò)配。
抑制性核酸本發(fā)明還涉及可特異性地改變BACE455多肽或包括其片段的多肽(或缺乏功能性外顯子4的任何BACE多肽)的表達(dá)或活性的核酸分子。所述抑制性核酸包括反義核酸、iRNA、核酶、適體等等。這些抑制性核酸包括與靶異構(gòu)型基因或RNA的部分互補(bǔ)，并且引起其轉(zhuǎn)錄或翻譯特異性降低的核酸。絕對的互補(bǔ)，雖是優(yōu)選的，但并不是必需的。
用于所述分子的產(chǎn)生和使用的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且如下簡單描述。寡核苷酸可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如通過利用自動(dòng)化的DNA合成儀(例如為可從Applied Biosystems，Inc.購買得到的)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可通過Matsukura等.(Gene.198872343-7)等的方法合成。
反義脫氧核苷酸已廣泛用于研究給定基因的作用(作為綜述，參見Stein&Cheng，Science 2611004-12(1993)，并且可用在外顯子-外顯子的接合和靶特定的mRNA異構(gòu)型上(Sugi等.Dev.Biol.15728-37(1993)；Mahon等.Exp Hematol.231606-11(1995)；Desire等.J.Neurochem.75151-163(2000))。
反義寡核苷酸可以為DNA或RNA或嵌合的混合物或衍生物或其改進(jìn)型，單鏈的或雙鏈的。寡核苷酸可在堿基部分、糖部分或磷酸酯主鏈，例如(選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和其甲縮醛(formacetal)或類似物)處修飾，以改進(jìn)分子、雜交的穩(wěn)定性等等。寡核苷酸可包括其他附加的基團(tuán)例如肽(例如，用于體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)，或促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)透過細(xì)胞膜或血腦屏障的試劑(Letsinger(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866553-6556)，雜交-引發(fā)的裂解試劑(Krol(1988)Bio.Techniques6958-976)或嵌入劑(Zon(1988)Ann.N.Y.Acad.Sci.616161-72(1990))。
反義寡核苷酸可以為α-異頭寡核苷酸，其與互補(bǔ)RNA以平行鏈形成特異性雙鏈雜交物(Gautier等.(1987)Nucl.Acids Res.1566256641)。寡核苷酸為2′-O-甲基核糖核苷酸(Mayeda等.J.Biochem.108399-405(1990))，或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
還可將小干擾RNA用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而實(shí)現(xiàn)基因沉默(Elbashir等.Nature 411494-498；Brummelkamp等.Science 296550-553(2003)并且已成功用于可變剪接范圍中以研究特異性異構(gòu)型的功能關(guān)聯(lián)(Celotto&Graveley，RNA 8718-724(2002))。核酶為能催化RNA特異性裂解的酶促RNA分子，也可用于阻止靶基因mRNA的翻譯以及，由此靶基因產(chǎn)物的表達(dá)(Sarver等.(1990)Science 2471222-1225；Rossi(1994)Current Biology 4469-471)。核酶作用的機(jī)理包括核酶分子至互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交，及隨后內(nèi)切核酸水解的裂解事件。錘頭核酶為經(jīng)修飾的核酶，其在位于和靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對的側(cè)翼區(qū)位置裂解mRNA。錘頭核酶的組成和產(chǎn)生為本領(lǐng)域所熟知且在Haseloff和Gerlach，1988(Nature)334585-591中更充分地描述。
這些抑制性核酸可在本申請中公開的序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)。
特異性配體本發(fā)明還涉及選擇性結(jié)合如上公開的BACE455異構(gòu)型或其特有片段的配體。
可包含不同類型的配體，例如特異性的抗體、合成分子、適體、肽等等。
在一具體的實(shí)施方案中，配體為抗體，或其片段或衍生物。因此，本發(fā)明的一個(gè)具體方面屬于特異性結(jié)合BACE455-特異性表位，更優(yōu)選通過外顯子4(由SEQ ID NO9的氨基酸190至235編碼)的全部或部分缺失產(chǎn)生的抗原表位的抗體。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，抗體指多克隆抗體、單克隆抗體以及具有基本上相同的抗原特異性的其片段或衍生物。片段包括Fab、Fab′2、CDR區(qū)等等。衍生物包括單鏈抗體、人源化抗體、人抗體、多功能性抗體等等。
針對人BACE455蛋白的抗體可通過本領(lǐng)域通常所知的方法產(chǎn)生。例如，多克隆抗體可通過將蛋白質(zhì)單獨(dú)或與合適的蛋白質(zhì)一起注射入非-人動(dòng)物而產(chǎn)生。適當(dāng)時(shí)間后，動(dòng)物放血，回收血清并且用本領(lǐng)域已知的技術(shù)純化(參見Paul，W.E.″Fundamental Immunology″第二版.RavenPress，NY，p176，1989；Harlow等.″AntibodiesA laboratory Manual″，CSH Press，1988；Ward等.(Nature 341(1989)544)。單克隆抗體可例如通過包括免疫B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合的Kohler-Millstein(2)技術(shù)(Kohler-Millstein，Galfre，G.，和Milstein，C，Methods Enz.73p.1(1981))制備。例如，上述抗原可注射入上述的小鼠中直至在小鼠血清中檢測到多克隆抗體的應(yīng)答。小鼠可再次加強(qiáng)注射，取出其脾臟并且根據(jù)各種方法進(jìn)行與骨髓瘤的融合。單個(gè)存活的雜交瘤細(xì)胞首先通過其結(jié)合免疫抗原的能力，隨后通過其免疫沉淀來自細(xì)胞的BACE的能力來檢驗(yàn)抗-BACE抗體的分泌。
抗體″選擇性針對BACE455多肽″指比其他BACE異構(gòu)型更大程度地選擇性結(jié)合BACE455多肽的抗體，即針對BACE455多肽或其包含抗原表位片段產(chǎn)生的抗體。雖然可能存在對其他抗原的非特異性結(jié)合，結(jié)合至靶BACE455多肽以較高的親合力發(fā)生并且可以與非特異性結(jié)合可靠地區(qū)別開。優(yōu)選的抗體為選擇性針對包含外顯子3和外顯子5之間新建接合區(qū)的BACE455特異性結(jié)構(gòu)域。選擇性針對所述結(jié)構(gòu)域的抗體允許樣品中BACE455多肽存在的檢測。配體可以可溶性形式，或涂布于表面或支持物上而使用。
合成抑制劑的特定實(shí)例包括Gleevec和布雷菲德菌素A。肽抑制劑的特定實(shí)例為BACE抑制劑III(SEQ ID NO3)。
檢測和診斷本發(fā)明允許檢測或診斷分析的執(zhí)行，所述檢測或診斷分析尤其可用于檢測樣品或患者中BACE455或?qū)?yīng)核酸的存在、缺乏或量。術(shù)語″診斷″應(yīng)當(dāng)認(rèn)為包括檢測哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)樣品中BACE455異構(gòu)型、對應(yīng)核酸和其片段、診斷(定性或定量)、藥物基因組學(xué)、預(yù)后等等的方法。
在一個(gè)具體方面，本發(fā)明涉及檢測樣品，優(yōu)選人組織樣品中BACE455核酸或多肽或其片段的方法，包括將所述樣品與其特異性配體接觸并且測定復(fù)合物的生成。
本發(fā)明的一個(gè)特定目的為檢測受試者神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥的存在或易感性的方法，該方法包括檢測來自患者的樣品中特有的BACE455核酸或多肽，尤其為缺乏全部外顯子4的BACE異構(gòu)型，更優(yōu)選為分別具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2多核苷酸或氨基酸序列的BACE異構(gòu)型的存在。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為評(píng)估患者對神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥治療應(yīng)答的方法，該方法包括檢測來自治療前后不同時(shí)期受試者的樣品中特有BACE455核酸或多肽的存在。
本發(fā)明還涉及測定神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥治療效力的方法，該方法包括(i)提供來自所述治療期間或之后受試者的組織樣品，(ii)測定所述樣品中BACE455核酸或多肽的存在和/或豐度和(iii)將上述的存在和/或豐度與來自所述受試者治療之前或早期時(shí)取得的對照樣品中所述核酸、多肽或片段的量進(jìn)行比較。
樣品中特有BACE455多肽或核酸的存在(或提高)為神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥的存在、易感性或發(fā)展階段的指示。因此，本發(fā)明允許合適的治療干預(yù)的設(shè)計(jì)，其更有效且更有針對性。此外，前-癥狀水平時(shí)的測定允許預(yù)防療法的應(yīng)用。
可通過各種技術(shù)進(jìn)行樣品中特有BACE455多肽或核酸的存在、缺乏或相對豐度的測定。更優(yōu)選，該測定包括將樣品與BACE455-選擇性試劑例如如上述定義的探針、引物或配體接觸，并且因此檢測樣品中最初BACE455多肽或核酸的存在，或測定其量?？稍谌魏魏线m的裝置，例如平板、微量滴定皿、試管、孔、玻璃、柱等等中進(jìn)行接觸。在具體的實(shí)施方案中，接觸在涂布有試劑的基質(zhì)，例如核酸陣列或特定的配體陣列上進(jìn)行?；|(zhì)可以是固體或半固體的基質(zhì)例如任何合適的支持物，包括玻璃、塑料、尼龍、紙、金屬、聚合物等等?；|(zhì)可以是不同的形式和大小，例如載玻片、薄膜、珠、柱、凝膠等等。接觸可以在適于試劑和樣品的核酸或多肽間形成的可檢測復(fù)合物，例如核酸雜交物或抗體-抗原復(fù)合物的任何條件下進(jìn)行。
在一具體的實(shí)施方案中，該方法包括將來自受試者的樣品與(涂有其的支持物)如上述定義的BACE455選擇性抗體接觸，并且測定免疫復(fù)合物的存在?？墒褂糜糜跈z測免疫復(fù)合物的各種熟知的方法，例如ELISA、放射免疫測定(RIA)等等。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該方法包括將來自受試者的樣品與(涂有其的支持物)如上述定義的BACE455選擇性核酸探針在允許雜交發(fā)生的合適條件下接觸，并且測定雜交物的存在。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該方法包括將來自受試者的樣品與如上述定義的核酸引物在允許核酸擴(kuò)增發(fā)生的條件下接觸，并且測定擴(kuò)增產(chǎn)物(“擴(kuò)增子”)的存在。可根據(jù)本領(lǐng)域本身已知的各種技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，例如不限于，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。
檢測樣品中核酸的合適方法包括不限于，下列方法等位基因特異性寡核苷酸(ASO)、等位基因特異性擴(kuò)增、Southern印跡(用于DNA)、Northern印跡(用于RNA)、單鏈構(gòu)像分析(SSCA)、熒光原位雜交(FISH)、凝膠遷移、發(fā)夾變性凝膠電泳、異源雙鏈分析等等。
本發(fā)明的診斷方法可在體外、離體或體內(nèi)優(yōu)選體外或離體外進(jìn)行。樣品可以是源自受試者的任何生物樣品，其視情況包含核酸或多肽。所述樣品的實(shí)例包括液體、組織、細(xì)胞樣品、器官、活組織等等。最優(yōu)選的樣品為血液、血漿、唾液、尿、精液等等。還可通過檢驗(yàn)胎兒細(xì)胞或胎盤細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷，例如，可根據(jù)常規(guī)方法收集樣品并且直接用于診斷或儲(chǔ)存。樣品可在執(zhí)行該方法前處理，以便提供或改進(jìn)用于檢驗(yàn)的核酸或多肽的有效性。處理可包括，例如下列的一種或多種細(xì)胞裂解(例如，機(jī)械的、物理的、化學(xué)的等等)、離心、抽提、柱層析等等。
治療除裂解基于APP的底物外，重組人BACE還裂解具有序列LVNM/AEGD(Lin等.Proc Natl Acad Sci USA.97(4)1456-1460(2000))的底物，其為人早老素序列的體內(nèi)加工位點(diǎn)序列。早老素1和早老素2為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其經(jīng)加工并且隨后通過未知蛋白酶穩(wěn)定(Capell等.，J.Biol.Chem.273，3205(1998)；Thinakaran等.，Neurobiol.Dis.4，438(1998))。眾所周知早老素通過APP在γ-分泌酶位點(diǎn)的切割但仍有BACE活性而控制A-β肽的生成。早老素因此加強(qiáng)了阿爾茨海默氏病的發(fā)展。因此，早老素經(jīng)BACE的加工將增強(qiáng)A-β肽的產(chǎn)生，而由此進(jìn)一步促進(jìn)阿爾茨海默氏病的發(fā)展。因此，BACE抑制劑將通過在β-分泌酶位點(diǎn)抑制APP的裂解和/(或)通過阻止早老素的加工因此在γ-分泌酶位點(diǎn)間接抑制APP的裂解而降低阿爾茨海默氏病發(fā)展的可能性或遲緩其的發(fā)展。
本發(fā)明的另一個(gè)目的為包括BACE455抑制劑，優(yōu)選BACE455-選擇性抑制劑，和藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)的藥物組合物。在一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括(i)BACE455的特異性配體或如上述的BACE455抑制性核酸分子和(ii)藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥的方法，該方法包括將有效量的BACE455-選擇性抑制劑施于上述受試者。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為治療或預(yù)防受試者中Aβ肽產(chǎn)生或累積的方法，該方法包括將有效量的BACE455-選擇性抑制劑施于上述受試者。
本發(fā)明還涉及BACE455-選擇性抑制劑在用于治療或預(yù)防受試者神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥的藥物組合物的制備中的用途。
貫穿該說明書，最優(yōu)選的受試者為人受試者。
BACE455-選擇性抑制劑可以是任何試劑，條件或處理，其降低受試者BACE455多肽或其特有片段的表達(dá)或活性；或BACE455核酸或其特有片段的轉(zhuǎn)錄或翻譯。最優(yōu)選，BACE455-選擇性抑制劑為特異性的，即優(yōu)先改變BACE455異構(gòu)型的表達(dá)或活性而基本上不直接改變其他BACE剪接異構(gòu)型的表達(dá)。然而，抑制劑可能也更高或更低程度地影響野生型BACE的表達(dá)或活性。
BACE455-選擇性抑制劑，其呈現(xiàn)出對抑制BACE455活性比對至少一種其他的BACE異構(gòu)型的2倍，或5倍，或10倍，或30倍，或100倍，和/或＞1000倍的選擇能力，相比那些缺乏所述選擇能力或那些顯著降低野生型BACE活性的化合物，具有改善的效用。抑制BACE455活性和對抑制BACE455相比野生型BACE具有2倍或更高選擇能力的抑制劑擁有許多不明顯的益處，包括(但不限于)對抑制病理性疾病發(fā)展的更高效力、由于對非病理性Aβ的產(chǎn)生更少抑制帶來的降低的副作用和由于化合物提高的選擇能力帶來的改善的安全性。抑制劑可用于病癥的預(yù)防性或治療性的目的，病癥包括例如阿爾茨海默氏病和與Aβ40或42肽升高的水平以及淀粉樣蛋白斑中該肽的累積相關(guān)的其他病癥。BACE455抑制劑可選自肽、蛋白質(zhì)、核酸、小藥物等等。代表性實(shí)例包括上述公開的抑制性核酸和抗體以及小藥物。所述藥物可利用以下公開的篩選方法表征或確認(rèn)。其可獲自現(xiàn)有的分子文庫或其可利用市售的軟件程序和有機(jī)化學(xué)和酶學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的技術(shù)而設(shè)計(jì)。用于制備抑制劑的方法可包括(但不限于)組合化學(xué)、分子文庫的篩選、合理的藥物設(shè)計(jì)-這些篩選法可利用BACE455多肽或核酸或其片段作為用于合適的治療候選物選擇的測定法的要素。抑制BACE455的方法可包括但不局限于，小分子抑制劑、肽、反義寡核苷酸、iRNA、核酶和封閉抗體的使用，即降低BACE455蛋白的水平、活性或防止腦中天然存在的底物裂解的試劑。
在一具體的實(shí)施方案中，BACE455抑制劑為結(jié)合BACE455的抗體?？贵w可通過本領(lǐng)域本身已知的各種技術(shù)產(chǎn)生。尤其，其可通過包括用BACE455多肽或其特有片段免疫非-人動(dòng)物，和收集來自上述動(dòng)物的抗體或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的方法產(chǎn)生。抗體可以是單克隆的，多克隆的，以及具有基本上相同的抗原特異性(即，能夠結(jié)合BACE455)的其片段或衍生物?？贵w片段包括Fab、Fab′2、CDR等等?？贵w衍生物包括單鏈抗體(ScFv)、人源化抗體、人抗體、重組抗體、雙特異性抗體等等。用于單鏈抗體產(chǎn)生的技術(shù)(美國專利4,946,778；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward等.，Nature 334544-54(1989))可適于產(chǎn)生單鏈抗體。單鏈抗體通過經(jīng)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段，產(chǎn)生單鏈多肽而形成。也可利用大腸桿菌中功能性Fy片段裝配的技術(shù)(Skerra等.，Science 2421038-1041(1988))。此外，可利用開發(fā)用于″嵌合抗體″產(chǎn)生的，通過將來自適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和來自適當(dāng)生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起的技術(shù)(Morrison等.Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger等.，Nature 312604-608(1984)；Takeda等.，Nature 314452-454(1985))。嵌合抗體為其中不同部分源自不同動(dòng)物種類的分子，例如具有源自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些，例如人源化抗體。
人抗體合乎人類病人治療的需要。人抗體可通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備，包括利用源自人免疫球蛋白序列抗體文庫的噬菌體展示方法(Brinkman等.，J.Immunol.Methods18241-50(1995)；Ames等.，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等.，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等.，Gene 1879-18(1997)；Burton等.，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT公開WO90/02809；WO91/10737)。產(chǎn)生所述抗體的方法在文獻(xiàn)中熟知，如在下文中說明的，不限于文獻(xiàn)Harlow等.(AntibodiesA laboratoryManual，CSH Press，1988；Ward等.(Nature 341(1989)544))。最優(yōu)選的抗體選擇性結(jié)合BACE455，例如結(jié)合相比其他BACE異構(gòu)型特有的BACE455抗原表位。
在另一具體的實(shí)施方案中，BACE455抑制劑為結(jié)合BACE455基因或RNA，優(yōu)選BACE455RNA，并且抑制或降低其轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制性核酸。所述抑制性核酸可如上述公開的而產(chǎn)生。其優(yōu)選包括雜交至如上述公開的BACE455RNA分子特有片段的序列。
在另一實(shí)施方案中，BACE455抑制劑為選擇性抑制劑如BACE抑制劑III(SEQ ID NO3)。
BACE455抑制劑可配制于適合藥物用途的任何合適的稀釋劑、賦形劑、載體或介質(zhì)中。在這方面，本發(fā)明還包括制備包含BACE455抑制劑的組合物的方法，該方法包括i)選擇抑制BACE455的化合物，ii)產(chǎn)生上述化合物，和iii)將上述化合物與其藥學(xué)可接受鹽混合。
本發(fā)明抑制BACE的化合物可利用本領(lǐng)域已知的用于所述給藥的任何藥學(xué)可接受劑型經(jīng)口給藥。介質(zhì)可以是任何溶液、懸浮液、粉劑、凝膠等等，包括等滲溶液、緩沖液和鹽溶液，如糖漿或水懸劑等等。該化合物可通過任何合適的路徑，包括全身性投遞、靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、大腦內(nèi)的或鞘內(nèi)注射而給藥。如果需要，可進(jìn)行重復(fù)注射。取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾個(gè)因素，劑量可在很大限制的范圍內(nèi)變化并且在每個(gè)具體病例中必須根據(jù)個(gè)體需要而調(diào)節(jié)。測定活性化合物用量劑量的因素可以是該具體試劑的藥效特征和其模式和給藥途徑；受體的年齡、健康和重量；癥狀的性質(zhì)和程度；共同療法的類型；治療頻率；和所希望的效果。活性組分的日常劑量可預(yù)計(jì)為約0.001至約1000毫克每公斤體重，優(yōu)選的劑量為約0.1至約30mg/kg。日?？诜靠稍诩s0.01mg至1000mg，0.1mg至100mg，或10mg至500mg化合物每天的范圍內(nèi)變動(dòng)。日劑量可作為單劑量或分開的劑量給藥，并且此外，當(dāng)發(fā)現(xiàn)其為指示性的時(shí)候還可以超出其上限。
本發(fā)明的化合物可以如片劑、膠囊(每個(gè)可包括持續(xù)釋放或緩釋的制劑)、丸劑、粉劑、粒劑、酏劑、酊劑、懸浮液、糖漿和乳劑的所述口服劑形式給藥。同樣地，其還可以靜脈內(nèi)(丸劑或輸液)、腹膜內(nèi)、皮下的或肌內(nèi)方式給藥，所有利用的劑型為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。可利用有效但無毒性的所需化合物的量以預(yù)防或治療與β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生或累積相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，例如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征。
該化合物可單獨(dú)給藥，但是通常與根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物操作(例如Remington′s Pharmaceutical Sciences中所述的，Mack出版物)的藥物載體一起給藥。
抑制BACE455的化合物可以產(chǎn)生宿主，例如人或哺乳動(dòng)物體內(nèi)活化劑與試劑作用位點(diǎn)接觸的任何方式給藥。其可通過任何可用于和藥物一起，或作為單個(gè)治療劑或以治療劑的組合，或單獨(dú)給藥或與根據(jù)給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物操作所選的藥物載體一起給藥的常規(guī)方法給藥。
本發(fā)明抑制BACE455的化合物可以鼻內(nèi)形式經(jīng)合適的鼻內(nèi)介質(zhì)的局部利用，或經(jīng)透皮路徑，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的透皮貼片而給藥。
含有活性化合物的片劑或膠囊劑形式的口服給藥可與口服的、無毒的、藥學(xué)可接受的惰性載體例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇、山梨糖醇等等結(jié)合；以液體劑口服給藥時(shí)，口服的藥物組分可與任何口服的、無毒的、藥物上可以接受的惰性載體例如乙醇、甘油、水等等結(jié)合。進(jìn)一步說，當(dāng)希望或必須時(shí)，混合物亦可加入合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、以及著色劑?？商砑尤缫陨纤龅哪切┨鹞秳┖驼{(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這些組合物可通過抗-氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚(anisol)或維生素E的加入而儲(chǔ)存。適宜的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖，例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然和合成膠，例如阿拉伯膠、黃蓍膠、或藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等等。這些劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等等。崩解劑包括但不限于，淀粉、甲基纖維素、瓊脂、皂土、黃原膠等等。
抑制BACE455的化合物還可以脂質(zhì)微粒投遞系統(tǒng)的形式給藥，例如小的單層囊、大的單層囊、以及多層囊。脂質(zhì)體可由各種磷脂例如膽甾醇、硬脂酰胺、或卵磷脂形成?；蛘?，本發(fā)明的化合物亦可與作為靶向藥物載體的可溶性聚合物結(jié)合，如聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚體、聚羥丙基異丁烯酰胺-苯酚、聚羥乙基天冬酰胺-苯酚，或被棕櫚酰殘基取代的聚亞乙基氧-聚賴氨酸制備的聚合物。聚合物還可為可用于實(shí)現(xiàn)藥物控釋的生物可降解聚合物的種類，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚體，聚ω-己內(nèi)酯、聚氰基?；锏鹊然蛩z的嵌段共聚體。
本發(fā)明的化合物可與外加乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等等的粉劑載體配制為膠囊。類似的稀釋劑可用于制備壓縮片。片劑和膠囊均可以制備成持續(xù)釋放的產(chǎn)品以在數(shù)小時(shí)期間持續(xù)釋放藥物。壓縮片可以是糖包衣的或是膜包衣的，以掩蓋令人不快的味道并使片與環(huán)境隔離，或者可以是腸溶包衣的以選擇性地在胃腸道崩解?？诜后w劑型可以含有著色劑和調(diào)味劑以使受試者易于接受。通常，水、合適的油、鹽、水相右旋糖(葡萄糖)、以及相關(guān)的糖溶液和二元醇如丙二醇或聚乙二醇是非腸道溶液的適宜載體。非腸道給藥溶液優(yōu)選含有活性組分的水溶性鹽、適宜的穩(wěn)定劑，以及如果需要，還含有緩沖物質(zhì)?？寡趸瘎├鐏喠蛩釟溻c、亞硫酸鈉或抗壞血酸單獨(dú)或其組合是適宜的穩(wěn)定劑。還可以使用檸檬酸和其鹽以及EDTA鈉鹽。此外，非腸道溶液可以含有防腐劑例如氯化芐烷銨、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯以及氯丁醇。本發(fā)明的治療組合物和方法可用于抑制病理性疾病如(但不限于)，阿爾茨海默氏病、癡呆、青光眼、帕金森氏癥、ALS和中風(fēng)的發(fā)展。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語″治療″指神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的預(yù)防性或治愈性的治療，包括發(fā)展的早期或晚期。治療包括延緩疾病發(fā)展，降低Aβ肽的產(chǎn)生或累積，改善病人病癥等等。治療可單獨(dú)或與其他活性劑結(jié)合使用。
藥物篩選在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供用于藥物候選物或先導(dǎo)物篩選的新靶標(biāo)和方法。該方法包括結(jié)合分析和/或功能(活性)分析，并且可在體外、細(xì)胞系統(tǒng)中、動(dòng)物中等等進(jìn)行。
本發(fā)明的特定目的為選擇、表征、篩選或優(yōu)化生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括將試驗(yàn)化合物與特有的BACE455核酸、多肽或這些中一種的片段體外接觸，并且測定所述試驗(yàn)化合物結(jié)合和/或影響B(tài)ACE455核酸或多肽活性的能力。單獨(dú)結(jié)合提供了化合物調(diào)節(jié)所述靶活性，并且因此影響引起神經(jīng)變性病癥通路的能力的一些指標(biāo)，(雖然不結(jié)合的變構(gòu)抑制劑也可用于，并且包括在本發(fā)明治療性方法的范圍內(nèi))。在目前的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將試驗(yàn)化合物和特有的BACE455多肽或其片段體外接觸并且測定所述試驗(yàn)化合物結(jié)合所述多肽或片段的能力。該片段優(yōu)選包括異構(gòu)型-特異的結(jié)構(gòu)域和/或催化結(jié)構(gòu)域。
結(jié)合的測定可通過各種技術(shù)，例如通過試驗(yàn)化合物的標(biāo)記，通過與標(biāo)記的對照配體的競爭作用，或其他檢測結(jié)合復(fù)合物的直接或間接的方法進(jìn)行。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為選擇、表征、篩選或優(yōu)化生物學(xué)活性物質(zhì)的方法，所述方法包括將試驗(yàn)化合物和BACE455多肽體外接觸并且測定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)所述多肽活性的能力。在一具體的實(shí)施方案中，該試驗(yàn)化合物在BACE底物(例如，APP或其合適的片段)存在時(shí)和BACE455多肽接觸，并且觀察BACE455活性的任何改變，例如蛋白水解活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括測定試驗(yàn)化合物是否選擇性地影響B(tài)ACE-介導(dǎo)的底物的水解。通常，試驗(yàn)利用表達(dá)BACE455多肽的細(xì)胞(例如，重組宿主細(xì)胞)進(jìn)行。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為選擇、表征、篩選和/或優(yōu)化生物學(xué)活性物質(zhì)的方法，所述方法包括將試驗(yàn)化合物和BACE455RNA接觸并且測定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)所述BACE455RNA翻譯的能力。
化合物的選擇能力可通過測定其對包含全長外顯子4的其他BACE剪接異構(gòu)型的作用而進(jìn)行評(píng)估。
上述篩選分析可在任何合適的裝置，例如平板、試管、皿、細(xì)頸瓶等等中進(jìn)行。通常，該分析在多孔微量滴定皿中進(jìn)行。利用本發(fā)明可同時(shí)分析幾個(gè)試驗(yàn)化合物。此外，試驗(yàn)化合物可以是各種來源的、天然的和組合物。其可以是分離的或與其他物質(zhì)混合的任何有機(jī)或無機(jī)物，例如脂類、肽、多肽、核酸、小分子。例如，該化合物可以是化合物組合文庫的全部或部分。
本發(fā)明另外的方面和優(yōu)點(diǎn)將在下列實(shí)施例中公開，其應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是說明性的而不限制本申請的范圍。貫穿本說明書和實(shí)施例中引用的所有出版物、專利或?qū)＠暾埖娜績?nèi)容在此加入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1DATAS技術(shù)鑒定人BACE中的可變剪接事件用于表達(dá)分布研究的DATAS技術(shù)(例如，美國專利6,251,590中詳述的，因此在此引入作為參考)用來比較確證為AD病人和健康對照的前額皮層中存在的可變剪接的RNA。對照受試者為非精神錯(cuò)亂的，為年齡-匹配的并且腦組織為相似年齡死后的以除去分布研究中老化-相關(guān)的和mRNA穩(wěn)定性-相關(guān)的改變。
EXH-NADC5033DATAS片段與NM_012104比對，所述NM_012104包含BACE501蛋白質(zhì)(異構(gòu)型變體)的編碼序列。由于這2個(gè)序列的差異，EXH-NADC5033變體的存在指示了患AD的病人腦中正常RNA剪接事件的調(diào)節(jié)異常。
通過在BACE序列中外顯子3和4水平的各種可變剪接事件，已經(jīng)描述了不同的異構(gòu)型(轉(zhuǎn)錄本變體-a至-d)(Bodendorf等.，J BiolChem.276(15)12019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res Mol BrainRes.1151)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci Lett.307(1)9-12(2001)，由此在此引入作為參考)。
下列引物用于證實(shí)和該DATAS片段有關(guān)的可變RNA剪接事件的存在用于包含該DATAS片段的核酸片段擴(kuò)增的PR_NM_012104-F01(BACE501編碼序列3760-3780的位置)(SEQ ID NO26)和PR_NM_012104-R01(BACE501編碼序列4312-4330的位置)(SEQ IDNO27)以及用于包含經(jīng)受之前鑒定的可變剪接事件(轉(zhuǎn)錄本變體-a至-d)的RNA區(qū)域的核酸片段擴(kuò)增的PR_NM_012104-F02(BACE501編碼序列698-716的位置)(SEQ ID NO28)和PR_NM_012104-R02(BACE501編碼序列1158-1178的位置)(SEQ ID NO29)(Bodendorf等.，J Biol Chem.276(15)12019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res Mol Brain Res.115(1)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci Lett.307(1)9-12(2001))。
分離自確證AD病人前額皮層的人腦總RNA利用Trizol(Invitrogen)分離。1微克RNA在35μl中利用Superscript RT試劑盒(Invitrogen)在42℃反轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，隨后與1μl RNAse I(Promega)37℃溫育15分鐘。用1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，每種引物1μM對反轉(zhuǎn)錄本的1/10th進(jìn)行PCR。條件為94℃3分鐘以及94℃30秒，60℃30秒30個(gè)循環(huán)和72℃45秒。72℃5分鐘的最終延伸后，在1.5％瓊脂糖凝膠上分析對應(yīng)全長cDNA的PCR片段，利用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆入TOPO TA載體并且將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)。在96孔平皿中37℃過夜培養(yǎng)細(xì)胞并且挑選克隆并在氨芐存在時(shí)2XTY細(xì)菌培養(yǎng)基中37℃過夜擴(kuò)增。
測序前，利用SP6和T7引物(每種1μM，Invitrogen)的PCR對每種培養(yǎng)物的1μl等份進(jìn)行55℃30個(gè)循環(huán)。5μl PCR反應(yīng)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，而剩余的PCR產(chǎn)物經(jīng)P100Bio-Gel(Biorad)柱純化。測序反應(yīng)利用ABI Prism Big Dye Terminator Cycles SequencingReady Reaction試劑盒3.0版(Aplera)進(jìn)行并且反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)G50Sephadex柱(Amersham)純化且經(jīng)3100Genetic Analyser測序儀(Applied Biosystems)分析。
所有PCR產(chǎn)物的批量克隆和測序顯示對應(yīng)BACE501轉(zhuǎn)錄本變體a和b加新異構(gòu)型的2個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本的存在。
推導(dǎo)經(jīng)DATAS片段部分編碼的蛋白質(zhì)的分析，假定DATAS片段為BACE501和BACE455之間變異的位點(diǎn)。該蛋白質(zhì)呈現(xiàn)與Sinha等.，Nature 402，537-540(1999)和Vassar等.，Science 286，735-741(1999)所述的天冬蛋白酶2BACE(或ASP2)的高同源性，上述兩篇文獻(xiàn)都在此處引入作為參考。利用公眾可得到的生物信息工具例如BLAT(Kent，Genomeres.12656-664(2002))或利用商業(yè)可得到的DoubleTwist Annotated人基因組數(shù)據(jù)庫和DoubleTwist Annotated人和小鼠基因索引(Double Twist，Inc.出品)在各種公共的ETS數(shù)據(jù)庫例如Genbank、DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)庫)和EMBL(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)中的搜索未能鑒定新的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)型。新轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)型根據(jù)文獻(xiàn)的命名法(Bodendorf等.J Biol Chem.276(1512019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res Mol Brain Res.115(1)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci Lett.307(1)9-12(2001))命名為BACE455。在與BACE501和其他異構(gòu)型比對的基礎(chǔ)上，確定BACE455轉(zhuǎn)錄本缺乏外顯子4。
實(shí)施例2人BACE455，一種新的BACE可變剪接形式的分子克隆全長BACE501cDNA和BACE455的cDNA隨后利用富含GC的-PCR-系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals)(Capell等.，J.Biol.Chem.27540，30849-30854(2000))從來自阿爾茨海默腦的相同的起始材料克隆。利用廠商說明書，反轉(zhuǎn)錄的RNA(參見實(shí)施例1)用下列引物擴(kuò)增1.5mM MgCl2存在時(shí)以1μM濃度使用的PR_NM_012104-F03(BACE501編碼序列442-459的位置)(SEQ ID NO.6)和PR_NM_012104-R03(BACE501編碼序列1971-1984的位置)(SEQ IDNO.7)。對應(yīng)BACE501和BACE455全長cDNA的PCR產(chǎn)物克隆入實(shí)施例1中所述的TOPO TA載體中并且利用SP6和T7引物以及引物PR_NM_012104-F01(SEQ ID NO26)，PR_NM_012104-F02(SEQ IDNO28)和PR_NM_012104-R02(SEQ ID NO29)測序。為富集對應(yīng)BACE455異構(gòu)型的cDNA中的cDNA群，20μl的第一鏈反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物在包含DNA聚合酶I，dNTP混合物10mM，RNase H(大腸桿菌，Gibco)和DNA連接酶(大腸桿菌，Gibco)的第二鏈緩沖液(Gibco)中16℃2小時(shí)進(jìn)行第二鏈的合成。隨后，雙鏈cDNA(dscDNA)經(jīng)苯酚/氯仿/異戊醇(24∶25∶1，v/v)抽提和沉淀。dscDNA隨后用限制性酶Stul或Bcll(New England Biolabs)消化。消化反應(yīng)利用五分之一純化的dscDNA反應(yīng)產(chǎn)物在20μl中37℃進(jìn)行2小時(shí)。Bace455不能由Stul或Bcll切割，其在缺失的DNA片段中切割，而BACE501被消化而不能通過PCR擴(kuò)增。BACE455利用在1.5mM MgCl2存在時(shí)以1μM濃度使用的引物PR_NM_012104-F03(BACE501編碼序列442-459的位置)(SEQ ID NO30)和PR_NM_012104-R03(BACE501編碼序列1971-1984的位置)(SEQ ID NO31)，和T7引物以及引物PR_NM_012104-F01(SEQ ID NO26)，PR_NM_012104-F02(SEQ IDNO28)和PR_NM_012104-R02(SEQ ID NO29)而PCR擴(kuò)增(60℃，30個(gè)循環(huán))。對應(yīng)全長cDNA的PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上分析，亞克隆入實(shí)施例1中所述的TOPO TA載體并且測序。
全長克隆和測序后，確定BACE455的全長核苷酸(SEQ ID NO1)和預(yù)測的氨基酸(SEQ ID NO2)序列。結(jié)果和比對在圖1中顯示。
BACE501也克隆自EST IMAGE數(shù)據(jù)庫中的ESTBC036084，克隆MGC33762。含有該EST序列的對應(yīng)的菌株#MHS1010獲自O(shè)penBiosystem(Huntsville，AL)。利用富含GC的-PCR-系統(tǒng)(Roche MolecularBiochemicals)，利用廠商說明書和1μM的引物PR_NM_012104-F03(SEQ ID NO30)和PR_NM_012104-R03(SEQ ID NO31)和1.5mMMgCl2進(jìn)行PCR。在1.5％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物并且將對應(yīng)全長序列的cDNA克隆入實(shí)施例1中所述的TOPOTA載體中且利用SP6和T7引物以及引物PR_NM_012104-F01(SEQ ID NO26)，PR_NM_012104-F02(SEQ ID NO28)和PR_NM_012104-R02(SEQID NO29)測序。
由于位于橋接BACE501蛋白質(zhì)2個(gè)胞外突的暴露于溶劑的α-螺旋(氨基酸殘基190至235)內(nèi)2個(gè)活性天冬氨酸殘基之間的讀框內(nèi)138bp缺失，命名為BACE455的新BACE變體完全缺失BACE501外顯子4。在Hong等.，Science.290(5489)150-3(2000)公開的BACE501晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，似乎BACE455的活性部位更張開和易于靠近，而因此可能產(chǎn)生顯著提高水平的Aβ肽。
新的較短的蛋白質(zhì)包含455個(gè)氨基酸殘基并且具有約50kD的理論分子量。BACE455包含前區(qū)，天冬氨酸蛋白酶區(qū)域，對于正確的BACE加工(Asn153和Asn172)體系(Fluhrer，R.等.；J Biol Chem.278(8)5531-5538(2003)，Haniu，M.等.J.Biol.Chem.27521099-106(2000))必不可少的靠近C-末端和N-糖基化位點(diǎn)的轉(zhuǎn)膜區(qū)，提示新的BACE455變體經(jīng)過正確的加工并且在分泌途徑中成熟?；钚悦笧锽ACE455而前酶為前BACE455。
Huse等.(J Biol Chem.278(19)17141-9(2003))的最新數(shù)據(jù)表明BACEβ-分泌酶活性由BACE1的內(nèi)部蛋白水解裂解而部分終止。最近發(fā)現(xiàn)的加工在BACE的2個(gè)胞外突(Leu228和Ala229之間)之間的α-螺旋上發(fā)生。已報(bào)道在該位點(diǎn)經(jīng)未知蛋白酶的裂解導(dǎo)致每種37kD大小特有的N-和C末端片段的產(chǎn)生。該2個(gè)片段通過二硫鍵以偽活性的構(gòu)象表面上維持，導(dǎo)致顯著減弱的，而不是消除的酶活性。重要的是，由于該區(qū)域由缺失的外顯子4編碼，BACE455不是蛋白內(nèi)水解加工的底物。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中BACE455呈現(xiàn)與BACE501類似的免疫反應(yīng)性BACE在細(xì)胞中具有大于9小時(shí)的半衰期(Haniu等.，J.Biol.Chem.27521099-21106(2000))并且在這期間循環(huán)至膜數(shù)次。因此，利用特異于其N末端部分的抗體，BACE可在完整細(xì)胞(即非滲透的)的細(xì)胞表面和滲透細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)部(高爾基體和核內(nèi)體區(qū)室)免疫定位。相反，BACE變體，例如非活化的并且其按照分泌途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)有缺陷的且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水平被阻斷的BACE457，在細(xì)胞表面未能檢測到(Bodendorf等.，J Biol Chem.2762019-23(2001))。
因此，免疫組織化學(xué)研究可確定給定的BACE變體例如BACE455是否如APP一樣存在于相同的胞內(nèi)部位，或如BACE501一樣存在于胞內(nèi)和胞外，其為致淀粉樣活性的前提。
材料和方法為了產(chǎn)生基于pCDNA3的表達(dá)載體，TOPO TA載體中BACE50和BACE455的全長cDNA亞克隆入pcDNA3(Invitrogen)的EcoRl位點(diǎn)以分別產(chǎn)生pcDNA3-BACE501和pcDNA3-BACE455。cDNA(200ng質(zhì)粒/測序反應(yīng))利用Invitrogen的SP6和T7引物和實(shí)施例1中所述方案測序用于插入的驗(yàn)證和定向。由于其胞質(zhì)的大容量和其鼠來源，NIH3T3細(xì)胞(ATCC#CRL1658)用于研究BACE免疫反應(yīng)性。細(xì)胞在T150培養(yǎng)瓶中，在具有4.5g/l葡萄糖和補(bǔ)充有10％新生牛血清，1％青霉素/鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基中37℃以及5％CO2下常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞以40.000細(xì)胞/孔涂布于6-孔平皿。根據(jù)廠商的建議，用pcDNA3-BACE501、pcDNA3-BACE455或pcDNA3-GFP(1μg載體/孔)以及Lipofectamine Plus試劑(Life Technologies)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后2天，處理細(xì)胞用于免疫定位或功能分析。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在聚D-賴氨酸-涂布的蓋玻片上培養(yǎng)。對于免疫染色，細(xì)胞在20℃固定于3％的仲甲醛。細(xì)胞可用Triton X100(PBS中0.1％)滲透或完好處理(無滲透作用)。用磷酸鹽緩沖鹽中3％的牛血清白蛋白封閉后，滲透的或完整的細(xì)胞與1∶800稀釋的針對氨基酸序列46-65或487-501的兔抗-人BACE抗體(Calbiochem)溫育。Cy3-或FITC-偶聯(lián)的二抗(Sigma)以1∶800稀釋利用。染色的細(xì)胞包埋于FluorSave中(Calbiochem)。
結(jié)果從結(jié)果可明顯看出在細(xì)胞表面和亞細(xì)胞區(qū)室BACE455呈現(xiàn)與BACE501類似的免疫反應(yīng)性(圖2)。此表明由于BACE有效地運(yùn)至細(xì)胞膜，BACE455中外顯子4的缺失并不影響其轉(zhuǎn)運(yùn)。由于BACE的胞內(nèi)運(yùn)輸與加工和成熟密切相關(guān)，很可能BACE455的加工和成熟并未改變并且，從而當(dāng)與BACE501相比時(shí)BACE455的致淀粉樣活性沒有減弱。
實(shí)施例4BACE455對肽底物活性的驗(yàn)證進(jìn)行2個(gè)實(shí)驗(yàn)，其證實(shí)BACE455對基于APP的包含β裂解位點(diǎn)肽底物的活性。底物的氨基酸序列對應(yīng)APP并且摹擬在具有遺傳性AD的Swedish家族中發(fā)現(xiàn)的APP中的突變，其中KM氨基酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镹L。Swedish突變已知提高APP經(jīng)β-分泌酶的裂解。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，顯示轉(zhuǎn)染的人胚腎HEK293中BACE455增強(qiáng)的表達(dá)提高了合成熒光底物的裂解。
第二組實(shí)驗(yàn)證實(shí)在熒光生成分析中BACE455呈現(xiàn)與BACE501類似的活性效力。對此，得到很好表征的人胚腎HEK293細(xì)胞系為研究過表達(dá)蛋白質(zhì)功能的實(shí)用工具。
材料和方法哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和克隆的選擇人胚腎HEK293細(xì)胞(ATCC#CRC-1573)利用Invitrogen的Lipofectamine Plus試劑用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿中以70-80％鋪曼的密度接種。每個(gè)平皿用2μgDNA，8μlPlus試劑和4μlOptiMEM的Lipofectamine轉(zhuǎn)染。溫育5小時(shí)后，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基用DMEM，10％FBS，NaPyruvate，及抗生素替換并且細(xì)胞在正常條件下溫育(37℃，5％CO2)72小時(shí)。轉(zhuǎn)染后三天，細(xì)胞傳代入包含400μg/ml G418的培養(yǎng)基中。在選擇培養(yǎng)基中生長十五個(gè)天后，選擇單個(gè)克隆接入包含添加G418的生長培養(yǎng)基的96孔平皿的每個(gè)孔中。克隆從96孔平皿擴(kuò)大至24孔平皿隨后至6孔平皿。所選的克隆中BACE455或BACE501的表達(dá)通過利用如實(shí)施例3中的C末端-特異性抗體的Western印跡法和免疫組織化學(xué)分析而測定。最終選擇的BACE455或BACE501細(xì)胞系分別表現(xiàn)出BACE455或BACE501最高的表達(dá)水平。
細(xì)胞提取物的制備，熒光產(chǎn)生的分析方案收集細(xì)胞并且在1,500rpm離心5分鐘除去培養(yǎng)基。細(xì)胞沉淀用PBS洗滌一次。為了進(jìn)一步比較BACE455和BACE501的活性，基于包含APP中Swedish突變KM->NL的淬滅的熒光底物(底物V，Calbiochem)開發(fā)體外分析。肽序列為MCA-SEVNLDAEFK(DNP)-CONH2(SEQ ID NO32)，包含Swedish APP突變(黑體)，7-氨基-4-甲基香豆素(MCA)為熒光基團(tuán)和二硝基苯酚(DNP)為猝滅劑。當(dāng)BACE455和BACE501表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物與熒光底物V溫育時(shí)，通過蛋白酶裂解后，熒光基團(tuán)與淬火基團(tuán)分離，恢復(fù)了供體的全部熒光產(chǎn)率。(Ermolief等.，Biochemistry 3912450-12456(2000)；Ellerby等.J Neurosci.176165-6178(1997)；Capel等.，J Biol Chem.2775637-43(2002))。
模擬轉(zhuǎn)染的HEK293和HEK293-BACE455和-BACE501細(xì)胞通過在冰冷的20mM Tris/150mM NaCl，pH7.5加完全的蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics)中破碎而采集。細(xì)胞經(jīng)重復(fù)凍融裂解并且在500g離心10分鐘后產(chǎn)生核后(postnuclear)組分。沉淀重懸于包含蛋白酶抑制劑混合物的膜提取緩沖液中(20mM MES/1％Triton X100)并且冰上孵育30分鐘。分析以200l體積的稀釋于包含15μM肽底物V的反應(yīng)緩沖液(25mM MES/25mM乙酸鈉/25mM Tris，pH4.4)中的膜制備物在黑暗的96孔平板(ATGC)中進(jìn)行。這些組分多次平衡至37℃并且反應(yīng)通過添加底物而起始。在320nm進(jìn)行激發(fā)并且反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通過測定420nm處的熒光發(fā)射而監(jiān)測。為了測試pH的作用，裂解的細(xì)胞重懸于調(diào)整pH值為4.4至8之間的25mM MES/25mM乙酸鈉/25mMTris中并且隨后如上進(jìn)行溫育。
包括純化的重組人BACE501蛋白質(zhì)(R&DSystems)的對照，或單獨(dú)的底物以及本底熒光被除去以記錄BACE異構(gòu)型的活性。
結(jié)果蛋白質(zhì)水解測定法中抽提自膜組分的BACE455產(chǎn)生了熒光信號(hào)的時(shí)間相關(guān)的提高，表明BACE455具有β-分泌酶活性。在2小時(shí)后見到最大的蛋白質(zhì)水解，其后可能由于隨著完全裂解的底物的減少而到達(dá)平臺(tái)期。
表2隨時(shí)間的BACE活性
*p＜0.05，Wilkoxon檢驗(yàn)。顯示的結(jié)果表示用BACE455、BACE501或模擬-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行的至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的熒光信號(hào)±SEM實(shí)施例5BACE455活性的特異性通過在良好表征的市售BACE501抑制劑，BACE抑制劑III存在下進(jìn)行β-分泌酶分析而評(píng)估BACE455對基于APP肽底物的特異性。更重要的是，利用劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，表明BACE455顯示明顯不同于BACE501的抑制分布。
材料和方法來自Calbiochem的BACE抑制劑III(H-Glu-Val-Asn-Statine-Val-Ala-Glu-Phe-NH2)(SEQ ID NO33)為BACE的底物類似抑制劑。之前顯示完全阻斷了來自BACE轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶解的膜組分中蛋白水解活性(Capel等.，J.Biol.Chem.2775637-43(2002))。抑胃肽A、抑凝乳蛋白酶素、E64c、亮肽素(Sigma)分別為組織蛋白酶D(及其他天冬氨酰蛋白酶)或絲氨酸蛋白酶以及半胱氨酰蛋白酶的抑制劑。
蛋白酶抑制劑以100μM的終濃度加至100μl的反應(yīng)緩沖液中(25mM MES/25mM乙酸鈉/25mM Tris，pH4.4)。當(dāng)用于指示時(shí)，該分析緩沖液具有4.4至8的pH。如實(shí)施例4獲得膜制備物并且與抑制劑一起在室溫下溫育10分鐘。隨后通過添加100μl包含底物的反應(yīng)緩沖液(15μM終濃度)起始反應(yīng)并且如實(shí)施例4中所述監(jiān)測。對于圖3的劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，在100μM至100nM的不同濃度范圍分析抑制劑III。
結(jié)果存在經(jīng)非BACE-特異性抑制劑對BACE455或BACE501過表達(dá)的微小抑制活性。此可歸結(jié)于分析期間共-純化的其他非BACE膜-結(jié)合的蛋白酶。然而，在BACE455或BACE501提取物中，底物裂解活性總的來說對抑胃肽和其它分別為組織蛋白酶D(及其他天冬氨酰蛋白酶)或絲氨酸和半胱氨酰蛋白酶的抑制劑的蛋白酶抑制劑都不是很敏感。這提示對底物裂解的非BACE蛋白水解活性是微小的。
相反，100μM的BACE抑制劑III完全消除了BACE455以及BACE501的活性，證實(shí)了對BACE-介導(dǎo)的熒光底物裂解的特異性。
表3不同抑制劑抑制BACE455的百分比
顯示的結(jié)果為BACE455、BACE501或模擬-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物加所示抑制劑(每種100μM)中裂解抑制±SEM的百分比。
為了進(jìn)一步研究BACE455的抑制分布并與BACE501比較，進(jìn)行劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)(參見圖3)。當(dāng)與模擬的轉(zhuǎn)染對照比較時(shí)，對于10μM濃度的抑制劑III，BACE455活性為36.04±4.13％(±SEM)而BACE501活性為57.6±3.12％(±SEM)。當(dāng)與模擬的轉(zhuǎn)染對照比較時(shí)，對于1μM濃度的抑制劑III，BACE455活性為57.52±9.08％(±SEM)而BACE501活性為85.15±2.93％(±SEM)。因此顯然對于給定的抑制劑濃度，BACE455比BACE501受到更小的抑制，其提示在抑制分布上BACE455明顯不同于BACE501以及與BACE501比較時(shí)BACE455中外顯子4的缺失產(chǎn)生了顯著的藥理學(xué)差異。
實(shí)施例6酸性pH為BACE455活性所需BACE為主要定位于高爾基體中以及核內(nèi)體區(qū)室中，并且在這些酸性區(qū)室中裂解APP的酸性天冬氨酰蛋白酶。BACE在6.0及以上的pH值時(shí)為幾乎無活性的(Vassar R.等.Science 286，735-741(1999)；Lin X.等.Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，1456-1460(2000))。這里，我們提供了支持新的BACE455變體呈現(xiàn)真實(shí)的β-分泌酶活性的另一個(gè)論據(jù)通過BACE-特異性裂解觀察到強(qiáng)pH的需求。
材料和方法如實(shí)施例4獲得膜制備物，并且在BACE抑制劑III(100μM終濃度)存在或缺乏時(shí)，在調(diào)節(jié)至4.4到8終pH的分析緩沖液(25mMMES/25mM乙酸鈉/25mM Tris)中溫育。通過添加100μl包含底物的(15μM終濃度)反應(yīng)緩沖液(4.4至8的pH)起始反應(yīng)并且如實(shí)施例4中所述監(jiān)測。在這些條件下測定了由抑制劑III抑制BACE的百分比。
結(jié)果BACE特異性抑制劑的抑制活性在pH4.4時(shí)迅速到最大值。在pH6和8時(shí)，觀察到非常高的底物裂解活性，不同于在pH4.4時(shí)，但其對BACE商品化抑制劑不敏感。此可能是由于在pH6.0或以上起作用的其他蛋白酶的補(bǔ)充而導(dǎo)致，已知BACE在pH6或以上明顯無活性。這些數(shù)據(jù)表明該分析允許僅在文獻(xiàn)中已知的，與BACE生物活性相關(guān)pH時(shí)，BACE455和BACE501分泌酶活性的選擇性劑量。此外，結(jié)果證實(shí)BACE455表現(xiàn)出與BACE501類似的對活性的酸性pH依賴性。
表4抑制劑-敏感的底物V通過表達(dá)BACE455和BACE501細(xì)胞的水解為pH-依賴的。
顯示的結(jié)果為用調(diào)節(jié)至不同pH的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行的BACE455或BACE501細(xì)胞提取物中裂解抑制的平均百分比。
因此，BACE455和BACE501，當(dāng)同樣在HEK293細(xì)胞中表達(dá)并且利用相同的條件純化時(shí)，也在利用相同分析條件的蛋白質(zhì)水解分析中裂解Swedishβ-分泌酶肽。
實(shí)施例7BACE455和BACE501對內(nèi)源表達(dá)的APP異構(gòu)型加工的作用APP的蛋白水解加工分為致淀粉樣的和抗致淀粉樣的途徑。在致淀粉樣途徑中，APP通過BACE的裂解在Aβ結(jié)構(gòu)域的N-末端發(fā)生并且產(chǎn)生分泌的sAPPβ以及99個(gè)氨基酸(C99)11,145道爾頓分子量的APP的C末端片段。C99進(jìn)一步在其跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)由γ-分泌酶裂解，導(dǎo)致Aβ肽的分泌和APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域AICD的產(chǎn)生。在抗致淀粉樣途徑中，APP通過α-分泌酶在Aβ肽內(nèi)的裂解產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)性的和神經(jīng)保護(hù)的sAPPα。
加工來自APP的Aβ肽的人細(xì)胞系提供了在細(xì)胞分析中篩選β-分泌酶的活化劑和抑制劑的工具。雖然APP的表達(dá)以及內(nèi)源APP的加工和Aβ肽的釋放是低的，SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(ATCC，CRL-2266)為檢測APP加工和C99和Aβ肽產(chǎn)生的有效體系。
材料和方法哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和克隆的選擇用于轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中生長至80％鋪滿。利用LipofectAmine Plus(Gibco-BRL)和4pcDNA3DNA每10*10<6>細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后三天，細(xì)胞傳代入包含400μg/ml濃度G418的培養(yǎng)基中。在選擇培養(yǎng)基中生長二十天后，選擇單個(gè)克隆并且接入包含添加G418的生長培養(yǎng)基的96孔平皿的每個(gè)孔中?？寺?6孔平皿擴(kuò)大至24孔平皿隨后至6孔平皿。已失去原始神經(jīng)元-樣形態(tài)的克隆不擴(kuò)增。所選的克隆中BACE455或BACE501的表達(dá)通過利用C末端-特異性抗體的Western印跡法和免疫組織化學(xué)分析而進(jìn)行測定。最終的細(xì)胞系表現(xiàn)出最高的BACE455或BACE501表達(dá)水平并且已在400μg/ml G418中每隔三日傳代入新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
細(xì)胞提取物的制備，Western印跡方案接種3天后收集細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗滌兩次并且在1ml添加蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics)的CellLytic溶液(Sigma)中裂解15分鐘。裂解物轉(zhuǎn)入1.5ml微量離心管并且在1,500rpm離心5分鐘。上清作為細(xì)胞提取物在-80℃儲(chǔ)存。來自用BACE455或?qū)φ蛰d體(模擬的)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物的等份(20μg)通過12％Bis-Tris NOVEX凝膠(Invitrogen)電泳。分離多肽至PVDF膜的電轉(zhuǎn)移后，APP和C99蛋白水解片段用1/500在PBS-Tween200.1％中的C末端-特異性兔抗-APP抗體(Serotec，UK)檢測，并且抗體-抗原復(fù)合物利用堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-兔抗體(1/5000)觀察。初級(jí)抗體識(shí)別的序列對應(yīng)于C99片段的氨基酸85-99。細(xì)胞中，初級(jí)抗體還檢測到遷移至約45kD的非特異性條帶。
結(jié)果用抗生素G418選擇后，BACE455對來自內(nèi)源表達(dá)的APP異構(gòu)型的C99片段產(chǎn)生的作用在轉(zhuǎn)化體有表達(dá)BACE455的構(gòu)建體或用空載體(模擬的)轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞中轉(zhuǎn)化體(圖4)進(jìn)行評(píng)估。相比用空載體DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，用BACE455構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中C99的產(chǎn)生強(qiáng)烈增高。此與內(nèi)源APP在殘基Asp-1處以類似于BACE501中所述的方式提高的蛋白質(zhì)水解相對應(yīng)。此外，如文獻(xiàn)中對BACE501的報(bào)道，BACE455的過表達(dá)對APP水平?jīng)]有影響。
實(shí)施例8布雷菲德菌素和Gleevec對內(nèi)源APP異構(gòu)型的BACE455-依賴的加工的抑制作用干涉BACE活性以及APP加工的一種途徑為真菌代謝物布雷菲德菌素A(BFA)的利用，其促進(jìn)順式、中間和反式高爾基體(而不是TGN)與ER的融合(Lippincott-Schwartz等.Cell 67601-616(1991))，或破壞高爾基體內(nèi)運(yùn)輸?shù)哪芫氐睦?Dinter等.Histochem.CellBiol.109571-590(1998))。兩種藥物不僅影響APP加工，而且影響B(tài)ACE前肽在高爾基體內(nèi)通過抑制通過ER和高爾基體的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)某?。因此，BFA存在時(shí)，BACE的過表達(dá)導(dǎo)致C99產(chǎn)生的降低(Fischer等.J.Neurochem.801079(2002))。
Gleevec(imatinib甲磺酸鹽)為選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，其由于阻斷β-分泌酶-介導(dǎo)的APP的裂解而可抑制Aβ的釋放(Netzer等.Proc Natl Acad Sci USA 10012444-12449(2003))。Gleevec為調(diào)控細(xì)胞骨架、軸突發(fā)育和樹突發(fā)生的Bcr-Abl抑制劑(Jones等.J.Neurosci 248510-8521(2004))。因此，Gleevec已檢驗(yàn)為經(jīng)BACE，通過影響細(xì)胞細(xì)胞骨架和胞內(nèi)運(yùn)輸，由此阻止APP和BACE加工而最終調(diào)控C99產(chǎn)生的藥理學(xué)試劑。
材料和方法BACE455SH-SY5Y細(xì)胞如實(shí)施例7中處理。接種后3天收集細(xì)胞并且如上述處理用于Western印跡實(shí)驗(yàn)。對于BFA和Gleevec處理，分別在最后的8小時(shí)期間以10μg/ml以及在最后的24小時(shí)期間以10μM處理細(xì)胞。
結(jié)果為了檢驗(yàn)BFA是否以類似于已報(bào)道的BACE501的方式在BACE455細(xì)胞中干擾C99的產(chǎn)生，用BFA或Gleevec處理BACE455細(xì)胞并且細(xì)胞裂解物經(jīng)受利用C末端-特異的兔抗-APP抗體的Western印跡(圖5)。不出所料，在不僅影響APP加工，而且影響B(tài)ACE加工的BFA存在時(shí)，BACE的過表達(dá)導(dǎo)致C99產(chǎn)生的降低。此表明BACE455呈現(xiàn)與BACE501類似的通過ER-高爾基體的加工。
BACE455細(xì)胞的Gleevec處理也強(qiáng)烈降低了C99肽的產(chǎn)生。雖然不清楚作用機(jī)理，其可能涉及對BACE定位的作用或以可能通過胞內(nèi)運(yùn)輸和加工的改變而阻止APP與BACE455相互作用的方式對APP的作用。
實(shí)施例9BACE455和BACE501對來自內(nèi)源表達(dá)的APP異構(gòu)型的Aβ肽產(chǎn)生的作用加工來自APP的Aβ肽的人細(xì)胞系提供了在細(xì)胞分析中篩選β-分泌酶的活化劑和抑制劑的工具。多個(gè)亞細(xì)胞部位負(fù)責(zé)不同Aβ肽的產(chǎn)生。反式-高爾基體網(wǎng)主要產(chǎn)生Aβ1-40(Xu等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.943748-3752(12997)，Hartmann等.，Nat.Med.31016-1020(1997))，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/中間體區(qū)室產(chǎn)生Aβ1-42(Lee等.，J.Biol.Chem.，Vol.2784458-4466(2003)，Greenfield等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，742-747(1999))。Aβ肽的產(chǎn)生和釋放入培養(yǎng)物上清中可通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)監(jiān)測。雖然APP的表達(dá)以及內(nèi)源APP的加工和Aβ肽的釋放是低的，SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(ATCC，CRL-2266)為檢測Aβ加工的有效體系。對此，可利用指示細(xì)胞提取物、血清、培養(yǎng)基中Aβ體外定量的異構(gòu)型-特異的ELISA。ELISA試劑盒的實(shí)例為來自BioSource International的異構(gòu)型-特異的Aβ1-40ELISA。
通常，常規(guī)條件中培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞分泌約40pg/ml的Aβ1-40，其正好處于分析的檢測限制和線性范圍中(Takahashi等.，J.Biol.Chem.27818664-70(2003))。相反，Aβ1-42的產(chǎn)生弱于Aβ1-40并且因此在不過表達(dá)APP時(shí)檢測不到。
AβELISA分析(對Aβ1-40的雙抗體夾心ELISA)接種后72小時(shí)收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清在標(biāo)準(zhǔn)的雙抗異構(gòu)型-特異的Aβ1-40ELISA(BioSource International)中進(jìn)行如下分析。捕獲兔抗體特異于Aβ呈遞的抗原表位并且已涂布至96孔微量滴定板。檢測抗體特異于Aβ1-40并且偶聯(lián)的二抗為偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的抗-兔IgG。合成的人Aβ1-40標(biāo)準(zhǔn)肽在提供用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品稀釋劑(diluant)中連續(xù)稀釋。稀釋后肽的濃度為100μl/孔體積中1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6和0.0pg/ml。
為了進(jìn)行條件培養(yǎng)基中的定量，含有1μM金屬內(nèi)蛋白酶抑制劑膦酰二肽的5ml DMEM通過一個(gè)3.5*106SH-SY5Y細(xì)胞(接種密度)的10cm平皿條件化培養(yǎng)17小時(shí)并且在低速離心5分鐘以除去細(xì)胞碎片(Haugabook等.，J.Neurosci.Methods.108171-179(2001))。人Aβ1-40標(biāo)準(zhǔn)樣品，以及100μl/孔樣品，例如所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在洗滌平皿后加入。平皿在4℃過夜孵育。第二天，洗滌平皿4次后，加入100μl/孔的兔檢測抗體并且在軌道平皿振蕩器上20℃溫育2小時(shí)。4次洗滌后，使用100μl/孔的抗-兔IgG-辣根過氧化酶抗體(1∶100稀釋)并且在室溫下振蕩溫育2小時(shí)。最近5次洗滌后作為生色團(tuán)底物加入100μl/孔的四甲基聯(lián)苯胺并且在室溫下暗處進(jìn)行20分鐘的顯色。加入100μl/孔終止溶液并且2小時(shí)內(nèi)在450nm讀取每孔的吸光度，每種生色團(tuán)的100μl溶液和終止溶液作為空白。所有標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品進(jìn)行3次。從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷具有落入標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)吸光值的樣品(通過與在相同的平皿上分析的A-β40和A-β42標(biāo)準(zhǔn)肽而獲得的值相比較)并且以pg/ml培養(yǎng)基表示。
結(jié)果在用表達(dá)BACE455或BACE501的構(gòu)建體或用空載體(模擬的)轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞中在轉(zhuǎn)化體用抗生素G418選擇后評(píng)估BACE455或BACE501對來自內(nèi)源表達(dá)的APP產(chǎn)生Aβ肽的作用。相比用空載體DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，用BACE455或BACE501構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中Aβ1-40的產(chǎn)生提高了兩倍。收集自用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中Aβ1-40的水平為43.21+1.46pg/ml，正好處于分析線性范圍內(nèi)的值。表示為對照(用空載體DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)百分比，從用BACE455或BACE501轉(zhuǎn)染的細(xì)胞釋放的Aβ1-40分別為199.95+18％和193.15+2.73(兩者均p＜0.001)。此表明如BACE501那樣，BACE455促進(jìn)來自內(nèi)源表達(dá)APP的Aβ的加工和釋放。在不僅影響APP加工而且影響B(tài)ACE加工的BFA，以及Aβ1-40源自其的C99片段產(chǎn)生存在時(shí)，條件培養(yǎng)基中Aβ1-40的水平與模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的類似。BACE455細(xì)胞的Gleevec處理也強(qiáng)烈降低Aβ1-40的釋放。Gleevec已顯示阻斷β-分泌酶-介導(dǎo)的APP的裂解(Netzer等.Proc Natl Acad SciUSA 10012444-12449(2003))，其為產(chǎn)生Aβ1-40所必需。因此，結(jié)果表明Gleevec的作用不僅涉及β-分泌酶-介導(dǎo)的APP裂解的降低，而且以阻止APP與BACE455相互作用的方式產(chǎn)生對BACE或APP的胞內(nèi)運(yùn)輸和加工即對其的定位的影響。
總起來說，這些數(shù)據(jù)證實(shí)BACE455在β分泌酶部位直接作用而裂解APP，并且在細(xì)胞內(nèi)該異構(gòu)型和BACE501之間的裂解速率并不顯著不同。然而，BACE455的活性依賴胞內(nèi)運(yùn)輸和加工并且可由布雷菲德菌素A和Gleevec抑制。BACE455因此為患有阿爾茨海默氏病的病人腦中表達(dá)的有活性的APP-裂解蛋白酶。因此，本申請人認(rèn)為BACE455導(dǎo)致負(fù)責(zé)阿爾茨海默氏病發(fā)展的致淀粉樣Aβ肽的累積。
表5轉(zhuǎn)染BACE455或BACE501質(zhì)粒DNA對Aβ釋放的效果
*p＜0.05，Wilkoxon檢驗(yàn)。表中的值為Aβ釋放±SEM的百分比，對照設(shè)為100％表1引物序列的列表
Refseq(NCBI參照序列)上的位置指BACE501核酸序列上(NM_012104)引物的位置。RefSeq為基因鑒定和表征、突變分析、表達(dá)研究、多態(tài)性發(fā)現(xiàn)和比較分析的參照。參照序列(RefSeq)的集合提供了主要研究的生物體的序列，包括基因組DNA、轉(zhuǎn)錄本(RNA)和蛋白質(zhì)產(chǎn)物的全面、綜合、非冗余的組。
序列表<110>?？松Ｌ蒯t(yī)療股份有限公司(EXONHIT THERAPEUTICS SA)<120>BACE455，人β-分泌酶的可變剪接變體(Compositions a，d methods to inhibit the production of Abeta peptide)<130>SCT061608-66<150>US 60/517,401<151>2003-11-06<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1368<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(1368)<223>
<400>1atg gcc caa gcc ctg ccc tgg ctc ctg ctg tgg atg ggc gcg gga gtg48Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val1 5 10 15ctg cct gcc cac ggc acc cag cac ggc atc cgg ctg ccc ctg cgc agc96Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser20 25 30ggc ctg ggg ggc gcc ccc ctg ggg ctg cgg ctg ccc cgg gag acc gac 144Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp35 40 45gaa gag ccc gag gag ccc ggc cgg agg ggc agc ttt gtg gag atg gtg 192Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val50 55 60gac aac ctg agg ggc aag tcg ggg cag ggc tac tac gtg gag atg acc 240Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr65 70 75 80gtg ggc agc ccc ccg cag acg ctc aac atc ctg gtg gat aca ggc agc 288Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser85 90 95
agt aac ttt gca gtg ggt gct gcc ccc cac ccc ttc ctg cat cgc tac336Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr100 105 110tac cag agg cag ctg tcc agc aca tac cgg gac ctc cgg aag ggt gtg384Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val115 120 125tat gtg ccc tac acc cag ggc aag tgg gaa ggg gag ctg ggc acc gac432Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp130 135 140ctg gta agc atc ccc cat ggc ccc aac gtc act gtg cgt gcc aac att480Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile145 150 155 160gct gcc atc act gaa tca gac aag ttc ttc atc aac ggc tcc aac tgg528Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp165 170 175gaa ggc atc ctg ggg ctg gcc tat gct gag att gcc agg atc att gga576Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Ile Ile Gly180 185 190ggt atc gac cac tcg ctg tac aca ggc agt ctc tgg tat aca ccc atc624Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile195 200 205cgg cgg gag tgg tat tat gag gtc atc att gtg cgg gtg gag atc aat672Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn210 215 220gga cag gat ctg aaa atg gac tgc aag gag tac aac tat gac aag agc720Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser225 230 235 240att gtg gac agt ggc acc acc aac ctt cgt ttg ccc aag aaa gtg ttt768Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe245 250 255gaa gct gca gtc aaa tcc atc aag gca gcc tcc tcc acg gag aag ttc816Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe260 265 270cct gat ggt ttc tgg cta gga gag cag ctg gtg tgc tgg caa gca ggc864Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly275 280 285acc acc cct tgg aac att ttc cca gtc atc tca ctc tac cta atg ggt912Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly
290 295 300gag gtt acc aac cag tcc ttc cgc atc acc atc ctt ccg cag caa tac960Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr305 310 315 320ctg cgg cca gtg gaa gat gtg gcc acg tcc caa gac gac tgt tac aag 1008Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys325 330 335ttt gcc atc tca cag tca tcc acg ggc act gtt atg gga gct gtt atc 1056Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile340 345 350atg gag ggc ttc tac gtt gtc ttt gat cgg gcc cga aaa cga att ggc 1104Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly355 360 365ttt gct gtc agc gct tgc cat gtg cac gat gag ttc agg acg gca gcg 1152Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala370 375 380gtg gaa ggc cct ttt gtc acc ttg gac atg gaa gac tgt ggc tac aac 1200Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn385 390 395 400att cca cag aca gat gag tca acc ctc atg acc ata gcc tat gtc atg 1248Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met405 410 415gct gcc atc tgc gcc ctc ttc atg ctg cca ctc tgc ctc atg gtg tgt 1296Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys420 425 430cag tgg cgc tgc ctc cgc tgc ctg cgc cag cag cat gat gac ttt gct 1344Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala435 440 445gat gac atc tcc ctg ctg aag tga 1368Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys450 455<210>2<211>455<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser20 25 30Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp35 40 45Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val50 55 60Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr65 70 75 80Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser85 90 95Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr100 105 110Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val115 120 125Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp130 135 140Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile145 150 155 160Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp165 170 175Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Ile Ile Gly180 185 190Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile195 200 205
Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn210 215 220Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser225 230 235 240Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe245 250 255Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe260 265 270Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly275 280 285Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly290 295 300Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr305 310 315 320Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys325 330 335Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile340 345 350Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly355 360 365Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala370 375 380Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn385 390 395 400Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met405 410 415
Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys420 425 430Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala435 440 445Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys450 455<210>3<211>6<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>13aggcatcctg 10<210>14<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>14gggctggcct 10<210>15<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>15atgctgagat 10<210>16<211>6<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>16tgccag 6<210>17<211>6<212>DNA<213>artificial sequence
<220>
<223>primer<400>17gatcat 6<210>18<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>18tggaggtatc 10<210>19<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>19gaccactcgc 10<210>20<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>20tgtacacagg 10<210>21<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer
<400>21cagtctctgg 10<210>22<211>6<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>22caggat 6<210>23<211>8<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>23ccaggatc8<210>24<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>24gccaggatca 10<210>25<211>18<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>25attgccagga tcattgga18
<210>26<211>21<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>26tgactgggaa caccccataa c21<210>27<211>19<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>27agttgtgcat gggagcgag 19<210>28<211>19<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>28cccgcagacg ctcaacatc 19<210>29<211>21<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>29cagcgagtgg tcgatacctc c21<210>30<211>24
<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>30gcggatccac catggcccaa gccc 24<210>31<211>33<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>31ggggaattca cttcagcagg gagatgtcat cag 33<210>32<211>10<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>fluorogenic APP-based peptide MCA<220>
<221>MOD_RES<222>(10)..(10)<223>AMIDATION<400>32Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種包括BACE455全部或特有片段的分離的多肽。
2.權(quán)利要求的多肽，包括氨基酸序列SEQ ID NO2的全部或特有片段。
3.權(quán)利要求2的多肽，其包括選自SEQ ID Nos 3-11的氨基酸序列。
4.一種編碼權(quán)利要求1、2或3的多肽的分離的多核苷酸。
5.權(quán)利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO1的序列。
6.包括權(quán)利要求4或5的多核苷酸的載體。
7.核酸探針，選自a)選擇性雜交至編碼BACE455多肽或其特有片段的第二核酸的第一核酸，和b)與所述的第一核酸精確互補(bǔ)的第三核酸。
8.可用于擴(kuò)增編碼BACE455多肽的核酸分子的至少一個(gè)特有片段的核酸引物。
9.抑制性核酸分子，其中所述分子在生理?xiàng)l件下雜交至編碼BACE455多肽的核酸分子并且選擇性抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯。
10.包括權(quán)利要求4的多核苷酸或權(quán)利要求6的載體的宿主細(xì)胞。
11.一種多核苷酸，選自a)包括在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至SEQ ID NO1所示核酸序列的第一核苷酸序列的核酸，和b)包括與所述的第一核苷酸序列精確互補(bǔ)的第二核苷酸序列的核酸。
12.能選擇性結(jié)合BACE455多肽或其特有片段的配體。
13.權(quán)利要求12的配體，其包括選自抗體、抗體片段或抗體衍生物的多肽。
14.權(quán)利要求13的多肽，其結(jié)合BACE455多肽的特有片段。
15.一種BACE455抑制劑，其中所述抑制劑抑制BACE455多肽或核酸的表達(dá)或活性。
16.一種藥物組合物，包括BACE455抑制劑和藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)。
17.一種治療或預(yù)防受試者神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥的方法，該方法包括給所述受試者施用有效量的BACE455抑制劑。
18.一種治療或預(yù)防受試者Aβ肽產(chǎn)生或累積的方法，該方法包括給所述受試者施用有效量的BACE455抑制劑。
19.一種選擇、表征、篩選或優(yōu)化生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括將試驗(yàn)化合物與BACE455核酸、多肽或所述核酸或多肽的特有片段接觸，并且測定所述試驗(yàn)化合物是否結(jié)合所述BACE455核酸或多肽或調(diào)控所述BACE455核酸或多肽的活性。
20.一種檢測受試者神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥存在或易感性的方法，該方法包括檢測來自受試者的樣品中BACE455核酸或多肽的存在。
21.一種評(píng)估受試者對神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥治療應(yīng)答的方法，該方法包括檢測來自受試者的樣品中BACE455核酸或多肽的存在。
22.一種測定受試者的神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥治療效力的方法，該方法包括(i)測定取自所述治療期間或之后所述受試者的樣品中BACE455核酸或多肽的存在和/或豐度，和(ii)將所述存在和/或豐度與來自治療之前或早期的所述受試者的參照樣品相比較。
23.一種用于制備結(jié)合BACE455多肽的抗體的方法，該方法包括用BACE455多肽或其特有片段免疫非-人動(dòng)物，并且收集來自所述動(dòng)物的抗體或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
24.一種制備含有BACE455抑制劑的組合物的方法，該方法包括iv)選擇抑制BACE455的化合物，v)產(chǎn)生所述化合物，和vi)將所述化合物與其藥學(xué)可接受的鹽混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)、生物化學(xué)、藥物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明更尤其公開了參與神經(jīng)病理學(xué)病癥的人基因變體的鑒定，和用于所述疾病和相關(guān)病癥的診斷、預(yù)防和治療以及用于治療活性藥物篩選的方法。本發(fā)明涉及催化活性的β－分泌酶(Memapsin2，BACE)變體，和編碼其的核酸。本發(fā)明可用于鑒定抑制特定BACE異構(gòu)型的活性的試劑和影響神經(jīng)病理學(xué)病癥，包括阿爾茨海默氏病和癡呆的發(fā)生、發(fā)展或進(jìn)展的試劑和療法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1875100SQ200480032656
公開日2006年12月6日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月6日
發(fā)明者勞倫特·德西雷 申請人:?？松Ｌ蒯t(yī)療股份有限公司