專(zhuān)利名稱(chēng)：可中和的hgf表位和與其結(jié)合的中和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)與其受體結(jié)合的HGF的可中和表位，以及抗HGF的中和抗體，其作為單獨(dú)試劑通過(guò)與所述的可中和的HGF表位結(jié)合而能夠中和HGF。
背景技術(shù)：
HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)是由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的多功能的異二聚體多肽。HGF由含有N端結(jié)構(gòu)域和連接到絲氨酸蛋白酶樣β鏈C端結(jié)構(gòu)域的4個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域的α鏈組成(參見(jiàn)圖1)。人HGF以無(wú)生物活性的單鏈前體形式合成，其由728個(gè)氨基酸組成，該氨基酸具有在成熟蛋白中不存在的29氨基酸信號(hào)肽。生物學(xué)活性的HGF通過(guò)特異的細(xì)胞外血清絲氨酸蛋白酶在R494殘基切割而獲得。這樣獲得的活性HGF是具有全部活性的異源二聚體，其由二硫鍵連接的69kDa的α鏈和34kDa的β鏈組成。然而，目前還不清楚HGF全面的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且也沒(méi)有闡明究竟是這些結(jié)構(gòu)中的哪一個(gè)對(duì)HGF的特異功能起作用(Maulik等，Cytokine & Growth Factor Reviews 13(1)1-59，2002)。
HGF與其受體Met的結(jié)合誘導(dǎo)多種細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)和分布，介導(dǎo)上皮間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及管和腔的形成，并促進(jìn)血管發(fā)生。Met和HGF基因敲除的小鼠都是胚胎致死的并表現(xiàn)出在胎盤(pán)，胎肝和肢/肌肉形成的發(fā)育缺陷(Cao等，PNAS 98(13)7443-7448，2001，Gmyrek等，AmericanJournal of Pathology 159(2)579-590，2001)。
Met首先作為人致癌基因trp-met的產(chǎn)物而被分離，其編碼具有轉(zhuǎn)化活性的修飾的(altered)組成型活性的蛋白激酶。Met活性還體現(xiàn)在能顯著增強(qiáng)癌癥物質(zhì)從其刺激影響的突起處轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，例如血管發(fā)生，細(xì)胞遷移以及細(xì)胞表面蛋白酶調(diào)控(Wielenga等，American Journal ofPathology 157(5)1563-1573，2000)。由于Met被報(bào)道在多種人肝、前列腺、結(jié)腸、乳腺、腦和皮膚的癌癥中過(guò)量表達(dá)(Maulik等，見(jiàn)上)，其被視為重要的預(yù)防和治療癌癥的靶分子。而且，據(jù)報(bào)道，瘧疾的感染通過(guò)分泌的HGF而依賴于HGF受體的活性，因此，HGF及其受體被認(rèn)為是預(yù)防瘧疾的新方法的潛在的靶分子(Carrolo M等，Nat.Med.9(11)1363-1369，2003)。還發(fā)現(xiàn)這樣的可能性，即HGF可能與阿爾茨海默癥中發(fā)生的病理改變相關(guān)(Fenton H等，Brain Res.779(1-2)262-270，1998)。此外，還發(fā)現(xiàn)HGF明確的參與了增強(qiáng)皮膚傷口愈合的過(guò)程，包括再生上皮形成，新生血管和顆粒組織形成(Yoshida S等，J.Invest.Dermatol.120(2)335-343，2003)。
同時(shí)，在癌癥的發(fā)展和擴(kuò)散中發(fā)揮關(guān)鍵作用的腫瘤相關(guān)生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子及其受體的選擇性中和是具有吸引力的開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物的策略。最近，使用諸如組合的抗體文庫(kù)的噬菌體展示的重組抗體技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于這些靶分子的多種治療單克隆抗體(mAbs)，例如赫賽汀Herceptin，以及抗促血管生成素(angiopoietin)人單抗。
眾所周知，抗HGF的多克隆抗體封閉了HGF的多種生物學(xué)功能。另外，最近報(bào)道，在動(dòng)物模型中，抗HGF的中和單抗的混合物顯示出抗腫瘤的活性(Cao等，PNAS 198(13)7443-7448，2001)。特別的，Cao等發(fā)現(xiàn)為了在體內(nèi)和體外抑制HGF活性，需要阻斷三或更多的表位，可能兩個(gè)用于Met受體并且一個(gè)用于肝磷脂，在體外實(shí)驗(yàn)中，至少3個(gè)單抗的混合物能夠中和HGF。
然而，作為單一試劑的能中和HGF并在體外抑制細(xì)胞擴(kuò)散的單克隆抗體還未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供抑制HGF和其受體結(jié)合的可中和的HGF表位。
本發(fā)明其它的目的還提供編碼所述可中和表位的多聚核苷酸；抗HGF的中和抗體，其作為單一試劑通過(guò)與所述可中和表位的結(jié)合而能夠中和HGF；所述中和抗體在預(yù)防和治療頑固疾病和癌癥中的用途；用于預(yù)防和治療頑固疾病和癌癥的包括所述中和抗體和藥學(xué)可接受載體的藥學(xué)組合物；用于預(yù)防和治療頑固疾病和癌癥的方法，其包括將所述中和抗體給藥于患者。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供含有SEQ ID NO32或33的氨基酸序列的可中和的HGF表位。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供抗HGF的與所述可中和的表位結(jié)合的中和抗體，其包括含有SEQ ID NO27或29的氨基酸序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO28或30的氨基酸序列的VL區(qū)。


當(dāng)通過(guò)下述說(shuō)明書(shū)與附圖聯(lián)合描述時(shí)，本發(fā)明的上述和其它目的和特征將變得顯而易見(jiàn)，所述附圖分別表示圖1HGF的結(jié)構(gòu)圖2用于抗體文庫(kù)構(gòu)建的噬菌粒載體pComb3X的基因圖譜A在噬菌粒表面展示Fab的情況B在噬菌粒表面展示scFv或微型雙功能抗體(Diabody)的情況，圖3在培養(yǎng)HGF結(jié)合克隆的過(guò)程中，通過(guò)淘選(panning)富集展示特異結(jié)合HGF的Fab的噬菌體庫(kù)，圖4用考馬斯亮蘭檢測(cè)的純化的Fab片段的結(jié)果，1標(biāo)記，2非還原克隆68抗體(50,000Da)3.還原克隆68抗體(25,000Da)圖5蛋白印跡分析的結(jié)果，以檢測(cè)純化的Fab片段是否表達(dá)，圖6含有本發(fā)明的可中和的表位的噬菌體與c-MET結(jié)合的水平，1.含有SEQ ID NO32肽的噬菌體，2.含有SEQ ID NO33肽的噬菌體，3和4.不含有SEQ ID NO32或33肽的對(duì)照噬菌體，圖7克隆61和68Fabs分別與HGF的特異結(jié)合，圖8克隆61和68分別限定的本發(fā)明的可中和的表位的構(gòu)象依賴性A克隆61
B克隆68，泳道1非還原HGF，泳道2還原HGF圖9a表示范圍為1級(jí)到6級(jí)的細(xì)胞擴(kuò)散水平的標(biāo)準(zhǔn)圖9b擴(kuò)散鑒定的結(jié)果，顯示隨著加入的HGF濃度，抗HGF Fab和抗人Fab抗體的擴(kuò)散水平的改變，圖10隨著注入克隆68抗體的量，與固定在CM5傳感器芯片上的HGF結(jié)合的克隆68抗體的量增加I非特異Fab的注入II注入50nM克隆68抗體III注入100nM克隆68抗體IV注入200nM克隆68抗體V注入400nM克隆68抗體VI注入600nM克隆68抗體圖11克隆68抗體抑制HGF與c-Met的結(jié)合，I注入50nM的HGFII注入與50nM克隆68抗體混合的50nM的HGFIII注入與250nM克隆68抗體混合的50nM的HGFIV注入與500nM克隆68抗體混合的50nM的HGFV注入與1uM克隆68抗體混合的50nM的HGFVI注入與1.5uM克隆68抗體混合的50nM的HGF圖12可溶的c-Met抑制HGF與c-Met的結(jié)合I注入50nM的HGFII注入與50nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFIII注入與100nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFIV注入與200nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFV注入與400nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFVI注入與600nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF
發(fā)明詳述如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“可中和的表位”包括任何蛋白決定簇，其能夠抑制HGF與其受體c-Met的結(jié)合。表位決定簇通常由諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的具有化學(xué)活性的表面分子基團(tuán)組成，并通常具有特異的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征，以及特異的電荷特點(diǎn)。優(yōu)選，本發(fā)明的可中和的表位是包含SEQ ID NO32或33的氨基酸序列的多肽。
術(shù)語(yǔ)“中和抗體”指能夠特異結(jié)合HGF可中和的表位的抗體，并且充分地抑制或消除HGF的生物活性。典型的中和抗體將能至少抑制此HGF生物活性的大約50％，優(yōu)選大于80％。本發(fā)明的中和抗體在治療應(yīng)用，即預(yù)防或治療頑固疾病和癌癥中特別有用。
本發(fā)明提供含有SEQ ID NO32或33的氨基酸序列的多肽，其功能是作為HGF的可中和的表位。
為了制備根據(jù)本發(fā)明的HGF的可中和的表位，實(shí)施ELISA方法檢測(cè)是否來(lái)自用HGF免疫的動(dòng)物的抗血清能夠與重組的人HGF結(jié)合；并且該方法顯示來(lái)自HGF免疫動(dòng)物的抗血清特異地與HGF結(jié)合。然后，提取HGF免疫動(dòng)物的總RNA并進(jìn)行cDNA合成。
為了擴(kuò)增含有兔輕鏈(VL)(Vκ，Vλ)和重鏈(VH)的可變區(qū)以及含有人Cκ和CH1的保守區(qū)，通過(guò)使用合成的cDNA作為模板和結(jié)合SEQ ID NO1到20的引物而實(shí)施PCRs，然后，通過(guò)使用上述獲得的PCR產(chǎn)物作為模板而擴(kuò)增兔/人輕和重鏈的嵌合抗體。在擴(kuò)增的兔VL和VH序列與擴(kuò)增的人Cκ和CH1序列結(jié)合之后，最終編碼抗體片段(Fab)文庫(kù)的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)表達(dá)載體，并將得到的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌，以構(gòu)建嵌合的兔/人Fab文庫(kù)。本發(fā)明中使用的載體和宿主細(xì)胞包括本領(lǐng)域中常規(guī)使用的所用的表達(dá)載體和大腸桿菌菌株而沒(méi)有限制，但優(yōu)選使用噬菌粒載體pComb3X(Scripps研究中心，CA，USA)作為表達(dá)載體和大腸桿菌ER2537(NEB)作為宿主細(xì)胞。
使用HGF包被的ELISA板和抗人山羊Fab多克隆抗體而通過(guò)EIA方法選擇含有抗HGF Fab的噬菌體克隆。上述選出的噬菌體克隆命名為H61(克隆61)和H68(克隆68)。
分別對(duì)H61和H68克隆進(jìn)行核酸測(cè)序，并通過(guò)分析核酸序列確定其氨基酸序列。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)染料標(biāo)記引物測(cè)序方法實(shí)施核酸測(cè)序(Chung等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.128641-649，2002)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H61克隆包括分別含有SEQ ID NOs23和24核苷序列的VH和VL區(qū)；而H68克隆包括分別含有SEQ ID NOs25和26核苷序列的VH和VL區(qū)。
從分析的核苷序列得出的H61和H68克隆的VH和VL區(qū)分別的氨基酸序列提示H61克隆包括含有SEQ ID NOs28的氨基酸序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NOs28的氨基酸序列的VL區(qū)，而H68克隆，VH區(qū)含有SEQID NOs29的氨基酸序列和VL區(qū)含有SEQ ID NOs30的氨基酸序列。
對(duì)H61和H68克隆的氨基酸序列中結(jié)構(gòu)區(qū)(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)分析顯示，H61和H68克隆的每個(gè)VH和VL區(qū)含有4個(gè)FRs和3CDRs(參見(jiàn)表2)。
為了確定HGF的可中和的表位，通過(guò)使用組合肽文庫(kù)的噬菌體展示通過(guò)淘選富集H61和H68克隆，使用抗HGF H61 Fab或抗HGF H68Fab和抗HGF H61 Fab-或抗HGF H68 Fab-包被的ELISA板對(duì)如此擴(kuò)增的噬菌體庫(kù)進(jìn)行EIA檢測(cè)。然后選擇對(duì)抗HGF H61和H68 Fabs顯示有結(jié)合親和性的噬菌體克隆。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用PHD肽庫(kù)(New England Biolab)作為肽庫(kù)。
選出的噬菌體克隆進(jìn)行核苷測(cè)序，而從分析的核苷測(cè)序推斷出的氨基酸序列含有SEQ ID NO32和33的氨基酸序列，其被發(fā)現(xiàn)與c-MET結(jié)合(參見(jiàn)圖6)。這些結(jié)果提示抗HGF抗體H61或H68的抗原結(jié)合位點(diǎn)模仿了c-MET的HGF結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合抗HGF抗體H61或H68的SEQID NO32和33的肽模仿了HGF的c-MET結(jié)合位點(diǎn)。因此，本發(fā)明的SEQID NO32和33的肽能夠具有作為HGF可中和的表位的功能。
另外，本發(fā)明提供編碼所述可中和的表位的多聚核苷酸。特別地，所述可中和的表位含有SEQ ID NO34或35的核苷序列。
此外，本發(fā)明提供抗HGF的中和抗體，其通過(guò)結(jié)合作為HGF可中和的表位的SEQ ID NO32或33的肽而能夠中和HGF。
本發(fā)明的中和抗體可以是嵌合抗體，單克隆抗體或人源化抗體。
嵌合抗體是包含人或非人部分的免疫球蛋白分子。特別地，嵌合抗體的抗原結(jié)合區(qū)(可變區(qū))來(lái)自非人源(例如小鼠、兔、家禽)，而賦予免疫球蛋白生物效應(yīng)器功能的嵌合抗體的保守區(qū)來(lái)自人源。嵌合抗體應(yīng)該含有非人抗體分子的抗原結(jié)合特異性和由人抗體分子賦予的效應(yīng)器功能。
一般而言，用于制備嵌合抗體的方法包括下述步驟a鑒定和克隆編碼抗體分子抗原結(jié)合區(qū)的正確的基因片段，(對(duì)于重鏈已知為VDJ，可變區(qū)，多變區(qū)和連接區(qū)，或?qū)τ谳p鏈已知為VJ，可變區(qū)和連接區(qū)或?qū)τ诳勺儏^(qū)簡(jiǎn)單的為V的上述片段)可以是cDNA或基因組形式；b克隆編碼保守區(qū)或其期望片段的基因片段；c連接可變區(qū)和可變區(qū)，以便完整的嵌合抗體以能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯的形式編碼；d將構(gòu)建子連接到含有選擇性標(biāo)記和諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和poly(A)附加信號(hào)的載體；e擴(kuò)增載體并將其導(dǎo)入真核細(xì)胞(轉(zhuǎn)染)，通常為哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞；f選擇表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞g篩選表達(dá)期望嵌合抗體的細(xì)胞h檢測(cè)抗體的適合的結(jié)合特異性和效應(yīng)器功能。
單克隆抗體指分離自單個(gè)克隆的抗體，包括任何真核、原核或噬菌體克隆。單克隆抗體可以包括或由兩個(gè)蛋白組成，即重鏈和輕鏈?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)中的一種制備單克隆抗體，包括使用雜交瘤、重組和噬菌體展示技術(shù)或其組合。
人源抗體指分子的CDRs(互補(bǔ)決定區(qū))來(lái)自非人物種免疫球蛋白，并且抗體分子的其余部分主要來(lái)自人免疫球蛋白。這里使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”，除非特別指明，廣泛的用作指抗體分子和抗體衍生的分子。這些抗體衍生的分子包括至少一個(gè)可變區(qū)(可變區(qū)的重鏈或輕鏈)并包括分子，例如Fab片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’).sub.2片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)abc片段，Sc抗體(單鏈抗體)，雙功能抗體，個(gè)體抗體輕鏈，個(gè)體抗體重鏈，在抗體鏈和其它分子中嵌合的融合。
特別地，本發(fā)明提供作為抗HGF的中和抗體的兔/人嵌合抗體。本發(fā)明的中和抗體包含SEQ ID NO27的VH區(qū)和SEQ ID NO28的VL區(qū)或SEQ ID NO29的VH區(qū)和SEQ ID NO30的VL區(qū)。
可以采用MDCK2擴(kuò)散方法檢測(cè)中和抗體是否發(fā)揮中和活性(Cao等，PNAS 98(13)7443-7448，201)。在用2ng/ml的HGF(29pM)處理的MDCK2細(xì)胞情況中，本發(fā)明的中和抗體顯示出當(dāng)抗HGF Fab與HGF的摩爾比為50∶1，抗人Fab與HGF的摩爾比的范圍為50∶1到100∶1時(shí)，獲得最高的擴(kuò)散抑制活性(參見(jiàn)圖9)。這些結(jié)果第一次顯示至少在體外，僅僅對(duì)一個(gè)表位的封閉對(duì)于中和HGF是充分的，而區(qū)別于Cao的抑制MDCK2細(xì)胞擴(kuò)散需要中和至少三個(gè)表位的報(bào)道(Cao等，見(jiàn)上)。另外，本發(fā)明顯示這樣的事實(shí)，即僅僅當(dāng)結(jié)合可中和表位的抗體是二價(jià)或更高時(shí)，中和抗體發(fā)揮其中和活性，這提示同樣的可中和表位可以存在于HGF的兩個(gè)或更多個(gè)的位點(diǎn)。
也可以用EIA檢測(cè)抗HGF Fab對(duì)HGF的結(jié)合親和性，68克隆對(duì)HGF與c-Met結(jié)合的的抑制活性和可溶的c-Met對(duì)HGF與c-Met結(jié)合的抑制活性。隨著注入克隆68抗體的量，與固定在傳感器芯片上的HGF結(jié)合的克隆68抗體的量增加(參見(jiàn)圖10)，并且隨著克隆68抗體的濃度的增加，HGF與c-Met結(jié)合的量減少(參見(jiàn)圖11)。另外，隨著可溶c-Met濃度的增加，與固定在傳感器芯片上的c-Met結(jié)合的HGF的量減少(圖12)。
上述結(jié)果顯示本發(fā)明的中和抗體可作為能中和HGF的單一試劑。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供包括有效劑量的本發(fā)明中和抗體和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，其用于預(yù)防和治療由HGF與其受體結(jié)合所引起的頑固的疾病和癌癥。此外，本發(fā)明提供通過(guò)使用本發(fā)明中和抗體而用于預(yù)防和治療頑固疾病和癌癥的方法。優(yōu)選地，癌癥包括但不局限于，多種人肝，前列腺，結(jié)腸，乳腺，腦和皮膚的癌癥，并且頑固疾病包括那些通過(guò)HGF與其受體c-Met結(jié)合引起的疾病，包括但不局限于瘧疾，阿爾茲海默癥等等。
本發(fā)明的藥物配方可以結(jié)合任何一個(gè)常規(guī)的方法而制備。在制備配方中，有效成份優(yōu)選使用載體混合的或稀釋的。合適的載體，賦性劑或稀釋劑是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯樹(shù)膠，藻酸鹽，白明膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯(Methylhydroxybenzoate)，羥基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。配方還可以包括填充料，抗粘劑，潤(rùn)滑劑，濕潤(rùn)劑，芳香劑，乳化劑，防腐劑等等。本發(fā)明的組合物通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的任何一種方法配制，以便當(dāng)其對(duì)患者給藥后，能構(gòu)提供活性成份迅速，持續(xù)或延遲的釋放。
本發(fā)明的藥學(xué)配方可以通過(guò)注射給藥(例如肌肉注射，靜脈注射，腹腔注射，皮下注射)，或通過(guò)其它方法，例如灌注以便確保以有效的形式遞送到血流。藥物配方還可以通過(guò)瘤內(nèi)，瘤周，病灶內(nèi)或病灶旁途徑給藥，以發(fā)揮局部和全身治療效果。局部或靜脈注射是優(yōu)選的方式。
為了治療人類(lèi)患者，作為有效成份的本發(fā)明中和抗體的典型一日劑量的范圍是大約0.1到100mg/kg體重，優(yōu)選1到10mg/kg體重，其可以作為一次劑量或均分的劑量給藥。然而，可以理解的是實(shí)際上活性成份的給藥劑量應(yīng)該根據(jù)多種相關(guān)因素而決定，這些因素包括治療的疾病，選擇的給藥途徑，年齡，性別和個(gè)體患者的體重，以及患者癥狀的嚴(yán)重性，因此，上述劑量將不會(huì)在任何方面限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明進(jìn)一步提供下述實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。需要理解的是，顯示本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的這些實(shí)施例，僅僅以說(shuō)明本發(fā)明的方式給出。從上述討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不偏離其領(lǐng)域和范圍下確定本發(fā)明的必要特征，能對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變和修飾以適合不同的用途和條件。
實(shí)施例1HGF免疫和抗體文庫(kù)構(gòu)建經(jīng)過(guò)4到5個(gè)月的時(shí)間，通過(guò)間隔3周的5次HGF皮膚注射免疫2只新西蘭白兔(R&D系統(tǒng)，USA)，HGF分散在MPL(單磷酰脂A，分離自″S.minnesota再次突變(remutants)的高度精練的無(wú)毒脂A)+TDM(合成的海藻糖(dicorynomycolate)，來(lái)自結(jié)核桿菌索狀因子(Cord factor)的海藻糖雙分枝菌酸的類(lèi)似物)+CWS(細(xì)胞壁骨架，來(lái)自分枝桿菌去蛋白和去脂質(zhì)額細(xì)胞壁)佐劑中(Sigma)。通過(guò)使用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔Fc山羊多克隆抗體(Pierce)的ELISA方法檢測(cè)來(lái)自免疫動(dòng)物的抗血清對(duì)重組人HGF的結(jié)合(R&D系統(tǒng)或Research DiagnosticsInc.)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然在HGF免疫之前獲得的抗血清基本不與HGF結(jié)合，然而在5次皮膚注射后獲得的抗血清特異的與HGF結(jié)合。
在最后增強(qiáng)之后的幾天，從免疫動(dòng)物分離脾臟和骨髓，并使用TRI試劑(Molecular Reaserch Center，Cincinnati，USA)和氯化鋰沉淀制備總RNA。使用SUPERSCRIPT Preamlification系統(tǒng)和寡(dT)引物(LifeTechnologies，Inc.)合成第一鏈cDNA。
根據(jù)Rader等描述的方法構(gòu)建兔/人嵌合抗體庫(kù)(Rader C等，J.Biol.Chem.27513668-13676，2000)。
實(shí)施例2兔源抗體可變區(qū)和人源抗體保守區(qū)的擴(kuò)增(2-1)兔源抗體可變區(qū)的擴(kuò)增為了擴(kuò)增兔VL(Vκ，Vλ)和重鏈(VH)，通過(guò)使用表1描述的引物組合進(jìn)行PCR.
表1

PCR反應(yīng)溶液如下制備混合1μl實(shí)施例1合成的cDNA模板(大約0.5μg)，60pmol每種引物，10μl 10×PCR緩沖液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并將終體積調(diào)整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預(yù)變性后，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 90秒共30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。將擴(kuò)增DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
(2-2)人源抗體保守區(qū)的擴(kuò)增擴(kuò)增人源抗體保守區(qū)的Cκ區(qū)的PCR如下實(shí)施制備PCR反應(yīng)溶液，即混合20ng 1μl pComb3XTT載體(Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1588(18)，7978-82，1991)，60pmol每種引物(SEQ ID NO14和15)，10μl 10×PCR緩沖液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并將終體積調(diào)整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預(yù)變性后，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 90秒共20個(gè)循環(huán)，最后在72℃延仲10分鐘。
同時(shí)，擴(kuò)增人源抗體保守區(qū)的CH1區(qū)的PCR如下實(shí)施制備PCR反應(yīng)溶液，即混合20ng 1μl pComb3XTT載體(Barbas等，同上)，60pmol每種引物(SEQ ID NO16和17)，10μl 10×PCR緩沖液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并將終體積調(diào)整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預(yù)變性后，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 90秒共20個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。
將擴(kuò)增DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
實(shí)施例3擴(kuò)增嵌合抗體的輕重鏈(3-1)輕鏈擴(kuò)增擴(kuò)增人輕鏈的PCR如下實(shí)施制備PCR反應(yīng)溶液，即混合100ng實(shí)施例(2-1)純化的每個(gè)PCP產(chǎn)物VL(Vκ，Vλ)和實(shí)施例(2-2)純化的PCR產(chǎn)物Cκ，60pmol每種引物(SEQ ID NO18和15)，10μl 10×PCR緩沖液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并將終體積調(diào)整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預(yù)變性后，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 120秒共20個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。
將擴(kuò)增DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
(3-2)重鏈擴(kuò)增擴(kuò)增重鏈的Fd區(qū)域(VH和CH1)的重疊PCR如下實(shí)施制備PCR反應(yīng)溶液，即混合100ng實(shí)施例(2-1)純化的每個(gè)PCP產(chǎn)物VH和實(shí)施例(2-2)純化的PCR產(chǎn)物VH1，60pmol每種引物(SEQ ID NO19和17)，10μl 10×PCR緩沖液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并將終體積調(diào)整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預(yù)變性后，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 120秒共20個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。
將擴(kuò)增DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
實(shí)施例4制備嵌合Fab文庫(kù)擴(kuò)增嵌合兔/人Fab基因的PCR如下實(shí)施制備PCR反應(yīng)溶液，即混合100ng實(shí)施例(3-1)純化的每個(gè)嵌合輕鏈產(chǎn)物和實(shí)施例(3-2)純化的嵌合重鏈產(chǎn)物，60pmol每種引物(SEQ ID NO18和20)，10μl 10×PCR緩沖液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，并將終體積調(diào)整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預(yù)變性后，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 180秒共20個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。
將擴(kuò)增DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
在編碼兔VL和VH序列的PCR產(chǎn)物與編碼人Cκ和CH1序列的PCR產(chǎn)物結(jié)合之后，編碼抗體片段文庫(kù)的終PCR片段進(jìn)行SfiI消化并克隆到噬菌粒載體pComb3X(Scripps研究中心，CA，USA)(圖2)。通過(guò)電轉(zhuǎn)化將噬菌粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ER2537菌株(NEB)。作為融合在噬菌體包被蛋白pIII的導(dǎo)入的噬菌體展示Fab融合蛋白與其DNA形成噬菌體顆粒(基因和多肽作為一個(gè)單位)存在于噬菌體DNA。
實(shí)施例5選擇含有抗HGF Fab的噬菌體克隆當(dāng)96孔板(Costar No.3690)每孔包被濃度為10μl/ml的溶解在25μl的TBS的HGF之后，實(shí)施例4制備的噬菌體展示Fab加入孔板，孔板在室溫保持2小時(shí)，并淘選在孔板中的抗免疫的HGF抗原。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗滌孔板并用0.1M HCl-甘氨酸(PH2.2)洗脫。洗滌步驟從第一個(gè)循環(huán)的5次增加到第二個(gè)循環(huán)的10次和隨后循環(huán)的15次。實(shí)施典型的7循環(huán)淘選。隨著淘選進(jìn)行，特異結(jié)合HGF的抗HGF Fab的噬菌體展示庫(kù)增加，其在使用HRP-偶聯(lián)的抗-M13噬菌體抗體(Pharmacia)和HGF-包被的ELISA板的EIA檢測(cè)中，導(dǎo)致顯示HGF結(jié)合Fab的吸光率的增加(圖3)。在最后一個(gè)淘選循環(huán)之后，通過(guò)分別使用HGF包被的ELISA板和山羊抗人Fab多克隆抗體(Pierce)EIA方法選擇含有抗HGF Fab的噬菌體克隆。選出的噬菌體克隆命名為H61(克隆61)和H68(克隆68)。相對(duì)于背景具有強(qiáng)信號(hào)的H61和H68克隆(圖7)進(jìn)一步進(jìn)行核苷測(cè)序分析。
實(shí)施例6篩選噬菌體的核苷測(cè)序分析使用SEQ ID NO21和22的兩個(gè)測(cè)序引物，通過(guò)染料標(biāo)記引物測(cè)序方法實(shí)施核酸測(cè)序(Chung等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.128641-649，2002)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H61克隆編碼由含有SEQ ID NOs23核苷序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NOs24的核苷序列的VL區(qū)組成的抗HGF Fab；而H68克隆編碼由含有SEQ ID NOs25核苷序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NOs26的核苷序列的VL區(qū)組成的抗HGF Fab組成。
從分析的核苷序列分別得出H61和H68克隆的氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H61克隆的VH區(qū)和VL區(qū)分別含有SEQ ID NOs27和SEQ ID NOs28，而H68克隆的VH區(qū)和VL區(qū)分別含有SEQ ID NOs29和SEQ ID NOs30的氨基酸序列。
根據(jù)Harris(Harris等，Protein Science4(2)306-10，1995)描述的方法，作為對(duì)H61和H68克隆的氨基酸序列中結(jié)構(gòu)區(qū)(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)分析結(jié)果，H61和H68克隆含有表2描述的區(qū)。
表2

實(shí)施例7用于體外實(shí)驗(yàn)的抗HGF Fab的表達(dá)和純化將實(shí)施例5篩選的克隆的噬菌粒DNAs轉(zhuǎn)化無(wú)抑制因子的大腸桿菌菌株HB2151?？寺∩L(zhǎng)到A600nm吸光值為0.5到1.0時(shí)，使用IPTG(1mM)誘導(dǎo)抗HGF Fab表達(dá)20至24小時(shí)。使用實(shí)驗(yàn)級(jí)TFF系統(tǒng)(Millipore)濃縮培養(yǎng)上清。使用抗HA標(biāo)簽小鼠單克隆抗體通過(guò)親和層析的方法純化濃縮的抗HGF Fab。使用考馬斯亮蘭染色和蛋白質(zhì)印跡分析純化的Fab片段。
首先，通過(guò)加樣到NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上對(duì)純化的H68抗體Fab(大約1-3ug)進(jìn)行電泳。負(fù)載的凝膠在考馬斯亮蘭凝膠染色溶液中浸泡(Invitrogen)，搖動(dòng)30分鐘，轉(zhuǎn)移至考馬斯亮蘭脫色液中，搖動(dòng)直到能夠觀察到蛋白條帶。圖4顯示考馬斯亮蘭染色的結(jié)果。如圖4所示，在非還原的H68抗體(泳道2)中，大部分的Fab抗體在分子量為50000Da的位置處檢測(cè)到；而在還原的H68抗體(泳道3)中，F(xiàn)ab抗體被分別分離在Fd區(qū)域的輕鏈和重鏈，因此在分子量為25000Da的位置處檢測(cè)到條帶；而其它非抗體的條帶沒(méi)有檢測(cè)到。由于H68抗體Fab的輕重鏈的大小分別約為25000Da，而通過(guò)輕重鏈間的二硫鍵共價(jià)連接形成的Fab的大小為大約50000Da的事實(shí)，H68抗體Fab被成功的分離并獲得滿意的純度。然而，在泳道2中25000Da位置處的弱帶是由于存在彼此沒(méi)有連接的自由的Fab輕重鏈。
同時(shí)，為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，過(guò)加樣到NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上對(duì)純化的抗HGF Fab(大約1-3ug)進(jìn)行電泳。根據(jù)分子量分離的Fab印跡到BioTrace硝化纖維膜上(PALL)。使用5％脫脂奶粉/TBS封閉處理30分鐘。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗人山羊Fab多克隆抗體(Pierce)使用3％脫脂奶粉/TBS按1∶1000的比例稀釋?zhuān)⑴c膜搖動(dòng)反應(yīng)1小時(shí)。使用TBS洗滌膜30分鐘并用等體積的Supersignal West Pico穩(wěn)定過(guò)氧化物溶液(Pierce)和Supersignal WestPico氨基苯二酰一肼/增強(qiáng)溶液(Pierce)的混合溶液基本潤(rùn)濕膜。在暗室中將膜曝光于X-射線(Kodak)。
圖5顯示了分析純化的Fab片段的表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其中左邊泳道是大小標(biāo)記，而另一泳道是純化的Fabs。如圖5所示，在相應(yīng)于50000Da的位置檢測(cè)到大量的Fab，在相應(yīng)于25000Da的位置檢測(cè)到游離的輕重鏈Fd區(qū)。
實(shí)施例8核苷序列分析和HGF可中和的表位的特點(diǎn)(8-1)核苷測(cè)序96孔板(Costar No.3690)每孔包被濃度為10μl/ml的溶解在25μl的TBS的抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab。PHD肽文庫(kù)(重組肽的噬菌體展示文庫(kù))(New England Biolab)加入孔板，然后孔板在室溫保持2小時(shí)。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗滌孔板并用0.1M HCl-甘氨酸(PH2.2)洗脫。洗滌步驟從第一個(gè)循環(huán)的5次增加到第二個(gè)循環(huán)的10次和隨后循環(huán)的15次。實(shí)施典型的7循環(huán)淘選。在最后一個(gè)淘選循環(huán)之后，通過(guò)使用抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab包被的ELISA板和辣根過(guò)氧化物藕聯(lián)的抗-M13噬菌體山羊單克隆抗體(Roche)的EIA方法選擇含有抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab的噬菌體克隆。選出的克隆進(jìn)行核苷測(cè)序，并且從分析的核苷序列確定氨基酸序列。
使用SEQ ID NO31的測(cè)序引物，根據(jù)染料標(biāo)記引物測(cè)序方法實(shí)施核酸測(cè)序(Chung等，同上)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從分析的核苷序列推導(dǎo)的編碼抗HGF H61和H68 Fabs的肽分別含有SEQ ID NOs32和33的氨基酸序列。
然后，96孔板(Costar No.3690)每孔包被濃度為10μl/ml的溶解在25μl的TBS的c-Met，并且含有SEQ ID NOs32和33的肽的克隆也每個(gè)加入。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗滌孔板，辣根過(guò)氧化物藕聯(lián)的抗-M13噬菌體山羊單克隆抗體(Roche)也加入。
如圖6所示，當(dāng)分別含有SEQ ID NOs32和33的肽(1和2)的噬菌體與c-Met結(jié)合，兩個(gè)沒(méi)有所述肽的對(duì)照噬菌體(3和4)沒(méi)有結(jié)合。這些結(jié)果提示因?yàn)榭笻GF抗體H68的抗原結(jié)合位點(diǎn)模仿了c-MET的HGF結(jié)合位點(diǎn)，以及結(jié)合克隆68的SEQ ID NO32和33的肽模仿了HGF的c-MET結(jié)合位點(diǎn)，所以SEQ ID NO32和33的肽能夠具有作為HGF可中和的表位的功能。
(8-2)特點(diǎn)為了表征抗HGF抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如下實(shí)施蛋白質(zhì)印跡。通過(guò)加樣到NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上對(duì)1-3ug HGF進(jìn)行電泳。此時(shí)，一些在經(jīng)過(guò)還原劑處理之后上樣，而其它則不經(jīng)過(guò)上述處理而上樣。根據(jù)分子量分離的蛋白印跡到BioTrace硝化纖維膜上(PALL)。使用5％脫脂奶粉/TBS封閉處理膜30分鐘。將抗HGFH61和H68 Fabs加到膜上，然后膜搖動(dòng)1小時(shí)。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗人山羊Fab多克隆抗體(Pierce)使用3％脫脂奶粉/TBS按1∶1000的比例稀釋?zhuān)⑴c膜搖動(dòng)反應(yīng)1小時(shí)。使用TBS洗滌膜30分鐘并用等體積的Supersignal West Pico穩(wěn)定過(guò)氧化物溶液(Pierce)和Supersignal WestPico氨基苯二酰一肼/增強(qiáng)溶液(Pierce)的混合溶液基本潤(rùn)濕膜。在暗室中將膜曝光于X-射線(Kodak)。
圖8顯示了H61和H68限定的可中和的表位的構(gòu)象依賴性，其中箭頭代表大小標(biāo)記；A，克隆61；B，克隆68；泳道1，非還原HGF，泳道2還原HGF。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆61和68與非還原的HGF結(jié)合，而不與還原的HGF結(jié)合。這些結(jié)果提示作為克隆61和68結(jié)合位點(diǎn)的抗原決定簇的三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如表位，對(duì)于抗原-抗體反應(yīng)是關(guān)鍵的，并且本發(fā)明的可中和的表位具有非線性的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例9MDCK擴(kuò)散試驗(yàn)MDCK細(xì)胞(Madine Darby犬腎細(xì)胞；ATCC CCL 34)在補(bǔ)充有5％FCS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，95％空氣和5％二氧化碳的潮濕空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以2×103細(xì)胞/孔的濃度將細(xì)胞接種于96孔板中，并與新鮮培養(yǎng)基中的2ng/ml(29pM)的HGF孵育過(guò)夜。然后，以不同濃度將抗HGF Fab和抗人Fab抗體加入孔板。通過(guò)光學(xué)顯微鏡監(jiān)控?cái)U(kuò)散效果，結(jié)果在圖9顯示。圖9a表示范圍為1級(jí)到6級(jí)的細(xì)胞擴(kuò)散水平的標(biāo)準(zhǔn)，其中6級(jí)指HGF引起的擴(kuò)散效果100％的抑制；5級(jí)指HGF引起的擴(kuò)散效果為從90-100％的抑制；4級(jí)指HGF引起的擴(kuò)散效果為從60-90％的抑制；3級(jí)指HGF引起的擴(kuò)散效果為從30-60％的抑制；2級(jí)指HGF引起的擴(kuò)散效果為從10-30％的抑制；1級(jí)指HGF引起的擴(kuò)散效果為10％以及更少的抑制。圖9b顯示根據(jù)加入的HGF濃度，抗HGF Fab和抗人Fab抗體的擴(kuò)散水平可能改變。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗HGF Fab與HGF的摩爾比為50∶1，以及時(shí)抗人Fab抗體與HGF的摩爾比范圍為50∶1到100∶1時(shí)，可以獲得預(yù)料的最有效的擴(kuò)散效果。
實(shí)施例10BIAcore檢測(cè)(10-1)抗HGF Fab與HGF的親和分析使用BIAcore 3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)通過(guò)SPR(表面等離子共振技術(shù))檢測(cè)抗HGF Fab與HGF的結(jié)合親和性。
大約，通過(guò)胺偶聯(lián)方法將HGF的1069共振單位(RU)耦合到CM5傳感器芯片(BIAcore AB)。在含有0.005％表面活性劑P20，25℃流速為30μl/分鐘的PBS緩沖液中進(jìn)行結(jié)合相互作用。用1M NaCl/50mMNaOH再生表面。檢測(cè)了動(dòng)力速率常數(shù)(Kon和Koff)以及平衡離解常數(shù)(Kd)。圖10顯示抗HGF H68 Fab與HGF的結(jié)合親和性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著抗HGF H68 Fab的濃度，與固定在傳感器芯片上的HGF結(jié)合的抗HGFH68 Fab的量增加。
(10-2)抗HGF的克隆68抗體的HGF結(jié)合抑制活性的分析為了在實(shí)時(shí)確定抗HGF H68 Fab能抑制HGF與c-Met結(jié)合的事實(shí)，通過(guò)胺偶聯(lián)方法將c-Met耦合到CM5傳感器芯片。然后，分別將HGF以50nM的濃度單獨(dú)，與5個(gè)不同濃度(50nM，250nM，500nM，1μM和1.5μM)的抗HGF H68 Fab和可溶的5個(gè)不同濃度(50nM，100nM，200nM，400nM和600nM)的c-Met預(yù)混合注入。在含有0.005％表面活性劑P20，25℃流速為30μl/分鐘的PBS緩沖液中進(jìn)行結(jié)合相互作用。用1MNaCl/50mM NaOH再生表面。
圖11顯示抗HGF H68 Fab抑制HGF與c-Met的結(jié)合。結(jié)果是，在注入50nM的HGF時(shí)，HGF與c-Met的結(jié)合為455.5RU(I)，當(dāng)50nM的HGF與5個(gè)不同濃度50nM(II)，250nM(III)，500nM(IV)，1μM(V)和1.5μM(VI)的抗HGF H68 Fab注入時(shí)，HGF與c-Met的結(jié)合分別為406.5，328，260，111.1和71RU。這些結(jié)果提示隨著抗HGF H68 Fab濃度的增加，HGF與c-Met的結(jié)合減少。當(dāng)抗HGF H68 Fab單獨(dú)注入時(shí)，HGF沒(méi)有結(jié)合。
(10-3)可溶的c-Met抗c-Met與HGF結(jié)合的抑制活性檢測(cè)可溶的c-Met是否抑制HGF與c-Met的結(jié)合如下進(jìn)行。通過(guò)胺偶聯(lián)方法將2979RU的c-Met耦合到CM5傳感器芯片。在含有0.005％表面活性劑P20，25℃流速為30μl/分鐘的PBS緩沖液中進(jìn)行結(jié)合相互作用。用1M NaCl/50mM NaOH再生表面。
圖12顯示可溶c-Met抑制HGF與c-Met的結(jié)合。如圖12所示，在注入50nM的HGF時(shí)，HGF與c-Met的結(jié)合為455.5RU(I)，當(dāng)50nM的HGF與5個(gè)不同濃度50nM(II)，100nM(III)，200nM(IV)，400nM(V)和600nM(VI)的可溶c-Met注入時(shí)，HGF與c-Met的結(jié)合分別為310.3，225.7，167.4，93.7和70.9RU。這些結(jié)果提示隨著可溶c-Met濃度的增加，HGF與耦合到傳感器芯片上的c-Met的結(jié)合逐漸減少。
盡管本發(fā)明主題的實(shí)施方案已經(jīng)做過(guò)描述和解釋?zhuān)@而易見(jiàn)的是，在不脫離僅僅被權(quán)利要求的范圍所限定的本發(fā)明的精神的前題下，可以進(jìn)行多種改變和修飾。
序列表<110>國(guó)立癌中心<120>可中和的HGF表位和與其結(jié)合的中和抗體<130>PCA31170/NCC<160>35<170>KoDatentIn 1.71<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vkappa 5′正向引物RSCVK1<400>1gggcccaggc ggccgagctc gtgmtgaccc agactcca38<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vkappa 5′正向引物RSCVK2<400>2gggcccaggc ggccgagctc gatmtgaccc agactcca38<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Vkappa 5′正向引物RSCVK3<400>3gggcccaggc ggccgagctc gtgatgaccc agactgaa38<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vkappa 3′反向引物RHybK1-B<400>4agatggtgca gccacagttc gtttgatttc cacattggtg cc 42<210>5<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vkappa 3′反向引物RHybK2-B<400>5agatggtgca gccacagttc gtaggatctc cagctcggtc cc 42<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vkappa 3′反向引物RHybK3-B<400>6agatggtgca gccacagttc gtttgacsac cacctcggtc cc 42<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VIambda 5′正向引物RSCIambda1<400>7gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agtcgccctc 40<210>8<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VIambda 3′反向引物RHybL-B<400>8agatggtgca gccacagttc ggcctgtgac ggtcagctgg gtccc45<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VH 5′正向引物RHyVH1
<400>9gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg gaggagtccr gg 42<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VH 5′正向引物RHyVH2<400>10gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg aaggagtccg ag 42<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VH 5′正向引物RHyVH3<400>11gctgcccaac cagccatggc ccagtcgytg gaggagtccg gg 42<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VH 5′正向引物RHyVH4<400>12
gctgcccaac cagccatggc ccagsagcag ctgrtggagt ccgg 44<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VH 3′反向引物RHyIgGCH1-B<400>13cgatgggccc ttggtggagg ctgargagay ggtgaccagg gtgcc45<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從克隆的人Fab擴(kuò)增人Ckappa區(qū)和peIB引導(dǎo)區(qū)序列的正向引物HKC-F<400>14cgaactgtgg ctgcaccatc tgtc 24<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從克隆的人Fab擴(kuò)增人Ckappa區(qū)和peIB引導(dǎo)區(qū)序列的反向引物L(fēng)ead-B<400>15ggccatggct ggttgggcag c 21<210>16
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從克隆的人Fab擴(kuò)增人CH1鏈的正向引物HIgGCH1-F<400>16gcctccacca agggcccatc ggtc 24<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于從克隆的人Fab擴(kuò)增人CH1鏈的反向引物dpseq<400>17agaagcgtag tccggaacgt c 21<210>18<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于兔VL序列與人Ckappa PCR產(chǎn)物連接的PCR正向引物RSC-F<400>18gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c41<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于兔VH序列與人CH1 PCR產(chǎn)物連接的PCR正向引物L(fēng)eadVH<400>19gctgcccaac cagccatggc c 21<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于嵌合的輕鏈序列與嵌合的重鏈序列(Fd)連接的PCR反向引物dp-EX<400>20gaggaggagg aggaggagag aagcgtagtc cggaacgtc 39<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>測(cè)序引物<400>21agaaacacaa agtctacgcc20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>測(cè)序引物<400>22
gttgggcagc gagtaataac20<210>23<211>348<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼克隆61的VH區(qū)的核苷酸序列<400>23caggagcagc tgatggagtc cgggggtcgc ctggtcaatc ctggcgaatc cctgacactc 60acctgcaaag cctctggatt caccttcagt agctactaca tgagctgggt ccgccaggct120ccagggaagg ggctggagtg gatcggatac attggtacta gtagtggtac cacttactac180gcgaactctg tgaagggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa taccgtattt240ctgcgaatga ccagtctcac agactcggac acggccacct atttctgtgc aagagggctg300ggcagaatca acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcttca 348<210>24<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼克隆61的VL區(qū)的核苷酸序列<400>24gagctcgtgc tgacccagac tccatcctct atgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aactacttag cctggtatca gcagaaacca120gggcagcctc ccaagctcct gatctacagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg180cgtttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct240
gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattata gtgctggtgc gacttttgga300ggtggcacca atgtggaaat caaacga327<210>25<211>348<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼克隆68的VH區(qū)的核苷酸序列<400>25cagcagcagc tggtggagtc cgggggtcgc ctggtcaatc ctggcgaatc cctgacactc 60acctgcaaag cctctggatt caccttcagt acctactaca tgagctgggt ccgccaggct120ccagggaagg ggctagagtg gatcggatac attggtacta gtagtggtac cacttactac180gcgaactctg tgaagggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa taccgtattt240ctgcaaatga ccagtctgac agactcggac acggccacct atttctgtgc aagagggctg300ggcagaatta acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctca 348<210>26<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼克隆68的VL區(qū)的核苷酸序列<400>26gagctcgatc tgacccagac tccatcctct gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aacctcttag cctggtatca gcagaaacca120
gggcagcctc ccaagctcct gatttatggt gcatccaatc tggaatctgg ggtcccatcg180cgtttccgtg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct240gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattata gtgctggtgc gacttttgga300gctggcacca atgtggaaat caaacga327<210>27<211>116<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>克隆61的VH區(qū)的氨基酸序列<400>27Gln Glu Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Asn Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe65 70 75 80Leu Arg Met Thr Ser Leu Thr Asp Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser
115<210>28<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>克隆61的VL區(qū)的氨基酸序列<400>28Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Met Ser Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala65 70 75 80Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly85 90 95Ala Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>29<211>116<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>克隆68的VH區(qū)的氨基酸序列<400>29Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Asn Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe65 70 75 80Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Asp Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>30<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>克隆68的VL區(qū)的氨基酸序列<400>30Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Leu
20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala65 70 75 80Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly85 90 95Ala Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>測(cè)序引物<400>31ccctcatagt tagcgtaacg20<210>32<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>neutralizable epitope of HGF<400>32
His His Pro His Phe Lys Pro Val Ser Asn Ser Arg1 5 10<210>33<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HGF可中和的表位<400>33Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His1 5 10<210>34<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼SEQ.ID.No.32的核苷酸序列<400>34catcatccgc attttaagcc tgtgtctaat agtcgt 36<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼SEQ.ID.No.33的核苷酸序列<400>35
aagtctctta gtcggcatga tcatattcat catcat 3權(quán)利要求
1.一種含有SEQ ID NO32或33的氨基酸序列的HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的可中和的表位，其抑制HGF與其受體的結(jié)合。
2.編碼如權(quán)利要求1所述的可中和的表位的多聚核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多聚核苷酸，其特征在于，其含有SEQ ID NO34的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多聚核苷酸，其特征在于，其含有SEQ ID NO35的核苷酸序列。
5.一種特異結(jié)合于如權(quán)利要求1所述的可中和的表位的中和抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中和抗體，其特征在于，其選自嵌合抗體、單克隆抗體或人源抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中和抗體，其特征在于，其包括含有SEQ ID NO27的氨基酸序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO28的氨基酸序列的VL區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中和抗體，其特征在于，其包括含有SEQ ID NO29的氨基酸序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO30的氨基酸序列的VL區(qū)。
9.一種用于預(yù)防或治療由HGF與其受體結(jié)合引起的疾病的方法，其包括將如權(quán)利要求7所述的中和抗體給藥于哺乳動(dòng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的疾病是肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腦癌、皮膚癌、瘧疾和阿爾茲海默癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合本發(fā)明HGF可中和的表位的抗HGF的中和抗體能夠作為單獨(dú)試劑中和HGF，并可以有效的用于預(yù)防和治療由HGF與其受體Met結(jié)合所引起的頑固疾病和癌癥。
文檔編號(hào)C07K14/475GK1878790SQ200480033164
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月11日
發(fā)明者鄭埈昊, 許英美 申請(qǐng)人:國(guó)立癌中心