專利名稱：利用來(lái)自酵母的膽固醇酯酶進(jìn)行的對(duì)映純中間體的酶促合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備可用于合成有價(jià)值的藥學(xué)活性化合物的對(duì)映純(enantipoure)中間體的方法，并涉及這些新中間體。
更具體而言，本發(fā)明提供了一種制備式I化合物和/或式II化合物的方法，所述的式I化合物是 其中R21、R22和R23彼此獨(dú)立地是氫或鹵素；且R24是氫、甲基或鹵素；所述的式II化合物是 其中R1是(C1-C8)-烷基、(C2-C4)-鏈烯基或式A的基團(tuán)R3(OCH2CH2)n- (A)其中R3是氫或(C1-C4)-烷基；且n是1、2或3；并且R21、R22、R23和R24具有上文所定義的含義，該方法包括使式III化合物與來(lái)自酵母的膽固醇酯酶接觸，
其中R1、R21、R22、R23和R24具有上文所定義的含義。
在本文所給出的結(jié)構(gòu)式中，楔形鍵( )表示取代基位于紙平面之上。
在本文所給出的結(jié)構(gòu)式中，虛線鍵( )表示取代基位于紙平面之下。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”表示含有1至8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烴殘基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、辛基，包括它們的各種異構(gòu)體。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“烷基”表示含有1至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烴殘基，其可以是未被取代的或者被一個(gè)或一個(gè)以上取代基取代。取代基的實(shí)例包括羥基、(C1-C4)-烷氧基、(C3-C6)-環(huán)烷基、芳基和鹵素原子。被取代的烷基的實(shí)例包括3-羥基丁基、4-甲氧基丁基、3-乙氧基丙基、3-環(huán)己基丙基、芐基、2-苯基乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、2，2-二氯乙基、3-溴丙基或2，2，2-三氟乙基等。鏈烯基的實(shí)例包括乙烯基、烯丙基、異丙烯基、丁烯基以及丁烯基的異構(gòu)體，例如1-或2-丁烯基。環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
鹵素的實(shí)例包括氟、氯和溴。
膽固醇酯酶(EC 3.1.1.13)是一族具有廣泛特異性的酶，其也被稱為膽甾醇酯酶；膽固醇基酯合酶；三萜烯醇(triterpenol)酯酶；膽固醇基酯酶；膽固醇基酯水解酶；固醇酯水解酶或膽固醇酯水解酶。它們屬于還包括酯酶、蛋白酶和脂肪酶的水解酶族。
來(lái)自酵母的膽固醇酯酶的實(shí)例包括來(lái)自假絲酵母屬(Candida)、例如來(lái)自柱狀假絲酵母(Candida cylindracea)的膽固醇酯酶。例如，膽固醇酯酶可以通過(guò)對(duì)可商購(gòu)獲得的Lipase MY(Meito Sangyo，日本)(其是由柱狀假絲酵母獲得的)進(jìn)行純化來(lái)獲得。該純化可以是部分純化?？缮藤?gòu)獲得的來(lái)自酵母的膽固醇酯酶的實(shí)例有Roche Applied Science，Industrial Products，Enzyme Projects，Sandhofer Str.116，D-68305 Mannheim，德國(guó)提供的訂貨號(hào)為例如10129046103(固體制劑)、0393916或0396800(液體制劑)的來(lái)自柱狀假絲酵母的膽固醇酯酶。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中來(lái)自酵母的膽固醇酯酶是柱狀假絲酵母的膽固醇酯酶。
來(lái)自酵母的膽固醇酯酶可以以可溶性形式或者以被固定的形式被使用。如何固定酶的各種選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
酶促反應(yīng)可以在水性系統(tǒng)或在水性-有機(jī)系統(tǒng)中進(jìn)行。
底物、即式III化合物可以例如以混懸液形式被應(yīng)用。其濃度可以為0.5-20％總濃度(w/w)，或者2-10％。式III化合物可以根據(jù)已知方法用任選地被取代的氨基苯酚由衣康酸來(lái)制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24彼此獨(dú)立地是氫或氟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24是氫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中在式III中，R1是甲基或乙基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸和(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯的方法，其包括使(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯與來(lái)自酵母的膽固醇酯酶接觸。
可以使用已知可用于生物化學(xué)轉(zhuǎn)化的常見緩沖液如磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液等。緩沖液濃度可以為不超過(guò)1M，或者為約3mM至約250mM。
所述酶促反應(yīng)可以在存在有機(jī)助溶劑(co-solvent)的情況下進(jìn)行。所述有機(jī)助溶劑可以是水可混溶性的或水不可混溶性的助溶劑。當(dāng)存在水可混溶性有機(jī)助溶劑時(shí)，其總濃度可以為不超過(guò)30％或不超過(guò)25％。水不可混溶性有機(jī)助溶劑可以以任何比例、以總濃度被使用。
有機(jī)助溶劑的實(shí)例包括技術(shù)上常見的溶劑如醚類(例如四氫呋喃、二烷或叔丁基甲基醚(TBME))、低級(jí)醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、叔丁醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、極性非質(zhì)子溶劑(例如二甲基亞砜、二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺或丙酮)和鏈烷烴(例如庚烷)或環(huán)烷烴(例如環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中酶促反應(yīng)在存在有機(jī)助溶劑的情況下進(jìn)行，所述的有機(jī)助溶劑選自水不可混溶性助溶劑，例如TBME、庚烷；環(huán)己烷和甲基環(huán)己烷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中酶促反應(yīng)在存在環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷的情況下進(jìn)行。
所述酶促反應(yīng)可以在存在水溶性添加劑的情況下進(jìn)行，例如在存在鹽、多元醇、聚乙二醇或其衍生物的情況下進(jìn)行。添加劑可對(duì)酶具有活化、選擇性觸發(fā)或穩(wěn)定作用。
鹽的實(shí)例包括氯化鈉或氯化鉀，也可以是其它添加劑例如LiSCN、Na2SO4和Mg2SO4。特別地，水性緩沖液可含有已知是酶活化劑的鎂離子。鹽可以以不超過(guò)1M或不超過(guò)0.5M的濃度存在。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種方法，其中酶促反應(yīng)在存在鎂鹽的情況下進(jìn)行。
多元醇的實(shí)例包括甘油和糖。多元醇可以以不超過(guò)水相40％(w/w)的濃度存在。
任選地為單-或二甲基醚形式的聚乙二醇(PEG)可以以不超過(guò)50％(w/v)或以5％至25％的濃度被使用。例如，可以使用任選地為單-或二甲基醚形式的4kD至6kD的聚乙二醇。
在加入酶后，可以將反應(yīng)混合物的pH維持在所選擇的pH-值下，例如所述酶促反應(yīng)可以在pH 3.5至pH 10.0或pH 4.0至pH 8.0或pH 5.5至pH 7.0的pH下進(jìn)行。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法維持恒定的pH值，例如控制性地加入堿例如氫氧化鈉或氫氧化鉀或碳酸氫鈉或碳酸氫鉀的水溶液或者選擇具有足夠緩沖容量的緩沖液。
所述酶促反應(yīng)可以在4℃至45℃的溫度下或在15℃至35℃的溫度下或在26℃至32℃的溫度下進(jìn)行。
反應(yīng)終止后，可以通過(guò)萃取將式I化合物和式II化合物分離出來(lái)。
例如，可以通過(guò)用適宜的有機(jī)溶劑例如二氯甲烷萃取反應(yīng)混合物來(lái)對(duì)式II化合物進(jìn)行常規(guī)后處理。將溶液濃縮后，式II化合物可析出結(jié)晶，從而可以容易地增加其光學(xué)純度。
殘留在水相中的對(duì)映體形式的(antipodal)式I化合物可以通過(guò)隨后在更低pH值下對(duì)水相進(jìn)行萃取來(lái)分離。這通?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)保留的水相進(jìn)行酸化和將所形成的沉淀濾出或者通過(guò)用適宜的有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯進(jìn)行萃取來(lái)實(shí)現(xiàn)。將溶液濃縮后，式I化合物可析出結(jié)晶，從而可以增加其光學(xué)純度。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備式I化合物和/或式II化合物的方法，其包括(a)使式III化合物與來(lái)自酵母的膽固醇酯酶接觸，和(b)通過(guò)在不同pH下進(jìn)行萃取分離所得的式I化合物和所得的式II化合物。
如果水溶性添加劑與式I或式II的化合物一起被共萃取出來(lái)，則可能需要進(jìn)行另外的萃取步驟以將各反應(yīng)產(chǎn)物與添加劑分離開?；蛘撸梢允褂梦綐渲螂x子交換樹脂。對(duì)所用特定萃取方案進(jìn)行選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)并且取決于添加劑、例如PEG添加劑的具體性質(zhì)。例如，可以通過(guò)用例如二氯甲烷進(jìn)行萃取(通過(guò)與保留的式II化合物一起共萃取)將聚乙烯與式I化合物分離開，隨后可以用乙酸乙酯通過(guò)溶劑改變或通過(guò)研磨/消化(聚乙烯在這些條件下不溶)將聚乙烯與保留的式II化合物的級(jí)分分離開。
可以將由本發(fā)明的方法獲得的化合物、即式I化合物和式II化合物在羧酸或酯官能度上進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的衍生化反應(yīng)，生成例如化合物如甲酰胺、N-取代的甲酰胺、N，N-二取代的甲酰胺、甲脒、N-羥基-甲脒、羧酸羥酰胺、羧酸酰肼、腈、醛、酮、異氰酸酯、異硫氰酸酯、氨基甲酸酯、脲、N-取代的脲、N，N-二取代的脲、伯，仲和叔胺、N-酰胺、胍、氨基甲基-、羥基甲基衍生物以及酯衍生物。
這類化合物的實(shí)例包括式IVa或式IVb化合物 其中R21、R22、R23和R24具有式I、II和III中所定義的含義，并且R是CN、CHO、CH2R4、C(O)R5、C(O)NHR6、C(NH)NH2、NHR7或C(O)OR8；R4是OH或NH2；R5是(C1-C6)-烷基；R6是H、OH、NH2或(C1-C6)-烷基；R7是H或C(NH)NH2；且R8是(C1-C6)-烷基。
式IVa和IVb的化合物是新化合物并且也形成了本發(fā)明的實(shí)施方案。
為了使兩種對(duì)映體中的一種重結(jié)晶，可以用堿例如醇化物或1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)進(jìn)行式II化合物的外消旋化，和在酯化后，進(jìn)行式I化合物的外消旋化。
由本發(fā)明的方法獲得的化合物、即式I化合物和式II化合物以及式IVa和IVb的化合物是有價(jià)值的構(gòu)造塊，可用于合成化學(xué)、農(nóng)業(yè)學(xué)和藥學(xué)工業(yè)中有用的產(chǎn)品，例如可用于合成藥學(xué)活性化合物，例如可用于治療疾病如帕金森病、阿爾茨海默病或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的單胺氧化酶抑制劑。
例如，可以使(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸與醇、優(yōu)選甲醇或乙醇進(jìn)行反應(yīng)，從而在酸催化下得到相應(yīng)的(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯。該酯可以用未被取代的或被取代的選自芐基鹵化物的芐基衍生物、甲苯磺酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)或三氟甲烷磺酸酯(三氟甲磺酸酯)通過(guò)Williamson-醚合成而被烷基化。所用的堿可以是碳酸鹽，如碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銫。溶劑的實(shí)例有低級(jí)酮如丙酮或2-丁酮。該反應(yīng)可以在20℃至回流溫度下進(jìn)行。另一種供選擇的烷基化方法是Mitsunobu-偶聯(lián)使任選地被取代的芐型醇與苯酚在惰性溶劑例如乙醚或四氫呋喃中、使用偶氮二甲酸二烷基酯、在存在膦類例如三丁基-或三苯基-膦的情況下進(jìn)行反應(yīng)。酯官能團(tuán)的水解可以用本身已知的方法進(jìn)行，如在酸性條件下水解，例如在使用鹽酸的酸性條件下水解，或在堿性條件下水解，例如使用氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀水解，用醇和水的混合物作為溶劑。然后，可以將所得的酸經(jīng)由形成相應(yīng)的異氰酸酯來(lái)進(jìn)行從碳原子到氮原子的親核遷移，如例如通過(guò)Hofmann或Curtius重排來(lái)進(jìn)行遷移。隨后用水性酸處理該異氰酸酯，直接得到相應(yīng)的胺。用適宜的醇處理該異氰酸酯中間體，得到氨基甲酸酯形式的被保護(hù)的氨基衍生物。對(duì)于該異氰酸酯的處理，選擇可產(chǎn)生用作胺保護(hù)基的典型氨基甲酸酯的醇，所述的胺保護(hù)基例如叔丁氧基羰基、芐氧基羰基或芴基甲氧基羰基。用于裂解成胺的方法在文獻(xiàn)中是眾所周知的?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成N-酰胺，如例如通過(guò)與活化的酰基衍生物、例如酰鹵或酸酐進(jìn)行反應(yīng)或者通過(guò)使用例如碳二亞胺作為縮合劑的酸的縮合反應(yīng)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而得到化合物如(S)-N-{1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-乙酰胺(實(shí)施例10)。
可以將(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯通過(guò)上文所述的Williamson-醚合成或Mitsunobu-偶聯(lián)用未被取代的或被取代的芐基衍生物進(jìn)行烷基化。酯官能團(tuán)的水解可以用本身已知的方法進(jìn)行，如在酸性條件下水解，例如在使用鹽酸的酸性條件下水解，或在堿性條件下水解，例如使用氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀水解，用醇和水的混合物作為溶劑。然后，可以用標(biāo)準(zhǔn)操作方法將所得的酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰胺。對(duì)于與伯胺或仲胺的反應(yīng)而言，可以使用縮合試劑，如碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺或苯并三唑衍生物例如O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)，從而得到化合物如(R)-1-[4-(4-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲基酰胺(實(shí)施例9)。
在實(shí)施例中，使用了以下縮寫ISN-MS離子噴霧負(fù)質(zhì)譜；EI-MS電子碰撞質(zhì)譜；NMR核磁共振光譜；IR紅外光譜；HPLC高效液相色譜法；min分鐘；RT室溫；HBTUO-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲-六氟磷酸鹽；TBME叔丁基甲基醚；HV高真空實(shí)施例1(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯的制備a)將2.355mol 4-氨基苯酚和2.32mol衣康酸的混合物逐漸加熱在60℃下，該粉末開始變粘，在110-120℃下，其變成液體并且顏色變成深棕色，同時(shí)剩余的固體物質(zhì)也溶解。在沸騰下開始該放熱反應(yīng)并且溫度升至150℃。在1-2小時(shí)內(nèi)將沙質(zhì)產(chǎn)物放置冷卻至RT。將所得的粗品(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸不經(jīng)進(jìn)一步純化或表征直接用于下一步。
b)將粗品(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸溶解于5000ml甲醇、24ml濃硫酸和400ml 2，2-二甲氧基丙烷的混合物中并將其在回流下攪拌2小時(shí)。通過(guò)蒸餾使反應(yīng)溶液的體積降至一半，然后將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)20L的容器中。在40℃下進(jìn)行攪拌的同時(shí)，加入2500ml水/冰(1∶1)混合物。立即開始結(jié)晶，然后，在過(guò)濾漏斗上收集細(xì)小的白色結(jié)晶。共計(jì)用2000ml冷水對(duì)其進(jìn)行洗滌直至濾液為中性。將該產(chǎn)物減壓干燥，得到980g(理論值的84％，2步)(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，為白色固體；MSm/e＝234(M+H)+。
用與實(shí)施例1b)中所述方法相似的方式，通過(guò)使粗品(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸與乙醇反應(yīng)，得到(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸乙酯，為白色固體；MSm/e＝248(M-H)+。
實(shí)施例2(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯和(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制備a)在適度攪拌下，將213.5mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(98％HPLC)混懸于500ml環(huán)己烷中。加入2.0L 3mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0，含有0.1M氯化鈉和50mM硫酸鎂)，將所得的乳液/混懸液重新調(diào)節(jié)至pH 6.0并將溫度設(shè)定為30℃。通過(guò)加入201mg來(lái)自柱狀假絲酵母的膽固醇酯酶(Roche Applied Science，Industrial Products，EnzymeProjects，Sandhofer Str.116，D-68305 Mannheim，德國(guó)，訂貨號(hào)為10129046103，下文被稱為酶)來(lái)開始水解并通過(guò)在適度攪拌下控制性加入0.1N NaOH溶液(pH-恒定)而將pH恒定保持在6.0。在共消耗1016ml滴定劑(一整夜；轉(zhuǎn)化率為48.6％)后，用3.5L和2×2.5L二氯甲烷(開始時(shí)為渾濁相)、然后用3.5L乙酸乙酯(被棄去的有機(jī)相)萃取反應(yīng)混合物。將合并的二氯甲烷相用硫酸鈉干燥、蒸發(fā)并在HV下干燥，得到22.5g(95.6mmol；44.8％)(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，為白色晶體。分析HPLC＞99％。對(duì)映體過(guò)量96.3％(Chiralpak AD，250×4.6mm；70％己烷+10％0.1％TFA的己烷溶液+20％乙醇；1ml/min；DADsig＝210.8nm，ref＝360.1nm；應(yīng)用的樣品0.5μl 2mg/ml 1％TFA的EtOH溶液)。[δ]D＝-27.7°(c＝1.02；EtOH)。EI-MSm/e＝235.1(M；67)，122.0(100)。1H-NMR(400MHz；CDCl3)2.89(ddd，2H，-CHaHb-)，3.37(m，1H，-CHCOO)，3.78(s，3H，COOCH3)，4.03(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，6.08(s，1H，Ph-OH)，6.77，7.30(AA’XX’，2x2H，C6H4)。
b)用32％鹽酸將二氯甲烷和乙酸乙酯萃取后剩余的水層的pH設(shè)定為2.2，用3×3.5L乙酸乙酯進(jìn)行萃取。將合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥、蒸發(fā)并在HV下干燥，得到21.9g(99.0mmol；46.4％)(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，為白色固體。分析HPLC＞99％。對(duì)映體過(guò)量99.1％(方法見上)。[δ]D＝25.4°(c＝1.05；EtOH)。EI-MSm/e＝221.1(M；57)，122.0(100)。
1H-NMR(400MHz；MeOD)2.83(dd，2H，-CHaHb-)，3.39(m，1H，-CHCOO)，4.05(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，6.79，7.31(AA’XX’，2x2H，C6H4)。
實(shí)施例3在存在各種有機(jī)助溶劑的情況下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解a)在攪拌下，向2.13mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(98％)在5ml TBME中的混懸液中加入2ml 50mM硫酸鎂和20ml 3mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0，含有0.1M氯化鈉和0.02％疊氮化鈉)。通過(guò)加入10mg酶來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)控制性加入0.1N NaOH而將pH維持在6.0。在消耗10.4ml(轉(zhuǎn)化率49.9％；45小時(shí))后，用3×50ml二氯甲烷萃取反應(yīng)混合物，將合并的有機(jī)相蒸發(fā)并進(jìn)行對(duì)映體過(guò)量測(cè)定。將水性酸化至pH 2，用3×50ml乙酸乙酯萃取，將合并的有機(jī)相蒸發(fā)并進(jìn)行對(duì)映體過(guò)量(ee)-測(cè)定。b)在適度攪拌下，向4.25mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(含有大約2％各外消旋酸)在10ml有機(jī)溶劑(見下表)中的混懸液中加入39ml 3mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0，含有50mM氯化鎂和0.1M氯化鈉)并將其溫度設(shè)定為28℃。通過(guò)加入6.5mg溶解于1.0ml去離子水中的酶來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)控制性加入0.1N NaOH來(lái)將其pH維持在6.0。在大約50％轉(zhuǎn)化后，與實(shí)施例3a相似地對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行后處理。
表在存在各種有機(jī)助溶劑的情況下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解
a根據(jù)所消耗的滴定劑的量獲得(相對(duì)于100％純物質(zhì)計(jì)算得到)b其測(cè)定如實(shí)施例2所述實(shí)施例4在存在各種添加劑的情況下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解在適度攪拌下，向4.25mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(含有大約2％各外消旋酸)在10ml環(huán)己烷中的混懸液中加入添加劑(見下表)在3mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0，含有50mM氯化鎂和0.1M氯化鈉)(下表給出的量)中的溶液，并將溫度設(shè)定為28℃。通過(guò)加入6.5mg溶解于1.0ml去離子水中的酶來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)控制性加入0.1N NaOH而將pH維持在6.0。在大約50％轉(zhuǎn)化后，與實(shí)施例3a)相似地對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行后處理。
表在存在各種添加劑的情況下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解
a根據(jù)所消耗的滴定劑的量獲得(相對(duì)于100％純物質(zhì)計(jì)算得到)b其測(cè)定如實(shí)施例2所述實(shí)施例5在存在各種鹽添加劑的情況下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解在適度攪拌下，向4.25mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(含有大約2％各外消旋酸)在10ml環(huán)己烷中的混懸液中分別加入39ml 3mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0，含有一種或兩種中性鹽)(見下表)并將溫度設(shè)定為28℃。通過(guò)加入6.5mg溶解于1.0ml去離子水中的酶來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)控制性加入0.1N NaOH而將pH維持在6.0。在大約50％轉(zhuǎn)化后，與實(shí)施例3a)相似地對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行后處理。
表在存在各種鹽添加劑的情況下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解
a根據(jù)所消耗的滴定劑的量獲得(相對(duì)于100％純物質(zhì)計(jì)算得到)b其測(cè)定如實(shí)施例2所述實(shí)施例6在各種條件下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解在適度攪拌下，向(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(其量見下表；含有大約2％各外消旋酸)在有機(jī)溶劑(見下表)中的混懸液中加入含有添加劑(見下表)的緩沖水溶液，將溫度設(shè)定為28℃。通過(guò)加入溶解于1.0ml去離子水中的酶(其量見下表)來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)控制性加入0.1NNaOH而將pH維持在6.0。在大約50％轉(zhuǎn)化后，與實(shí)施例3a)相似地對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行后處理。
表在各種條件下進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解
a根據(jù)所消耗的滴定劑的量獲得(相對(duì)于100％純物質(zhì)計(jì)算得到)b其測(cè)定如實(shí)施例2所述c用0.1N NaOH溶液作為滴定劑所用的縮寫CH環(huán)己烷(10ml)；MCH甲基環(huán)己烷(10ml)；PPB150mMMgCl2，0.1M NaCl，pH 6.0的3mM磷酸鉀緩沖液(31ml)；PPB2100mMMgCl2，0.1M NaCl，pH 6.0的3mM磷酸鉀緩沖液(31ml)；MgAc2100mM二醋酸鎂pH 6.0；PG聚乙二醇200；PGM聚乙二醇5000單甲醚實(shí)施例7用不同酯進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解在適度攪拌下，向4.01mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸乙酯在10ml環(huán)己烷中的混懸液中加入39ml 3mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0，含有50mM氯化鎂)并將溫度設(shè)定為28℃。通過(guò)加入6.5mg溶解于1.0ml去離子水中的酶來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)控制性加入0.1N NaOH而將pH維持在6.0。反應(yīng)完全后，與實(shí)施例3a)相似地對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行后處理。
表用不同酯進(jìn)行的對(duì)映選擇性水解
a根據(jù)所消耗的滴定劑的量獲得(相對(duì)于100％純物質(zhì)計(jì)算得到)b其測(cè)定如實(shí)施例2所述實(shí)施例8(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯和(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制備a)(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯的制備在適度攪拌下，將106.3mmol(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(98.2％HPLC；含有0.2％外消旋酸)混懸于100ml甲基環(huán)己烷中。將20.00g聚乙二醇單甲醚5000溶解于380ml pH 6.0的0.1M醋酸鎂中(攪拌0.5小時(shí)；體積為大約398ml)，將該溶液倒入上述混懸液。將所得的乳液/混懸液重新調(diào)至pH 6.0并將溫度設(shè)定為28℃。通過(guò)加入83mg酶來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)在適度攪拌下控制性加入1.0N NaOH-溶液(pH-恒定)而將pH恒定保持在6.0。17.2小時(shí)和共消耗49.64ml滴定劑(轉(zhuǎn)化率47.5％)后，通過(guò)加入500ml二氯甲烷來(lái)終止反應(yīng)。用4×500ml二氯甲烷(開始時(shí)為渾濁相)、隨后用500ml乙酸乙酯(被棄去的有機(jī)相)萃取反應(yīng)混合物。將合并的二氯甲烷相用硫酸鈉干燥并進(jìn)行蒸發(fā)。將殘余物在400ml乙酸乙酯中研磨一整夜以除去不溶性PEG。將混懸液過(guò)濾，蒸發(fā)濾液，將殘余物用二氯甲烷重結(jié)晶，得到11.27g(47.9mmol；45.1％)(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，為白色晶體。分析HPLC99.4％(A226nm)。對(duì)映體過(guò)量97.8％(方法見實(shí)施例2)。[δ]D＝-29.1°(c＝1.04；EtOH)。ISN-MSm/e＝294.2(M+OAc；70)，234.0(M-H；100)。IR(Nujol)3292，2923，2854，1742，1662，1615，1269，1221，1029，832cm-1。1H-NMR(400MHz；CDCl3)2.89(ddd，2H，-CHaHb-)，3.48(m，1H，-CHCOO)，3.78(s，3H，COOCH3)，4.03(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，5.59(s，1H，Ph-OH)，6.78，7.33(AA’XX’，2x2H，C6H4)b)(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制備用25％硫酸將水相的pH調(diào)至2.0并用4×500ml乙酸乙酯對(duì)其進(jìn)行萃取。將合并的有機(jī)相用硫酸鈉干燥、蒸發(fā)，將殘余物用TBME重結(jié)晶，得到10.49g(47.4mmol；44.6％)(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，為白色固體。分析HPLC99.9％(A226nm)。對(duì)映體過(guò)量98.2％(方法見上；保留時(shí)間(R)-酸12.44min，(S)-酸16.25min)。[δ]D＝+25.0°(c＝1.01；EtOH)。ISN-MSm/e＝220.1(M-H；100)。IR(Nujol)3419，2925，2854，2600，1702，1628，1613，1519，1277，1211，1130，837cm-1。1H-NMR(400MHz；DMSO)2.67(ddd，2H，-CHaHb-)，3.31(m，1H，-CHCOO)，3.92(ddd，2H，C(O)NCHaHb)，6.74，7.38(AA’XX’，2x2H，C6H4)。NMR表明該產(chǎn)物含有約2％PEG。
實(shí)施例9(R)-1-[4-(4-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲基酰胺的制備a)在0℃下，將4.3mmol 4-氟-芐醇和4.7mmol三苯膦在7ml四氫呋喃中的溶液滴加到4.7mmol(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯[實(shí)施例2a)或8a)]和4.7mmol偶氮二甲酸二異丙酯在11ml四氫呋喃中的溶液中。使該混合物升溫至RT并將其繼續(xù)攪拌18小時(shí)。加入2g硅膠后，將反應(yīng)混合物減壓蒸發(fā)。將所得物質(zhì)在硅膠上進(jìn)行色譜處理，首先用庚烷和乙酸乙酯的2∶1混合物、然后用庚烷和乙酸乙酯的1∶1混合物作為洗脫劑，得到(R)-1-[4-(4-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯，為白色固體；MSm/e＝344(M+H)+。
b)將3.7mmol(R)-1-[4-(4-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯在77ml二烷中的溶液用8.64ml鹽酸(37％)處理。將該混合物在封閉的燒瓶中于52℃下加熱18小時(shí)。將該溶液減壓蒸發(fā)，得到微黃色固體形式的粗品酸。將粗品酸在-5℃下用10ml乙酸乙酯研磨。在過(guò)濾漏斗上收集固體，然后將其在高真空下干燥，得到(R)-1-[4-(4-氟-芐氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，為白色固體；MSm/e＝330(M+H)+。
c)將被冷卻至0℃的1.82mmol(R)-1-[4-(4-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸在37ml N，N-二甲基甲酰胺中的溶液連續(xù)用2.0mmol三乙胺、1.82mmol HBTU、2.2mmol鹽酸甲胺和2.0mmol三乙胺進(jìn)行處理。除去冰浴，繼續(xù)在RT下進(jìn)行攪拌。30min后停止反應(yīng)，將該橙色的溶液減壓蒸發(fā)。將所得的殘余物用1ml乙酸乙酯研磨，濾出白色固體產(chǎn)物，其后將其溶解于二氯甲烷中并將溶液用水洗滌三次。將有機(jī)相用硫酸鈉干燥，然后減壓蒸發(fā)，得到409mg(理論值的66％)(R)-1-[4-(4-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲基酰胺，為白色固體。MSm/e＝343(M+H)+；對(duì)映體過(guò)量＞99.5％。
實(shí)施例10(S)-N-{1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-乙酰胺的制備a)在氮?dú)鈿夥铡?℃下，將110.6mmol 3-氟-芐醇和108.8mmol三苯膦在150ml四氫呋喃中的溶液在50min內(nèi)滴加到100.5mmol(S)-1-(4-羥基-苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯和100.5mmol偶氮二甲酸二異丙酯在200ml四氫呋喃中的溶液中。使該混合物升溫至RT，繼續(xù)攪拌18小時(shí)。將該混合物減壓蒸發(fā)。將固體殘余物在400ml乙醚中研磨，得到主要由產(chǎn)物和氧化三苯膦組成的白色固體。過(guò)濾后，將固體物質(zhì)用100ml冷甲醇研磨，得到白色固體形式的(S)-1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯[MSm/e＝344(M+H)+]以及痕量的三苯膦和氫化偶氮二甲酸二異丙酯(diisopropyl hydrazodicarboxylate)。
b)將74.6mmol(S)-1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯在650ml二烷中的溶液用175ml鹽酸(37％)處理。將該混合物在封閉的燒瓶中于50℃下加熱18小時(shí)。將該溶液減壓蒸發(fā)，得到黃色固體形式的粗品。將粗品酸在0℃下用50ml乙酸乙酯進(jìn)行研磨。在過(guò)濾漏斗上收集固體，然后在高真空下干燥，得到(S)-1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸，為微黃色固體；MSm/e＝330(M+H)+。
c)將61mmol(S)-1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸在300ml二烷中的溶液用61mmol N-甲基嗎啉處理。其后，將該反應(yīng)混合物冷卻至-8℃并加入61mmol氯甲酸異丁酯。攪拌5min后，加入121mmol疊氮化鈉在40ml水中的溶液，同時(shí)使溫度升至0℃。在0℃下攪拌70min后，將混懸液用Dicalite過(guò)濾。將濾液用700ml甲苯稀釋并轉(zhuǎn)移到一個(gè)分液漏斗中。分離出有機(jī)層，然后用250ml飽和碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，用200ml飽和氯化鈉溶液洗滌兩次。其后，將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，加入400ml甲苯后，蒸發(fā)掉溶劑和殘余的異丁醇，最后至約350ml的體積。將該溶液逐漸加熱至80℃并將其在該溫度下保持70min。冷卻后，將異氰酸酯中間體的溶液濃縮至約300ml并將其滴加到25.4ml鹽酸(37％)在100ml二烷中的溶液中，同時(shí)加熱至45℃。最后，在完全加入后，使溫度升高至60℃達(dá)1小時(shí)，鹽酸鹽已經(jīng)開始沉淀。將該混合物冷卻至0℃并在過(guò)濾漏斗上收集所形成的固體物質(zhì)。用叔丁基甲基醚洗滌后，將產(chǎn)物在高真空下干燥。得到鹽酸(S)-4-氨基-1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-吡咯烷-2-酮，為白色固體。MSm/e＝301(M+H)+。
d)將11.3mmol鹽酸(S)-4-氨基-1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-吡咯烷-2-酮在86ml二氯甲烷中的混懸液用23.8mmol三乙胺進(jìn)行處理并冷卻至0℃。向該溶液中加入12.5mmol乙酰氯并在0℃下繼續(xù)攪拌15min。關(guān)于后處理，將反應(yīng)混合物用100ml水萃取兩次。將有機(jī)層分離出來(lái)，用硫酸鈉干燥并減壓蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物在100ml甲苯中進(jìn)行研磨，然后在過(guò)濾漏斗上收集固體。在第二步中，將產(chǎn)物在200ml叔丁基甲基醚中于RT下進(jìn)行研磨。再次在過(guò)濾漏斗上收集固體產(chǎn)物并將其在高真空下干燥。得到(S)-N-{1-[4-(3-氟-芐基氧基)-苯基]-5-氧代-吡咯烷-3-基}-乙酰胺，為白色固體。MSm/e＝343(M+H)+；對(duì)映體過(guò)量＞99.5％。
實(shí)施例11(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸的制備在攪拌下，將8.00g聚乙二醇6000溶解于150mL pH 6.0的100mM醋酸鎂緩沖液中，將該溶液加入到進(jìn)行著攪拌的10.00g(42.51mmol)(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸甲酯(99.7％)在40mL甲基環(huán)己烷中的混懸液中。將該混合物加熱至28℃并用2M NaOH將pH重新調(diào)節(jié)至6.0。通過(guò)加入33.2mg柱狀假絲酵母膽固醇酯酶(16.88kU/g)來(lái)開始反應(yīng)并通過(guò)在攪拌下控制性加入1.0M NaOH溶液而將pH維持在6.0。在共計(jì)消耗20.35mL(20.35mmol)1.0M氫氧化鈉溶液后(17.1小時(shí)后；轉(zhuǎn)化率47.9％)，用垂熔玻璃漏斗對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行過(guò)濾。濾液自動(dòng)分離成水相和有機(jī)相。將水相用2×200ml乙酸乙酯洗滌以除去未裂解的酯。用25％的硫酸將水相的pH調(diào)至4.0并將其真空濃縮至約80ml的體積(浴溫為60℃)。將該溶液冷卻至1℃(形成白色沉淀/晶體)，用25％的硫酸將pH調(diào)至1.5。將沉淀/晶體在1℃下攪拌一整夜，用玻璃垂熔漏斗濾出(用最少量的水洗滌)并在高真空下干燥一整夜(RT，6×10-2mbar)，得到4.32g(19.53mmol；45.9％)(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸。分析HPLC(A226nm面積)99.3％，0.7％酯。98.9％ee。該產(chǎn)物含有5.3％水(根據(jù)Karl Fischer測(cè)定法測(cè)得)和2.1％(w/w)PEG(根據(jù)NMR測(cè)得)。
權(quán)利要求
1.一種制備式I化合物和/或式II化合物的方法，所述的式I化合物是 其中R21、R22和R23彼此獨(dú)立地是氫或鹵素；且R24是氫、甲基或鹵素；所述的式II化合物是 其中R1是(C1-C8)-烷基、(C2-C4)-鏈烯基或式A的基團(tuán)R3(OCH2CH2)n-(A)其中R3是氫或(C1-C4)-烷基；且n是1、2或3；并且R21、R22、R23和R24具有上文所定義的含義，該方法包括使式III化合物與來(lái)自酵母的膽固醇酯酶接觸， 其中R1、R21、R22、R23和R24具有上文所定義的含義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的來(lái)自酵母的膽固醇酯酶是來(lái)自柱狀假絲酵母(Candida cylindracea)的膽固醇酯酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的來(lái)自酵母的膽固醇酯酶是由Roche Applied Science，Industrial Products，Enzyme Projects，Sandhofer Str.116，D-68305 Mannheim，德國(guó)提供的、訂貨號(hào)為10129046103、0393916或0396800的可商購(gòu)獲得的膽固醇酯酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中式III化合物以0.5至20％總濃度(w/w)的濃度被應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24彼此獨(dú)立地是氫或氟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在式III中，R21、R22、R23和R24是氫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在式III中，R1是甲基或乙基。
8.一種制備(S)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸和(R)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯的方法，其包括使(RS)-1-(4-羥基苯基)-5-氧代-吡咯烷-3-甲酸酯與來(lái)自酵母的膽固醇酯酶接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中緩沖液、例如磷酸鉀緩沖液或二醋酸鎂以約3mM至約1M被使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中存在有機(jī)助溶劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的助溶劑是叔丁基甲基醚、環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法在存在添加劑的情況下進(jìn)行，所述添加劑選自鎂鹽、多元醇和聚乙二醇以及聚乙二醇衍生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的鹽以不超過(guò)1M的濃度存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的多元醇以不超過(guò)水相40％(w/v)的濃度存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的聚乙二醇(PEG)選自分子量為4kD至6kD、任選地為單-或二甲基醚形式的PEG。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中聚乙二醇的濃度為不超過(guò)50％(v/v)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)是在pH 3.5至pH 10的pH下進(jìn)行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)是在4℃至45℃的溫度下進(jìn)行的。
19.一種制備權(quán)利要求1中的式I化合物和/或權(quán)利要求1中的式II化合物的方法，其包括(a)使權(quán)利要求1中的式III化合物與來(lái)自酵母的膽固醇酯酶接觸，和(b)通過(guò)在不同pH下進(jìn)行萃取分離所得的式I化合物和式II化合物。
20.權(quán)利要求1中的式I化合物。
21.權(quán)利要求1中的式II化合物。
22.權(quán)利要求1中的式I化合物或式II化合物的衍生物，其中所述的衍生物選自甲酰胺、N-取代的甲酰胺、N，N-二取代的甲酰胺、甲脒、N-羥基-甲脒、羧酸羥酰胺、羧酸酰肼、腈、醛、酮、異氰酸酯、異硫氰酸酯、氨基甲酸酯、脲、N-取代的脲、N，N-二取代的脲、伯，仲和叔胺、N-酰胺、胍、氨基甲基-、羥基甲基衍生物以及酯衍生物。
23.式IVa或式IVb的化合物， 其中R21、R22、R23和R24具有權(quán)利要求1中的式I、II和III中所定義的含義，并且R是CN、CHO、CH2R4、C(O)R5、C(O)NHR6、C(NH)NH2、NHR7或C(O)OR8；R4是OH或NH2；R5是(C1-C6)-烷基；R6是H、OH、NH2或(C1-C6)-烷基；R7是H或C(NH)NH2；且R8是(C1-C6)-烷基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備可用于合成有價(jià)值的藥學(xué)活性化合物、例如MAOB抑制劑的對(duì)映純中間體的方法以及式(I)和(II)的新中間體，其中R
文檔編號(hào)C07D207/26GK1882695SQ200480033700
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者H·伊丁, D·克魯梅納赫, B·沃爾茲, W·沃斯特爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司