專利名稱：用于增強植物脅迫耐受性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物中冷、旱、鹽、冷發(fā)芽(cold germination)、熱和其他非生物脅迫耐受性以及植物中病毒、真菌、細菌和其他非生物脅迫耐受性。具體來說，本發(fā)明涉及一種通過在植物細胞內表達冷休克蛋白增強所述植物生物和非生物脅迫耐受性的方法。
背景技術：
種子和果實生產是數十億美元的商品行業(yè)，對于美國許多州和世界上許多國家來說是其收入的主要來源。商業(yè)上有價值的種子包括，例如，低芥酸菜子(canola)、棉籽和向日葵籽，其備受珍視，因為從種子中可以榨取植物油。諸如豌豆、菜豆和小扁豆的豆科植物的種子由于它們富含蛋白質，因此在商業(yè)上也有價值，例如，就大豆來說，其含有40-45％的蛋白質及18％的脂類和油類。此外，咖啡亦是一種有價值的作物，由干燥并烘烤過的阿拉伯咖啡(Coffeaarabica)植物的種子制成，而巧克力則由可可樹種子或“豆”制成。同樣地，許多果實和種子在商業(yè)上也有價值，包括，例如玉米、稻、小麥、大麥和其他谷類、堅果、豆類、西紅柿和柑橘類水果。例如，玉米種子可制成多種食品或用于烹飪的物品，如玉米面豆卷殼、玉米油、玉米餅、玉米片、玉米面等。玉米也用作為許多產品生產的原料，包括但不限于，飼料和酒精生產。
由于生物和非生物脅迫，種子和果實生產固有地受之所限。例如，大豆(Glycine max)是一種在貯藏期間遭受種子發(fā)芽損失并當土壤溫度降低時無法發(fā)芽的作物(Zhang等，Plant Soil 188(1997))。這種現象實際上也存在于玉米和其他重要的農作物中。改善植物的非生物脅迫耐受性在農業(yè)上將有利于作物，使得生長增加和/或在冷、旱、洪澇、熱、紫外線脅迫、臭氧增加、酸雨、污染、鹽脅迫、重金屬、礦化土壤和其他非生物脅迫下發(fā)芽。生物脅迫，例如真菌和病毒感染，在世界范圍內也導致大量作物減產。
幾世紀來，傳統育種(將一種基因型的特定等位基因與另一種雜交)業(yè)已用于增強生物脅迫耐受性、非生物脅迫耐受性和產量。傳統育種固有地受限于親本植物中所存在的有限數量的等位基因。其又限制了以這種方式累積的遺傳變異性的數量。分子生物學已容許本發(fā)明的發(fā)明人能廣泛地尋找可改善植物脅迫耐受性的基因。我們的發(fā)明人尋求確定其他生物如何對脅迫環(huán)境起反應并耐受之。冷休克蛋白是為細菌和其他生物在冷和脅迫環(huán)境下生存所使用系統的一部分。本發(fā)明人提出將編碼冷休克蛋白及其相關蛋白的基因導入植物中并表達，將能增強植物的冷、旱、熱、水分和其他非生物脅迫耐受性以及植物的真菌、病毒、和其他生物脅迫耐受性。他們也相信使用與冷休克蛋白同源或具有序列相似性的基因，也將能增強生物和非生物脅迫耐受性。
經營農業(yè)者可使用本發(fā)明來減少它們因生物和非生物脅迫所造成的損失。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種在植物細胞中表達冷休克蛋白(Csp)的植物。冷休克蛋白的表達在所述植物中產生了更強的非生物脅迫耐受性。在一個實施方案中，編碼冷休克蛋白的多核苷酸通過可操縱地連接到在植物中起作用的啟動子和終止子而得到表達。
更具體地說，本發(fā)明提供了一種重組DNA分子，在5’至3’方向包含包含在植物中起作用的啟動子的第一DNA多核苷酸，可操縱地連接到編碼冷休克蛋白的第二DNA多核苷酸，其可操縱地連接到提供多腺苷酸化位點的3’轉錄終止DNA多核苷酸。所述第一DNA多核苷酸通常優(yōu)選與第二DNA多核苷酸異源。本發(fā)明也提供了一種具有在第一DNA多核苷酸和第二DNA多核苷酸之間插入內含子的重組DNA分子。本發(fā)明也提供了一種重組DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸編碼一種包含SEQ ID NO3基序的蛋白。在本發(fā)明重組DNA的特定實施方案中，所述第二DNA多核苷酸編碼一種選自(a)具有基本上同一于革蘭氏陽性細菌冷休克蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，(b)來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的冷休克蛋白，(c)枯草桿菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，(d)具有基本上同一于SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白，(e)具有基本上同一于革蘭氏陰性細菌冷休克蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，(f)包含來自大腸桿菌(Escherichia coli)冷休克蛋白的蛋白，(g)大腸桿菌冷休克蛋白A(CspA)同系物，(h)具有基本上同一于SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白，(i)來自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的冷休克蛋白，和(j)具有基本上同一于SEQ ID NO5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63或65任一的氨基酸序列的蛋白。
本發(fā)明也提供了一種重組DNA分子，其中所述啟動子選自由誘導型啟動子、組成型啟動子、時序調節(jié)型啟動子、發(fā)育調節(jié)型啟動子、組織優(yōu)選型啟動子、低溫增強型啟動子、低溫特異性啟動子、脅迫增強型啟動子、脅迫特異性啟動子、干旱誘導型啟動子、缺水誘導型啟動子和組織特異性啟動子組成的組。
本發(fā)明也提供了在其基因組中包含上述重組DNA分子的植物細胞和植物以及繁殖體及由其產生的后代。植物包括，但不限于作物植物、單子葉植物和雙子葉植物。更具體地說，這些植物可包括大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麥、燕麥、草坪草、棉花和小麥。
本發(fā)明也提供了非生物脅迫耐受的轉基因植物，其已用表達冷休克蛋白的重組DNA分子轉化。這樣的植物及其細胞和諸如種子的繁殖體在它們的基因組中包含表達冷休克蛋白的重組DNA分子。這樣的植物具有一種或多種下列增強的性狀在限制相同種非轉化植物生長的低溫條件下更高的生長率，(a)在限制相同種非轉化植物生長的高溫條件下更高的生長率，(b)在限制相同種非轉化植物生長的水分條件下更高的生長率，(c)在限制相同種非轉化植物生長的土壤和/或水中增加的鹽類或離子條件下更高的生長率，(d)在冷休克后較相同種未轉化植物更大百分率的植物存活率，(e)當與相同種未轉化植物相比時增加的產量，或(f)與相同種未轉化植物相比對干旱的抗性。
本發(fā)明的一種方法包含繁殖本發(fā)明的植物，如，為了產生種子，僅通過將上述種子種植在土壤中并使之生長，如在脅迫環(huán)境下。更具體地說，本發(fā)明提供了一種生產的植物的方法，所述植物具有諸如非生物脅迫耐受性、增加的產量或增加的根群的增強的性狀。所述方法包括步驟a)將包含編碼冷休克蛋白DNA的重組DNA分子插入到植物細胞的基因組中，b)獲得轉化的植物細胞，c)從所述轉化的植物細胞再生植物；和d)擇具有增強的性狀的植物。
在本發(fā)明的一個方面，植物選自具有增強的非生物脅迫耐受性的植物，所述非生物脅迫耐受性選自耐熱性、耐鹽性、耐旱性和冷休克后存活。
本發(fā)明也提供了分離的蛋白質，其是至少40％同一于具有選自SEQ ID NOS5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的氨基酸序列的蛋白質。在某些方面，可通過用具有較40％同一性更高的同源性的蛋白質來取代冷休克蛋白以獲得類似的性狀。如，用與在此具體披露的冷休克蛋白具有至少50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性的蛋白質來取代。同樣地，本發(fā)明也提供了一種編碼冷休克蛋白基序的分離的核酸，其可與具有選自SEQ ID NOs4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，90和92的DNA序列的核酸雜交。
本發(fā)明也具體提供了編碼冷休克蛋白的分離的核酸，所述冷休克蛋白具有基本上同一于選自SEQ ID NOs5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65序列的DNA序列。
本發(fā)明也提供了包含上述重組DNA分子的繁殖體，當它們被種植或以其他方式發(fā)芽時，從所述繁殖體發(fā)芽的田間作物，如在上述繁殖體所播種的田地上。
本發(fā)明也提供了一種生產種子的方法，包括在土壤中種植權利要求59的種子；b)從所述植物收獲種子；因此生產得到種子。
也提供了一種生產轉基因植物的方法，所述方法包括步驟(i)將DNA分子導入植物細胞的基因組中，所述DNA分子包含至少40％同源于具有選自SEQ ID Nos5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的氨基酸序列的蛋白的DNA多核苷酸，或其片段、順式元件，其中所述DNA多核苷酸可操縱地連接到啟動子并且可操縱地連接到3’轉錄終止DNA多核苷酸；和(ii)選擇所述轉基因植物細胞；和(iii)在轉基因植物中再生所述轉基因植物細胞；也提供了通過該方法生產的植物。
附圖簡述

圖1顯示了pMON57396的質粒圖。
圖2顯示了pMON23450的質粒圖。
圖3顯示了pMON57397的質粒圖。
圖4顯示了pMON57398的質粒圖。
圖5顯示了pMON23450的質粒圖。
圖6顯示了pMON57399的質粒圖。
圖7顯示了pMON48421的質粒圖。
圖8顯示了pMON56609的質粒圖。
圖9顯示了pMON56610的質粒圖。
圖10顯示了pMON73607的質粒圖。
圖11顯示了pMON61322的質粒圖。
圖12顯示了pMON73608的質粒圖。
圖13顯示了pMON65154的質粒圖。
圖14顯示了pMON72472的質粒圖。
圖15顯示了pENTRl的質粒圖。
圖16顯示了表達指示基因植物和對照植物的生長型，顯示了所導入的基因提供了非生物脅迫耐受性。
圖17顯示了pMON42916的質粒圖。
圖18顯示了pMON73983的質粒圖。
圖19顯示了pMON73984的質粒圖。
具體實施方案詳述本發(fā)明提供了一種對生物和非生物脅迫具有增強的耐受性的植物。由于在所述植物的細胞中表達了冷休克蛋白(csp)，所提供的植物具有增強的脅迫耐受性。本發(fā)明提供了幾個實施方案的例子，并預計其他實施方案應能在本發(fā)明中起作用。
提供了下列定義和方法以便更好地定義本發(fā)明并指導本領域普通技術人員實踐本發(fā)明。除非另作說明，術語將依照本領域普通技術人員之慣例進行理解。例如，分子生物學和分子遺傳學的常用術語的定義可見于Lewin，Genes VII，Oxford University Press and CellPress，New York，2000；Buchanan，等，Biochemistry and MolecularBiology of Plants，Courier Companies，USA，2000；Lodish，等，Molecular Cell Biology，W.H.Freeman and Co.，New York，2000。遺傳學的常用術語可見于在前的參考文獻和Lynch，等，Genetics andAnalysis of Quantitative Traits，Sinauer and Associates，Sunderland，MA，1998；Hartwell，等，GeneticsFrom Genes toGenomes，McOraw-Hill Companies，Boston，MA，2000；Hartl，等，GeneticsAnalysis of Genes and Genomes，Jones and BartlettPublishers，Sudbury，MA；Strachan，等，Human MolecularGenetics，JohnWiley and Sons，New York，1999。
使用了37CFR§1.822所示的DNA堿基命名法。使用了標準的單字母和三字母氨基酸殘基命名法。
許多農學性狀能影響“產量”。例如，這些性狀可包括，不限于，株高、莢數、植物上莢位置、節(jié)間數量、莢裂傾角、粒度、根瘤和固氮作用效率、營養(yǎng)素同化作用效率、生物和非生物脅迫抗性、碳同化、植物結構、倒伏抗性、種子發(fā)芽率、幼苗活力以及幼株性狀。例如，這些性狀也可包括，不限于，發(fā)芽率(包括在脅迫條件下的發(fā)芽)、任一或所有植物部位的生長率(包括在脅迫條件下的生長率)、穗數量、每一穗的種子數量、種子粒度、種子成分(淀粉、油、蛋白質)、種子飽滿特性。可用多種方法來測定產量，這些方法可包括容重、種子重量、每株植物種子數量、每株植物種子重量、每單位面積種子數量或重量(即每英畝種子數量或種子重量)、每英畝蒲式耳數、每英畝公噸數、每英畝美噸數、每公頃公斤數。在一個實施方案中，本發(fā)明植物表現了增強的性狀，即為產量之一要素。
“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”指基因組或合成來源的單鏈或雙鏈DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)，即分別為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的多聚體，讀碼從5’(上游)末端到3’(下游)末端。所述核酸可為正義或互補(反義)鏈。
“天然的”指天然存在的(“野生型“)核酸序列。
“異源”序列指來源于外源或外來物種的序列，或者如果是相同來源的，則為來自其原型修飾的序列。例如，天然啟動子可用來使相同或不同物種中的異源基因發(fā)生轉錄。
植物“部位”包括植物的所有部位或部分，包括，但不限于，根、苗、葉、莖、花粉、種子、花、雄蕊、雌蕊、菌蕾、胚、花瓣、花絲、心皮(包括柱頭、子房和花柱)、細胞或上述的任何部分。
“繁殖體”包括減數分裂和有絲分裂的所有產物，包括但不限于，種子和能繁殖為新植物的植物部位。例如，繁殖體包括苗、根或其他能生長為完整植物的植物部位。繁殖體也包括嫁接體，在此植物的一部分嫁接到不同植物(甚至是不同種的植物)的另一部分上以產生活的生物體。繁殖體也包括通過克隆、通過聚集減數分裂產物或使減數分裂產物聚集形成胚或受精卵(天然地或人為干預的)所產生的所有植物和種子。
“分離的”核酸序列是基本上分離或純化的，不含其天然存在的生物體細胞中通常與之相關的其他核酸序列，即其他的染色體或DNA。該術語包括生物化學純化的核酸，使得基本上除去污染的核酸和其他細胞組分。該術語也包括重組核酸和化學合成的核酸。
在此使用的“同一性”或“同一的”，當涉及在蛋白質或核酸之間比較時，指98％或更高的同一性。
如果第一核酸或蛋白質序列顯示“基本上同一”或“基本上相似”于參照核酸序列或蛋白質，當與其他核酸(或其互補鏈)或蛋白質進行最優(yōu)比對(在比較窗口內具有總和小于參照序列的20％的適當的核苷酸或氨基酸插入或缺失)時，在至少20個核苷酸或氨基酸位置、優(yōu)選至少50個核苷酸或氨基酸位置、更優(yōu)選至少100個核苷酸或氨基酸位置、以及最優(yōu)選在全長的第一核酸或蛋白質的比較窗口內有至少約60％核苷酸序列相等，更好為70％，優(yōu)選至少約80％相等，更優(yōu)選至少約85％相等，以及最優(yōu)選至少約90％相等。用于比對比較窗口的最優(yōu)比對可通過局部同源性算法來執(zhí)行，優(yōu)選通過使用計算機執(zhí)行這些算法(可見于，例如，Wisconsin遺傳學軟件包7.0版，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)。所述參照核酸可以是全長分子或更長分子的一部分。換句話說，如果在嚴格條件下互相雜交，則兩個核酸是基本上同一的。合適的雜交條件可根據經驗來確定，或如果已知的話，可基于例如探針相對的G+C含量以及在探針和靶序列之間錯配數量來估計?？赏ㄟ^改變例如雜交溫度或鹽濃度而自由地調整雜交條件(Sambrook等.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Press，1989)。
當序列是如此排列使得第一核酸序列影響第二核酸序列的功能時，第一核酸序列是與第二核酸序列“可操縱地連接”。優(yōu)選地，所述兩個序列是單個連續(xù)核酸分子的一部分，更優(yōu)選是相鄰的。例如，如果在細胞中該啟動子調節(jié)或介導該基因的轉錄，則其與該基因是可操縱地連接。例如，當所述終止子導致RNA聚合酶在該終止子處或附近終止含有所述基因的轉錄產物時，轉錄終止區(qū)域(終止子)與該基因是可操縱地連接。例如，增強子通常并不與其所作用的啟動子相毗連，但是一般位于同一個核酸分子中。
通過人工組合兩種不同的分離的序列片斷制備得到“重組”核酸或DNA、或RNA分子，如，通過化學合成或通過基因工程技術操作分離的核酸片斷。用于核酸操作的技術眾所周知(參見，如.，Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。例如，在Beaucage和Carruthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.1033185，1981中討論了核酸化學合成所使用的方法，例如，可在商用寡核苷酸自動合成儀上進行核酸的化學合成。
基因“表達”指基因轉錄產生相應的mRNA以及該mRNA翻譯生成相應的基因產物，即肽、多肽或蛋白?；虮磉_受調控元件控制或調節(jié)，所述調控元件包括諸如啟動子的5’調控元件。
術語“重組DNA構建體”、“重組載體”、“表達載體”或“表達盒”指任何來源的，具有基因組整合或自主復制能力的所有介質，例如質粒、粘粒、病毒、BAC(細菌人工染色體)、自主復制序列、噬菌體、線狀或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，其包含DNA分子，其中一個或多個DNA序列業(yè)以功能上可操作的方式連接。
“互補”指核酸序列通過堿基配對的天然結合。如果僅有一些核酸配對是互補的，則兩個單鏈分子間的互補可以是部分的；或者如果所有的堿基對都是互補的，則上述單鏈分子間的互補是完全的?；パa度影響了雜交和擴增反應的效率和強度。
“同源性”指核酸或氨基酸序列之間相似性水平，用核苷酸或氨基酸同一性或相似性詞句，分別為序列相似性或同一性。同源性、同系物以及同源的也指在不同核酸或蛋白質之間具有相似功能性的概念。同系物包括定向進化同源和平行進化同源的基因。同系物可依所使用的基因編碼序列來確定，以一種或多種下列方式披露在此或見于合適的數據庫(例如NCBI或其他數據庫)。對于蛋白質序列而言，序列應當使用算法進行比較(例如參見涉及“同一性”和“基本上同一”部分的內容)。對于核苷酸序列而言，一個DNA分子的序列可與已知或推定同源的序列以大致相同的方式進行比較。在分子(DNA、RNA或蛋白質分子)任何完整的實質(25個核苷酸或氨基酸，更優(yōu)選50個核苷酸或氨基酸，更優(yōu)選100個核苷酸或氨基酸，或最優(yōu)選較短序列的全長)區(qū)域上，同系物具有至少20％、更優(yōu)選30％、更優(yōu)選40％、更優(yōu)選50％、更優(yōu)選60％、更優(yōu)選70％、更優(yōu)選80％、更優(yōu)選88％、更優(yōu)選92％、最優(yōu)選95％的同一性。
或者，如果具有相似功能的兩條序列，或其中一條或兩條序列的互補序列，在嚴謹條件下互相雜交，則兩條序列，或編碼或可編碼氨基酸序列的DNA或RNA是同源的，或是同系物，或編碼同源序列。因此，如果要確定兩條蛋白質序列是否是同系物，則這兩條序列都要進行在此描述的計算機作業(yè)，并創(chuàng)建所有可能的能編碼蛋白質的核酸序列的簡并密碼序列，確定它們是否能在嚴謹條件下雜交。促使DNA雜交的合適的嚴謹條件，例如，在約45℃下在6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在50℃下用2.0xSSC洗滌，為本領域技術人員所熟知，或可見于Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可從在50℃下約2.0xSSC的低嚴謹性到在50℃下約0.2xSSC的高嚴謹性中選擇。此外，洗滌步驟的溫度可從在約22℃的室溫下的低嚴謹條件遞增到約65℃的高嚴謹條件。溫度和鹽濃度都可以改變，或當溫度和鹽濃度中的一個變量改變時，另一個保持不變。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明所述蛋白的核酸在高嚴謹條件下可與一個或多個核酸分子或其互補分子或兩者的片段特異性雜交，例如在約65℃下在約2.0xSSC中?？赏ㄟ^本領域技術人員所熟知的多種方法檢測探針與靶DNA分子的雜交，這些方法包括，但不限于，熒光標記、放射性標記、基于抗體的標記和化學發(fā)光標記。
“冷休克蛋白”(Csp(s)或CSP(s))是具有與大腸桿菌CspA蛋白(SEQ ID NO1)或枯草桿菌CspB蛋白(SEQ ID NO2)大于40％同一性的蛋白，或者，冷休克蛋白可通過使用在文獻中所確定的保守結構域來發(fā)現。例如，在大腸桿菌CspA或枯草桿菌CspB全長范圍中，在此使用的冷休克蛋白與大腸桿菌CspA或枯草桿菌CspB具有40％同一性，更優(yōu)選50％同一性，更優(yōu)選60％同一性，更優(yōu)選70％同一性，更優(yōu)選80％同一性，更優(yōu)選90％同一性，更優(yōu)選95％同一性?？衫脦讉€數據庫，提供給本領域技術人員來確定是否新的或現有的蛋白包含冷休克結構域或是否為冷休克蛋白，包括從Genbank到用來提供確定蛋白相互關系和/或發(fā)現相關蛋白的蛋白質數據庫。在此包括于該定義中的是所有已知的冷休克蛋白，包括但不限于來自大腸桿菌的CspA，CspB，CspC，CspD，CspE，CspF，CspG，CspH和CspI(美國專利6,610,533)。
所述保守的冷休克結構域示于SEQ NO3([FY]-G-F-I-x(6，7)-[DER]-LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY])(Prosite基序PS00352；Bucher和Bairoch，(In)ISMB-94；Proceedings 2ndInternational Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology，Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.，編.，Menlo Park，1994；Hofmann等，Nucleic Acids Res.27215，1999)中。或者，可使用Sprint數據庫(一種相關的蛋白指紋圖譜數據庫)(Attwood等.，Nucleic Acids Res.282000；Attwood，等.，Nucleic Acids Research，30(1)，出版中，2002)來發(fā)現冷休克蛋白?；蛘撸墒褂没诿枋龅木仃嚮騊fam來發(fā)現冷休克蛋白。Pfam是一種多重序列比對和包含許多常見蛋白結構域的隱馬爾可夫模型的大集合(Bateman等，Nucleic Acids Research 28263，2000)。在寫操作下(2001年11月；Pfam第6版)，有3071個家族。包括冷休克蛋白，為PF00313。物種樹顯示了在Pfam數據庫中所確定的冷休克蛋白的歸類。
在此使用的“冷休克蛋白”也包括，但不限于，在使用冷休克蛋白作為使用NCBI的“Blink”(Blast Link)函數的數據庫的詢問序列的搜索中所發(fā)現的任何蛋白?！癇link”是一種快速搜索函數，用于尋找具有相似序列的蛋白質。該“冷休克蛋白”或“冷休克結構域”的定義除用于上述的那些之外，并不能代替所述的定義。冷休克蛋白或含有冷休克結構域的蛋白包括，但不限于，在公用和專用數據庫中所有目前已知的蛋白，以及還要去發(fā)現的足以相似于所宣稱的蛋白(例如，大腸桿菌CspA和枯草桿菌CspB)的那些，其在BlastLink(2001年11月1日)所普遍使用的標準blast搜索設定值下被“命中”。在寫操作時，Blast 2正運行，且Blast Link(“Blink”)運行缺省參數進行蛋白質-蛋白質blast搜索。在寫操作時，我們認為Blink使用的缺省設定值如下運行BLOSUM62矩陣，使用“nr”數據庫，選擇CD搜索，作為是基于統計學的組合，具有選作為“低復雜性”的復雜性，期望值為10，具有3的字長，缺口罰分是存在11和延伸1。表I所列的顯示了使用這些標準設定值對大腸桿菌CspA最初的200個命中，但我們并不限制我們的權利要求在這最初的200個命中中。本領域技術人員應注意在這些相當嚴格的標準下，發(fā)現了167個細菌來源的蛋白，但也發(fā)現了28個多細胞動物蛋白和5個植物蛋白。這些蛋白包括來源廣泛的與CspA同源的蛋白，發(fā)明人預計其在本發(fā)明中將發(fā)揮作用。該表決不是包括一切的列表，預計其他蛋白將在本發(fā)明中發(fā)揮作用。
表20.依據與大腸桿菌CspA相似性所發(fā)現的一些冷休克蛋白和含有冷休克結構域的蛋白。該列表是使用NCBI標準的Blast Link設定值所編輯的。顯示了每個蛋白的Genbank ID和名稱。注釋由于蛋白命名的方式，一些蛋白和序列將具有幾個登錄項，如蛋白、cDNAs、等位基因等。Genbank ID可被認為是每一登錄項的特定標識符。登錄項以與詢問序列比較得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
枯草桿菌(B.subtilis)CspB是一種在對冷休克響應中累積的蛋白(Willimsky，等，Journal of Bacteriology 1746326(1992))。其與來自大腸桿菌的CspA具有同源性(見表I)并含有單鏈核酸結合域(Lopez，等，The Journal of Biological Chemistry 27615511(2001))。在NCBI(Blink)中使用相同的基本Blast搜索，下列蛋白被指定為“命中”。在此所示的命中數量限制在200，但許多其他蛋白預計可在本發(fā)明中起作用。
表21.用枯草桿菌CspB搜索所發(fā)現的一些冷休克蛋白和含有冷休克結構域的蛋白。該列表是使用NCBI標準的Blast Link(Blink)設定值所編輯的。顯示了每個蛋白的Genbank ID和名稱。注釋由于蛋白命名的方式，一些蛋白和序列將具有幾個登錄項，如蛋白、cDNAs、等位基因等。Genbank ID可被認為是每一登錄項的特定標識符。登錄項以與詢問序列比較得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
當溫度降低或施加其他脅迫時，CSP是一組在數量上可能或沒有增加的蛋白。事實上，就冷休克蛋白而言，在最好的研究生物大腸桿菌中，當其他蛋白為冷所誘導時。一些冷休克蛋白是組成型表達的，還有一些蛋白似乎特異于特定的脅迫和/或生長條件或階段。該評論見于Yamanaka，等.，Molecular Microbiology，27247(1998)。在該評論中，Yamanaka和同事詳述了大腸桿菌中9個冷休克蛋白(CspA-CspI)是如何表達的。CspA、CspB和CspG是冷誘導的。CspD在細胞周期靜止期和在饑餓期間被誘導。CspC和E涉及細胞分裂。
CspA是來自大腸桿菌(E.coli)的主要冷休克蛋白(SEQ IDNO1)。CspA也稱作主要冷休克蛋白7.4。CspA在對冷休克響應中高度誘導(Goldstein，等.，Proceedings of the National Academy ofScience(USA)87283(1990))。在某些減慢生長環(huán)境中，核糖體不活躍是因為RNA或DNA二級結構形成之故，在其天然生物體中可作為增加CSPs合成的信號。在體外環(huán)境中CSPs與ssDNA和RNA結合(Phadtare，等.，Molecular Microbiology 331004(1999))。在翻譯過程中CSPs被認為以相對非特異性的方式與RNA結合并阻止二級結構形成，穩(wěn)定了RNA(這種功能有時稱為RNA蛋白伴侶)。然后，該核糖體能容易地取代該CSPs并在線狀RNA模板上啟動翻譯。我們相信本發(fā)明可涉及這些蛋白質的單鏈核酸結合功能，該功能能來自任何一種冷休克蛋白或含有冷休克結構域的蛋白，其包括，例如，原核生物冷休克蛋白、含有真核生物Y-框的基因、某些富甘氨酸蛋白(GRP)以及含有冷休克結構域的其他蛋白。這些蛋白包括，但不限于，在圖4，Trends in Biochemical Science，23(8)289(1998)(論文包括的，在此引入作為參考)中所示的那些。該圖清楚地顯示了這些蛋白之間的進化關系。這些蛋白很可能在現代細菌和真核細胞趨異之前起源，且已假定這些蛋白質在單細胞演化出現之時，即35億年前就已存在了。如實施例我們選擇將兩種蛋白質轉化入植物，如上述引證的圖所示，這些蛋白質較許多其真核生物對應物而言，彼此之間更加趨異。我們預計這些蛋白質的異位表達能在各種脅迫條件下，包括冷、旱、鹽脅迫、熱、冷休克后存活、真菌感染、病毒感染、微生物感染和冷發(fā)芽，改善對生物和非生物脅迫的耐受性，包括但不限于植物生長、活力、產量和健康。
在脅迫下植物生長率增加的另一種可能解釋是通過CSP表達所激發(fā)的病原體相關性分子圖式(PAMP)。在該模型中，植物將出現PAMP響應，其將激發(fā)植物響應，有些類似于系統性獲得抗性(SAR)(更類似于生物脅迫所產生的SAR)，如同植物在脅迫施加前就對之“有所準備”一樣。對于該模型運轉而言，CSP存在時植物應發(fā)出信號，最近業(yè)已通過將植物受體與CSP結合提供了該機制(Felix，等，Journalof Biological Chemistry 278(8)6201-8(2003))。該機制意味著任何與激發(fā)PAMP型響應受體結合的基因將在本發(fā)明中起作用。PAMP型響應通常用于生物脅迫的研究，一般通過外源給予的試劑激發(fā)。在此，我們能激發(fā)對CSP轉基因所產生的CSP的PAMP型響應。通過基因槍或農桿菌介導的轉化，該轉基因轉化入植物細胞作為重組DNA構建體的一部分。其在植物中又能引起系統性獲得抗性型響應，增強了對非生物脅迫的抗性。該響應能引入到單子葉植物和雙子葉植物中，包括但不限于玉米、大豆、小麥，稻、擬南芥、低芥酸菜子和棉花。如果上述PAMP法是CSPs為代表的模型，則預計該CSP可以提供生物脅迫和非生物脅迫保護。這些機制并不意在限制，且其中一種或兩種，或其他種種，可能與所出現的表型相關。
MF2，一種來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)的Csp樣蛋白，據稱在植物中能提供某些抗病毒感染的保護。美國專利6,528,480顯示了通過使用含有該蛋白的提取物摩擦植物葉片并用病毒感染該植物所產生的對生物脅迫的耐受性。在該專利中它們預計能，但并沒有產生轉基因植物。
“相同種非轉化植物”意在包括于與轉化植物相同種的所有植物之內。在一個實施方案中，所述非轉化植物和轉化植物是相同種和品系的。在另一個實施方案中，所述植物與轉化植物有可能相同。
“冷休克結構域”(CSD)是一種與冷休克蛋白同源的蛋白序列。對于本發(fā)明來說，包含冷休克結構域的蛋白是一種“冷休克蛋白”。在大腸桿菌CspA或枯草桿菌CspB與含有冷休克結構域的蛋白的冷休克結構域之間，觀察到大于40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％的氨基酸同一性(Wistow，Nature 344823(1990)；Yamanaka，等.，Mol.Micro.，27247，具體參見Yamanaka參考文獻的圖1B；Graumann，等.TIBS 23286)。
在此使用的“酵母”通常指Saccharomyces cerevissiae但也包括栗酒裂殖酵母(Schizosacchoramyces pombe)和其他品種(例如，來自畢赤酵母屬的)?！坝衩住敝竄ea Mays以及可由其培育的所有種和變種?！靶←湣敝杆械腡riticum aestivum品種，包括但不限于春小麥、冬小麥和所有可選擇的小麥品種?！靶←湣卑ㄈ魏纹渌男←溒贩N，包括但不限于硬質小麥(Triticum durum)、斯佩爾特小麥(Triticum spelta)、雙粒小麥(Triticum dicoccum)和野生二粒小麥(Triticum monococcum)?！靶←湣币舶捎缮鲜鋈我恍←溒贩N培育的所有種和所述雜交種(包括黑小麥、一種小麥和黑麥的雜種)的后代。“大豆”指Glycine max或Glycine soja以及可由其培育的所有種或變種?！暗尽敝窸ryza sativa以及可由其培育的所有種或變種?！按篼湣敝窰ordeum vulgare以及可由其培育的所有種和變種?！把帑湣敝窤vena sativa以及可由其培育的所有種和變種?！暗徒嫠岵俗印笔墙鼇碣x予遺傳修飾的油菜籽植物、油籽油菜(Brassica napus L.)和蕪箐油菜(B.campestris L)所產生的種子、油和食品的新創(chuàng)名，在此低芥酸菜子包括所有油菜籽植物以及可用其育種的生物。在此使用的大腸桿菌(E.coli和Escherichia coli)包括大腸桿菌種生物及其所有菌株；即E.coli K12。在此使用的大腸桿菌(E.coli和Escherichia coli)也可包括能與任何大腸桿菌菌株接合的所有生物，當一者為F+或Hfr菌株，而另一者不是時?？莶輻U菌(B.subtilis和Bacillus subtilis)指所有芽孢桿菌屬枯草桿菌種生物。在此使用的根癌農桿菌(Agrobacterium tumifaciens)包括所有該種的菌株和型?！安萜翰荨卑ㄋ性浽耘噙^或能栽培產生草皮的草種及品系，所述草皮包括但不限于草坪、用于比賽(即美式足球、棒球或英式足球)的場地、和高爾夫球場的所有區(qū)域(即開球區(qū)域、球道、果嶺、障礙區(qū)等)?！懊藁ā敝杆鵊ossypium屬植物以及可由其培育的所有植物。
在此所指的“耐熱性”作為植物在熱環(huán)境或較熱溫度下生長能力的量度，所述熱環(huán)境或較熱溫度對相同種植物的生長、活力、產量、大小起不利影響。耐熱植物在熱脅迫環(huán)境下較相同種的非耐熱植物生長得更好。
“耐鹽性”指某些植物在滲透脅迫或由水和土壤中的鹽類或離子所產生的脅迫下生長的能力。例如，當澆水液體或載體的培養(yǎng)基含有對相同種不同植物生長起不利作用的水和離子的混合物時，與相同種和/或變種植物相比，具有增加的生長率的植物據此應有耐鹽性。某些轉化植物較相同種和品系的非轉化植物對于這些類型的情況具有更強的耐受性。
所有在此使用數值應受術語“約”所修飾，約意味著該數值可以改變，在任一方向上，至多10％且仍保持相同的含義。例如，1M溶液應包括所有這種類型的溶液，小于等于1.1M但大于等于0.9M。例如，百分數也可被修飾，10％包括包括從9％至11％的所有百分數。形容詞“正好”所限定的術語并不受術語“約”所限定。
“富甘氨酸蛋白”定義為一種真核細胞中的蛋白，即含有冷休克結構域的蛋白，或者與之基本上同一，或是其同系物。
“冷休克后存活”定義為植物在置于低于該種植物生長階段正常溫度的溫度之后持續(xù)生長一段有效時間的能力。應當指出某些植物，甚至是那些相同種的，經選擇在冷環(huán)境下能生長。玉米的Wigor純系能耐受冷環(huán)境且當置于那些環(huán)境中時，較美國市售的大多數商用品系具有明顯更高的成活率。Wigor在波蘭作為商品出售。因此，對于轉基因植物而言低溫耐受性應當在相同的相關階段的相同品系的植物以及相同種類植物的范圍內比較，以獲取有意義的科學數據。接著，應馬上對植物進行打分，或在休克后幾天或幾周測定它們的生活力、生長率和其他表型。
“干旱”或“生長水分受限”定義為一段干燥的時期，特別是當其延長時，能損害農作物或妨礙它們順利生長。此外，相同種的不同植物，以及那些相同種的不同品系，對干旱、干燥和/或缺水可具有不同的耐受性。在實驗室中，干旱可通過較對照植物給予植物95％或更少的水分來模擬，并尋找在活力、生長、大小、根長和種種其他生理和物理量度上的差異。干旱也可通過在田地中給某些植物澆水，而不其他植物澆水來模擬，并比較它們的生長速率，特別是水分嚴重受限地方植物的生長。
非生物脅迫耐受性包括但不限于，增加的產量、生長、生物量、健康或其他指示脅迫耐受性的量度，其包括但不限于熱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫(包括在發(fā)芽過程中的冷脅迫)、水分脅迫(包括但不限于旱脅迫)、氮脅迫(包括高氮和低氮)。
生物脅迫耐受性包括，但不限于，增加的產量、生長、生物量、健康、或其他指示脅迫耐受性的量度，其包括但不限于植物的真菌感染、細菌感染、和病毒感染。
某些作為本發(fā)明一部分披露的基因序列是細菌來源的，例如，某些原核生物冷休克蛋白。本領域技術人員公知未修飾的細菌基因有時在轉基因植物中表達很低。植物密碼子用法較諸如細菌的單細胞生物更類似于人類和其他高等生物。一些報告已披露用于改善植物中重組基因表達的方法。這些報告披露了多種方法，基于植物密碼子頻率表，改善密碼子第3位堿基偏愛，使用不含可疑的多腺苷酸化或富含A/T區(qū)域或內含子剪接共有序列的重組序列，用于人工改造編碼序列以提供能更有效翻譯的序列。雖然這些用于合成基因構建的方法值得注意，但是本發(fā)明人打算根據Brown等(美國專利號5,689,052 1997，其全文在此引入作為參考)和/或上述引用的方法以及其他方法，生產冷休克蛋白或含有冷休克結構域蛋白的合成基因。因此，本發(fā)明提供了一種用于制備在植物中表達所需蛋白產物的合成植物基因的方法。簡言之，根據Brown等的方法，減少編碼所需蛋白多核苷酸序列中稀有或半稀有單子葉植物密碼子的頻率并用更偏愛的單子葉植物密碼子取代?；谠趩巫尤~植物中六單體單元的出現頻率，也就是最稀有的284，484和664六單體單元的出現頻率，通過分析連續(xù)的六核苷酸片斷中編碼序列并改變該序列修飾的多核苷酸序列編碼的所需多肽，在單子葉植物中增加的累積是產生偏愛密碼子頻率增加的結果。此外，Brown等披露了通過應用減少稀有密碼子頻率的方法來增加重組基因的表達，使用了減少核苷酸序列中多腺苷酸化信號和內含子剪接位點出現，去除核苷酸序列中自補序列并用非自補核苷酸取代上述序列，且保持編碼該多肽的結構基因，并減少核苷酸序列中5’-CG-3’二核苷酸配對出現的頻率的方法。對于期望多肽中存在的大多數氨基酸而言，這些步驟順序執(zhí)行，所具有的累積效應導致了在核苷酸序列中含有對于單子葉植物優(yōu)先利用的更偏愛的單子葉植物密碼子。特別是所有在此提及的蛋白預計要被制成如上所討論的合成基因，或使用類似的方法，這些蛋白包括但不限于大腸桿菌CspA和枯草桿菌CspB。
在此描述的工作具有確定的加強植物表達冷休克蛋白和含有冷休克結構域蛋白的方法，當在摻入易感植物細胞核、質體或葉綠體基因組后異位表達時，其可賦予對許多植物脅迫的抗性，可包括但不限于冷、熱、旱、鹽和其他脅迫，或脅迫相關表型(冷發(fā)芽、冷休克后存活和其他非生物脅迫)。美國專利5,500,365(在此特別引入作為參考)描述了一種用于合成植物基因以優(yōu)化該合成基因編碼蛋白表達水平的方法。該方法涉及修飾外源轉基因的結構基因序列使得它們更加“類似于植物”并因此更有可能被翻譯并通過植物、單子葉植物或雙子葉植物來表達。但是，在單子葉植物中更適宜使用美國專利5,689,052中所披露的方法，其用于增強轉基因的表達。
在開發(fā)本發(fā)明的核酸構建體中，該構建體的多種成分或其片斷通常被插入到適宜的克隆載體中，如能在諸如大腸桿菌的細菌宿主中復制的質粒。在文獻中業(yè)已描述了存在的多種載體，其中有許多是市場上可買到的。在每次克隆后，具有所需插入物的克隆載體可被分離并進行進一步的操作，例如限制酶切消化、插入新片斷或核苷酸、連接、缺失、突變、切除等，以適合期望序列的成分。一旦完成該構建體，接著根據宿主細胞轉化的方法可將其轉移到合適載體中用于進一步操作。
本發(fā)明的雙鏈DNA分子包括，例如，通過任何適合的方法可插入植物基因組表達盒中的冷休克蛋白。適合的植物轉化載體包括來自于根癌農桿菌Ti質粒的那些，以及披露于，如Herrera-Estrella等，(1983)，Bevan(1984)，Klee等，(1985)和EPO公開號120,516的那些。除了來自于農桿菌的Ti或毛根誘導(Ri)質粒的植物轉化載體，替代的方法可用于將本發(fā)明的DNA構建體插入到植物細胞中。這樣的方法可包括，但不限于，例如通過使用脂質體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學藥品、通過微粒轟擊遞送游離DNA以及使用病毒或花粉進行轉化。
適合于使用電穿孔將編碼冷休克蛋白或含有冷休克結構域蛋白的基因導入單子葉植物的質粒表達載體可由如下所組成在植物中起作用的啟動子；提供剪接位點利于基因表達的內含子，例如Hsp70內含子(PCT公開號WO 93/19189)；以及諸如胭脂堿合酶3’序列(NOS 3’)的3’多腺苷酸化序列。該表達盒可裝配為適合于大量DNA生產的高拷貝復制體。
一種用于植物轉化的Ti質粒盒載體是pMON-17227。該載體描述于PCT公開號WO 92/04449中并含有編碼賦予草甘膦抗性的酶(命名為CP4)的基因，對于許多植物而言，該基因是一種極好的選擇標記。如該文所述，該基因被融合到擬南芥EPSPS葉綠體轉運肽(CTP2)上并從FMV啟動子表達。當獲得含有景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶基因或cDNA的足夠量細胞(或原生質體)時，該細胞(或原生質體)再生為全植物。用于再生步驟方法的選擇并不是關鍵的，對于來自豆科(苜蓿、大豆、三葉草等)，傘形科(胡蘿卜、芹菜、歐洲防風草)，十字花科(甘藍、蘿卜、低芥酸菜子/油菜籽等)，葫蘆科(甜瓜和黃瓜)，禾本科(小麥、大麥、稻、玉米等)，茄科(馬鈴薯、煙草、番茄、胡椒)，各種花作物，例如向日葵，以及產堅果樹木，例如杏樹、腰果樹、胡桃樹和美洲山核桃樹的宿主具有合適的實驗方案可供使用。
可通過本發(fā)明實踐用于表達冷休克蛋白的植物包括，但不限于，刺槐、紫花苜蓿、小茴香、蘋果、杏、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類植物、甜菜、黑莓、越桔、莖椰菜、抱子甘藍、卷心菜、低芥酸菜子、羅馬甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、蕪荽、柑橘類植物、克萊門氏小柑橘、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、寬葉萵苣、桉樹、茴香、無花果、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物、番木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱美國長葉松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、白薯、楓香、紅桔、茶樹煙草、番茄、草皮、藤本植物、西瓜、小麥、薯蕷、綠皮密生西葫蘆、或任何一種其他植物。
“啟動子”指結合RNA聚合酶(以及經常是其他轉錄因子)并啟動下游DNA序列轉錄的DNA序列。當與其他組織相比時，在某些組織中啟動子通常提供增強的或減弱的表達。選擇啟動子，具體來說選擇當植物承受非生物脅迫時能增加表達的啟動子在本發(fā)明中應該特別有用。
在本領域中已觀察到某些脅迫響應對植物具有類似的作用，且對一種脅迫的抗性可提供對另一種脅迫的抗性。例如，從對脫水和低溫響應之間的關系可以看出這點(Shinozaki，等.，Current Opinionsin Plant Biology 3(3)217，2000)。許多其他論文表明了在不同的非生物脅迫之間具有一般的相互關系，并指出對于一種脅迫的耐受性能導致產生對一些其他非生物脅迫更強的耐受性(Pernas，等.，FEBS Lett 467(2-3)206，2000；Knight，Int Rev Cytol 195269，2000；Didierjean，等.，Planta 1991，1996；Jeong，等.，MolCells12185，2001)。
在包含于T-DNA的植物表達元件外DNA區(qū)段中所含有的表達盒和調節(jié)元件通常存在于許多質粒DNA骨架中，并起質粒維持元件之用，這些元件包括，但不限于，具細菌壯觀霉素/鏈霉素抗性的aad(Spc/Str)基因，提供復制起點用于在大腸桿菌中保持的pBR322 ori(ori322)，用于接合轉移入根癌農桿菌細胞的bom位點，以及含有來自RK2質粒復制起點的0.75kb oriV DNA區(qū)段。此外，那些為轉化植物所設計的質粒通常含有為起插入元件作用的農桿菌蛋白內源性DNA整合所需的元件。這些元件包括邊緣區(qū)(borders)(右邊緣區(qū)(RB)和左邊緣區(qū)(LB))。
在此使用的重組DNA技術實驗室規(guī)程是那些為本領域熟知且通常使用的。標準技術用于克隆，DNA和RNA分離、擴增和純化。一般的酶促反應包括根據產品說明書所述使用DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切酶等。這些技術和多種其他技術通常根據Sambrook等.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989)所述的來執(zhí)行。
所有在本說明書中引證的出版物和公布的專利文獻在此引入作為參考，如同每一篇單獨的出版物或專利申請明確且單獨地被表明引入作為參考一樣。
下列所包括的實施例用于舉例說明本發(fā)明的實施方案。本領域技術人員應當理解在實施例中所披露的技術隨后代表的是本發(fā)明人所發(fā)現的能在本發(fā)明實踐中起很好作用的技術。但是，考慮到本發(fā)明所公開的內容，本領域技術人員應當意識到可對所披露的具體實施方案進行許多修改，仍能獲得同樣或相似的結果，而不背離本發(fā)明的精神和范圍，因此所有在附圖和實施例中所列或所示的內容被認為是例證性的，并不意在限制。
實施例實施例1.
pMON57396(圖1)是一種雙元載體，用于農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似于大腸桿菌CspA的蛋白(SEQ ID NO56)的組成型表達。為克隆該大腸桿菌CspA基因，基于來自隸屬于國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫(yī)學圖書館(National Library of Medicine)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的CspA序列信息(GenbankM30139，GI409136)，設計兩條基因特異性引物MF1和MF2。MF1序列是AGGTAATACACCATGGCCGGTAA(SEQ IDNO66)，其在CspA翻譯起始位點處退火并在5’末端引入NcoI位點，MF2序列是TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT(SEQ IDNO67)，其在CspA最后密碼子處退火并在該引物末端引入EcoRI位點。進行PCR分離大腸桿菌CspA。具體來說，裂解大腸桿菌DH5α細胞，少量裂解液作為模板擴增CspA基因，使用MF1和MF2引物、Taq聚合酶和來Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)的dNTP。熱循環(huán)條件如下94℃，1分鐘，接著94℃，16秒；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘的30個循環(huán)。用凝膠電泳純化所擴增的CspA DNA，用NcoI和EcoRI消化并連接入雙元載體pMON23450(圖2)，該載體事先已用NcoI和EcoRI消化而被線性化。使用T4連接酶進行連接，并根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之后程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用于質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。轉化的細胞在合適的選擇培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)(Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Press，1989)，并在幾小時或幾天后對菌落劃線。質粒制備自單個菌落并測定完整插入序列。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co.，New York)和測序得到確認。當載體中所選擇的NcoI-EcoRI克隆位點在上游(5’)側接CaMV e35S啟動子和在下游(3’)側接附加表位(Flag，其編碼寡肽DYKDDDK(SEQ ID NO68)，SIGMA，St Louis)時，該構建體中的大腸桿菌CspA從而在C-末端加上Flag附加表位，并可通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄轉化擬南芥。上述克隆產生了一種編碼類似于SEQID NO55的蛋白的質粒。所產生的質粒稱為pMON57396。
實施例2.
pMON57397(圖2)是一種雙元載體，用于農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似于大腸桿菌CspA的蛋白(SEQ ID NO57)的組成型表達。為構建pMON57397，用限制性內切酶XhoI和SalI消化其C-末端加有Flag附加表位的含有大腸桿菌CspA基因的雙元載體pMON57396(見上述實施例)，以去除載體中這些位點并釋放出FLAG附加表位(該FLAG附加表位編碼寡肽DYKDDDK，SIGMA，St Louis)。接著純化并重新連接線性化的質粒。使用T4連接酶進行連接，并根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之后程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用于質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。轉化的細胞在合適的選擇培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)(Sambrook等.，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)并在幾小時或幾天后對菌落劃線。質粒制備自單個菌落并測定完整插入序列。上述克隆產生了一種編碼類似于SEQ ID NO57的蛋白的質粒。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜以確保XhoI和SalI位點不存在(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co.，New York)以及測序而得到確認。在該構建體中大腸桿菌CspA基因在C-末端沒有標記物，并通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄。
實施例3.
pMON57398(圖4)是一種雙元載體，用于農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似于枯草桿菌CspB的蛋白(SEQ ID NO59)的組成型表達。為克隆該枯草桿菌CspB基因，基于來自隸屬于國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫(yī)學圖書館(National Library of Medicine)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的CspB序列信息(GenbankU58859，gi1336655)，設計兩條基因特異性引物MF3和MF4。MF3序列是AGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG(SEQ IDNO69)，其在CspB翻譯起始位點處退火并在5’末端引入NcoI位點，MF4序列TCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT(SEQ IDNO70)，其在CspB最后密碼子處退火并在該引物末端引入EcoRI位點。進行PCR分離枯草桿菌CspB?？莶輻U菌細胞獲得自CarolinaBiological Supply(Burlington，NC)，裂解細胞并將少量裂解液作為模板擴增CspB基因，使用MF3和MF4引物、Taq聚合酶和來自Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)的dNTPs。熱循環(huán)條件如下94℃，1分鐘，接著94℃，16秒；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘的30個循環(huán)。用凝膠電泳純化所擴增的CspB DNA，用NcoI和EcoRI消化并連接入雙元載體pMON23450(圖5)，該載體事先已用NcoI和EcoRI消化而被線性化。使用T4連接酶進行連接，并根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之后程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用于質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。將轉化的細胞在合適的選擇培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)(Sambrook等.，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)并在一天后對菌落劃線。質粒制備自單個菌落并測定完整插入序列。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman和Co.，New York)和測序得到確認。當載體中所選擇的NcoI-EcoRI克隆位點在上游(5’)側接CaMV e35S啟動子和在下游(3’)側接附加表位(Flag，其編碼寡肽DYKDDDK(SEQ ID NO68)，SIGMA，St Louis)時，該構建體中枯草桿菌CspB樣基因從而在C-末端加上Flag附加表位，并可通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄轉化擬南芥。該克隆產生了一種質粒，其具有插入所述質粒中的編碼類似于SEQ ID NO59的蛋白的序列。
實施例4.
pMON57399(圖6)是一種雙元載體，用于農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似于枯草桿菌CspB的蛋白(SEQ ID NO61)的組成型表達。為構建pMON57399，用限制性內切酶XhoI和SalI消化在其C-末端加有Flag附加表位的含有枯草桿菌CspB基因的雙元載體pMON57398(見上述實施例)，以除去載體中這些位點并釋放出FLAG附加表位(該FLAG附加表位編碼寡肽DYKDDDK，SIGMA，St Louis)。接著純化并重新連接線性化的質粒。使用T4連接酶進行連接，并根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之后程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用于質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。將轉化的細胞在合適的選擇培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)(Sambrook等.，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)并在幾小時或幾天后對菌落劃線。質粒制備自單個菌落并測定完整插入序列。該克隆產生了一種質粒，具有插入到所述質粒中的編碼類似于SEQ ID NO61的蛋白的序列。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜以確保XhoI和SalI位點不存在(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co.，New York)以及測序而得到確認。當載體中所選擇的NcoI-EcoRI克隆位點在上游(5’)N-末端側接CaMV e35S啟動子時，該構建體中的枯草桿菌CspB基因在C-末端沒有標記物，并通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄轉化擬南芥。所述質粒被轉化入根癌農桿菌。
實施例5.
可以用任何一種可獲得的方法轉化擬南芥植物。例如，可以使用In planta轉化法通過真空滲入轉化擬南芥植物(參見，Bechtold等.，In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration ofadult Arabidopsis thaliana plants.CR Acad.Sci.Paris Sciences de lavie/life sciences 3161194-1199(1993))。該實施例說明了擬南芥植物是怎樣被轉化的。
親本株材料和生長條件準備2.5英寸裝有土壤的盆，并用篩網覆蓋，確保土壤沒有壓得太緊以及篩網與土壤表面接觸(其保證了發(fā)芽的幼苗將能穿過篩孔生長)。播種種子并用發(fā)芽罩(germination dome)覆蓋。春化處理種子3-4天。在20-22℃、70％濕度、16小時光照/8小時黑暗條件下培育植物。每周澆水兩次，并施予低于1/2X(廠商推薦強度的一半)的Peters 20-20-20肥料(來自Hummert International，Earth City，MO)。每隔一周(以廠商推薦的全強度)添加微量營養(yǎng)物(Hummert′sDyna-谷物可溶性微量元素)一次。約1-2周后，除去罩并讓盆中植物減少到每盆一株或兩株。當其發(fā)育時，修剪初生芽(primary bolt)，以促進更多再生芽(secondary bolt)產生。在5-7天中，該植物準備就緒可用于滲入。
農桿菌制備(小規(guī)模和大規(guī)模培養(yǎng))在LB平板上對農桿菌菌株ABI劃線，該培養(yǎng)基含有壯觀霉素100mg/L、鏈霉素100mg/L、氯霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L(稱為SSCK)。在滲入前兩天，將一環(huán)的農桿菌置于含有10mlLB/SSCK的試管中并放在振蕩器上，在黑暗中于28℃下培養(yǎng)過夜。第二天，將農桿菌以1∶50在400ml YEP/SSCK中稀釋并放在振蕩器上，在28℃下培養(yǎng)16-20小時。(附注我們發(fā)現當LB用于第一次過夜培養(yǎng)及YEP用于大規(guī)模過夜培養(yǎng)時，轉化率明顯更高)。
滲入將其注入500ml離心瓶并在3500rpm下旋轉20-25分鐘，收獲農桿菌細胞。倒出上清液。干燥沉淀物，然后重懸于25ml滲入培養(yǎng)基(MS基礎鹽0.5％、Gamborg氏B-5維生素1％、蔗糖5％、MES0.5g/L，pH 5.7)中，該培養(yǎng)基含有0.44nM苯甲酸嘌呤(BAP)(10μl的1.0mg/L DMSO母液)和來自Lehle Seeds(Round Rock，TX)的0.02％Vac-In-Stuff(Silwet L-77)。BAP和Silwet L-77在滲入日新鮮添加。添加200μl Silwet L-77和20μl BAP(0.5mg/L母液)。使用滲入培養(yǎng)基作為眾所周知的空白，獲取1∶10稀釋的農桿菌懸液的OD600。計算400ml農桿菌懸液/滲入培養(yǎng)基，OD600＝0.6，用于真空滲入所需的體積。
方程式
將重懸的培養(yǎng)物置于真空水提取器的Rubbermaid容器中。翻轉含有植物的盆以滲入溶液中，以致整個植物都浸入，包括蓮座叢，但不要讓太多的土壤被浸沒。在浸入前用水浸泡植物至少30分鐘(阻止土壤吸收農桿菌懸液)。
抽真空到約23-27英寸汞柱，持續(xù)10分鐘。快速進氣。在短時間內排出盆中水分，將盆側放在帶襯里的布墊上，用罩子蓋住布墊以保持濕度，并放回到生長箱中。第二天，揭開盆上的罩子，使盆直立，并移開布墊。連續(xù)5天不給植物澆水。直立5天后，給植物澆水并在如前所述的相同條件下繼續(xù)生長。(被滲入的葉片可退化，但植物應存活直至開花完成)。
種子收獲和滅菌在滲入約2周后，通過使用Lehle Aracons(Lehle Seeds，RoundRock，TX)使植物一個一個單獨地形成錐體。在所有種子成熟結果后(滲入后約4周)，從水中移出植物并將全部種子弄干。約2周后通過收割錐體下的枝條收獲種子。使用篩子清潔種子，截留長角果和枝條物，讓種子通過。將種子置于信封或15ml試管中。
滅菌前將期望數量的種子轉移到15ml錐形試管中。松開錐形試管蓋并將試管側置于真空干燥器中，在干燥器中放有容納400mlClorox漂白劑(Clorox Company，Oakland，CA)和4ml鹽酸的燒杯(在通風櫥中將HCl添加到Clorox中)。抽真空到剛好密封該干燥器，關閉抽氣機16小時(即，使得該干燥器仍處于真空但并不總是直接抽真空)。滅菌后，打開真空干燥器將容有種子的試管置于無菌通風櫥中(松開蓋子使得氣體仍能釋放)。
將種子撒播(“灑”)在選擇平板上，該平板含有MS基礎鹽4.3g/L、Gamborg氏B-5(500X)2.0g/L、蔗糖10g/L、MES0.5g/L和8g/L Phytagar(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)、羧芐青霉素250mg/L、頭孢噻肟100mg/L。選擇水平為卡那霉素60mg/L、草甘膦60pM或Bialaphos 10mg/L。
首先，取出極少量的種子檢查污染物。如果有污染物，對種子重新滅菌多于約4小時，再次檢查污染物。通常不需要第二次滅菌，但有時種子沾有真菌污染物，需重復滅菌。(滅菌持續(xù)時間一般短于16小時，因為滅菌超過24小時會明顯降低發(fā)芽率)。用石蠟膜封住平板并置于冷藏室中施以春化處理約2-4天。在種子春化處理后，置于裝有冷白色燈泡的percival中。
轉移到土壤在約26℃下和16/8光周期5-10天后，可以看見轉化體成為綠色植物。再1-2周后，植物將有至少一組真葉。將植物轉移到土壤，蓋上發(fā)芽罩，并移至具有常規(guī)擬南芥生長條件的生長箱中。保持覆蓋直至出現明顯的新生長(通常5-7天)。
實施例6.
為了比較野生型非轉基因和CspA或CspB轉基因擬南芥植物的生長，使之在無菌培養(yǎng)皿中垂直生長野生型或轉基因種子使用如下方法進行液體滅菌●在70％乙醇中溫育5分鐘后進行渦旋混合●在30％Chlorox(6.15％次氯酸鈉)+0.01％Triton X-100中溫育5分鐘后進行渦旋混合●無菌水連續(xù)洗滌5次種子被置于100×15mm方形的塑料培養(yǎng)皿上(BectonDickinson-Falcon # 35-1112)，每一培養(yǎng)皿含有40ml瓊脂培養(yǎng)基，制備如下用氫氧化銨調節(jié)含常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和維生素的0.5X Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Sigma #M5519)pH至5.8，添加1％Phytagel(Sigma #P8169)，作為固體載體。
在半個培養(yǎng)皿上撒播10粒野生型擬南芥種子，距邊緣約1cm并均勻分布。使用管尖消毒的Gilson P-200移液器進行該步驟。10粒CspA或CspB轉基因擬南芥種子同樣地撒播在培養(yǎng)皿的另一半，均勻分布。用記號筆標記平板以指示哪一半含有轉基因種子。
培養(yǎng)皿于4℃下在黑暗中放置3天以層積種子，然后置于Percival恒溫箱(AR-36L型)中，于8℃下在24小時120微愛因斯坦/平方米的恒光下持續(xù)6周。溫育結束時，比較CspA和CspB和野生型蓮座型葉叢大小，發(fā)現CspA和CspB較大。該結果見圖16。見于第一、第二和最后一張平板照片，在此使用了上述測定法。在圖16中，第三張照片(CspB+Flag，pMON57399)顯示了平板中植物經受了類似于如下所述的冷休克試驗。
轉基因擬南芥種子冷休克幼苗活力評估水平平板測定法。
介紹這是一種用于評估已發(fā)芽轉基因擬南芥種子在水平培養(yǎng)皿瓊脂培養(yǎng)基上從常溫轉換到低溫時持續(xù)生長能力的方法。簡而言之，對來自對照植物和試驗轉基因植物的種子滅菌、層積、并撒播在培養(yǎng)皿上任何一半的6×8網格中。在水平位置處于常溫下溫育平板一周，然后移至急冷溫度下再溫育兩周，保持平板水平位置。采用數字照相術記錄幼苗的株冠面積并用成像軟件進行定量。測試幼苗總株冠面積與對照幼苗總株冠面積的比值可作為定量參數來比較轉基因測交品系中各種目的基因低溫耐受性潛力。
材料下列所用的主要常規(guī)設備可獲得自標準生物技術實驗室(高壓滅菌器、天平、層流罩超凈臺等)-擬南芥種子在本實驗方案中使用Arabidopsis thaliana cv。
-培養(yǎng)皿Falcon #35-1112(100mm方形×15mm深)-培養(yǎng)基Sigma M5519＝Murashige & Skoog基礎培養(yǎng)基-Phytagel(Sigma #P-8169)-1-升玻璃瓶，對其中瓊脂培養(yǎng)基高壓滅菌并用于澆鑄平板。我們使用帶有橙色螺旋蓋的康寧(Corning)玻璃瓶。
-磁力攪拌器和磁性攪拌棒-可使用50ml塑料移液管的電動移液管管理器。
-用于照曬種子的具有塑料放大鏡的小熒光燈盒-P1000 Gilson移液器(或等價物)和消毒管尖-P200 Gilson移液器(或等價物)和消毒管尖-70％滅菌乙醇-30％Chlorox漂白劑+0.1％Tween 20-無菌去離子水-無菌微離心管和試管架-4℃冷藏室，低溫試驗箱或電冰箱，優(yōu)選黑暗的-具有約150μE/m2/秒光源的22℃Percival植物生長箱或等價物。
-具有約150μE/m2/秒光源的8℃ Percival植物生長箱或等價物。
-半透性外科用膠帶3M微孔膠帶(3M#1530-1)-黑色(Sharpie)標記筆-Glassine天平稱量紙(VWR#12578-165)-計算器-筆記本-IBM兼容機-Image-Pro Plus軟件，4.1.0.0版-微軟Excel軟件實驗方案1-將貯藏在試管或信封中的種子等分置于滅菌的微量離心管中，2-用黑色記號筆(sharpie)標記試管以記住種子身份，3-通過用下列溶液連續(xù)洗滌并保持下列時間對試管中種子進行表面滅菌。注意，在洗滌過程中翻轉試管至少兩次以確保溶液與種子表面良好接觸。種子將落到試管底部，形成柔軟沉淀a.70％滅菌乙醇，持續(xù)3-5分鐘，b.30％Chlorox漂白劑+0.1％Tween 20，持續(xù)3-5分鐘，c.無菌過濾的去離子水，持續(xù)30秒，d.重復c四次以上并在最后一次，留下約0.5ml無菌水覆在種子沉淀上。
1-將微量離心管于4℃下在黑暗中放置3天以層積種子，使得平板培養(yǎng)的種子發(fā)芽更加一致。2-通過在玻璃瓶中制備1升試樣量的0.5X Murashige和Skoog培養(yǎng)基，用氫氧化銨調節(jié)pH至5.8，然后添加10克Phytagel，來制備平板。當調節(jié)pH時使用磁力攪拌器并與phytagel混合均勻，然后對液體高壓滅菌，設定(緩慢排氣)45分鐘。
3-在層流罩超凈臺中澆鑄平板，使用帶50ml滅菌移液管的電動移液管管理器將40ml培養(yǎng)基釋放到每個平板后，立刻用蓋子蓋住平板。
4-在層流罩超凈臺中用鼓風機讓平板冷卻至少2小時，結束后于4℃下貯藏在帶日期的塑料袋中。
5-標記平板并撒播種子1-用半透性微孔膠帶捆住平板的四邊，標記日期并將平板置于Percival培養(yǎng)箱中，設定在22℃和約100μE/m2的16小時白天光周期。將平板水平放置，僅放一層并溫育7天。用數碼照相機為每個平板拍照并將數據儲存在光盤上。
2-將平板轉移到Percival培養(yǎng)箱中，設定在8℃和約100μE/m2的24小時白天光周期。將平板水平放置，僅放一層并再溫育最多3周。用數碼照相機為每個平板拍照并將數據儲存在光盤上。
3-每2-3天觀察平板一次，觀察與對照相比的測試種質生長狀況并不時對種質有代表性的常規(guī)性狀進行數碼照相。在8℃下溫育時間應小于2周(最多3周)。那些長得較長表現出差異的種質要在較低種子密度下進行平板培養(yǎng)以避免在進行數碼照相時過度擁擠。
4-使用數碼照相機拍照和Image-Pro Plus軟件測量蓮座型葉子叢株冠面積。計算對照和測試群體的平均幼苗株冠面積，在分析中排除沒有發(fā)芽的種子。在溫度變化后，計算對照幼苗和測試幼苗的平均幼苗株冠面積的比值，對照和測試幼苗組的標準偏差和標準誤差。如果在測試幼苗和對照幼苗之間存在統計學差異，則結果就為可靠。在筆記本上記錄結果。
5-對于轉基因植物材料來說，將平板和幼苗丟棄在合適的處理容器中(帶透明塑料垃圾袋的灰色垃圾箱)。
實施例7.
依照廠商的實驗方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)將CspA和CspB基因的PCR產物連接入載體pCR-TOPO 2.1。將pCR-TOPO 2.1衍生物的NcoI/EcoRI片段亞克隆入pMON48421(圖7)，通過相同的限制性內切酶線性化。將含有35S啟動子、Csp基因和e9終止子的pMON48421衍生物的NotI片段在NotI位點亞克隆入pMON42916(圖17)，用于分別構建含有CspA和CspB基因的pMON56609(圖8)和pMON56610(圖9)。采用已知方法將所述質粒轉化到根癌農桿菌中。預計pMON56609含有編碼類似于SEQ ID NO7的蛋白的核苷酸序列。預計pMON56610含有編碼類似于SEQ ID NO9的蛋白的核苷酸序列。
實施例8.
農桿菌制備在含有卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L(稱為LB/KH)的LB平板上對農桿菌菌株EHA105劃線。在共培養(yǎng)前兩天，將一環(huán)的農桿菌轉移到含10ml LB/KH的試管中，并于28℃黑暗中在振蕩器上溫育24小時。將該培養(yǎng)物在20ml LB/KH中稀釋到1∶100，并于28℃黑暗中在振蕩器上溫育過夜。第二天取1ml 1∶2稀釋的培養(yǎng)物置于比色杯中，用LB/KH作空白對照測定OD600。計算用于共培養(yǎng)的5ml O.D 1.0農桿菌懸液所需體積。
方程式 取所需體積的農桿菌培養(yǎng)物置于40ml離心管中，在7000rpm下離心7分鐘。除去上清液并干燥沉淀物。將沉淀物重懸于5ml含有20mg/L乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(CC MEDIA-MS基礎鹽、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、硫胺素HCl 0.5mg/L、L-脯氨酸115mg/L、2，4-D 2mg/L)中。
稻胚轉化收獲溫室生長的Nipponbare和Taipai 309稻品種的穗(panicles)。通過將遂浸在50％商用漂白劑中10分鐘接著在無菌蒸餾水中漂洗進行滅菌。用70％乙醇處理穗3分鐘。然后從穗上剝離種子并一個一個地脫殼，接著轉移到含有0.1％tween 20溶液的falcon塑料試管中。接著在層流罩超凈臺中用70％乙醇處理種子。然后用無菌水漂洗種子。接著用50％漂白劑處理45分鐘。在無菌蒸餾水中漂洗種子5分鐘。最后用0.1％氯化汞處理種子5分鐘。再用無菌蒸餾水洗滌種子8分鐘。
在層流罩超凈臺中，在無菌條件下從無菌種子上切離胚，并放置在固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含有2g/L phytagel的CC MEDIA)中。將50μL一滴的農桿菌懸液滴在滅菌的培養(yǎng)皿上。將10個胚轉移到每滴懸液中。進行15分鐘的感染。用滅菌移液管尖移去農桿菌懸液。轉移感染的胚到新鮮的固體CC MEDIA平板上并在黑暗中培養(yǎng)2天。在第3天用500mg/L頭孢噻肟洗滌胚。然后在滅菌濾紙上干燥胚并置于延遲(Delay)培養(yǎng)基(MS基礎鹽、硫胺素HCl 1mg/L、谷氨酰胺500mg/L、氯化鎂750mg/L、干酪素水解物100mg/L、蔗糖20mg/L、2，4-D 2mg/L、Pichloram 2.2mg/L、頭孢噻肟250mg/L)中。將胚在延遲培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)7天。在該期間形成愈傷組織。轉移愈傷組織到選擇培養(yǎng)基(含有50mg/L潮霉素的延遲培養(yǎng)基)中并在黑暗中培養(yǎng)10天。之后將該愈傷組織在新鮮的選擇培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。又10天后，轉移愈傷組織到再生培養(yǎng)基(MS基礎鹽、蔗糖30mg/L、激動素2mg/L、NAA-0.2mg/L、頭孢噻肟250mg/L、潮霉素25mg/L)中并在黑暗中培養(yǎng)7天。然后將愈傷組織轉移到新鮮的再生培養(yǎng)基中并移至30℃16小時光周期下。轉移愈傷組織發(fā)育的苗到生根培養(yǎng)基(半強度MS基礎鹽、蔗糖15g/L、頭孢噻肟250mg/L、潮霉素25mg/L)中。將生根的苗轉移到含水的測試用試管中并置于霧室中鍛煉(hardening)。
挑選陽性植物。例如，可使用類似于實施例12-14和26-29所描述的那些方法來進行。包括所描述的用于產生轉基因植物后代的育種方法。
實施例9.
三葉期冷休克響應-CspB和CspA稻轉基因植物植物體制備發(fā)芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，并在milique水中徹底洗滌10分鐘以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌濕濾紙上于30℃溫度和60％RH下發(fā)芽，使用了種子發(fā)芽器(Serwell Instruments Inc.)。
三葉期幼苗確定將發(fā)芽3天的幼苗轉移到溫室中的portrays(52.5mm(長)×26mm(深)×5.2mm(直徑))中，該溫室具有800微摩/mt2/秒的光強度和60％RH。在含有紅砂壤土的portrays中幼苗一直生長到三葉期(約12天)。一周施用肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)一次直到試驗結束。
CspB-R2植物分析實驗方案在100微摩/mt2/秒光照和70％RH下，讓三葉期稻幼苗(12天的)經受10℃冷脅迫4天(Percival生長室)。在脅迫處理后，在溫室中讓植物恢復10天并在第10天對存活的植物進行生長觀察，記錄影像證據。每種品系每次處理具有10次重復且它們是完全隨機的。
結果在用于冷脅迫耐受性測試的8個不同品系中，與野生型相比，6個品系具有明顯更高的低溫耐受性。與野生型相比，包括R2-226-6-9-3、R2-226-29-1-1、R2-257-20-2-1、R2-238-1-1-3、R2-230-4-4-2和R2-257-3-1-3的品系通過表現高恢復和低縮小率的生長(對于無脅迫的對照)，顯示了高的低溫耐受性(表-1，平板-1)。品系R2-230-4-42，具有非常好的性能，其具有100％存活率并在恢復過程中保持良好的生長(表1)。
表1.CspB R2轉基因品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
(索引WT＝野生型)CspB-R3植物分析實驗方案在1000微摩/mt2/秒光照下，讓三葉期幼苗暴露于8℃冷脅迫1天(Percival生長室)。隨后，在28℃溫室中讓幼苗恢復15天并在恢復結束時記錄植物高度。
結果8個不同品系用于測試冷脅迫耐受性，與野生型(非轉基因)植物相比所有8個品系都顯示了改善的耐受性。這些結果證實了顯示改善低溫耐受性的R2分析數據(表2)。
表2CspB R3轉基因品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
CspA-R2植物分析實驗方案在1000微摩/mt2/秒光照和70％RH的生長室中，讓三葉期稻幼苗(12天的)經受10℃冷脅迫3天。在脅迫處理后，在溫室中讓植物恢復15天并在第15天記錄生長觀察。每一數值是12次觀察的平均值，且該實驗是根據如下完全隨機化(CRD)實驗設計來實施的。
結果與野生型相比，在所測試的7個獨立CspA轉基因品系中有6個品系顯示改善的低溫耐受性。在該實驗中，與無脅迫的植物相比，在冷處理的對照植物(WT)中植物高度減少了約50％。而在冷處理的具有CspA基因的不同獨立品系轉基因植物中，植物高度減少在4.5％-22.50％之間(除了一種品系生長減少47.09％外)。這些結果表明CspA改善了稻的低溫耐受性(表3)。
表3CspA R2轉基因稻品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
CspA-R3植物分析實驗I實驗方案在1000微摩光照下，讓三葉期幼苗暴露于10℃冷脅迫3天。隨后，在28℃溫室中讓幼苗恢復30天并在恢復結束時記錄植物高度和幼苗存活率(在該實驗中，每一轉基因品系重復8次而野生型重復10次)。
結果經受了冷脅迫的6個轉基因品系在冷脅迫下較野生型表現更好。通過顯示改善的低溫耐受性，這些結果進一步證實了R2分析數據(表4)。
表4CspA R3轉基因稻品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
注釋僅對存活植物記錄植物高度，以上給出了它們的平均值。
實驗II實驗方案在1000微摩光照下，讓三葉期幼苗暴露于10℃冷脅迫1天。隨后，在28℃溫室中讓幼苗恢復30天并在恢復結束時記錄植物高度和幼苗存活率(在該實驗中，每一轉基因品系重復8次而野生型重復10次)。
結果經受了冷脅迫的5個轉基因品系在冷脅迫下較野生型表現更好。通過顯示改善的低溫耐受性，這些結果進一步證實了R2分析數據(表5)。
表5CspA R3轉基因稻品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察值結果
三葉期熱脅迫響應植物體制備發(fā)芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，并徹底洗滌(在去離子水中約10分鐘)以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌濕濾紙上于30℃溫度和60％RH下發(fā)芽，使用了種子發(fā)芽器(Serwell Instruments Inc.)。
三葉期幼苗的確定將發(fā)芽3天的幼苗轉移到溫室中的portrays(52.5mm(長)×26mm(深)×5.2mm(直徑))中，該溫室具有800微摩/mt2/秒的光強度和60％RH。在含有紅土的portrays中幼苗一直生長到三葉期(約12天)。一周施用肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)一次直到試驗結束。
CspA-R2植物分析實驗方案在70％RH下，讓三葉期稻幼苗(12天的)經受50℃熱脅迫3天。在脅迫處理后，在溫室中讓植物恢復15天并在第15天記錄生長觀察值。每一數值是12次觀察的平均值。
結果與野生型相比，在所測試的7個獨立CspA轉基因品系中有6個品系顯示改善的耐熱性。在該實驗中，與無脅迫的植物相比，在熱處理的對照植物(WT)中植物高度減少了超過50％。而在熱處理的帶有CspA基因的不同獨立品系轉基因植物中，植物高度減少在9.5％-35％之間。這些結果表明CspA改善了稻的耐熱性(表6)。
表6CspA R2轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果
CspB-R3植物分析實驗方案將三葉期幼苗暴露于53℃熱脅迫2小時，隨后在28℃溫室中讓幼苗恢復15天并在恢復結束時記錄植物高度。
結果與野生型相比，在測試的8個轉基因品系中有7個品系在熱脅迫測試下表現更好。這些結果表明CspB改善了稻的熱耐性(表7)。
表7CspB R3轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果
CspA-R3植物分析實驗I實驗方案將三葉期幼苗暴露于53℃熱脅迫3小時，隨后在28℃溫室中讓幼苗恢復30天并在恢復結束時記錄植物高度。
結果通過顯示改善的耐熱性，這些結果證實了R2分析數據(表8)。
表8CspA R3轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果
實驗II實驗方案在1000微摩光照下，讓三葉期幼苗暴露于50℃熱脅迫1小時，隨后在28℃溫室中讓幼苗恢復30天并在恢復結束時記錄植物高度。
結果通過顯示改善的耐熱性，這些結果證實了R2分析數據(表9)。
表9CspA R3轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果。
水分脅迫響應植物體制備發(fā)芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，并在milique水中徹底洗滌10分鐘以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌濕濾紙上于30℃溫度和60％RH下發(fā)芽，使用了種子發(fā)芽器(Serwell Instruments Inc.)。
CspB-R2植物分析實驗方案將發(fā)芽幼苗(3天的)轉移到兩種不同水平的水分脅迫中，該水分脅迫是在含蛭石的PVC盆中建立的，是依據田間持水量(FC)來測定的。FC-100％是飽和狀態(tài)(即100g蛭石需要350ml水)(Sharp等.，1988，Plant physiol.8750-57)。通過添加所需量的水，在含蛭石的PVC盆中建立不同水平的水分脅迫(即50％FC和25％FC)。在整個實驗過程中，通過每天添加由于蒸發(fā)所失去的水分量，保持不同脅迫水平中的水分狀態(tài)不變。在800微摩/mt2/秒光強度和60％RH的溫室中，讓幼苗在水分脅迫條件下生長15天。在生長的第15天，采用拍照記錄根和苗。每一品系每次處理重復10次，且它們是完全隨機化的。
通過采用如下公式計算生長減少的百分率。
結果對4個不同的CspB轉基因品系進行水分脅迫耐受性的分析。與野生型植物相比，在脅迫過程中所有測試的CspB轉基因品系都顯示出明顯更高的生長。上述轉基因品系包括R2-257-15-1-1、R2-238-1-1-3、R2-257-3-1-6和R2-226-6-9-3，與無脅迫的對照相比在根和苗生長中顯示最小的百分數減少(FC-100％)。在這些品系的根和苗生長中減少的范圍在11-25％之間。而野生型植物在生長中顯示最大的減少，其接近50％。這些結果表明CspA改善了稻的水分脅迫耐受性(表-10和表-11)。
表10cspB轉基因品系和野生型在水分脅迫結束時根和苗生長的比較
(索引WT＝野生型，R∶S＝根與苗比值)
表11cspB轉基因品系和野生型根和苗生長減少率的比較。
CspA-R2植物分析a.植物體制備發(fā)芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，并在milique水中徹底洗滌10分鐘以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌濕濾紙上于30℃溫度和60％RH下發(fā)芽，使用了種子發(fā)芽器(Serwell Instruments Inc.)。
三葉期幼苗的確定將發(fā)芽3天的幼苗轉移到溫室中的portrays(52.5mm(長)×26mm(深)×5.2mm(直徑))中，該溫室具有800微摩/mt2/秒的光強度和60％RH。在含有紅砂壤土的portrays中幼苗一直生長到三葉期(約12天)。將肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)噴灑到幼苗表面，一周一次直到試驗結束。
實驗方案在800微摩/mt2/秒光照和60％RH的溫室中，讓一個月大的幼苗經受水分脅迫3天。通過停止灌溉強加水分脅迫。在3天結束時，植物開始顯示出萎蔫癥狀。通過用水灌溉植物減輕該脅迫，24小時后記錄植物顯示萎蔫癥狀百分率的觀察值。在每次處理中每一品系保持最少12株植物。
結果與野生型相比，在所測試的7個獨立的CspA轉基因品系中有6個品系顯示改善的水分脅迫耐受性。在灌溉后66％的對照植物沒有從萎蔫中恢復，而在不同獨立品系的CspA轉基因植物之間，在灌溉后有5％-43％的植物顯示萎蔫癥狀(除一個品系的植物顯示85％的萎蔫之外)。這些結果表明在稻中CspA改善了水分脅迫耐受性(表12)。
表12CspA R2轉基因稻品系的水分脅迫響應。
鹽脅迫響應CspB-R3植物分析實驗方案通過將發(fā)芽的幼苗(48小時的)轉移到帶有含200mMNaCl蛭石的PVC盆中生長10天，讓它們經受鹽分脅迫。在脅迫10天后，通過將幼苗轉移到含水蛭石的新盆中，讓它們恢復15天。在恢復結束時記錄諸如植物高度的生長觀察值。該實驗在完全隨機設計(CRD)后在溫室中進行，每次處理保持8次重復。
結果7個CspB轉基因品系和野生型植物經受了200mM NaCl脅迫。在該條件下，與野生型相比，5個轉基因品系表現更好。這些結果表明CspB改善了稻植物對鹽脅迫的耐受性(表13)。
表13CspA R2轉基因稻品系鹽脅迫恢復生長觀察結果
R3水分脅迫測定通過將它們轉移到含有蛭石的盆中，讓來自cspA的4個獨立轉基因品系(1，2，3，4)和野生型(Nipponbare 5號)的發(fā)芽的幼苗(3天的)經受水分脅迫。保持3種水平的水分狀態(tài)，它們是100％田間持水量(FC-100＝3.72毫升水/克蛭石)、25％田間持水量(FC25＝0.93毫升水/克蛭石)、15％田間持水量(FC15＝0.558毫升/克蛭石)。在800微摩./mt2/秒.光強度和60％RH的溫室中，幼苗在不同的水分狀態(tài)中生長30天。在整個實驗過程中，通過每天添加由于蒸發(fā)所失去的水分量，保持不同脅迫水平中的水分狀態(tài)不變。在第30天時，通過添加水分使其水平到FC100并保持15天，讓植物恢復。在實驗過程中，記錄諸如在脅迫(ES)結束時植物高度(pl.ht.)和根(R)苗(S)長度以及在恢復結束時干重的生長觀察值。
每一品系每次處理重復10次，并且它們是完全隨機的。
表14恢復結束時平均苗和根長度(cm)
表15恢復結束時平均苗和根干重(mg)
表16脅迫結束時平均苗長度
實施例10.
cspA構建pMON73607(圖10)
1.用NcoI和ApaI酶切pMON61322載體以打開主鏈并切下CspA基因。通過凝膠純化分離主鏈片段。
2.從pMON56609(圖8)載體PCR擴增大腸桿菌cspA基因。使用PCR引物在基因的5’末端留下NcoI位點并在3’末端創(chuàng)建SwaI和ApaI位點。
3.連接PCR片段和pMON61322(圖11)主鏈。轉化入文庫效率(library efficiency)DH5α細胞。篩選的菌落使用ApaI和NcoIc來鑒定具有插入物的克隆。
4.對載體測序以證實cspA基因和質粒其他選定區(qū)域的保真性。
cspB構建pMON73608(圖12)1.用NcoI和ApaI酶切pMON61322載體以打開主鏈并切下HVA1基因。通過凝膠純化分離主鏈片段。
2.從pMON56610載體PCR擴增枯草桿菌cspB基因。使用PCR引物在基因5’末端留下NcoI位點并在3’末端創(chuàng)建SwaI和ApaI位點。
3.連接PCR片段和pMON61322主鏈。轉化入文庫效率DH5細胞。篩選的菌落使用ApaI和NcoIc來鑒定具有插入物的克隆。
4.對載體測序以證實Csp B基因和質粒其他選定區(qū)域的保真性。
實施例11.玉米植物轉化通過本領域公知方法可轉化玉米植物，例如，參見本文中實施例20-25。
實施例12.
可采用下列方法分析轉基因植物的拷貝數。
從嫩葉中收集葉組織，盡可能從靠近底部和葉的一側收集。將試樣置于96孔板中凍干過夜。通過在每個孔中放置3個3mm金屬球并使用Mega研磨機在1200rpm下振動2分鐘均質組織。使用含有β-巰基乙醇、緩沖到pH 8的Tris、EDTA、NaCl和十二烷基硫酸鈉的標準緩沖液提取DNA。先用乙酸鉀再用氯仿進行提取，并用異丙醇進行沉淀。接著離心，用乙醇溶液洗滌并干燥，在進一步分析前將DNA重懸于Tris-EDTA緩沖液中。
用多種限制性內切酶消化DNA并通過非變性瓊脂糖凝膠電泳分離片段。用NaOH溶液變性DNA。在含NaCl的Tris緩沖液中中和凝膠并通過毛細管作用轉印在尼龍濾膜上。在添加合適的探針前，將尼龍濾膜在含鮭魚精子DNA緩沖溶液中預雜交，該探針可以是放射性或DIG標記的。雜交后，洗滌印跡并通過對放射自顯影膠片曝光或用抗DIG抗體綴合物和合適的底物檢測DIG來檢測。
實施例13.
我們使用cspA和cspB的全長開放閱讀框在大腸桿菌中表達，使用了容許合成并純化His-標記的抗原的載體(Novagen，MerckKgaA，Darmstadt，Germany的分支機構)。使用了供應商，例如Strategic Biosolutions的產品，純化的抗原可用于產生多克隆抗體。所產生的抗體可用來測試表達CSP蛋白的植物。
實施例14.
轉基因玉米品系改良。在諸如玉米種質A(CORN OFGERMPLASM A)、玉米種質C(CORN OF GERMPLASM C)和玉米種質D(CORN OF GERMPLASM D)的種質中產原代轉化體生。原代轉化體自交并與相同的近交基因型非轉基因植物回交。將來自自交植物的種子在田地里種植并通過Taqman接合性測定法測定以鑒定推定的純合選擇物，推定的雜合選擇物和負選擇物。將推定的雜合選擇物與多種合適的測交植物雜交，如玉米種質B(CORNOF GERMPLASM B)和玉米種質D(CORN OF GERMPLASM D)。收獲雜交的種子，手工脫殼，并通過選擇進行分組。其他育種方法也可采用，例如，參見本文實施例29。
實施例15.
對幼苗進行處理，限制可獲得水分至最適度以下水平使得處理產生可測的表型響應。例如，該處理可采取在若干天內限制水分量導致進行性水分虧缺的形式，或采取通過溶液培養(yǎng)滲透脅迫幼苗產生急性缺水的形式，或采用鹽處理。對該處理具有改善的表型響應的轉基因陽性植物可被篩選。測定的表型響應可包括在處理期間或在處理后恢復期間苗生長率或干重累積、萎蔫或萎蔫恢復、以及根生長率和干重累積。對于田間有效性試驗那些具有改善的響應將得到提升。篩選將需要許多在小盆中生長的轉基因陽性和轉基因陰性植物，這些植物在諸如生長室或溫室的可控環(huán)境中生長。被篩選的植物數量受與所應用的處理和所測表型相關的變量支配。
實施例16.
田間生長的植物可經限制可獲得水分至最適度以下水平的處理，使得可處理產生可測的表型響應。例如，該處理可采取在植物的后期生長和早期生殖發(fā)育期間，在若干天內限制植物可獲得水分量導致進行性水分虧缺的形式。在該處理中相對于轉基因陰性植物，篩選具有改善表型響應的轉基因陽性植物。測定的表型響應可包括在處理期間苗生長率、葉萎蔫、谷物產量以及諸如谷粒數量和千粒重的穗產量組分。對于第一年產量試驗那些具有改善響應的事件將得到提升。篩選可在具有可控灌溉的兩塊旱地區(qū)域的標準種植密度下進行。被篩選的植物數量受與所應用的處理和所測表型相關的變量支配。
實施例17.
一些所描述的基因將被克隆轉化入植物中，并以一種類似于如下的方法(實施例17-30)產生表型。例如，核苷酸和編碼SEQ IDNOS4-53的核苷酸。
構建目的載體使用本領域技術人員公知的方法構建GATEWAYTM目的(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)植物表達載體(pMON65154，圖13)。表達載體的元件概述于表17中。包含細菌復制功能的質粒pMON65154主鏈和來自于質粒pSK-的在大腸桿菌中表達的氨芐青霉素抗性基因。pMON64154中植物表達元件是本領域技術人員可以獲得的，表17中提供了每一元件的參考文獻。所有在表17中引用的位置指每一元件在圖13所披露的質粒圖中的堿基對坐標。一般來說，pMON65154包含含有可操縱地連接編碼新霉素磷酸轉移酶II(nptII)基因的花椰菜花葉病毒35S啟動子的選擇標記表達盒。該選擇標記表達盒3’區(qū)包含根癌農桿菌胭脂堿合酶基因(nos)3’區(qū)和在其之后的馬鈴薯蛋白酶抑制因子II(pinII)基因3’區(qū)。質粒pMON65154還包含一個植物表達盒，使用GATEWAYTM克隆方法可以插入目的基因。該GATEWAYTM克隆盒5’側接有稻肌動蛋白1啟動子、外顯子和內含子的，3’側接有馬鈴薯pinII基因3’區(qū)。使用GATEWAYTM方法，用目的基因取代該克隆盒。包含目的基因的載體pMON65154及其衍生物在通過諸如微粒轟擊的直接DNA遞送的植物轉化方法中是特別有用的。本領域技術人員使用本領域公知方法可以構建具有相似特征的表達載體。此外，本領域技術人員應當理解其他啟動子和3’區(qū)可用于表達目的基因，并可以使用其他選擇標記。
表17.
質粒pMON65154的元件
構建一種用于農桿菌介導的植物轉化方法的分離的質粒載體(pMON72472，圖14)。該質粒pRG76包括pMON65154中的目的基因植物表達盒、GATEWAYTM克隆盒和植物選擇標記表達盒。此外來自農桿菌的左和右T-DNA邊緣區(qū)被添加到該質粒上。右邊緣區(qū)位于稻肌動蛋白1啟動子的5’，左邊緣區(qū)位于pinII 3’序列的3’，該pinII 3’序列位于nptII基因的3’。此外，pMON65164的pSK-主鏈被質粒主鏈所取代以便于該質粒在大腸桿菌和農桿菌中復制。該主鏈包含多種宿主來源的在農桿菌中起DNA復制作用的oriV、pBR322來源的在大腸桿菌中起DNA復制作用的rop序列和用于在大腸桿菌和農桿菌中選擇所存在質粒的壯觀霉素/鏈霉素抗性基因。
表18中描述了存在于質粒載體pRG81中的元件。
表18.質粒載體pRG81的遺傳元件
實施例18.
編碼序列在插入諸如pMON65154(圖13)的GATEWAYTM目的植物表達載體之前通過PCR進行擴增。所有編碼序列皆可獲得自克隆的全長序列或DNA序列信息，使來自cDNA文庫期望序列的擴增得以進行。為了除去大部分的5’和3’非翻譯區(qū)，根據起始和終止密碼子處或其附近序列，設計PCR擴增引物。為了能通過重組入GATEWAYTM載體(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)進行克隆，PCR產物末尾帶有attB1和attB2序列。
兩種方法用于產生attB側翼的PCR擴增的目的序列。這兩種方法詳述于GATEWAYTM克隆技術使用說明書中(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。在第一種方法中，使用包含attB和模板特異性序列的一組引物。引物序列如下attB1正向引物5’GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN模板特異性序列3’(SEQ ID NO71)attB2反向引物5’GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN模板特異性序列3’(SEQ ID NO72)或者，attB接頭PCR用于制備attB側翼PCR產物。attB1接頭PCR使用兩組引物，即基因特異性引物和裝配attB序列的引物。設計所需DNA序列引物，包括attB1或attB2序列5’末端的12個堿基對。使用的引物如下attB1基因特異性正向引物5’CCTGCAGGACCATG正向基因特異性引物3’(SEQ IDNO73)attB2基因特異性反向引物5’CCTGCAGGCTCGAGCTA反向基因特異性引物3’(SEQ IDNO74)第二組引物是attB接頭引物，具有如下序列attB1頭正向引物5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3’(SEQ ID NO75)attB2接頭反向引物
5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA3’(SEQ ID NO76)依照Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)所描述的方法，通過PCR擴增attB1和attB2側翼序列。如上所述從凝膠中純化并回收attB側翼PCR產物。
在某些情況下，使用GATEWAYTM技術，自PCR回收attB側翼序列，但不插入到供體載體(Donor Vector)中。當GATEWAYTM重組入供體載體失敗時，使用連接酶的常規(guī)克隆方法用于將DNA序列插入到中間載體(Entry Vector)(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中。中間載體的選擇取決于該載體中限制性內切酶位點和所需插入序列的相容性。用經選擇的限制性內切酶消化中間載體以除去ccdB基因，脫磷酸并通過凝膠純化。所選擇的限制性內切酶取決于所使用的中間載體和期望插入的序列。例如，使用EcoRI或其他諸如EcoRV和XmaI或NcoI和XhoI的限制性內切酶組合從pENTR11(圖15)中除去ccdB基因。其他限制性內切酶可與其他中間載體一起使用，用于GATEWAYTM方法中。為使用限制性內切酶消化中間載體，在期望PCR產物上產生合適的粘性末端是必需的?？赏ㄟ^多種本領域技術人員公知的方法產生粘性末端，例如限制性內切酶消化、接頭連接或在PCR過程中添加限制酶切位點。
在某些情況下，在PCR片段和中間載體上不可能產生合適的粘性末端。或者，要通過限制性內切酶消化cDNA克隆指導產生合適的粘性末端。但是，有可能產生平末端連接的PCR片段和中間載體。使用該方法，用限制性內切酶酶切中間載體以除去ccdB基因。用T4DNA聚合酶使得凝膠純化的線性中間載體平末端化。本領域技術人員知道其他制備平末端的DNA分子的方法，例如使用Klenow DNA聚合酶的方法。通過與T4 DNA聚合酶或其他合適的聚合酶、T4多核苷酸激酶以及磷酸酶溫育，PCR產物平末端化且較好地脫磷酸化。使用本領域公知方法進行中間載體和PCR產物的平末端連接。將連接產物轉化入大腸桿菌和質粒，分析單個菌落中插入DNA的存在和在中間載體中相對于attL位點的期望方向。選擇帶有緊接于開放閱讀框氨基末端的attL1序列的克隆。
更適宜地，當使用GATEWAYTM方法，attB側翼PCR產物不能插入質粒中時，使用克隆PCR產物的TA法(Marchuk等.，1991)。該TA法利用了Taq聚合酶末端轉移酶活性。使用在此所述的方法，用限制性內切酶酶切中間載體并產生平末端化。該平末端化線性中間載體與dTTP和Taq聚合酶溫育，在每條DNA鏈的3’末端添加一個胸腺嘧啶殘基。由于Taq聚合酶嗜好dATP，因此大多數產生的PCR產物通常在3’末端添加有一個腺苷。因此，中間載體和PCR產物具有互補的單堿基3’突出物。在本領域技術人員公知的條件下連接后，將質粒轉化入大腸桿菌。從單個菌落中分離質粒并進行分析以鑒定在正確方向上具有期望插入物的質粒。或者，將末尾帶有attB位點的PCR產物TA克隆入商用TA克隆載體中，例如pGEM-TEASY(Promega Corporation，Madison，WI)。
在導入植物前，對所有PCR擴增產物測序。對通過GATEWAYTM法產生的目的表達載體中的PCR插入物測序，以證實所插入的序列編碼期望的氨基酸序列。如果使用連接法產生中間載體，則在使用GATEWAYTM技術產生目的表達載體前對中間載體中插入序列進行測序。點突變并不影響氨基酸編碼序列，即沉默突變是可接受的。
實施例19.構建表達載體GATEWAYTM克隆法(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)用于構建玉米轉化中使用的表達載體。該GATEWAYTM法詳盡描述于GATEWAYTM克隆技術使用說明書(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中。使用GATEWAYTM系統有利于編碼基因在植物表達載體中的高通量克隆。如上所述，通過PCR產生帶attB1和attB2側翼序列的基因序列。取決于所重組的序列，將attB1和attB2置于編碼序列的5’和3’，產生正義或反義表達載體。一種植物表達載體，pMON65154(圖13)，其中任一編碼序列都可在正義或反義方向插入，如實施例1所述得到構建，并在GATEWAYTM克隆方法中用作為目的載體。
兩種任取其一的方法用于在植物表達載體中插入PCR擴增的編碼序列。在第一種方法中，包含5’和3’末端attB1和attB2側翼序列的目的編碼序列的PCR產物與供體載體(pDONR201TM，InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)在BP CLONASETM存在下溫育。GATEWAYTM中間克隆物產生自該反應并轉化入大腸桿菌。從中間克隆物分離質粒DNA。為證實PCR反應的保真性，可對來自中間載體的插入編碼序列進行測序。將分離自大腸桿菌菌落中間克隆物的質粒DNA與線性化的目的載體溫育，優(yōu)選pMON65154，在LRCLONASETM存在下產生包含目的編碼序列的植物表達載體。將來自LR CLONASETM反應的DNA轉化入大腸桿菌。分離來自目的表達載體的質粒DNA并測序以確定正確方向和該植物表達載體中的序列。在第二種產生植物表達載體的方法中，如上所述，將帶attB1和attB2側翼序列的PCR產物與供體載體(pDONR201TM，Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)及BP CLONASETM溫育。溫育后，等分量的反應混合物進一步與線性化的目的載體及LR CLONASETM溫育。將所產生的DNA轉化入大腸桿菌，并使用本領域公知的PCR或DNA印跡分析技術選擇含有目的編碼序列的植物表達載體。Invitrogen Life Technologies(GATEWAYTM克隆技術使用說明書)描述了這兩種產生包含目的編碼序列的植物表達載體的方法。
或者，使用限制性內切酶和連接酶產生中間載體。中間載體可獲得自EInvitrogen Life Technlogies(Carlsbad，CA)。每種中間載體，如pENTR1A、pENTR2B、pENTR3C、pENTR4和pENTR11，具有獨特的克隆和表達特性。pENTR11優(yōu)先用于本發(fā)明的實踐中。本領域技術人員應當意識到其他中間載體也能使用。在使用限制性內切酶和連接酶將期望序列插入一種中間載體之前，在ccdB基因的每一側上需要對中間載體進行限制酶切消化。取決于在要被插入中間載體的DNA序列上所存在的限制酶切位點，使用多種不同組合的限制性內切酶。優(yōu)選的中間載體是脫磷酸化的，以及在限制酶切消化后通過凝膠純化的。使用本領域技術人員公知的分子生物學常規(guī)方法將期望DNA序列插入中間載體。TA克隆(美國專利號5,827,657)是一種將PCR片段克隆入中間載體的優(yōu)選方法。
載體(稱為pMON和5數字編號)以及其中包含使用GATEWAYTM克隆方法產生的編碼序列是，例如，SEQ ID NOS4-28。預計使用本文所述的方法，本發(fā)明的某些編碼序列可以克隆入植物表達載體。
實施例20.
在溫室中種植玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)植物。當胚長1.5-2.0mm時，從植物上收獲穗，通常在授粉后10-15天，最經常在授粉后11-12天。通過噴灑或將穗浸泡在80％乙醇中對穗進行表面滅菌，隨后風干?；蛘?，通過浸沒在含10％SDS的50％CLOROXTM中20分鐘對穗進行表面滅菌，然后用無菌水漂洗3次。
使用本領域技術人員公知的方法分離每粒種子的未成熟胚。在含有16.9mg/L AgNO3的培養(yǎng)基211(N6鹽、2％蔗糖、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L煙酸、1.0mg/L硫胺素-HCl、0.91g/L L-天冬酰胺、100mg/L肌醇、0.5g/L MES、100mg/L干酪素水解物、1.6g/L MgCl2、0.69g/LL-脯氨酸、2g/L GELGROTM，pH 5.8)(稱為培養(yǎng)基211V)上培養(yǎng)未成熟胚3-6天，優(yōu)選在微粒轟擊前培養(yǎng)3-4天。
實施例21.
已知農桿菌介導的玉米細胞和其他單子葉植物轉化的方法(Hiei等.，1997；美國專利號5,591,616；美國專利號5,981,840；公開的歐洲專利申請EP 0 672 752)。雖然多種農桿菌菌株可以使用(見上述參考文獻)，本發(fā)明人優(yōu)先使用菌株ABI。該農桿菌ABI菌株來自菌株A208，一種C58胭脂堿型菌株，通過在37℃下培養(yǎng)除去其中的Ti質粒，還含有修飾的Ti質粒pMP90RK(Koncz和Schell，1986)。一種根癌農桿菌雙元載體系統(An等.，1998)優(yōu)選用于轉化玉米。業(yè)已描述了可替換的共整合Ti質粒(Rogers等，1988)，可用于轉化玉米。使用電穿孔(Wen-jun和Forde，1989)或三親株雜交(Ditta等.，1980)可將一種包含一或多個目的基因的雙元載體導入無害的(disarmed)農桿菌菌株中。雙元載體可含有選擇標記基因、可篩選的標記基因和/或一種或多種賦予轉化的植物所需表型性狀的基因。一種例證的雙元載體，pMON30113，示于圖4中。其他雙元載體可使用且為本領域技術人員公知。
在玉米細胞共培養(yǎng)前，農桿菌細胞可在28℃下LB(DIFCO)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有合適的抗生素進行選擇用于修飾的Ti質粒和雙元載體的保持。例如，ABI/pMON30113，可在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)進行選擇用于pMP90RK修飾的Ti質粒的保持，以及100μg/ml壯觀霉素進行選擇用于雙元載體pMON30113的保持。在農桿菌菌株宿主中使用合適的選擇試劑來保持質粒，對于本領域技術人員而言是顯而易見的。在玉米細胞接種前，在室溫下于AB培養(yǎng)基(Chilton等.，1974)中培養(yǎng)農桿菌細胞過夜，該培養(yǎng)基含有用于質粒保持的合適的抗生素和200μM乙酰丁香酮。在玉米細胞接種之前即刻，優(yōu)選通過離心沉淀農桿菌，在含有200μM乙酰丁香酮的MSVI培養(yǎng)基(2.2g/L GIBCO(Carlsbad，CA)MS鹽、2mg/L甘氨酸、0.5g/L煙酸、0.5g/L L-吡哆醇-HCl、0.1mg/L硫胺素、115g/L L-脯氨酸、10g/L D-葡萄糖和10g/L蔗糖，pH 5.4)中洗滌，以0.1-1.0×109個細胞/毫升重懸于含200μM乙酰丁香酮的MSPL培養(yǎng)基(2.2g/L GIBCO(Carlsbad，CA)MS鹽、2mg/L甘氨酸、0.5g/L煙酸、0.5g/L L-吡哆醇-HCl、0.1mg/L硫胺素、115g/L L-脯氨酸、26g/L D-葡萄糖、68.5g/L蔗糖，pH 5.4)中。本領域技術人員可用其他培養(yǎng)基替換MSVI和MSPL。
如前所述分離未成熟玉米胚。在切除后0-7天內用農桿菌接種胚，優(yōu)選在切除后馬上接種。或者，未成熟胚可培養(yǎng)超過7天。例如，如上所述，胚形成的愈傷組織可被誘發(fā)并與農桿菌共培養(yǎng)。優(yōu)選地，切除未成熟玉米胚，浸沒在農桿菌懸液中，如上所述該懸液在MSPL培養(yǎng)基中制備并在室溫下與農桿菌溫育5-20分鐘。
在接種胚被轉移到半強度的含3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1％D-葡萄糖、2％蔗糖、0.115g/L L-脯氨酸、0.5mg/L硫胺素-HCl、200μM乙酰丁香酮和20μM硝酸銀或硫代硫酸銀的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中后。在黑暗中于23℃下將未成熟胚與農桿菌共培養(yǎng)1-3天。本領域技術人員可用其他培養(yǎng)基替換所述的培養(yǎng)基。
將共培養(yǎng)的胚轉移到培養(yǎng)基15AA(462mg/L(NH4)SO4、400mg/L KH2PO4、186mg/L MgSO4-7H2O、166mg/L CaCl2-2H2O、10mg/L MnSO4-H2O、3mg/L H3BO3、2mg/L ZnSO4-7H2O、0.25mg/LNaMoO4-2H2O、0.025mg/L CuSO4-5H2O、0.025mg/L CoCl2-6H2O、0.75mg/L KI、2.83g/L KNO3、0.2mg/L煙酸、0.1mg/L硫胺素-HCl、0.2mg/L吡哆醇-HCl、0.1mg/L D-生物素、0.1mg/L氯化膽堿、0.1mg/L泛酸鈣、0.05mg/L葉酸、0.05mg/L對氨基苯甲酸、0.05mg/L核黃素、0.015mg/L維生素B12、0.5g/L水解酪蛋白氨基酸、33.5mg/LNa2EDTA、1.38g/L L-脯氨酸、20g/L蔗糖、10g/L D-葡萄糖)或含有1.5mg/L 2，4-D、500mg/L羧芐青霉素、3％蔗糖、1.38g/L L-脯氨酸和20μM硝酸銀或硫代硫酸銀的MS培養(yǎng)基中，并在黑暗中于27℃下無選擇培養(yǎng)0-8天。用于選擇轉化體和植物再生的培養(yǎng)基優(yōu)選含有500mg/L羧芐青霉素。本領域技術人員可用其他抗生素替換其他控制農桿菌生長的抗生素。其他支持細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基可用作為選擇。在沒有選擇延遲(0天培養(yǎng))情況下，選擇可以開始于25mg/L巴龍霉素。選擇培養(yǎng)基可包含培養(yǎng)基211(上述的)或培養(yǎng)基211的變體，其中N6鹽置換為MS鹽。兩周后，將胚形成的愈傷組織轉移到含100mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基中，約兩周間隔傳代培養(yǎng)一次。當共培養(yǎng)后選擇延遲時，開始將胚在含50mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含100-200mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)胚形成的愈傷組織。本領域技術人員可以在抑制缺少選擇標記基因的細胞生長的巴龍霉素濃度下培養(yǎng)組織，但轉化的愈傷組織所在的濃度是可以增殖的。或者，可以使用其他的選擇標記來鑒定轉化的細胞。相信在25-50mg/L巴龍霉素下初始培養(yǎng)約兩周，接著在50-200mg/L巴龍霉素下培養(yǎng)可導致轉化的愈傷組織恢復。選擇開始6-8周后恢復轉化體。植物再生自如上所述的轉化的胚形成愈傷組織，該愈傷組織在微粒轟擊后用于轉化體恢復。
實施例22.農桿菌介導的玉米愈傷組織轉化該實施例描述了使用農桿菌轉化玉米愈傷組織的方法。該方法作為例證使用了一種nptII選擇標記基因和巴龍霉素選擇劑。本領域技術人員應當意識到其他選擇標記和選擇劑組合可替換使用。
使用本領域技術人員公知的方法從未成熟胚誘導愈傷組織。例如，從諸如玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)基因型的發(fā)育的玉米種子上切除下1.5mm-2.0mm未成熟胚，并將胚軸側面朝下在培養(yǎng)基211V上培養(yǎng)，一般在切除后培養(yǎng)8-21天。或者，確定通過本領域技術人員公知的方法可以開始并維持確定的愈傷組織的培養(yǎng)。
依照描述于實施例21的方法制備用于植物組織接種的農桿菌。將50-100塊愈傷組織轉移到含約0.1-1.0×109cfu/ml的15ml農桿菌懸液的60mm ×20mm的培養(yǎng)皿中。一塊愈傷組織通常是在培養(yǎng)第21天產生自未成熟胚的整個愈傷組織或一塊2mm-8mm直徑確定的愈傷組織。愈傷組織在室溫下與農桿菌懸液溫育約30分鐘，接著通過抽吸除去液體。
添加約50μL無菌蒸餾水到60mm×20mm培養(yǎng)皿中的Whatman#1濾紙上。1-5分鐘后，將15-20塊愈傷組織轉移到每張濾紙上，用例如PARAFILM密封培養(yǎng)皿。愈傷組織和農桿菌在黑暗中于23℃下共培養(yǎng)約3天。
從濾紙上將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀和500mg/L羧芐青霉素的培養(yǎng)基211上，在黑暗中于27℃-28℃下培養(yǎng)2-5天C，優(yōu)選3天。通過將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀、500mg/L羧芐青霉素和25mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基211上起動選擇。在黑暗中于27℃-28℃下培養(yǎng)培養(yǎng)2周后，將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀、500mg/L羧芐青霉素和50mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基211(培養(yǎng)基211QRG)中。兩周后愈傷組織在新鮮的培養(yǎng)基211QRG上傳代培養(yǎng)，并在黑暗中于27℃-28℃下進一步培養(yǎng)兩周。然后，將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀、500mg/L羧芐青霉素和75mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基211上。在黑暗中于27℃-28℃下培養(yǎng)2-3周后，鑒定巴龍霉素抗性愈傷組織。本領域技術人員應意識到愈傷組織傳代培養(yǎng)時間間隔是大約的，以更短的時間間隔轉移組織能加速選擇過程，如每周一次勝于兩周一次。
從轉化的愈傷組織再生的植物，轉移到土壤中并如實施例所描述在溫室中生長。在農桿菌介導的轉化后，培養(yǎng)基217(見實施例9)進一步添加500mg/L羧芐青霉素以及培養(yǎng)基127T(見實施例9)進一步添加250mg/L羧芐青霉素。使用表Y中概述的農桿菌介導的轉化來產生包含本發(fā)明基因的轉化的玉米植物。
實施例23.微粒轟擊的方法在微粒轟擊前約4小時，將未成熟的胚轉移到培養(yǎng)基211SV(增加蔗糖至12％的培養(yǎng)基211V)上。優(yōu)選將25個未成熟的胚置于60×15mm培養(yǎng)皿中，排成5×5網格，將胚鱗的胚芽鞘末端以20度角輕輕地壓到培養(yǎng)基中。在轟擊前組織保存在黑暗中。
在微粒轟擊前，制備其上沉淀有所需DNA的金粒懸浮液。將10毫克0.6μrn金粒(BioRad)懸浮在50μL緩沖液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0)中，添加25μL 2.4nM期望DNA溶液到金粒懸浮液中，并輕輕地渦旋約5秒。添加75μL 0.1M亞精胺并輕輕地渦旋溶液約5秒。添加75μL 25％聚乙二醇(3000-4000分子量，American Type Culture Collection)溶液并輕輕地渦旋溶液約5秒。添加75μL 2.5M CaCl2并渦旋溶液5秒。添加CaCl2后，將溶液在室溫下溫育10-15分鐘。隨后將懸浮液在12,000rpm下離心20秒(Sorval MC-12V離心機)，移除上清液。用100％乙醇洗滌金粒/DNA沉淀兩次并重懸在10mL 100％乙醇中。將金粒/DNA制備物貯藏在-20℃下最多兩周。
使用放電粒子加速基因遞送裝置(美國專利號5,015,580)將DNA導入玉米細胞中。通過在薄片上分散310-320μL的金粒/DNA懸浮液，將金粒/DNA懸浮液包覆在Mylar薄片(Du Pont Mylar聚酯軟片，型號SMMC2，一面涂有鋁層，之上兩面都涂有PVDC共聚物，切成18mm的正方形)上。在金粒懸浮液固定1-3分鐘后，除去過量乙醇并風干薄片。如美國專利號5,015,580所述進行玉米組織的微粒轟擊。在放電粒子遞送裝置中交流電電壓可以改變。對于玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)預培養(yǎng)的未成熟胚的微粒轟擊，優(yōu)選使用35％-45％的最大電壓。微粒轟擊后，在黑暗中于27℃下培養(yǎng)組織。
實施例24.轉化細胞的選擇基于轉基因新霉素磷酸轉移酶(nptII)基因的表達，在包含巴龍霉素的培養(yǎng)基上選擇轉化體。DNA遞送24小時后，將組織轉移到含25mg/L巴龍霉素的211V培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基211HV)。在黑暗中于27℃下溫育3周后，將組織轉移到含50mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基211上(培養(yǎng)基211G)。3周后，將組織轉移到含75mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基211(培養(yǎng)基211XX)上。在9周的選擇后分離轉化體。表Y披露了使用在此披露的微粒轟擊方法進行轉化體實驗的結果。
實施例25.能育轉基因植物的再生能育轉基因植物產生自轉化的玉米細胞。將轉化的愈傷組織轉移到培養(yǎng)基217(N6鹽、1mg/L硫胺素-HCl、0.5mg/L煙酸、3.52mg/L苯甲酸嘌呤、0.91mg/L L-天冬酰胺一水化物、100mg/L肌醇、0.5g/LMES、1.6g/L MgCl2-6H2O、100mg/L干酪素水解物、0.69g/L L-脯氨酸、20g/L蔗糖、2g/L GELGROTM，pH 5.8)中在黑暗中于27℃下培養(yǎng)5-7天。體細胞胚成熟和苗再生開始于培養(yǎng)基217上。將組織轉移到培養(yǎng)基127T(MS鹽、0.65mg/L煙酸、0.125mg/L吡哆醇-HCl、0.125mg/L硫胺素-HCl、0.125mg/L泛酸鈣、150mg/L L-天冬酰胺、100mg/L肌醇、10g/L葡萄糖、20g/L L-麥芽糖、100mg/L巴龍霉素、5.5g PHYTAGARTM，pH 5.8)中用于苗發(fā)育。培養(yǎng)基127T上的組織在400-600lux光照下于26℃下培養(yǎng)。在轉移到127T培養(yǎng)基后約4-6周，當苗約3英寸高并有根時，將苗轉移到土壤中，優(yōu)選在3英寸盆中。在生長室中植物于26℃下培養(yǎng)2周，接著在移栽到用于溫室生長的5加侖盆前，在溫室中的霧臺(mist bench)上培養(yǎng)2周。植物在溫室中生長至成熟期并用近交的玉米種質A(CORN OFGERMPLASM A)進行反交授粉。從植物中收集種子并用于進一步的繁殖活動。
實施例26.從植物中分離核酸在幼苗移栽到土壤中后0-2周，從R0植物的葉組織中分離核酸，收集并在96孔收集盒中速凍，從每一植株上收集了大約100毫克的組織并在分析前貯藏在-80℃下。
使用改良的Qiagen Rneasy 96TM試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)從單個組織樣品中分離DNA和RNA。在700μL RneasyTMRTL緩沖液(Qiagen Inc.，Valencia，CA)中使用Bead攪拌器(BiospecProducts，Bartlesville，OK)均質100毫克的冷凍組織。樣品在3200rpm下離心15分鐘，并將全部上清液轉移到Promega WIZARDTM透明平板(Promega Corporation，Madison，WI)的孔中。通過真空過濾透明平板澄清樣品溶液。澄清的上清液用于核酸提取。
對于DNA提取，將70μL澄清的樣品轉移到v-孔PCR平板上，用粘合箔覆蓋，并加熱至95℃，持續(xù)8分鐘。在0℃下溫育樣品5分鐘，接著離心3分鐘以除去不溶物。Sephadex G-50凝膠過濾盒(Edge Biosystems，Gaithersburg，MO)在2000rpm下離心2分鐘作為準備。將50μL熱處理的上清液加載到每個孔中，并將盒在2500rpm下離心2分鐘。將額外的20μL TE緩沖液添加到柱流出液中，并在分析前將樣品平板貯藏在-20℃下。
對于RNA提取，將500微升的澄清溶液轉移到清潔的96孔樣品盒中。在每個孔中添加250微升的100％乙醇，并與樣品充分混合。然后將全部約750微升的溶液加載到Promega WIZARDTM過濾單元中Qiagen RneasyTM結合平板的孔中。將500毫升的RW1緩沖液(QiagenInc.，Valencia，CA)添加到每個孔中，并通過真空過濾除去緩沖液。將80微升不含RNA酶的DNA酶(Qiagen Inc.，Valencia，CA)添加到每個孔中，在室溫下溫育15分鐘，通過真空過濾將DNA酶溶液從孔中抽出。將額外的500微升RW1緩沖液(Qiagen Inc.，Valencia，CA)添加到孔中，并通過真空過濾除去該緩沖液。使用500微升的RPE緩沖液2X(Qiagen，Valencia，CA)通過真空過濾對樣品進行進一步的洗滌。將提取平板置于微量滴定板上并在3000rpm下離心3分鐘以除去所有殘留于過濾器中的RPE緩沖液溶液。添加80微升的RNA級水(不含DNA酶)到每個孔中，然后在室溫下溫育2分鐘。將提取平板和微量滴定板在3000rpm下離心3分鐘，并將RNA制備物于-80℃下冷凍貯藏在收集平板中。
實施例27.拷貝數測定使用TAQMAN法測定R0植物中轉基因拷貝數。用來自馬鈴薯pinII基因3’區(qū)的序列構建的pMON65154和pRG76GATEWAYTM目的載體，可用于轉基因插入物拷貝數的測定。pinII正向和反向引物如下正向引物5’ccccaccctgcaatgtga 3’(SEQ ID NO77)反向引物5’tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3’(SEQ ID NO78)pinII TAQMAN探針序列是5’cctagacttgtccatcttctggattggcca 3’(SEQ ID NO79)。
該探針在5’末端標記有熒光染料FAM(6-羧基熒光素)，淬滅劑染料TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明)通過接頭連接在該探針的3’末端。TAQMAN探針獲得自Applied Biosystems(FosterCity，CA)。在TAQMAN拷貝數測定中，_SAT，一種單拷貝玉米基因用作為內標。SAT引物如下正向引物5’gcctgccgcagaccaa 3’(SEQ ID NO80)反向引物5’atgcagagctcagcttcatc 3’(SEQ ID NO81)SAT TAQMAN探針序列是5’tccagtacgtgcagtccctcctcc 3’(SEQID NO82)該探針在其5’末端標記有熒光染料VICTM(Applied Biosystems，Foster City，CA)，在其3’末端具有淬滅劑染料TAMRA。
依照廠商說明書(Applied Biosystems，Foster City，CA)，進行TAQMANPCR。在每次測定中使用5-100ng DNA。PCR擴增和TAQMAN探針檢測在1X TAQMAN Universal PCR MasterMix(Applied Biosystems，Foster City，CA)中進行，其含有AmpliTaqGoldDNA聚合酶、AmpEraseUNG、含有dUTP的dNTPs、PassiveReference 1和優(yōu)化的緩沖液。800nM的每種正向和反向pinII引物以及150nM的pinII TAQMAN探針用于TAQMAN測定。200nM的每種Sat正向和反向引物以及150nM的Sat TAQMAN探針用于TAQMAN拷貝數測定。TAQMANPCR在50℃下進行2分鐘，在95℃下進行10分鐘，接著進行在95℃下15秒和在60℃下1分鐘的40個循環(huán)。使用ABI Prism 7700序列檢測系統或ABI7900HT序列檢測系統(Applied Biosystems，Foster City，CA)測定實時TAQMAN探針熒光。依照TAQMANEZ RT-PCR試劑盒使用說明書(Applied Biosystems，Foster City，CA)計算Cγ值。ΔΔCγ值計算為Cγ(內標基因(Sat))-Cγ(轉基因)-Cγ(非轉基因植物中內標基因(Sat))。依照表12中標準拷貝數賦值如下。
表19.用于TAQMAN測定拷貝數的標準
含有本發(fā)明基因的植物可以通過TAQMAN法分析拷貝數。通過將TAQMAN和DNA印跡雜交，用DNA印跡分析證實在被分析的約80％的植物中TAQMAN拷貝數測定結果。
實施例28.基因表達測定通過TAQMANRT-PCR測定本發(fā)明轉基因的表達，其使用了來自Applied Biosystems(Foster City，CA)的TAQMANEZ RT-PCR試劑盒。測定相對于轉基因標準表達的RNA表達，該轉基因標準是稱為DBT418的轉基因玉米事件，包含可操縱地連接pinII 3’非翻譯區(qū)的蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)cryIAI基因。該DBT418事件以可賦予對諸如玉米螟(European Corn Borer)的鱗翅類昆蟲商用水平抗性的水平表達cryIAI基因，并為DEKALB GeneticsCorporation以DEKALBt商標名作為商品出售。用來自馬鈴薯pinII基因3’區(qū)的序列構建pMON65154和pRG76GATEWAYTM目的載體，可用于任何插入目的載體的編碼序列轉基因轉錄物水平的測定。之前描述的pinII引物和探針用于TAQMANRT-PCR。泛素融合蛋白(UBI)RNA用作為所有TAQMANRT-PCR測定中的內標。使用的UBI引物如下正向引物5’cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3’(SEQ ID NO83)反向引物5’ccaacaggtgaatgcttgatagg 3’(SEQID NO84)UBI TAQMAN探針序列是5’catgcgccgctttgcttc 3’(SEQ ID NO85)該UBI TAQMAN探針在其5’末端標記有熒光染料VICTM(Applied Biosystems，Foster City，CA)，在其3’末端具有淬滅劑染料TAMRA。
依照描述于TAQMANEZ RT-PCR試劑盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA)中的一步法，進行逆轉錄、PCR擴增和TAQMAN探查。在每次測定中使用5-100ng的總RNA。來自DBT418事件體外轉錄的對照RNA被包括作為每個平板上的對照，運轉濃度范圍為0.01pg-10pg。來自DBT418葉和來自非轉基因近交玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)的總RNA分別作為正對照和負對照。在含有3mM乙酸錳，300μM每種dATP，dCTP，dGTP和dUTP，100單位rTthTM(Applied Biosystems，Foster City，CA)DNA聚合酶和25單位AmpErase UNG(Applied Biosytems，FosterCity，CA)的TAQMANEZ緩沖液(50mM N-二羥乙基甘氨酸、115mM乙酸鉀、0.01mM EDTA、60mM Passive Reference 1、8％甘油，pH 8.2，Applied Biosystems，Foster City，CA)中進行RT-PCR。RT-PCR進行如下在50℃下2分鐘，在60℃下30分鐘，在95℃下5分鐘，接著進行在95℃下20秒和在60℃下1分鐘的40個循環(huán)，400nM的每種正向和反向引物用來擴增pinII序列，200nMTAQMANpinII探針用來檢測。使用400nM每種正向和反向引物擴增UBI RNA，200nM UBI TAQMAN用來檢測。使用ABI Prism7700序列檢測系統或ABI7900HT序列檢測系統(AppliedBiosystems，Foster City，CA)測定TAQMAN熒光。相對于DBT418中轉基因表達，對本發(fā)明轉基因表達定量，并記錄轉基因表達對DBT418表達的比值，即2-(ΔΔC)γ(轉基因)/2-(ΔΔC)γ(DBT418)。
實施例29.植物育種回交可用來改良源植物(starting plant)?；亟粚碜栽粗参锏奶囟ㄆ谕誀钷D移到缺少該性狀的近交種和其他植物中。其可進行如下，例如，通過將優(yōu)良的近交種(A)(回交親本)與供體近交種(非回交親本)進行第一次雜交，該供體近交種攜帶有對于所討論性狀合適的基因，例如，依照本發(fā)明所制備的構建體。在所產生的后代中選擇期望性狀從非回交親本轉移的第一次雜交的后代，然后將所選擇的后代與所述優(yōu)良的回交親本(A)回交。在5次或更多次回交后產生了對期望性狀的選擇，對于控制要被轉移性狀的基因座而言，該后代是半合子，但對于大多數或幾乎所有的其他基因來說，與類似于所述優(yōu)良的親本。最后一次回交應當自花授粉以產生對于被轉移基因，即一個或更多個轉化事件，而言是純系繁育的后代。
因此，通過一系列育種操作，所選擇的轉基因可從一種品系轉移到全部不同的品系中，無需進行進一步的重組操作。由于它們具有與任何其他基因相同的典型遺傳學行為且可以一種與其他玉米基因相同的方法通過育種技術進行操作，因此轉基因是有價值。因此，可以產生對于一種或更多種轉基因而言是純合的近交植物。通過雜交不同的近交植物，可以產生大量具有不同轉基因組合的不同雜種。這樣，可以產生具有與雜種密切相關的期望農學性狀(“雜種優(yōu)勢”)以及通過一種或多種轉基因賦予期望性狀的植物。
期望將本發(fā)明的基因滲入到玉米雜種中用于鑒定轉化植物中每種基因所賦予的表型。導入轉基因的宿主基因型，優(yōu)選玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)，是一種優(yōu)良的近交種，所以僅需有限次數的育種就可產生高產量的玉米雜種。將再生自愈傷組織的轉化植物與諸如玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)的相同基因型的植物進行雜交。后代自花授粉兩次并鑒定對于轉基因純合的植物。為了產生雜種，將純合的轉基因植物與測交親本雜交。該測交親本是一種屬于與轉基因親本不同的雜種優(yōu)勢群的近交種，已知其能產生高產量的雜種，例如產生自玉米種質A(CORN OFGERMPLASM A)和玉米種質E(CORN OF GERMPLASM E)或玉米種質B(CORN OF GERMPLASM B)雜交的雜種。
實施例30.評估表現型的方法本發(fā)明基因的表達在轉化細胞和植物中產生了各種表型，如在此中所披露的。在愈傷組織轉化和植物再生過程以及在植物和后代中，收集表型數據。收集在轉化的愈傷組織中與外觀形態(tài)以及愈傷組織生長相關的表型數據，例如，苗、根、淀粉、類粘蛋白、無胚胎發(fā)生、增加的生長率、減少的生長率、死亡。應當預計本領域技術人員可以意識到轉化愈傷組織中的其他表型性狀。
在植物再生和再生植物轉移到土壤的過程中也收集表型數據。表型數據包括諸如正常植物、叢生植物、狹葉、具條紋葉、有結表型、缺綠癥、白化體、花色素苷產生、buggy whipped(一種本領域公知的現象，其中大多數新生葉伸長且互相卷繞)或改變的雄花穗、穗或根的性狀。預計本領域技術員能識別轉化植物中其他的表型性狀。
多種表型在植物育種和近交種及雜種植物測定過程中被監(jiān)測。例如，在R0和R1植物(直接再生自愈傷組織的植物及其直系后代)中，記錄株型(常規(guī)形態(tài)性狀，例如上述對于幼苗所描述的那些)和產生自上述植物的谷粒的營養(yǎng)組成。營養(yǎng)組成分析可以包括氨基酸組成，蛋白、淀粉和油類的量，蛋白、淀粉和油類的特性，纖維、灰分、礦物質含量可都被測定。預計本領域技術人員可以進行包括谷粒其他組分在內的分析。在R2和R3植物中，觀察花粉釋放日、抽穗日和株型。此外，作R2植物代謝物分布圖。使用本領域技術人員可獲得的方法，可分析植物中50-100種或更多種的代謝物，由此建立了該植物的代謝物指紋圖譜。另外，在田間條件下測定R3植物中葉伸長速度。在包含本發(fā)明轉基因的雜種中可以測定多種表型。例如，可以記錄產量、水分、容重、營養(yǎng)組成、葉綠素含量、葉溫、林分、幼苗活力、株高、葉數目、分蘗、支柱根、持綠性(stay green)、莖部倒伏、根部倒伏、植物健康、不結實/增殖力、green snap、有害物抗性(包括疾病、病毒和昆蟲)以及代謝物分布圖。此外，可記錄雜種收獲的谷物的表型性狀，包括穗上每行種子的數量、穗上種子的行數、種子敗育、種子重量、種子大小、種子密度和谷物物理屬性。此外，在雜種或近交種中可以測定諸如光合作用、葉面積、外殼結構、種子干燥率和節(jié)間長的特性。預計可以對表達本發(fā)明基因的轉基因植物作出轉錄分布圖。
為測定表達本發(fā)明基因的轉基因植物的雜種產量，應當意識到雜種必須在玉米常規(guī)種植的地理位置中的多個位置處進行測試，如，愛荷華州、伊利諾斯州或在美國中西部的其他位置。為了鑒定轉基因對于玉米雜種改良的貢獻，預計多于一年的產量測試是需要的。因此，可以在第一年在足夠數量的位置處評估轉基因雜種，以鑒定與非轉基因雜種對應物至少約10％的產量差異。第二年在足夠的位置處進行產量測試，為了能在兩種雜種之間鑒定出4-5％的產量差異，需要足夠多的重復。此外，在第二年的產量測試中，可以在正常的田間條件和脅迫條件下評估雜種，如，在水分或種群密度脅迫條件下。本領域技術人員知道如何去設計產量試驗使得在兩種雜種之間可以檢測到期望精度級別的統計學顯著的產量差異。
實施例31.玉米種子的表面滅菌和吸漲對于每批轉基因而言，通過將約50粒種子放在裝有50ml含0.01％Triton X-100的30％漂白劑(次氯酸鈉溶液＝Chlorox或等價物)溶液的滅菌的500ml Erlenmyer燒瓶中并在定軌搖床上旋轉該燒瓶5分鐘對它們進行表面滅菌。然后，倒掉漂白劑溶液并用約100ml的滅菌去離子水洗滌，再倒掉洗滌用水。重復多于4次的滅菌水洗滌，在種子上留下最后一次洗滌用水。在該水中于室溫下溫育種子24小時，用于在起泡條件下的吸漲(通過0.2μm濾紙)。
I.制備Phytotrays中的培養(yǎng)基制備用于一些Phytotrays的水-瓊脂培養(yǎng)基。我們使用PhytotrayIT(或塑料盒60×30×15cm)，翻轉位置讓該容器中間大的一面在底部，并將較小的一面作為蓋子。通過在45分鐘的液體循環(huán)周期中，在去離子水中高壓滅菌0.3％BactoAgar，制備足夠的水-瓊脂培養(yǎng)基，每個Phytotray 100ml。冷卻培養(yǎng)基至其易于操作為止，當其還熔化時，向每個Phytotray中倒入約100ml。
II.玉米冷幼苗活力測定
●當培養(yǎng)基凝固時，將其和滅菌的種子放到層流罩超凈臺中。
●使用滅菌鑷子，挑選20粒健康的，極其一致的種子并將種子放在一個Phytotray中用于該測定，均勻間隔種子使得任一個體稍后能容易地拔除。
●放置種子使得胚一側斜向下插入，且種子正好在瓊脂表面下。在該位置，出現的苗和根能直接伸長而不受限。
●于22℃下在培養(yǎng)基中溫育種子一周，或直到大部分的種子生根并開始從瓊脂顯露出來為止。
●除保留10株生長極其一致的幼苗外，在層流罩超凈臺中拔除所有的幼苗。
●將Phytotrays轉移到低溫植物生長室中，設定在10℃和16小時晝周期并在此溫育2周。
●將Phytotrays移回到22℃下保持一周。
●拔除幼苗，測量每株幼苗的根長和苗長，并測量每3株幼苗的鮮重g，記錄在筆記本上。
適應冷發(fā)芽和出苗測定。
與上述相同，但具有如下例外●在I中最后一次水洗滌后，在過夜吸漲步驟中將燒瓶置于10℃。在10℃下也預冷含有凝固培養(yǎng)基的Phytotrays。
●在冷卻的Phytotrays中播種冷吸漲的種子后，將它們直接置于10℃冷室中。
●約5天后，除保留10株胚根具有大約相同長度的生長極其一致的種子外，拔除其他所有的種子。將Phytotrays送回10℃冷室中保持1-2周。拔除幼苗，測量每株幼苗的根長和苗長，并測量每3株幼苗的鮮重，記錄在筆記本上。
●將第二組的Phytotrays轉移到22℃下保持1周。
拔除幼苗，測量每株幼苗的根長和苗長，記錄在筆記本上。
實施例31.構建用于大豆轉化的質粒實施例(用于CspA和B構建體-pMON73983和73984)pMON73983(圖18)是一種雙元載體，用于農桿菌介導的轉化和在大豆中類似于枯草桿菌CspA的蛋白(SEQ ID NO1)的組成型表達。為克隆該枯草桿菌CspA基因，基于來自隸屬于國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫(yī)學圖書館(National Library of Medicine)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的CspA序列信息(Genbank#M30139)，設計兩條基因特異性引物MSA452和MSA453。MSA452的序列是GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG(SEQ ID NO86)，其在CspA翻譯起始位點處退火并在5’末端導入StuI和BglII位點，MSA453序列是CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC(SEQ ID NO87)，其在CspA最后密碼子處退火并在該引物末端導入BamHI和EcoRI位點。反向引物MSA453被設計用來匹配Genbank基因序列的3’末端。
使用引物MSA452和MSA453、高保真Taq聚合酶(BRL)和pMON57397(圖3)作為模板進行PCR反應。該模板與GenBank序列CspA基因的3’末端不同。擴增的CspB DNA通過凝膠電泳純化并連接到pCR-XL-TOPO載體(Invitrogen)上。按照廠商的實驗方案，將連接反應物轉化到大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen)中。挑選出四個轉化體菌落并使用Qiagen Miniprep試劑盒小量制備DNA。使用M13-特異性正向和反向引物對插入物進行測序。將含有正確序列的克隆命名為pMON73981并用于進一步的亞克隆。
用StuI和BamHI消化PMON73881DNA以分離CspA基因片段。繼續(xù)用StuI和BamHI消化pMON73980DNA，然后通過GeneCleanII試劑盒純化。連接該CspB片段和純化的載體pMON73980并將連接反應物電轉化入大腸桿菌DH10B細胞中。在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上挑選轉化體。由轉化體小量制備DNA，使用CaMV35S-啟動子特異性正向引物檢測DNA中插入物的存在。含有該插入物的克隆命名為pMON73983。大量制備DNA并進行一系列的經證實的消化，包括BgIII、EcoRI、PstI、EcoRI+BamHI、StuI+XhoI。這些證實了正確的克隆。
pMON73984是一種雙元載體，用于農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似于枯草桿菌CspB的蛋白(SEQ ID NO2)的組成型表達。為克隆該枯草桿菌CspB基因，基于來自隸屬于國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫(yī)學圖書館(NationalLibrary of Medicine)的國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information)的CspB序列信息(Genbank #X59715)，設計兩條基因特異性引物MSA454和MSA455。MSA454的序列是GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG(SEQ ID NO88)，其在CspB翻譯起始位點處退火并在5’末端導入StuI和BglII位點，MSA455序列是CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG(SEQ ID NO89)，其在CspB最后密碼子處退火并在該引物末端導入BamHI和EcoRI位點。反向引物MSA455被設計用來匹配Genbank基因序列的3’末端。使用引物MSA454和MSA455、高保真Taq聚合酶(BRL)和pMON57399作為模板進行PCR反應。該模板與GenBank序列CspB基因的3’末端不同。擴增的CspB DNA通過凝膠電泳純化并連接到pCR-XL-TOPO載體(Invitrogen)上。按照廠商的實驗方案，將連接反應物轉化到大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen)中。挑選出四個轉化體菌落并使用Qiagen Miniprep試劑盒小量制備DNA。使用M13-特異性正向和反向引物對插入物進行測序。將含有正確序列的克隆命名為pMON73982并用于進一步的亞克隆。
用StuI和BamHI消化PMON73882DNA以分離CspB基因片段。繼續(xù)用StuI和BamHI消化pMON73980DNA，然后通過GeneCleanII試劑盒純化。連接該CspB片段和純化的載體pMON73980并將連接反應物電轉化入大腸桿菌DH10B細胞中。在含壯觀霉素的培養(yǎng)基上挑選轉化體。由轉化體小量制備DNA，并使用CaMV35S-啟動子-特異性正向引物檢測DNA中插入物的存在。含有該插入物的克隆命名為pMON73984。大量制備DNA并進行一系列的經證實的消化，包括BglII，EcoRI，PstI，EcoRI+BamHI，StuI+XhoI。這些證實了正確的克隆。大豆植物通過用上述穩(wěn)定地整合入其基因組中的pMON構建體通過轉化產生。
實施例32.
用來自上述被研究的實施例10和11的DNA構建體轉化玉米植物溫室●對耐旱性進行兩次試驗，一次測試10個cspA事件，另一次測試10個cspB事件。
●對來自每一事件的24株轉基因陽性和24株轉基因陰性雜種幼苗進行測試(所有的種子來自分離的雜種穗)。
●該測試在溫室工作臺上進行。
●該處理包括限制給水和監(jiān)測每一容有植物盆的總盆重量。每個充滿水的盆重約1000g，限制給水直至每個盆重量到達400g位置，接著在其余的實驗過程中讓盆維持在該重量。
●在整個試驗過程中，通過測量從盆土壤表面到“最高”葉片的頂端的距離確定株高。從這些測量中，通過比較兩次測量之間的高度來確定LER(葉伸長速度)。
●在一個事件中，在干旱過程中進行轉基因陰性和轉基因陽性植物之間LER的比較。
●對于所測試的3/10的事件，在試驗過程中對于LER，cspA轉基因植物得到明顯(p＜0.10)改善。
●對于所測試的3/10的事件，在試驗過程中對于LER，cspB轉基因植物得到明顯(p＜0.10)改善。
田間效率●對于在生長的營養(yǎng)階段后期耐旱性使用雜種種子進行3次試驗，一次測試16個cspB事件(CA)，另一次測試21個cspB事件(KS)，還一次測試14個cspA事件(HI)。
●對于CA和HI試驗，苗行(rows)含有約34株植物，分離所存在的轉基因，分別出現6和4次重復。分離的苗行來自于分離的穗。
●對于KS試驗，苗行含有約34株植物；作為轉基因和非轉基因配對的作物行，具有6次重復。
●該處理包括在生長的營養(yǎng)階段后期限制給水約10天(給予少量維持植物生存所必需的水)。10天后，對植物進行良好灌溉直至收獲。
●在整個試驗過程中，測定許多種表型，包括LER、葉綠素(用SPAD儀)和光合作用率。在試驗后，測定的額外表型包括花粉釋放日和抽穗日、以及諸如種子/穗、具有種子的穗、種子重量和產量的穗特征。
●在一個事件中以及在所有的構建體中，進行轉基因陽性和陰性植物之間的表型比較。
●在CA試驗中，在干旱處理過程中或之后，cspB作為構建體(在營養(yǎng)性狀的所有事件和重復性狀的“最佳”6個事件中)轉基因陽性植物顯著地(p＜0.10)改善了LER、葉溫和種子/穗。
●在CA試驗中，在干旱處理過程中或之后，個別事件顯著地(p＜0.10)改善了LER、平均穗長、種子質量/穗、氣孔導度和抽穗日。
●在KS試驗中，cspB作為構建體(在營養(yǎng)性狀的所有事件和重復性狀的“最佳”6個事件中)轉基因陽性植物顯著地(p＜0.10)改善了LER、穗上承載的種子/行、種子/穗、種子/植物、莢重和產量。
●在KS試驗中，個別事件顯著地(p＜0.10)改善了LER、光合作用率、氣孔導度、穗/行和種子/植物。
●在HI試驗中，3個事件顯著地(p＜0.10)改善了LER(在HI中葉綠素含量是唯一測定的其他表型).
CA和KS結果概述cspB-KS生境(site)田間效率結果概述1.田間設計、位置均勻性和種植及取樣的執(zhí)行都符合能產生信息數據集合的高質量的試驗。
2.限水處理以一種對所有測定表型，特別是LER、葉綠素和光合作用率，產生處理影響的方式執(zhí)行。
3.影響營養(yǎng)和再生的表型的處理在統計學滿足是實數的且滿足觀察到統計顯著水平的轉基因介導的改良之用。
4.在包含轉基因的植物中，一個或多個事件在統計學上改善了LER、葉綠素、光合作用率、氣孔導度、葉溫、花粉釋放日、抽穗日、開花期抽絲間隔、穗/盆、種子/穗、種子/植物、莢重和估計產量。
5.在干處理中，對于LER、穗/盆、種子/植物、莢重和估計產量，在濕處理中，對于LER觀察到構建體水平統計學改善p＜0.10。
表20.
cspB-CS生境田間效率結果概述(字形變化)
1.田間設計、位置均勻性和種植及取樣的執(zhí)行都符合能產生信息數據集合的高質量的試驗。
2.限水處理以一種對所有測定的營養(yǎng)表型，特別是LER、葉綠素和光合作用率，產生處理影響，但不對所有的再生表型產生處理影響的方式執(zhí)行。
3.影響目的表型(營養(yǎng))的處理在統計學上滿足是實數的且滿足觀察到統計顯著水平的轉基因介導的改良之用。
4.在包含轉基因的植物中，一個或多個事件在統計學上改善了LER、葉綠素、光合作用率、氣孔導度、葉溫、花粉釋放日、抽穗日、開花期抽絲間隔、穗/盆、種子/穗、平均穗長和種子質量/穗。
5.在干處理中，對于LER、葉溫和花粉釋放日，在濕處理中，對于ASI觀察到構建體水平統計學改善。
表21.
這些事件中的許多業(yè)已隨后被測試用于改善冷發(fā)芽效率和幼苗在冷環(huán)境下生長，但不被證實是有效的。因此，這些由啟動子驅動的基因不太可能在玉米中起改善冷發(fā)芽或幼苗在冷環(huán)境下生長的作用，但不同的啟動子(propomters)驅動相同的基因，或不同的冷休克蛋白可以在玉米中起改善這些表型的作用。
序列表<110>Monsanto Technology<120>用于增強植物非生物肋迫耐受性的方法及其組合物<130>Docket number(38-21)51768C<160>95<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>70<212>PRT<213>大腸桿菌<300>
<301>Goldstein，等<302>大腸桿菌主要冷休克蛋白<303>Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)<304>87<305>1<306>283-287<307>1990-01-01<308>M30139<309>1993-10-20<313>(1)..(70)<400>1Met Ser Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu65 70<210>2<211>67<212>PRT<213>枯草桿菌<300>
<308>X59715<309>1996-03-29<313>(1)..(67)<400>2Met Leu Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala65<210>3<211>28<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>Prosite基序PS00352<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa＝6-7個氨基酸(任意氨基酸)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>Xaa＝任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa＝任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>Xaa＝任意氨基酸<400>3Phe Tyr Gly Phe Ile Xaa Asp Glu Arg Leu Ile Val Met Phe Xaa His1 5 10 15Xaa Ser Thr Lys Arg Xaa Leu Ile Val Met Phe Tyr20 25<210>4<211>545<212>DNA<213>大豆<220>
<221>CDS<222>(61)..(354)
<400>4attcggctcg aggaccttag aaagagaagg aaaaaaaaaa cttgtgtttc ttgggaagcc 60atg agc acc acc gag agt caa aga tat aag ggc aca gtg aaa tgg ttc108Met Ser Thr Thr Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe1 5 10 15aac gag gag aag ggt ttc ggt ttc ata act ccc gaa gat ggt ggc tct156Asn Glu Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser20 25 30gat ctc ttc gtt cac tac agt gcg atc caa acc gac ggc ggc ttc cgc204Asp Leu Phe Val His Tyr Ser Ala Ile Gln Thr Asp Gly Gly Phe Arg35 40 45acc ttg tcg gag ggt cag tca gta gag ttc ctc gtc act cag gac gac252Thr Leu Ser Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe Leu Val Thr Gln Asp Asp50 55 60agc ggg cga gcc gcg gcc gtc aac gtg acg acc acc acg gtt aaa tct300Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Asn Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Ser65 70 75 80agt gac agc ggt aac ggg gaa aac tct ggt ggt gat gct gcc aat gtt348Ser Asp Ser Gly Asn Gly Glu Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Asn Val85 90 95gag aaa taagtgagaa tgaattattg gagtttcctg aattgcgagt atgatattta 404Glu Lystattgatagt tggacaatat actagtccat tggtatttta tattttatta tattatctct 464ggttattggc atttggttcc aaacttgtaa tacatttatc atgtgtttaa cgtggttatg 524tagtaagttg ttggatgtgt c545<210>5<211>98<212>PRT<213>大豆<400>5
Met Ser Thr Thr Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe1 5 10 15Asn Glu Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser20 25 30Asp Leu Phe Val His Tyr Ser Ala Ile Gln Thr Asp Gly Gly Phe Arg35 40 45Thr Leu Ser Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe Leu Val Thr Gln Asp Asp50 55 60Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Asn Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Ser65 70 75 80Ser Asp Ser Gly Asn Gly Glu Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Asn Val85 90 95Glu Lys<210>6<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列稍類似于大腸桿菌CspA<220>
<221>CDS<222>(1)..(252)<400>6atg gcc ggt aaa atg act ggt atc gta aaa tgg ttc aac gct gac aaa48
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15ggc ttc ggc ttc atc act cct gac gat ggc tct aaa gat gtg ttc gta 96Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30cac ttc tct gct atc cag aac gat ggt tac aaa tct ctg gac gaa ggt144His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45cag aaa gtg tcc ttc acc atc gaa agc ggc gct aaa ggc ccg gca gct192Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60ggt aac gta acc agc ctg aat tct cga gcg att aca agg atg atg ata240Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile65 70 75 80agt aag tcg acc tag255Ser Lys Ser Thr<210>7<211>84<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建體<400>7Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile65 70 75 80Ser Lys Ser Thr<210>8<211>246<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>稍類似于枯草桿菌CspB<220>
<221>CDS<222>(1)..(243)<400>8atg gta gaa ggt aaa gta aaa tgg ttc aac tct gaa aaa ggt ttc gga48Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc atc gaa gta gaa ggt caa gac gat gta ttc gtt cat ttc tct gct96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30att caa ggc gaa ggc ttc aaa act tta gaa gaa ggc caa gct gtt tct144Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45ttt gaa atc gtt gaa gga aac cgc gga cca caa gct gct aac gtt act192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60
aaa gaa gcg aat tct cga gcg att aca agg atg atg ata agt aag tcg240Lys Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile Ser Lys Ser65 70 75 80acc tag246Thr<210>9<211>81<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建體<400>9Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile Ser Lys Ser65 70 75 80Thr<210>10
<211>877<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(528)..(743)<300>
<308>L28429<309>1994-05-04<313>(1)..(877)<400>10agctttaata tagctcatga aaggtaaaca ttggcagctg aagggccacg cagaccattt 60atccggcaaa attccacgcg taatccggtg gtaatttctt ctgcatcgcg gagattgagc 120gctgaaacat gaagctggac atcgatacga ccatcggatg gggtgataag acccttgccg 180cttttgccgt caaaggtttt gacaattcct gtcattttac gggacaaaaa aattccttaa 240tactgataac ttggcgcact atacacacgt tcctgaagaa agctatagtt ttttgatggg 300gttgaagatg gctggatgtc taaaataaac attgcttcat atgttcaact atgcgttaat 360gattgcgtcg gtttgaagaa cagacgatat acgaagtagt ttactaaagc agttctcatt 420tcaggtgtta ttcacttatt ccttctttga gtctctccaa ttaagtacga agtcgtttct 480gttatgcaaa ccatttatgc cgaaaggctc aagttaagga atgtaga atg tca aat536Met Ser Asn1aaa atg act ggt tta gta aaa tgg ttt aac gct gat aaa ggt ttc ggc584Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly5 10 15ttt att tct cct gtt gat ggt agt aaa gat gtg ttt gtg cat ttt tct632Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Ser20 25 30 35gcg att cag aat gat aat tat cga acc tta ttt gaa ggt caa aag gtt680
Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly Gln Lys Val40 45 50acc ttc tct ata gag agt ggt gct aaa ggt cct gca gca gca aat gtc728Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val55 60 65atc att act gat taa aattcatcgc tcgtctgtat acgataacga agaaggctga783Ile Ile Thr Asp70tgcctgagta gagatacgga cagagtagtg aatattggat ctctttaata aaaagtaagg 843aggtccaata catgaaacaa tggctagcat attt 877<210>11<211>71<212>PRT<213>大腸桿菌<400>11Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Ala Asn Val Ile Ile Thr Asp65 70<210>12
<211>1601<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(243)..(452)<300>
<308>D28496<309>1994-02-05<313>(1)..(1601)<400>12gatcgagaca tgtttaaaaa tggcttgcca taattaacgt tgtatgtgat aacagatttc 60gggttaaacg aggtacagtt ctgtttatgt gtggcatttt cagtaaagaa gtcctgagta 120aacacgttga cgttgaatac cgcttctctg ccgagcctta tattggtgcc tcatgcagta 180atgtgtcagt tttatctatg ttatgcctgc gggcgaagaa aacaatctaa ggaatttttc 240aa atg gca aag att aaa ggt cag gtt aag tgg ttc aac gag tct aaa 287Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys1 5 10 15ggt ttt ggc ttc att act ccg gct gat ggc agc aaa gat gtg ttc gta335Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30cac ttc tcc gct atc cag ggt aat ggc ttc aaa act ctg gct gaa ggt383His Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly35 40 45cag aac gtt gag ttc gaa att cag gac ggc cag aaa ggt ccg gca gct431Gln Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60gtt aac gta aca gct atc tga tcgaatccac tgatctgaag tgtgaatacg 482Val Asn Val Thr Ala Ile65cttcaatctc gctataaagc ctcgtcgaat gcgaggcttt ttactatgct ttatcttcgc 542
tcctggcgtt cggatatttg cccgccgcgt gattcgcgtt acacttgcgg cctttagtat 602cctgccggag ttgtcatgtc tttttcctgt ccactttgcc atcagcctct ttcgcgtgaa 662aaaaacagct atatctgtcc ccagcgacat cagtttgata tggcgaaaga agggtatgtc 722aatctgctgc ccgttcagca taaacggtct cgtgatccgg gcgacagcgc ggaaatgatg 782caagcacgcc gcgcattctt agatgccgga cattatcagc cgctgcgtga tgcaattgtc 842gcccaactga gggaacggct tgatgataag gccacggcgg tgctggatat tggctgtggt 902gaagggtatt acacacacgc atttgccgat gcgttgcccg aaatcaccac gtttggtctg 962gatgtttcga aggtagcgat aaaagcggcg gcgaaacgct atccgcaggt cactttttgt 1022gtcgcttcca gccaccgttt gccgttttcc gataccagta tggacgccat aatacgtatt 1082tacgcgccgt gtaaagcaga agaattagca cgagtagtga agcccggcgg ctgggtcatt 1142actgccacgc cgggaccgcg acatttgatg gagctgaagg ggctgattta caatgaagta 1202catcttcatg cacctcatgc agaacaactg gaaggtttta cattacagca gagtgcggag 1262ttgtgttatc cgatgcgtct tcgcggtgat gaagccgtcg cattattgca gatgacgccg 1322tttgcctggc gtgcgaagcc agaagtctgg caaacactgg cagcaaaaga agtgttcgac 1382tgccagacgg actttaatat tcacctctgg cagcgttctt attaaccgtg gaagtgcgtc 1442cagaggatct ggacgccgat gccgatcagc accagcccgc cgagaatttc cgcttttttc 1502ccaataattg agccgataaa gcgaccaacc atcatcccta atgttgacat aatcaaggtt 1562gcacaaccaa tggccaatgc ggtcgcgata atgttgacc 1601<210>13<211>69<212>PRT<213>大腸桿菌<400>13
Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys Gly1 5 10 15Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His20 25 30Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly Gln35 40 45Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala Val50 55 60Asn Val Thr Ala Ile65<210>14<211>351<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(74)..(298)<300>
<308>P24245<309>1992-03-01<313>(1)..(351)<400>14ttttgaacag ccccctctct gaccccggtt tattccatct tacttgtata agatttgcga 60aggatgtcga agc atg gaa aag ggt act gtt aag tgg ttc aac aat gcc 109Met Glu Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asn Ala1 5 10aaa ggg ttt ggt ttc atc tgc cct gaa ggc ggc ggc gaa gat att ttc157
Lys Gly Phe Gly Phe Ile Cys Pro Glu Gly Gly Gly Glu Asp Ile Phe15 20 25gct cat tat tcc acc att cag atg gat ggt tac aga acg cta aaa gct205Ala His Tyr Ser Thr Ile Gln Met Asp Gly Tyr Arg Thr Leu Lys Ala30 35 40gga caa tcc gtt cag ttt gat gtc cac cag ggg cca aaa ggc aat cac253Gly Gln Ser Val Gln Phe Asp Val His Gln Gly Pro Lys Gly Asn His45 50 55 60gcc agt gtt att gtg ccc gtc gaa gta gaa gcg gca gtc gca tag298Ala Ser Val Ile Val Pro Val Glu Val Glu Ala Ala Val Ala65 70ctcttctgtc tcattgtgta catcctaaag gcaaaatgcc agcccgatcg gct 351<210>15<211>74<212>PRT<213>大腸桿菌<400>15Met Glu Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asn Ala Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Cys Pro Glu Gly Gly Gly Glu Asp Ile Phe Ala His Tyr Ser20 25 30Thr Ile Gln Met Asp Gly Tyr Arg Thr Leu Lys Ala Gly Gln Ser Val35 40 45Gln Phe Asp Val His Gln Gly Pro Lys Gly Asn His Ala Ser Val Ile50 55 60Val Pro Val Glu Val Glu Ala Ala Val Ala65 70
<210>16<211>301<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(62)..(259)<300>
<308>P39819<309>1995-02-01<313>(1)..(301)<400>16tcaggaacgt gtgtatagtg cgccaagtta tcagtattaa ggaatttttt tgtcccgtaa 60a atg aca gga att gtc aaa acc ttt gac ggc aaa agc ggc aag ggt ctt 109Met Thr Gly Ile Val Lys Thr Phe Asp Gly Lys Ser Gly Lys Gly Leu1 5 10 15atc acc cca tcc gat ggt cgt atc gat gtc cag ctt cat gtt tca gcg157Ile Thr Pro Ser Asp Gly Arg Ile Asp Val Gln Leu His Val Ser Ala20 25 30ctc aat ctc cgc gat gca gaa gaa att acc acc gga tta cgc gtg gaa205Leu Asn Leu Arg Asp Ala Glu Glu Ile Thr Thr Gly Leu Arg Val Glu35 40 45ttt tgc cgg ata aat ggt ctg cgt ggc cct tca gct gcc aat gtt tac253Phe Cys Arg Ile Asn Gly Leu Arg Gly Pro Ser Ala Ala Asn Val Tyr50 55 60ctt tca tgagctatat taaagcttta atttcaggcc ccatcggatc ac 301Leu Ser65<210>17<211>66<212>PRT<213>大腸桿菌
<400>17Met Thr Gly Ile Val Lys Thr Phe Asp Gly Lys Ser Gly Lys Gly Leu1 5 10 15Ile Thr Pro Ser Asp Gly Arg Ile Asp Val Gln Leu His Val Ser Ala20 25 30Leu Asn Leu Arg Asp Ala Glu Glu Ile Thr Thr Gly Leu Arg Val Glu35 40 45Phe Cys Arg Ile Asn Gly Leu Arg Gly Pro Ser Ala Ala Asn Val Tyr50 55 60Leu Ser65<210>18<211>994<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(560)..(772)<300>
<308>D63344<309>1999-02-13<313>(1)..(994)<400>18aaatgtatga tgtgactatt cactatccaa taaaccagtc agcttaaaca agcacgtcat 60attaagagag ataaacattt gccgctgttg gtcctcgcag gccatttacg cggcaaaatt120ccacacgtaa tcctggtata agcacttctg cgtcgcgggg agtgaatgcg gaaatatgga180
cctgaacttc tttacgaccg tcggagggga taatgaatcc tttgccgctt ttgcgatcaa240aggttttgac aattcctgtc attttacggg acaaacaaat tccttactga aaatactgcg300ctgcactata cggggttaat aaaataaagc cagcgatatt taagaccgcc ggacggctaa360aataaaattt gcttaatctc aattatcatg cgttaatagc tgcgtcggtt tgaaagacag420acagcataca aagtagttta ctaaagcagt tctcattatc aggcattatc cccttctttt480gagtctctct cctgaacact aagtagtttc tgtattaaag ccctgtttgc cgaaaggccc540aaaatgaagg aagtaaaat atg tct aat aaa atg act ggt tta gta aaa tgg 592Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp1 5 10ttt aac gca gat aaa ggt ttt ggc ttt atc act cct gat gat ggc agc 640Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser15 20 25aaa gac gtt ttc gtc cat ttc acc gcc atc cag agc aat gaa ttc cgc 688Lys Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala Ile Gln Ser Asn Glu Phe Arg30 35 40acg ctg aac gaa aat cag aaa gtt gaa ttt tct att gag cag ggg caa 736Thr Leu Asn Glu Asn Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile Glu Gln Gly Gln45 50 55cgt ggc ccc gcg gca gcg aac gtt gtt acg ctc taa ggttgccatt 782Arg Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val Val Thr Leu60 65 70attactcaac atctccattt ccgctgtcca tgttgtcatg gttcacagta ccgcacatcg842gcattcgatg tgacggagcg aaaccctttg gcgctaagtg tattttttgt aaatcgacga902tgatcacctt tgataacgtc gcgctgcaaa tacgcactga ccatgcgcgc tggatttcac962aaataatatc aggctcctcg tggagctttt tt 994<210>19<211>70
<212>PRT<213>大腸桿菌<400>19Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Thr Ala Ile Gln Ser Asn Glu Phe Arg Thr Leu Asn Glu Asn35 40 45Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile Glu Gln Gly Gln Arg Gly Pro Ala Ala50 55 60Ala Asn Val Val Thr Leu65 70<210>20<211>351<212>DNA<213>根癌農桿菌<220>
<221>CDS<222>(125)..(334)<300>
<308>AAK90623<309>2001-12-18<313>(1)..(351)<400>20catcgaccat tgcttgtgac gtcgttaccg gaacctcgtg ttccccgtcg gatttcctct 60caaaaatcga tctaatcccg caaggtatcg cgggaaccac aacgattcta aaaaggagat120
cgtt atg aac act ggt act gta aag tgg ttt aac gcc acc aag ggc ttc 169Met Asn Thr Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Thr Lys Gly Phe1 5 10 15ggc ttc att cag cct gac aac ggc ggc acg gac gtt ttc gtt cac att217Gly Phe Ile Gln Pro Asp Asn Gly Gly Thr Asp Val Phe Val His Ile20 25 30tct gct gtt gag cgc gct ggc atg cgt tcg ctg aac gac ggc cag aag265Ser Ala Val Glu Arg Ala Gly Met Arg Ser Leu Asn Asp Gly Gln Lys35 40 45atc agc tat gag atc gtt cag gac cgc cgg tcc gga aaa agc tct gcc313Ile Ser Tyr Glu Ile Val Gln Asp Arg Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ala50 55 60gat aac ctt cag gca gct tga tattcgtcat tttggcc 351Asp Asn Leu Gln Ala Ala65<210>21<211>69<212>PRT<213>根癌農桿菌<400>21Met Asn Thr Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Thr Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Gln Pro Asp Asn Gly Gly Thr Asp Val Phe Val His Ile Ser20 25 30Ala Val Glu Arg Ala Gly Met Arg Ser Leu Asn Asp Gly Gln Lys Ile35 40 45Ser Tyr Glu Ile Val Gln Asp Arg Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ala Asp50 55 60
Asn Leu Gln Ala Ala65<210>22<211>301<212>DNA<213>根癌農桿菌<220>
<221>CDS<222>(59)..(262)<300>
<308>AAK89225<309>2001-12-18<313>(1)..(301)<400>22cgtaccgatc aatgatcggt attgcgttga ggtgcactca gcaatcaacg aggacaag 58atg gca act ggc act gta aaa ttc ttc gct cag gac aag ggc ttt ggc106Met Ala Thr Gly Thr Val Lys Phe Phe Ala Gln Asp Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc att acc cct gac aat ggc ggt cct gac gta ttc gtt cac atc tcg154Phe Ile Thr Pro Asp Asn Gly Gly Pro Asp Val Phe Val His Ile Ser20 25 30gca gtc ggt ttc ggc ggc tct ctt cag gat ggt cag aag gtg agc tac202Ala Val Gly Phe Gly Gly Ser Leu Gln Asp Gly Gln Lys Val Ser Tyr35 40 45gag ttg gga caa gac cgc aag acc ggt aaa tcg aaa gcc gag aac gtc250Glu Leu Gly Gln Asp Arg Lys Thr Gly Lys Ser Lys Ala Glu Asn Val50 55 60act ctc ctt tga tggcagcgcc gcggcccaac gcacgatagc gcgtgagca 301Thr Leu Leu65
<210>23<211>67<212>PRT<213>根癌農桿菌<400>23Met Ala Thr Gly Thr Val Lys Phe Phe Ala Gln Asp Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Thr Pro Asp Asn Gly Gly Pro Asp Val Phe Val His Ile Ser20 25 30Ala Val Gly Phe Gly Gly Ser Leu Gln Asp Gly Gln Lys Val Ser Tyr35 40 45Glu Leu Gly Gln Asp Arg Lys Thr Gly Lys Ser Lys Ala Glu Asn Val50 55 60Thr Leu Leu65<210>24<211>251<212>DNA<213>根癌農桿菌<220>
<221>CDS<222>(27)..(242)<300>
<308>AAK87945<309>2001-12-18<313>(1)..(251)<400>24cgggcagagc gaaaaggacc tgatgc atg gcc gaa act ggc acc gta aaa ttc53
Met Ala Glu Thr Gly Thr Val Lys Phe1 5ttt aat acc gac aaa ggc ttc ggc ttc atc aag cca gac aat ggt ggc101Phe Asn Thr Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Lys Pro Asp Asn Gly Gly10 15 20 25gct gat atc ttt gtt cac atc tct gcc gta cag gct tct ggc ctg tcc149Ala Asp Ile Phe Val His Ile Ser Ala Val Gln Ala Ser Gly Leu Ser30 35 40gga ctt tca gaa aat cag aaa gtg agc ttc gac acg gaa ccg gat cgt197Gly Leu Ser Glu Asn Gln Lys Val Ser Phe Asp Thr Glu Pro Asp Arg45 50 55cgc ggc aag ggc ccg aag gca gtc aat ctg cag att gct ggc tga242Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala Val Asn Leu Gln Ile Ala Gly60 65 70ccctaaaac 251<210>25<211>71<212>PRT<213>根癌農桿菌<400>25Met Ala Glu Thr Gly Thr Val Lys Phe Phe Asn Thr Asp Lys Gly Phe1 5 10 15Gly Phe Ile Lys Pro Asp Asn Gly Gly Ala Asp Ile Phe Val His Ile20 25 30Ser Ala Val Gln Ala Ser Gly Leu Ser Gly Leu Ser Glu Asn Gln Lys35 40 45Val Ser Phe Asp Thr Glu Pro Asp Arg Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala50 55 60
Val Asn Leu Gln Ile Ala Gly65 70<210>26<211>651<212>DNA<213>根癌農桿菌<220>
<221>CDS<222>(297)..(605)<300>
<308>AAK87573<309>2001-12-18<313>(1)..(651)<400>26gcgcgtaatc gaggggttgg caggatatgg ctgataggat gtcatcgaaa acgatagtcg 60atgtcgagga cctttcgggc gatgccgtcg acctgaccga aatcaccggc gtcgtgaaat 120ggttcgacgt cgccaagggt ttcggcttca tcgtgcccga taacggtaca caggatgtgc 180tgctgcacgt ctcgtgcctg cgccgcgacg gctaccagac catccttgaa ggcacgcgca 240tcgtcgccct catccagcgg cgcgaccgcg gtttccaggt tttccgcatc ctgtcc atg 299Met1gat cag tcg acc gcc gtt cac ccg tcg cag ctg ccg ccg gtg cgc acc347Asp Gln Ser Thr Ala Val His Pro Ser Gln Leu Pro Pro Val Arg Thr5 10 15cat gtg cag gtg acg ccg cat agc ggg ctt gag cgt gcc atc gtc aag395His Val Gln Val Thr Pro His Ser Gly Leu Glu Arg Ala Ile Val Lys20 25 30tgg ttc aac cgc acc aag ggt ttc ggt ttc ctg acg cgt ggc gaa gga443Trp Phe Asn Arg Thr Lys Gly Phe Gly Phe Leu Thr Arg Gly Glu Gly35 40 45
acg gaa gat att ttc gtg cat atg gaa acg ctg cgc cgt ttc ggc ctg491Thr Glu Asp Ile Phe Val His Met Glu Thr Leu Arg Arg Phe Gly Leu50 55 60 65acg gaa ctg cgc ccc ggc cag gtg gtg ctc gtg cgt tac ggc gat ggc539Thr Glu Leu Arg Pro Gly Gln Val Val Leu Val Arg Tyr Gly Asp Gly70 75 80gac aag ggc ctg atg gca gcg gaa atc cat ccc gat aac ccg gtt tcc587Asp Lys Gly Leu Met Ala Ala Glu Ile His Pro Asp Asn Pro Val Ser85 90 95atc ggg atg tcg cat tga tgtccggcct gcgtcccatg ctgaaaggcg 635Ile Gly Met Ser His100ccgtcatggc gcttgt 651<210>27<211>102<212>PRT<213>根癌農桿菌<400>27Met Asp Gln Ser Thr Ala Val His Pro Ser Gln Leu Pro Pro Val Arg1 5 10 15Thr His Val Gln Val Thr Pro His Ser Gly Leu Glu Arg Ala Ile Val20 25 30Lys Trp Phe Asn Arg Thr Lys Gly Phe Gly Phe Leu Thr Arg Gly Glu35 40 45Gly Thr Glu Asp Ile Phe Val His Met Glu Thr Leu Arg Arg Phe Gly50 55 60Leu Thr Glu Leu Arg Pro Gly Gln Val Val Leu Val Arg Tyr Gly Asp
65 70 75 80Gly Asp Lys Gly Leu Met Ala Ala Glu Ile His Pro Asp Asn Pro Val85 90 95Ser Ile Gly Met Ser His100<210>28<211>301<212>DNA<213>集胞藻屬PCC6803<220>
<221>CDS<222>(22)..(273)<400>28ctctggtttt ggagctaatt t atg tcc att tat gtc ggg aac ctt tct tac51Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr1 5 10caa gcc acc gaa gat gac gtt ttg act gtc ttc tcc gag tat ggc act99Gln Ala Thr Glu Asp Asp Val Leu Thr Val Phe Ser Glu Tyr Gly Thr15 20 25gtt aag cgg gtt caa ctt ccc act gat cgg gag acc ggt cgt atg cgg147Val Lys Arg Val Gln Leu Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg30 35 40ggt ttt ggt ttc gtt gaa atg tct tcc gat aag gaa gaa gat gcc gcc195Gly Phe Gly Phe Val Glu Met Ser Ser Asp Lys Glu Glu Asp Ala Ala45 50 55att gaa gct ctg gat gga gcc gaa tgg atg ggg cgg gat ctc aaa gtt243Ile Glu Ala Leu Asp Gly Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val60 65 70aat aaa gca aga ccg aga acc cct cgt taa gtttttgcct aattacctga 293Asn Lys Ala Arg Pro Arg Thr Pro Arg
75 80atttaaga 301<210>29<211>83<212>PRT<213>集胞藻屬PCC6803<400>29Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr Gln Ala Thr Glu Asp Asp1 5 10 15Val Leu Thr Val Phe Ser Glu Tyr Gly Thr Val Lys Arg Val Gln Leu20 25 30Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu35 40 45Met Ser Ser Asp Lys Glu Glu Asp Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly50 55 60Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val Asn Lys Ala Arg Pro Arg65 70 75 80Thr Pro Arg<210>30<211>401<212>DNA<213>集胞藻屬PCC6803<220>
<221>CDS
<222>(91)..(396)<400>30tctagtatta acggtttttc gcgtttttcc attgacaggc atttctccga aatcaccctc 60tacatatccc tcagtttttg gagaaaatcc atg tca att tat gta ggc aac ctg 114Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu1 5tcc tat gac gtt tca gaa gcc gat tta acc gcg gtt ttt gct gaa tac162Ser Tyr Asp Val Ser Glu Ala Asp Leu Thr Ala Val Phe Ala Glu Tyr10 15 20ggt tcc gta aag cgg gtt cag ctc ccc acc gac cgg gaa act ggt cgc210Gly Ser Val Lys Arg Val Gln Leu Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg25 30 35 40atg cgg ggc ttc ggt ttt gtc gag cta gaa gct gac gcc gaa gaa acg258Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu Leu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Thr45 50 55gct gcc att gaa gcc cta gac ggt gca gaa tgg atg ggt cgt gac ctt306Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu60 65 70aaa gtt aac aaa gcc aag ccc cgg gaa aat cgc agt ggc ggt ggt tcc354Lys Val Asn Lys Ala Lys Pro Arg Glu Asn Arg Ser Gly Gly Gly Ser75 80 85ttt ggt ggc ggt cgt aaa agc tat ggt ggt agc cgc tac tag ggctt 401Phe Gly Gly Gly Arg Lys Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Tyr90 95 100<210>31<211>101<212>PRT<213>集胞藻屬PCC6803<400>31Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr Asp Val Ser Glu Ala Asp1 5 10 15
Leu Thr Ala Val Phe Ala Glu Tyr Gly Ser Val Lys Arg Val Gln Leu20 25 30Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu35 40 45Leu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Thr Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly50 55 60Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val Asn Lys Ala Lys Pro Arg65 70 75 80Glu Asn Arg Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Gly Gly Arg Lys Ser Tyr85 90 95Gly Gly Ser Arg Tyr100<210>32<211>951<212>DNA<213>擬南芥<220>
<221>CDS<222>(46)..(654)<400>32aaagatttag agaaaaaagt gagttattaa gagattccaa tcaaa atg agc gga gac57Met Ser Gly Asp1aac ggc ggt ggt gag agg cgc aaa ggc tcc gtc aag tgg ttt gat acc 105Asn Gly Gly Gly Glu Arg Arg Lys Gly Ser Val Lys Trp Phe Asp Thr5 10 15 20
cag aag ggt ttc ggc ttc atc act cct gac gac ggt ggc gac gat ctc153Gln Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Gly Asp Asp Leu25 30 35ttc gtt cac cag tcc tcc atc aga tct gag ggt ttc cgt agc ctc gct201Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala40 45 50gcc gaa gaa gcc gta gag ttc gag gtt gag atc gac aac aac aac cgt249Ala Glu Glu Ala Val Glu Phe Glu Val Glu Ile Asp Asn Asn Asn Arg55 60 65ccc aag gcc atc gat gtt tct gga ccc gac ggc gct ccc gtc caa gga297Pro Lys Ala Ile Asp Val Ser Gly Pro Asp Gly Ala Pro Val Gln Gly70 75 80aac agc ggt ggt ggt tca tct ggc gga cgc ggc ggt ttc ggt gga gga345Asn Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly85 90 95 100aga gga ggt gga cgc gga tct gga ggt gga tac ggc ggt ggc ggt ggt393Arg Gly Gly Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly105 110 115gga tac gga gga aga gga ggt ggt ggt cga gga ggc agc gac tgc tac441Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Ser Asp Cys Tyr120 125 130aag tgt ggt gag ccc ggt cac atg gcg aga gac tgt tct gaa ggc ggt489Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Ser Glu Gly Gly135 140 145gga ggt tac gga gga ggc ggc ggt ggc tac gga ggt gga ggc gga tac537Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr150 155 160ggc gga gga ggt ggt ggt tac gga ggt ggt ggc cgt gga ggt ggt ggc585Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly165 170 175 180ggc ggg gga agc tgc tac agc tgt ggc gag tcg gga cat ttc gcc agg633Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala Arg185 190 195
gat tgc acc agc ggt gga cgt taaaaccaac gccggttacg cggtggagaa684Asp Cys Thr Ser Gly Gly Arg200gagtgagttg gttatctcac aagtgatcgg ttctttctcc cgccgccttc tatctctcta 744ttatccactt tttgcttatt atgatggatc tctatctttg ttagttggtt ttttcttgat 804ggtttcggat taggactctt cttttggttt tgctacttat ggttggtttt atttctggta 864cttgtgatat gggtgaaatg ctctacttgt tgctctgttt caagtgttca taatatgcga 924acaaatattc tgggttttgt ttcagtc 951<210>33<211>203<212>PRT<213>擬南芥<400>33Met Ser Gly Asp Asn Gly Gly Gly Glu Arg Arg Lys Gly Ser Val Lys1 5 10 15Trp Phe Asp Thr Gln Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly20 25 30Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly Phe35 40 45Arg Ser Leu Ala Ala Glu Glu Ala Val Glu Phe Glu Val Glu Ile Asp50 55 60Asn Asn Asn Arg Pro Lys Ala Ile Asp Val Ser Gly Pro Asp Gly Ala65 70 75 80Pro Val Gln Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Gly Gly85 90 95
Phe Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly100 105 110Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly115 120 125Ser Asp Cys Tyr Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys130 135 140Ser Glu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly145 150 155 160Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg165 170 175Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly180 185 190His Phe Ala Arg Asp Cys Thr Ser Gly Gly Arg195 200<210>34<211>950<212>DNA<213>陸地棉<220>
<221>CDS<222>(58)..(618)<400>34cccacgcgtc cggagactta tttactttag gaattttcta gaaccttctc gaaggca 57atg gct gag gcg acc agc acc gag aga tcc act ggc aca gtc aaa tgg105
Met Ala Glu Ala Thr Ser Thr Glu Arg Ser Thr Gly Thr Val Lys Trp1 5 10 15ttc agc gcc cag aaa tgt ttt ggt ttc ata gct ccc gac gac gga ggc153Phe Ser Ala Gln Lys Cys Phe Gly Phe Ile Ala Pro Asp Asp Gly Gly20 25 30gac gac ctt ttc gtc cac caa acc tct att ctt tcc caa ggc ttt cgt201Asp Asp Leu Phe Val His Gln Thr Ser Ile Leu Ser Gln Gly Phe Arg35 40 45aca ctc tcc gat aac caa ccc gtc gag ttc ttc gtt gat gtc ggt gaa249Thr Leu Ser Asp Asn Gln Pro Val Glu Phe Phe Val Asp Val Gly Glu50 55 60gat ggc cga gct aag gcc gtt gat gta act cct atg cct cga cct cgc297Asp Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Pro Met Pro Arg Pro Arg65 70 75 80cgt cct tcc cgc ggc ggt gga aga gga gga tat ttt ggc ggc aga ggt345Arg Pro Ser Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Gly Arg Gly85 90 95aga gga ggt ggt ggt tac agg aga gga ggt tat ggt ggt ggc ggt ggc393Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly100 105 110ggt ggc gga ggt agt ggc gct tgt tat aat tgt ggg agg acg ggg cat441Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Cys Tyr Asn Cys Gly Arg Thr Gly His115 120 125ata gcc agg gat tgt tat caa ggt ggt gga agt gga agt acg aga tac489Ile Ala Arg Asp Cys Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Ser Thr Arg Tyr130 135 140agt ggc ggc cgt gga gat ggt ggt gga aat aga aga tac ggt ggc gat537Ser Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Asn Arg Arg Tyr Gly Gly Asp145 150 155 160agc ggt gat gga cga gga gct ggg gga cga tgt ttt aat tgt gga gat585Ser Gly Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gly Arg Cys Phe Asn Cys Gly Asp165 170 175gaa ggc cat ttt gca agg gat tgc cct aac aaa taattcagaa aacaaaaccg 638
Glu Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro Asn Lys180 185gacatttcct ataatatttt gtgagtataa gtttttcttt tacggtgttt tggaaagggg 698tttatcagca aaagaagaag aaaccggaaa gttgtctatt ctttccgatc aggcttactt 758ttcccgattc cgattgatct ggtaacatct ttaaaaaaaa ggtccattgt tttgtataat 818gtgttgtaat tgttgttatt ctcttaattc ttatcgattc ttctttcttt aatcctctat 878tcttagtctt tgcattgaca gtatgaacgg gcaatcattt gtcttccttg aagcagattt 938cttttatttt tc 950<210>35<211>187<212>PRT<213>陸地棉<400>35Met Ala Glu Ala Thr Ser Thr Glu Arg Ser Thr Gly Thr Val Lys Trp1 5 10 15Phe Ser Ala Gln Lys Cys Phe Gly Phe Ile Ala Pro Asp Asp Gly Gly20 25 30Asp Asp Leu Phe Val His Gln Thr Ser Ile Leu Ser Gln Gly Phe Arg35 40 45Thr Leu Ser Asp Asn Gln Pro Val Glu Phe Phe Val Asp Val Gly Glu50 55 60Asp Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Pro Met Pro Arg Pro Arg65 70 75 80Arg Pro Ser Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Gly Arg Gly
85 90 95Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly100 105 110Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Cys Tyr Asn Cys Gly Arg Thr Gly His115 120 125Ile Ala Arg Asp Cys Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Ser Thr Arg Tyr130 135 140Ser Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Asn Arg Arg Tyr Gly Gly Asp145 150 155 160Ser Gly Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gly Arg Cys Phe Asn Cys Gly Asp165 170 175Glu Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro Asn Lys180 185<210>36<211>516<212>DNA<213>陸地棉<220>
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<221>misc_feature<222>(388)..(388)<223>n＝A，G，T，或C<400>36cggacgcgtg ggttgggatt ttaaagatgg gtgagaatag g atg acc ggc aag gtg56
Met Thr Gly Lys Val1 5aag tgg ttc gat gac caa aag ggt tat ggc ttc ata tcc cct gac gac104Lys Trp Phe Asp Asp Gln Lys Gly Tyr Gly Phe Ile Ser Pro Asp Asp10 15 20ggc ggc gac gat ttg ttt gtt cac cag tct tcc atc cgt tcc gag ggt152Gly Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly25 30 35ttc cgt agc ctt gct gat ggt gaa gag gtc gag tac gtt gtc gag tct200Phe Arg Ser Leu Ala Asp Gly Glu Glu Val Glu Tyr Val Val Glu Ser40 45 50tct gaa ggt cgc ccc aag gct gtt gag gtc act ggc ccc aac ggc aac248Ser Glu Gly Arg Pro Lys Ala Val Glu Val Thr Gly Pro Asn Gly Asn55 60 65cct gtt cgt gga tca tct aga tcc gga cgc ggc ggc ggc ggt ggt ggc296Pro Val Arg Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly70 75 80 85ggt tat ggc ggt gga tcc ggt gga tat ggt gga ggg gga agg aga ggc344Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Arg Gly90 95 100ggt tat ggt gga gga att gga ggg gga ttt tag ttgcaaaatg ngcatgctta 397Gly Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Phe105 110aaaatattat aagttgtaag cgtgcatgct aatgcagagt gtggttgact atgacgtatc 457atactgccat actaattaat attattgagt aaaataaaaa acaatgcttt cttgtttcc 516<210>37<211>111<212>PRT<213>陸地棉<400>37Met Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asp Asp Gln Lys Gly Tyr Gly Phe
1 5 10 15Ile Ser Pro Asp Asp Gly Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser20 25 30Ile Arg Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala Asp Gly Glu Glu Val Glu35 40 45Tyr Val Val Glu Ser Ser Glu Gly Arg Pro Lys Ala Val Glu Val Thr50 55 60Gly Pro Asn Gly Asn Pro Val Arg Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly85 90 95Gly Gly Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Phe100 105 110<210>38<211>792<212>DNA<213>大豆<220>
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15 20 25gaa ctc ttc gtt cac caa tct cag atc aaa tct gac ggt ttc cga agc148Glu Leu Phe Val His Gln Ser Gln Ile Lys Ser Asp Gly Phe Arg Ser30 35 40cta gct gaa gga gag tcc gtt gag ttc gct att gaa tct gaa tct gac196Leu Ala Glu Gly Glu Ser Val Glu Phe Ala Ile Glu Ser Glu Ser Asp45 50 55 60gga cgc gcc aag gct gtt gat gtc act ggc ccc gac ggc gcc agc gtc244Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ala Ser Val65 70 75cag gga acc aga cgc ggc ggt gat ggt ggc cga agc tat ggc ggg gga292Gln Gly Thr Arg Arg Gly Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Gly80 85 90cga gga ggt ggc tac ggt ggt ggt ggg cga ggc ggt ggt ggc ggg gct340Arg Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala95 100 105tgc tac aac tgc ggt gaa tcg gga cat ctg gct agg gac tgc agc caa388Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ser Gly His Leu Ala Arg Asp Cys Ser Gln110 115 120gga ggc ggt gga gac agg tac ggc gga ggc ggt ggt ggt ggt ggc agg436Gly Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg125 130 135 140tat gga ggc ggc ggt ggc ggc agg tac ggt ggt ggt gga gga ggt ggt484Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly145 150 155ggc ggc gga gga agc tgc tac agc tgt gga gag tct ggg cat ttc gcc532Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala160 165 170aga gat tgc cca tca agt gct cgt tgaaattact gttatggtgg tttatgttat 586Arg Asp Cys Pro Ser Ser Ala Arg175 180gcggattgtt ttaagttttt actttaacat gttgtaggga ttttaatggt ttctgtcaaa 646
gctgtggctt cttataagta gatgcgtgag atttttcttt tttttggtta tttaaatgaa 706agtttctgtg ttatcgttac aatctgcaaa caaaatctgt ttggacctac attttgctat 766aatgaattgg atgattgtta tcggtt 792<210>39<211>180<212>PRT<213>大豆<400>39Met Ser Gly Arg Val Ser Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asp Gln Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Glu Glu Leu Phe Val20 25 30His Gln Ser Gln Ile Lys Ser Asp Gly Phe Arg Ser Leu Ala Glu Gly35 40 45Glu Ser Val Glu Phe Ala Ile Glu Ser Glu Ser Asp Gly Arg Ala Lys50 55 60Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ala Ser Val Gln Gly Thr Arg65 70 75 80Arg Gly Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly85 90 95Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Tyr Asn Cys100 105 110Gly Glu Ser Gly His Leu Ala Arg Asp Cys Ser Gln Gly Gly Gly Gly115 120 125
Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly130 135 140Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly145 150 155 160Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro165 170 175Ser Ser Ala Arg180<210>40<211>1245<212>DNA<213>玉米<220>
<221>CDS<222>(75)..(806)<400>40gcgagagacg ggcaggggag aggaaaaaaa aaatctaacc ctagcatccg cagcgctagg 60gttcgggggt tgcg atg gcg gcg gcg gcg aga cag cgg ggg acg gtg aag110Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys1 5 10tgg ttc aac gac acc aag ggc ttc ggg ttc atc tcc ccc gag gac ggc158Trp Phe Asn Asp Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly15 20 25agc gaa gat ctc ttc gtg cac cag tcg tcg atc aag tcg gag ggc ttc206Ser Glu Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe30 35 40cgc tcg ctc gcg gag ggc gag gag gtg gag ttt tcc gtc tcg gag ggt 254
Arg Ser Leu Ala Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly45 50 55 60gac gac ggc cgc act aag gcc gtc gac gtg acc ggc ccc gac gga tcc302Asp Asp Gly Arg Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser65 70 75ttc gtc agg ggc ggc gga ggc gga gga gga ggc ggc ggc ggc tac ggc350Phe Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly80 85 90tcc cgc ggc ggt ggc gga tct ggc ggc ggc ggt cgc agc tac ggt ggt398Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly95 100 105agc tgg ggc ggc ggc cgg aga tcc ggc ggc ggg ggc ggt ccc ggc gcg446Ser Trp Gly Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala110 115 120tgc tac aag tgc ggc gag ccc ggc cac atg gca agg gac tgc cct agc494Cys Tyr Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser125 130 135 140gcc gac ggc gga ggc ggc tac ggc gga ggc ggc tac gga gga gga ggc542Ala Asp Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly145 150 155ggc ggc ggc ggt ggc tgc ttc aag tgt ggc gag cct ggc cac atg gcc590Gly Gly Gly Gly Gly Cys Phe Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala160 165 170agg gac tgc tcc agc ggc ggc ggc ggc tac ggc ggt ggc ggc ggc ggc638Arg Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly175 180 185ggt gga ggc ggc tgc tac aac tgc ggc cag gcc ggc cac atg gcc agg686Gly Gly Gly Gly Cys Tyr Asn Cys Gly Gln Ala Gly His Met Ala Arg190 195 200gac tgc ccc agc ggt ggc ggc ggt ggc gga ggg agg ttc ggc ggc ggc734Asp Cys Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Phe Gly Gly Gly205 210 215 220ggc ggg ggt ggc ggc gac cgc tcc tgc tac aac tgc ggc gag gcc ggc782
Gly Gly Gly Gly Gly Asp Arg Ser Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ala Gly225 230 235cac atc gcc cgc gac tgc ccc acg tgaggtgtgt ccgcgtccgt ccgtccagcc836His Ile Ala Arg Asp Cys Pro Thr240agatcagatc ggatcgctcc accacctgct ggtctgatgg cgccgccccc ttctagatct 896cgcttaaaaa aacacccccc tctcgctgtg tgtcggagta ccgctttagt tttgccgatc 956cgggcacgag tgcccgctgc ctctttcctc tcatgcgtaa gaggaacccg tccgccgttt 1016tcagatttcg ttcggtccgt agaagaactc tcaagttaag ttaagttatc atggtgtgtg 1076cttggtcgtt gttcgtcgtc gtcgttaagg ttttaagaga tgatttggtc ctgtgttgcc 1136gaggggaagt cgaatctgct tttttctttt tttgtggttt gttccaccag actgaggaag 1196gagatgagat gattattctc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1245<210>41<211>244<212>PRT<213>玉米<400>41Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp1 5 10 15Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu20 25 30Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala35 40 45Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg50 55 60
Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly Gly85 90 95Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Gly100 105 110Gly Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala Cys Tyr Lys Cys115 120 125Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser Ala Asp Gly Gly130 135 140Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly145 150 155 160Gly Cys Phe Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Ser165 170 175Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly180 185 190Cys Tyr Asn Cys Gly Gln Ala Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser195 200 205Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly210 215 220Gly Asp Arg Ser Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ala Gly His Ile Ala Arg225 230 235 240
Asp Cys Pro Thr<210>42<211>1409<212>DNA<213>玉米<220>
<221>CDS<222>(27)..(995)<400>42cgcagcgcta gggttcgggg gttgcg atg gcg gcg gcg gcg agg cag cgg ggg53Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly1 5acg gtg aag tgg ttc aac gac acc aag ggc ttc ggg ttc atc tcc ccc101Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro10 15 20 25gag gac ggc agc gag gat ctc ttc gtg cac cag tcg tcg atc aag tcg149Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser30 35 40gag ggc ttc cgc tcg ctc gcg gag ggc gag gag gtg gag ttt tcc gtc197Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val45 50 55tcg gag ggt gac gac ggc cgc act aag gcc gtc gac gtg acc ggc ccc245Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro60 65 70gac gga tcc ttc gtc agg ggc ggc gga ggc gga gga ggc ggc ggc ggc293Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly75 80 85ggc ggc tac ggc tcc cgc ggc ggt ggc gga tct ggc ggc ggc ggt cgc341Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg90 95 100 105
agc tac ggt ggt agc tgg ggc ggc ggc cgg aga tcc gcg ccc gac gcc389Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Gly Gly Arg Arg Ser Ala Pro Asp Ala110 115 120gct ttc ggc tcc gtc ctc tcc ggc acc gcc ggc gac gcc gcc ccc agc437Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ser125 130 135gac cag tgg ttc gtc gac gcg ctc aac gcc ccc gcg ccg cac ccc atc485Asp Gln Trp Phe Val Asp Ala Leu Asn Ala Pro Ala Pro His Pro Ile140 145 150gag cgc gtc cga tcc gag tcc tcc tcg atc gtc tcc gac gtc ccc gac533Glu Arg Val Arg Ser Glu Ser Ser Ser Ile Val Ser Asp Val Pro Asp155 160 165tac ctc ttc agc ctc gac agc ccg tcc gac gac ccc agc ccc ggc ccc581Tyr Leu Phe Ser Leu Asp Ser Pro Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Pro170 175 180 185tcg gcg gct cgc gcc aag tcc gac ccc gcg gag act ccg cac cac cac629Ser Ala Ala Arg Ala Lys Ser Asp Pro Ala Glu Thr Pro His His His190 195 200ggc gac gac gtg ccg cct tcc gct cga cag ata ccg cac gtc gca gga677Gly Asp Asp Val Pro Pro Ser Ala Arg Gln Ile Pro His Val Ala Gly205 210 215gga gcg tca tcg tgg ccc gcc ccg ccg ccg ccg tac atg gcg cag cct725Gly Ala Ser Ser Trp Pro Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Met Ala Gln Pro220 225 230atg tac tac ttc ccc gtg ccg cca ccg gtc cac tac ctc gac cag tct773Met Tyr Tyr Phe Pro Val Pro Pro Pro Val His Tyr Leu Asp Gln Ser235 240 245gcg cag agt ggc tac atg cct cgc ccg atc tac cac att gtc ggt ggc821Ala Gln Ser Gly Tyr Met Pro Arg Pro Ile Tyr His Ile Val Gly Gly250 255 260 265gga gga agc gag gcg cct ggc gga gat ctt cac gcg gcc ggc gga gtc869Gly Gly Ser Glu Ala Pro Gly Gly Asp Leu His Ala Ala Gly Gly Val270 275 280
tac ggc gtc tcg cac cac atg cag ggg ttc ccg ccg atg atg tac gcg 917Tyr Gly Val Ser His His Met Gln Gly Phe Pro Pro Met Met Tyr Ala285 290 295ccg ccg cgc gcg gtc atc tac aac tac aag tcg gag ggg atg cca tcg 965Pro Pro Arg Ala Val Ile Tyr Asn Tyr Lys Ser Glu Gly Met Pro Ser300 305 310ctg cct ccg gaa ggt ggg gca cac tct tcc taggtgcatc ggctacttca 1015Leu Pro Pro Glu Gly Gly Ala His Ser Ser315 320catctctgaa tcctgattat tgttgcagat gcctaagcta aggagttttg cgtggtaatt 1075tttttatcga ttcgtctaga gtcttgttcg ttgttttgta tagatggagg ggttgatggt 1135gatggataga tattaatgca gttttcgtct agtggaaata tattcgtgaa atgtatatca 1195tactaaatag tatagtattt ggtgtgatta attaatattc tagttaatgt aatgtgggat 1255tcatataatc taggtggttc tggtcttata gaaaccattt ttgggcattt tatatttaca 1315taaactggat gttgggtgaa tgttctaagc agtatgtgct gtgttgaacc tcaatcactt 1375atgagtggtt actaaatttg aatttgatgt cttc 1409<210>43<211>323<212>PRT<213>玉米<400>43Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp1 5 10 15Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu20 25 30Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala35 40 45
Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg50 55 60Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly85 90 95Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly100 105 110Gly Gly Arg Arg Ser Ala Pro Asp Ala Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser115 120 125Gly Thr Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ser Asp Gln Trp Phe Val Asp Ala130 135 140Leu Asn Ala Pro Ala Pro His Pro Ile Glu Arg Val Arg Ser Glu Ser145 150 155 160Ser Ser Ile Val Ser Asp Val Pro Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Asp Ser165 170 175Pro Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Pro Ser Ala Ala Arg Ala Lys Ser180 185 190Asp Pro Ala Glu Thr Pro His His His Gly Asp Asp Val Pro Pro Ser195 200 205Ala Arg Gln Ile Pro His Val Ala Gly Gly Ala Ser Ser Trp Pro Ala210 215 220
Pro Pro Pro Pro Tyr Met Ala Gln Pro Met Tyr Tyr Phe Pro Val Pro225 230 235 240Pro Pro Val His Tyr Leu Asp Gln Ser Ala Gln Ser Gly Tyr Met Pro245 250 255Arg Pro Ile Tyr His Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Pro Gly260 265 270Gly Asp Leu His Ala Ala Gly Gly Val Tyr Gly Val Ser His His Met275 280 285Gln Gly Phe Pro Pro Met Met Tyr Ala Pro Pro Arg Ala Val Ile Tyr290 295 300Asn Tyr Lys Ser Glu Gly Met Pro Ser Leu Pro Pro Glu Gly Gly Ala305 310 315 320His Ser Ser<210>44<211>215<212>DNA<213>枯草桿菌<220>
<221>CDS<222>(15)..(215)<300>
<308>AB001488<309>1999-02-13<313>(1)..(215)
<400>44aggaggcaac aaaa atg gaa caa ggt aca gtt aaa tgg ttt aat gca gaa50Met Glu Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu1 5 10aaa ggt ttt ggc ttt atc gaa cgc gaa aat gga gac gat gta ttc gta98Lys Gly Phe Gly Phe Ile Glu Arg Glu Asn Gly Asp Asp Val Phe Val15 20 25cac ttt tct gca atc caa agt gac gga ttc aaa tct tta gac gaa ggt146His Phe Ser Ala Ile Gln Ser Asp Gly Phe Lys Ser Leu Asp Glu Gly30 35 40caa aaa gta tcg ttt gac gtt gag caa ggt gct cgt gga gct caa gct194Gln Lys Val Ser Phe Asp Val Glu Gln Gly Ala Arg Gly Ala Gln Ala45 50 55 60gct aac gtt caa aaa gct taa215Ala Asn Val Gln Lys Ala65<210>45<211>66<212>PRT<213>枯草桿菌<400>45Met Glu Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Arg Glu Asn Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Ser Asp Gly Phe Lys Ser Leu Asp Glu Gly Gln Lys Val Ser35 40 45Phe Asp Val Glu Gln Gly Ala Arg Gly Ala Gln Ala Ala Asn Val Gln50 55 60
Lys Ala65<210>46<211>201<212>DNA<213>枯草桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(201)<300>
<308>L77246<309>2001-12-14<313>(1)..(201)<400>46atg caa aac ggt aaa gta aaa tgg ttc aac aac gaa aaa gga ttc ggc48Met Gln Asn Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asn Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc att gaa gtt gaa ggc gga gac gat gta ttt gtt cac ttc aca gct96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala20 25 30atc gaa gga gat gga tac aaa tca tta gaa gaa gga caa gaa gtt tct144Ile Glu Gly Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser35 40 45ttt gaa att gtc gaa ggt aat cgt gga cct caa gct tct aat gtt gta192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ser Asn Val Val50 55 60aaa ctc taa201Lys Leu65<210>47
<211>66<212>PRT<213>枯草桿菌<400>47Met Gln Asn Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asn Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala20 25 30Ile Glu Gly Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ser Asn Val Val50 55 60Lys Leu65<210>48<211>198<212>DNA<213>Bacillus halodurans<220>
<221>CDS<222>(1)..(198)<300>
<308>AP001519<309>2001-01-10<313>(1)..(198)<400>48atg caa gga aaa gta aaa tgg ttt aac gca gaa aaa ggt ttc ggt ttt48Met Gln Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe
1 5 10 15atc gag cgc gaa gat ggt gac gat gta ttt gtt cat ttc tct gcc att 96Ile Glu Arg Glu Asp Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala Ile20 25 30aac aca gac ggt ttc aaa aca tta gac gaa ggt caa tct gtt gag ttt144Asn Thr Asp Gly Phe Lys Thr Leu Asp Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe35 40 45gat atc gtt gaa gga gct cgc gga cct caa gct gcg aac gtc act aag192Asp Ile Val Glu Gly Ala Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr Lys50 55 60ctt taa198Leu65<210>49<211>65<212>PRT<213>Bacillus halodurans<400>49Met Gln Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe1 5 10 15Ile Glu Arg Glu Asp Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala Ile20 25 30Asn Thr Asp Gly Phe Lys Thr Leu Asp Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe35 40 45Asp Ile Val Glu Gly Ala Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr Lys50 55 60Leu65
<210>50<211>204<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(204)<400>50atg gca cag ggt act gtg aaa tgg ttc aac ggc gaa aag gga ttt ggt48Met Ala Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Gly Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc atc gct ccc aac gat ggc tcc gca gat ctc ttc gtc cac tac tct96Phe Ile Ala Pro Asn Asp Gly Ser Ala Asp Leu Phe Val His Tyr Ser20 25 30gag att cag ggc tcc ggt ttc cgt aat ctt gag gaa aac cag cca gtt144Glu Ile Gln Gly Ser Gly Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Gln Pro Val35 40 45gaa ttt gag gtc ggc gag ggc gcc aag ggc cca cag gct cag cag gtt192Glu Phe Glu Val Gly Glu Gly Ala Lys Gly Pro Gln Ala Gln Gln Val50 55 60cgt gct ctc taa204Arg Ala Leu65<210>51<211>67<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>51Met Ala Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Gly Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15
Phe Ile Ala Pro Asn Asp Gly Ser Ala Asp Leu Phe Val His Tyr Ser20 25 30Glu Ile Gln Gly Ser Gly Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Gln Pro Val35 40 45Glu Phe Glu Val Gly Glu Gly Ala Lys Gly Pro Gln Ala Gln Gln Val50 55 60Arg Ala Leu65<210>52<211>384<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(384)<400>52atg cct gtc gga aca gtg aag tgg tac gac gcg gag cgt ggt ttc ggc 48Met Pro Val Gly Thr Val Lys Trp Tyr Asp Ala Glu Arg Gly Phe Gly1 5 10 15ttt gtc tcc aat cca ggt ggt gaa gat tgc ttc gta ggt aag caa gta 96Phe Val Ser Asn Pro Gly Gly Glu Asp Cys Phe Val Gly Lys Gln Val20 25 30ctt ccc aag gga gtc acc gaa ttg cac aag gga cag cga atc gat ttt144Leu Pro Lys Gly Val Thr Glu Leu His Lys Gly Gln Arg Ile Asp Phe35 40 45gac ttc gcc gca ggc cgt aag ggc cct caa gca ctt cga ata aag att192Asp Phe Ala Ala Gly Arg Lys Gly Pro Gln Ala Leu Arg Ile Lys Ile50 55 60
ctt gaa act cca cgc agg cgt cca cag cac aaa tac aag cca gaa gag240Leu Glu Thr Pro Arg Arg Arg Pro Gln His Lys Tyr Lys Pro Glu Glu65 70 75 80ctc aac gga atg atc tct gac ctc atc acg ctt cta gaa agt gga gtg288Leu Asn Gly Met Ile Ser Asp Leu Ile Thr Leu Leu Glu Ser Gly Val85 90 95caa cca ggc ctt gcc aaa ggg caa tac ccg gag cac aaa gct gga gcg336Gln Pro Gly Leu Ala Lys Gly Gln Tyr Pro Glu His Lys Ala Gly Ala100 105 110cag gta gca gaa att ctt cgc gtt gtt gcg aag gag ctt gag tct taa384Gln Val Ala Glu Ile Leu Arg Val Val Ala Lys Glu Leu Glu Ser115 120 125<210>53<211>127<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>53Met Pro Val Gly Thr Val Lys Trp Tyr Asp Ala Glu Arg Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Val Ser Asn Pro Gly Gly Glu Asp Cys Phe Val Gly Lys Gln Val20 25 30Leu Pro Lys Gly Val Thr Glu Leu His Lys Gly Gln Arg Ile Asp Phe35 40 45Asp Phe Ala Ala Gly Arg Lys Gly Pro Gln Ala Leu Arg Ile Lys Ile50 55 60Leu Glu Thr Pro Arg Arg Arg Pro Gln His Lys Tyr Lys Pro Glu Glu65 70 75 80
Leu Asn Gly Met Ile Ser Asp Leu Ile Thr Leu Leu Glu Ser Gly Val85 90 95Gln Pro Gly Leu Ala Lys Gly Gln Tyr Pro Glu His Lys Ala Gly Ala100 105 110Gln Val Ala Glu Ile Leu Arg Val Val Ala Lys Glu Leu Glu Ser115 120 125<210>54<211>249<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列，稍類似于大腸桿菌CspA<400>54atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc 60atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat120ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa180ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg aattcctcga gcgattacaa ggatgatgat240gataagtaa249<210>55<211>82<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大腸桿菌CspA-樣<400>55Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp65 70 75 80Asp Lys<210>56<211>225<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>大腸桿菌CspA-樣<400>56atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc60atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat 120ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa 180ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg aattcctcga cctag 225<210>57<211>74<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>大腸桿菌CspA-樣蛋白<400>57Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Ser Thr65 70<210>58<211>240<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>枯草桿菌CspB-樣<400>58atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctg aaa g gtttcggatt catcgaagta 60gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaa ct120ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct180gctaacgtta ctaaagaagc gaattcctcg agcgattaca aggatgatga tgataagtaa240
<210>59<211>79<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>枯草桿菌CspB-樣<400>59Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys65 70 75<210>60<211>216<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>枯草桿菌CspB-樣<400>60atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact120ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct180
gctaacgtta ctaaagaagc gaattcctcg acctag 216<210>61<211>71<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>枯草桿菌CspB-樣<400>61Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala Asn Ser Ser Thr65 70<210>62<211>213<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>大腸桿菌CspA-樣<400>62atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc60
atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat120ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa180ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg tga 213<210>63<211>70<212>PRT<213>CspA-樣蛋白<400>63Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu65 70<210>64<211>204<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>枯草桿菌CspB-樣<400>64
atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact120ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct180gctaacgtta ctaaagaagc gtga 204<210>65<211>67<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>枯草桿菌CspB-樣<400>65Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala65<210>66<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物<400>66aggtaataca ccatggccgg taa23<210>67<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR的引物<400>67ttaagcagag aattcaggct ggtt24<210>68<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Flag tag for epi tope tagging<400>68Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys1 5<210>69<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>69aggaggaaat tccatggtag aag 23
<210>70<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>70tcaatttatg aattcgcttc tttagt 26<210>71<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<222>(27)..(27)<223>n＝a，c，t，或g<400>71gggcactttg tacaagaaag ctgggtn27<210>72<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<222>(28)..(28)<223>n＝a，c，t，或g
<400>72ggggcacttt gtacaagaaa gctgggtn 28<210>73<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>73cctgcaggac catg 14<210>74<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>74cctgcaggct cgagcta 17<210>75<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>75ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 43<210>76<211>47<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>76ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cctgcaggct cgagcta 47<210>77<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>77ccccaccctg caatgtga 18<210>78<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>78tgtgcatcct tttatttcat acattaatta a31<210>79<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>79cctagacttg tccatcttct ggattggcca 30
<210>80<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>80gcctgccgca gaccaa 16<210>81<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>81atgcagagct cagcttcatc 20<210>82<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>82tccagtacgt gcagtccctc ctcc 24<210>83<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>83cgtctacaat cagaaggcgt aatc24<210>84<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>84ccaacaggtg aatgcttgat agg 23<210>85<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>85catgcgccgc tttgcttc 18<210>86<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>86gcgcaggcct agatgtacca tgtccggtaa aatgactggt atcgtaaaat gg 52<210>87<211>46<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>87cgcgaattcg gatccttatt acaggctggt tacgttacca gctgcc46<210>88<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>88gcgcaggcct agatgtacca tgttagaagg taaagtaaaa tggttcaact ctg53<210>89<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>89cgcgaattcg gatccttatt acgcttcttt agtaacgtta gcagcttgtg g 51<210>90<211>204<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對于植物表達的合成密碼子優(yōu)化的CspB<220>
<221>CDS
<222>(1)..(204)<400>90atg gtg gag ggc aag gtg aag tgg ttc aac tcc gag aag ggc ttc ggc 48Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc atc gag gtg gag ggt caa gac gat gtg ttc gtc cac ttc tcc gcc 96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30atc cag ggc gaa ggg ttc aag acc ctg gaa gag ggg cag gcc gtc tcc144Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45ttc gag atc gtc gag gga aac cgc ggt ccg cag gcc gcg aac gtc acg192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60aag gaa gcg tga204Lys Glu Ala65<210>91<211>67<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建體<400>91Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala65<210>92<211>213<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼CspA的合成密碼子<220>
<221>CDS<222>(1)..(213)<400>92atg gcc ggc aag atg acc ggc atc gtg aag tgg ttc aac gct gac aag 48Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15ggc ttc ggc ttc atc acg ccg gac gac ggc agc aag gat gtc ttc gtg 96Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30cac ttc tcc gcc atc cag aac gac ggc tac aag tcc ctc gac gag ggc144His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45cag aag gtc agc ttc acc atc gag agc ggc gcc aaa ggc ccg gcc gcc192Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60ggt aac gtc acg tcg ctg tga213Gly Asn Val Thr Ser Leu65 70
<210>93<211>70<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建體<400>93Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu65 70<210>94<211>201<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(201)<400>94atg caa aca ggt aaa gtt aaa tgg ttc aac agc gaa aaa ggt ttc ggt 48Met Gln Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15ttc atc gaa gtt gaa ggt gga gac gat gta ttc gtt cac ttc tca gct 96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30atc caa ggt gac gga ttc aaa act tta gaa gaa ggt caa gaa gtt tct144Ile Gln Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser35 40 45ttc gaa atc gtt gaa ggt aac cgt gga cca caa gct gct aac gtt aca192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60aaa aac taa201Lys Asn65<210>95<211>66<212>PRT<213>蘇云金芽孢桿菌<400>95Met Gln Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Asn6權利要求
1.一種重組DNA分子，其在5’到3’方向包含a)包含在植物中起作用的啟動子的第一DNA多核苷酸，其可操縱地連接到；b)編碼冷休克蛋白的第二DNA多核苷酸，可操縱地連接到；c)起多腺苷酸化序列作用的3’轉錄終止DNA多核苷酸。
2.一種權利要求1的重組DNA分子，其中在所述第一DNA多核苷酸和所述第二DNA多核苷酸之間插入植物DNA內含子。
3.一種權利要求1的重組DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸編碼包含SEQ ID NO3的氨基酸基序的蛋白。
4.一種權利要求3的重組DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸編碼選自下列的蛋白(a)具有基本上同一于來自革蘭氏陽性細菌冷休克蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，(b)來自枯草桿菌的冷休克蛋白，(c)枯草桿菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，(d)具有基本上同一于SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白，(e)具有基本上同一于來自革蘭氏陰性細菌冷休克蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，(f)包含來自大腸桿菌冷休克蛋白的蛋白，(g)大腸桿菌冷休克蛋白A(CspA)的同系物，(h)具有基本上同一于SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白，(i)來自根癌農桿菌的冷休克蛋白，和(j)具有基本上同一于SEQ ID NO5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63或65中任一的氨基酸序列的蛋白。
5.一種根據權利要求1的重組DNA分子，其中啟動子選自誘導型啟動子、組成型啟動子、時序調節(jié)型啟動子、發(fā)育調節(jié)型啟動子、組織優(yōu)選型啟動子、低溫增強型啟動子、低溫特異性啟動子、脅迫增強型啟動子、脅迫特異性啟動子、干旱誘導型啟動子、缺水誘導型啟動子和組織特異性啟動子。
6.一種已用表達冷休克蛋白的DNA分子轉化的耐非生物脅迫的轉基因植物。
7.一種權利要求6的植物的繁殖體。
8.權利要求6的植物的后代。
9.一種權利要求6的植物，其是一種作物。
10.一種權利要求6的植物，其是一種單子葉植物。
11.一種權利要求6的植物，其是一種雙子葉植物。
12.一種權利要求6的植物，其選自大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麥、燕麥、草坪草、棉花和小麥。
13.一種權利要求6的植物，其具有(a)在將限制相同種未轉化植物生長的低溫條件下更高的生長率，(b)在將限制相同種未轉化植物生長的高溫條件下更高的生長率，(c)在將限制相同種未轉化植物生長的水分條件下更高的生長率，(d)在將限制相同種未轉化植物生長的土壤和/或水中增加的鹽類或離子條件下更高的生長率，(e)在冷休克后較相同種未轉化植物更大百分率的植物存活率，(f)當與相同種未轉化植物相比時增加的產量，或(g)與相同種未轉化植物相比對干旱的抗性。
14.一種權利要求13的植物的繁殖體，其是種子。
15.一種方法，其中將權利要求14的種子種植在土壤中并使之生長。
16.一種產生轉基因植物的方法，所述方法包括下列步驟a)將權利要求1的重組DNA分子插入到植物細胞的基因組中；b)獲得含有所述重組DNA的轉化植物細胞；c)從所述的植物細胞再生植物；和d)選擇增強的非生物脅迫耐受性或增加的根生長的植物。
17.一種通過權利要求16的方法生產的脅迫耐受植物。
18.一種權利要求16的方法，其中所述非生物脅迫選自耐熱性、耐鹽性、耐旱性和冷休克后存活。
19.一種分離的蛋白，其(a)是至少40％同一于選自SEQ ID NOS5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65的至少一種蛋白，(b)在嚴謹條件下與選自SEQ ID NOs4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，90和92的核酸雜交，(c)具有基本上同一于SEQ ID NOS5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65中任一的氨基酸序列。
20.一種農作物，其包含至少50％的從包含原核冷休克蛋白的繁殖體發(fā)育的植物。
全文摘要
通過在植物中導入表達冷休克蛋白例如細菌冷休克蛋白的DNA提供了植物中增強的非生物脅迫耐受性。
文檔編號C07K14/195GK1886514SQ200480035385
公開日2006年12月27日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權日2003年9月29日
發(fā)明者M·費爾南德斯 申請人:孟山都技術有限公司