專利名稱：：制備新伐他汀及中間體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性地涉及合成有機(jī)化學(xué)和醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備新伐他汀及各種中間體以及相關(guān)化合物的合成化學(xué)方法和化學(xué)酶方法。在一個(gè)方面，在本發(fā)明方法中應(yīng)用到酶，如水解酶，例如酯酶。
背景技術(shù)：
：新伐他汀(Simvastatin)是有效的抗高膽固醇血癥制劑。其銷售的商品名是ZOCOR(Merck)。新伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀和普伐他汀是六氫化萘衍生物，作為HMG-CoA還原酶的抑制劑而應(yīng)用，HMG-CoA還原酶是人體內(nèi)產(chǎn)生膽固醇的生物合成途徑中的控速酶(rate-controllingenzyme)?？诜?，作為無活性內(nèi)酯的新伐他汀被水解為相應(yīng)的P-羥基酸形式。這是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑。該酶催化HMG-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸，這是膽固醇生物合成中的一個(gè)早期的和限速的步驟。新伐他汀、洛伐他汀(lovastatin)和普伐他汀是天然的發(fā)酵產(chǎn)物，其在它們的六氫化萘環(huán)系統(tǒng)的C-8位置上有2-甲基丁酸酯側(cè)鏈。新伐他汀合成地來自于土曲霉04^erg///^fe〃'eiw)的發(fā)酵產(chǎn)物。帶有C-82,2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈的化合物，包括新伐他汀，是比它們的2-甲基丁酸酯天然相對(duì)物更好的HMG-CoA還原酶抑制劑。因此，2,2-二甲基丁酸酯衍生物對(duì)于治療動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥、家族性高膽固醇血癥和相似疾病，具有更大的希望。然而，這些衍生物，包括新伐他汀，不是天然存在的，必須合成制備。結(jié)果是，將更有效的HMG-CoA抑制劑新伐他汀引入市場(chǎng)促進(jìn)了對(duì)有效地、高產(chǎn)地制備新伐他汀的方法的需求。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新方法，包括(i)在溫和的條件下，用本發(fā)明的酶(例如，具有SEQIDNO:4所列出序列的示范性酶，由SEQIDNO:3編碼)去除洛伐他汀側(cè)鏈，(ii)在最后的步驟中，用相同的酶選擇性去除酯保護(hù)基團(tuán)，和(iii)應(yīng)用新的條件引入新伐他汀側(cè)鏈。本發(fā)明提供了用于制備新伐他汀的新穎的四步法，包括下列步驟:(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸的鹽，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸的鹽；(b)在一個(gè)步驟中通過化學(xué)和/或酶促內(nèi)酯化作用以及酰化作用產(chǎn)生4-?；鶅?nèi)酯(包括酰化內(nèi)酯環(huán)上的第4位(4'-OH)，其中的環(huán)被如下所述的R-基團(tuán)酰化)；(c)通過化學(xué)和/或酶促酰化作用，酰化4-乙?；鶅?nèi)酯的第8位(8'-OH)，產(chǎn)生4-酰基新伐他??；和(d)通過化學(xué)和/或酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)選擇性地去除4'位的?；瑥亩苽湫路ニ?。在一個(gè)方面，制備本發(fā)明新伐他汀的四步法包括圖5中列出的過程。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了以四步法進(jìn)行的洛伐他汀向新伐他汀的化學(xué)酶促轉(zhuǎn)化，如圖5所概括顯示。在可選的方面中，本發(fā)明制備新伐他汀的方法(例如，圖5顯示的過程)中洛伐他汀轉(zhuǎn)化為新伐他汀的總產(chǎn)率是至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%或更多。確定何處發(fā)生了產(chǎn)率損失以及何處實(shí)現(xiàn)了工藝改進(jìn)的示范性方案和研究討論于下，例如，在實(shí)施例5、6、7和8中。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了四步途徑，用以從洛伐他汀合成新伐他汀，如圖5所示例描述，其中所述合成方案包括下列步驟步驟l:用能夠水解洛伐他汀酸的酶，例如，如此處描述的水解酶或商業(yè)上可得到的水解酶，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸的鹽，產(chǎn)生三醇酸。例如，用于酶促水解(S)-2-甲基丁酸酯側(cè)鏈的示范性水解酶是酯酶SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)、SEQIDNO:6(由例如SEQIDNO:5編碼)、和SEQIDNO:2(由例如SEQIDNO:1編碼)。SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)。步驟2:在?；瘎┐嬖诘那闆r下，攪拌三醇酸，產(chǎn)生4-?；鶅?nèi)酯。步驟3:第8位羥基的?；?，可以化學(xué)進(jìn)行，或用此處描述的水解酶或商業(yè)上可得到的水解酶酶促進(jìn)行。步驟4:化學(xué)地或是酶促地(用此處描述的水解酶，例如酯酶，或商業(yè)上可得到的水解酶)選擇性去除第4位的?；Ｗo(hù)基團(tuán)，產(chǎn)生新伐他汀(參見，例如，圖5，步驟5，指出了在可選的方面，甲基(Me)基團(tuán)可以是垸基，或等價(jià)物，R-基團(tuán))。在一個(gè)方面，用例如由SEQIDNO:3編碼的SEQIDNO:4酯酶催化內(nèi)酯第4位的?；鶊F(tuán)的選擇性水解。如果需要，或必要，在一個(gè)方面，此步驟也包括產(chǎn)生新伐他汀的銨鹽和重結(jié)晶新伐他汀，隨后對(duì)其重新內(nèi)酯化。這提供了具有期望純度的新伐他汀。選擇性地，可以通過在酶(例如，水解酶或酯酶)以及合適的?；瘎┐嬖诘那闆r下攪拌三醇酸來實(shí)施步驟2。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備新伐他汀的方法，包括圖6A中指出的方法。本發(fā)明提供了從洛伐他汀制備三醇酸的方法，包括圖15A或16A所指出的方法。本發(fā)明提供了從洛伐他汀制備洛伐他汀的方法，包括圖16A所指出的方法。本發(fā)明提供了從洛伐他汀酸制備三醇酸的方法，包括圖16A中指出的方法。本發(fā)明提供了從三醇酸(triolacid)制備二醇內(nèi)酯(diollactone)的方法，包括圖8或圖16B指出的方法。本發(fā)明提供了從二醇內(nèi)酯制備酰基內(nèi)酯的酶促方法，包括圖16C指出的方法。本發(fā)明提供了從三醇內(nèi)酯制備?；鶅?nèi)酯的方法，包括圖16D指出的方法。本發(fā)明提供了從三醇內(nèi)酯制備4-乙?；鶅?nèi)酯的方法，包括圖9A指出的方法。本發(fā)明提供了從?；鶅?nèi)酯制備?；路ニ〉姆椒?，包括圖16E指出的方法。本發(fā)明提供了從4-乙?；鶅?nèi)酯制備4-乙?；路ニ〉姆椒ǎ▓D9B指出的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從4-乙?；鶅?nèi)酯制備4-乙?；路ニ〉幕瘜W(xué)方法，例如，用圖9B示例的條件或其變化，用三氟化硼作催化劑。本發(fā)明提供了從4-乙酰基新伐他汀制備新伐他汀的方法，包括圖9C或圖ll指出的方法。本發(fā)明提供了從酰基新伐他汀制備新伐他汀銨鹽的方法，包括圖16F指出的方法。本發(fā)明提供了從辛伐他汀銨鹽制備辛伐他汀的方法，包括圖16F指出的方法。本發(fā)明提供了經(jīng)同二酰基化作用(homodiacylation)途徑從洛伐他汀制備新伐他汀的方法，如圖38所示例?？梢杂迷谝粋€(gè)、幾個(gè)或全部這些步驟中的酶促水解中的示范性酶包括SEQIDNO:4(例如，由SEQIDNO:3編碼)、SEQIDNO:6(例如，由SEQIDNO:5編碼)、禾QSEQIDNO:2(例如，由SEQIDNO:1編碼)。SEQIDNO:4(例如，由SEQIDNO:3編碼)，或與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性的酶。本發(fā)明提供了制備新伐他汀的方法，包括五步驟的異二酰基化作用(heterodiacylation)方法，具有下列步驟(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸；(b)在存在酸的情況下加熱三醇酸或攪拌，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯；(c)通過酶促區(qū)域選擇性?；?'-OH，保護(hù)二醇內(nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)上第4位的羥基(4'-OH)，產(chǎn)生4-?；鶅?nèi)酯；(d)通過化學(xué)和域酶促區(qū)域選擇性酰化第8位，從而?；?-?；鶅?nèi)酯的8位羥基(8'-OH)，產(chǎn)生4-酰基新伐他??；和(e)化學(xué)或酶促地選擇性去除第4位的?；Ｗo(hù)基團(tuán)，從而生產(chǎn)出新伐他汀。在可選的方面，本發(fā)明方法可以在至少2個(gè)容器中進(jìn)行，SP，以2罐、3罐等工藝過程。本發(fā)明方法可以在任意容器形式中實(shí)施，例如，毛細(xì)管陣列如GIGAMATRIX,DiversaCorporation,SanDiego,CA。本發(fā)明提供了制備新伐他汀的同二?；饔梅椒?，包括下列步驟的方法(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸鹽；(b)通過內(nèi)酯化從三醇酸產(chǎn)生二醇內(nèi)酯；(c)通過化學(xué)或酶促的?；饔茫；純?nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)上的第4位(4，-OH)和第8位(8'-OH)，產(chǎn)生4,8-二酰內(nèi)酯；和(d)通過酶促水解，選擇性去除4'位的?；瑥亩苽湫路ニ?。在本發(fā)明的其它方案中，通過在4位和8位加入選擇性的保護(hù)基團(tuán)，可以由二醇內(nèi)酯合成其它組合物，例如，當(dāng)R—基團(tuán)選自(i)-H，甲基酸衍生物；(ii)Cl-n垸基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基等，均為直鏈和支鏈，其中在一個(gè)方面，n是1和20之間的整數(shù)；(iii)取代的烷基，例如，氯乙酰、三氯乙酰、三氟乙酰、甲氧基乙酰、苯乙酰、4-氧戊基(乙酰丙酸)；(iv)苯基和取代的苯基例如苯基、對(duì)硝基苯基；和(力R'O-基團(tuán)，產(chǎn)生羧酸鹽保護(hù)基團(tuán)，示例但不限于tBuOCO、PhOCO、PhCH2OCO，其中，在一個(gè)方面，R'O-基團(tuán)產(chǎn)生羧酸鹽保護(hù)基團(tuán)，其中R'是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任意一個(gè)基團(tuán)。在本發(fā)明的這些可供選擇的合成反應(yīng)中，保護(hù)基團(tuán)(R-基團(tuán))可以被化學(xué)地或酶促地區(qū)域選擇性去除，生成所需的終產(chǎn)物。這些R-基團(tuán)，或等價(jià)的R-基團(tuán)，可以被用作本發(fā)明任何方法的任何步驟中的"保護(hù)基團(tuán)"。例如，這些R-基團(tuán)，或等價(jià)的R-基團(tuán)，被用作如圖5、圖6A、圖9、圖10、圖ll、圖16C、圖16D、圖16E或圖16F所闡釋的本發(fā)明示范性方法或本發(fā)明等價(jià)工藝方法中的R-基團(tuán)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從洛伐他汀合成新伐他汀的五步路線，如圖6所示例，其中的合成過程包括下列步驟步驟l:用能夠催化洛伐他汀酸水解的酶，例如，如此處描述的水解酶或可從商業(yè)途徑得到的水解酶酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸。例如，可用于酶促水解(S)-2-甲基丁酸酯側(cè)鏈的示范性水解酶是酯酶SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)、SEQIDNO:6(由例如SEQIDNO:5編碼)和SEQIDNO:2(由例如SEQIDNO:1編碼)。SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)。步驟2:在存在酸的情況下加熱三醇酸或攪拌，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯。步驟3:應(yīng)用如此處描述的水解酶或可從商業(yè)途徑得到的水解酶，通過酶促區(qū)域選擇性?；饔?，保護(hù)內(nèi)酯環(huán)上的4'-OH。參見，例如，圖6，步驟3，注意在可供選擇的步驟中，甲基(Me)可以是任意烷基或等價(jià)的(例如，甲氧基、烷氧基、苯基等)R-基團(tuán)。步驟4:酰化8位的羥基；可以用如此處描述的水解酶或可從商業(yè)途徑得到的水解酶，化學(xué)地或酶促地進(jìn)行。步驟5:化學(xué)或酶促地選擇性去除4'位的?；Ｗo(hù)基團(tuán)(如此處描述的水解酶例如酯酶，或可從商業(yè)途徑得到的水解酶)，生成新伐他汀(參見例如圖6，步驟5，注意在可選的步驟中，甲基(Me)可以是任意烷基或等價(jià)的R基團(tuán))。在一個(gè)方面，例如由SEQIDNO:3編碼的SEQIDNO:4被用來催化內(nèi)酯4'位?；倪x擇性水解。如果需要或必須，在一個(gè)方面，此步驟也包括產(chǎn)生新伐他汀的銨鹽和重結(jié)晶新伐他汀，隨后重新酯化。這提供了所需純度的新伐他汀。本發(fā)明也提供了方法，用能夠水解洛伐他汀酸的酶，例如此處描述的水解酶或可從商業(yè)上得到的水解酶(參見下面的實(shí)施例6，步驟1)，從洛伐他汀產(chǎn)生新伐他汀酸。本發(fā)明也提供了產(chǎn)生三醇酸的方法，包括用能夠催化洛伐他汀酸水解的酶，例如此處描述的水解酶或可從商業(yè)上得到的水解酶，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸。本發(fā)明提供了方法，用此處描述的水解酶或可從商業(yè)上得到的水解酶，通過區(qū)域選擇性?；?，保護(hù)內(nèi)酯的羥基，例如，內(nèi)酯環(huán)上的4，-OH(例如，二醇內(nèi)酯上的，如圖6所示)。本發(fā)明提供了?；?-?；鶅?nèi)酯8位羥基的方法(如圖6所示)，這可以用化學(xué)方法實(shí)施，或者用此處描述的水解酶或可從商業(yè)上得到的水解酶用酶促方法實(shí)施。本發(fā)明提供了方法，用于選擇性去除內(nèi)酯上的?；?，內(nèi)酯上的保護(hù)?；?，如圖6所示的內(nèi)酯上第4'位的保護(hù)性酰基，用化學(xué)方法或酶促方法進(jìn)行。本發(fā)明也提供了方法，包括這些方法中的兩種或更多種或全部，例如，化學(xué)酶促地從洛伐他汀、三醇酸、二醇內(nèi)酯、4-?；鶅?nèi)酯或4-?；路ニ‘a(chǎn)生新伐他汀。關(guān)于實(shí)施這些方法的本發(fā)明示范性方案，參見例如，下面的實(shí)施例5、6、7和8。在一個(gè)方面，用二甲基丁酸衍生物和路易斯酸催化劑(Lewisacidcatalyst)，區(qū)域選擇性地?；純?nèi)酯的第8位。在一個(gè)方面，本發(fā)明方法生成了帶有<1%的洛伐他汀的新伐他汀，原因是，在一些情況下，將洛伐他汀與新伐他汀分離開來可能是低效率的。在可選的方面，本發(fā)明方法生成了新伐他汀，其中所述方法的總產(chǎn)率大于或等于(=)50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、710/0、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯°/?；蚋?。在一個(gè)方面，本發(fā)明方法生成新伐他汀，其中對(duì)洛伐他汀的起始酶促水解以大約20%w/v進(jìn)行。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生新伐他汀的方法，包括圖5示例出的方案("方案l")或其變化，這是合成新伐他汀的異二酰基化作用途徑。在方案l(圖5)的可選方面，步驟1可以包括化學(xué)或酶促水解；步驟2可以包括化學(xué)或酶促內(nèi)酯化及?；徊襟E3可以包括化學(xué)或酶促?；?，步驟4可以包括化學(xué)或酶促水解，或其任何結(jié)合。在一個(gè)方面，這些水解反應(yīng)中的至少一個(gè)是區(qū)域?qū)Ｒ坏?regiospecific)。在本發(fā)明任何方法的可選方面，至少一個(gè)步驟是在反應(yīng)容器中進(jìn)行的。在本發(fā)明任何方法的可選方面，至少一個(gè)步驟是用細(xì)胞提取物進(jìn)行的。在本發(fā)明的任何一個(gè)方法的可選方面，至少一個(gè)步驟是在完整的細(xì)胞中進(jìn)行的。細(xì)胞可以是任何來源，例如，植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在本發(fā)明任何方法的一個(gè)方面，產(chǎn)生新伐他汀的銨鹽。在一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括新伐他汀的重結(jié)晶。在一個(gè)方面，所述方法包括重內(nèi)酯化，以提供所需純度的新伐他汀。在本發(fā)明任何方法的一個(gè)方面，至少一個(gè)酶促反應(yīng)是通過水解酶進(jìn)行的(例如，酯酶或脂酶)，所述水解酶是由與SEQIDNO:1有至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89°/。、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所編碼的，或者是其酶學(xué)上的活性片段。在本發(fā)明任何方法的一個(gè)方面，至少一個(gè)酶促反應(yīng)是通過水解酶進(jìn)行的，所述水解酶是由與SEQIDNO:3有至少53%、54%、55°/。、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62°/。、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所編碼的，或者是其酶學(xué)上的活性片段。在本發(fā)明任何方法的一個(gè)方面，至少一個(gè)酶促反應(yīng)是通過水解酶進(jìn)行的，所述水解酶是由與SEQIDNO:5有至少56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、7P/。、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91°/。、92%、93%、94°/。、95%、96°/。、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所編碼的，或者是其酶學(xué)上的活性片段。本發(fā)明任何方法的一個(gè)方面，至少一個(gè)酶促反應(yīng)是通過水解酶(例如，酯酶)進(jìn)行的，所述水解酶和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性，或者是其酶學(xué)上的活性片段。本發(fā)明提供了試劑盒，所述試劑盒包括用于實(shí)施本發(fā)明的試劑和水解酶。在一個(gè)方面，所述試劑盒包括至少一種水解酶，該水解酶和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少約51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性，或者是其酶學(xué)上的活性片段。在一個(gè)方面，所述試劑盒包括實(shí)施本發(fā)明方法的說明書。本發(fā)明的一種或多種實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在下面的附圖和描述中說明。根據(jù)說明書和附圖以及從權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢(shì)將是顯然的。此處引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)、GenBank序列和ATCC保藏物，特別地在此并入作為參考，用于所有用途。附圖簡(jiǎn)述圖1是對(duì)三氟甲基磺酸鹽(triflate)和醚合BFr催化的4-乙?；鶅?nèi)酯的酰化作用的示范性方案的說明，如下面的實(shí)施例5中詳述。圖2是對(duì)幾種BF3.0Et2催化的?；饔玫慕Y(jié)果的說明，如表3，如下面的實(shí)施例5所詳述。圖3是對(duì)表4的說明，顯示了沉淀之前和沉淀之后，12g?；磻?yīng)產(chǎn)物的雜質(zhì)分布，如下面的實(shí)施例5中所詳述。圖4是對(duì)表8的說明，顯示了分離新伐他汀的數(shù)據(jù)，如下面的實(shí)施例5中所詳述。圖5說明了本發(fā)明的示范性過程，四步異二?；緩?，用以從洛伐他汀合成新伐他汀。圖6A和圖6B說明了本發(fā)明的示范性過程，五步途徑，用以從洛伐他汀合成新伐他汀(圖6A)，和對(duì)洛伐他汀向新伐他汀轉(zhuǎn)化的總結(jié)(圖6B)。圖7說明了對(duì)酶促水解乙?；路ニ〉氖痉缎苑桨傅慕Y(jié)果的HPLC分析，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖8說明了本發(fā)明的示范性內(nèi)酯化/酰化反應(yīng)及其產(chǎn)物，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖9A說明了本發(fā)明的示范性內(nèi)酯化/酰化方案，包括從三醇酸產(chǎn)生4-乙?；鶅?nèi)酯，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖9B說明了本發(fā)明的示范性方法，包括從4-乙?；鶅?nèi)酯產(chǎn)生4-乙酰基新伐他汀，如下面的實(shí)施例5中所詳述。圖9C說明了本發(fā)明的示范性方法，包括乙?；路ニ∠蛐路ニ〉霓D(zhuǎn)化，如下面的實(shí)施例5中所詳述。圖10說明了化學(xué)酰化第8位的示范性方案，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖11說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，4-乙酰基新伐他汀的酶促脫乙酰作用，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖12說明了用本發(fā)明示范性方案產(chǎn)生的兩批新伐他汀的HPLC曲線，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖13說明了HPLC分析，顯示了本發(fā)明示范性方案產(chǎn)生的新伐他汀樣品的雜質(zhì)曲線圖，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖14說明了一張表格，顯示了對(duì)本發(fā)明示范性方案的比較，所述方案是以三醇酸作為原料的一步內(nèi)酯化/乙酰化作用，如下面的實(shí)施例7中所詳述。圖15A說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，包括用酯酶水解洛伐他汀為三醇酸，如下面的實(shí)施例5和7中所詳述。圖16A說明了從洛伐他汀制備洛伐他汀酸、以及從洛伐他汀酸制備三醇酸的示范性方法，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖16B說明了從三醇酸制備二醇內(nèi)酯的示范性方法，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖16C說明了從二醇內(nèi)酯制備酰基內(nèi)酯的示范性方法，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖16D說明了本發(fā)明的示范性方案，包括對(duì)內(nèi)酯的4位進(jìn)行內(nèi)酯化和?；?，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖16E說明了本發(fā)明的示范性方案，包括從?；鶅?nèi)酯制備酰基新伐他汀，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖16F說明了本發(fā)明的示范性方案，包括從?；路ニ≈苽湫路ニ′@鹽，和從新伐他汀銨鹽制備新伐他汀，如下面的實(shí)施例6中所詳述。圖17A說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，包括用路易斯酸從二醇內(nèi)酯制備新伐他汀、4'-酰基內(nèi)酯(也稱作異新伐他汀)和同新伐他汀(也稱作二新伐他汀)的過程，如下面所詳述。圖17B說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，包括經(jīng)酶促水解，從新伐他汀、4'-酰基內(nèi)酯(異新伐他汀)和同新伐他汀(也稱作二新伐他汀)制備新伐他汀和二醇內(nèi)酯，如下所詳述。圖18A說明了本發(fā)明的示范性方案，包括合成4-乙?；純?nèi)酯的方法，如下面的實(shí)施例3所詳述。圖18B說明了4-乙酰基內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)、相應(yīng)的二乙酸酯的結(jié)構(gòu)以及消除產(chǎn)物，如下面的實(shí)施例3所詳述。圖18C說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，包括4-乙酰基新伐他汀的合成，如下面的實(shí)施例4所詳述。圖18D說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，包括經(jīng)水解酶水解4-乙?；路ニ?，如下面的實(shí)施例4所詳述。圖18E說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，包括將洛伐他汀酶促水解為三醇酸，如下面的實(shí)施例2所詳述。圖19說明了制備4-乙?；鶅?nèi)酯的示范性過程，如下面的實(shí)施例13所詳述。圖20說明了4-乙?；路ニ∠蛐路ニ〉乃?，和相應(yīng)的消除產(chǎn)物以及酸，如下面的實(shí)施例5所詳述。圖21說明了一張表格，顯示了選出的新伐他汀樣品的雜質(zhì)曲線圖數(shù)據(jù)、HPLC分析數(shù)據(jù)和組分分析結(jié)果，如下面的實(shí)施例8所詳述。圖22是對(duì)本發(fā)明示范性反應(yīng)的說明，例如，三醇酸向相應(yīng)二醇內(nèi)酯、3-乙酰基三醇酸和5-乙?；妓岬霓D(zhuǎn)化，和隨后向3,5-二乙?；妓?、4-乙?；鶅?nèi)酯和消除產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，如下面的實(shí)施例9所詳述。圖23是對(duì)用SEQIDNO:4的酯酶酶促水解洛伐他汀的研究的說明，如下面的實(shí)施例7所詳述。圖24是對(duì)應(yīng)用DESIGNEXPERT軟件，經(jīng)部分析因設(shè)計(jì)對(duì)洛伐他汀的酶促水解進(jìn)行最佳化的說明，如下面的實(shí)施例IO所詳述。圖25是總結(jié)影響洛伐他汀酸水解的四個(gè)因子的說明，如下面的實(shí)施例IO所詳述。圖26說明了應(yīng)用DESIGNEXPERT軟件，用中心復(fù)合設(shè)計(jì)對(duì)水解洛伐他汀進(jìn)行的反應(yīng)表面分析(ResponseSurfaceAnalysis)(RSA)的結(jié)果，如下面的實(shí)施例IO所詳述。圖27說明了用SEQIDNO:4原位水解洛伐他汀的最佳化結(jié)果，如下面的實(shí)施例IO所詳述。圖28說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，所述反應(yīng)是大規(guī)模地水解洛伐他汀的方案，如下面的實(shí)施例IO所詳述。圖29說明了經(jīng)SEQIDNO:4水解的新伐他汀的4-?；苌铮缦旅娴膶?shí)施例10所詳述。圖30說明了本發(fā)明的應(yīng)用SEQIDNO:4的示范性洛伐他汀水解方案，如下面的實(shí)施例11所詳述。圖31說明了放大方案(scaled-upprotocol)中的洛伐他汀向三醇酸的示范性酶促水解，如下面的實(shí)施例ll所詳述。圖32說明了將洛伐他汀酶促水解為三醇酸的放大方案，如下面的實(shí)施例ll所詳述。圖33說明了在放大方案中應(yīng)用的洛伐他汀向三醇酸的示范性酶促水解，和對(duì)反應(yīng)參數(shù)的總結(jié)，如下面的實(shí)施例11所詳述。圖34說明了對(duì)數(shù)據(jù)的圖解總結(jié)，所述數(shù)據(jù)來自40g反應(yīng)(a)在內(nèi)酯化和濃縮之后(圖34A)以及(b)粗產(chǎn)物(圖34B)。圖35說明了對(duì)數(shù)據(jù)的圖解總結(jié)，所述數(shù)據(jù)來自100g反應(yīng)(a)三醇酸(圖35A)以及(b)內(nèi)酯化作用之后(圖35B)。圖36說明了對(duì)數(shù)據(jù)的圖解總結(jié)，所述數(shù)據(jù)來自lOg放大酶促水解反應(yīng)，其中4-乙酰基內(nèi)酯被?；癁?-乙?；路ニ。缦旅娴膶?shí)施例11所詳述。圖37說明了在本發(fā)明方法中應(yīng)用的示范性化學(xué)?；饔茫錇閼?yīng)用?；谆撬猁}的路易斯酸催化的?；饔?，如下面的實(shí)施例11所詳述。圖38和圖39說明了通過同二?；饔脧穆宸ニ≈苽湫路ニ〉氖痉缎苑椒ê蜅l件，如下面的實(shí)施例12所詳述。圖40A和40B圖形說明了用本發(fā)明方法用SEQIDNO:4對(duì)同新伐他汀進(jìn)行的水解，以及得到的反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)的條件是lmM同新伐他汀和10mM同新伐他汀，如下面的實(shí)施例12所詳述。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新穎的化學(xué)和生物化學(xué)方法，用于產(chǎn)生新伐他汀(例如，ZOCORTM)及其中間產(chǎn)物。這些方法可以是高效的和在成本上有效的。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，本發(fā)明用各種酶生物催化地催化反應(yīng)，所述酶包括水解酶，例如?；D(zhuǎn)移酶和酯酶。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用水解酶將洛伐他汀酶促水解為洛伐他汀酸的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將洛伐他汀酸或其鹽酶促水解為三醇酸或其鹽的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用水解酶將二醇內(nèi)酯酶促?；癁轷；鶅?nèi)酯的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用水解酶將?；鶅?nèi)酯酶促?；癁轷；路ニ〉姆椒?。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用水解酶水解內(nèi)酯環(huán)的方法。本發(fā)明包括經(jīng)體外或體內(nèi)技術(shù)產(chǎn)生新伐他汀和各種中間產(chǎn)物的方法，所述技術(shù)例如，全細(xì)胞方案，如發(fā)酵或其它生物催化過程。在可選的方面，本發(fā)明提供了將洛伐他汀轉(zhuǎn)化為新伐他汀的新穎的方法，如圖5或圖6A和6B所圖示說明。在一個(gè)方面，應(yīng)用二甲基丁酸衍生物和路易斯酸催化劑，經(jīng)水解從洛伐他汀制備的二醇內(nèi)酯在8位上被區(qū)域選擇性地?；?。二醇內(nèi)酯可以應(yīng)用此處描述的化學(xué)酶方法從洛伐他汀而制備。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了方法，包括用路易斯酸從二醇內(nèi)酯制備新伐他汀、4'-酰基新伐他汀和同新伐他汀，如圖17A所說明。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在路易斯酸存在的情況下，用羧酸衍生物處理二醇內(nèi)酯，導(dǎo)致位置8處的優(yōu)勢(shì)酰化。在三氟甲基磺酸金屬鹽存在的情況下應(yīng)用過量的乙烯基乙酸鹽(酯)時(shí)，8-乙酰基衍生物幾乎獨(dú)有地以低的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。.到此為止的結(jié)果顯示了，用二甲基丁酸酐和溶于二氯甲垸的Bi(0Tf)3或Cu(0Tf)2的聯(lián)合在室溫下處理二醇內(nèi)酯，導(dǎo)致了快速反應(yīng)，其中新伐他汀:4'-?；鶅?nèi)酯的比率>4:1。在一個(gè)方面，新伐他汀的分離和純化是通過結(jié)晶進(jìn)行的。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了篩選Lewis酸催化劑和/或?；噭┑姆椒ǎ靡蕴峁┻x擇性反應(yīng)條件，以最大化新伐他汀的產(chǎn)量和最小化副產(chǎn)物。最大化新伐他汀的產(chǎn)量和最小化副產(chǎn)物有助于結(jié)晶方案。采用結(jié)晶分離/純化新伐他汀導(dǎo)致了從洛伐他汀到新伐他汀的2步方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了方法，包括經(jīng)酶促水解從新伐他汀、4'-酰基內(nèi)酯新伐他汀和同新伐他汀制備新伐他汀和二醇內(nèi)酯，如圖17B所說明。在一個(gè)方面，如果異新伐他汀和同新伐他汀不能通過結(jié)晶降低為可以被凈化的水平，則采用最終的酶促水解步驟協(xié)助回收產(chǎn)物。在一個(gè)方面，用酯酶(例如，具有SEQIDNO:4列出的序列的酶，由SEQIDNO:3編碼的)處理新伐他汀、異新伐他汀和同新伐他汀的混合物，導(dǎo)致4'位置處的?；膮^(qū)域選擇性水解，這產(chǎn)生了新伐他汀和二醇內(nèi)酯的混合物。在一個(gè)方面，新伐他汀是通過結(jié)晶而分離的。選擇性地，應(yīng)用過量的酐將反應(yīng)向產(chǎn)生新伐他汀和同新伐他汀的反向推進(jìn)。這可以最小化異新伐他汀的量。酶促水解這樣的混合物導(dǎo)致了新伐他汀的產(chǎn)生和迅速分離。在路易斯酸存在的情況下經(jīng)區(qū)域選擇性地酰化二醇內(nèi)酯對(duì)新伐他汀進(jìn)行制備的一個(gè)方面，用二氯甲垸中的二甲基丁酸酐(0.5當(dāng)量(eq))在室溫(RT)下處理二醇內(nèi)酯，5mol。/。的Cu(OTf)2作為催化劑而存在。HPLC分析表明，在10分鐘內(nèi)二醇內(nèi)酯的50%發(fā)生轉(zhuǎn)化。新伐他汀(在8位處酰化)和異新伐他汀(在4位處?；?的比值是4:1，產(chǎn)生了4%的同新伐他汀。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了方法，包括在圖5的新穎的4步法或圖6A的5步法中指明的步驟或其聯(lián)合。在選擇性的方面，本發(fā)明提供了方法，包括下列步驟中的至少一種、幾種或全部步驟l:酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸鹽，其中采用水解酶，例如此處描述的酶，例如，SEQIDNO:4，其由例如SEQIDNO:3編碼，或商業(yè)上可得到的水解酶。步驟2:將三醇酸轉(zhuǎn)化為4-乙?；鶅?nèi)酯，例如，在一個(gè)步驟中，例如在圖5的步驟2中，或在兩個(gè)步驟中，例如在圖6A的步驟2和3中(在一個(gè)方面，在酸存在的情況下加熱或攪拌三醇酸，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯)。歩驟3:保護(hù)二醇內(nèi)酯內(nèi)酯環(huán)上的4，-0H，產(chǎn)生4-乙?；鶅?nèi)酯，用例如此處描述的酶或商業(yè)上可得到的水解酶經(jīng)區(qū)域選擇性?；鴮?shí)施。步驟4:?；?位上的羥基；這可以化學(xué)地進(jìn)行，或用例如此處描述的酶或商業(yè)上可得到的水解酶而酶促進(jìn)行。步驟5:或是化學(xué)地或是酶促地，選擇性去除4'位的?；Ｗo(hù)基團(tuán)，產(chǎn)生新伐他汀。如果需要，產(chǎn)生新伐他汀的銨鹽并對(duì)新伐他汀重結(jié)晶，隨后重新內(nèi)酯化，提供具有所需純度的新伐他汀。在一個(gè)方面，參照如上所述的步驟l，本發(fā)明提供了包括經(jīng)酶促水解或化學(xué)水解從洛伐他汀制備出洛伐他汀酸的方法，如圖16A所描述。本發(fā)明提供了經(jīng)酶促水解或化學(xué)水解從洛伐他汀酸制備出三醇酸或三醇酸鹽的方法，如圖16A所描述。完全地或基本完全地(在可選擇的方面，>99%、>98%、>97%或>96%)去除甲基丁酸酯側(cè)鏈，對(duì)一種方法來說可能是必須的，原因是分離洛伐他汀和新伐他汀有難度，以及在新伐他汀API中洛伐他汀的允許水平低。已報(bào)道的水解洛伐他汀的方法需要應(yīng)用高溫和長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，以完全反應(yīng)。在一個(gè)方面，洛伐他汀在溫和的條件下被水解，其中采用水解酶(例如，具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、或SEQIDNO:6列出序列的酶，上述酶分別由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5編碼)。這導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)的水解和完全去除第8位的側(cè)鏈。具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中列出序列的酶已經(jīng)被證明對(duì)甲基丁酸酯側(cè)鏈酶促水解特別有效SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、或SEQIDNO:6。具有SEQIDNO:4所列出序列的酶已被亞克隆并在宿主如大腸桿菌CE.co/i)中表達(dá)。洛伐他汀在酶促活性所需的水性條件下可以顯示出差的溶解性。因此，在一個(gè)選擇性方面，洛伐他汀在水中的懸浮液的pH值被升高至pH>12，以實(shí)現(xiàn)內(nèi)酯環(huán)的快速水解。這導(dǎo)致原位產(chǎn)生更加可溶的洛伐他汀酸鹽。在一個(gè)方面，隨后將反應(yīng)混合物的pH值重新下調(diào)為適合水解反應(yīng)的范圍；并且加入酶。酶促水解條件也可以被施用于從發(fā)酵肉湯直接提取出的洛伐他汀和洛伐他汀酸的混合物。選擇性地，可以將酶加入發(fā)酵肉湯并直接分離三醇酸。在一個(gè)方面，在水解之后，酸化反應(yīng)混合物。三醇酸可以通過萃取和/或過濾被分離出來，并且直接在下一步驟中應(yīng)用。選擇性地，三醇酸在合適的結(jié)晶/沉淀步驟之后被分離出來。在一個(gè)方面，參照上述步驟2，本發(fā)明提供了包括圖16B所說明的步驟的方法。在一個(gè)方面，通過在合適的溶劑中加熱并用常規(guī)方法去除水而將平衡向內(nèi)酯形式驅(qū)動(dòng)，使三醇酸重新內(nèi)酯化。選擇性地，在合適的酸存在的情況下，攪拌將導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)的閉合。在一個(gè)方面，參照上述的步驟3，本發(fā)明提供了方法，包括用具有所需活性和選擇性的酶，例如水解酶如酯酶，酰化4'位羥基。在一個(gè)方面，用水解酶(例如，酯酶)?；純?nèi)酯?？梢宰兓；男再|(zhì)，用以賦予其合適的特征，例如，變?yōu)橐宜狨ヒ员闳菀兹コ?，苯甲酸酯以增?qiáng)結(jié)晶性，甲酸酯以增強(qiáng)水溶解性。在此處描述的示范性方法(例如，圖5和6A，圖38)的可選方面，包括步驟3(上)、4和5(下)中描述的反應(yīng)物和試劑的可選方面，?；梢员惶娲鸀槿我夂线m的R-基團(tuán)(g卩，"保護(hù)"基團(tuán)可以是任何R-基團(tuán))，其中"R"可以是(i)-H，甲酰衍生物；(ii)Cl-n烷基，直鏈的和支鏈的；(m)取代的垸基基團(tuán)，例如，氯乙酰、三氯乙酰、三氟乙酰、甲氧乙酰、苯乙酰、4-氧代苯基(乙酰丙酸酯)；(iv)苯基和取代的苯基例如，苯基、對(duì)-硝基苯基；(v)R'0基團(tuán)，產(chǎn)生碳酸酯保護(hù)基團(tuán)，示例但不限于tBuOCO、PhOCO、PhCH2OCO。在一個(gè)方面，R'0基團(tuán)產(chǎn)生碳酸酯保護(hù)基團(tuán)，R，是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任何基團(tuán)。在一個(gè)方面，當(dāng)R是長(zhǎng)鏈垸基基團(tuán)時(shí)，應(yīng)用對(duì)長(zhǎng)鏈烷基酯有增強(qiáng)反應(yīng)活性的酶。當(dāng)R是長(zhǎng)鏈烷基時(shí)，溶解性可能是一個(gè)問題。在一個(gè)方面，R是乙酸酯，這可以是有利的，原因是(i)容易加入，(ii)良好的水解酶活性，(iii)溶解性，(iv)試劑的成本。在一個(gè)方面，參照上述的步驟4，本發(fā)明提供了方法，包括圖16E描述的步驟，并且在可選的實(shí)施方案中，包括圖16E描述的試劑。在一個(gè)方面，用二甲基丁酸衍生物和合適的?；呋瘎?通過活性?；蛎复脔；?的組合，加入所需的新伐他汀側(cè)鏈。二甲基丁酸酐/路易斯酸的組合(例如，三氟甲基磺酸鉍Bi(triflate)3，三氟甲基磺酸銅Cu(triflate)2),導(dǎo)致在室溫下(RT)的快速反應(yīng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了篩選合適的路易斯酸和反應(yīng)條件的方法，包括溫度、溶劑等等?？蛇x方案中此酰化的最適條件或試劑可以用常規(guī)的篩選方法確定。在一個(gè)方面，在十分溫和的條件下(例如，在一方面，在室溫(RT)下，例如，約4(TC，用有機(jī)溶劑)，用催化?；鶅?nèi)酯?；拿冈诘?位加入二甲基丁酸酯基團(tuán)，而不產(chǎn)生副產(chǎn)物。本發(fā)明提供了篩選在本發(fā)明方法中具有所需活性的可選酶的方法?？梢酝ㄟ^用常規(guī)方法篩選酶在本發(fā)明各種方案中的有效性，對(duì)酶進(jìn)行篩選。在一個(gè)方面，參照上述步驟5，本發(fā)明提供了方法，包括圖16F描述的步驟，并且在可選的實(shí)施方案中，包括圖16F描述的試劑。在一個(gè)方面，最終步驟需要選擇性地去除4'位上的?；?'位上的?；梢詫?duì)堿催化的消除高度敏感，甚至僅在強(qiáng)度堿性條件下也敏感。因此，酶促水解曾是區(qū)域選擇性去除此酰基的最方便的方法。已經(jīng)證明，水解洛伐他汀的相同的酶(SEQIDNO:4(由SEQIDNO:3編碼)，在上面的步驟1中)也是選擇性水解內(nèi)酯4'位?；挠行Т呋瘎?。當(dāng)在pH值為7時(shí)實(shí)施時(shí)，此酶促水解產(chǎn)生內(nèi)酯環(huán)基本上完整的新伐他汀。一般方法本發(fā)明提供了生產(chǎn)新伐他汀和各種中間體的新穎的化學(xué)方法。金屬人員將認(rèn)識(shí)到，可以利用各種過程和方法學(xué)合成本發(fā)明方法中應(yīng)用的起始化合物以及中間化合物，所述過程和方法學(xué)在科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中詳細(xì)描述，例如，OrganicSynthesesCollectiveVolumes,GilmanWa/.(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.,NY;Venuti(1989)尸/w/^/^"6:867-873。可以結(jié)合科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中詳細(xì)描述的本領(lǐng)域中的任何方法或方案，來實(shí)踐本發(fā)明。此處給出的對(duì)一般方法的討論僅意圖于示例性的目的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容之后，其它的可選方法和實(shí)施方案將是顯而易見的。酶在本發(fā)明任意方法的一方面，至少一個(gè)酶反應(yīng)是由具有水解酶活性(例如，酯酶活性)的多肽進(jìn)行的，例如，和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6至少有約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性、或完全(100%)相同序列的序列的水解酶，或其酶學(xué)上的活性片段。具有水解酶活性的多肽也可以是包括催化位點(diǎn)的肽、催化抗體和類似多肽。具有SEQIDNO:4列出序列的多肽是家族VII酯酶，禾口!3-內(nèi)酰胺酶有同源性，并且與其共享SXXK基序。因此，可以在本發(fā)明的一個(gè)、幾個(gè)或所有步驟中應(yīng)用的酶，可以具有酯酶活性，并且具有和SEQIDNO:4至少約50。/。、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79°/0、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性、或完全(100%)相同序列的序列以及SXXF基序。具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:6列出序列的多肽是阿魏酸酯酶(feruloylesterases)。因此，可以在本發(fā)明的一個(gè)、幾個(gè)或所有步驟中應(yīng)用的酶，可以具有阿魏酸酯酶活性。本發(fā)明的方法中應(yīng)用的酶可以通過任何合成或重組方法產(chǎn)生，或者，可以從天然來源或其組合分離出來。用來實(shí)踐本發(fā)明方法的、編碼酶的，不論是RNA、cDNA、載體、病毒或其雜化物(hybrids)，可以從多種來源分離出來、進(jìn)行遺傳工程、擴(kuò)增、和/或重組表達(dá)/產(chǎn)生。從這些核酸產(chǎn)生的重組多肽可以被單獨(dú)的分離或克隆并檢測(cè)所需活性?？梢杂弥亟M表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲或植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。將用于實(shí)施本發(fā)明的核酸可以用擴(kuò)增方法產(chǎn)生，所述方法在本領(lǐng)域是熟知的，包括例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、PCR(參見，例如，PCRPROTOCOLS,AGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS,ed.Innis,AcademicPress,N.Y.(1990)和PCRSTRATEGIES(1995),ed.Innis,AcademicPress,Inc.,N.Y.,ligasechainreaction(LGR)(參見，例如，Wu(1989)Genomics4:560;Landegren(1988)Science241:1077;Barringer(1990)Gene89:117);轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見，例如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173);禾口，自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(參見，例如，Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874);Qg復(fù)制酶擴(kuò)增(Q-betareplicaseamplification)(參見，例如Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477-1491)，自動(dòng)QP復(fù)制酶擴(kuò)增分析(automatedQ-betareplicaseamplificationassay)(參見，例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes10:257-271)和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如，NASBA，Cangene,Mississauga,Ontario)?？蛇x地，可以經(jīng)公知的化學(xué)合成技術(shù)體外合成這些核酸，所述技術(shù)如，例如，在Adams(1983)J.Am.Cl想.Soc.105:661;Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25:34403444;Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19:373380;Blommers(1994)Biochemistry33:78867896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;美國(guó)專利4,458,066號(hào)中有所描述。修飾核酸的技術(shù)如，例如亞克隆、標(biāo)記探針(例如，用Klenow聚合酶進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記、切口平移、擴(kuò)增)、測(cè)序、雜交以及類似技術(shù)，在科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中詳細(xì)描述，參見，例如，Sambrook,ed.,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(2NDED.),Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,Ausubel,ed.JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1997);LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY:HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES,PartI.TheoryandNucleicAcidPreparation,Tijssen,ed.Elsevier,N.Y(1993)。獲得和操作用于本發(fā)明的方法的實(shí)踐中的核酸的另一有用方法是對(duì)基因組樣品進(jìn)行克隆，并且在需要的情況下，對(duì)從例如基因組克隆或cDNA克隆分離或擴(kuò)增出來的插入物進(jìn)行篩選和再克隆。用于本發(fā)明方法的核酸的來源包括基因組文庫或cDNA文庫，所述文庫包含在，例如，哺乳動(dòng)物人工染色體(MACs)，參見，例如，美國(guó)專利5,721,118、6,025,155;人類人工染色體，參見，例如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15:333-335;酵母人工染色體(YAC);細(xì)菌人工染色體(BAC);Pl人工染色體，參見，例如，Woon(1998)Genomics50:306-316;Pl-衍生載體(PACs)，參見，例如，Kern(1997)Biotechniques23:120-124;粘粒；重組病毒；噬菌體或質(zhì)粒中。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法中的任意一種進(jìn)行檢測(cè)、確認(rèn)和定量。檢測(cè)核酸和相應(yīng)蛋白質(zhì)的一般方法包括分析生物化學(xué)方法，如分光光度法、放射顯影術(shù)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、高擴(kuò)散色譜(hyperdiffosionchromatography),和類似方法，以及多種免疫學(xué)方法如液體或凝膠沉淀反應(yīng)(fluidorgelprecipitinreactions)、免疫擴(kuò)散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫分析(RIAs)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISAs)、免疫熒光分析、和類似方法。對(duì)核酸和多肽的檢測(cè)可以通過公知方法如Southern分析、northern分析、凝膠電泳、PCR、放射標(biāo)記、閃爍計(jì)數(shù)、和親和色譜。在本發(fā)明示范性方法的各個(gè)方面，使用具有酯酶活性的多肽，例如酯酶?？梢詰?yīng)用酯酶或酶(例如水解酶)或具有相似活性的其它多肽(例如，催化抗體或包括活性位點(diǎn)的肽)。篩選用于本發(fā)明的酶的任何方法均可以應(yīng)用，并且這些方法在本領(lǐng)域中是公知的，所述酶用于例如水解洛伐他汀、洛伐他汀酸、4-乙酰基新伐他汀或新伐他汀。例如，用來確定欲在本發(fā)明方法中應(yīng)用的酶的(多種酶)的一個(gè)示范性篩選條件組中，包括應(yīng)用2.5mM的底物、100mM的磷酸鹽緩沖液/共溶劑，pH7至pH8,30°C,48h,和下列組分(i)洛伐他汀或新伐他汀，溶于MTBE/緩沖液，(ii)洛伐他汀或新伐他汀，溶于甲苯/緩沖液，(iii)洛伐他汀酸或新伐他汀酸，溶于10%甲醇/緩沖液。篩選結(jié)果在lmM底物中中證實(shí)。應(yīng)用此示范性的分析確定出，具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6列出序列的三種酶，對(duì)于水解洛伐他汀或洛伐他汀酸是有活性的。僅具有SEQIDNO:4列出序列的酶顯示出水解新伐他汀的活性。在pH為9的10%MeOH/緩沖液中的25、50和lOOmM洛伐他汀酸中，進(jìn)一步評(píng)價(jià)SEQIDNO:4和SEQIDNO:2;為了方便，用更多的可溶洛伐他汀酸作為底物。在許多情形下，SEQIDNO:4顯示出對(duì)底物的高度轉(zhuǎn)化，溶液產(chǎn)量是12-60%的三醇酸。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(相同的總蛋白濃度，或相同的酶活性，用熒光底物甲基傘形酮丁酸鹽(MUB)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化)，比較包括酶編碼序列的基因組克隆，比較它們對(duì)洛伐他汀酸的水解作用，所述酶具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:2、SEQIDNO:6列出的序列(例如，分別由示范性的SEQIDNO:3、SEQIDNO:1和SEQIDNO:5編碼)。在反應(yīng)條件下，具有包括SEQIDNO:4的序列的酶修飾出了最佳活性。對(duì)包括酶編碼序列的基因組克隆進(jìn)行亞克隆，所述酶具有SEQIDNO:4和SEQIDNO:2列出的序列(例如，分別由示范性的SEQIDNO:3和SEQIDNO:1編碼)。SEQIDNO:2具有先導(dǎo)序列，認(rèn)為其對(duì)分泌/定位是必須的，對(duì)SEQIDNO:2進(jìn)行帶有和不帶有先導(dǎo)序列的亞克隆。對(duì)亞克隆進(jìn)行MUB和洛伐他汀酸分析；僅帶有先導(dǎo)序列的編碼SEQIDNO:2的亞克隆顯示出了對(duì)MUB的活性。并且，亞克隆均沒有對(duì)洛伐他汀酸顯示出活性。用包括編碼SEQIDNO:4的核酸的基因組克隆進(jìn)行的轉(zhuǎn)座子插入試驗(yàn)鑒定出了對(duì)洛伐他汀酯酶活性負(fù)責(zé)的基因。此基因編碼預(yù)測(cè)分子量是43KD的酯酶，通過從天然凝膠分離出該43KD條帶和證實(shí)對(duì)洛伐他汀酸的活性以及通過MS分析，進(jìn)一步證實(shí)其身份(identity)。包括編碼SEQIDNO:4的核酸的大腸桿菌構(gòu)建物能夠水解洛伐他汀，得到向三醇酸的93-98%的轉(zhuǎn)化，所述反應(yīng)在21小時(shí)、在35°C、在350mM底物的條件下發(fā)生。毛細(xì)管陣列本發(fā)明的方法，和/或欲在本發(fā)明方法中應(yīng)用的確定酶(多種酶)的篩選方案，可以全部或部分通過毛細(xì)管陣列來實(shí)施，如GIGAMATRIX,DiversaCorporation,SanDiego,CA。參見，例如W00138583。可以將試劑或多肽(例如酶)固定化或施加在陣列上，包括毛細(xì)管陣列。毛細(xì)管陣列提供了保持并篩選試劑、催化劑(例如酶)和產(chǎn)物的另一系統(tǒng)。該裝置可以進(jìn)一步包括排列在陣列中的相鄰毛細(xì)管之間的間隙物質(zhì)，和在間隙物質(zhì)中形成的一個(gè)或多個(gè)參照標(biāo)記。也可以將高通量篩選裝置進(jìn)行適應(yīng)性修改并用其實(shí)施本發(fā)明方法，參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)20020001809號(hào)?；谌?xì)胞的方法本發(fā)明方法可以全部或部分地在全細(xì)胞環(huán)境中實(shí)施。本發(fā)明也提供了對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的全細(xì)胞進(jìn)化或全細(xì)胞工程，以開發(fā)出具有新的表型的新細(xì)胞株，用于本發(fā)明方法，例如，包括本發(fā)明方法中應(yīng)用的一種、幾種或全部酶的新的細(xì)胞系。這可以通過修飾細(xì)胞的遺傳組分來進(jìn)行，其中所述遺傳組分是通過將核酸加入細(xì)胞而被修飾的，所述核酸例如本發(fā)明方法中應(yīng)用的酶的編碼序列。參見，例如，W00229032、WO0196551。"全細(xì)胞方法"中的宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何細(xì)胞，包括原核細(xì)胞、真核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。為了檢測(cè)本發(fā)明方法的中間產(chǎn)物或產(chǎn)物、或新表型的產(chǎn)量，通過代謝通量分析(MetabolicFluxAnalysis(MFA))，在細(xì)胞中以"實(shí)時(shí)"或"在線"時(shí)間范圍監(jiān)測(cè)細(xì)胞(或遺傳上修飾的細(xì)胞)中的至少一個(gè)代謝參數(shù)。在一個(gè)方面，許多細(xì)胞，如細(xì)胞培養(yǎng)物，被"實(shí)時(shí)"或"在線"監(jiān)測(cè)。在一個(gè)方面，許多代謝參數(shù)被"實(shí)日寸"或"在線"監(jiān)測(cè)。代謝通量分析(MetabolicFluxAnalysis)(MFA)是基于己知的生物化學(xué)構(gòu)架。根據(jù)質(zhì)量守恒定律和對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝物的準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)假設(shè)(pseudo-steadystatehypothesis(PSSH))，構(gòu)建了線性非依賴性代謝矩陣。在實(shí)施本發(fā)明方法中，確立了代謝網(wǎng)絡(luò)，包括對(duì)所有通路底物、產(chǎn)物和中間代謝物的鑒定對(duì)所有的使通路代謝物互變的化學(xué)反應(yīng)的鑒定，通路反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量，對(duì)催化反應(yīng)的所有酶的鑒定，酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，通路成分之間的調(diào)節(jié)性相互作用，例如，變構(gòu)作用、酶-酶相互作用等等，酶或酶的任何其它超分子組分的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室化，和任何濃度梯度的代謝物、酶或效應(yīng)分子或它們移動(dòng)的擴(kuò)散屏障的存在情況。—旦對(duì)特定細(xì)胞株確立了代謝網(wǎng)絡(luò)，可以導(dǎo)入經(jīng)矩陣概念進(jìn)行的數(shù)學(xué)表示(mathematicpresentation)，用以在可得到在線代謝物組(metalolome)數(shù)據(jù)吋，估計(jì)細(xì)胞內(nèi)代謝通量。代謝表型取決于細(xì)胞內(nèi)整體代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。代謝表型取決于針對(duì)環(huán)境條件、遺傳調(diào)節(jié)、發(fā)育狀態(tài)和基因型等產(chǎn)生的通路使用上的變化。在本發(fā)明方法的一方面，在線MFA計(jì)算之后，通過研究通路使用，分析細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為、它們的表型和其它性質(zhì)。在通路分析之后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的生理狀態(tài)的調(diào)控將變得可能。本發(fā)明方法可以幫助確定如何調(diào)節(jié)發(fā)酵，這是通過確定如何改變底物供應(yīng)、溫度、誘導(dǎo)物的使用等，來控制細(xì)胞的生理狀態(tài)，以沿著所需方向進(jìn)行來實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)施本發(fā)明方法中，MFA的結(jié)果也可以和轉(zhuǎn)錄物組(transcriptome)以及蛋白質(zhì)組(proteome)數(shù)據(jù)相比較，用以設(shè)計(jì)試驗(yàn)和方案，用于進(jìn)行代謝工程或基因改組等。代謝或生長(zhǎng)的任何一個(gè)方面都可以被監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)在本發(fā)明的一方面，基因工程的表型包括增加或減少細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)或在細(xì)胞中產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄物。此增加或減少的表達(dá)可以通過應(yīng)用熒光多肽來追蹤，例如，包括本發(fā)明方法中應(yīng)用的酶的嵌合蛋白質(zhì)。mRMA轉(zhuǎn)錄物或信息(messages)也可以通過本領(lǐng)域的已知方法來檢測(cè)和定量，包括，例如，Northern印跡、定量擴(kuò)增反應(yīng)、雜交于陣列、和類似方法。定量擴(kuò)增反應(yīng)包括，例如定量PCR，包括，例如定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或RT-PCR;定量實(shí)時(shí)RT-PCR，或"實(shí)時(shí)動(dòng)力RT-PCR"(real-timekineticRT-PCR)(參見，例如Kreuzer(2001)Br.J.Haematol.114:313-318;Xia(2001)Transplantation72:907-914)。在本發(fā)明的一方面，基因工程的表型是通過敲除表達(dá)同源基因產(chǎn)生的。基因的編碼序列或一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄控制元件可以被敲除，例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子。因此，轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)可以被完全去除或僅僅被降低。在本發(fā)明的一方面，基因工程的表型包括增加同源基因的表達(dá)。這可以通過敲除負(fù)向調(diào)控元件，包括順式或反式起作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，或通過誘變正向調(diào)控元件來實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^與陣列上的固定化核酸進(jìn)行雜交的方法，將包括細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物或代表一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物的核酸樣品或互補(bǔ)于一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物的核酸樣品進(jìn)行雜交，測(cè)定細(xì)胞中的一種或多種或所有轉(zhuǎn)錄物。監(jiān)測(cè)多肽、肽和氨基酸的表達(dá)情況在本發(fā)明的一方面，基因工程的表型包括在細(xì)胞中增加或降低多肽的表達(dá)或產(chǎn)生新的多肽。此增加或減少的表達(dá)可以通過應(yīng)用熒光多肽來追蹤，例如，包括本發(fā)明方法中應(yīng)用的酶的嵌合蛋白質(zhì)。多肽、試劑和終產(chǎn)物(例如，新伐他汀)也可以通過本領(lǐng)域的已知方法來檢測(cè)和定量，包括，例如，核磁共振(NMR)、分光光度法、放射顯影術(shù)(蛋白質(zhì)放射標(biāo)記)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、高擴(kuò)散色譜(hyperdiffusionchromatography)、多種免疫學(xué)方法例如免疫沉淀、免疫擴(kuò)散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫分析(RIAs)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISAs)、免疫熒光分析、凝膠電泳(例如，SDS-PAGE)、用抗體染色、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、熱解質(zhì)譜法、傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜、GC-MS和LC-電霧化以及加帽-LC-串聯(lián)-電霧化質(zhì)譜(cap-LC-tandem-electrospraymassspec加metries)和類似方法。也可以用美國(guó)專利6,057,103描述的方法或其變化來篩選新的生物活性。使用蛋白質(zhì)陣列，可以測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的多肽。確定序列同一性的程度在本發(fā)明任意一個(gè)方法的一方面，所述過程的至少一個(gè)步驟包括由水解酶(例如酯酶或?；D(zhuǎn)移酶)進(jìn)行的酶促反應(yīng)(例如，?；饔?，所述水解酶是由與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3禾口/或SEQIDNO:5具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71°/。、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，或序列完全(100%)相同的核酸編碼的，或其酶學(xué)上的活性片段(或可選地，可商業(yè)得到的水解酶)。在本發(fā)明任意一個(gè)方法的一方面，至少一個(gè)酶促反應(yīng)是由水解酶進(jìn)行的，例如酯酶或?；D(zhuǎn)移酶，具有和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，或序列完全(100%)相同的序列，或其酶學(xué)上的活性片段(或可選地，可商業(yè)得到的水解酶)?？梢杂靡阎桨富虼颂幟枋龅谋景l(fā)明方法，經(jīng)常規(guī)篩選，確定酶活性。例如，可以通過檢測(cè)多肽或肽是否能夠水解內(nèi)酯環(huán)或酶促地?；純?nèi)酯，來確定酶活性，如此處所述?？梢杂帽绢I(lǐng)域中已知的許多序列比對(duì)算法和程序中的任一個(gè)來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和/核酸序列同源性。這種算法和程序包括但決不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、禾BCLUSTALW(參見，例如，Pearson(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8):2444-2448;Altschul(1990)J.Mol.Biol.215(3):403-410;Thompson(1994)NucleicAcidsRes.22(2):4673-4680;Higginsetal.,MethodsEnzymol.266:383-402,1996;Altschuletal.,J.Mol.Biol.215(3):403-410,19卯；Altschuletal"NatureGenetics3:266-272,1993)。通常用序列分析軟件測(cè)定同源性或同一性(例如，SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison,WI53705)。這種軟件通過對(duì)各種刪除、取代和其它修飾指定同源性程度來匹配相似序列。術(shù)語"同源性"和"同一性"，在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的語境中，是指兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列是相同的，或者在比較窗(comparisionwindow)或指定的區(qū)域上進(jìn)行比較和比對(duì)得到最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列具有相同的氨基酸或核苷酸的具體百分?jǐn)?shù)，正如使用任何數(shù)目的序列比對(duì)算法或通過人工比對(duì)和肉眼觀察所測(cè)定。為了進(jìn)行序列比較，一個(gè)序列通常作為參照序列，檢測(cè)序列和所述參照序列相比較。當(dāng)應(yīng)用序列比對(duì)算法時(shí)，使檢測(cè)序列和參照序列進(jìn)入計(jì)算機(jī)，指定子序列的坐標(biāo)(subsequencecoordinates),如果需要，指定序列算法程序參數(shù)?？梢圆捎媚J(rèn)的程序參數(shù)，或可以指定備選參數(shù)。隨后，根據(jù)程序參數(shù)，序列比對(duì)算法計(jì)算出檢測(cè)序列相對(duì)于參照序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。如此處所用，"比較窗"包括參照由連續(xù)殘基數(shù)目中的任一數(shù)目構(gòu)成的片段。例如，在本發(fā)明的可選方面，在兩個(gè)序列被最佳聯(lián)配之后，將在本發(fā)明的示范性多肽或核酸序列的從約20個(gè)至全長(zhǎng)范圍內(nèi)任一處的連續(xù)殘基，和相同數(shù)目連續(xù)位置的參照序列相比較。如果參照序列和本發(fā)明的示范性多肽或核酸序列有必要的序列同一性，例如，與SEQIDNO:l、與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6有50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、8815/0、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，并且序列是水解酶或編碼水解酶，則可以將該序列用于本發(fā)明方法的至少一個(gè)步驟。在可選的實(shí)施方案中，在兩個(gè)序列被最佳聯(lián)配之后，將約20至600、約50至200和約100至150范圍的子序列和相同數(shù)目連續(xù)位點(diǎn)的參照序列相比較。用于比較的序列聯(lián)配方法是本領(lǐng)域公知的。可以通過下列算法進(jìn)行用于比較的序列最佳聯(lián)配，例如8!!1池&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性聯(lián)配算法，person&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444,1988的相似性方法搜索，這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,564462012840Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通過人工比對(duì)和肉眼觀察。除了BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchToolattheNationalCenterforBiologicalInformation),確定同源性或同一性的其它算法包括，例如，AL!GN、AMAS(多重比對(duì)序列分析(AnalysisofMultiplyAlignedS叫uences))、AMPS(蛋白質(zhì)多重序列比對(duì)(ProteinMultipleSequenceAlignmen切、ASSET(比對(duì)片段統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)工具(AlignedSegmentStatisticalEvaluationTool))、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物學(xué)序列比較分析終端(BiologicalSequenceComparativeAnalysisNode))、BLIMPS(BLocksIMProvedSearcher)、FASTA，Intervals&Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smkh-Waterman算法、DARWIN、LasVegas算法、FNAT(ForcedNucleotideAlignmentTool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(FristenskySequenceAnalysisPackage)、GAP(GlobalAlignmentProgram)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(SensitiveSequenceComparison)、LALIGN(LocalSequenceAlignment)、LCP(LocalContentProgram)、MACAW(MultipleAlignmentConstruction&AnalysisWorkbench)、MAP(MultipleAlignmentProgram)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-InducedMulti-sequenceAlignment)、SAGA(SequenceAlignmentbyGeneticAlgorithm)和WHAT-IF。這些比對(duì)程序也可以用來篩選基因組數(shù)據(jù)庫，用以鑒定具有基本上相同序列的多核苷酸序列。注釋有一些功能信息的含基因組信息的數(shù)據(jù)庫由不同的組織所維護(hù)，可以經(jīng)因特網(wǎng)得到。BLAST、BLAST2.0和BLAST2.2.2算法也用來實(shí)施本發(fā)明。它們?cè)诶鏏ltschul(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402、Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中有所描述。進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開得到。此算法首先涉及，通過鑒定待詢序列中W長(zhǎng)度的短字符，鑒定出高度得分序列對(duì)(HSPs);其在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長(zhǎng)度的字符串比對(duì)時(shí)，或是匹配于或是滿足了一些正值的閾分值T。T是指相鄰字符串得分閾值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul(1990)見上文)。以這些起始的相鄰字符串命中(neighboi'hoodwordhits)作為根據(jù)，開始搜索，以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)的HSPs。字符串命中沿著每一序列在兩個(gè)方向上延伸，直到累積的聯(lián)配分?jǐn)?shù)增加。對(duì)于核苷酸序列，累積分?jǐn)?shù)是用參數(shù)M來計(jì)算的(M為對(duì)一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)；通常>0)。對(duì)于氨基酸序列，用得分矩陣計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。在下列情況下，字符串命中(wordhits)在每一方向上的延伸被停止累積聯(lián)配分?jǐn)?shù)從其最大獲得值降低數(shù)量X;由于累積了一個(gè)或多個(gè)負(fù)記分殘基聯(lián)配，累積分?jǐn)?shù)達(dá)到0或更低；或到達(dá)了任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)應(yīng)用的默認(rèn)值是，字符串長(zhǎng)(W)為11、期望值(E)是10、M=5、N=-4以及比較兩條鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序應(yīng)用的默認(rèn)值是，字符串長(zhǎng)為3、和期望值(E)為10，和BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci,USA89:10915)比対(B)是50、期望值(E)為10、M=5、N=-4和比對(duì)兩條鏈。BLAST算法也對(duì)兩條序列的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如，Kai'lin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873)。BLAST算法提供的一種相似性測(cè)定方法是最低總概率(smallestsumprobability)(P(N))，這表明了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的概率。例如，如果在檢測(cè)核酸和參照核酸的比較中，最低總概率小于約0.2，更優(yōu)選地小于約0.01，最優(yōu)選地小于約0.001,則認(rèn)為該核酸和參照序列相似。在一方面，蛋白質(zhì)和核酸序列的同源性是用BasicLocalAlignmentSearchTool("BLAST")來評(píng)價(jià)的。例如，可以用5個(gè)特定的BLAST程序?qū)嵤┫铝腥蝿?wù)(1)BLASTP和BLAST3將氨基酸待詢序列和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫相比較；(2)BLASTN將核苷酸待詢序列和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫相比較；(3)BLASTX將待詢核苷酸序列(兩條鏈)的六框架概念上的翻譯產(chǎn)物與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫相比較；(4)TBLASTN將待詢蛋白質(zhì)序列和在所有六個(gè)閱讀框(兩條鏈)中翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫相比較；和(5)TBLASTX將核苷酸待詢序列的六框架翻譯產(chǎn)物和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的六框架翻譯產(chǎn)物相比較。BLAST程序通過鑒定相似片段來鑒定同源序列，這被稱作在待詢氨基酸或核酸序列與檢測(cè)序列之間的"高度匹配的片段對(duì)(high-scoringsegmentpairs)"，所述檢測(cè)序列優(yōu)選地得自蛋白質(zhì)或核酸序列數(shù)據(jù)庫。高得分片段對(duì)(high-scoringsegmentpairs)優(yōu)選地通過記分矩陣方法被鑒定出來(即被比對(duì)出來)，許多記分矩陣方法是已知的。優(yōu)選地，應(yīng)用的記分矩陣是BLOSUM62矩陣(Go畫tetal.,Science256:1443-1445,1992;HenilsoffandHenilcoff,Proteins17:49-61,1993)。較不優(yōu)選地，也應(yīng)用PAM或PAM250矩陣(參見，例如，SchwartzandDayhoff,eds.,1978,MatricesforDetectingDistanceRelationships:AtlasofProteinSequenceandStructure,Washington:NationalBiomedicalResearchFoundation)。在本發(fā)明的一方面，應(yīng)用NCBIBLAST2.2.2程序，這是blastp的默認(rèn)選項(xiàng)。BLAST2.2.2程序中有約38個(gè)設(shè)置選項(xiàng)。在本發(fā)明的此示范性方面，除了默認(rèn)濾過設(shè)置之外，應(yīng)用所有的默認(rèn)值(即，除了將濾過設(shè)置為關(guān)閉之外，將所有參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值)；在其位置上，應(yīng)用"-FF"設(shè)置，這使得不能濾過。應(yīng)用默認(rèn)的濾過通常導(dǎo)致Karlin-Altschul干擾，其原因是序列的短長(zhǎng)度。用于本發(fā)明的此示范性方面的默認(rèn)值包括"對(duì)低復(fù)雜性濾過(Filterforlowcomplexity):ON字符串長(zhǎng)度(WordSize):3矩陣Blosum62空位罰分(GapCosts):(空位存在)existence:11空位延伸(extension):1"其它的默認(rèn)設(shè)置可以是對(duì)低復(fù)雜性濾過OFF,對(duì)蛋白質(zhì)的字符串長(zhǎng)度為3，BLOSUM62矩陣，空位存在罰分為-11和空位延伸罰分為-1。示范性NCBIBLAST2.2.2程序設(shè)置的"-W"選項(xiàng)默認(rèn)為0。這意味著，如果未加設(shè)置，蛋白質(zhì)的字符串長(zhǎng)度默認(rèn)為3，核苷酸的字符串長(zhǎng)度默認(rèn)為11。參照下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明；然而，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1:化學(xué)酶促地生產(chǎn)新伐他汀下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，例如，用于化學(xué)酶促地生產(chǎn)新伐他汀。洛伐他汀的酶促水解在7-10%MeOH/緩沖液中的濃度是0.1至0.5M的洛伐他汀或洛伐他汀酸中，評(píng)價(jià)具有SEQIDNO:4(由SEQIDNO:3編碼)序列的酶，通過自動(dòng)加入堿，將反應(yīng)維持在pH9-9.5進(jìn)行。例如，在500ml規(guī)模上，在0.5M洛伐他汀中，用含有14mg/ml總蛋白的酶SEQIDNO:4(來自裂解細(xì)胞的離心上清液)凍干制備物，在48小時(shí)之后觀察到底物的完全轉(zhuǎn)化。使反應(yīng)混合物酸化(pH2)，離心收集沉淀并使之干燥。用iPrOAc萃取濾液，將有機(jī)相萃取物加入干燥濾餅。加熱得到的懸浮液，在Dean-Stark儀器中回流，直至內(nèi)酯化作用完成。將得到的溶液濾過硅藻土墊(Cditepad),用飽和(satd.)NaHC03洗滌濾液。濃縮得到的iPrOAc溶液直至(x0.5)，用己垸稀釋并冷卻至0"C。過濾沉淀出的固體并空氣干燥，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯(63g，79.5%分離產(chǎn)率；其它10.3g產(chǎn)物在各種洗滌液和母液中得到鑒定)。產(chǎn)物含有<1%的洛伐他汀。二醇內(nèi)酯的酶促酰化在室溫下振蕩二醇內(nèi)酯(25mM)、乙酸乙烯酯(250mM)和南極洲假絲酵母(Om^Waa"tor"/cfl)月旨肪酶B(33mg)在TBME(lml)中的混合物。44小時(shí)之后，HPLC表明形成了單乙酸酯，轉(zhuǎn)化率是60%。制備乙?；路ニ≡谑覝刂?，真空下，過夜干燥4-乙?；鶅?nèi)酯，在氮下儲(chǔ)存，然后在氮下室溫中溶解于無水二氯甲垸中(lg/2.5-3ml的比值)。同時(shí)，在最小量的乙腈中室溫下溶解Cu(OTf)2(5moP/。)，隨后向溶液中加入1.05-1.2當(dāng)量的二甲基丁酸酐，室溫下攪拌30分鐘至1小時(shí)。在氮?dú)夥障拢谑覝叵?，將此Cu(OTfV酸酐溶液通過注射器轉(zhuǎn)移到4-乙?；鶅?nèi)酯溶液中，同時(shí)攪拌。當(dāng)完成時(shí)(HPLC監(jiān)測(cè))，通過加入水淬滅(quench)反應(yīng)，用飽和NaHC03洗滌。分離的有機(jī)層經(jīng)Na2S04干燥，過濾并蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物4-乙?；路ニ?〉99)。乙?；路ニ〉拿复偎?.22g乙?；路ニ?終濃度為350mM);2mlMeOH;10(^14MTris;9.9mlzK;8ml酯酶(SEQIDNO:4，由例如SEQIDNO:3編碼)，水中的125mg/ml凍干裂解物。反應(yīng)在帶有頂部攪拌和磁力攪棒的25ml容器中進(jìn)行。pH穩(wěn)態(tài)條件(pH-statconditions)是由DasGipSTIRRER-PRO⑧系統(tǒng)維持的；pH值7是通過加入10XNH40H維持的。轉(zhuǎn)化率接近75%時(shí)，加入4ml的甲苯使物質(zhì)溶解。使反應(yīng)過夜進(jìn)行，此時(shí)加入另外的溶劑(甲苯或二氯甲烷)以確保所有的不溶性物質(zhì)被溶解。反應(yīng)的最終組分是新伐他汀酸4.7%，新伐他汀90.9%，乙?；路ニ?.9%，推斷的新伐他汀消除產(chǎn)物是3.5%。最終的轉(zhuǎn)化率是95.6%。實(shí)施例2:洛伐他汀酯酶分析在一方面，本發(fā)明提供了方法，包括用水解酶，例如，本發(fā)明的酶，例如SEQIDNO:3編碼的SEQIDNO:4，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸。在一方面，本發(fā)明提供了方法，包括酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生新伐他汀。下列例子描述了示范性的洛伐他汀酯酶分析，可以用其來實(shí)施本發(fā)明方法。例如，該示范性分析可以用來確定是否可以用水解酶例如酯酶來實(shí)施本發(fā)明方法。(a)細(xì)胞裂解(分析級(jí))從B-PER(4.5L)(Pierce，#78248)、溶菌酶(200)iL)(Sigma，L-6876;貝亡存液10mg/ml)和DNaseI(40pL)(Sigma，DN-25;IC存液5mg/mL)，制備冰冷裂解液(足夠用于9個(gè)樣品)。同時(shí)，通過在950pL水中漩渦振蕩并以16,000g在4。C離心15分鐘，重懸浮50)aL的培養(yǎng)物。通過移液管吹打，將得到的細(xì)胞沉淀重懸浮在500nL裂解液中。在進(jìn)行活性分析之前，將樣品在冰上溫育45分鐘。(b)總蛋白定量蛋白質(zhì)定量可以通過基于考馬斯染料的任何分析，用Bradford法進(jìn)行；此時(shí)應(yīng)用的試劑盒是CoomassiePlusProteinAssayKit(Pierce,#23236)。按制造商的指南使用(可以從Pierce,Doc#0229得到)。將感興趣的蛋白質(zhì)溶液稀釋到同時(shí)測(cè)定的已知蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(白蛋白)的線性范圍內(nèi)。得知蛋白質(zhì)的濃度后，計(jì)算合適的稀釋度，以允許合理地吸取O.l微克的總蛋白(g卩，在2至20pL范圍)。(c)酶活性甲基傘形酮丁酸鹽(MUB)水解使O.lpg總蛋白成為25pL，帶有50mMTris-HClpH9緩沖液(緩沖型/pH是可變的)，置于96孔板中。同時(shí)制備4mMMUB(9.8mg，在10mLDMSO中)儲(chǔ)液并分配在400nL的等分試樣中，在-2(TC存儲(chǔ)。將貯存液稀釋至20(^M的工作濃度400jaL，溶于pH7.0的7.6mL10mMHEPES緩沖液。在動(dòng)態(tài)地在300秒期間閱讀熒光板讀數(shù)器(SPECTRAMAXGEMINIXS:ex=360nm;em=465nm)之前即刻，向25pL樣品中加入工作MUB液。工作液可以在4"C存儲(chǔ)幾天，而后發(fā)生降解。優(yōu)選地，在每次分析之前，使等份DMSO貯存液解凍，并制備新鮮的工作液。SEOIDNO:4(100g水平)對(duì)洛伐他汀的水解包括將洛伐他汀酶促水解為三醇酸的本發(fā)明示范性反應(yīng)示例于圖18E中。1.將洛伐他汀(10xl0g，0.25mol)和水(13xl0mL)按交替的部分緩慢加入快速攪拌的MeOH(35mL，終體積是7%)和6MNaOH(43mL，0.26mol)的混合物中，混合物在配備有頂部攪棒攪拌器(overheadpaddlestirrer)的1L的3-頸燒瓶中。2.當(dāng)?shù)玫骄嗷旌衔飼r(shí)，在35'C下攪拌該混合物，直至pH值降至8(大約2小時(shí))，洛伐他汀因而轉(zhuǎn)化為洛伐他汀酸。3.同時(shí)將凍干的酶(22.64g)和水重新結(jié)合(終體積是180mL)。將4MTris(4mL)和重新結(jié)合的酶溶液加入洛伐他汀酸溶液。加入水(108mL)使體積成為500mL，隨后進(jìn)行pH調(diào)控。4.用DASGIPAG-PRO⑧生物反應(yīng)器，用30%的NH4OH維持pH為9.5，來控制反應(yīng)。攪拌反應(yīng)物48小時(shí)(備注1，如下)并維持在35C定期移去等分試樣(10pL，在990pLMeOH中淬滅)，經(jīng)HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(備注2，如下)。5.轉(zhuǎn)移至4L燒杯中并用水稀釋(1L)，使反應(yīng)終止。用6MHCL調(diào)節(jié)混合物的pH值。在pH4.4時(shí)，混合物變得非常粘，同時(shí)沉淀出白色固體，使攪拌速度增加以防止混合物"凝膠化"。用總量120mL的6MHCL將混合物調(diào)節(jié)為pH2.5并再攪拌0.5小時(shí)。6.將得到的槳液通過21cmBuchner漏斗上的Whatman#1濾紙而過濾，用水(0.5L)洗滌潮濕的濾餅。使潮濕的濾餅在空氣中干燥1小時(shí)；隨后將其轉(zhuǎn)移到4x600mL的凍干瓶中，并在凍干機(jī)上干燥48小時(shí)，產(chǎn)生淺白色的粉末(98.6g)(備注3，如下)。7.將濾液分為三等份，用單份EtOAc(500mL)萃取。盡管第一次萃取分離得容易，但第二和第三份形成乳液，所述乳液甚至在用飽和NaCl(100mL)處理后，也沒有完全分離。用飽和("satd")NaC1(100mL)洗滌EtOAc萃取物，干燥0%2804)并過濾。在N2下攪拌濾液，在5分鐘期間滴加溶于EtOAc(5mL)中的MeS03H溶液(0.2mL，3.1mmol;終濃度是~7mM)。4.5小時(shí)之后，用飽和NaHC03(200mL)、水(100mL)和飽和NaCl(100mL)洗滌反應(yīng)液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將EtOAc層濃縮至50mL，緩慢滴加已烷(200mL)，沉淀出二醇內(nèi)酯。經(jīng)過濾和干燥收集沉淀的固體(3.36g，純度是81.3%);另外0.26g殘留在母液中。8.確定總產(chǎn)率是94.9%(參見備注4，如下)。備注1.HPLC表明，100g水平的反應(yīng)在22小時(shí)之后完成了97。/。，但常常攪拌反應(yīng)較長(zhǎng)吋間，以確保完全水解，2.樣品是在配備有DAD的Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSB-苯基柱(4.6x75mm)(45。/。MeCN/0.P/。H3PO4等度(isocratic);lml/min;30°C;238nm)分析的。洗脫的順序是三醇酸1.4分鐘，二醇內(nèi)酯1.9分鐘，洛伐他汀酸3.8分鐘，洛伐他汀7.3分鐘。3.此階段的濾餅由粗三醇酸和沉淀出的蛋白質(zhì)組成。4.計(jì)算出的產(chǎn)物的總產(chǎn)量顯示在表中5.<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>w由！HNMR分析，與內(nèi)標(biāo)甲基甲酸比較。*由HPLC分析，與工作標(biāo)樣比較。SEQIDNO:4(150g水平)對(duì)洛伐他汀的水解1.將洛伐他汀(150g，0.37mol)和水(300mL)按交替的部分緩慢加入快速攪拌的MeOH(52.5mL)和50%w/wNaOH(30niL，0.57mol)的混合物中，混合物在配備有頂部攪棒攪拌器的1L的3-頸燒瓶中。室溫下攪拌反應(yīng)物過夜，然后用濃縮HCl(25mL)將澄清的混合物酸化至pH7-8(備注1,如下)。2.將SEQIDNO:4(17g)和水重新結(jié)合(50mL水)并將其加入反應(yīng)。再加入一份水水(300mL)，使反應(yīng)總體積為750mL。3.用DASGIPAGFEDBATCH-pro⑧生物反應(yīng)器，用30%的NH4OH維持pH為9.5，來控制反應(yīng)。攪拌反應(yīng)物并維持在35°C，定期移去等分試樣(10pL，在990pLMeOH中淬滅)，由HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(備注2，如下)。4.86.3小時(shí)之后，HPLC表明，殘留~1%的洛伐他汀酸并且反應(yīng)被終止。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至4L燒杯中，用水(1L)稀釋并劇烈攪拌。用6MHCL(160mL)使混合物酸化至pH值2.5，室溫下再攪拌1.5小時(shí)。5.將得到的漿液通過19cmBuchner漏斗上的Whatman#1濾紙而過濾，用水(0.5L)洗滌潮濕的濾餅?；旌衔锶菀椎貫V過，得到奶白色的濾餅和金黃色的濾液。使潮濕的濾餅在空氣中干燥1小時(shí)；隨后將其轉(zhuǎn)移到4x600mL的凍干瓶中，并在凍干機(jī)上干燥，產(chǎn)生淺白色的粉末(154.8g)(備注3，如下)。6.將濾液分為三等份，用單份的EtOAc(600mL)萃取。用飽和NaCl(lOOmL)洗滌EtOAc萃取物、干燥(Na2S04)、過濾并濃縮為250mL。在N2下攪拌濾液，在5分鐘期間滴加溶于EtOAc(4mL)中的MeS03H溶液(0.2mL，3.1mmol;終濃度是15mM)。70分鐘之后，用飽和NaHCO3(200mL)和飽和NaCl(50mL)洗滌反應(yīng)液。使EtOAc溶液保持過夜、輕輕倒出并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至120mL。緩慢滴加已烷(200mL)，沉淀出二醇內(nèi)酯。過濾和干燥沉淀的固體(3.22g，純度是92.3%);另外0.47g殘留在母液中。7.確定總產(chǎn)率是98.9%(參見備注4，如下)。計(jì)算出的產(chǎn)物的總產(chǎn)量顯示在下面的表中:<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>#由'HNMR分析，與內(nèi)標(biāo)甲基甲酸比較。*由HPLC分析，與工作標(biāo)樣比較。實(shí)施例3:4-乙?；純?nèi)酯的合成本發(fā)明提供了合成4-乙?；純?nèi)酯的合成方法，如圖18A所示例。A.直接乙?；妓酧0g水平)1.在N2下，將粗提的三醇酸(25.82g，59.1mmol)(備注1，如下)裝進(jìn)干燥的500mL圓底燒瓶中，隨后加入干燥CH2Ch(200mL)。在N2下，室溫下磁力攪拌該漿狀混合物。加入DMAP(1.08g，8.8mmol;15mol%)，隨后通過注射泵在8.5小時(shí)期間緩慢加入乙酸酐(15.8mL，共2.8當(dāng)量)。在7.75小時(shí)，再加入一份DMAP(0.36g，2.9mmol)(備注2，如下)。2.用HPLC密切監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(備注3，如下)。3.11小時(shí)之后，加入水(5mL)淬滅反應(yīng)，在工作前使混合物儲(chǔ)存在-2(TC。使混合物濾過硅藻土墊以去除不溶物質(zhì)，用CH2Cl2洗滌硅藻土墊。隨后，用5%HC1(100mL)、H20(50mL)、飽和NaHC03(3x100mL)和飽和NaCl(lOOmL)洗滌濾液，干燥(Na2S04)并過濾。隨后濃縮濾液(去除150mL)，加入EtOAc(100mL)并進(jìn)一步濃縮至60mL。4.伴隨著快速攪拌，在5分鐘期間加入己烷(420mL)。過濾收集沉淀出的產(chǎn)物，用巳烷(100mL)洗滌并在真空下干燥，得到白色固體(17.4g，81.2%)(備注4、5，如下)。1.經(jīng)'HNMR分析，用甲基甲酸作為內(nèi)標(biāo)，確定三醇酸的純度是77.5%;其余的物質(zhì)是沉淀的蛋白質(zhì)/凍干物質(zhì)。2.加入乙酸酐和DMAP的速度顯示在下面的表中。DMAP和乙酸酐加入的順序<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>3.樣品是在Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSBTm-笨基柱(4.6x75mm)(40%MeCN/0.5%AcOH梯度；lml/min;RT;238nm)分析的。梯度和洗脫順序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>4.還有2.20g(10.3。/。)乙酰基內(nèi)酯殘留在母液中，總產(chǎn)率是91.5%。5.HPLC百分面積顯示:二醇內(nèi)酯0.8%;4-乙?；鶅?nèi)酯98.5%;4,8-二乙酸酯0.2%，消除產(chǎn)物0.6%。B.直接乙?；妓?37g水平)1.應(yīng)用粗提的三醇酸(48.43g，111mmol)(純度77.45%)(備注1，如下)和DMAP(2.30g，18.8mmol;15mol%)，在無水CH2C12(375mL)中，如上述進(jìn)行反應(yīng)。在N2下，室溫下磁力攪拌漿狀混合物，并通過注射泵緩慢加入乙酸酐(34.6mL,3.3當(dāng)量)(備注2，如下)。2.在N2下，將三醇酸(2287-40，48.43g，77.45%)裝入1L的干燥燒瓶，隨后3.在8小時(shí)之后，加入水(5mL)淬滅反應(yīng)，攪拌10分鐘，在工作前使混合物儲(chǔ)存在-2(TC。使混合物濾過硅藻土墊以去除不溶物質(zhì)，用CH2Cl2洗滌硅藻土墊。隨后，用5%HC1(175mL)、H20(50mL)、飽和NaHC03(2x175mL，100mL)和飽和NaCl(175mL)洗滌濾液，干燥(Na2S04)并過濾。濃縮濾液(去除300mL)，加入EtOAc(200mL)并進(jìn)一步濃縮至110mL。4.伴隨著快速攪拌，在5分鐘期間加入己垸(450mL)。過濾收集沉淀產(chǎn)物，用已烷(50mL)洗滌并在真空下干燥，得到白色固體(31.5g，78.4%)(備注3、4，如下)。C.直接乙?；妓?150g水平)1.應(yīng)用粗提的三醇酸(154g)(備注1，如下)和DMAP(6.8g，55.7mmol;15mol%)，在無水CH2Cl2(lL)中，如上述進(jìn)行反應(yīng)。在N2下，機(jī)械攪拌反應(yīng)漿液，并通過注射泵緩慢加入乙酸酐(備注2，如下)。先使反應(yīng)保持在15°C1.5小時(shí)，隨后室溫下攪拌。2.在9.25小時(shí)之后，加入水(200mL)淬滅反應(yīng)，室溫下攪拌20分鐘，然后維持過夜。3.使反應(yīng)混合物通過硅藻土墊過濾，隨后，用CH2C12(2x250mL)洗滌。用5%HC1(500mL)和H20(500mL)按順序洗滌結(jié)合的濾液，隨后濃縮(去除1.2LCH2C12)。向殘余物中加入EtOAc(500mL)，再去除400mL溶劑。用飽和NaHC03(500mL)洗滌殘留溶液，然后和NaHC03/H20混合物(500mL飽和NaHC03，500mLH20，再按份加入167.2gNaHC03粉末)攪拌(備注3，如下)。4.兩層被緩慢地保持分離，用NaCl(250mL)洗滌有機(jī)層。干燥有機(jī)層(Na2SO4)、過濾并濃縮至500mL。5.伴隨著快速攪拌，在45分鐘期間向殘留物加入已垸(3.5L)。過濾沉淀產(chǎn)物并干燥，得到白色固體(95g，70.7%)(備注4、5，如下)。備注1.粗提的三醇酸是從150g洛伐他汀的水解分離出以及此前反應(yīng)的物質(zhì)。2.加入乙酸酐的速度顯示在下面的表中表加入乙酸酐的順序<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>3.乙酸和二甲基丁酸應(yīng)該被去除，以防止它們?cè)俅螀⑴c隨后的?；磻?yīng)。4.還有10.1g(7.5。/。)乙酰基內(nèi)酯殘留在母液中，它和約0.16%水洗滌的產(chǎn)物丟失相結(jié)合，代表從洛伐他汀的78.4%的總產(chǎn)率。5.HPLC百分面積顯示二醇內(nèi)酉旨0.9%;4-乙?；鶅?nèi)酯98.7%;4,8-二乙酸酯0.2%，消除產(chǎn)物0.1%。6.'HNMR(CDC13)d0.90(d,J=6.94Hz,3H)，1.19(d,,T=7.57Hz,3H)，1.27-1.41(m,1H)，1.45-1.60(m,2H)，1.76-1.95(m,6H)，2.09(s,3H)，2.10-2.13(m,1H),2.14-2.20(m,1H)，2.32-2.41(m,1H)，2.41-2.50(m,1H)，2.67-2.75(m,1H)，2.75-2.82(m,1H)，4.23(brs,1H)，4.54-4.63(m,1H)，5.22-5.28(m,1H)，5.53-5.58(m,IH)，5.77-5.83(m,1H)，5.99(d,J=9.46Hz,1H);13CNMR(CDC13)d13.98，21.07，23.82，24.19，27.40，30.82，32.95，33.39,35.40，35.83，36.50，38.77，65.34，65.61，76.51，128.51，130.14，131.29，133.60,168.90，170.02。D.直接乙?；妓醤50G水平)a.將粗提的三醇酸(151.21g，來自150g洛伐他汀)裝入2L的干燥燒瓶，隨后加入CH2C12(1.0L)。通過頂部機(jī)械攪拌器攪拌漿液并在室溫下保持過夜。b.加入一份DMAP(6.8g，基于150g洛伐他汀為15mol%)，隨后在20分鐘期間加入乙酸酐(157.6ml，4.5當(dāng)量)。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。c.3.5小時(shí)之后，加入水(IOOmL)淬滅反應(yīng)，在室溫下再攪拌3小時(shí)。使反應(yīng)混合物通過Whatman#1濾紙過濾，用CH2C12(2x250ml)洗滌濾餅。d.用5%HC1(500mL)和H20(500mL)按順序洗滌CH2C12，隨后將有機(jī)層濃縮為400ml并用EtOAc(500ml)稀釋。用飽和(satd.)NaHCO3(500ml)攪拌溶液，加入另外的NaHCO3(60g)以中和乙酸。用飽和NaCl(500ml)洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并過濾。將濾液濃縮至約100mL。伴隨著攪拌，迅速向殘留物加入已烷(500ml)。過濾沉淀產(chǎn)物并干燥，得到白色固體(112.6g，83.4%)(備注l、2，如下)。備注1.還有7.6g(5.7。/。)4-乙?；鶅?nèi)酯殘留在母液中，代表了從洛伐他汀的總產(chǎn)率是89.1%。2.HPLC百分面積顯示二醇內(nèi)酯0.9%;4-乙?；鶅?nèi)酯99.0%;4，8-二乙酸酉旨0.45%，消除產(chǎn)物0.53%。E.直接乙?；妓?150G水平)1.將粗提的三醇酸(158.4g，來自150g洛伐他汀)裝入2L的干燥燒瓶，隨后加入CH2C12(625mL)。通過頂部機(jī)械攪拌器攪拌漿液并在室溫下保持過夜。2.加入加入一份DMAP(6.8g，基于150g洛伐他汀為15mol%)，隨后在17分鐘期間加入乙酸酐(122.6ml，3.5當(dāng)量)。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。2.5小時(shí)時(shí)，再加入一份乙酸酐(35ml，1.0當(dāng)量)，隨后在3.5小時(shí)時(shí)加入Et3N(25.8ml，0.5當(dāng)量)(備注1，如下)。3.6.3小時(shí)之后，終止反應(yīng)，使之經(jīng)歷前述的同樣萃取操作。此時(shí)加入已垸沉淀出大塊產(chǎn)物。使固體在CH2Cl2(300mL)和EtOAc(300ml)中重新溶解，濃縮至約130mL。加入己烷(650mL)沉淀出產(chǎn)物，收集該產(chǎn)物并干燥，得到白色固體(107.24g，79.8%)(備注2、3,如下)。遞1.反應(yīng)在約60%轉(zhuǎn)化時(shí)停止，加入Et3N協(xié)助乙?；?。2.還有10.7g(8.0。/。)4-乙酰基內(nèi)酯殘留在母液中，代表了從洛伐他汀的總產(chǎn)率是87.8%。3.HPLC百分面積顯示二醇內(nèi)酯0.6%;4-乙酰基內(nèi)酯97.9%;4,8-二乙酸酯0.6%，消除產(chǎn)物0.9%。圖18B說明了4-乙?；鶅?nèi)酯的結(jié)構(gòu)，相應(yīng)的二乙酸酯結(jié)構(gòu)和消除產(chǎn)物。實(shí)施例4:4-乙酰基新伐他汀的合成下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，例如，4-乙?；路ニ〉暮铣?，如圖18C所示例。A.三氟化硼醚合物催化1.在2L的雙頸燒瓶(備注l)中，使4-乙酰基內(nèi)酯(110g，0.3mol)在真空下(0.1托)干燥過夜。2.在N2下，將干燥的原料室溫溶解在無水CH2C12(875mL)中。3.如下制備催化劑。在N2下，在手套袋(glovebag)中將2,2-二甲基丁酸酐(7.1mL，30.3mmol)加入無水乙腈(125mL)，隨后加入剛打開的BF3.OEt2(3.1mL，24.3mmol;8mol。/。)(備注2、3)。4.將2,2-二甲基丁酸酐(78mL，0.33mol;1.1當(dāng)量)加入4-乙?；鶅?nèi)酯溶液，將混合物加熱至40°C10分鐘(備注4)。隨后經(jīng)導(dǎo)管加入BF3.OEt2的MeCN溶液(備注5)。使反應(yīng)避光，在4(TC攪拌并由HPLC監(jiān)測(cè)。5.5.5小時(shí)后，判斷反應(yīng)完成，使反應(yīng)物在冰浴中冷卻至5'C。加入飽和NaHC03250mL)，同時(shí)劇烈攪拌。分離水相層，用CH2Cl2(200mL)萃取。6.合并有機(jī)萃取物，干燥(Na2S04)、過濾并在低壓下濃縮。向濃縮物中加入MeOH(200mL)(備注6);更多MeOH的去除造成4-乙酰基新伐他汀沉淀。將白色固體過濾、用冷的MeOH(100mL)洗滌并在真空下干燥(92.8g)。7.將母液濃縮至大約一半體積，在-l(TC冷卻過夜。如果通過過濾收集產(chǎn)物(17.2g)并干燥，將第二次收獲到產(chǎn)物(備注7)。8.HPLC圖顯示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>1.原料應(yīng)該被研磨成粉末。以有助于去除大塊中可能帶有的乙酸。殘留的乙酸會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生4,8-二乙酸酯。在升高的溫度下真空干燥，可能引起分解。4-乙?；鶅?nèi)酯在40'C真空干燥時(shí)變成黃色。2.由于反應(yīng)對(duì)濕氣的存在是敏感的，因此起初將過量的酸酐加入乙腈，用以清除任何殘留的水。預(yù)熱酸酐，乙?；鶅?nèi)酯從反應(yīng)容器中清除水。3.應(yīng)該將新打開的BF3.0Et2用在反應(yīng)中；以前打開過的試劑可能導(dǎo)致反應(yīng)緩慢或甚至不發(fā)生反應(yīng)。4.溶液必須在加入催化劑期間冷卻下來，否則產(chǎn)生芳香族副產(chǎn)物。5.CH2Cl2/MeCN比值是7:1。典型地，該比值是6:1禾卩9:1之間。反應(yīng)在MeCN中較快，但是產(chǎn)生的產(chǎn)物帶有較不希望產(chǎn)生的雜質(zhì)分布。6.MeOH應(yīng)該在粗產(chǎn)物凝固之前加入，否則其難于在MeOH中重新溶解。在熱的甲醇中溶解固體產(chǎn)物引起分解，并因此得到較低的產(chǎn)量。7.總的固體產(chǎn)量是110g(78.7%)。將最終的母液蒸發(fā)至干燥，與工作標(biāo)樣(workingstandard)比較，分析殘余物，顯示出還含有9.02g(6.8%)的產(chǎn)物。還有約2%的產(chǎn)物殘留在含水洗滌物中。參見圖18C。B.4-乙酰基新伐他汀的合成如上制備。4-乙酰基內(nèi)酯(111.6g,91%)第一次收獲86.2g第二次收獲U.6g總量97.8g，75.8%分析'HNMR99.8%(與作為內(nèi)標(biāo)的甲基甲酸比較)HPLC98,1%(與工作標(biāo)樣4-乙?；路ニ”容^)含水洗滌物含有約1.9%，還有約7%殘留在殘余物中，總產(chǎn)率是84.7%。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>C.4-乙?；路ニ〉暮铣扇缟现苽?。4-乙?；鶅?nèi)酯(107g，96%)第一次收集90.4g第二次收集12.7g總量97.8g，79.3%分析"HNMR99.2%(與作為內(nèi)標(biāo)的甲基甲酸比較)HPLC96.8%(與工作標(biāo)樣4-乙?；路ニ”容^)含水洗滌物含有約1.8%，還有約7%殘留在殘余物中，總產(chǎn)率是88.1%。HPLC圖顯示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>D.卩比卩定/DMAP法1.在真空下使4-乙?；鶅?nèi)酯(2.6g，7.2mmol)室溫下真空中干燥過夜，然后在氮?dú)夥障率覝厝芙庠跓o水吡啶中(6.0mL)，同時(shí)攪拌。加入DMAP(176mg，0.2當(dāng)量)的1.5mL無水吡啶溶液，在冰浴中冷卻該混合物。2.用注射泵在15分鐘期間滴加2,2-二甲基丁酰氯(7.72g，8當(dāng)量)。于0。C攪拌混合物約1小時(shí)，隨后室溫下攪拌1小時(shí)。3.在氮?dú)夥障?，?(TC加熱反應(yīng)混合物，用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。4-乙?；鶅?nèi)酯消耗之后(2天)，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移去吡啶。殘余物在EtOAc(20mL)和飽和NaCl(20mL)之間進(jìn)行分配。干燥有機(jī)層(Na2S04)、過濾并蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物(96.5%)。E.Cu(OTfb/(酸)酐法1.在真空下室溫干燥10.0g的4-乙?；鶅?nèi)酯(10.0g，27.6mmol)l小時(shí)，然后溶解于無水CH2C12(60mL)中并在氮?dú)夥障聰嚢琛?.同時(shí)，在密封的瓶中制備無水MeCN(7.0mL)中的Cu(OTf)2(0.5g，5mol%)和2,2-二甲基丁酸酐(7.15mL，30.5mmol)的溶液并在室溫下攪拌。3.使內(nèi)酯溶液冷卻至15°C。用注射泵滴加Cu(OTf)2和2,2-二甲基丁酸酐的溶液。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，并判定其在3.0小時(shí)內(nèi)完成。4.用水(20mL)淬滅反應(yīng)，并在CH2Cl2(100mL)和飽和NaCl(100mL)之間進(jìn)行分配。隨后用1M蘋果酸(50mL)和飽和NaC1(50mL)的混合物攪拌有機(jī)層10分鐘，隨后用飽和NaCl(100mL)攪拌。干燥有機(jī)層(Na2S04)、過濾并蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物(12.8g，重量產(chǎn)率>100%)(備注3、4)。1.HPLC的產(chǎn)物分布面積百分?jǐn)?shù)是4-乙?；路ニ?79.5%)，消除產(chǎn)物(12%)，二新伐他汀(2%)，未鑒定雜質(zhì)(6.5%)。2.柱層析之后，4-乙?；路ニ∫?3%被分離。認(rèn)為4-?；路ニ?duì)Si02層析的穩(wěn)定性有限。3.HPLC的產(chǎn)物分布面積百分?jǐn)?shù)是4-乙?；路ニ?92.5%)，消除產(chǎn)物(2.7%)，二新伐他汀(1.7%)，未鑒定雜質(zhì)(3.1%)4.柱層析之后，4-乙?；路ニ∫?1%分離。SEOIDNO:4對(duì)4-乙?；路ニ〉乃獗景l(fā)明也提供了方法，包括用水解酶水解4-乙?；路ニ?，例如，圖18D所示例。1.在25mL的三頸燒瓶中，將4-乙?；路ニ?3.68g，8mmol)在MeOH(2mL)中的溶液加入4MTris緩沖液(O.lmL)在水(9.9mL)中的混合物中。劇烈攪拌該漿液(磁力攪拌和頂部攪拌)并加熱至50°C。2.將SEQIDNO:4(lg凍干物質(zhì))溶解在水(8mL)中并加入到反應(yīng)混合物。3.用DASGIPFEDBATCH-PRO⑧系統(tǒng)，通過加入10%NH3水溶液，將pH維持在6.75，用加熱水浴將反應(yīng)溫度維持在5(TC。4.一旦反應(yīng)達(dá)到75%的轉(zhuǎn)化，加入甲苯(4mL)，目的是溶解產(chǎn)物和剩余原料。5.定期取出等分試樣(20pL，在980^LMeOH中淬滅)，用以通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(備注l，如下)。當(dāng)判斷反應(yīng)結(jié)束時(shí)，通過離心使反應(yīng)混合物澄清(45000xg，4°°C，25分鐘)，得到甲苯上層、水相澄清層和壓縮的固體沉淀。用HCl將澄清的水相層調(diào)節(jié)至pH2.5。觀察到絮狀沉淀。通過離心使混合物澄清(45000xg，4°°C，25分鐘)，形成另一個(gè)小的沉淀。6.通過HPLC檢測(cè)每一組分，將新伐他汀濃縮在有機(jī)相和沉淀物中。用二氯甲烷(100mL)萃取沉淀物，離心分離得到的乳液(45000x，4'C,25分鐘)。合并CH2Cl2層，干燥(Na2S04)并蒸發(fā)，得到黃色油狀物(3.05g，91%)(備注2，如下)。1.在Waters1100SeriesHPLC上，用ZorbaxSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(45%MeCN/0."/。H3PO4梯度，1ml/分鐘；RT;238nm)分析樣品。梯度和洗脫順序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>SEOIDNO:4對(duì)4-乙?；路ニ〉乃獗景l(fā)明也提供了方法，包括用酯酶水解4-乙酰基新伐他汀，例如，SEQIDNO:4的酯酶，參見圖18D。1.在配備有磁力攪拌棒和頂部攪拌器的2L的圓底燒瓶中，將4-乙酰基新伐他汀(96.6g，0.21mol)和SEQIDNO:4(20g)的混合物懸浮在10%MeOH(1L)中。劇烈攪拌混合物并在熱水浴中保持在60°C。2.用DASGIPFEDBATCH-pro⑧系統(tǒng)，通過加入10%NH3水溶液，將pH維持在7.5。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。3.24小時(shí)之后，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到4x250mL離心瓶中并以10,000rpm在4"離心15分鐘。將上清液輕輕倒出并棄去。沉淀物在水中(4x250mL)重懸浮，如前進(jìn)行離心。再次輕輕倒出上清液并將其棄去。4.將離心沉淀轉(zhuǎn)移至燒結(jié)的玻璃漏斗，除去過量的水。用丙酮(2xl50mL)潤(rùn)洗離心瓶，將丙酮轉(zhuǎn)移至漏斗。向漏斗中加入硅藻土(Celite)(10g)，磨碎混合物并吸干。5.用CH2C12(5x200ml)洗滌漏斗上的殘余物，每一次后進(jìn)行研磨，如果需要，再加入硅藻土。6.用飽和NaCl(100ml)洗滌合并的洗液，棄去水相層。干燥有機(jī)層(Na2S04)，過濾并將溶劑換為甲苯(2Q0ml)。7.向甲苯溶液加入已烷(600ml)，同時(shí)攪拌；加入約300ml之后，開始沉淀。過濾沉淀物并干燥，產(chǎn)生白色固體(69.9g，79.7%)。8.將母液冷卻至-20。C過夜，收集第二批新伐他汀(3.5g，4.0%)。實(shí)施例5:本發(fā)明的示范性合成過程下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，例如，從洛伐他汀合成新伐他汀的過程。步驟l:洛伐他汀水解本發(fā)明也提供了方法，包括從洛伐他汀生成三醇酸，如圖15A所示例。鑒定了新的洛伐他汀酯酶(序列如SEQIDNO:4列出和隨后的亞克隆)之后，努力的重點(diǎn)集中在產(chǎn)生可分級(jí)(scaleable)的酶促水解方法上。提出的新伐他汀方法的所需參數(shù)之一是，酶促反應(yīng)在高的底物加載量下進(jìn)行。起始的篩選和證實(shí)反應(yīng)是用洛伐他汀酸進(jìn)行的，原因是它的水溶性高。用洛伐他汀進(jìn)行的反應(yīng)慢得多，原因是洛伐他汀在水中的溶解度較低，特別是在較低的pH值(7-8)和高底物加載量時(shí)。溶解性的缺乏通過首先化學(xué)地原位打開內(nèi)酯環(huán)而被克服。因此，用1當(dāng)量的NaOH處理洛伐他汀在MeOH/水(反應(yīng)終濃度是7-10%MeOH)中的懸浮液，并攪拌混合物幾小時(shí)，直至洛伐他汀被轉(zhuǎn)化為更加可溶的洛伐他汀酸。當(dāng)完成開環(huán)時(shí)，將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至pH9.5，隨后加入酶，盡管在許多情況下，不必要對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，原因是pH在進(jìn)行開環(huán)時(shí)降低到可接受值。通過加入重構(gòu)成的酶溶液引發(fā)酶促反應(yīng)。隨后在35-4(TC攪拌混合物，通過自動(dòng)加入10-30%NH4OH，將pH保持在9.5不變。在這些條件下，通常在48小時(shí)處獲得洛伐他汀向三醇酸的>98%的轉(zhuǎn)化。接近結(jié)束時(shí)，反應(yīng)大大減慢。一系列的大規(guī)模水解的結(jié)果總結(jié)于表1中。表l:洛伐他汀水解<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>試驗(yàn)2和3顯示了異常的長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。在這兩種情況下，洛伐他汀內(nèi)酯開環(huán)是用大大過量的NaOH完成的，需要添加HCl將pH調(diào)回合適的范圍，用于進(jìn)行酶促反應(yīng)。此前觀察到，高的鹽濃度對(duì)酶促水解產(chǎn)生有害影響。而且，由于在其時(shí)的可利用性有限，初始的酶進(jìn)料(11%w/w)少于以前應(yīng)用的量；再加入幾份酶，使酶的總進(jìn)料達(dá)到17%w/w。用水稀釋反應(yīng)混合物并隨后將混合物酸化為pH約2，使反應(yīng)終止。在這些條件下，三醇酸、變性蛋白質(zhì)和其它培養(yǎng)基/細(xì)胞組分從溶液中沉淀出來。對(duì)于起始的小規(guī)模反應(yīng)，稀釋反應(yīng)物，用回流的iPrOAc使此混合物經(jīng)歷連續(xù)的液體萃取。在這些條件下，發(fā)生三醇酸內(nèi)酯化，二醇內(nèi)酯可以從濃縮的iPrOAc萃取物沉淀而容易地得到。對(duì)于大規(guī)模的反應(yīng)，通過過濾，分離沉淀的三醇酸/變性蛋白質(zhì)混合物，在濾餅仍然潮濕時(shí)，將其懸浮在iPrOAc中并使其經(jīng)歷共沸蒸餾，實(shí)現(xiàn)內(nèi)酯化。通過過濾，去除不溶的變性蛋白質(zhì)/細(xì)胞組分，通過濃縮和沉淀，分離出二醇內(nèi)酯。此方法在10-30g規(guī)模上的效果很好，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯，而無需純化三醇酸。然而，隨著反應(yīng)規(guī)模增加(50-100g)，共沸蒸餾需要對(duì)更濃縮的溶液進(jìn)行較長(zhǎng)的回流時(shí)間，以形成內(nèi)酯化。在這些條件下分離出的二醇內(nèi)酯的產(chǎn)量減少，并且產(chǎn)物被增加量的黃色油狀物所污染，估計(jì)是由于三醇酸或二醇內(nèi)酯的聚合引起的。在實(shí)驗(yàn)室中〉100g規(guī)模時(shí)，最方便的工作是稀釋和酸化酶反應(yīng)混合物。通過過濾收集不溶物質(zhì)并干燥此潮濕的濾餅；起初的凍干物用于干燥，但是對(duì)其它的試驗(yàn)，將濾餅在真空爐中30-40'C干燥。分析粗產(chǎn)物(在內(nèi)標(biāo)存在的情況下，進(jìn)行'HNMR)表明，其含有約78%的三醇酸，其余物質(zhì)是變性蛋白質(zhì)、細(xì)胞和培養(yǎng)基組分。過濾之后，可以用EtOAc萃取濾液，再回收約2%的產(chǎn)物。此物質(zhì)可以被分離，或是作為三醇酸或是內(nèi)酯化(7mMMeS03H)為二醇內(nèi)酯，并加入到下一步驟。步驟2:乙?；饔帽景l(fā)明也提供了方法，包括從三醇酸產(chǎn)生4-乙?；鶅?nèi)酯，如圖9A所示例。隨后的對(duì)此過程的改變，即(i)直接從三醇酸酰化為4-乙?；鶅?nèi)酯和(ii)改進(jìn)導(dǎo)入二甲基丁酸酯側(cè)鏈的條件，改進(jìn)了此過程。來自洛伐他汀水解步驟的粗產(chǎn)物含有三醇酸和變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞/培養(yǎng)基組分。將粗產(chǎn)物懸浮在CH2C12(10-15%w/v)中并在DMAP(0.15當(dāng)量)存在下，用三當(dāng)量(即3當(dāng)量)的乙酸酐處理。研究表明，4-乙?；鶅?nèi)酯8位的乙?；⑶铱梢院侠淼丶右钥刂?。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，典型地，在殘留<2%二醇內(nèi)酯時(shí)，終止反應(yīng)；此時(shí)產(chǎn)生<2%的二乙酸酯。可能產(chǎn)生一些消除產(chǎn)物，特別是在反應(yīng)物被攪拌過長(zhǎng)時(shí)期時(shí)。完成反應(yīng)之后，加入水淬滅反應(yīng)，通過硅藻土墊過濾，去除不溶物。用CH2Cl2洗滌該墊，用稀酸洗滌合并的濾液(用以去除DMAP)并用飽和NaHC03洗滌用以去除乙酸。在大規(guī)模上，發(fā)現(xiàn)更方便的是，在酸洗滌之后，將溶劑替換為EtOAc，以有助于用堿進(jìn)行隨后的洗滌。在堿萃取之后，使溶液干燥、過濾和濃縮。隨后加入已垸，導(dǎo)致4-乙酰基內(nèi)酯以白色固體沉淀出來。幾個(gè)較大試驗(yàn)的產(chǎn)量及產(chǎn)物分布總結(jié)于表2中。表2:三醇酸直接乙?；癁?-乙?；鶅?nèi)酯<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>1圓括號(hào)中的值包括母液中未回收的產(chǎn)物2圓括號(hào)中的值包括回收的第二次收獲的產(chǎn)物3也含有0.24%的4-乙酰基洛伐他汀，和0.5%的未知雜質(zhì)，時(shí)間是4分鐘時(shí)(步驟3:?；饔帽景l(fā)明也提供了方法，包括從4-乙?；鶅?nèi)酯產(chǎn)生4-乙酰基新伐他汀，如圖9B所示例(用，例如，2,2-二甲基丁酸酐)。催化劑的確定報(bào)道的引入新伐他汀側(cè)鏈的條件不適于過程的放大。反應(yīng)(i)在純吡啶中進(jìn)行，(ii)使用多達(dá)8當(dāng)量的2,2二甲基丁酰氯，和(iii)在升高溫度下需要幾天。在我們的控制下，從這種反應(yīng)條件分離出的產(chǎn)物以低產(chǎn)量得到，并且質(zhì)量差(2-乙酸基的消除是主要的問題)?？蛇x擇的溶劑/堿不改進(jìn)反應(yīng)。用二甲基丁酸酐作為?；瘎?，通過轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)ewis酸催化反應(yīng)，得到相當(dāng)大程度的改進(jìn)。檢測(cè)三氟甲基磺酸鉍(Bismuthtriflate)(Bi(OTf)3(已經(jīng)報(bào)道，(Bi(0Tf)3是使醇新戊酰化(pivaloylation)的有效催化劑)。此反應(yīng)較吡啶路線更加清潔。然而，(Bi(0Tf)3不能從商業(yè)途徑得到，并且難于從產(chǎn)物去除鉍殘?jiān)?。可以從商業(yè)途徑得到的三氟甲基磺酸銅(Cu(OTf)2)也有良好的效果，僅加入10%的催化劑和1.05當(dāng)量的二甲基丁酸酐，在室溫下就得到好的產(chǎn)物量。在此情況下，銅鹽的去除是一個(gè)問題。此時(shí)，我們已經(jīng)研究了一系列Lewis酸，研究它們催化二醇內(nèi)酯8位的區(qū)域選擇性?；苯赢a(chǎn)生新伐他汀的能力。在研究的>20例Lewis酸中，對(duì)鉍、銅、鈧、銦、鋁的三氟甲基磺酸鹽和TMSOTf以及BF3.0Et2，發(fā)現(xiàn)了活性。在相同條件下，Li、Mg、Zn、La、Pr、Sm、Yb的三氟甲基磺酸鹽沒有活性，三氟甲基磺酸吡啶鹽或咪唑鏡鹽也沒有活性，Bi、In或Sr的乙酸鹽也沒有活性。BF3.0Et2是?；?-乙?；鶅?nèi)酯的有吸引力的催化齊l」，原因是它可以便宜地得到。三氟化硼的其它各種加合物作為?；呋瘎┍粶y(cè)定。B&的THF加合物和二甲胺加合物均不是適合的Lewis催化劑。使用其它可以從商業(yè)得到的B&.溶劑化物也觀察到了活性，但是，由于它們不優(yōu)于BF3.OEt2，用醚合物進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。條件的優(yōu)化針對(duì)三氟甲基磺酸鹽和BF3醚合物催化的4-乙?；鶅?nèi)酯?；瑱z測(cè)一系列的溶劑和條件，如圖1所示例。最佳結(jié)果在CH3C12、MeCN、二氯乙烷或其混合物中得到。幾個(gè)BF3.0Et2催化的?；Y(jié)果總結(jié)于表3中，如圖2所示例。在存在更高比例MeCN時(shí)，反應(yīng)更快，但產(chǎn)量差(比較試驗(yàn)l、3)。用新鮮的BF3.0Et2觀察到更好的結(jié)果(比較試驗(yàn)1、2、6);BF3.0Et2在MeCN中的以前打開過瓶的BF3.0Et2(試驗(yàn)2)和預(yù)先等分的BF3.0Et2貯存液(試驗(yàn)6)的結(jié)果較差。最小的催化劑濃度是需要的；4moPX的催化劑得到不完全的反應(yīng)(試驗(yàn)4)。在所有反應(yīng)中，可以見到一些少量的雜質(zhì)。這些中的一些，例如，二乙酸酯或4-乙?；宸ニ〈嬖谟谄鹗嫉?-乙酰基內(nèi)酯中，或者是原料中雜質(zhì)的直接結(jié)果，例如，由二醇內(nèi)酯產(chǎn)生的二新伐他汀。通過從含水MeOH中沉淀出粗產(chǎn)物，可以大大降低大多數(shù)這些雜質(zhì)的水平；表4顯示了沉淀之前和之后，12g?；磻?yīng)產(chǎn)物的雜質(zhì)情況，如圖3所示例。20-100g水平的一系列反應(yīng)的產(chǎn)率顯示在表5中；表明了分離后的產(chǎn)率以及殘余物的位置和估計(jì)量。表5.4-乙酰基內(nèi)酯的?；Y(jié)果反應(yīng)4-乙酰時(shí)間分離含水部分3殘余物4總產(chǎn)率基內(nèi)酯1小時(shí)的固體2克克%克克％%121.0321.00.5L590.18226.1<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>條件4-乙?；鶅?nèi)酯10%w/v;BF3.OEt28mol%;40°C;5-9:1DCM/MeCN在從MeCN/水或單獨(dú)的MeCN沉淀之后含水洗液中物質(zhì)針對(duì)工作標(biāo)樣用HPLC分析測(cè)定濃縮后殘留在母液中；由NMR測(cè)定，針對(duì)內(nèi)標(biāo)步驟4:酶促脫乙酰作用本發(fā)明也提供了方法，包括將乙?；路ニ∞D(zhuǎn)化為新伐他汀，如圖9C所示例。在對(duì)4-乙?；路ニ∵M(jìn)行酶促脫乙?；?，需要克服兩個(gè)明顯的障石尋(i)原料4-乙?；路ニ『彤a(chǎn)物新伐他汀在水溶液中的不溶性，(ii)4-乙?；拿舾行裕湓趐H〉7時(shí)迅速發(fā)生消除。4-乙?；路ニ〉乃獗仨氃诮咏黳H7時(shí)進(jìn)行，在此時(shí)，不可能通過打開內(nèi)酯環(huán)增加溶解度，這和洛伐他汀的水解反應(yīng)不一樣。對(duì)于4-乙?；路ニ〉乃猓褂美缬蒘EQIDNO:3編碼的SEQIDNO:4，10mM底物被迅速水解，SEQIDNO:3是在大腸桿菌中克隆的酯酶基因。隨后在200mM的反應(yīng)提示出在46小時(shí)發(fā)生91-93%的轉(zhuǎn)化；4-氯乙酰基衍生物顯示出等同的轉(zhuǎn)化，而4-甲酰基衍生物在24小時(shí)完全反應(yīng)。盡管4-甲?；捎谄淙芙庑院头磻?yīng)性是引人注意的底物，但我們沒能開發(fā)出對(duì)它的有效合成。當(dāng)反應(yīng)在MTBE雙相系統(tǒng)中進(jìn)行時(shí)，全部三種衍生物的結(jié)果相似。許多反應(yīng)參數(shù)是用SEQIDNO:4來測(cè)定的。在pH8時(shí)開始水解，導(dǎo)致形成不可接受水平的消除產(chǎn)物，而用5^二隨烷作共溶劑或表面活性劑(0.P/。TritonX-100或Tween-20)得到不好的結(jié)果。盡管反應(yīng)速度在5(TC時(shí)大大增加，但由于反應(yīng)混合物變得越來越粘稠，所有的反應(yīng)通常在轉(zhuǎn)化約90%時(shí)停止。對(duì)于50mM底物時(shí)的雙相反應(yīng)，在這些條件下，應(yīng)用MTBE、二丁醚或甲苯為共溶劑，作用很好，而應(yīng)用氯化溶劑導(dǎo)致了可忽略不計(jì)的活性。如果水解在5(TC時(shí)開始，pH為7，存在10%的MeOH，可能在多達(dá)300-400mM時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。5-6小時(shí)之后，由于反應(yīng)物變得很粘，向反應(yīng)物中加入等量的甲苯。在這些條件下，觀察到幾乎全部轉(zhuǎn)化，消除達(dá)到最小。至此階段，所有的酶促反應(yīng)是用從新伐他汀制備而來的4-乙?；路ニ∵M(jìn)行的。從容易得到的新伐他汀制備此底物，使我們能夠在開發(fā)其它合成步驟的同時(shí)，進(jìn)行對(duì)最終酶促水解的初步研究。不幸的是，最初從洛伐他汀制備出的底物的質(zhì)量是不同的，這取決于應(yīng)用的Lewis酸催化劑和純化的程度。這些物質(zhì)導(dǎo)致結(jié)果顯著可變，起始的酶促脫乙酰的良好結(jié)果不能重復(fù)。4-乙酰基新伐他汀水解為新伐他汀的一組反應(yīng)的結(jié)果總結(jié)在表6中。在所有情況下，用10%MeOH和相同批次的酶(SEQIDNO:4-2)進(jìn)行反應(yīng)。圖20說明了將4-乙?；路ニ∷鉃樾路ニ。拖鄳?yīng)的消除產(chǎn)物以及酸。表6:4-乙酰基新伐他汀的酶促水解試驗(yàn)批次規(guī)模mM溫度pH時(shí)間克°c小時(shí)酸新伐他汀4-乙?；?%新伐他?。?2719-9310200507.0792合成的10200507.0431.390.86.61.31.593.91.13.53合成的20200507.07942719-9510200507.0453.892.703.53.095.50.51.05"5100507.0456"5200507.53375^"5200507.0458"5200457.0459"5200407.0221.495.32.70.62.594.81.6U1.596.11.40.91.394.23.60.942.756.70.610"10200507.51811"5200508.01812"5200507.0181.393.24.51.02.993.52.11.50.984.114.20.9*在24小時(shí)期間分4份加入的酶表6中的前兩次試驗(yàn)將水解從洛伐他汀制備(試驗(yàn)l)和從新伐他汀制備(試驗(yàn)2)的4-乙?；路ニ∠啾容^。在200mM時(shí)，與從新伐他汀(試驗(yàn)2)制備出的底物的43小時(shí)相比，底物2719-93的質(zhì)量明顯地差，需要79小時(shí)達(dá)到92%的轉(zhuǎn)化率。另一方面，與合成底物(試驗(yàn)3)的79小時(shí)相比，在200mM時(shí)，底物2719-95(試驗(yàn)4)在45小時(shí)時(shí)達(dá)到98%轉(zhuǎn)化率。底物2719-93的純度低，受到殘余的2,2-二甲基丁酸的污染并一致地得到不好的結(jié)果。盡管在低轉(zhuǎn)化率時(shí)，在2,2-二甲基丁酸存在下，沒有觀察到抑制效應(yīng)，但在高轉(zhuǎn)化率時(shí)，其可能對(duì)水解反應(yīng)速度的明顯降低負(fù)責(zé)。在20g規(guī)模時(shí)，來自新伐他汀的4-乙?；路ニ〗Y(jié)果不佳(比較試驗(yàn)2、3)。盡管此結(jié)果可能反映了攪拌大規(guī)模反應(yīng)中的問題，但此物質(zhì)比底物2719-95(試驗(yàn)4)的反應(yīng)慢得多。盡管消除產(chǎn)物由于可能作為Michael受體可能作為不可逆抑制物起作用，但當(dāng)反應(yīng)在消除產(chǎn)物存在下進(jìn)行時(shí)，在低濃度時(shí)沒有觀察到抑制效應(yīng)。用底物2719-95得到的結(jié)果得到了一致結(jié)果。反應(yīng)在100和200mM時(shí)(試驗(yàn)5、6)得到相似結(jié)果，這可能反映出了原料在反應(yīng)混合物中恒定的低溶解度。在pH為7時(shí)，在50。C觀察到了比40-45。C高的轉(zhuǎn)化率(試驗(yàn)7-9)。試驗(yàn)10-12表明，反應(yīng)在某些程度上是pH依賴性的，在pH7.5-8.0時(shí)觀察到比pH7時(shí)(85%)高的轉(zhuǎn)化率(94-96%)。這再次反映了底物在更堿性條件下的溶解度較高。然而，在較高pH下，轉(zhuǎn)化率的提高伴隨著新伐他汀酸水平的輕度增加。盡管更高的pH值增加反應(yīng)速度，但在到達(dá)pH8時(shí)，它不顯著增加消除的量。事實(shí)上，所有的反應(yīng)顯示出了<2%百分面積的消除產(chǎn)物，試驗(yàn)2和3除外；試驗(yàn)2、3的起始4-乙?；路ニ∫驯患s3.5%的消除產(chǎn)物所污染。對(duì)酶反應(yīng)的進(jìn)一步研究集中于試圖通過改變反應(yīng)溫度及pH值來縮短反應(yīng)時(shí)間。表7中的數(shù)據(jù)表明，可以通過在更高的溫度下操作，可縮短反應(yīng)時(shí)間，但是數(shù)據(jù)可能用于攪拌不同規(guī)模反應(yīng)的效果而復(fù)雜化(比較試驗(yàn)13-16)。然而，增加溫度和/或酸使產(chǎn)生的新伐他汀酸量增加，但通常地不使消除產(chǎn)物顯著增加(最高量見于6(TC和pH8(試驗(yàn)20))。在本實(shí)驗(yàn)室規(guī)模操作的情況下，新伐他汀酸損失在含水蒸汽中。然而，包括酸性操作的操作條件可能重新內(nèi)酯化為新伐他汀，同時(shí)捕獲這些物質(zhì)中的一些物質(zhì)。表7:4-乙?；路ニ〉乃鉁囟群蚿H的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在表7中，所有的反應(yīng)在200mM下進(jìn)行*-批次-方法加入酶**-重復(fù)進(jìn)行最新的在100g規(guī)模上的試驗(yàn)(試驗(yàn)21)是在6(TC和pH7.5時(shí)進(jìn)行，結(jié)合磁力攪拌和頂部攪拌，以有效地混合反應(yīng)瓶中的內(nèi)容物。在這些條件下，在24小時(shí)之后，觀察到原料的轉(zhuǎn)化率為約98%。酶催化水解反應(yīng)對(duì)試驗(yàn)室規(guī)模(lab-benchscale)形成了挑戰(zhàn)。反應(yīng)混合物的過濾非常慢，這推測(cè)是由于沉淀的蛋白質(zhì)形成的過濾器中的污垢造成的。替代地，離心是將沉淀的新伐他汀從大量上清水溶液中分離出來的方便方法；大多數(shù)新伐他汀酸在此階段丟失。隨后用CH2Cl2消化濕的離心出的沉淀兩次，每次將上清液輕輕倒出。含有新伐他汀產(chǎn)物塊的合并的有機(jī)上清液被干燥、過濾，溶劑替換為甲苯。向此甲苯溶液中加入己烷并冷卻，造成新伐他汀沉淀。甚至在CH2C12消化之后，離心的沉淀仍含有顯著量的產(chǎn)物;推測(cè)CH2C12不能有效地進(jìn)入濕的離心沉淀和萃取出夾帶的產(chǎn)物。在一個(gè)示范性修改中(試驗(yàn)4，表8)，用丙酮和硅藻土處理離心沉淀，隨后過濾。隨后可以用CH2Cl2容易地萃取出硅藻土墊。隨后干燥合并的含水丙酮和CH2Cl2洗液，并將溶劑替換為甲苯。加入已垸使新伐他汀迅速沉淀，隨后過濾和干燥新伐他汀。冷卻母液至-20。C導(dǎo)致第二次分離產(chǎn)物；表8中的產(chǎn)量數(shù)據(jù)(圖4)是合并的第一次和第二次產(chǎn)物。本發(fā)明提供了從洛伐他汀生成新伐他汀的新的實(shí)施路線。在本發(fā)明的可選方面，該路線的突出特征包括i.應(yīng)用新的洛伐他汀酯酶，它可以在35'C和pH9.5時(shí)，在底物加入量是0.5M，在約48小時(shí)時(shí)，以99%的轉(zhuǎn)化率去除2-甲基丁酸酯側(cè)鏈。存在著通過增加反應(yīng)溫度來顯著提高反應(yīng)速度的可能性。示范了將粗三醇酸轉(zhuǎn)化為4-乙?；鶅?nèi)酯的單釜內(nèi)酯化/乙酰化反應(yīng)。常規(guī)得到從洛伐他汀的80%總產(chǎn)率，另有8-10%的潛在產(chǎn)物殘留在母液中。ii.發(fā)現(xiàn)了引入新伐他汀側(cè)鏈的新的和溫和的條件，其采用與二甲基丁酸酐的BF3.0Et2催化?；?。反應(yīng)始終地在約100g規(guī)模，在10%的底物加載量下進(jìn)行，提供了產(chǎn)率約80%的4-乙酰基新伐他汀。另有8-10%的潛在產(chǎn)物殘留在反應(yīng)殘留物中。iii.最終的步驟采用如第一步驟中應(yīng)用的相同的洛伐他汀酯酶，以去除敏感的乙?；a(chǎn)生新伐他汀。此反應(yīng)在20-100g規(guī)模上，在9%w/v底物加載量下進(jìn)行，在24-48小時(shí)顯示出98%的產(chǎn)率。實(shí)施例6:本發(fā)明的示范性過程下列實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，包括從洛伐他汀合成新伐他汀的方案。本發(fā)明提供了從洛伐他汀制備洛伐他汀酸，和從洛伐他汀酸制備三醇酸的方法，如圖16A或"步驟1"所示例。在此方面，方案實(shí)現(xiàn)了甲基丁酸酯側(cè)鏈的完全(>99%)去除。這是重要的，這是因?yàn)樵诜蛛x洛伐他汀和新伐他汀中存在的困難，和新伐他汀API中可允許的低洛伐他汀水平(為了完全(>99%)反應(yīng)，水解洛伐他汀的一些過程需要應(yīng)用高溫和長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間)。用水解酶(例如，如此處所述)使洛伐他汀在溫和條件下水解，導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)水解和8位上側(cè)鏈的完全去除。可以用于甲基丁酸酯側(cè)鏈的此酶促水解的示范性水解酶是酯酶SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)、SEQIDNO:6(由例如SEQIDNO:5編碼)禾口SEQIDNO:2(由例如SEQIDNO:1編碼)。SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)。每一酯酶序列被亞克隆并在不同的宿主中表達(dá)，并以不同規(guī)模發(fā)酵，包括200升(L)規(guī)模。洛伐他汀在酶促活性所需的含水條件下顯示出差的溶解度?？蛇x地，在一個(gè)方面，將洛伐他汀在水中的懸浮液的pH值升高到pH>12，實(shí)現(xiàn)內(nèi)酯環(huán)快速水解，導(dǎo)致原位產(chǎn)生更加可溶的洛伐他汀酸鹽。實(shí)際上，用1摩爾當(dāng)量的NaOH水溶液處理洛伐他汀在水/MeOH中的懸浮液，并攪拌直至完成溶解。然后將反應(yīng)混合物的pH值再次調(diào)節(jié)至適于酶促反應(yīng)的范圍并加入酶。在可選的方面，酶促水解條件可以被施用于直接從發(fā)酵肉湯提取出的洛伐他汀和/或洛伐他汀酸的混合物，或者可以將酶加入發(fā)酵肉湯并直接分離三醇酸。水解之后，謹(jǐn)慎地酸化反應(yīng)混合物，通過萃取和/或過濾分離三醇酸。一方面，直接在下一步中應(yīng)用三醇酸，或者在合適的結(jié)晶/沉淀步驟之后以固體形式分離出三醇酸。本發(fā)明提供了從三醇酸制備二醇內(nèi)酯的方法，如圖16B或"步驟2"所示例。一方面，通過在合適的溶劑中加熱，三醇酸被重新內(nèi)酯化，通過用傳統(tǒng)方法去除水，使平衡移向內(nèi)酯形式?？蛇x地，一方面，通過在合適的酸存在下攪拌，三醇酸被重新內(nèi)酯化。這也將導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)閉合。二醇內(nèi)酯可以在此階段被純化，通過從合適的溶劑(幾種溶劑)中結(jié)晶/沉淀來實(shí)施。本發(fā)明提供了從二醇內(nèi)酯制備酰化內(nèi)酯的方法，如圖16C或"步驟3"所示例。一方面，用具有所需活性和選擇性的酶，酶促地進(jìn)行對(duì)4'位羥基的區(qū)域選擇性?；?。?；男再|(zhì)可以變化，用以賦予合適的特性，例如，變?yōu)橐宜狨ヒ员闳菀兹コ?，變?yōu)楸郊姿狨ヒ栽鰪?qiáng)結(jié)晶度，變?yōu)榧姿狨ヒ栽鰪?qiáng)水溶解性。。在可選的方面，如圖16D所示例(步驟2和3，上述，合并)，在本發(fā)明方案的"簡(jiǎn)化變化"(telescopedvariation)中，內(nèi)酯化和4位內(nèi)酯的酰化在單釜中進(jìn)行。在堿(例如，DMAP)存在下用2當(dāng)量酸酐處理時(shí)，三醇酸首先經(jīng)歷內(nèi)酯化，隨后在內(nèi)酯的4-OH進(jìn)行選擇性?；?，產(chǎn)生4-?；鶅?nèi)酯。隨后通過從合適的溶劑(幾種溶劑)中結(jié)晶/沉淀，分離并純化產(chǎn)物。本發(fā)明提供了從?；鶅?nèi)酯制備?；路ニ〉姆椒?，通過例如，化學(xué)或酶促?；瘉磉M(jìn)行，如圖16E或"步驟4"所示。二甲基丁酸衍生物和合適?；呋瘎┑慕M合可以被用來引入所需的側(cè)鏈，例如，新伐他汀側(cè)鏈。雖然已經(jīng)描述了二甲基丁酰氯/二甲基氨基吡啶的組合，但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，條件苛刻，并產(chǎn)生了不可接受水平的副產(chǎn)物。與之對(duì)比，本發(fā)明的二甲基丁酸酐/路易斯酸(例如，三氟甲基磺酸鉍Bi(triflate)3、三氟甲基磺酸銅Cu(triflate)2)的組合BF3.Et20致使在室溫下快速反應(yīng)。對(duì)合適的路易斯酸和反應(yīng)條件(溫度，溶劑等)的篩選可以確定此?；磻?yīng)的最適條件?！矫?，酶催化的酰基內(nèi)酯的?；挥脕碓谑譁睾偷臈l件下(室溫-40'C，有機(jī)溶劑)，在8位導(dǎo)入二甲基丁酸酯基團(tuán)，而不產(chǎn)生副產(chǎn)物。本發(fā)明提供了從?；路ニ≈苽湫路ニ′@鹽和從新伐他汀銨鹽制備新伐他汀的方法，如圖16F或"步驟5"所示。最終的步驟需要選擇性去除4'位的?；?。4'位的?；鶎?duì)于堿催化的消除反應(yīng)高度敏感，這甚至是在僅輕度的堿性條件下。因此，酶促水解是區(qū)域選擇性去除此酰基的最方便的方法。證實(shí)了在步驟l(如上)中水解洛伐他汀的酯酶(SEQIDNO:4，例如由SEQIDNO:3編碼)也可以有效地催化內(nèi)酯4'位?；倪x擇性水解。在pH7處進(jìn)行時(shí)，酶促水解產(chǎn)生新伐他汀，其內(nèi)酯環(huán)基本上完整?？梢杂帽绢I(lǐng)域己知的任何分析來篩選、表征等等。例如，酶篩選可以應(yīng)用任何標(biāo)準(zhǔn)的HPLC和TLC分析，這些中的許多對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是己知的。下面描述了實(shí)施本發(fā)明方法的另一示例性方案和可選的條件。洛伐他汀向三醇酸的酶促水解(步驟1)在7-10%的MeOH/緩沖液中的0.1-0.5M濃度的洛伐他汀或洛伐他汀酸中，評(píng)價(jià)SEQIDNO:4(例如由SEQIDNO:3編碼)，其中通過自動(dòng)加入堿，將反應(yīng)維持在pH9-9.5。在500ml規(guī)模上，0.5M洛伐他汀時(shí)，用含有14mg/ml總蛋白的酶SEQIDNO:4(由SEQIDNO:3編碼)的凍干制備物(來自裂解細(xì)胞的離心上清液)得到了最佳結(jié)果；在48小時(shí)后觀察到底物完全轉(zhuǎn)化。三醇酸向二醇內(nèi)酯的內(nèi)酯化(步驟2)使反應(yīng)混合物酸化(pH2)，通過離心收集沉淀物并干燥。用iPrOAc萃取濾液，將有機(jī)萃取物加入干燥的濾餅。在Dean-Stark設(shè)備中，加熱得到的懸浮液至回流，直至完全內(nèi)酯化。使得到的溶液過濾通過硅藻土墊，用飽和(satd.)NaHC03洗滌濾液。濃縮得到的iPrOAc溶液，直至(x0.5)，用已垸稀釋并冷卻至0'C。過濾沉淀出的固體，并將其在空氣中干燥，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯(63g，79.5%分離產(chǎn)率；其它10.3g的產(chǎn)物被鑒定在各種洗液和母液中)。產(chǎn)物含有<1%的洛伐他汀。二醇內(nèi)酯的酶促?；?步驟3)室溫下(RT)振蕩二醇內(nèi)酯(25mM)、乙酸乙烯酯(250mM)和南極洲假絲酵母脂肪酶(33mg)在TBME(1mL)中的混合物。44小時(shí)(h)之后，HPLC表明，產(chǎn)生了單乙酸酯，轉(zhuǎn)化率是60%。制備乙酰基新伐他汀(步驟4)在室溫下真空過夜干燥4-乙?；鶅?nèi)酯，在氮下儲(chǔ)存，然后在氮下室溫溶解于無水二氯甲烷中(lg/2.5-3ml的比值)。同時(shí)，在最小量的乙腈中室溫溶解Cu(OTf)2(5md%)，隨后向溶液中加入1.05-1.2當(dāng)量的二甲基丁酸酐，室溫下攪拌30分鐘至1小時(shí)。在氮?dú)夥障拢谑覝叵?，將此Cu(OTf)2/酸酐溶液通過注射器轉(zhuǎn)移到4-乙?；鶅?nèi)酯溶液中，同時(shí)攪拌。當(dāng)完成時(shí)(HPLC監(jiān)測(cè))，通過加入水淬滅反應(yīng)，用飽和NaHC03洗滌。分離的有機(jī)層經(jīng)Na2S04干燥，過濾并蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物4-乙酰基新伐他汀(>99%)。乙酰基新伐他汀的酶促水解(步驟5)酶促水解乙?；路ニ〉拇耸痉缎苑桨笐?yīng)用3.22g乙酰基新伐他汀(終濃度350m)M;2mlMeOH;lOO)il4MTris;9.9ml7K;8mlSEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3編碼)(水中的125mg/ml凍干裂解物)。反應(yīng)在帶有頂部攪拌和磁力攪棒的25ml容器中進(jìn)行。pH穩(wěn)態(tài)條件是由DasGipSTIRRER-PRO⑧系統(tǒng)維持的；通過加入10%NH4OH使pH值維持在7。轉(zhuǎn)化率接近75%時(shí)，加入4ml的甲苯使物質(zhì)溶解。使反應(yīng)過夜進(jìn)行，此時(shí)加入另外的溶劑(甲苯或二氯甲垸)以確保所有的不溶性物質(zhì)被溶解。用HPLC分析樣品，如圖7所示例。反應(yīng)的最終組分是新伐他汀酸4.7%，新伐他汀90.9%，乙?；路ニ?.9%，推斷的新伐他汀消除產(chǎn)物是3.5%。最終的轉(zhuǎn)化率是95.6%。實(shí)施例7:本發(fā)明的示范性實(shí)施方案下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，包括從洛伐他汀合成新伐他汀的方案，例如，圖5中列出的增加總產(chǎn)率的方案，即異二?；铣尚路ニ〉耐緩?。本實(shí)施例描述的方案將洛伐他汀轉(zhuǎn)化為新伐他汀的總轉(zhuǎn)化率提高到至少為60%，并確定何種情況下發(fā)生產(chǎn)率的損失，何種情況下實(shí)現(xiàn)了工藝的改進(jìn)。步驟l:洛伐他汀水解圖15A示例了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，用酯酶將洛伐他汀水解為三醇酸。一方面，此步驟涉及最初的內(nèi)酯環(huán)的化學(xué)開環(huán)(用1當(dāng)量NaOH)，產(chǎn)生水溶性洛伐他汀酸。調(diào)節(jié)pH和體積之后，酶的漿液被加入反應(yīng)，隨后將反應(yīng)維持在pH9.5以及4(TC，直至洛伐他汀酸的轉(zhuǎn)化率為99.5%。可選的示范性條件應(yīng)用10%w/v的底物加載量(0.25M)和10%w/v的粗酶/底物加載量。從前，在實(shí)驗(yàn)室的M00g規(guī)模上，最方便的操作是稀釋和酸化酶反應(yīng)混合物。通過過濾收集不溶性物質(zhì)，在真空爐中在3(TC至4(TC干燥此潮濕的濾餅。分析粗產(chǎn)物(在內(nèi)標(biāo)存在下用)HNMR)表明，其含有約78%的三醇酸，推測(cè)其余物質(zhì)是變性蛋白質(zhì)、細(xì)胞和培養(yǎng)基組分。進(jìn)行研究以回答在此起始步驟中是否發(fā)生了不可接受的產(chǎn)量損失問題。據(jù)推測(cè)，相對(duì)高的酶加載量導(dǎo)致(i)產(chǎn)物不可逆地吸收到沉淀蛋白質(zhì)中，(ii)由于副反應(yīng)造成產(chǎn)量損失，特別是在沉淀的酶被攜帶至步驟2，即內(nèi)酯化/乙?；襟E時(shí)(iii)粗的酶制備物，其含有能夠在此階段或隨后的階段中與產(chǎn)物反應(yīng)的其它組分。進(jìn)行嘗試以改進(jìn)此情況，通過(i)降低酶加載量(ii)通過使用前的簡(jiǎn)單預(yù)處理，增加酶制備物的純度(iii)通過超濾方法，從失效的酶中分離出三醇酸產(chǎn)物。降低酶加載量起始的步驟1是在20%w/v底物(0.5M)，20%w/w酶/溫度加載量下進(jìn)行的。在此條件下，反應(yīng)通常在4(TC，24-36小時(shí)內(nèi)完成。隨后稀釋反應(yīng)物，然后酸化和沉淀產(chǎn)物；在0.5M時(shí)的酸化總是形成難于攪拌的稠漿液。例如，用SEQIDNO:4酯酶對(duì)洛伐他汀酶促水解進(jìn)行的初步研究，是在0.35至0.5M，以15%至20%加載量進(jìn)行的，如圖23所示例。這些研究顯示了，可以獲得高的底物加載量；然而，轉(zhuǎn)化的速度需要優(yōu)化。由于反應(yīng)物在操作期間已需要稀釋，降低底物濃度至0.25M(10%w/v)和降低粗提酶進(jìn)料為10%，將不影響此過程的容積效率。在這些條件下，酶促水解在24-36小時(shí)間，提供了洛伐他汀酸向三醇酸的99.5%的轉(zhuǎn)化。酶預(yù)處理當(dāng)所需酶和其它污染蛋白質(zhì)之間存在熱穩(wěn)定差異時(shí)，通常用熱處理作為純化酶粗提制備物的方便方法。由于洛伐他汀酯酶顯示出良好的熱穩(wěn)定性(步驟1和4在40-5(TC進(jìn)行)，可使其在6(TC經(jīng)歷30分鐘，隨后離心，將上清液用于水解。熱預(yù)處理酶和未處理酶的活性沒有差異。超濾超濾被認(rèn)為是從失效酶和其它高分子量雜質(zhì)中分離出三醇酸產(chǎn)物的方法，所述雜質(zhì)可能通過吸收或副反應(yīng)降低此步驟或隨后步驟中的產(chǎn)量。洛伐他汀水解完成之后，使含有可溶三醇酸的反應(yīng)混合物通過中空的纖維膜裝置(SpectrumLabsMINIPROS中空纖維模塊，帶有聚砜微孔膜；10K截流；1050cm2表面積)。收集流出物，用水稀釋剩余的殘?jiān)⑹怪ㄟ^該裝置。隨后酸化合并的洗脫液，收集沉淀出的三醇酸。這和4-乙酰基新伐他汀水解步驟不同，有一個(gè)例外，在保留的殘?jiān)袥]有觀察到明顯的產(chǎn)物滯留。下表顯示了幾個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>1相對(duì)于工作;際樣，粗三醇酸的HPLC分析2基于HPLC純化，分離出的三醇酸的產(chǎn)率3總產(chǎn)率，包括分離物和洗液、濾液、殘?jiān)械漠a(chǎn)物(三醇酸和二醇內(nèi)酯;i4酸化反應(yīng)混合物和過濾沉淀的三醇酸及失效的酶5反應(yīng)混合物在沉淀前通過中空纖維束。步驟2:乙?；饔脠D8和圖9說明了方案2，本發(fā)明的示范性內(nèi)酯化/乙?；磻?yīng)，及其產(chǎn)物。來自洛伐他汀水解步驟的粗產(chǎn)物包括三醇酸和變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞/培養(yǎng)基組分。以前，在DMAP(0.15當(dāng)量)存在的情況下，在一步/一釜工藝中，將此粗提物懸浮在CH2C12(10-15%w/v)中并用乙酸酐(3當(dāng)量)處理。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，典型地在殘留<2%的二醇內(nèi)酯時(shí)終止反應(yīng)，此時(shí)產(chǎn)生了<2%的二乙酸酯。產(chǎn)生了一些消除產(chǎn)物，特別是在攪拌反應(yīng)物過長(zhǎng)時(shí)間的情況下。完全反應(yīng)之后，添加水淬滅反應(yīng)，過濾通過硅藻土墊，去除不溶性物質(zhì)。用CH2C12洗滌此墊，用稀酸洗滌合并的濾液(去除DMAP)并用飽和NaHC03洗滌以去除乙酸。堿萃取之后，使溶液干燥、過濾和濃縮。隨后加入已垸，導(dǎo)致4-乙?；鶅?nèi)酯以白色固體沉淀出來。以前認(rèn)為，在這些條件下，發(fā)生起始的唯一的內(nèi)酯化，隨后在4位羥基上乙?；粌H在長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，二乙?；拖磻?yīng)才變得明顯?！?shù)據(jù)表明，可測(cè)定量的乙酰化首先在開鏈形式的3和/或5羥基處發(fā)生，內(nèi)酯化之后發(fā)生的4羥基處的乙?；a(chǎn)生所需產(chǎn)物，但是5羥基處的乙酰化最終產(chǎn)生二乙酰酸(diacetylacid)形式(參見圖8示例的流程)。此雜質(zhì)在以前被誤認(rèn)為消除產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈兙邢嗤腍PLC保留時(shí)間。圖14的表中的數(shù)據(jù)對(duì)以二醇內(nèi)酯(其不能形成二乙酰酸副產(chǎn)物)或三醇酸作為原料的一步內(nèi)酯化/乙?；瘲l件進(jìn)行比較?？傊?，三醇酸得到的4-乙?；鶅?nèi)酯的產(chǎn)率較低，原因是5-8%的物質(zhì)轉(zhuǎn)變成二乙酰酸副產(chǎn)物。避免此雜質(zhì)的一個(gè)策略是，進(jìn)行酸催化的內(nèi)酯化，以唯一地產(chǎn)生二醇內(nèi)酯，隨后乙酰化。此順序可以在同一單釜中進(jìn)行，無需分離二醇內(nèi)酯(單釜/兩步工藝)。對(duì)這兩種方法的直接比較在50g規(guī)模上進(jìn)行，如下面的表所總結(jié)。這兩種方法是相當(dāng)?shù)?，兩步乙?；椒ㄓ欣?，其總產(chǎn)率高出3-4%。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>酸沉淀三醇酸和酶反應(yīng)混合物在酸沉淀前通過中空纖維束過濾僅乙酸酐酸催化的內(nèi)酯化，隨后乙?；?包括分離的物質(zhì)和母液中的物質(zhì)。由于表中的數(shù)據(jù)表明，乙?；襟E顯示了良好的質(zhì)量平衡，大多數(shù)產(chǎn)率損失發(fā)生在步驟l，即洛伐他汀水解和分離中。步驟3:?；饔没瘜W(xué)酰化內(nèi)酯8位的示范性方案示例在圖10中。以前的條件應(yīng)用2,2-二甲基丁酸酐作為酰化劑，用于導(dǎo)入新伐他汀側(cè)鏈。酸酐是不能從商業(yè)途徑得到的，應(yīng)用其制備物中多當(dāng)量的酰基氯對(duì)全過程造成了非常高的化學(xué)成本。試驗(yàn)中使用可從商業(yè)途徑得到的二甲基丁酰氯(2當(dāng)量)，存在LiBr作為?；呋瘎?，用吡啶(2當(dāng)量)捕獲釋放的酸。操作之后，蒸發(fā)反應(yīng)溶液至干燥，用iPrOH滴度得到的固體，過濾漿液，產(chǎn)生質(zhì)量可接受的4-乙酰基新伐他汀(總產(chǎn)率86-89%;純度95%)。步驟4:酶促脫乙酰化圖11說明了本發(fā)明的示范性反應(yīng)，4-乙?；路ニ〉拿复倜撘阴；?。在對(duì)4-乙酰基新伐他汀進(jìn)行酶促脫乙?；校枰朔蓚€(gè)明顯的障礙一原料4-乙酰基新伐他汀和產(chǎn)物新伐他汀在水溶液中的不溶性，一4-乙酰基的敏感性，其在pH〉7時(shí)迅速發(fā)生消除反應(yīng)。4-乙酰基新伐他汀的水解必須在接近pH7時(shí)進(jìn)行，在此時(shí)，不可能通過打開內(nèi)酯環(huán)增加溶解度，這和洛伐他汀的水解反應(yīng)不一樣。為了改進(jìn)此步驟，開發(fā)出了與洛伐他汀水解相同的策略(i)降低酶加載量(ii)通過使用前的簡(jiǎn)單預(yù)處理，增加酶制備物的純度(iii)通過超濾方法，從失效的酶中分離出產(chǎn)物(iv)用表面活性劑增加底物的溶解度(0再次用10%w/v(0.25M)的底物濃度，并將粗提酶加載量降低至10%w/w，得到的反應(yīng)在48小時(shí)的轉(zhuǎn)化率仍>95%。(ii)可選的示范性水解反應(yīng)是用熱預(yù)處理酶的上清液組分進(jìn)行的。(iii)用超濾純化產(chǎn)物使操作復(fù)雜化。新伐他汀在水中是不溶的(0.03mg/ml)。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)化完全時(shí)，通過加入1當(dāng)量的NaOH使反應(yīng)混合物的pH值增加，導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)打開和產(chǎn)物溶解。隨后，使反應(yīng)混合物通過中空纖維膜裝置過濾，分離失效的酶。和洛伐他汀水解不同的是，超濾含有新伐他汀酸和失效酶的反應(yīng)溶液產(chǎn)生顯著量的產(chǎn)物，其保留在膜裝置中。酸化洗脫液，新伐他汀酸沒有沉淀并被萃取，并以其銨鹽的形式被沉淀。此順序的總回收情況差。(iv)檢測(cè)五種表面活性劑(Ti'itonX-IOO、Tween80、Tween20、AOT禾口CTAB)通過增加底物溶解度而增強(qiáng)水解反應(yīng)的能力。0.05%w/v的TritonX-100在小規(guī)模上(lg)不增加反應(yīng)速度。然而，當(dāng)反應(yīng)規(guī)模增加時(shí)，該效應(yīng)變得較不明顯。最終的反應(yīng)條件應(yīng)用5%MeOH作為"濕潤(rùn)"劑(wettingagent);否則不溶性原料傾向于"爬"上(creepup)瓶壁。認(rèn)為完成時(shí)(轉(zhuǎn)化率>95%),過濾反應(yīng)混合物并在真空下干燥濾餅。將干燥濾餅在CH2Cl2中懸浮，得到含有凝膠樣物質(zhì)的棕/灰色的粘稠溶液。將其通過硅藻土墊過濾，用甲苯洗滌硅藻土墊。從濾液中去除CH2Ch和己烷的加入以88-89%的總產(chǎn)率沉淀出新伐他汀(相對(duì)于標(biāo)樣的純度是97.5%)。其它批次的粗提新伐他汀也都是從甲苯/已烷中以單一的純化方法結(jié)晶出來的。步驟l-4:總產(chǎn)率總產(chǎn)率下面的表("全過程的產(chǎn)率總結(jié)")展示了兩個(gè)50g規(guī)模試驗(yàn)的全過程的結(jié)果。全過程的產(chǎn)率總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>總產(chǎn)率百分?jǐn)?shù)是分離的產(chǎn)率加上母液/洗液等中的產(chǎn)率基于50g洛伐他汀進(jìn)料的新伐他汀產(chǎn)率百分?jǐn)?shù)三醇酸和酶的酸沉淀反應(yīng)物在三醇酸分離前通過中空纖維膜過濾同時(shí)內(nèi)酯化/乙酰化或內(nèi)酯化，之后乙酰化新伐他汀的總產(chǎn)率是51-58%，還有5-8%的物質(zhì)保留在母液中(甲苯/已烷)。此物質(zhì)經(jīng)過元素分析，經(jīng)HPLC分析，相對(duì)于商業(yè)級(jí)新伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品的純度是97.4-97.5%。雜質(zhì)矛既況(lmpurityprofile)圖12示例了用本發(fā)明的本示范性方案產(chǎn)生的兩批新伐他汀的HPLC曲線。兩個(gè)樣品均顯示出98%百分面積的新伐他汀。從甲苯/已烷中重結(jié)晶使大多數(shù)雜質(zhì)的水平比粗產(chǎn)物降低至少50%，例如，未反應(yīng)的4-乙?；路ニ?.7-1.8%減少到0.3-0.5%，消除產(chǎn)物甚至進(jìn)一步從1-2%降低到0.2%。二醇內(nèi)酯和4-乙酰基內(nèi)酯的水平從0.5%降低到0.1-0.2%。圖13是對(duì)HPLC分析的說明，顯示出從50g規(guī)模反應(yīng)分離出的新伐他汀樣品的雜質(zhì)概況。總結(jié)新伐他汀是應(yīng)用本發(fā)明的示范性4步化學(xué)酶方法，從洛伐他汀制備出來的。在兩個(gè)50g規(guī)模的示范性反應(yīng)中，新伐他汀以51%和58%的總產(chǎn)率被分離出來。每一步中分離物質(zhì)的產(chǎn)率是步驟l-2，82-85%;步驟3，83-89%和步驟4，74-82%。在步驟3和4中，還有6-14%的產(chǎn)物殘留在母液中。酶加載量降低至10%粗酶/底物，熱預(yù)處理和應(yīng)用離心的上清液降低了加載入體系的殘?jiān)牧俊３瑸V反應(yīng)混合物對(duì)從失效酶分離出產(chǎn)物沒有明顯的益處。完成工藝所需的試劑:步驟1:洛伐他汀(kg);洛伐他汀酯酶；Tris緩沖液(L);MeOH(L);EtOAc(L);巳垸(L)。步驟2:二醇內(nèi)酯(kg);乙酸酐(kg)，二甲氨基吡啶(kg);二氯甲烷(L);EtOAc(L);已烷(L);4-乙?；鶅?nèi)酯。步驟3:4-乙酰基內(nèi)酯(kg);二甲基丁酰氯(kg);二氯甲垸(L);EtOAc(L);MeOH(L);已烷(L);4-乙?；路ニ　２襟E4:4-乙?；路ニ』痝);洛伐他汀酯酶；Tris緩沖液(L);EtOAc(L);已烷(L);甲苯(L);新伐他汀。實(shí)施例8:洛伐他汀的酶促水解下列實(shí)施例提供了本發(fā)明的示范性方案，其包括洛伐他汀的水解。步驟l:酶促水解進(jìn)行50g和2xl50g規(guī)模的洛伐他汀水解。反應(yīng)在0.5M底物，pH9.5,4CTC下進(jìn)行，通過加入10%的NH4OH維持pH值不變。所有三個(gè)反應(yīng)的過程相似，在約24小時(shí)，達(dá)到>99%的轉(zhuǎn)化率(通過歸一化HPLC峰面積)。使反應(yīng)混合物酸化為pH約2.5。根據(jù)反應(yīng)的規(guī)模、攪拌的效率/力和稀釋的程度，反應(yīng)混合物在此操作中可以"凝固"，需要進(jìn)一步稀釋。"沉淀的產(chǎn)物容易地被過濾，在真空爐中將潮濕的濾餅在約4(TC干燥。靜止時(shí)，更多的三醇酸和二醇內(nèi)酯從酸性含水濾液中沉淀(1-4%)。討論盡管反應(yīng)是在0.5M(20w/v)底物下進(jìn)行的，但反應(yīng)混合物必須用達(dá)到相等體積的水來稀釋，以防止反應(yīng)混合物在操作期間凝固。容積效率可以通過一開始就使反應(yīng)在0.25M進(jìn)行而得到改進(jìn)。50g反應(yīng)顯示出，在含水濾液中有異常高含量的三醇酸(估計(jì)是12%)，這導(dǎo)致下一步中的總產(chǎn)率較低。步驟2:內(nèi)酯化/乙?；?個(gè)反應(yīng)是用來自50和150g反應(yīng)物的干燥濾餅(三醇酸/沉淀蛋白質(zhì))進(jìn)行的。反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下如所預(yù)期地進(jìn)行(4當(dāng)量Ac20，15%DMAP)。產(chǎn)物從EtOAc/已垸沉淀出來的4-乙酰基內(nèi)酯在兩步中以66-78%的產(chǎn)率(第一次收獲)分離出來；約7%殘留在母液中步驟3:?；谕ǔl件下進(jìn)行26g和98g規(guī)模的反應(yīng)較小的反應(yīng)在2次收獲中4-乙酰基新伐他汀的產(chǎn)率是79.8%。產(chǎn)物是從MeOH(2X)中分離出來的(通過加入水從MeOH中沉淀出產(chǎn)物的嘗試是不成功的)。98g的反應(yīng)在操作之后被分為2份工藝流(processstream)。一份(約25%物質(zhì))直接轉(zhuǎn)向最終的酶促水解步驟。剩余的物質(zhì)從MeOH(2X)中沉淀，在兩次收獲中得到74%的產(chǎn)率；另有12%的產(chǎn)物殘留在母液中。步驟4:酶促水解27g規(guī)模的反應(yīng)(10Xw/v底物)是在pH7.5和55'C進(jìn)行的(外部溫度)。在20小時(shí)后觀察到4-乙?；路ニ〉霓D(zhuǎn)化率是98%。對(duì)粗分離物的分析表明，新伐他汀的產(chǎn)率是91%。從甲苯/已烷中分離并沉淀物質(zhì)，在兩次收獲中得到88%產(chǎn)率的新伐他汀。這代表了從洛伐他汀的總產(chǎn)率是46%。雜質(zhì)情況和HPLC分析的結(jié)果顯示在下面的表中。在一種情況下，將粗乙?；路ニ∠蚯皫胱罱K的酶促步驟，而不純化。MeOH中的工藝流經(jīng)真空蒸餾而濃縮，以用水稀釋時(shí)提供正確的濃度。然而，底物從反應(yīng)混合物中以不溶的聚結(jié)蠟樣球沉淀出來，。向混合物中加入甲苯以溶解底物。酶的加入使反應(yīng)非常慢。92小時(shí)后，主要產(chǎn)物是新伐他汀酸，帶有約20%的消除產(chǎn)物。最終69g規(guī)模反應(yīng)在pH7.5/50。C時(shí)是慢的，需要4天達(dá)到充分的轉(zhuǎn)化，在此期間，產(chǎn)生約10%的新伐他汀酸。產(chǎn)物被分離，產(chǎn)率是60%。討論從干燥濾餅分離新伐他??；提取效率不同。一些試驗(yàn)顯示出較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，但是這可以反映出底物的質(zhì)量。圖21中示例的表顯示了所選新伐他汀樣品的雜質(zhì)概況、HPLC分析和元素分析。粗洛伐他汀的水解粗洛伐他汀(91。/。)的水解是在4x10g規(guī)模上，用兩份酶(SEQIDNO:4，由例如SEQIDNO:3編碼)在pH9.5/4(TC進(jìn)行的。和此酶的反應(yīng)在此時(shí)間段內(nèi)得到99.5°/。的轉(zhuǎn)化率(一份在27小時(shí)后的轉(zhuǎn)化率是96%，另一份20%加載量的酶在18.75小時(shí)的轉(zhuǎn)化率是99.4%)。合并3個(gè)反應(yīng)，如此處所述進(jìn)行反應(yīng)。分析表明，三醇酸作為粗濾餅的的產(chǎn)率是89.4%，估計(jì)有5%損失在含水濾液中。在此處所述的條件下內(nèi)酯化/乙?；妓帷?shí)施例9:洛伐他汀的酶促水解下面的實(shí)施例提供了本發(fā)明的示范性方案，其包括洛伐他汀的水解。步驟l:洛伐他汀的酶促水解A:從三醇酸分離失效的酶熱處理酶促水解完成后，將4x10g反應(yīng)物加熱至80-85°C1小時(shí)。沒有明顯的變性蛋白質(zhì)沉淀；反應(yīng)物保持為混濁的墨綠/黑色。冷卻至室溫對(duì)反應(yīng)混合物的顏色或粘度沒有造成明顯的變化。pH控制用CELITE⑧硅藻土(3g)處理時(shí)，10g酶粉末在pH10.5的10%MeOH/水中的溶液不能容易地過濾。調(diào)節(jié)為pH6造成大塊沉淀，其不能容易地過濾，甚至在用相同重量CELITE硅藻土延長(zhǎng)攪拌后，也不能容易地過濾。調(diào)節(jié)至pH6和離心之后，上清液仍含有物質(zhì)，所述物質(zhì)在進(jìn)一步降低pH之后沉淀。三醇酸在約0.2M時(shí)，在pH9.5-3.5范圍內(nèi)是可溶的。微量過濾離心去除少量的不溶物之后，使4x10g合并的酶促水解物過濾通過SpectrumLabs聚砜中空纖維束(10KMW截流；1050cm2)。這是在三醇酸沉淀前從反應(yīng)混合物中去除高M(jìn)W物質(zhì)的方便方法。溶液以合理的速度(約3-4小時(shí)過濾約1L溶液)過濾。微量過濾后，降低流出液的pH值不產(chǎn)生沉淀，直至約pH4時(shí)。將沉淀的三醇酸容易地過濾并在真空下干燥。B.酶批次的性能(PerformanceofEnzymeBatches)應(yīng)用4份洛伐他汀酯酶。在0.5M/20。/。酶加載量和0.25M/10n/。酶加載量時(shí)對(duì)4份酶的比較顯示，所有份的酶的性能相當(dāng)，在23小時(shí)的轉(zhuǎn)化率是99%，在23-40.5小時(shí)的轉(zhuǎn)化率是>99.5%。兩種酶使用試驗(yàn)(4xl0g和5X10g)經(jīng)歷微量過濾操作。在兩種情況下，分離的三醇酸針對(duì)三醇酸工作標(biāo)樣的純度僅是82.7和83.8%。當(dāng)分析殘?jiān)鼤r(shí)，僅有83-86%的物質(zhì)。步驟2:內(nèi)酯化/乙酰化本發(fā)明提供了方法，其包括將三醇酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二醇內(nèi)酯、3-二乙酰基三醇酸和5-二乙?；妓?，以及隨后轉(zhuǎn)化為3,5-二乙?；妓?、4-乙酰基內(nèi)酯和消除產(chǎn)物，如圖22所示。一定量的三醇酸和二醇內(nèi)酯是通過化學(xué)水解(KOH/MeOH)和共沸內(nèi)酯化(iPrOAc)制備的。與工作標(biāo)準(zhǔn)品相比，三醇酸的純度是99.4%，而二醇內(nèi)酯的純度是94.5%。兩種化合物均經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)條件(AC20，15%DMAP;在CH2Cl2中10。/。w/v)下的內(nèi)酯化和/或乙酰化。反應(yīng)通過HPLC監(jiān)測(cè)，并通過用水淬滅以及用酸和NaHC03洗滌而終止；將CH2Cl2稀釋為已知體積并針對(duì)4-乙?；鶅?nèi)酯工作標(biāo)準(zhǔn)品而分析；所有含水洗液和殘?jiān)脖环治?。三醇的兩次?nèi)酯化/乙?；磻?yīng)得到分析液的產(chǎn)率是78.9%和87.4%;產(chǎn)物中的雜質(zhì)包括(HPLC面積百分?jǐn)?shù))0.4%二醇內(nèi)酯，5.6%消除產(chǎn)物，1.5%4，8-二乙?；鶅?nèi)酯，0.5%未知。二醇內(nèi)酯的兩次乙?；磻?yīng)得到分析液的產(chǎn)率是88.5%和94.7%;產(chǎn)物的雜質(zhì)分布比三醇酸反應(yīng)少。以前在更稀釋條件下0'C時(shí)在CH2C12中的反應(yīng)顯示出，HPLC上有兩個(gè)新的峰，其保留時(shí)間長(zhǎng)于二醇內(nèi)酯。這些峰隨反應(yīng)的進(jìn)行而降低。隨著乙?；倪M(jìn)行，在乙?；鶅?nèi)酯峰之前相鄰的一個(gè)峰增大。以前將此指定為消除的內(nèi)酯產(chǎn)物。LC-MS數(shù)據(jù)表明，此峰實(shí)際上是消除產(chǎn)物和3,5-二乙?；妓岬慕M合。參見圖22，其說明了這些反應(yīng)和它們的相應(yīng)產(chǎn)物(三醇酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二醇內(nèi)酯、3-二乙?；妓岷?-二乙酰基三醇酸，和隨后轉(zhuǎn)化為3，5-二乙?；妓帷?-乙?；鶅?nèi)酯和消除產(chǎn)物)。與三醇酸內(nèi)酯化/乙?；啾?，預(yù)形成的二醇內(nèi)酯的乙?；玫礁叩漠a(chǎn)率和更無雜質(zhì)的產(chǎn)物。步驟3:酰化作用保留的4-乙?；路ニ悠酚蒆PLC(238和210nmUV檢測(cè)和ELSD)和LC-MS進(jìn)行分析。在210nm或ELSD光譜上沒有觀察到大的新的峰?；衔镫x子化的缺乏妨礙了對(duì)微量雜質(zhì)進(jìn)行的LC-MS分析。步驟4:酶促水解用于去除4-乙?；谋景l(fā)明可選方法酶催化的醇解MeOH存在情況下(32當(dāng)量)，與甲苯中的5種酶不反應(yīng)；向這些反應(yīng)物加入水(0.6%v/v)不造成任何水解。在濕的可混溶水的溶劑(9種溶劑)中酶促水解；用一份酶(SEQIDNO:4，由例如SEQIDNO:3編碼)在43小時(shí)后沒有產(chǎn)物信號(hào)，帶有不同程度的消除。酶催化氨解7種酶，使用甲苯或MTBE中的nBuNH2;背景消除后主要為產(chǎn)物。H202/NaHC03:在過量固體NaHC03存在下，增加50%H202在MeOH、THF或丙酮中的量；沒有乙酸酯去除的信號(hào)。酸催化的甲醇分解；0.1M乙?；路ニ≡?0%HCI/MeOH中過夜產(chǎn)生新伐他汀和新伐他汀甲酯的混合物。實(shí)施例10:洛伐他汀酶促水解的部分析因設(shè)計(jì)為了優(yōu)化反應(yīng)，對(duì)洛伐他汀的酶促水解進(jìn)行部分析因設(shè)計(jì)。部分析因設(shè)計(jì)是用DESIGNEXPERTTM軟件對(duì)0.35M洛伐他汀酸、Na鹽進(jìn)行的，結(jié)果顯示在圖24中。對(duì)圖24的備注是1.酶活性是對(duì)甲基傘形酮丁酸鹽測(cè)定的，并表示為0.1嗎總蛋白得到的斜率。2.達(dá)3小時(shí)時(shí)三醇酸產(chǎn)生的速度。3.45.5小時(shí)產(chǎn)生的三醇酸(％)。四個(gè)因素影響洛伐他汀酸水解產(chǎn)生的三醇酸％、酶濃度、緩沖液濃度和MeOH的量，如圖25所示例，其中所有反應(yīng)用含有SEQIDNO:4的大腸桿菌的澄清裂解物進(jìn)行，并且反應(yīng)是在pH穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下，在DasGipFEDBATCH-PRO系統(tǒng)中進(jìn)行的。響應(yīng)曲面分析(ResponseSurfaceAnalysis(RSA))是用DESIGNEXPERT⑧軟件，用對(duì)水解0.35M洛伐他汀的中心復(fù)合設(shè)計(jì)(centralcompositedesign)進(jìn)行的，結(jié)果在圖26中說明。對(duì)圖26的備注是1.酶活性是對(duì)甲基傘形酮丁酸鹽測(cè)定的，并表示為O.l叱總蛋白得到的斜率(RFU/s)。2.達(dá)3小時(shí)時(shí)三醇酸產(chǎn)生的速度。3.45.5小時(shí)產(chǎn)生的三醇酸(％)。對(duì)用SEQIDNO:4的洛伐他汀原位水解進(jìn)行優(yōu)化，這樣產(chǎn)生了不顯著量的NaCl:加入MeOH中的0.85g洛伐他汀和等摩爾的NaOH。向洛伐他汀酸中加入含有SEQIDNO:4的大腸桿菌的澄清裂解物。顯著的因素是甲醇濃度([MeOH])，酶濃度([Enzyme])是非常顯著的，以及緩沖液濃度([Buffer])在低[Enzyme]時(shí)有輕微的影響。參見圖27，其說明了對(duì)結(jié)果的總結(jié)?？梢杂庙憫?yīng)曲面分析(ResponseSurfaceAnalysis(RSA))的結(jié)果大規(guī)模地水解洛伐他汀，例如，用圖28所示例的方案。反應(yīng)在100g規(guī)模上成功進(jìn)行(0.5M);在27小時(shí)的轉(zhuǎn)化率是97.5%;生產(chǎn)率Xg/g酯酶/h;特異活性0.084pmol/mg酯酶/min。研究SEQIDNO:4的底物特異性新伐他汀的許多4-?；苌锉籗EQIDNO:4活性水解，如圖29所示例。乙?；路ニ〉幕瘜W(xué)水解導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)脫水。實(shí)施例ll:示范性水解方案本實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，包括制備新伐他汀及中間產(chǎn)物的工業(yè)放大工藝，例如在圖5和6所示例。用SEQIDNO:4(參見例如圖5步驟l)將洛伐他汀水解為三醇酸的酶促水解方案被完成，圖30示例了此示范性洛伐他汀水解方案的結(jié)果。SEQIDNO:4的酶來源是來自小型發(fā)酵罐的裂解物。本方案對(duì)于來自10L發(fā)酵物的親液物質(zhì)(lyophilate)在12g規(guī)模上(0.5M)，39小時(shí)的轉(zhuǎn)化率是99%(24小時(shí)是90%)?？偨Y(jié)用于本研究的參數(shù)催化劑加載量轉(zhuǎn)化率時(shí)間56%w/w100%大約4小時(shí)33%w/w97%大約24小時(shí)22%w/w97%大約24小時(shí)在22%w/w親液物質(zhì)加載量時(shí)，用10L發(fā)酵物水解lkg洛伐他汀。大規(guī)模酶促水解洛伐他汀為洛伐他汀酸為三醇酸，是在DasGipFEDBATCHPRO生物反應(yīng)器中進(jìn)行的，pH—直是9，底物濃度是500mM，7%MeOH，40°C，如圖31所示例。放大的酶促水解洛伐他汀為二醇內(nèi)酯的示范性方案在圖32的示意圖中描述，其可以是示例性的工業(yè)規(guī)模過程。此反應(yīng)和對(duì)反應(yīng)參數(shù)的總結(jié)(反應(yīng)規(guī)模，操作，理論產(chǎn)量，產(chǎn)物克數(shù)，產(chǎn)率％)，在圖33中被說明。(a)50克(g)反應(yīng)的數(shù)據(jù)總結(jié)于圖34A(內(nèi)酯化和濃縮之后)和34B(粗產(chǎn)物)中，(b)100g反應(yīng)的數(shù)據(jù)總結(jié)于圖35A(三醇酸)和35B(內(nèi)酯化之后)中。利用圖6步驟5的反應(yīng)，甲基(Me)4-乙酰基新伐他汀被酶促水解為新伐他汀。此反應(yīng)的結(jié)果和從此反應(yīng)得到的結(jié)論是在pH〉7是容易消除(在pH8是13%)。酶促水解容易地發(fā)生，但是被溶解度所限。甲酸酯>乙酸酯氯代乙酸酯>甲氧基乙酸酯。100mM(5%w/v)水解過夜，pH值是7。200mM在10%MeOH中在20小時(shí)的轉(zhuǎn)化率是84%，溫度是50°C。200mM在7小時(shí)，用50%w/w親液物質(zhì)，轉(zhuǎn)化率是84%。400mM雙相，帶有甲苯。反應(yīng)進(jìn)行至80-90%，隨后停止。不溶的新伐他汀捕獲了未反應(yīng)的底物?？偨Y(jié)這些反應(yīng)(300mM(14%w/v)底物，所有的反應(yīng)帶有頂部攪拌和下部的攪棒，pH7，10%NH4OH;5(TC)和最終轉(zhuǎn)化率270mM乙?；路ニ?，13mM同型新伐他汀(homosimvastatin)，溶劑是等體積的甲苯，最終轉(zhuǎn)化率是88.2%。300mM乙?；路ニ?，溶劑是10X甲醇(MeOH)，最終轉(zhuǎn)化率是91.3%。300mM乙酰基新伐他汀，溶劑是10X甲醇(MeOH)，在6小時(shí)添加甲苯，最終轉(zhuǎn)化率是96.1%。實(shí)施例12:新伐他汀的同二?；?homodiacylatioii)途徑本實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性方案，即制備新伐他汀的同二?；^程，如圖38和39所示例。一方面，同二?；に嚢ň哂邢率霾襟E的方法(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸；(b)通過內(nèi)酯化從三醇酸產(chǎn)生二醇內(nèi)酯；(c)通過化學(xué)?；?，?；純?nèi)酯內(nèi)酯環(huán)的內(nèi)酯環(huán)上的4位(4'-OH)和8位(8'-OH)，產(chǎn)生4,8-二乙?；鶅?nèi)酯；禾口(d)通過酶促水解，選擇性去除4'位的?；?，從而制備新伐他汀。應(yīng)用本發(fā)明的同二酰基化方法的好處是四步合成；原位酶促水解洛伐他汀單一的?；瘎?沒有區(qū)域選擇性。決定何時(shí)應(yīng)用本發(fā)明的同?；椒ㄐ枰紤]的問題可能需要應(yīng)用過量的二甲基丁酰氯；苛刻的條件一可能有不可接受水平的消除；在酶促水解上可能有困難可以用溫和的酰化條件去除4'-二甲基丁酸酯可能是有困難的?！矫妫M(jìn)行本發(fā)明的同二?；椒ㄊ纠趫D39中。用SEQIDNO:4,在lmM規(guī)模上進(jìn)行水解，形成新伐他汀和新伐他汀酸。應(yīng)用100mM生物反應(yīng)器。主要產(chǎn)生三醇酸，同時(shí)存在痕量的新伐他汀酸。溶解度需要注意。在不同底物濃度下進(jìn)行小規(guī)模的反應(yīng)；2天后的轉(zhuǎn)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>圖40A和40B以圖形分別示例了用SEQIDNO:4對(duì)同型新伐他汀的水解以及在1mM同型新伐他汀和10mM同新伐他汀的反應(yīng)條件下得到的反應(yīng)產(chǎn)物。實(shí)施例13:制備新伐他汀的示范性過程本實(shí)施例描述了本發(fā)明的示范性過程，用于制備新伐他汀、新伐他汀中間體或等同化合物。本發(fā)明的本示范性過程包括下列方法(i)用洛伐他汀酯酶水解洛伐他汀和隨后的"單釜/一步"內(nèi)酯化/乙酰化(如步驟1和2)，(ii)用二甲基丁酸酐和BF3(Et20)(A)或Cu(0Tf)2(B)催化劑?；?-乙?；鶅?nèi)酯(如歩驟3)。用二甲基丁酸酐/吡啶/DMAP(C)進(jìn)行的?；ㄔ趦?nèi)，用于比較，證明本方法的優(yōu)勢(shì)。(iii)用洛伐他汀酯酶水解乙酰基新伐他汀(如步驟4)。4-乙?；鶅?nèi)酯(50g規(guī)模)制備4-乙?；鶅?nèi)酯的示范性過程，如圖19所示例，包括1.將洛伐他汀(50.05g，124mmol)稱入配備有磁力攪棒和N2進(jìn)口的1L3-頸燒瓶中。加入2MNaOH(65mL，130mmol)并攪拌槳液。加入MeOH(10mL)和BHT(0.25g)，在5(TC水浴中攪拌漿液1小時(shí)。此時(shí)，所有的洛伐他汀已經(jīng)溶解，得到粘的淡黃色溶液。用水(175mL)稀釋該溶液，將溫度調(diào)節(jié)至40'C。2.同時(shí)，將洛伐他汀酯酶(5.0g粗提酶凍干物)稱入聚丙烯離心瓶中，在水中(100mL)懸浮并在室溫下攪拌30分鐘。隨后將混合物在4'C以10,000rpm離心15分鐘。將上清液加入洛伐他汀酸反應(yīng)混合物。用又一份水(150mL)潤(rùn)洗離心瓶，將其加入反應(yīng)混合物。(參見下面的備注1)。3.將反應(yīng)的pH調(diào)節(jié)至pH9.5，并在DASGIPAGFEDBATCH-PRO⑧生物反應(yīng)器上，通過自動(dòng)加入10X的NH4OH，維持在40。和pH9.5。4.定期移除反應(yīng)混合物的等分試樣(25)iL)，用MeOH稀釋并用HPLC檢測(cè)(參見下面的備注2)。26.5小時(shí)后，殘留0.5%的未反應(yīng)洛伐他汀酸。43小時(shí)后終止反應(yīng)。5.將反應(yīng)混合物在1L的燒杯中稀釋為800mL并冷卻至+12'C。伴隨著劇烈攪拌，用6MHCI將pH值降低為pH2.5。在N2下過濾沉淀固體，用水(300mL)洗滌，在真空爐中在4(TC干燥潮濕的濾餅(參見下面的備注3)。6.在配備有溫度計(jì)、附加漏斗、磁力攪棒和N2進(jìn)口的1L的三頸燒瓶中，將粗提的三醇酸濾餅懸浮在CH2C12(500mL)中。在冰浴中冷卻漿液并在N2下攪拌。7.將二甲基氨基吡啶(2.24g，18.3mmol;0.15當(dāng)量)力卩入反應(yīng)混合物。乙酸酐(35mL,0.37mol;3當(dāng)量)放置在附加漏斗中，在12分鐘期間滴加入反應(yīng)混合物，溫度維持在8.5-9.2°C。8.每30分鐘移除反應(yīng)混合物的等分試樣(25^L)，用MeOH稀釋并用HPLC檢測(cè)(參見下面的備注4)。9.30分鐘后，去除冷卻浴，在室溫下攪拌反應(yīng)物(參見下面的備注5)。加入Ac20后6.25小時(shí)終止反應(yīng)(參見下面的備注6)。將反應(yīng)混合物過濾通過硅藻土墊，用CH2C12(2x100mL)洗滌該墊。用水(200mL)、1.2MHC1(200mL)和水(100mL)洗滌合并的濾液。10.在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotovap)上濃縮有機(jī)層(去除250mL)并用EtOAc(300mL)稀釋。向有機(jī)溶液中加入水(400mL和固體NaHC03(53g)，攪拌混合物30分鐘。分離有機(jī)層。用水(400mL)稀釋含水層并用EtOAc(150mL)萃取。合并EtOAc萃取物并用水(IOOmL)和飽和(satd.)NaCl(50mL)的混合物洗滌，隨后用飽和NaCl(100mL)洗滌。干燥(Na2S04)、過濾和濃縮有機(jī)層(從600mL體積中去除420mL)。11.用頂部攪拌器攪拌淺黃色濃縮溶液，迅速加入己烷(200mL)，產(chǎn)生濃的白色沉淀。加入又一份的已垸(300mL)，在冰浴中冷卻混合物1.5小時(shí)。12.過濾沉淀固體，用冷的20%EtOAc/已烷(80mL)洗滌，空氣中千燥0.5小時(shí)，隨后在真空爐中4(TC干燥過夜。13.蒸發(fā)母液至干燥。將得到的黃色油狀物重新溶解在EtOAc(25mL)中，通過滴加已烷(175mL)，將第二次收獲的產(chǎn)物沉淀出來。通過過濾收集沉淀固體并在真空爐中4(TC干燥(參見下面的備注7)。備注:1.反應(yīng)的總體積是500mL，這相應(yīng)于0.25M(10%w/v底物)的底物濃度和10%w/w的粗酶加載量。2.樣品是在配備有DAD的Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(45o/oMeCN/0.10/0AcOH等度;lml/min;30°C;238nm)分析的。洗脫的順序是三醇酸1.4分鐘，二醇內(nèi)酯1.9分鐘，洛伐他汀酸3.8分鐘，洛伐他汀7.3分鐘。3.此階段的濾餅(43.61g)由粗三醇酸和沉淀蛋白質(zhì)組成。針對(duì)三醇酸工作標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析表明，含水濾液含有0.69g三醇酸(1.6%)和0.69g二醇內(nèi)酯(1.8%)。4.樣品是在配備有DAD的Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(45%MeCN/0.1%AcOH等度；lml/min;30°C;238nm)分析的。洗脫的順序是三醇酸1.4分鐘，二醇內(nèi)酯1.9分鐘，二乙酸酯酸(diacetateacid)/消除產(chǎn)物3.6分鐘，4-乙酰基內(nèi)酯4.1分鐘，二乙酸酯7.6分鐘。5.反應(yīng)混合物在開始是結(jié)塊的，但是劇烈攪拌破壞了大的團(tuán)塊。2小時(shí)后，反應(yīng)混合物被超聲降解分散成一些仍為較小的塊。建議研磨粗三醇酸濾餅，而后將其懸浮在溶劑中。最終的反應(yīng)混合物是乳狀的白色懸浮液。6.淬滅前的HPLC表明，存在1.1%的二醇內(nèi)酯、3.9%的二乙酸酯酸/消除產(chǎn)物和1.2%的二乙酸酯。7.計(jì)算產(chǎn)物的總產(chǎn)量，如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>4-乙?；路ニ〉暮铣芍苽?-乙?；路ニ〉氖痉缎赃^程，如圖18C所示例，包括A.三氟化硼醚合物催化1.在2L的雙頸燒瓶中，使4-乙?；鶅?nèi)酯(110g，0.3mol)在真空下(O.l托)干燥過夜(參見下面的備注1)。2.在N2下，將干燥的原料室溫溶解在無水CH2C12(875mL)中。3.如下制備催化劑。在N2下，在手套袋中將2,2-二甲基丁酸酐(7.1mL，30.3mmol)加入無水乙腈(125mL)，隨后加入新開封的BF3.OEt2(3.1mL，24.3mmol;8mol%)(參見下面的備注2、3)。4.將2,2-二甲基丁酸酐(78niL，0.33mol;1.1當(dāng)量)加入4-乙?；鶅?nèi)酯溶液，將混合物加熱至40°C10分鐘。隨后經(jīng)導(dǎo)管加入BF3.OEt2的MeCN溶液(參見下面的備注4)。使反應(yīng)避光，在40'C攪拌并由HPLC監(jiān)測(cè)。5.5.5小時(shí)之后，判斷反應(yīng)完成，使反應(yīng)物在冰浴中冷卻至5°C。加入飽和NaHCO3(250mL),同時(shí)劇烈攪拌。分離水相層，用CH2C12(200mL)萃取。6.合并有機(jī)萃取物，干燥(Na2S04)、過濾并在低壓下濃縮。向濃縮物中加入MeOH(200mL)(備注5);更多MeOH的去除造成4-乙?；路ニ〕恋?。將白色固體過濾、用冷的MeOH(100mL)洗滌并在真空下干燥(92.8g)。7.將母液濃縮至大約一半體積，在-10'C冷卻過夜。如果通過過濾收集產(chǎn)物(17.2g)并干燥，將第二次收獲到產(chǎn)物(參見下面的備注6)。8.HPLC圖顯示在下面的表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>備注:1.在升高的溫度下真空干燥，可能引起分解。4-乙?；鶅?nèi)酯在4(TC真空干燥時(shí)變成黃色。2.由于反應(yīng)對(duì)濕氣的存在是敏感的，因此在剛開始將過量的酸酐加入乙腈，用以清除任何殘留的水。3.應(yīng)該在反應(yīng)中使用新開封的BF3.OEt2;以前打開過的試劑可能導(dǎo)致反應(yīng)緩慢或甚至不發(fā)生反應(yīng)。4.CH2Cl2/MeCN比值是7:1。典型地，該比值是6:1禾Q9:1之間。反應(yīng)在MeCN中較快，但是產(chǎn)生的產(chǎn)物帶有較不希望產(chǎn)生的雜質(zhì)情況。5.MeOH應(yīng)該在粗產(chǎn)物凝固之前加入，否則其難于在MeOH中重新溶解。在熱的甲醇中溶解固體產(chǎn)物引起分解，并因此得到較低的產(chǎn)量。6.總的固體產(chǎn)量是110g(78.7%)。將最終的母液蒸發(fā)至干燥，針對(duì)工作標(biāo)樣分析殘余物，顯示出還含有9.02g(6.8%)的產(chǎn)物。還有約2%的產(chǎn)物殘留在含水洗滌物中。B.Cu(OTfy(酸)酐法1.在真空下室溫千燥10.0g的4-乙?；鶅?nèi)酯(10.0g，27.6mmol)l小時(shí)，然后溶解于無水CH2C12(60mL)中并在氮?dú)夥障聰嚢琛?.同時(shí)，在密封的瓶中制備并攪拌無水MeCN(7.0mL)中的Cu(OTf)2(0.5g，5mol。/。)禾卩2，2-二甲基丁酸酐(7.15mL，30.5mmol)溶液。3.使內(nèi)酯溶液冷卻至15r。用注射泵滴加Cu(OTf)2和2,2-二甲基丁酸酐的溶液。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，并判定其在3.0小時(shí)內(nèi)完成。4.用水(20mL)淬滅反應(yīng)，并在CH2C12(100mL)和飽和NaCl(100mL)之間進(jìn)行分配。隨后用1M蘋果酸(50mL)和飽和NaC1(50mL)的混合物攪拌有機(jī)層10分鐘，隨后用飽和NaCl(100mL)攪拌。干燥(Na2S04)、過濾并蒸發(fā)有機(jī)層，得到粗產(chǎn)物(12.8g〉100y。重量產(chǎn)率)(參見下面的備注1、2)。備注1.HPLC檢測(cè)產(chǎn)物分布的面積百分?jǐn)?shù)是4-乙?；路ニ?92.5%)，消除產(chǎn)物(2.7°/。)，二新伐他汀(1.7%)，未鑒定雜質(zhì)(3.1%)。2.柱層析之后，4-乙酰基新伐他汀以61%被分離。C.卩比啶/DMAP法1.在真空下使4-乙?；鶅?nèi)酯(2.6g，7.2mmol)室溫下干燥過夜，然后在氮?dú)夥障率覝厝芙庠跓o水吡啶中(6.0mL)，同時(shí)攪拌。加入DMAP(176mg，0.2當(dāng)量)的1.5mL無水吡啶溶液，在冰浴中冷卻該混合物。2.用注射泵在15分鐘期間滴加2,2-二甲基丁酰氯(7.72g，8當(dāng)量)。于(TC攪拌混合物約1小時(shí)，隨后室溫下攪拌1小時(shí)。3.在氮?dú)夥障?，?(TC加熱反應(yīng)混合物，用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。4-乙?；鶅?nèi)酯消耗之后(2天)，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移去吡啶。殘余物在EtOAc(20mL)和飽和NaCl(20mL)之間進(jìn)行分配。干燥(Na2S04)、過濾并蒸發(fā)有機(jī)層，得到粗產(chǎn)物(96.5%)(參見下面的備注1、2)。備注1.HPLC檢測(cè)產(chǎn)物分布的面積百分?jǐn)?shù)是4-乙?；路ニ?79.5%)，消除產(chǎn)物(12%)，二新伐他汀(2%)，未鑒定雜質(zhì)(6.5%)。2.柱層析之后，4-乙?；路ニ∫?3%被分離。認(rèn)為4-乙?；路ニ?duì)Si02層析的穩(wěn)定性低。洛伐他汀酯酶對(duì)4-乙?；路ニ〉乃庵苽?-乙?；路ニ〉氖痉缎苑桨福鐖D18D所示例，包括1.在配備有攪棒和pH電極的500mL三頸圓底燒瓶中，稱入4-乙?；路ニ?39.69g，86.2mmol)(參見下面的備注1)。加入水(295mL)、MeOH(20mL)和BHT(0.24g)。在5(TC水浴中攪拌，用0.5MNaOH調(diào)節(jié)pH為7-8。2.將洛伐他汀酯酶(7g)稱入離心瓶并在水(150mL)中懸浮。于6(TC攪拌混合物30分鐘，隨后在冰上冷卻。隨后在4。C以10,000rpm使混合物離心125分鐘。將一份上清液(92mL)加入反應(yīng)混合物。3.于50°C攪拌反應(yīng)并通過自動(dòng)加入10%NH4OH，用DASGIPFEDBATCH-PRO⑧系統(tǒng)將反應(yīng)維持在pH7.5。4.定期移除反應(yīng)混合物的等分試樣(25^L),用MeOH稀釋并用HPLC檢測(cè)(參見下面的備注2)。42小時(shí)后，轉(zhuǎn)化率是96.8%(產(chǎn)物與原料峰面積的比值)。64小時(shí)后終止反應(yīng)。5.使反應(yīng)混合物通過配有Whatman#1濾紙的13cmBuchner漏斗而過濾，用水(IOOmL)洗滌濾餅。在真空爐中于40。C下使潮濕的濾餅干燥過夜(參見下面的備注3)。6.在CH2C12(200mL)中懸浮干燥的新伐他汀濾餅。室溫下攪拌該混合物，得到含有凝膠樣物質(zhì)的粘稠的棕色溶液。將硅藻土(lg)加入混合物并持續(xù)攪拌。隨后使混合物通過粗糙燒結(jié)玻璃漏斗上的硅藻土墊(IOg)而過濾(備注4)。用甲苯(100mL)洗滌硅藻土墊。7.在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotovap)上濃縮濾液，去除012<:12(浴溫度是20°C)。用甲苯(150mL)稀釋殘余物并在室溫下攪拌。緩慢滴加已烷(50mL);在加完之前開始沉淀。室溫下?lián)璋柙摑{液過夜。隨后在冰浴上冷卻漿液，滴加又一份已烷(50mL)。隨后過濾冷的漿液，用冷的25%甲苯/已垸(50mL)洗絳濾餅。短暫地在空氣中干燥濾餅，隨后在真空中約3(TC下干燥。8.在相似條件下，相同規(guī)模上進(jìn)行第二次反應(yīng)(40.68g，88.3mmo1)。這兩次試驗(yàn)的結(jié)果在備注5中列表。敏1.由于原料和產(chǎn)物都是不溶的，故需要有效的攪拌。物質(zhì)趨向于粘附在瓶壁上，導(dǎo)致分析反應(yīng)程度上的潛在誤差。建議研磨原料以降低顆粒大小和使用濕潤(rùn)劑。2.樣品是在Waters1100SeriesHPLC上，用ZorbaxSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(60-90%MeCN/0.5%AcOH梯度；lml/min;RT;238nm)分析的。梯度和洗脫順序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>3.此階段的濾餅(35.28g)由粗新伐他汀和一些酶相關(guān)物質(zhì)組成。相對(duì)于新伐他汀工作標(biāo)樣的HPLC分析表明，含水濾液含有0.30g新伐他汀(1.0%)。4.不溶的凝膠樣物質(zhì)可以在硅藻土墊上產(chǎn)生妨礙過濾的沉淀物。5.上述兩次試驗(yàn)的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方案。然而，應(yīng)該理解的是，可以進(jìn)行各種變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其它實(shí)施方案包含在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)。序列表<110>戴弗薩公司朱作霖J査普林、k庫什特德約黃子林w格林伯林<120>制備新伐他汀及中間體的方法<130>564462012840<140>NotYetAssigned<141>2004_10-20<150>US60/542,100<151>2004-02-O4<150>US60/513,237<151>2003-10-21<160>6<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>1629<212>DNA<213>未知的<220><223>環(huán)境的<糊〉1atgsgcctttgcgtcattcgattcstcgccggsactttggtacttgtggcgtcagtgga—a60tcggcagttgctcaacaagcgtgtgctgscctgstgggcctcgsgctgcc120atsacgtccgctgcagtggctaccgsgggcCC33tCCC3Csgccggcgstctttggssgc180actgaccccattgtggctccgaagtgcgggcggtcscgcgccctacgs的240gactccgagattcgwtcgsgctctggctgccgctctccg300caia^ttggtagcggtggctgggctggttcgcggggctgat3ggccctctt360csgcgcggttstgccgtagctcagcgataggtttggtgcct420gscgcctcctgggctatcggcc3tccgca333gctgstcgatttcggttatcgcgccgtg480gtgttcaggcctgcgcgcctactttggccgcggtcsggst540ctgagctacttcsgcggttgttct33tggcggacgcgaggctctcatggaggcgcagcgc600根克溫摩伯緊<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>GluGlyProlieProGinProAlsliePheGlySerThrAspProlie505560ValAlaProGluArgCysGluValArgAlaValThrArgProThrLys65707580AspSerGlulieArg工leGluLeuTrpLeuProLeuSerGlyTrpAsn859095GlyLysTyrLeuGinlieGlySerGlyGlyTrpAlaGlySerlieAsn100105110ArgThrGlyLeu工leGlyProLeuGinArgGlyTyrAlaValAlaAla115120125ThrAspAsnGlyHis工leSerGluGlyLeuValProAspAlaSerTrp130135140Ala工leGlyHisProGinLysLeulieAspPheGlyTyrArgAlaVal145150155160HisGluThrSerValGinAlaLysAla工leLeuArgAlaTyrPheGly165170175ArgGlyGinAspLeuSerTyrPheSerGlyCysSerAsnGlyGlyArg180185190GluAlaLeuMetGluMaGinArgTyrProGluAspPheGluGlylie195200205工leAlaGlyAlaProAlaAsnAsnTrpSerArgLeuPheThrGlyPhe210215220ValTrpAsnGluArgAlaLeuAlaAspAspPro工leProProAlaLys225230235240LeuThrAlalieGinAlaAlaAlalieAlaAlaCysAspThrLeuAsp245250255GlyValGluAspGlyLeulieGluAsnProArgAlaCysSerPheAsp260265270ProArgSerMetValCysThrAlaAspAspAlaSerAspCysLeuThr275280285GluGlyGinValAlaThrLeuHisArglieTyrSerGlyProThrAsn290295300ProArgThrGlyGluArgliePheProGlyTyrProMetGlyThrGlu305310315320AlaValProGlyGlyTrpValProTrp工leValSerAlaSerSerGlu325330335ValProSer工leGinAlaSerPheGlyAsnSerTyrTyrGlyHisAla340345350ValPheGluGinSerAsnTrpAspPheArgThrLeuAspPheAspGin355360365AspValAlaPheGlyAspAlaLysAlaGlyProValLeuAsnAlaThr370375380AsnProAspLeuArgSerPheArgAlaAsnGlyGlyLysLeu工leGin385390395400TyrHisGlyTrpGlyAspAlaAlalieThrAlaPheSerSerlieAsp405410415TyrTyrGluAsnValArgAlaPheLeuAspArgPheProAspProArg420425430SerGluAsnThrAsp工leAspGlyPheTyrArgLeuPheLeuValPro435440化GlyMetGlyHisCysSerGlyGly工leGlyProSerSerPheGlyAsn450455460GlyPheArgSerAlaArgThrAspAlaGluHisAspLeuLeuSerAla465470475480LeuGluAlaTrpValGluArgAspThrAlaProGluArgLeulieGly485490495ThrGlyThrAlaValGlyAspProThrAlaThrLeuThrArgProLeu500505510CysProTyrProArgThrAlaArgTyrLeuGlySerGlyAsnSerAsn515520525AspAlaAlaAsnPheGluCysAlaLeuProAlaGlyValGin530535540<210>3<211>1209<212>DNA<213>未知的<220><223>環(huán)境的<4〇0>3atgg333tccatggtacatgtttcacttggtgcggcaggsgtttgascga60astttgcgtg3gcgcggcg3sgtsggsgcgtccgtttgcgtcacgttgcscggcgsascc120gtagtggacttgtggggcggcstggcgcgtgccgscactcagscgccstggscggcggsg180acggtcagtattgttttttcCtCCSCC333ggcgcaacggcactctgcgcccatstgctg240gcgtcacgcggcc33ctgg3tcttg3tgc3ccsgtcgcc3cct3Ctggccggaatttgcc.300cssgccggcaaagctcgcatcccggtgss3atgctcttgatggtctccct360gccgtscgg3csccgctgccccsgggtgcctacgctgactgggaactgatggtC33tscg420ttggccaaggaagsgccgttttgggs3cctggc3cccgcs3cggctatc3tgcgctcacc糊stggggtggctggtggg3g3sgtggtgcgscgtgtctctggtssgtcgcttgggscattc540ttccaagaggagatcgccaggccgttggggttagatttctggattggctt600C33gsggcscgggtcgcgccg己tg3tcgcggcggagcctgatccgc333gcctcttcttc"0caagaggtcgcgsagcctggggccttscsgtcgctcgtsctccttssctccggcggctst720atgggtgctcagcctgagtstgsctcgcgggcggcgcatgcggccgagattggtgcsgcc780ggtggtstcacc3scgc3cgcggcctggcsggcstgtacgC3cc3ctggcctgcggaggc840gggtggagttggtcsgtcctgacatgctggcccgastgtccsgagtggcc900tctgcgsctgggsgsgstgccgtgctcstg3tgcca_3cccggtttgccctgggcttcstg960asgtccatggac33ccgccgggsgcctgctggcgtgcagg3c己gcgcgctctttggggsg1020gsggcttttggccstgtgggggccgggggttcgtttggttttgccgstcc1080atgtcctttggctstaccatgggctggg3gccgggctcsscccgcggggg1140tggstgcs3Cct3ccgctcgttagggtstcsgtcgg3tgcctctggsgcc1200tggscctgs1209<formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>LeuGlyThrPhePheGinGluGlu工leAlaArgProLeuGlyLeuAsp180185190PheTrpI丄eGlyLeuProAlaGluGinGluAlaArgValAlsProMet195200205lieAlaAlaGluProAspProGinSerLeuPhePheGinGluValAla210215220LysProGlyAlaLeuGinSerLeuValLeuLeuAsnSerGlyGlyTyr225230235240MetGlyAlaGinProGluTyrAspSerArgAlaAlaHisAlaAlaGlu245250255工leGlyAlaAlaGlyGly工leThrAsnAlaArgGlyLeuAlaGlyMet260265270TyrAlaProLeuAlaCysGlyGlyLysLeuLysGlyValGluLeuVal275280285SerProAspMetLeuAlaArgMetSerArgValAlaSerAlaThrGly290295300ArgAspAlaValLeuMetMetProThrArgPheAlaLeuGlyPheMet305310315320LysSerMetAspAsnArgArgGluProAlaGlyValGinAspSerAla325330335LeuPheGlyGluGluAlaPheGlyHisValGlyAlaGlyGlySerPhe340345350GlyPheAlaAspProLysAlaGlyMetSerPheGlyTyrThrMetAsn355360365ArgMetGlyLeuGlyMaGlyLeuAsnProArgGlyGinSerLeuVal370375380AspAlaThrTyrArgSerLeuGlyTyrGinSerAspAlaSerGlyAla385390395400TrpThi:<21〇>5<211>1578<212>DKIA<213>未知的<220><223>環(huán)境的<400>5atgagatcsgcagctcgcatcagcgtggcggcsgttgcctttctttgcctgctcttgacg603ctcgggtttccgcccagatcgtgccggcgatggaatgtgcggatctggcgaatcsgcag120cttcccaacacgacgatcacctcggcccagaccgtcaccaccggatcgttaacgcccccg180ggctcgacgaatccgatcaccgacctgcctcctttctgccgtgtcacaggcgccstcgcc240ccgscgagcgagtcgcacatcctcttcgaggtctggctgccgctggstaaatggaacggc300asgttcgccggcgtgggcaacggcggctgggccggcatcatctccttcggcgccctcgga360agccagctca3gcgcggctacgcgaccgcctccacgaatacgggtcscgaagcggcgccg420gggstgaacgcagccaggtttgcgttcgagaagccggagcsgcttstcgacttcgcctat480cgctcccagcacgagacggccctgaaagcgaaggcgctggttcaggctttctacgggaag540ccgccggaacactcctatttcstcgggtgctcstcgggtgggtaccagggcctgatggag600gcccsacgatttccggccg3ctacgacgggatcgtcgccggtatgccggcgaacaactgg6603cacggctgstggccggcgscttggacgcgatccttgccgtctccgtagatcctgccagc720caccttcccgtctccgcattgggtctgttgtatcgctcggtgctcgctgcctgcgscggc780stcgacggtgttgtagacggtgttctggaggatccgcgccgatgccggttcgacccggcc840gtgttga_tgtgc33ggcgg3tcsgsatcccgstggctgccttacgccggctcaggtggsa900gcggcacggcgcstatscggcggtctgaaggatcccssgaccggcgctcagctctatccg960gggctggcgccgggaagcgagccgttctggccgcaccgcaatccggcgaatccgttccct1020attccgatcgcgcactacaagtggctcgtctttgccgstccasactgggattggagaaca1080ttcaagttcacggatccggcggactaccaggctttcctcaatgcggaagccacgtatgcc1140cctsctctcaatgcgaccaatccggacctccgggagttcagccggcgcggcggcaggttg1200attcsgtaccatggctggaacgatcagctgattgccccgcaasacagcatcgactattac1260gsgagcgtcctttcgttcttcgggtccggcaaacaggstcgagcgcagaccgtgcgcgag1320gttcagagcttct3ccggctgttcatggcgccgggtstggctcactgtggaggcggtaca1380ggtccgaactcatttgacstgctggatgccctcgagssgtgggtggaaggcgggatagcg1440ccggaacgagtccttgcgacgcgttccataaacggcgtagtcgaccggctgcgcccgctc1500tgtccatatccgcaggtcgccgtgtacsagggtcatggggatscaaacgacgccgcgaac1560ttcgtctgtcgcgattag<210〉6<211〉525<212〉PRT<213>未知的<220><223〉環(huán)境的<220><221>信號(hào)<222〉(1)...(25)<400〉6MetArgSerAlaAlaArg工leSerValAlaAlaValAlaPheLeuCys151015LeuLeuLeuThrThrArgValSerAlaGin工leValProAlaMetGlu202530CysAlaAspLeuAlaAsnGinGinLeuProAsnThrThr工leThrSer354045AlaGinThrValThrThrGlySerLeuThrProProGlySerThrAsn505560Pro工leThrAspLeuProProPheCysArgValThrGlyAlalieAla65707580ProThrSerGluSerHis工leLeuPheGluValTrpLeuProLeuAsp859095LysTrpAsnGlyLysPheAlaGlyValGlyAsnGlyGlyTrpAlaGly100105110工lelieSerPheGlyAlaLeuGlySerGinLeuLysArgGlyTyrAla115120125ThrAlaSerThrAsnThrGlyHisGluAlaAlaProGlyMetAsnAla130135140AlaArgPheAlaPheGluLysProGluGinLeu工leAspPheAlaTyr1451501551601578<formula>formulaseeoriginaldocumentpage80</formula>工leGinTyrHisGlyTrpAsnAspGinLeu工leAlaProGinAsnSer405410415工leAspTyrTyrGluSerValLeuSerPhePheGlySerGlyLysGin420425430AspArgAlaGinThrValArgGluValGinSerPheTyrArgLeuPhe435440化MetAlaProGlyMetAlaHisCysGlyGlyGlyThrGlyProAsnSer450455460PheAspMetLeuAspAlaLeuGluLysTrpValGluGlyGlylieAla465470475糊ProGluArgValLeuAlaThrArgSer工leAsnGlyValValAspArg485490495LeuArgProLeuCysProTyrPr〇GinValAlaValTyrLysGlyHis500505510GlyAspThrAsnAspAlaAlaAsnPheValCysArgAsp51552052權(quán)利要求1.用于制備新伐他汀的方法，其包括圖5、圖6A或圖38中列出的方法。2.用于制備新伐他汀的方法，其包括具有下列步驟的方法(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸±卜.(b)內(nèi)酯化和酰化三醇酸，產(chǎn)生4-乙酰基內(nèi)酯，其中所述?；ㄍㄟ^區(qū)域選擇性?；?'-OH，保護(hù)內(nèi)酯環(huán)上的4位羥基(4'-OH);(c)酶促?；?-乙?；鶅?nèi)酯的8位羥基(8，-OH)，產(chǎn)生4-乙酰基新伐他??；和(d)化學(xué)地或是酶促地選擇性去除4'位的?；Ｗo(hù)基團(tuán)，從而產(chǎn)生新伐他汀。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(b)中的酰化包括，通過酶促區(qū)域選擇性?；?，-OH，保護(hù)內(nèi)酯環(huán)上的4位羥基(4'-OH)。4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(c)中的酶促?；?-乙?；鶅?nèi)酯8位羥基(8'-OH)，酶促地區(qū)域選擇性?；?位，產(chǎn)生4-乙?；路ニ?。5.用于制備新伐他汀的同型二酰基化方法，包括具有下列步驟的方法(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸；(b)通過內(nèi)酯化，從三醇酸產(chǎn)生二醇內(nèi)酯；(c)通過化學(xué)?；?，?；純?nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)上的第4位(4，-OH)和第8位(8，-OH)，產(chǎn)生4,8-二乙酰基內(nèi)酯；禾口(d)通過酶促水解，選擇性去除4'位的?；?，從而產(chǎn)生新伐他汀。6.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)步驟是在單獨(dú)的反應(yīng)容器中進(jìn)行的。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少兩個(gè)步驟是在單獨(dú)的反應(yīng)容器中進(jìn)行的。8.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)步驟是用細(xì)胞提取物進(jìn)行的。9.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)步驟是在全細(xì)胞中進(jìn)行的。10.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，進(jìn)一步包括新伐他汀的結(jié)晶。11.權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包括新伐他汀的重結(jié)晶。12.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，進(jìn)一步包括重新內(nèi)酯化，用以提供具有所需純度的新伐他汀。13.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)酶促反應(yīng)是用水解酶進(jìn)行的，所述水解酶是由與SEQIDNO:1有至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所編碼的，或者是其酶促活性片段。14.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)酶促反應(yīng)是用水解酶進(jìn)行的，所述水解酶是由與SEQIDNO:3有至少53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82°/o、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所編碼的，或者是其酶促活性片段。15.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)酶促反應(yīng)是通過水解酶進(jìn)行的，所述水解酶是由與SEQIDNO:5有至少56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所編碼的，或者是其酶促活性片段。16.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個(gè)酶促反應(yīng)是通過水解酶進(jìn)行的，所述水解酶具有的序列和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99。/?；蚋叩男蛄型恍?，或序列完全相同(100%)，或者是其酶促活性片段。17.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述方法包括酶促水解洛伐他汀，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸鹽，隨后通過內(nèi)酯化三醇酸和酶促?；瘍?nèi)酯環(huán)的第4位(4'-OH)，產(chǎn)生4-?；鶅?nèi)酯，之后酶促?；?-?；鶅?nèi)酯，產(chǎn)生4-乙?；路ニ?，然后通過區(qū)域選擇性酶促水解4-乙酰基新伐他汀，產(chǎn)生新伐他汀。18.制備4-乙?；鶅?nèi)酯的方法，包括酶促水解洛伐他汀，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸鹽，隨后通過內(nèi)酯化三醇酸，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯，然后通過區(qū)域選擇性?；純?nèi)酯中內(nèi)酯環(huán)上的第4位(4'-OH)，產(chǎn)生4-乙?；鶅?nèi)酯。19.制備4-乙?；路ニ〉姆椒ǎ复偎饴宸ニ?，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸鹽，隨后通過內(nèi)酯化三醇酸，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯，之后通過區(qū)域選擇性酶促酰化二醇內(nèi)酯中內(nèi)酯環(huán)上的第4位(4'-OH)，產(chǎn)生4-乙酰基內(nèi)酯，然后通過區(qū)域選擇性酶促酰化4-乙?；鶅?nèi)酯中內(nèi)酯的第8位(8'-OH)，產(chǎn)生4-乙?；路ニ　?0.從洛伐他汀制備三醇酸或三醇酸鹽的方法，包括(a)提供洛伐他汀、洛伐他汀或洛伐他汀鹽，以及酯酶；(b)在酯酶催化洛伐他汀水解為三醇酸或三醇酸鹽的條件下，用酯酶接觸洛伐他汀、洛伐他汀或洛伐他汀鹽。21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述酯酶的序列和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)。22.從洛伐他汀制備三醇酸或三醇酸鹽的方法，包括如圖15A、圖16A、圖18E或圖19中列出的方法。23.從洛伐他汀酸制備三醇酸的方法，包括如圖16A中列出的方法。24.從洛伐他汀制備洛伐他汀酸的方法，包括如圖16A中列出的方法。25.從三醇酸制備二醇內(nèi)酯的方法，包括如圖8中列出的方法。26.從二醇內(nèi)酯制備酰基內(nèi)酯的方法，包括如圖16C中列出的方法。27.從三醇酸制備酰基內(nèi)酯的方法，包括如圖16D中列出的方法。28.從三醇酸制備4-乙?；鶅?nèi)酯的方法，包括如圖9A中列出的方法。29.從酰基內(nèi)酯制備?；路ニ〉姆椒ǎㄈ鐖D16E中列出的方法。30.從4-乙?；鶅?nèi)酯制備4-乙酰基新伐他汀的方法，包括如圖9B中列出的方法。31.從4-乙酰基新伐他汀制備新伐他汀的方法，包括如圖9C或圖11中列出的方法。32.從酰基新伐他汀制備新伐他汀銨鹽的方法，包括如圖16F中列出的方法。33.從新伐他汀銨鹽制備新伐他汀的方法，包括如圖16F中列出的方法。34.從洛伐他汀、三醇酸、4-?；鶅?nèi)酯或4-?；路ニ≈苽湫路ニ』蛳嚓P(guān)化合物的方法，包括如圖5、圖6A或圖38中列出的方法，其中在步驟3中加入的4位保護(hù)基團(tuán)是R基團(tuán)，所述R基團(tuán)選自(i)-H，甲基或甲酰衍生物；(ii)Cl-n烷基，直鏈和支鏈的，其中n是l和20之間的整數(shù)；(iii)取代的垸基；(iv)苯基和取代的苯基例如苯基、對(duì)硝基苯基；和(v)R'O-基團(tuán)，其形成碳酸酯保護(hù)基團(tuán)，其中所述R'是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任何一個(gè)基團(tuán)。35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述取代的烷基包括氯乙?；⑷纫阴；⑷阴；⒓籽趸阴；⒈揭阴；?、4-氧戊基(乙酰丙酸)或其等價(jià)物。36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述碳酸酯保護(hù)基團(tuán)包括tBuOCO、PhOCO、PhCH20CO或其等價(jià)物。37.試劑盒，包括試劑和至少一種水解酶，用于實(shí)施權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求5的方法。38.權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述至少一種水解酶的序列和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(IOO%)，或者是其酶促活性片段。39.制備新伐他汀的方法，包括5步異二?；^程，所述過程具有下列步驟(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸鹽，產(chǎn)生三醇酸或三醇酸jm，(b)內(nèi)酯化三醇酸，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯；(c)通過酶促地選擇性?；?'-OH，保護(hù)二醇內(nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)上的第4位羥基(4，-OH)，產(chǎn)生4-?；鶅?nèi)酯；(d)通過酶促地選擇性酰化第8位，?；?-?；鶅?nèi)酯的第8位羥基(8'-OH)，產(chǎn)生4-?；路ニ。缓?e)化學(xué)地或是酶促地選擇性去除4'位的?；Ｗo(hù)基團(tuán)，從而產(chǎn)生新伐他汀。40.權(quán)利要求39所述的方法，其中在步驟(b)中的內(nèi)酯化三醇酸產(chǎn)生二醇內(nèi)酯包括，加熱三醇酸或在酸存在下進(jìn)行攪拌，產(chǎn)生二醇內(nèi)酯。全文摘要本發(fā)明提供了制備新伐他汀及各種中間體的合成化學(xué)和化學(xué)酶方法。在一個(gè)方面，在本發(fā)明方法中應(yīng)用酶，如水解酶，例如酯酶。文檔編號(hào)C07DGK101415833SQ200480036202公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2004年10月20日優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日發(fā)明者B·摩根,J·查普林,K·庫什特德約,M·伯克,M·萊溫,W·格林伯林,朱作霖,黃子林申請(qǐng)人:戴弗薩公司