基于李斯特菌的EphA2疫苗的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化學(xué)裝置的制造及其處理,應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：：基于李斯特菌的EphA2疫苗的制作方法本申請(qǐng)要求如下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2003年10月15日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/511,919、2003年10月15日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/511,719、2003年12月24日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/532,666、2004年3月26日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/556,631、2004年10月遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)(律師案卷號(hào)10271-144-888)、和2004年10月7日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)(律師案卷號(hào)10271-146-888)，各申請(qǐng)?jiān)诖吮煌暾貐⒖家谩?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療、控制或預(yù)防增殖細(xì)胞疾病的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及引發(fā)對(duì)抗過量增殖細(xì)胞的免疫反應(yīng)的、基于李斯特菌的組合物以及使用該組合物的方法。其中，本發(fā)明包括含有表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌(Listeria)的疫苗，和用這種EphA2疫苗給藥以引發(fā)對(duì)抗表達(dá)EphA2的過量增殖細(xì)胞的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了疫苗，該疫苗包含與一種或多種用于治療增殖性病癥的其它試劑組合的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的組合物。2、
背景技術(shù)：
2.1.李斯特菌單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(李斯特菌)是革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌，由于該菌能夠通過MHCI類和II類抗原呈遞路徑激發(fā)有效的CD4+/CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，因此其被研制用于抗原特異性的疫苗，且最近在正常健康志愿者的人體臨床實(shí)驗(yàn)中作為疫苗載體得到測(cè)試。李斯特菌作為刺激先天性和適應(yīng)性T細(xì)胞依賴的抗菌免疫性的模型已被研究多年。李斯特菌有效刺激細(xì)胞免疫性的能力是基于其細(xì)胞內(nèi)的生命周期。一旦感染了宿主，該細(xì)菌就被噬菌細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，迅速吸收進(jìn)吞噬溶酶體內(nèi)。大部分的細(xì)菌隨后被降解。在感染的抗原呈遞細(xì)胞的吞噬體內(nèi)，病原體蛋白水解成肽，該肽直接加載到MHCII類分子上。這些MHCII-肽復(fù)合物激活CD4+“輔助”T細(xì)胞，從而刺激抗體的產(chǎn)生，且加工后的抗原通過II類內(nèi)涵體通路在該抗原的呈遞細(xì)胞表面表達(dá)。在所述酸性小室中，某些細(xì)菌基因被激活，包括膽固醇依賴性細(xì)胞溶解素、LLO，其能夠降解吞噬溶酶體，從而將細(xì)菌釋放到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)小室中，存活的李斯特菌在此繁殖。通過MHCI類路徑有效呈遞異源抗原需要李斯特菌重新表達(dá)內(nèi)源蛋白。在抗原呈遞細(xì)胞(APC)中，由李斯特菌合成和分泌的蛋白被蛋白體吸收和降解。產(chǎn)生的肽被TAP蛋白運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并加載到MHCI類細(xì)胞上。MHCI-肽復(fù)合物被遞送到細(xì)胞表面，與足量的共刺激(信號(hào)2)結(jié)合而激活并刺激具有同源T細(xì)胞受體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增并隨后識(shí)別MHCI-肽復(fù)合物。2.2.過量增殖性疾病2.2.1.癌癥瘤或腫瘤是由異常的不受控制的細(xì)胞生長所產(chǎn)生的瘤物質(zhì)，其可以是良性的或惡性的。良性腫瘤一般保持在局部。惡性腫瘤統(tǒng)稱為癌癥。術(shù)語“惡性的”一般是指能夠入侵并破壞鄰近肌體結(jié)構(gòu)，并擴(kuò)散至遠(yuǎn)位點(diǎn)而造成死亡的腫瘤(關(guān)于綜述，參見Robbins和Angell，1976，BasicPathology，第二版，W.B.Saunders公司，Philadelphia，第68-122頁)。癌癥可以在身體的許多位點(diǎn)發(fā)生并根據(jù)其起源有不同的表現(xiàn)。癌細(xì)胞破壞其起源處的身體部分并隨后擴(kuò)散到身體的其它部分，在這些部分它們開始新的生長并引起進(jìn)一步的破壞。每年有超過一百二十萬的美國人患癌癥。在美國癌癥是第二大致死因，而且如果按照目前的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2010年癌癥將成為第一大致死因。肺癌和前列腺癌是美國男性的最大癌殺手。肺癌和乳腺癌是美國女性的最大癌殺手。在美國，兩名男性中有一名會(huì)在其生命中的某個(gè)時(shí)期被診斷患有癌癥，三名女性中有一名會(huì)在其生命中的某個(gè)時(shí)期被診斷患有癌癥。癌癥仍然無法治愈。目前的治療選擇，如手術(shù)、化療和放療，常常無效或產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。2.2.2.轉(zhuǎn)移瘤當(dāng)腫瘤細(xì)胞群獲得了在身體的遠(yuǎn)位點(diǎn)和異質(zhì)位點(diǎn)定居生長的能力時(shí)，通常就會(huì)產(chǎn)生最具生命威脅的形式的癌。這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞通過突破正常抑制細(xì)胞向不同組織定居生長的限制而存活。例如，如果將一般的哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞移植到肺部，其一般不能生長或存活，然而肺轉(zhuǎn)移瘤是乳腺癌發(fā)病率和死亡率的主要原因。近來有證據(jù)表明，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞在身體內(nèi)的擴(kuò)散可以發(fā)生在原發(fā)瘤出現(xiàn)臨床表現(xiàn)很長的時(shí)間之前。在檢測(cè)到并除去原發(fā)性腫瘤之后，這些微轉(zhuǎn)移性細(xì)胞可以保持休眠幾個(gè)月或幾年。因此，為了改進(jìn)設(shè)計(jì)而對(duì)抗轉(zhuǎn)移性癌的治療并用于早期檢測(cè)和定位轉(zhuǎn)移瘤的診斷，更好地了解轉(zhuǎn)移性細(xì)胞在異質(zhì)微環(huán)境中生長和存活的機(jī)制十分重要。2.2.3.癌細(xì)胞信號(hào)癌癥是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的疾病。異常的細(xì)胞信號(hào)突破了對(duì)細(xì)胞生長和存活的錨定依賴性限制(Rhim等1997，CritRevinOncogenesis8305；Patarca，1996，CritRev.inOncogenesis7343；Malik等，1996，BiochimicaetBiophysicaActa128773；Cance等，1995，BreastCancerRes.Treat.35105)。酪氨酸激酶活性由胞外基質(zhì)(ECM)錨定誘導(dǎo)，且事實(shí)上，酪氨酸激酶的表達(dá)或功能通常在惡性細(xì)胞中被增強(qiáng)(Rhim等，1997，CriticalReviewsinOncogenesis8305；Cance等，1995，BreastCancerRes.Treat.35105；Hunter，1997，Cell88333)。鑒于惡性細(xì)胞的生長需要酪氨酸激酶活性的事實(shí)，酪氨酸激酶成為新治療方法的標(biāo)靶(Levitzki等1995，Science2671782；Kondapaka等1996，Mol.&CellEndocrinol.11753；Fry等，1995，Curr.Opin.inBioTechnology6662)。不幸地是，與腫瘤細(xì)胞特異性有關(guān)的障礙經(jīng)常限制這些藥物的應(yīng)用。具體而言，酪氨酸激酶活性對(duì)于良性組織的功能和存活通常至關(guān)重要(Levitzki等人，Science2671782，1995)。為了使附隨的毒性最小化，首先識(shí)別在腫瘤細(xì)胞中選擇性過量表達(dá)的酪氨酸激酶，然后以其為標(biāo)靶非常重要。2.2.4.癌癥治療研發(fā)抗轉(zhuǎn)移試劑的障礙是用于設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)這些藥物的分析系統(tǒng)。大多數(shù)常規(guī)的癌癥治療是以迅速生長的細(xì)胞為標(biāo)靶。然而，癌細(xì)胞并不一定快速生長，然而卻可以在不允許正常細(xì)胞存活的條件下存活或生長(Lawrence和Steeg，1996，WorldJ.Urol.14124-130)。正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞在行為上的這些基本差異為治療標(biāo)靶提供了機(jī)會(huì)。擴(kuò)散到全身的微轉(zhuǎn)移腫瘤的實(shí)例強(qiáng)調(diào)了在外部和三維微環(huán)境中需要評(píng)估可能的化學(xué)治療藥物。在常用細(xì)胞培養(yǎng)條件下可用多種標(biāo)準(zhǔn)的癌癥藥物分析法來測(cè)量腫瘤細(xì)胞的生長或存活(即單層生長)。然而，在二維分析中的細(xì)胞行為通常不能可靠地預(yù)測(cè)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞行為。目前，癌癥治療可以包括外科治療、化學(xué)治療、激素治療和/或放射治療，以根除患者的腫瘤細(xì)胞(參見，例如，Stockdale，1998，″PrinciplesofCancerPatientManagement″，ScientificAmericanMedicine，卷3，Rubenstein和Federman，第12章，第IV部分)。近來，癌癥治療也可以包括生物治療或免疫治療。所有這些方法對(duì)患者而言都有明顯的缺點(diǎn)。例如，外科治療可能由于患者的健康情況而不適宜，或者患者不能接受。此外，外科治療不可能完全除去腫瘤組織。放射治療只有在新生組織比正常組織表現(xiàn)出更高的放射敏感性時(shí)才有效，并且放射治療還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。激素治療雖然是有效的，但是其很少以單一試劑給予，在使用其他治療除去大部分癌細(xì)胞后，激素治療常用于預(yù)防或延緩癌癥復(fù)發(fā)。生物治療/免疫治療受到次數(shù)限制，并且每種治療通常只對(duì)極特定類型的癌癥有效。關(guān)于化學(xué)治療，有多種化學(xué)治療試劑可用來治療癌癥。大部分癌癥的化學(xué)治療是通過直接抑制DNA合成或間接抑制脫氧(核糖)核苷三磷酸前體的生物合成以預(yù)防DNA復(fù)制和伴隨的細(xì)胞分裂而發(fā)揮作用(參見，例如，Gilman等人，1990，Goodman和Gilman′sThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第八版(PergamomPress，NewYork))。這些試劑包括烷基化試劑，如亞硝基脲，抗代謝物，如甲氨蝶呤和羥基脲，及其他試劑，如依托泊苷(etoposide)，campathecins，博來霉素，多柔比星，柔紅霉素等，盡管它們具有必需的細(xì)胞周期特異性，但是由于它們對(duì)DNA復(fù)制起作用，因此可以在S期殺死細(xì)胞。其他試劑，具體而言是秋水仙堿和長春花生物堿，如長春堿和長春新堿，可以干擾微管組裝，從而使有絲分裂停滯?；瘜W(xué)治療方法通常包括給予化學(xué)治療試劑的組合來提高治療效果。盡管可以使用多種化學(xué)治療試劑，但是化學(xué)治療具有很多缺點(diǎn)(參見，例如，Stockdale，1998，″PrinciplesofCancerPatientManagement″，ScientificAmericanMedicine，卷3，Rubenstein和Federman，第12章，第10部分)。幾乎所有的化學(xué)治療試劑都有毒性，而且化學(xué)治療會(huì)引發(fā)明顯的而且經(jīng)常是很危險(xiǎn)的副作用，包括嚴(yán)重惡心，骨髓抑制，免疫抑制等。此外，即使給予化學(xué)治療試劑的組合，很多腫瘤細(xì)胞仍會(huì)對(duì)化學(xué)治療試劑有抗性或會(huì)發(fā)展成具有抗性。事實(shí)上，對(duì)治療方法中使用的特定化學(xué)治療試劑有抗性的那些細(xì)胞經(jīng)常被證實(shí)對(duì)其他藥物也有抗性，即使那些試劑的作用機(jī)理不同于特異性治療中所用藥物的作用機(jī)理；這種現(xiàn)象稱為多向耐藥性或多藥耐藥性。因此，由于耐藥性，多種癌癥難于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)治療。這樣明顯需要可選擇的癌癥治療方法，尤其是用于治療難于用標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療法(如外科治療，放射治療，化學(xué)治療，及激素治療)治療的癌癥的治療方法。此外，僅通過一種方法來進(jìn)行癌癥治療非常少見。因此，需要研發(fā)治療癌癥的新的治療試劑和治療癌癥的、新的更有效的治療組合。2.2.5.其它過量增殖性病癥2.2.5.1.哮喘哮喘是一種特征為間歇性氣道堵塞的病癥。在西方國家，哮喘影響了15％的少兒人群和及7.5％的成人人群(Strachan等，1994，Arch.Dis.Child70174-178)。兒童和年輕人中的絕大部分哮喘是由對(duì)吸入的過敏原，如家塵螨和貓毛過敏原的IgE介導(dǎo)性過敏(遺傳性過敏癥)所引發(fā)的。然而，并不是所有的哮喘病都是遺傳過敏性的，且絕大多數(shù)遺傳性過敏癥的個(gè)體不患哮喘病。因此遺傳性過敏癥以外的因素是誘導(dǎo)該病癥所必需的(Fraser等編，1994，SynopsisofDiseasesoftheChest635-53(WBSaunders公司，Philadelphia)；Djukanovic等，1990，Am.Rev.Respri.Dis.142434-457)。哮喘有很強(qiáng)的家族性，且由遺傳因素和環(huán)境因素之間的相互作用引起。該遺傳因素被認(rèn)為是正?；虻淖儺愺w(“多態(tài)性”)，這些變異體的功能發(fā)生改變而易于發(fā)生哮喘。哮喘可通過周期性喘息和間歇性氣流限制來識(shí)別。通過測(cè)量支氣管的過度反應(yīng)性可以將哮喘的趨勢(shì)量化，其中構(gòu)建個(gè)體對(duì)支氣管收縮劑如組胺或乙酰甲膽堿的劑量-應(yīng)答曲線。該曲線通常總結(jié)為導(dǎo)致氣流20％降低(PD20)的劑量，或初始?xì)饬鳒y(cè)量值與最后給藥劑量之間的曲線的斜率(斜率)。在遺傳性過敏反應(yīng)中，B細(xì)胞在應(yīng)答過敏原刺激時(shí)產(chǎn)生IgE。這些抗體通過與IgE的高親和性受體結(jié)合而包被肥大細(xì)胞并引起一系列的細(xì)胞事件，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜不穩(wěn)定和釋放炎性介質(zhì)。這會(huì)導(dǎo)致粘膜發(fā)炎、喘息、咳嗽、打噴嚏和鼻塞。遺傳性過敏癥可通過如下方式來診斷(i)應(yīng)答普通過敏原的陽性皮試；(ii)檢測(cè)過敏原的特異性血清IgE的存在；或(iii)檢測(cè)總血清IgE的升高。2.2.5.2.COPD慢性阻塞性肺病(COPD)常被用來描述固定性氣道病癥的兩種情況，即慢性支氣管炎和肺氣腫的總稱。慢性支氣管炎和肺氣腫最通常地是由吸煙引起，大約90％的COPD患者是或曾經(jīng)是吸煙者。盡管大約50％的吸煙者產(chǎn)生了慢性支氣管炎，但是僅有15％的吸煙者出現(xiàn)閉塞性氣流阻塞。某些動(dòng)物，特別是馬，也會(huì)患COPD。與COPD相關(guān)的氣流阻塞是漸進(jìn)性的，可能伴隨有氣道的過度反應(yīng)且可能部分地可逆。非特異性氣道過度反應(yīng)性在COPD的發(fā)展中也可能發(fā)揮著作用，而且可能是肺功能加速衰竭的先兆。COPD是死亡和殘疾的重要原因。目前它在美國和歐洲是第四大致死因。治療指導(dǎo)提倡早期檢測(cè)和實(shí)施戒煙計(jì)劃，以幫助降低該病癥的發(fā)病率和死亡率。然而，因?yàn)樵S多原因，早期的檢測(cè)和診斷一直很困難。COPD的發(fā)展需要數(shù)年的時(shí)間，且支氣管炎的急性發(fā)作經(jīng)常不被一般的醫(yī)生認(rèn)作是COPD的早期信號(hào)。很多患者表現(xiàn)出多種病癥(例如慢性支氣管炎或哮喘性支氣管炎)的特征，這使得準(zhǔn)確診斷成為一種挑戰(zhàn)，特別是在該病癥癥的病因?qū)W早期進(jìn)行診斷。而且，很多患者不尋求醫(yī)學(xué)幫助，直到他們經(jīng)受到與肺功能衰竭有關(guān)的更嚴(yán)重癥狀，例如呼吸困難、持續(xù)咳嗽和產(chǎn)生痰。因此，絕大部分患者得不到診斷或治療直至他們發(fā)展到該病癥的更高階段。2.2.5.3.粘蛋白粘蛋白是由上皮細(xì)胞，包括呼吸道、胃腸道和女性生殖道的上皮細(xì)胞分泌的糖蛋白家族。粘蛋白使粘液具有粘彈性(Thornton等，1997，J.Biol.Chem.2729561-9566)。已知在人體中表達(dá)九種粘蛋白基因MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7和MUC8(Bobek等，1993，J.Biol.Chem.26820563-9；Dusseyn等，1997，J.Biol.Chem.2723168-78；Gendler等，1991，Am.Rev.Resp.Dis.144S42-S47；Gum等，1989，J.Biol.Chem.2646480-6487；Gum等，1990，Biochem.Biophys.Res.Comm.171407-415；Lesuffleur等，1995，J.Biol.Chem.27013665-13673；Meerzaman等，1994，J.Biol.Chem.26912932-12939；Porchet等，1991，Biochem.Biophys.Res.Comm.175414-422；Shankar等，1994，Biochem.J.300295-298；Toribara等，1997，J.Biol.Chem.27216398-403)。許多氣道疾病如慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病、bronchietactis、哮喘、囊腫性纖維化和細(xì)菌感染的特征為粘蛋白過量表達(dá)(Prescott等，Eur.Respir.J.，1995，81333-1338；Kim等，Eur.Respir.J.，1997，101438；Steiger等，AmJRespir.CellMol.Biol.，12307-314)。粘蛋白過量分泌導(dǎo)致粘膜纖毛損傷，從而使氣道粘液阻塞，該阻塞會(huì)促進(jìn)慢性感染、氣道堵塞、有時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。例如，COPD，一種以緩慢進(jìn)行性和不可逆性氣流限制為特征的病癥，在發(fā)達(dá)國家是主要的致死原因。呼吸退化主要包括內(nèi)腔直徑變小，這是由于杯狀細(xì)胞增生和過度分泌導(dǎo)致氣道壁變厚和粘液增加。已知表皮生長因子(EGF)上調(diào)上皮細(xì)胞的增殖以及粘蛋白的產(chǎn)生/分泌(Takeyama等，1999，Proc.Natl.Sci.USA963081-6；Burgel等，2001，J.Immunol.1675948-54)。EGF還使粘蛋白分泌細(xì)胞，如杯狀細(xì)胞增殖并使氣道上皮細(xì)胞中的粘蛋白產(chǎn)生增加(Lee等，2000，Am.J.Physiol.LungCellMol.Physiol.278185-92；Takeyama等，2001，Am.J.Respir.Crit.Care.Med.163511-6；Burgel等，2000，JAllergyClin.Immunol.106705-12)。一直以來，使用兩種方法來治療粘液過度分泌增加清除試劑和粘液溶解試劑的物理方法。沒有一種方法對(duì)患者產(chǎn)生了明顯效果或降低了粘蛋白阻塞。因此，需要減少粘蛋白產(chǎn)生和治療與粘蛋白過度分泌相關(guān)的病癥的方法。2.2.5.4.再狹窄血管介入，包括血管成形術(shù)、支架植入術(shù)、切除術(shù)和移植術(shù)通常由于產(chǎn)生不需要的效果而復(fù)雜化。暴露于移植入或插入到患者體內(nèi)的醫(yī)學(xué)設(shè)備會(huì)使身體組織產(chǎn)生不良的生理反應(yīng)。例如，插入或植入某些導(dǎo)管或支架會(huì)導(dǎo)致在血管中形成栓或凝塊。其它血管介入的不良反應(yīng)包括可導(dǎo)致增生的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、再狹窄(即動(dòng)脈的再阻塞)、血管阻塞、血小板聚集和鈣化。再狹窄的治療通常包括第二血管成形術(shù)或旁通手術(shù)。具體來說，再狹窄可能是由于在治療再狹窄過程中的血管介入所造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的。血管成形術(shù)包括在部分阻塞的動(dòng)脈粥樣硬化的損傷位點(diǎn)將球囊導(dǎo)管插入動(dòng)脈。球囊的膨脹易于破壞內(nèi)膜并擴(kuò)大阻塞。大約20％到30％的阻塞僅在幾天或幾周后再閉塞(Eltchaninoff等，1998，J.AmColl.Cardiol.32980-984)。支架的使用降低了再閉塞的發(fā)生率，但是發(fā)生再狹窄的百分比仍然很顯著。血管成形術(shù)后的再狹窄率依賴于許多因素，包括斑塊的長度。依據(jù)存在的風(fēng)險(xiǎn)因子，狹窄率在10％至35％之間變化。此外，一年后重復(fù)進(jìn)行的血管造影術(shù)表明，僅在大約30％的經(jīng)歷過該過程的血管中有看起來正常的內(nèi)腔。再狹窄是由胞外基質(zhì)的堆積所導(dǎo)致的，該胞外基質(zhì)含有與平滑肌細(xì)胞有關(guān)的膠原蛋白和蛋白聚糖，在球囊損傷或臨床血管成形術(shù)后在動(dòng)脈粥樣瘤和動(dòng)脈增生損傷中發(fā)現(xiàn)這些基質(zhì)。與平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)的內(nèi)腔狹窄的一些延遲可能是由于新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞持續(xù)合成基質(zhì)材料。在體內(nèi)有各種介質(zhì)可以改變平滑肌的基質(zhì)合成。2.2.5.5.新生內(nèi)膜增生新生內(nèi)膜增生是移植動(dòng)脈硬化、狹窄和大部分血管移植閉塞的病理學(xué)過程。新生內(nèi)膜增生通常在各種形式的血管損傷和大部分靜脈移植摘取反應(yīng)和手術(shù)移植到高壓動(dòng)脈循環(huán)后觀察到。血管壁中間層(即中層)的平滑肌細(xì)胞被活化、分裂、增殖并遷移進(jìn)內(nèi)層(即內(nèi)膜層)。生成的異常新生內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)促炎分子，包括細(xì)胞因子、化學(xué)因子和粘附分子，它們進(jìn)一步啟動(dòng)級(jí)聯(lián)事件，造成閉塞性新生內(nèi)膜疾病和最終的移植失敗。平滑肌細(xì)胞增殖是新生內(nèi)膜增生反應(yīng)中的關(guān)鍵事件。使用各種方法進(jìn)行研究，已經(jīng)清楚地證實(shí)了阻斷平滑肌細(xì)胞增殖會(huì)使正常血管的表型和功能得到維持，從而減少新生內(nèi)膜增生和最終的移植失敗。治療上文所討論的適應(yīng)癥的現(xiàn)有治療方法還不足夠，因此，需要對(duì)上述適應(yīng)癥的治療方法進(jìn)行改進(jìn)。2.3.EphA2EphA2是在成人上皮細(xì)胞中表達(dá)的130kDa的受體酪氨酸激酶，發(fā)現(xiàn)其在上皮細(xì)胞中的水平低而在細(xì)胞-細(xì)胞粘附位點(diǎn)內(nèi)得到富集(Zantek等，1999，CellGrowth&Differentiation10629；Lindberg等，1990，Molecular&CellularBiology106316)。這種亞細(xì)胞定位很重要，因?yàn)镋phA2結(jié)合錨定在細(xì)胞膜上的配體(已知為EphrinsA1至A5)(Eph命名委員會(huì)，1997，Cell90403；Gale等，Cell&TisueResearch290227)。配體結(jié)合的初級(jí)結(jié)果是EphA2自動(dòng)磷酸化(Lindberg等，1990，同上)。但是，不像其它的受體酪氨酸激酶，在配體結(jié)合或磷酸化酪氨酸缺乏的情況下，EphA2保持酶活性(Zantek等，1999，同上)。EphA2上調(diào)大量過量增殖的細(xì)胞，包括侵入性癌細(xì)胞。3、
發(fā)明內(nèi)容EphA2在大量惡性癌癥中過量表達(dá)并發(fā)生功能性變化。EphA2是癌蛋白并足以賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛力。EphA2還與其它過量增殖細(xì)胞有關(guān)并與細(xì)胞過量增殖引起的疾病有關(guān)。本發(fā)明是基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)對(duì)個(gè)體用表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌給藥，產(chǎn)生對(duì)抗與EphA2過量表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的過量增殖性病癥的有益治療和預(yù)防效果。不受到任何機(jī)制或理論的約束，相信治療和預(yù)防效果是用表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌給藥而引起免疫應(yīng)答的結(jié)果。本發(fā)明因此提供了基于李斯特菌的EphA2疫苗和使用它們的方法。本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗可以引起細(xì)胞免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答或兩者。當(dāng)免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)，其可以是Tc、Th1或Th2免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫應(yīng)答是Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗表達(dá)EphA2的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇，該EphA2相對(duì)于非癌細(xì)胞(即正常的、健康的細(xì)胞或不過量增殖的細(xì)胞)在癌細(xì)胞上選擇性地暴露或增加。在一實(shí)施方案中，該癌癥是上皮細(xì)胞源的。在其它實(shí)施方案中，該癌癥是皮膚癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌或胰腺癌或是腎細(xì)胞癌或黑素瘤。在另一實(shí)施方案中，該癌癥是T細(xì)胞源的。在其它實(shí)施方案中，癌癥是白血病或淋巴瘤。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于預(yù)防、治療或控制表達(dá)EphA2的腫瘤的轉(zhuǎn)移。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答所對(duì)抗的EphA2表達(dá)細(xì)胞(“靶細(xì)胞”)相對(duì)于相同類型的正常健康細(xì)胞過量表達(dá)EphA2，這可以用本文所描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分析方法(例如免疫分析如ELISA或Western印跡、Northern印跡或RT-PCR)來檢測(cè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于相同類型的正常健康細(xì)胞，靶細(xì)胞上的EphA2很少與配體結(jié)合，這可能是因?yàn)榧?xì)胞-細(xì)胞接觸減少、亞細(xì)胞定位被改變或EphA2的數(shù)量相對(duì)于配體增加。在另一實(shí)施方案中，相對(duì)于相同類型的正常健康的細(xì)胞，大約10％或更少的、大約15％或更少的、大約20％或更少的、大約25％或更少的、大約30％或更少的、大約35％或更少的、大約40％或更少的、大約45％或更少的、大約50％或更少的、大約55％或更少的、大約60％或更少的、大約65％或更少的、大約70％或更少的、大約75％或更少的、大約80％或更少的、大約85％或更少的、大約90％或更少的、大約95％或更少的靶細(xì)胞上EphA2與配體(例如EphrinA1)結(jié)合，這可以用本領(lǐng)域已知的分析方法(例如免疫分析)來檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，相對(duì)于相同類型的正常健康的細(xì)胞，少1-10倍、1-8倍、1-5倍、1-4倍或1-2倍、或1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍的靶細(xì)胞上EphA2與配體(例如EphrinA1)結(jié)合，這可以用本領(lǐng)域已知的分析方法(例如免疫分析)來檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了引發(fā)對(duì)抗EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包含以引發(fā)對(duì)抗EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)的有效量，用基于李斯特菌的EphA2疫苗向個(gè)體給藥。本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或控制EphA2表達(dá)細(xì)胞的過量增殖性病癥的方法，所述方法包括以治療或預(yù)防過量增殖性病癥(例如腫瘤過量增殖性病癥和非腫瘤過量增殖性病癥)的有效量，用基于李斯特菌的EphA2疫苗向個(gè)體給藥。本發(fā)明還提供了可用于引發(fā)對(duì)抗EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫應(yīng)答和/或用于治療、預(yù)防或控制EphA2表達(dá)細(xì)胞的過量增殖性病癥的基于李斯特菌的EphA2疫苗?；诶钏固鼐腅phA2疫苗可包含作為EphA2抗原性肽表達(dá)載體的李斯特菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向個(gè)體(優(yōu)選地是人)給藥的作為EphA2抗原性肽表達(dá)載體的李斯特菌是減毒的。例如，向個(gè)體(優(yōu)選地是人)給藥的減毒李斯特菌可能在其組織趨向性(例如inlB突變體)或從細(xì)胞至細(xì)胞的擴(kuò)散能力(例如actA突變體)方面得到減弱。在特定實(shí)施方案中，向個(gè)體(優(yōu)選地是人)給藥的作為EphA2抗原性肽表達(dá)載體的減毒李斯特菌包含在一或多個(gè)內(nèi)化素(例如inlA和/或inlB)中的突變(例如刪除、添加或取代)，且這種突變導(dǎo)致李斯特菌減毒。在另一實(shí)施方案中，向個(gè)體(優(yōu)選地是人個(gè)體)給藥的作為EphA2抗原性肽表達(dá)載體的減毒李斯特菌在其組織趨向性(例如inlB突變體)和從細(xì)胞至細(xì)胞的擴(kuò)散能力(例如actA突變體)方面得到減弱。在另一實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體(優(yōu)選地是人個(gè)體)給藥的作為EphA2抗原性肽表達(dá)載體的減毒李斯特菌包含在內(nèi)化素B中的突變(例如刪除、添加或取代)和在actA中的突變，且這些突變導(dǎo)致李斯特菌減毒。本發(fā)明的李斯特菌(優(yōu)選地，減毒的李斯特菌)優(yōu)選地構(gòu)建成能夠表達(dá)分泌自李斯特菌的EphA2抗原性肽。在特定實(shí)施方案中，編碼EphA2抗原性肽的核酸包含編碼分泌信號(hào)，例如SecA分泌信號(hào)或Tat信號(hào)，的核苷酸序列，該序列與編碼EphA2抗原性肽的核苷酸序列操作性地連接。在某些實(shí)施方案中，該信號(hào)序列是李斯特菌信號(hào)序列。在其它實(shí)施方案中，該信號(hào)序列是除了李斯特菌信號(hào)序列以外的細(xì)菌信號(hào)序列(即非李斯特菌信號(hào)序列)。適用于本發(fā)明的方法和組合物的李斯特菌菌株包括但不限于格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、無害李斯特菌(Listeriainnocua)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、斯氏李斯特菌(Listeriaseeligeri)和魏氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)。用于本發(fā)明的方法和組合物的李斯特菌的優(yōu)選菌株是單核增生李斯特菌。本發(fā)明的組合物和方法可用于治療、預(yù)防和/或控制過量增殖性疾病。在某些特定的實(shí)施方案中，該過量增殖性疾病是癌癥。在某些實(shí)施方案中，該癌癥是上皮細(xì)胞源的和/或涉及到相對(duì)于與所述癌細(xì)胞具有相同組織類型的非癌細(xì)胞過量表達(dá)EphA2的細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，該癌癥是皮膚癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌或是腎細(xì)胞癌或黑素瘤。在其它實(shí)施方案中，該癌癥是T細(xì)胞源的。在特定實(shí)施方案中，該癌癥是白血病或淋巴瘤。在其它實(shí)施方案中，該過量增殖性病癥是非腫瘤性的。在特定實(shí)施方案中，該非腫瘤過量增殖性病癥是上皮細(xì)胞病癥。非腫瘤過量增殖性病癥的例子是哮喘、慢性肺阻塞病、肺纖維化、支氣管過度反應(yīng)、牛皮癬和脂溢性皮炎。在某些實(shí)施方案中，該過量增殖性疾病是內(nèi)皮細(xì)胞病癥。用于本發(fā)明的方法和組合物的EphA2抗原性肽可以包含全長的EphA2或其抗原性片段、類似物或衍生物。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域或EphA2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽缺乏EphA2跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含EphA2的胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，并缺乏EphA2跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含全長EphA2或其片段，在EphA2的氨基酸殘基646處具有由賴氨酸至甲硫氨酸的取代。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含EphA2的胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，缺乏EphA2跨膜結(jié)構(gòu)域，且在EphA2的氨基酸殘基646處具有由賴氨酸至甲硫氨酸的取代。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽是嵌合多肽，其包含至少EphA2的抗原性部分和第二多肽。表達(dá)EphA2抗原性多肽的李斯特菌可表達(dá)一或多個(gè)EphA2抗原性肽。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌表達(dá)2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)或更多的EphA2抗原性肽，或2-5個(gè)、2-10個(gè)、2-20個(gè)、10-20個(gè)或15-25個(gè)EphA2抗原性肽。多個(gè)EphA2抗原性肽可以從單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體中表達(dá)。該表達(dá)構(gòu)建體可以是游離的或被整合到李斯特菌的基因組中。例如，在某些實(shí)施方案中，李斯特菌疫苗菌株的基因組包含一或多個(gè)基因表達(dá)框，它們組合編碼EphA2的胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域。在特定實(shí)施方案中，該一或多個(gè)表達(dá)框被整合到李斯特菌基因組中。本發(fā)明的疫苗可以含有一或多個(gè)表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗含有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)或更多的表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌，或2-5個(gè)、2-10個(gè)、2-20個(gè)、10-20個(gè)或15-25個(gè)表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。本發(fā)明的方法包括基于李斯特菌的EphA2疫苗與一種或多種其它治療(例如其它的抗癌治療)組合的治療。在某些實(shí)施方案中，其它的抗癌治療是激動(dòng)性EphA2抗體，即與EphA2結(jié)合并誘導(dǎo)EphA2信號(hào)和磷酸化的抗體。在其它實(shí)施方案中，該其它的抗癌治療是抗EphA2抗體的抗獨(dú)特型。在其它實(shí)施方案中，該其它的抗癌治療是化療、生物學(xué)治療、免疫治療、放療、激素治療或手術(shù)。在本發(fā)明的某些方面中，本發(fā)明的基于李斯特菌的疫苗與提高EphA2內(nèi)化的治療組合給藥。在特定實(shí)施方案中，所述試劑是EphA2激動(dòng)劑，例如抗體、肽(見例如Koolpe等，2002，J.Biol.Chem.277(49)46974-46979)或小分子。在其它特定實(shí)施方案中，該試劑是調(diào)節(jié)EphA2的磷脂酶，例如低分子量的酪氨酸磷脂酶(LMW-PTP)的抑制劑。本發(fā)明的疫苗可以通過粘膜、鼻內(nèi)、腸胃外、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服或腹腔內(nèi)途徑給藥。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗在疾病位點(diǎn)通過例如移植或腫瘤內(nèi)注射局部給藥。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗被用于治療、預(yù)防和/或控制與細(xì)胞過量增殖有關(guān)的非癌性疾病或病癥，例如但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病、再狹窄(平滑肌和/或內(nèi)皮)、牛皮癬等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該過量增殖細(xì)胞是上皮細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該過量增殖細(xì)胞過量表達(dá)EphA2。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，一些例如5％或更少、10％或更少、15％或更少、20％或更少、25％或更少、30％或更少、35％或更少、40％或更少、45％或更少、50％或更少、55％或更少、60％或更少、75％或更少、85％或更少)EphA2不與配體結(jié)合，這可以用本領(lǐng)域已知的分析方法(例如免疫分析)來檢測(cè)，這可能是因?yàn)榧?xì)胞-細(xì)胞接觸減少、亞細(xì)胞定位被改變或EphA2的數(shù)量相對(duì)于配體增加。在本發(fā)明的其它方面，基于李斯特菌的EphA2疫苗被用于治療、預(yù)防和/或控制與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥?；诶钏固鼐腅phA2疫苗被用于引發(fā)免疫應(yīng)答以對(duì)抗在新生血管上表達(dá)的EphA2。因此，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或控制與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的方法，該方法包括向有此需要的個(gè)體給予治療、預(yù)防和/或控制與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的有效量的組合物，該組合物包含表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。這些疾病的實(shí)例包括但不限于黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、血管再狹窄、嬰兒血管瘤、尋常疣、牛皮癬、卡波西氏肉瘤、神經(jīng)線纖維瘤、隱性萎縮型水泡上皮解離癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、系統(tǒng)性狼瘡、干癬性關(guān)節(jié)病變、萊特氏癥候群和舍格倫氏癥候群、子宮內(nèi)膜異位、孕期子癇前癥、動(dòng)脈硬化癥和冠狀動(dòng)脈疾病。本發(fā)明的方法和組合物不僅可用于治療未接受過治療的患者，還可用于治療用目前的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室癌癥療法，例如但不限于化療、激素治療、生物學(xué)治療、放療和/和手術(shù)，部分或完全地難以治療的患者，并提高這些治療的效果。具體地，EphA2的表達(dá)提高細(xì)胞因子IL-6的水平，該因子與癌癥細(xì)胞對(duì)不同治療方案，例如化療和激素治療的抗性的發(fā)生有關(guān)。此外，EphA2過量表達(dá)能夠克服對(duì)雌激素受體活性的需要，因而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的它莫西芬抗性。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或控制已表明是或可能是用除本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥以外的方法難以治療或沒有應(yīng)答的癌癥的治療和預(yù)防方法。在特定實(shí)施方案中，將本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給予用非基于EphA2的治療(特別是它莫西芬治療或抗性與升高的IL-6水平有關(guān)的治療)難以治療或沒有應(yīng)答的患者，從而使患者成為可治療的或應(yīng)答的。然后對(duì)此前是難于治療的或沒有應(yīng)答的患者給予有效的治療。本發(fā)明的方法和組合物不僅可用于治療未接受過治療的患者，還可用于治療用目前的治療非腫瘤過量增殖性病癥和/或與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室療法部分或完全地難以治療的患者。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療用目前的治療腫瘤過量增殖性病癥和/或與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥(例如黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、血管再狹窄、嬰兒血管瘤、尋常疣、牛皮癬、卡波西氏肉瘤、神經(jīng)線纖維瘤、隱性萎縮型水泡上皮解離癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、系統(tǒng)性狼瘡、干癬性關(guān)節(jié)病變、菜特氏癥候群和舍格倫氏癥候群、子宮內(nèi)膜異位、孕期子癇前癥、動(dòng)脈硬化癥和冠狀動(dòng)脈疾病)、哮喘、慢性肺阻塞性病、肺纖維化、支氣管過度反應(yīng)、牛皮癬和脂溢性皮炎)的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室療法部分或完全地難以治療的患者。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的疫苗或疫苗組分的試劑盒。3.1.定義在本說明書中，使用的術(shù)語“基于李斯特菌的EphA2疫苗”是指被構(gòu)建來表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌，或包含這種細(xì)菌的組合物。當(dāng)以有效量給藥時(shí)，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗引發(fā)了對(duì)抗過量增殖細(xì)胞上的EphA2的免疫應(yīng)答。適用于本發(fā)明疫苗的李斯特菌的菌株包括但不限于格氏李斯特菌、無害李斯特菌、伊氏李斯特菌、單核增生李斯特菌、斯氏李斯特菌和魏氏李斯特菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，李斯特菌是單核增生李斯特菌。在本說明書中，使用的術(shù)語“EphA2抗原性肽”和“EphA2抗原性多肽”指的是EphA2多肽、優(yōu)選地是SEQIDNO2的多肽、或包含EphA2的一或多個(gè)B細(xì)胞抗原決定簇或T細(xì)胞抗原決定簇的片段、類似物或衍生物。EphA2多肽可來自任何物種。在某些實(shí)施方案中，EphA2多肽是指EphA2的成熟、加工后形式。在另一些實(shí)施方案中，EphA2多肽是指EphA2的非成熟形式。在文獻(xiàn)或公共數(shù)據(jù)庫中可以找到EphA2多肽的核苷酸和/或氨基酸序列，或可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆和測(cè)序技術(shù)確定核苷酸和/或氨基酸序列。例如，在GenBank數(shù)據(jù)庫中可以找到人EphA2的核苷酸序列(見例如登記號(hào)BC037166、M59371和M36395)。在GenBank數(shù)據(jù)庫中可以找到人EphA2的氨基酸序列(見例如登記號(hào)NP_004422、AAH37166和AAA53375)。EhpA2的氨基酸序列的其它非限制性例子在下表中列舉。表1在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽不是一種或多種以下肽TLADFDPRV(SEQIDNO3)；VLLLVLAGV(SEQIDNO4)；VLAGVGFFI(SEQIDNO5)；IMNDMPIYM(SEQIDNO6)；SLLGLKDQV(SEQIDNO7)；WLVPIGQCL(SEQIDNO8)；LLWGCALAA(SEQIDNO9)；GLTRTSVTV(SEQIDNO10)；NLYYAESDL(SEQIDNO11)；KLNVEERSV(SEQIDNO12)；IMGQFSHHN(SEQIDNO13)；YSVCNVMSG(SEQIDNO14)；MQNIMNDMP(SEQIDNO15)；EAGIMGQFSHHNIIR(SEQIDNO16)；PIYMYSVCNVMSG(SEQIDNO17)；DLMQNIMNDMPIYMYS(SEQIDNO18)。在某些特定的實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽不是SEQIDNO3-12中的任何一種，不是SEQIDNO13-15中的任何一種，和/或不是SEQIDNO16-18中的任何一種。在另一特定實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽不是SEQIDNO3-18。在本說明書中，使用的關(guān)于蛋白質(zhì)樣試劑(例如肽、多肽、蛋白質(zhì)或抗體)的術(shù)語“類似物”是指具有與第二蛋白質(zhì)樣試劑(例如EphA2多肽)相似或相同的功能的蛋白質(zhì)樣試劑，但其不必包含與該第二蛋白質(zhì)樣試劑相似或相同的氨基酸序列或結(jié)構(gòu)。具有相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)樣試劑是指滿足至少以下一項(xiàng)的蛋白質(zhì)樣試劑(a)具有與第二蛋白質(zhì)樣試劑的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)樣試劑；(b)由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)樣試劑，該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與編碼至少20個(gè)氨基酸殘基、30個(gè)氨基酸殘基、40個(gè)氨基酸殘基、50個(gè)氨基酸殘基、60個(gè)氨基酸殘基、70個(gè)氨基酸殘基、80個(gè)氨基酸殘基、90個(gè)氨基酸殘基、100個(gè)氨基酸殘基、125個(gè)氨基酸殘基、或150個(gè)氨基酸殘基的第二蛋白質(zhì)樣試劑的核苷酸序列雜交；且(c)由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)樣試劑，該核苷酸序列與編碼第二蛋白質(zhì)樣試劑的核苷酸至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。與第二蛋白質(zhì)樣試劑具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)樣試劑是指具有與該第二蛋白質(zhì)樣試劑相似的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)樣試劑。蛋白質(zhì)樣試劑的結(jié)構(gòu)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定，包括但不限于X-射線晶體學(xué)、核磁共振和晶體學(xué)電鏡法。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)樣試劑具有EphA2活性。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的一致性百分比，將該序列進(jìn)行比對(duì)以實(shí)現(xiàn)最佳的比較目的(例如，可在第一氨基酸或核酸序列中引入間隔以與第二氨基酸或核酸序列進(jìn)行最佳比對(duì))。然后比較在對(duì)應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄心澄恢玫陌被釟埢蚝塑账崤c第二序列的對(duì)應(yīng)位置相同時(shí)，那么該兩分子在該位置是一致的。兩序列間的一致性百分比是序列共有的一致位置的數(shù)目的函數(shù)(即同一性％＝一致的重疊位置的數(shù)目/位置的總數(shù)目×100％)。在一實(shí)施方案中，兩序列同長?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法來確定兩序列間的一致性百分比。用于比較兩序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的、但非限制性的例子是Karlin和Altschul，1990，Proc.NatlAcadSci.U.S.A.872264-2268及Karlin和Altschul，1993，Proc.NatlAcadSci.U.S.A.905873-5877中改進(jìn)的算法。這種算法被整合進(jìn)了Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403的NBLAST和XBLAST程序中。可使用NBLAST核苷酸參數(shù)配置，例如以得分＝100，詞長＝12進(jìn)行BLAST核苷酸檢索以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢允褂肵BLAST程序參數(shù)配置，例如以得分＝50，詞長＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比對(duì)的間隔排列，可以使用如Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.253389-3402中所述的GappedBLAST?？蛇x擇地，可使用PSI-BLAST進(jìn)行多重檢索，該檢索檢測(cè)到分子間的遠(yuǎn)距離關(guān)系(出處同上)。當(dāng)使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)(如XBLAST和NBLAST的參數(shù))(參見例如NCBI網(wǎng)站)。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選的但非限制性例子是Myers和Miller，1988，CABIOS411-17的算法。這種算法被整合入ALIGN程序(2.0版)中，該程序是GCG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable)，間隔長度罰值(gaplengthpenalty)為12，間隔罰值(gappenalty)為4。兩序列間的一致性百分比可以用與上文所述的相似技術(shù)來確定，允許或不允許使用間隔。在計(jì)算一致性百分比時(shí)，一般只計(jì)算實(shí)際的配對(duì)。在本說明書中，使用的關(guān)于非蛋白質(zhì)類似物的術(shù)語“類似物”是指具有與第一有機(jī)或無機(jī)分子相似或相同的功能且與該第一有機(jī)或無機(jī)分子結(jié)構(gòu)相似的第二有機(jī)或無機(jī)分子。在本說明書中，使用的術(shù)語“減毒的”或“減毒”是指使得李斯特菌致病性更弱的修飾。減毒的最終結(jié)果是當(dāng)用李斯特菌對(duì)個(gè)體給藥時(shí)，毒性以及其它副作用的風(fēng)險(xiǎn)得到降低。在本說明書中，使用的關(guān)于蛋白質(zhì)樣試劑(例如蛋白質(zhì)、多肽、肽和抗體)的術(shù)語“衍生物”是指包含氨基酸序列的蛋白質(zhì)樣試劑，通過引入氨基酸殘基的取代、刪除和/或添加，該氨基酸序列已被改變。在此使用的術(shù)語“衍生物”也是指經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)樣試劑，即將一類分子共價(jià)連接到該蛋白質(zhì)樣試劑的蛋白質(zhì)樣試劑。例如，但不限于，可以制備蛋白質(zhì)樣試劑的衍生物，例如通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生、蛋白水解裂解、與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等方式制備。蛋白質(zhì)樣試劑的衍生物也可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；⒁旅顾氐拇x合成等進(jìn)行化學(xué)修飾來制備。此外，蛋白質(zhì)樣試劑的衍生物可以包含一或多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。蛋白質(zhì)樣試劑的衍生物與其衍生自的蛋白質(zhì)樣試劑具有相同的功能。在本說明書中，使用的關(guān)于EphA2蛋白質(zhì)樣試劑的術(shù)語“衍生物”是指包含EphA2多肽或EphA2多肽片段的氨基酸序列的蛋白質(zhì)樣試劑，該氨基酸序列已通過引入氨基酸殘基的取代、刪除或添加(即突變)而被改變。在此使用的關(guān)于EphA2蛋白質(zhì)樣試劑的術(shù)語“衍生物”也是指經(jīng)過修飾，即將任意類型的分子共價(jià)連接到該多肽上的EphA2多肽或EphA2多肽的片段。例如，但不限于，EphA2多肽或EphA2多肽片段可通過糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生、蛋白水解裂解、與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等方式而被修飾。EphA2多肽或EphA2多肽片段的衍生物也可以可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；?、衣霉素的代謝合成等進(jìn)行化學(xué)修飾而被修飾。此外，EphA2多肽或EphA2多肽片段的衍生物可包含一或多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。在一實(shí)施方案中，多肽衍生物具有與在此所述的EphA2多肽或EphA2多肽片段相似或相同的功能。在另一實(shí)施方案中，與未改變的多肽相比，EphA2多肽或EphA2多肽片段的衍生物的活性得到改變。例如，多肽或其片段的衍生物相比于EphA2多肽或其片段在磷酸化方面不同。在本說明書中，使用的關(guān)于非蛋白質(zhì)樣試劑的術(shù)語“衍生物”是指根據(jù)第一有機(jī)或無機(jī)分子的結(jié)構(gòu)形成的第二有機(jī)或無機(jī)分子。有機(jī)分子的衍生物包括但不限于修飾的分子，例如通過添加或刪除羥基、甲基、乙基、羧基、硝基或氨基而修飾的分子。有機(jī)分子也可以，例如被酯化、烷基化和/或磷酸化。在本說明書中，使用的“EphrinA1多肽”是指EphrinA1、其類似物、衍生物或片段，或包含EphrinA1、其類似物、衍生物或片段的融合蛋白。EphrinA1多肽可來自任何物種。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“EphrinA1多肽”是指EphrinA1的成熟、加工后形式。在其它實(shí)施方案中，術(shù)語“EphrinA1多肽”是指EphrinA1的不成熟形式。根據(jù)該實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體免疫特異性地結(jié)合相應(yīng)于EphrinA1的成熟加工后形式的EphrinA1的不成熟形式部分?？稍谖墨I(xiàn)或公共數(shù)據(jù)庫中找到EphrinA1多肽的核苷酸和/或氨基酸序列，或可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆和測(cè)序技術(shù)確定該核苷酸和/或氨基酸序列。例如，可在GenBank數(shù)據(jù)庫中可以找到人EphrinA1的核苷酸序列(見例如登記號(hào)BC032698)。在GenBank數(shù)據(jù)庫中可以找到人EphrinA1的氨基酸序列(見例如登記號(hào)AAH32698)。氨基酸序列的其它非限制性例子在下表2中列舉。表2在特定實(shí)施方案中，EphrinA1多肽是來自任何物種的EphrinA1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EphrinA1多肽是人EphrinA1。在本說明書中，使用的術(shù)語“有效量”是指治療(例如預(yù)防或治療性試劑)的量，該量足以降低和/或改善病癥(例如癌癥、非腫瘤性過量增殖細(xì)胞病癥或與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥)的嚴(yán)重性和/或持續(xù)時(shí)間或病癥癥狀，防止所述病癥的惡化，使所述病癥衰退，防止與所述病癥有關(guān)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)、發(fā)展或發(fā)作，或增強(qiáng)或提高另一種治療(例如預(yù)防或治療性試劑)的預(yù)防或治療效果。在本說明書中，使用的術(shù)語“B細(xì)胞抗原決定簇”是指在動(dòng)物，優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選地在小鼠或人中具有抗原或免疫原活性的EphA2多肽的一部分。具有免疫原活性的抗原決定簇是EphA2多肽的一部分，其引發(fā)動(dòng)物的抗體反應(yīng)。具有抗原活性的抗原決定簇是EphA2多肽的一部分，抗體與該部分免疫特異性地結(jié)合，這可以用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)例如免疫分析來測(cè)定。抗原性抗原決定簇不必需是免疫原性的。在本說明書中，使用的術(shù)語“T細(xì)胞抗原決定簇”是指EphA2多肽，優(yōu)選地指SEQIDNO2的EphA2多肽的至少一部分，該部分由T細(xì)胞受體識(shí)別。術(shù)語“T細(xì)胞抗原決定簇”包含輔助T細(xì)胞(Th)抗原決定簇和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)抗原決定簇。術(shù)語“輔助T細(xì)胞抗原決定簇”包含Th1和Th2抗原決定簇。在本說明書中，使用的關(guān)于EphA2多肽的術(shù)語“片段”包括EphA2抗原性肽或多肽，其包含EphA2多肽的氨基酸序列的至少5個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少10個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少15個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少20個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少25個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少40個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少50個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少60個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少70個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少80個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少90個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少100個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少125個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少150個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少175個(gè)相鄰的氨基酸殘基、至少200個(gè)相鄰的氨基酸殘基、或至少250個(gè)相鄰的氨基酸殘基的氨基酸序列。在本說明書中，使用的術(shù)語“融合蛋白”是指包含第一多肽或蛋白或其片段、類似物或衍生物的氨基酸序列以及異源多肽或蛋白的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。在一實(shí)施方案中，融合蛋白包含與異源蛋白、多肽或肽融合的預(yù)防或治療性試劑。根據(jù)該實(shí)施方案，異源蛋白、多肽或肽可以是或不是不同類型的預(yù)防或治療性試劑。例如，兩種不同的具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白、多肽或肽可以融合在一起形成融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于與異源蛋白、多肽或肽融合之前的原始多肽或蛋白的活性，融合蛋白保持活性或具有提高的活性。在本說明書中，使用的關(guān)于核酸序列(例如基因)或氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白質(zhì))的術(shù)語“異源的”是指在自然界中未發(fā)現(xiàn)與第二核酸序列或第二氨基酸序列(例如衍生自不同物種的核酸序列或氨基酸序列)有關(guān)聯(lián)的核酸序列或氨基酸序列。在本說明書中，使用的術(shù)語“過量增殖細(xì)胞病癥”、“過量增殖細(xì)胞疾病”、“過量增殖性病癥”和“過量增殖性疾病”以及類似的術(shù)語是指這樣的病癥，其中的細(xì)胞過量增殖或任何形式的過量細(xì)胞堆積造成或引起該病癥的病理狀態(tài)和癥狀。在某些實(shí)施方案中，過量增殖細(xì)胞病癥的特征為過量增殖的上皮細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，過量增殖細(xì)胞病癥的特征為過量增殖的內(nèi)皮細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，過量增殖細(xì)胞病癥的特征為過量增殖的成纖維細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，過量增殖細(xì)胞病癥不是腫瘤性的。非腫瘤性過量增殖細(xì)胞病癥的例子是哮喘、慢性肺阻塞病、纖維化(例如肺、肝和腎纖維化)、支氣管過度反應(yīng)、牛皮癬和脂溢性皮炎。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，過量增殖細(xì)胞病癥的特征是表達(dá)(優(yōu)選地過量表達(dá))EphA2的過量增殖細(xì)胞。在本說明書中，使用的術(shù)語“與EphA2免疫特異性地結(jié)合”以及類似術(shù)語是指與EphA2受體或其一或多個(gè)片段特異性結(jié)合，而不與其它受體或其片段特異性結(jié)合的肽、多肽、蛋白、融合蛋白和抗體或其片段。術(shù)語“與EphrinA1免疫特異性地結(jié)合”以及類似術(shù)語是指與EphrinA1或其一或多個(gè)片段特異性結(jié)合，而不與其它配體或其片段特異性結(jié)合的肽、多肽、蛋白、融合蛋白和抗體或其片段。與EphA2或EphrinA1或它們的片段免疫特異性結(jié)合的肽、多肽、蛋白或抗體可能與其它肽、多肽或蛋白以更低的親和力結(jié)合，這可以通過，例如免疫分析或本領(lǐng)域已知的其它檢測(cè)方法來測(cè)定。與EphA2或EphrinA1免疫特異性結(jié)合的抗體或片段可能與相關(guān)的抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，與EphA2或EphrinA1免疫特異性結(jié)合的抗體或其片段可通過，例如免疫分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)來鑒別。當(dāng)抗體或其片段與EphA2或EphrinA1的結(jié)合以比與任何交叉反應(yīng)性抗原的結(jié)合具有更高的親和力時(shí)，該抗體或其片段與EphA2或EphrinA1特異性結(jié)合，這可以通過使用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)如放射免疫分析(RIAs)以及酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)來測(cè)定。關(guān)于抗體特異性的討論參見例如Paul編，1989，F(xiàn)undamentalImmunology，第2版，Raven出版社，NewYork，第332-336頁。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與EphA2或EphrinA1免疫特異性結(jié)合的抗體不與其它抗原結(jié)合或發(fā)生交叉反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，與EphA2或EphrinA1融合蛋白結(jié)合的抗體特異性地與融合蛋白中的EphA2或EphrinA1部分結(jié)合。本發(fā)明的抗體包括但不限于合成抗體、單克隆抗體、重組制備的抗體、多特異性的抗體(包括雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、內(nèi)抗體(intrabodies)、單鏈Fvs(scFv)(例如包括單特異性和雙特異性等)、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體以及以上任何抗體的抗原決定簇結(jié)合片段。具體地，本發(fā)明的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含與EphA2抗原或EphrinA1抗原免疫特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如抗EphA2抗體或抗EphrinA1抗體的一或多個(gè)決定互補(bǔ)區(qū)(CDR))的分子。本發(fā)明的抗體可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類的免疫球蛋白分子。在本說明書中，使用的關(guān)于有機(jī)或無機(jī)分子(無論其是小分子或大分子)而非蛋白質(zhì)樣試劑或核酸的術(shù)語“分離的”是指基本上不含不同的有機(jī)或無機(jī)分子的有機(jī)或無機(jī)分子。優(yōu)選地，有機(jī)或無機(jī)分子的60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含第二種不同的有機(jī)或無機(jī)分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有機(jī)和/或無機(jī)分子是分離的。在本說明書中，使用的關(guān)于蛋白質(zhì)樣試劑(例如肽、多肽、融合蛋白或抗體)的術(shù)語“分離的”是指蛋白樣試劑基本上不含有來自該試劑的衍生細(xì)胞或組織源的細(xì)胞材料或污染蛋白，或在化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。語言“基本上不含有細(xì)胞材料”包括蛋白質(zhì)樣試劑的制劑，其中該蛋白質(zhì)樣試劑與分離或重組制備出該試劑的細(xì)胞的細(xì)胞成分分離。因此，基本上不含有細(xì)胞材料的蛋白質(zhì)樣試劑包括具有(干重)少于大約30％、20％、10％或5％的異源蛋白、多肽、肽或抗體(也被稱作“污染蛋白”)的蛋白質(zhì)樣試劑的制劑。當(dāng)重組制備該蛋白質(zhì)樣試劑時(shí)，它也優(yōu)選地基本上不含有培養(yǎng)基，即存在的培養(yǎng)基少于蛋白質(zhì)樣試劑制劑體積的大約20％、10％或5％。當(dāng)化學(xué)合成制備該蛋白質(zhì)樣試劑時(shí)，其優(yōu)選地基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品，即該蛋白質(zhì)樣試劑與參與該蛋白質(zhì)樣試劑合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品分離。因此，這種蛋白質(zhì)樣試劑的制劑除了感興趣的蛋白質(zhì)樣試劑以外具有(干重)小于大約30％、20％、10％、5％的化學(xué)前體或化合物。在特定實(shí)施方案中，在此所公開的蛋白質(zhì)樣試劑是分離的。在本說明書中，使用的關(guān)于核酸分子的術(shù)語“分離的”是指分離自存在于天然來源的其它核酸分子的核酸分子。此外，“分離的”核酸分子例如cDNA分子優(yōu)選地基本上不含有其它細(xì)胞材料，或不含有在用重組技術(shù)制備時(shí)的培養(yǎng)基，或基本上不含有用化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。在特定實(shí)施方案中，核酸分子是分離的。在本說明書中，使用的術(shù)語“疾病”和“病癥”被交替使用以表示一種狀態(tài)。在本說明書中，使用的術(shù)語“組合”是指使用多種治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)。術(shù)語“組合”的使用并不限制對(duì)患有過量增殖細(xì)胞病癥特別是癌癥的個(gè)體給予治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)的順序。第一治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)可以在進(jìn)行第二治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)之前(例如1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同時(shí)、或之后(例如1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)給予已患有、正患有或疑似患有過量增殖細(xì)胞病癥特別是癌癥的個(gè)體。依次并在時(shí)間間隔內(nèi)給予個(gè)體該治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)，從而使本發(fā)明的試劑能夠與其它試劑一起發(fā)揮作用，以提供比其它給藥方式更多的益處。任何其它的治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)可以與任何其它的治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)一起以任何順序給予。在本說明書中，使用的短語“低耐受性”是指一狀態(tài)，在該狀態(tài)下患者承受治療所帶來的副作用，因此由于不良效應(yīng)和/或來自副作用的傷害超過了治療的益處而使得患者不能從治療中獲益和/或?qū)⒉荒芾^續(xù)進(jìn)行治療。在本說明書中，使用的術(shù)語“控制”是指?jìng)€(gè)體從給予的治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)中獲得有益的效果，但是該治療不能治愈該疾病。在某些實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體進(jìn)行一種或多種治療(例如預(yù)防和/或治療性試劑)以“控制”疾病由此防止疾病的進(jìn)行或惡化。在本說明書中，使用的術(shù)語“腫瘤的”是指涉及細(xì)胞的疾病，這些細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端位點(diǎn)的潛力并表現(xiàn)出不同于非腫瘤細(xì)胞的表型特征，例如，在三維底物例如軟瓊脂上形成群落或在三維的基底膜或胞外基質(zhì)制劑例如MATRIGELTM中形成管狀網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)絡(luò)樣基質(zhì)。非腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂中不形成群落且在三維基底膜或胞外基質(zhì)制劑中形成明顯的球樣結(jié)構(gòu)。盡管具有不同的機(jī)制，但是腫瘤細(xì)胞在其發(fā)展過程中獲得特征性的一組功能性能力。這些能力包括躲避凋亡、生長信號(hào)自足、對(duì)于抗生長信號(hào)不敏感、組織入侵/轉(zhuǎn)移、無限復(fù)制潛能、以及持續(xù)的血管發(fā)生。因此，“非腫瘤的”是指不涉及癌細(xì)胞的癥狀、疾病或病癥。在本說明書中，使用的短語“沒有應(yīng)答的/難以治療的”用于描述用一種或多種目前可采用的治療(例如癌癥治療)進(jìn)行過治療的患者，目前可采用的治療如化療、放療、手術(shù)、激素治療和/或生物學(xué)治療/免疫治療，特別是針對(duì)特定癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，其中該治療在臨床上不足以治療患者而使這些患者需要額外的有效治療，即對(duì)治療不敏感。該短語也可以描述對(duì)治療產(chǎn)生應(yīng)答但遭受副作用、復(fù)發(fā)、產(chǎn)生抗性等的患者。在各種實(shí)施方案中，“沒有應(yīng)答的/難以治療的”是指癌細(xì)胞的至少一些顯著部分沒有被殺死或它們的細(xì)胞分裂沒有被停止?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，在體內(nèi)或體外檢測(cè)治療對(duì)癌細(xì)胞的有效性，確定癌細(xì)胞是否是“沒有應(yīng)答的/難以治療的”，在該過程中使用本領(lǐng)域接受的“難以治療的”的含義。在各種實(shí)施方案中，癌癥是“沒有應(yīng)答的/難以治療的”，其中在治療期間癌細(xì)胞的數(shù)目沒有顯著的減少或增加。在本說明書中，使用的關(guān)于EphA2過量表達(dá)的術(shù)語“過量表達(dá)”是指編碼EphA2的基因以正常人細(xì)胞的表達(dá)水平以上的水平表達(dá)，這可以通過在此所說明的、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的檢測(cè)方法(即免疫分析法如ELISA或Western印跡法、Northern印跡法或RT-PCR)來測(cè)定。在本說明書中，使用的術(shù)語“加強(qiáng)”是指在普通或許可劑量下提高治療的效果。在本說明書中，使用的術(shù)語“預(yù)防”是指給予治療(例如預(yù)防或治療性試劑)或治療組合以防止疾病在個(gè)體體內(nèi)發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散。在本說明書中，使用的術(shù)語“預(yù)防性試劑”是指可用于預(yù)防與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥、與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞疾病，特別是癌癥的發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的任何試劑。在某些特定實(shí)施方案中，術(shù)語“預(yù)防性試劑”是指本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗。在某些其它的實(shí)施方案中，術(shù)語“預(yù)防性試劑”指除了基于李斯特菌的EphA2疫苗以外的治療，例如癌癥化療、放療、激素治療、生物學(xué)治療(例如免疫治療)。在其它實(shí)施方案中，多種的預(yù)防性試劑可組合給予。在本說明書中，使用的“預(yù)防有效量”是指足以預(yù)防病癥(例如與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和過量增殖細(xì)胞疾病，優(yōu)選地是癌癥)的發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的治療(例如預(yù)防性試劑)的量。預(yù)防有效量可以是指足以預(yù)防個(gè)體體內(nèi)的病癥(例如與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和過量增殖細(xì)胞疾病，優(yōu)選地是癌癥)的發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的治療(例如預(yù)防性試劑)的量，個(gè)體包括但不限于易于患過量增殖細(xì)胞疾病的個(gè)體，例如那些遺傳上易患癌癥或此前暴露于致癌物質(zhì)的個(gè)體。預(yù)防有效量還可以指在病癥(例如與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和過量增殖細(xì)胞疾病)的預(yù)防中提供預(yù)防益處的治療(例如預(yù)防性試劑)的量。進(jìn)一步地，關(guān)于治療(例如預(yù)防性試劑)的預(yù)防有效量是指單獨(dú)的治療(例如預(yù)防性試劑)的量，或與其它治療(例如試劑)組合的量，該量在病癥(例如與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和過量增殖細(xì)胞疾病)的預(yù)防中提供預(yù)防益處。與本發(fā)明的EphA2疫苗的量結(jié)合使用時(shí)，該術(shù)語可包含提高整體預(yù)防或增強(qiáng)另一治療(例如預(yù)防性試劑)的預(yù)防效果或與另一治療(例如預(yù)防性試劑)發(fā)生協(xié)同作用的量。在本說明書中，使用的“方案”包括給藥時(shí)間和給藥方案。在本說明書中，使用的短語“副作用”包含預(yù)防或治療性試劑的不需要的或不良的效果。不良效果總是不需要的，但不需要的效果不必然是不良的。治療(例如預(yù)防或治療性試劑)的不良效果可以是有害的或者是不適的或是有風(fēng)險(xiǎn)的。化療的副作用包括但不限于胃腸毒性，例如但不限于早期和晚期出現(xiàn)的腹瀉和胃腸脹氣、惡心、嘔吐、厭食、白血球減少、貧血、嗜中性白血球減少、乏力、腹絞痛、發(fā)燒、疼痛、體重減輕、脫水、脫發(fā)、呼吸困難、失眠、眩暈、粘膜炎、口腔干燥、腎衰竭、以及便秘、神經(jīng)和肌肉效應(yīng)、短期的或永久的腎和膀胱損傷、類流感癥狀、體液滯留和短期或永久不育。放療的副作用包括但不限于疲勞、口干和胃口的喪失。生物學(xué)治療/免疫治療的副作用包括但不限于給藥位點(diǎn)處的皮炎或腫脹，類流感癥狀如發(fā)燒、寒冷和疲勞、消化道問題和過敏反應(yīng)。激素治療的副作用包括但不限于惡心、生育問題、抑郁、胃口的喪失、眼睛問題、頭疼和體重的波動(dòng)?；颊咄ǔ?huì)經(jīng)受的其它不需要的效果有很多而且是本領(lǐng)域已知的。在Physicians’DeskReference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中有許多說明。在本說明書中，使用的術(shù)語“個(gè)體”和“患者”可交換使用。在本說明書中，使用的個(gè)體優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，例如非靈長類(例如牛、豬、馬、貓、狗、鼠等)以及靈長類(例如猴和人)，最優(yōu)選地是人。在特定的實(shí)施方案中，該個(gè)體是非人類動(dòng)物。在另一實(shí)施方案中，該個(gè)體是家畜(例如馬、豬、羊或牛)或?qū)櫸?例如狗、貓、兔或鳥)。在另一實(shí)施方案中，該個(gè)體是除了實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物或動(dòng)物模型(例如小鼠、大鼠、豚鼠或猴)以外的動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該個(gè)體是人。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該個(gè)體是免疫未受損或免疫未被抑制的人。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該個(gè)體是平均絕對(duì)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為大約500細(xì)胞/mm3、大約600細(xì)胞/mm3、大約650細(xì)胞/mm3、大約700細(xì)胞/mm3、大約750細(xì)胞/mm3、大約800細(xì)胞/mm3、大約850細(xì)胞/mm3、大約900細(xì)胞/mm3、大約950細(xì)胞/mm3、大約1000細(xì)胞/mm3、大約1050細(xì)胞/mm3、大約1100細(xì)胞/mm3或大約1150細(xì)胞/mm3或大約1200細(xì)胞/mm3的人。在本說明書中，使用的術(shù)語“治療”是指給予一種或多種治療(例如治療性試劑)以根除、減輕或改善病癥或其癥狀，特別地根除、去除、改進(jìn)或控制原發(fā)性、區(qū)域性或轉(zhuǎn)移性癌組織。在某些實(shí)施方案中，該術(shù)語是指向患有這種疾病的個(gè)體給予一種或多種治療(例如治療性試劑)以使癌癥的擴(kuò)散最小化或延緩。在本說明書中，使用的術(shù)語“治療性試劑”是指能夠用來預(yù)防、治療或控制疾病(例如與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞疾病，特別是癌癥)的任何試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“治療性試劑”是指本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗。在某些其它實(shí)施方案中，術(shù)語“治療性試劑”是指除了基于李斯特菌的EphA2疫苗以外的治療，例如癌癥化療、放療、激素治療、生物學(xué)治療(例如免疫治療)。在其它實(shí)施方案中，可以組合使用多種治療(例如治療性試劑)。在本說明書中，使用的“治療有效量”是指足以治療或控制病癥(例如與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥、與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞疾病)的治療(例如治療性試劑)的量，且優(yōu)選地，足以破壞、改變、控制或去除原發(fā)性、區(qū)域性或轉(zhuǎn)移性癌組織的量。治療有效量可以是指足以使病癥(即過量增殖細(xì)胞疾病)的發(fā)作延緩或最小化的治療(例如治療性試劑)的量，例如使癌癥的擴(kuò)散延緩或最小化。治療有效量還可以是指在病癥(例如癌癥)的治療或控制中提供治療益處的治療(例如治療性試劑)的量。進(jìn)一步地，關(guān)于治療(例如治療性試劑)的治療有效量是指單獨(dú)的治療(例如治療性試劑)的量，或與其它治療(例如試劑)組合的量，該量在病癥(例如過量增殖細(xì)胞疾病，如癌癥)的治療或控制中提供了治療益處。與本發(fā)明的EphA2疫苗的量結(jié)合使用時(shí)，該術(shù)語可包含提高整體治療、減少或避免不需要的效果、或增強(qiáng)另一治療(例如治療性試劑)的治療效果或與另一治療(例如治療性試劑)發(fā)生協(xié)同作用的量。在本說明書中，使用的術(shù)語“治療”是指可用于預(yù)防、治療或控制病癥(例如過量增殖細(xì)胞病癥、與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和/或非腫瘤性過量增殖細(xì)胞病癥)或其癥狀的任何步驟、方案和/或試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“治療”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員，如醫(yī)療人員已知的用于治療、控制、預(yù)防、或改善病癥(例如過量增殖細(xì)胞病癥和/或非腫瘤性過量增殖細(xì)胞病癥)或其一種或多種癥狀的生物學(xué)治療、支持性治療、和/或其它治療。在本說明書中，使用的術(shù)語“發(fā)生協(xié)同作用的”是指治療(例如預(yù)防或治療性試劑)的組合，該組合具有比任何兩種或多種單個(gè)治療(例如一種或多種預(yù)防或治療性試劑)的加和效果更好的效果。治療組合(例如預(yù)防或治療性試劑的組合)的協(xié)同效果允許一種或多種治療(例如一種或多種治療或預(yù)防性試劑)以更低的劑量使用，和/或向患有非腫瘤性過量增殖上皮病癥和/或內(nèi)皮細(xì)胞病癥的個(gè)體以更低的頻率給予所述治療。使用更低劑量的治療(例如預(yù)防或治療性試劑)和/或以更低的頻率給予所述治療降低了與向個(gè)體給予所述治療有關(guān)的毒性，而不會(huì)降低所述治療預(yù)防或治療病癥(例如過量增值細(xì)胞病癥)的效果。此外，協(xié)同效果能夠提高所述治療(例如預(yù)防或治療性試劑)預(yù)防或治療病癥(例如與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和過量增殖細(xì)胞病癥)的效果。最后，治療(例如預(yù)防或治療性試劑)組合的協(xié)同效果可以避免或降低與任何單個(gè)治療的使用有關(guān)的不良或不需要的副作用。在本說明書中，使用的術(shù)語“T細(xì)胞惡性腫瘤”是指任何T細(xì)胞淋巴過量增殖性病癥，包括胸腺和后胸腺(post-thymic)惡性腫瘤。T細(xì)胞惡性腫瘤包括T細(xì)胞源的腫瘤。T細(xì)胞惡性腫瘤是指淋巴祖細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、或抗原呈遞細(xì)胞源的腫瘤。T細(xì)胞惡性腫瘤包括但不限于白血病，包括但不限于成淋巴細(xì)胞白血病、胸腺瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、和淋巴瘤，包括霍奇金氏和非霍奇金氏病，前提是T細(xì)胞惡性腫瘤不是皮膚的T細(xì)胞惡性腫瘤，特別地不是皮膚性細(xì)胞淋巴瘤。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞惡性腫瘤是系統(tǒng)性的、非皮膚性T細(xì)胞惡性腫瘤。3.2.序列以下是所附序列表中列出的序列的概述，該序列表在此完整地引為參考SEQIDNO1人EphA2cDNA(全長)SEQIDNO2人EphA2多肽(全長)SEQIDNO3-18人EphA2肽SEQIDNO19構(gòu)建體LLOss-PEST-hEphA2天然LLO信號(hào)肽+與全長人EphA2融合的PEST無密碼子優(yōu)化無抗原決定簇標(biāo)簽(例如用于該構(gòu)建體的myc或FLAG)顯示融合蛋白編碼子序列SEQIDNO20構(gòu)建體LLOss-PEST-hEphA2天然LLO信號(hào)肽+與全長人EphA2融合的PEST無密碼子優(yōu)化無抗原決定簇標(biāo)簽(例如用于該構(gòu)建體的myc或FLAG)顯示預(yù)測(cè)的融合蛋白SEQIDNO21EphA2EX2結(jié)構(gòu)域天然核苷酸序列SEQIDNO22EphA2EX2結(jié)構(gòu)域李斯特菌中使用的優(yōu)化密碼子的核苷酸序列SEQIDNO23EphA2EX2結(jié)構(gòu)域初級(jí)氨基酸序列SEQIDNO24構(gòu)建體LLOss-PEST-EX2_hEphA2天然LLO信號(hào)肽+與人EphA2的外部結(jié)構(gòu)域融合的PEST無密碼子優(yōu)化無抗原決定簇標(biāo)簽(例如用于該構(gòu)建體的myc或FLAG)SEQIDNO25構(gòu)建體LLOss-PEST-EX2_hEphA2天然LLO信號(hào)肽+與人EphA2的外部結(jié)構(gòu)域融合的PEST無密碼子優(yōu)化無抗原決定簇標(biāo)簽(例如用于該構(gòu)建體的myc或FLAG)顯示預(yù)測(cè)的融合蛋白SEQIDNO26天然LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(天然單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-EX-2EphA2-Myc)核苷酸序列(包括hly啟動(dòng)子)SEQIDNO27天然LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(天然單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-EX-2EphA2-Myc)初級(jí)氨基酸序列SEQIDNO28密碼子優(yōu)化的LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-EX-2EphA2-Myc)核苷酸序列(包括hly啟動(dòng)子)SEQIDNO29密碼子優(yōu)化的LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-EX-2EphA2-Myc)初級(jí)氨基酸序列SEQIDNO30PhoD-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的枯草芽孢桿菌PhoDTat信號(hào)肽-FLAG-EX-2EphA2-Myc)核苷酸序列(包括hly啟動(dòng)子)SEQIDNO31PhoD-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的枯草芽孢桿菌phoDTat信號(hào)肽-FLAG-EX-2EphA2-Myc)氨基酸序列SEQIDNO32EphA2CO結(jié)構(gòu)域天然核苷酸序列SEQIDNO33EphA2CO結(jié)構(gòu)域李斯特菌中使用的優(yōu)化密碼子的核苷酸序列SEQIDNO34EphA2CO結(jié)構(gòu)域初級(jí)氨基酸序列SEQIDNO35構(gòu)建體LLOss-PEST-CO-huEphA2天然LLO信號(hào)肽+與人EphA2的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的PEST無密碼子優(yōu)化無抗原決定簇標(biāo)簽(例如用于該構(gòu)建體的myc或FLAG)顯示融合蛋白編碼序列SEQIDNO36構(gòu)建體LLOss-PEST-CO-huEphA2天然LLO信號(hào)肽+與人EphA2的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的PEST無密碼子優(yōu)化無抗原決定簇標(biāo)簽(例如用于該構(gòu)建體的myc或FLAG)顯示預(yù)測(cè)的融合蛋白SEQIDNO37天然LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(天然單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-CO_EphA2-Myc)核苷酸序列(包括hly啟動(dòng)子)SEQIDNO38天然LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(天然單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-CO_EphA2-Myc)初級(jí)氨基酸序列SEQIDNO39密碼子優(yōu)化的LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-CO_EphA2-Myc)核苷酸序列(包括hly啟動(dòng)子)SEQIDNO40密碼子優(yōu)化的LLOss-PEST-FLAG-CO_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的單核增生李斯特菌LLO信號(hào)肽+PEST-密碼子優(yōu)化的-FLAG-CO_EphA2-Myc)初級(jí)氨基酸序列SEQIDNO41PhoD-FLAG-CO_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的枯草芽孢桿菌PhoDTat信號(hào)肽-FLAG-CO_EphA2-Myc)核苷酸序列(包括hly啟動(dòng)子)SEQIDNO42PhoD-FLAG-CO_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(密碼子優(yōu)化的枯草芽孢桿菌PhoDTat信號(hào)肽-FLAG-CO_EphA2-Myc)氨基酸序列SEQIDNO43構(gòu)建體pAM401-MCS包含來自pPL2載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)的質(zhì)粒pAM401來自pPL2的小AatIIMCS片段插入到pAM401的平末端XbaI和NruI位點(diǎn)之間顯示完整的pAM401-MCS質(zhì)粒序列。4、附圖的簡(jiǎn)要說明圖1.李斯特菌胞內(nèi)生命周期，抗原呈遞細(xì)胞活化和抗原呈遞；圖2.重組的李斯特菌的分泌蛋白的Western印跡分析，該菌編碼天然EphA2CO結(jié)構(gòu)域序列；圖3.重組的李斯特菌的分泌蛋白的Western印跡分析，該菌編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2EX2結(jié)構(gòu)域序列信號(hào)肽融合的、天然的或密碼子優(yōu)化的LLOsecA1信號(hào)肽；圖4.重組的李斯特菌的分泌蛋白的Western印跡分析，該菌編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2CO結(jié)構(gòu)域序列融合的、天然或密碼子優(yōu)化的LLOsecA2信號(hào)肽或密碼子優(yōu)化的Tat信號(hào)肽；圖5.CT2小鼠癌細(xì)胞中的人EphA2表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞FACS分類分析以識(shí)別高水平表達(dá)人EphA2的CT26細(xì)胞克隆；圖6.高水平表達(dá)人EphA2蛋白的CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的匯集群的Western印跡分析；圖7.表達(dá)huEphA2的B16F10細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖8.用編碼全長天然EphA2序列的pCDNA4質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后48小時(shí)，該293細(xì)胞的細(xì)胞裂解液的Western印跡分析；圖9A-9B.在CT26腫瘤模型中，用表達(dá)AH1-A5的李斯特菌陽性對(duì)照進(jìn)行治療性免疫；圖10A-10B.用表達(dá)hEphA2的ECD的李斯特菌進(jìn)行預(yù)防性免疫抑制了CT26-hEphA2腫瘤生長(圖10A)并提高了存活率(圖10B)；圖11A-11D.在L4029EphA2-exFlag、李斯特菌對(duì)照(L4029)的靜脈內(nèi)給藥或含有AH1蛋白的李斯特菌陽性對(duì)照(L4029-AH1)(100μl體積5×105個(gè)細(xì)胞)的皮下或靜脈內(nèi)給藥后的預(yù)防性研究。圖11A顯示了接種了表達(dá)huEphA2的ECD的CT26細(xì)胞、運(yùn)載體(HBSS)、李斯特菌(L4029)或李斯特菌陽性(L4029-AH1)對(duì)照的小鼠的腫瘤體積。圖11B顯示了接種了表達(dá)huEphA2的ECD的CT26細(xì)胞(L4029-EphA2exFlag)相對(duì)于接種了李斯特菌(L4029)對(duì)照的小鼠的平均腫瘤體積。圖11C顯示了在皮下模型中的預(yù)防性研究結(jié)果，測(cè)量了在CT26腫瘤細(xì)胞接種后的小鼠的存活百分比。圖11D顯示了在肺轉(zhuǎn)移模型中的預(yù)防性研究結(jié)果，測(cè)量了在腫瘤細(xì)胞接種后的小鼠的存活百分比；圖12.用表達(dá)hEphA2的ECD的李斯特菌進(jìn)行預(yù)防性免疫提高了患RenCa-hEphA2腫瘤后的存活率；圖13A-13C.圖13A-13C顯示了接種了CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的動(dòng)物的典型治療性研究結(jié)果，該癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染了人EphA2(L4029-EphA2exFlag)、李斯特菌對(duì)照(L4029-對(duì)照)或運(yùn)載體(HBSS)。在圖13A中，在接種后以若干間隔測(cè)量腫瘤體積。圖13B顯示了用含有李斯特菌對(duì)照或huEphA2的ECD的CT26細(xì)胞接種的小鼠的平均腫瘤體積。圖13C呈現(xiàn)了使用肺轉(zhuǎn)移模型的治療性研究結(jié)果，測(cè)量用含有HBSS或李斯特菌對(duì)照、或表達(dá)huEphA2的ECD的李斯特菌的CT26細(xì)胞接種后的小鼠的存活百分比；圖14A-F.圖14A.用表達(dá)hEphA2的ICD的李斯特菌對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行治療性免疫抑制了產(chǎn)生的CT26-hEphA2腫瘤的生長。圖14B.用編碼EphA2CO結(jié)構(gòu)域的重組李斯特菌對(duì)患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/C小鼠進(jìn)行免疫獲得長時(shí)間的存活。圖14C.用編碼OVA.AH1或OVA.AH1-A5的重組李斯特菌免疫患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤Balb/c小鼠獲得長時(shí)間存活。圖14D.用編碼密碼子優(yōu)化的或天然的EphA2CO結(jié)構(gòu)域序列的重組李斯特菌免疫患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/C小鼠提高了存活。圖14E.用編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2EX2結(jié)構(gòu)域序列融合的密碼子優(yōu)化的secA1信號(hào)肽的重組李斯特菌免疫患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/C小鼠提高了存活。圖14F.用編碼EphA2CO結(jié)構(gòu)域的重組李斯特菌而不用編碼全長EphA2的質(zhì)粒DNA對(duì)患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/C小鼠進(jìn)行免疫獲得長時(shí)間的存活；圖15.長期抑制在再次受到威脅時(shí)的CT26-hEphA2腫瘤生長；圖16.用表達(dá)hEphA2的李斯特菌進(jìn)行免疫引起了特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答；圖17.CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答都是最佳hEphA2引導(dǎo)性抗腫瘤作用所必需的；圖18A-B.用表達(dá)人EphA2ICD的李斯特菌進(jìn)行治療性接種提高了CD45+腫瘤的滲透性。圖18A說明了用生物素化大鼠抗小鼠CD45/B200染色的腫瘤切片圖。圖18B是將圖像數(shù)據(jù)規(guī)格化為腫瘤體積的柱狀圖。5、本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明部分地是基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)包含構(gòu)建成表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌的基于李斯特菌的疫苗能夠產(chǎn)生對(duì)抗與EphA2表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的過量增殖性疾病的有益的治療和預(yù)防效果。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、抑制和控制與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥、與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞病癥的方法和組合物。本發(fā)明的具體方面涉及包含化合物的方法和組合物，當(dāng)向患有與EphA2表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的過量增殖細(xì)胞病癥的個(gè)體給藥時(shí)，該化合物可以引發(fā)或介導(dǎo)對(duì)抗EphA2的免疫應(yīng)答，從而使與過量增殖細(xì)胞病癥有關(guān)的該EphA2表達(dá)細(xì)胞的生長受到抑制。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療、抑制或控制上皮細(xì)胞源癌轉(zhuǎn)移的方法和組合物，特別是人乳腺癌、卵巢癌、食道癌、肺癌、皮膚癌、前列腺癌、膀胱癌、和胰腺癌、和腎細(xì)胞癌以及黑素瘤。本發(fā)明進(jìn)一步涉及預(yù)防、治療、抑制或控制T細(xì)胞源癌的方法和組合物，特別是白血病和淋巴瘤。此外，本發(fā)明的組合物和方法包括與本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗組合的其它類型的活性成分。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物被用于治療、預(yù)防或控制其它非腫瘤性的過量增殖細(xì)胞病癥，例如但不限于哮喘、牛皮癬、再狹窄、COPD等。本發(fā)明也涉及治療、抑制和控制用目前的或標(biāo)準(zhǔn)的治療(例如癌癥治療，例如化療、放療、激素治療和生物學(xué)/免疫治療)部分或完全地難以治療的癌癥和其它過量增殖細(xì)胞病癥的方法。5.1.基于李斯特菌的疫苗本發(fā)明提供了構(gòu)建成表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌以及這種李斯特菌在控制、治療或預(yù)防與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的疾病和/或過量增殖細(xì)胞病癥中的用途?；诶钏固鼐腅phA2疫苗可包含一種或多種表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌菌株。在其它實(shí)施方案中，基于李斯特菌的EphA2疫苗可包含構(gòu)建成表達(dá)一種或多種EphA2抗原性肽的李斯特菌菌株。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗包含單核增生李斯特菌屬。5.1.1.減毒為了在人和動(dòng)物的治療中安全地使用李斯特菌，優(yōu)選地，將該細(xì)菌的致病毒性減弱。最終的結(jié)果是降低向患者施用該李斯特菌而引起中毒性休克或其它副作用的風(fēng)險(xiǎn)?？梢酝ㄟ^許多技術(shù)分離出這種減毒的李斯特菌。這些方法包括使用微生物的抗生素敏感性菌株、微生物的基因突變、選擇缺失毒性因子的微生物突變體以及構(gòu)建細(xì)胞壁脂多糖被改變的微生物的新菌株。在某些實(shí)施方案中，可以通過例如同源重組技術(shù)和化學(xué)突變或轉(zhuǎn)位子突變來刪除或破壞編碼毒性因子的DNA序列，以將李斯特菌減毒，這些毒性因子確保李斯特菌在宿主細(xì)胞，特別是在巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中存活。這些研究過的毒性因子中有很多，但不是全部與在巨噬細(xì)胞中的存活有關(guān)，該存活使這些因子在壓力，例如酸化作用，的作用下特異性地在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，或用來誘導(dǎo)特異性的宿主細(xì)胞應(yīng)答，例如巨胞飲作用，F(xiàn)ields等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA835189-5193。毒性基因的實(shí)施例包括但不限于hly、plcA、plcB、mpl、actA、inlA和inlB，也見Autret等，2001，InfectionandImmunity692054-2065。在特定實(shí)施方案中，將李斯特菌的組織趨向性(例如inlB突變體)和/或它們從細(xì)胞至細(xì)胞擴(kuò)散的能力(例如actA突變體)減弱。在另一實(shí)施方案中，李斯特菌包含一或多個(gè)內(nèi)化素(例如inlA和/或inlB)的突變(例如刪除、添加或取代)。在另一實(shí)施方案中，李斯特菌在actA中包含突變(例如刪除、添加或取代)。作為確保減毒表型且避免向非減毒表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)的方法，可構(gòu)建李斯特菌使其以多種方式減毒，例如影響組織趨向性的突變(例如inlB突變體)和影響從細(xì)胞向細(xì)胞擴(kuò)散的能力的突變(例如actA突變體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該李斯特菌包含內(nèi)化素B中的突變(刪除、添加或取代)和actA中的突變。5.1.2.表達(dá)系統(tǒng)EphA2抗原性肽優(yōu)選在李斯特菌中使用異源基因表達(dá)框表達(dá)。異源基因表達(dá)框典型地由按以下順序排列的元件組成(1)原核啟動(dòng)子；(2)SD(Shine-Dalgarno)序列；(3)分泌信號(hào)(信號(hào)肽)；和(4)異源基因。可選擇地，該異源基因表達(dá)框還可以包含轉(zhuǎn)錄終止序列，其結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定地整合到細(xì)菌染色體中。盡管不是必需的，在異源基因表達(dá)框中包含轉(zhuǎn)錄終止序列作為排列在最后的元件可以防止通讀(read-through)轉(zhuǎn)錄對(duì)相鄰基因的表達(dá)調(diào)節(jié)產(chǎn)生極性效應(yīng)。引入到上述基于李斯特菌的EphA2疫苗的表達(dá)載體優(yōu)選地設(shè)計(jì)成使李斯特菌產(chǎn)生EphA2肽，和可選地，第二腫瘤抗原由該李斯特菌分泌。許多細(xì)菌分泌信號(hào)是本領(lǐng)域公知的，可用于本發(fā)明的組合物和方法。可與李斯特菌一起使用的分泌信號(hào)的例子是SecA，如下文的5.2.1.4部分所述。驅(qū)動(dòng)EphA2抗原性肽表達(dá)的啟動(dòng)子可以是構(gòu)成型的，其中該肽被持續(xù)表達(dá)；誘導(dǎo)型的，其中該肽僅在誘導(dǎo)分子存在時(shí)才被表達(dá)；或細(xì)胞類型特異性的，其中肽或酶僅在某些細(xì)胞類型中表達(dá)。以下提供了EphA2抗原性肽表達(dá)系統(tǒng)的組分的優(yōu)選的實(shí)施方案，該系統(tǒng)將與5.2部分中所述的編碼EphA2抗原性肽的核酸結(jié)合使用。5.1.2.1.構(gòu)建體骨架本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可獲得各種適于裝配異源基因表達(dá)框的質(zhì)粒構(gòu)建體骨架。根據(jù)細(xì)菌染色體或染色體外附加體的異源基因表達(dá)框的表達(dá)是否理想來選擇具體的質(zhì)粒構(gòu)建體骨架。作為非限制性例子，使用整合載體將異源基因表達(dá)框整合進(jìn)單核增生李斯特菌(李斯特菌)的細(xì)菌染色體中，該整合載體包含李斯特噬菌體(listeriophage)整合酶的表達(dá)框，該整合酶催化載體序列特異性地整合到李斯特菌染色體中。例如，已知為pPL1和pPL2的整合載體促使異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框在細(xì)菌基因組的無毒區(qū)發(fā)生穩(wěn)定的單拷貝整合，這在文獻(xiàn)中有說明(Lauer等，2002，J.Bacteriol.1844177-4178)。整合載體在大腸桿菌中作為質(zhì)粒是穩(wěn)定的，其通過接合而引入到理想的李斯特菌背景中。各載體缺乏李斯特菌特異性復(fù)制原點(diǎn)并編碼噬菌體整合酶，因而該載體僅在整合進(jìn)染色體的噬菌體附著位點(diǎn)后才是穩(wěn)定的。從理想質(zhì)粒構(gòu)建體開始，制備表達(dá)理想蛋白的重組李斯特菌菌株的過程需要大約1周的時(shí)間。pPL1和pPL2整合載體分別是基于U153和PSA李斯特噬菌體。pPL1載體整合到comK基因的開放閱讀框中，而pPL2以這種方式整合到tRNAArg基因中一旦整合成功該基因的天然序列就得到恢復(fù)，從而保持其完整的天然表達(dá)功能。為了便于構(gòu)建含有異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框的質(zhì)粒，pPL1和pPL2整合載體含有多克隆位點(diǎn)序列。可選擇地，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等位基因交換法來將EphA2抗原性肽表達(dá)框整合進(jìn)李斯特菌染色體中。在具體組合中，在不希望將編碼抗生素抗性蛋白的基因整合成為含有異源基因表達(dá)框的構(gòu)建體的一部分的情況下，等位基因交換法是理想的。例如，pKSV7載體(Camilli等，1993，Mol.Microbiol8143-157)含有溫度敏感型李斯特菌革蘭氏陽性復(fù)制原點(diǎn)，該復(fù)制原點(diǎn)用來在限制溫度下選擇重組克隆，該克隆表示pKSV7質(zhì)粒重組進(jìn)了李斯特菌染色體中。為了便于構(gòu)建包含異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框和氯霉素抗性基因的質(zhì)粒，pKSV7等位基因交換質(zhì)粒載體包含多克隆位點(diǎn)序列。為了插入到李斯特菌的染色體中，異源EphA2抗原性肽表達(dá)框構(gòu)建體最好側(cè)翼連接大約1kb的染色體DNA序列，這些序列對(duì)應(yīng)于理想整合的準(zhǔn)確位點(diǎn)。pKSV7異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框質(zhì)粒最好根據(jù)革蘭氏陽性菌電穿孔的標(biāo)準(zhǔn)方法通過電穿孔而導(dǎo)入到理想菌株中。簡(jiǎn)言之，通過在含有氯霉素(10μg/ml)的BHI瓊脂培養(yǎng)基上涂板并在30℃的準(zhǔn)許溫度下培養(yǎng)來選擇經(jīng)pKSV7異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框質(zhì)粒電穿孔的細(xì)菌。在含有氯霉素的培養(yǎng)基中在41℃的限制溫度下將若干個(gè)單個(gè)克隆多代傳代來選擇細(xì)菌染色體的單交換整合。最后，通過在不含氯霉素的BHI培養(yǎng)基上在30℃的準(zhǔn)許溫度下將若干個(gè)單個(gè)克隆多代傳代來完成質(zhì)粒的切除和去除(雙交換)。通過PCR，利用引物對(duì)擴(kuò)增了從異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框內(nèi)到pKSV7質(zhì)粒載體構(gòu)建體不包含的細(xì)菌染色體靶序列之間的區(qū)域，可以驗(yàn)證異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)表達(dá)框在細(xì)菌染色體中的整合。在其它組合中，從穩(wěn)定的質(zhì)粒附加體中表達(dá)異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)是理想的。通過多代傳代來維持質(zhì)粒附加體則需要共同表達(dá)為含該質(zhì)粒的細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢(shì)的蛋白。作為非限制性例子，從質(zhì)粒中與異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)組合共表達(dá)的蛋白可以是抗生素抗性蛋白，例如氯霉素，或可以是細(xì)菌蛋白(在野生型細(xì)菌的染色體中表達(dá))，其也可以賦予選擇優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌蛋白的非限制性例子包括嘌呤或氨基酸生物合成所需的酶(在缺乏相關(guān)氨基酸或其它必要前體大分子的預(yù)定培養(yǎng)基中選擇)、或賦予體外或體內(nèi)選擇優(yōu)勢(shì)的基因表達(dá)所需要的轉(zhuǎn)錄因子(Gunn等，2001，J.Immuol.1676471-6479)。作為非限制性例子，pAM401是選定的異源蛋白(例如EphA2抗原性肽)的附加體在不同的革蘭氏陽性菌中表達(dá)的合適載體(Wirth等，1986，JBacteriol165831-836)。5.1.2.2.SD(Shine-Dalgarno)序列在啟動(dòng)子的3’端含有聚嘌呤SD序列，該序列是30S核糖體亞單元(通過16SrRNA)與異源基因RNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合以及翻譯起始所必需的元件。SD序列典型地具有以下相同序列(SEQIDNO66)5’-NAGGAGGU-N5-10-AUG(起始密碼子)-3’。存在聚嘌呤SD序列的變體。公知地，編碼李斯特溶菌素O(LLO)的李斯特菌hly基因具有以下SD序列(SEQIDNO67)AAGGAGAGTGAAACCCATG(下劃線處是SD序列，加粗的是翻譯起始密碼子)。5.1.2.3.密碼子優(yōu)化在某些實(shí)施方案中，為了最優(yōu)化選定的異源蛋白的翻譯效率，理想地使用李斯特菌偏好的密碼子。用于細(xì)菌表達(dá)的偏好密碼子可以如Nakamura等，2000，Nucl.AcidsRes.28292中的描述來確定。在某些實(shí)施方案中，從單核增生李斯特菌中密碼子優(yōu)化表達(dá)EphA2抗原性肽是理想的。下表3顯示了單核增生李斯特菌使用的各個(gè)氨基酸的優(yōu)化密碼子。表3李斯特菌密碼子偏好將用于優(yōu)化表達(dá)的密碼子5.1.2.4.信號(hào)肽細(xì)菌利用不同的蛋白分泌通路，包括secA1和雙Arg移位(Tat)，它們位于前蛋白的N末端。大部分的分泌蛋白利用Sec通路，其中蛋白以未折疊的構(gòu)象通過埋在細(xì)菌細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)Sec孔移位。相反，利用Tat通路的蛋白質(zhì)以折疊的構(gòu)象分泌。編碼這些蛋白分泌通路(包括但不限于5.1.2.4.部分中描述的信號(hào)肽和5.2.1.部分中描述的信號(hào)和引導(dǎo)肽)相應(yīng)的信號(hào)肽的核苷酸序列可以與理想的異源蛋白編碼序列同框基因融合。信號(hào)肽最好在其羧基末端包含信號(hào)肽酶，以將確實(shí)理想的蛋白釋放到胞外環(huán)境中(Sharkov和Cai，2002，J.Biol.Chem.2775796-5803；Nielsen等，1997，ProteinEngineering101-6)。可以使用程序如SignalP3.0(Bendtsen等，2004，J.Mol.Biol.340783-795)預(yù)測(cè)信號(hào)肽裂解位點(diǎn)。信號(hào)肽不僅可以衍生自不同的分泌通路，還可以衍生自不同的細(xì)菌屬。信號(hào)肽具有共同的結(jié)構(gòu)組成，具有帶電荷的N端(N結(jié)構(gòu)域)、疏水核區(qū)(H結(jié)構(gòu)域)和更具極性的C末端區(qū)域(C結(jié)構(gòu)域)，但是它們不沒有序列保守性。信號(hào)肽的C結(jié)構(gòu)域帶有I型信號(hào)肽酶(SPaseI)裂解位點(diǎn)，在相對(duì)于裂解位點(diǎn)的位置1和3帶有相同序列A-X-A。通過sec通路分泌的蛋白具有平均28個(gè)殘基的信號(hào)肽。與通過Tat通路分泌的蛋白相連的信號(hào)肽具有與Sec信號(hào)肽相似的三部分的組成，但其特征在于在N結(jié)構(gòu)域/H結(jié)構(gòu)域交界處具有RR基序(R-R-X-#-#，其中#是疏水殘基)。細(xì)菌Tat信號(hào)肽比sec信號(hào)肽平均長14個(gè)氨基酸。枯草桿菌分泌蛋白(secretome)可包含多達(dá)69個(gè)利用Tat分泌通路的推定蛋白，其中14個(gè)包含SPaseI裂解位點(diǎn)(Jongbloed等，2002，J.Biol.Chem.27744068-44078；Thalsma等，2000，Microbiol.Mol.Biol.Rev.64515-547)。下表4中是信號(hào)肽的非限制性例子，這些信號(hào)肽能在選定的異源基因的融合組合中使用，而使編碼蛋白從細(xì)菌中分泌。表4用于EphA2的細(xì)菌表達(dá)和分泌的信號(hào)序列在各種細(xì)菌屬中有各種通過Tat通路分泌的蛋白。在某些實(shí)施方案中，選擇的與這些蛋白相應(yīng)的Tat信號(hào)肽與編碼EphA2抗原性肽的理想序列同框基因融合，以促進(jìn)功能性連接的Tat信號(hào)肽-EphA2蛋白嵌合體通過Tat通路分泌。以下提供了來自枯草芽孢桿菌和李斯特菌(無害李斯特菌和單核增生李斯特菌)的蛋白的非限制性例子，這些蛋白據(jù)預(yù)測(cè)利用Tat通路分泌。推定的通過Tat分泌的枯草芽孢桿菌蛋白＞gi/2635523/emb/CAB15017.1/與雙(組分感應(yīng)器組氨酸激酶(YtsA)(枯草芽孢桿菌)相似＞gi/2632548/emb/CAB12056.1/磷酸二酯酶/堿性磷脂酶D(枯草芽孢桿菌)＞gi/2632573/emb/CAB12081.1/與假定蛋白(枯草芽孢桿菌)相似＞gi/2633776/emb/CAB13278.1/與假定蛋白(枯草芽孢桿菌)相似＞gi/2634674/emb/CAB14172.1/menaquinol細(xì)胞色素c氧化還原酶(鐵(硫亞單位)(枯草芽孢桿菌)＞gi/2635595/emb/CAB15089.1/yubF(枯草芽孢桿菌)＞gi/2636361/emb/CAB15852.1/替換基因名ipa(29d～與假定蛋白(枯草芽孢桿菌)相似推定的通過Tat分泌的李斯特菌蛋白＞gi/16799463/ref/NP_469731.1/與枯草芽孢桿菌YwbN蛋白相似的保守的假定蛋白(無害李斯特菌)＞gi/16801368/ref/NP_471636.1/與3(羰酰基(?；?載體蛋白合成酶(無害李斯特菌)相似單核增生李斯特菌EGD(e)＞gi/16802412/ref/NP_463897.1/與與枯草芽孢桿菌YwbN蛋白相似的保守的假定蛋白(單核增生李斯特菌EGD(e)微生物利用對(duì)密碼子的偏好來調(diào)節(jié)具體內(nèi)源基因的表達(dá)。因此，用于分泌選定異源蛋白的信號(hào)肽可能不包含使用偏好密碼子的密碼子，從而使蛋白質(zhì)以非最佳水合成。在某些實(shí)施方案中，與編碼選定異源蛋白的基因同框融合的信號(hào)肽序列是選定細(xì)菌所使用的最佳化密碼子。在某些實(shí)施方案中，為了從重組的單核增生李斯特菌中表達(dá)和分泌，選定的信號(hào)肽的核苷酸序列是根據(jù)上文表4在單核增生李斯特菌中最優(yōu)化表達(dá)的密碼子。5.1.2.5.轉(zhuǎn)錄終止序列在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄終止序列可插入異源蛋白表達(dá)框中，在異源蛋白的翻譯終止密碼子的C末端的下游?？梢栽诋愒吹鞍妆磉_(dá)框中放入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的序列元件，該元件促進(jìn)rho依賴性或非rho依賴性的轉(zhuǎn)錄終止。5.2.EphA2抗原性肽如上所述，本發(fā)明涉及李斯特菌的應(yīng)用，該菌構(gòu)建成表達(dá)EphA2抗原性肽。不受任何機(jī)制的約束，這種李斯特菌一旦給于患有與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的疾病的個(gè)體，其能夠引發(fā)對(duì)抗EphA2的免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生對(duì)抗內(nèi)源EphA2的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答。原則上，用于本發(fā)明的方法和組合物的EphA2抗原性肽(有時(shí)稱作“EphA2抗原性多肽”)可以是任何EphA2抗原性肽，該肽能夠引發(fā)對(duì)抗與過量增殖性病癥有關(guān)的EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此，EphA2抗原性肽可以是EphA2多肽，優(yōu)選地是SEQIDNO2的EphA2多肽，或EphA2多肽的片段或衍生物，該片段或衍生物(1)表現(xiàn)出EphA2的抗原性(與EphA2結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合抗EphA2抗體的能力)，(2)表現(xiàn)出EphA2的免疫原性(產(chǎn)生與EphA2結(jié)合的抗體的能力)，和/或(3)包含一或多個(gè)EphA2的T細(xì)胞抗原決定簇。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽是由以下提供的核苷酸序列編碼的序列或其片段或衍生物Genbank登記號(hào)NM_004431人Genbank登記號(hào)NM_010139小鼠Genbank登記號(hào)AB038986雞(部分)在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽是全長的人EphA2(SEQIDNO2)。在其它實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含EphA2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO2的殘基22至554)。在其它實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含EphA2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO2的殘基558至976)。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含全長的人EphA2的多于一個(gè)的結(jié)構(gòu)域。在特定實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽包含連接在一起的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)該實(shí)施方案，EphA2的跨膜結(jié)構(gòu)域被刪除。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，EphA2的酪氨酸激酶活性被去除。因此，EphA2可包含氨基酸殘基的刪除、添加或取代，以使酪氨酸激酶活性去除。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在位置646處存在由賴氨酸到甲硫氨酸的取代。在優(yōu)選實(shí)施方案中，刪除EphA2的跨膜結(jié)構(gòu)域，EphA2抗原性肽包含EphA2的胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域且在位置646處具有由賴氨酸至甲硫氨酸的取代。在某些實(shí)施方案中，上述肽對(duì)應(yīng)或包含EphA2抗原決定簇，該抗原決定簇在癌細(xì)胞中暴露但在非癌細(xì)胞中被屏蔽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽優(yōu)選地包含在癌細(xì)胞上而不在非癌細(xì)胞上選擇性地暴露或增加的EphA2抗原決定簇(“暴露的EphA2抗原決定簇肽”)。本發(fā)明進(jìn)一步包含在本發(fā)明的組合物和方法中使用多個(gè)EphA2抗原性肽，例如2、3、4、5、6、或更多個(gè)EphA2抗原性肽。用于本發(fā)明的方法和組合物的EphA2的片段可包含在由EphA2基因編碼的氨基酸序列內(nèi)的氨基酸殘基的刪除、添加或取代。優(yōu)選地，突變導(dǎo)致沉默改變，由此產(chǎn)生功能等價(jià)的EphA2基因產(chǎn)物。用“功能等價(jià)物”表示突變的EphA2基因產(chǎn)物具有與野生型EphA2基因產(chǎn)物相同的功能，例如包含EphA2的一或多個(gè)抗原決定簇。EphA2抗原性肽序列優(yōu)選地包含氨基酸序列，該序列與人EphA2表現(xiàn)出至少大約65％序列相似性、更優(yōu)選地與人EphA2表現(xiàn)出至少大約70％序列相似性、且更優(yōu)選地與人EphA2表現(xiàn)出至少大約75％序列相似性。在其它實(shí)施方案中，EphA2多肽序列優(yōu)選地包含氨基酸序列，該序列與人EphA2表現(xiàn)出至少大約85％序列相似性，更優(yōu)選地與人EphA2表現(xiàn)出至少大約90％序列相似性，且最優(yōu)選地與人EphA2表現(xiàn)出至少大約95％序列相似性。適合本方法的其它多肽是由以下5.2部分描述的核酸編碼的多肽?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法來確定兩序列間的一致性百分比。用于比較兩序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的、但非限制性的例子是Karlin和Altschul，1990，Proc.NatlAcadSci.U.S.A.872264-2268及Karlin和Altschul，1993，Proc.NatlAcadSci.U.S.A.905873-5877中改進(jìn)的算法。這種算法被整合進(jìn)了Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410的NBLAST和XBLAST程序中?？墒褂肗BLAST參數(shù)，以得分＝100，詞長＝12進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢允褂肵BLAST程序，以得分＝50，詞長＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比對(duì)的間隔排列，可以使用GappedBLAST，如Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.253389-3402中所述?？蛇x擇地，可使用PSI-BLAST進(jìn)行多重檢索，該檢索檢測(cè)到分子間的遠(yuǎn)距離關(guān)系(出去同上)。當(dāng)使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)(如XBLAST和NBLAST的參數(shù))。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選的、非限制性例子是Myers和Miller，1988，ComputApplBiosci411-17的算法。這種算法被結(jié)合進(jìn)了ALIGN程序(2.0版)中，該程序是GCG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表，間隔長度罰值為12，間隔罰值為4。序列分析的其它算法是本領(lǐng)域已知的，包括如Torellis和Robotti，1994，ComputApplBiosci103-5中所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman，1988，ProcNatlAcadSciUSA852444-8中所述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定搜索的敏感度和速度的控制選擇。如果ktup＝2，則在被比較的兩個(gè)序列中查看被比對(duì)的殘基對(duì)來尋找相似區(qū)域；如果ktup＝1，則檢查單個(gè)被比對(duì)的氨基酸。ktup對(duì)于蛋白質(zhì)序列可設(shè)定為2或1，或?qū)τ贒NA序列可設(shè)為1至6。如果沒有指明，ktup的默認(rèn)值對(duì)于蛋白質(zhì)是2且對(duì)于DNA是6。關(guān)于FASTA參數(shù)的進(jìn)一步說明，參見http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.html#sect2。兩序列間的一致性百分比可以使用上文所述的相似技術(shù)來確定，允許或不允許使用間隔。在計(jì)算一致性百分比時(shí)，僅計(jì)算實(shí)際的配對(duì)。但是，在評(píng)價(jià)與在此公開的EphA2序列具有低的一致性百分比的序列時(shí)，應(yīng)該考慮保守取代。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用包含至少EphA2多肽，優(yōu)選的SEQIDNO2的10、20、30、40、50、75、100或200個(gè)氨基酸的EphA2抗原性肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用包含至少EphA2多肽，優(yōu)選的SEQIDNO2的10、20、30、40、50、75、100或200個(gè)連續(xù)氨基酸的EphA2抗原性肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種多肽包含SEQIDNO2的EphA2多肽的胞外結(jié)構(gòu)域的全部或一部分。5.2.1.融合蛋白在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，基于李斯特菌的EphA2疫苗表達(dá)是融合蛋白的EphA2抗原性肽。因此，本發(fā)明包含組合物和方法，其中EphA2抗原性肽是融合蛋白，該融合蛋白包含與異源組分，例如異源肽操作性連接的EphA2的全部或片段或衍生物。異源組分可以包括但不限于有利于融合蛋白的分離和純化的序列。異源組分也可以包括賦予EphA2抗原性肽穩(wěn)定性的序列。這些融合組分是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明包括融合蛋白的應(yīng)用，該融合蛋白包含EphA2多肽(例如SEQIDNO2的多肽或其片段)和異源多肽(即多肽或其片段，優(yōu)選地是該多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100連續(xù)氨基酸的片段)。融合可以是直接的，也可以通過聯(lián)結(jié)子序列實(shí)現(xiàn)。異源肽可融合在EphA2抗原性肽的N末端或C末端?？蛇x擇地，異源肽可側(cè)翼連接EphA2多肽序列。融合蛋白可包含在其N末端與異源信號(hào)序列融合的EphA2抗原性肽。各種信號(hào)序列是商業(yè)上可獲得的。除了上文5.1.2.4.部分所述的信號(hào)序列，可用于本發(fā)明的方法的原核異源信號(hào)序列包括但不限于phoA分泌信號(hào)(Sambrook等編，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratory出版社，ColdSpringHarbor，NY)和蛋白A分泌信號(hào)(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。EphA2抗原性肽可與標(biāo)簽序列融合，該標(biāo)簽例如六組氨酸肽，如在pQE載體(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)等中提供的標(biāo)簽，其中許多是商業(yè)可獲得的，以用于本發(fā)明的方法。例如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824中所述，提供六組氨酸便于純化融合蛋白。肽標(biāo)簽的其它例子是紅血球凝集素“HA”標(biāo)簽，其對(duì)應(yīng)于從流感紅血球凝集素蛋白衍生出的抗原決定簇(Wilson等，1984，Cell，37767)，和“flag”標(biāo)簽(Knappik等，1994，Biotechniques，17(4)754-761)。這些標(biāo)簽對(duì)純化重組制備的EphA2抗原性肽特別有用。利用對(duì)表達(dá)的融合蛋白具有特異性或選擇性的抗體可以容易地純化任何融合蛋白。例如由Janknecht等描述的系統(tǒng)可以容易地純化在人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性的融合蛋白(Janknecht等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888972)。在該系統(tǒng)中，感興趣的基因插入到牛痘重組質(zhì)粒中，因而該基因的開放閱讀框與由六個(gè)組氨酸殘基組成的氨基末端標(biāo)簽翻譯性地融合。將重組牛痘病毒感染的細(xì)胞的提取物加樣至Ni2+-腈乙酸瓊脂糖柱上，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白被含有咪唑的緩沖液選擇性地洗脫。為了用與本發(fā)明的方法，也可以將親和標(biāo)簽在其氨基末端與EphA2抗原性肽的羧基末端融合。在羧基末端進(jìn)行融合的精確位點(diǎn)不是關(guān)鍵性的?？梢酝ㄟ^常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法確定最優(yōu)的位點(diǎn)。為了用與本發(fā)明的方法和組合物，還可以將親和標(biāo)簽在其羧基末端與EphA2抗原性肽的氨基末端融合。也可以使用本領(lǐng)域已知的各種親和標(biāo)簽，例如但不限于免疫球蛋白恒定區(qū)(也可參見Petty，1996，Metal-chelateaffinitychromatography，見CurrentProtocolsinMolecularBiology，第2卷，Ausubel等編，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST；Smith，1993，MethodsMol.CellBio.4220-229)、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(Guan等，1987，Gene6721-30)，和各種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(美國專利號(hào)5,496,934、5,202,247、5,137,819，Tomme等，1994，ProteinEng.7117-123)等。其它親和標(biāo)簽由特異性結(jié)合組分識(shí)別，因而有利于通過親和結(jié)合固定在固體支持物上的該結(jié)合組分來進(jìn)行分離。一些親和標(biāo)簽也可以使EphA2抗原性肽產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)屬性，例如形成多聚體的能力。這些親和標(biāo)簽常常衍生自通常作為同聚體存在的蛋白質(zhì)。親和標(biāo)簽例如CD8的胞外結(jié)構(gòu)域(Shiue等，1988，J.Exp.Med.1681993-2005)、或CD28(Lee等，1990，JImmunol.145344-352)、或包含鏈間二硫鍵形成位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的片段，可能會(huì)導(dǎo)致多聚體形成。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，許多方法可用于獲得上述親和標(biāo)簽的編碼區(qū)，包括但不限于DNA克隆、DNA擴(kuò)增和合成方法。用于它們的檢測(cè)和分離的一些親和標(biāo)簽和試劑是商業(yè)可獲得的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種引導(dǎo)序列以將EphA2抗原性肽從細(xì)菌細(xì)胞如李斯特菌中有效分泌出來(vonHeijne，J.Mol.Biol.18499-105)。除了上文所述的和5.1.2.4.部分中描述的信號(hào)序列外，在細(xì)菌細(xì)胞中引導(dǎo)EphA2抗原性肽表達(dá)的合適的引導(dǎo)序列包括但不限于大腸桿菌蛋白OmpA(Hobom等，1995，Dev.Biol.Stand.84255-262)、PhoA(Oka等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci827212-16)、OmpT(Johnson等，1996，ProteinExpression7104-113)、LamB和OmpF(Hoffman&Wright，Proc.Natl.Acad.Sci.USA825107-5111)、β-內(nèi)酰胺酶(Kodonaga等，1984，J.Biol.Chem.2592149-54)、腸毒素(Morioka-Fujimoto等，1991，J.Biol.Chem.2661728-32)、和金黃葡萄球菌蛋白質(zhì)A(Abrahmsen等，1986，NucleicAcidsRes.147487-7500)、和枯草芽孢桿菌的內(nèi)糖原酶(Lo等，Appl.Environ.Microbiol.542287-2292)的引導(dǎo)序列，以及人工的和合成的信號(hào)序列(MacIntyre等，1990，Mol.Gen.Genet.221466-74；Kaiser等，1987，Science，235312-317)。在某些實(shí)施方案中，融合組分包含與細(xì)胞類型相關(guān)抗原相應(yīng)的非EphA2多肽，該細(xì)胞類型是治療或預(yù)防免疫希望對(duì)抗的類型。例如，非EphA2多肽可以包含腫瘤相關(guān)抗原的抗原決定簇，例如但不限于MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、TRP-2、酪氨酸酶、MART-1、β-HCG、CEA、Ras、β-連鎖蛋白(β-catenin)、gp43、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V、p15、β-連鎖蛋白、BAGE-1、PSA、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人乳頭狀瘤病毒-E6、人乳頭狀瘤病毒-E7和MUC-1、2、3。編碼融合蛋白的聚核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來制備，例如編碼融合蛋白的核酸分子可以通過常規(guī)技術(shù)合成，包括自動(dòng)DNA合成儀?？蛇x擇地，可以使用在兩個(gè)相鄰基因片段之間提供互補(bǔ)粘性末端的錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，隨后可以將該基因片段退火并再擴(kuò)增而產(chǎn)生嵌合的基因序列(見例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等編，JohnWiley&Sons，1992)。編碼融合蛋白的核苷酸序列可插入到合適的表達(dá)載體，即包含被插入的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元件的載體中。融合蛋白的表達(dá)可以由構(gòu)成型的、誘導(dǎo)型的、或組織特異性或選擇性的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。技術(shù)人員能夠理解，融合蛋白可以促進(jìn)溶解和/或表達(dá)，并能夠延長EphA2抗原性肽在體內(nèi)的半衰期，因此可用于本發(fā)明的方法。EphA2抗原性肽或其肽片段或融合蛋白可用于檢測(cè)或測(cè)量EphA2抗原性肽的任何檢測(cè)方法或這些檢測(cè)方法的校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的方法包括EphA2抗原性肽或其肽片段的應(yīng)用，這些肽可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)制備。因此，通過表達(dá)包含EphA2抗原性基因序列的核酸而制備本發(fā)明的EphA2抗原性肽的方法在此得到描述。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含例如EphA2抗原性肽編碼序列(包括但不限于編碼SEQIDNO2多肽的全部或抗原性部分的核酸)和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、和體內(nèi)遺傳重組。見例如在Sambrook等，1989，同上，和Ausubel等，1989，同上所述的技術(shù)?？蛇x擇地，能夠編碼EphA2抗原性肽序列的RNA可以使用例如合成儀來化學(xué)合成(見例如在OligonucleotideSynthesis，1984，Gait，M.J.編，IRL出版社，Oxford中所描述的技術(shù))。在某些實(shí)施方案中，EphA2抗原性肽與內(nèi)化信號(hào)肽功能性連接，該信號(hào)肽也稱作“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”，可以使其被吸收到細(xì)胞核中。在某些特定實(shí)施方案中，該內(nèi)化信號(hào)是觸角足(antennapedia)(參見Prochiantz，1996，Curr.Opin.Neurobiol.6629-634、HoxA5(Chatelin等，1996，Mech.Dev.55111-117)、HIVTAT蛋白(Vives等，1997，J.Biol.Chem.27216010-16017)或VP22(Phelan等，1998，Nat.Biotechnol.16440-443)的內(nèi)化信號(hào)。5.2.2.編碼EphA2抗原性肽的聚核苷酸本發(fā)明也包含基于李斯特菌的疫苗的應(yīng)用，該疫苗包含或含有聚核苷酸，該聚核苷酸在下文所定義的高度嚴(yán)格、中度嚴(yán)格或較低程度嚴(yán)格的雜交條件下，與編碼本發(fā)明的EphA2抗原性肽的聚核苷酸雜交。作為例子而非限定，對(duì)于多于90個(gè)核苷酸的雜交區(qū)域，使用低度嚴(yán)格條件的步驟如下(也可參見Shilo和Weinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792)。在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml變性的鮭魚精子DNA的溶液中，將包含DNA的濾器在40℃預(yù)處理6小時(shí)。在具有以下改變的相同溶液中進(jìn)行雜交0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鮭魚精子DNA、10％(質(zhì)量/體積)硫酸葡聚糖，并使用5～20×106cpm32P-標(biāo)記的探針。在雜交混合物中40℃下培養(yǎng)18-20小時(shí)并隨后在含有2×SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1％SDS的溶液中55℃下洗滌1.5小時(shí)。洗滌溶液用新鮮溶液置換并在60℃再放置1.5小時(shí)。將濾器吸干并暴露用于放射自顯影。如果必要，在65-68℃下將濾器第三次洗滌并重新暴露于膜?？梢允褂玫牡蛧?yán)格的其它條件是本領(lǐng)域熟知的(例如用于種間雜交使用的條件)。同樣，作為例子而非限定，對(duì)于多于90個(gè)核苷酸的雜交區(qū)域，使用高度嚴(yán)格的條件的步驟如下。在含有6×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml變性的鮭魚精子DNA的緩沖液中在65℃下，將包含DNA的濾器進(jìn)行預(yù)雜交8小時(shí)至過夜。在含有100μg/ml變性鮭魚精子DNA和5～20×106cpm32P-標(biāo)記的探針的預(yù)雜交混合物中65℃下將濾器雜交48小時(shí)。在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中37℃將濾器洗滌1小時(shí)。此后在0.1×SSC中50℃洗滌45分鐘，然后放射自顯影?？墒褂玫母叨葒?yán)格的其它條件依賴于核酸的性質(zhì)(例如長度、GC含量等)以及雜交的目的(檢測(cè)、擴(kuò)增等)，這是本領(lǐng)域所熟知的。例如，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中大約15-40個(gè)堿基的核酸與互補(bǔ)序列的嚴(yán)格雜交在以下條件下進(jìn)行50mMKCl的鹽濃度、10mMTris-HCl的緩沖液濃度、1.5mM的Mg2+濃度、7-7.5的pH以及55-60℃的退火溫度。中度嚴(yán)格的合適條件的選擇也是本領(lǐng)域熟知的(見例如Sambrook等，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory出版社，ColdSpringHarbor，NewYork；也見Ausubel等編，CurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals，1987-1997，CurrentProtocols，1994-1997JohnWileyandSons公司)。用于本發(fā)明的核酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備。例如，如果EphA2抗原性肽的核苷酸序列是已知的，那么編碼肽的核酸序列可以從化學(xué)合成的寡核苷酸裝配(例如在Kutmeier等，1994，BioTechniques17242中所述)，其中，簡(jiǎn)言之，包括合成含有一部分肽編碼序列的有重疊的寡核苷酸，將這些寡核苷酸退火并連接，隨后通過PCR將連接的寡核苷酸擴(kuò)增。可選擇地，編碼EphA2抗原性肽的聚核苷酸可以從合適來源的核酸產(chǎn)生。如果無法獲得含有編碼具體肽的核酸的克隆，但是EphA2抗原性肽的序列是已知的，那么編碼肽的核酸可以化學(xué)合成或從合適的來源獲得(例如cDNA文庫、或產(chǎn)生自表達(dá)EphA2的任何組織或細(xì)胞的cDNA文庫、或從中分離的核酸，優(yōu)選聚A+RNA)。方法包括通過使用可與該序列的3’和5’端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或通過使用對(duì)確定的特定基因序列，例如來自表達(dá)所述肽的cDNA文庫的cDNA克隆，有特異性的寡核苷酸探針進(jìn)行克隆。隨后可使用本領(lǐng)域熟知的任何方法將由PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增的核酸克隆進(jìn)可復(fù)制的克隆載體中。此外，可使用本領(lǐng)域熟知的操作核苷酸序列的方法來操作用于本方法的核酸，例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)突變、PCR等(參見例如在Sambrook等1990，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY以及Ausubel等編，1998，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NY中描述的技術(shù)，這些文獻(xiàn)在此被完整地參考引用)，從而產(chǎn)生氨基酸序列不同于SEQIDNO2中所示氨基酸序列的EphA2抗原性肽，例如產(chǎn)生氨基酸取代、刪除和/或插入。5.3.EphA2抗原性肽的分析本發(fā)明提供了基于李斯特菌的EphA2疫苗，該疫苗包含構(gòu)建成表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。用來確定肽是否是T細(xì)胞抗原決定簇或B細(xì)胞抗原決定簇的本領(lǐng)域已知的任何分析方法都可以用來測(cè)試EphA2肽用于本發(fā)明的方法和組合物的合適性。例如，為了確定肽是否是T細(xì)胞抗原決定簇，可以使用ELISPOT分析和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的方法來進(jìn)行抗原特異性的CD4+和CD8+T的細(xì)胞計(jì)數(shù)和表征。Lalvani等，(1997)J.Exp.Med.186859-865；Waldrop等，(1997)J.ClinInvest.991739-1750。通過篩選與EphA2的部分相應(yīng)的合成肽可以確定EphA2抗原性肽?？梢愿鶕?jù)它們的序列或預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)來識(shí)別候選的抗原性肽。許多算法可用于該目的。下文給出了這種檢測(cè)的例舉性方案。5.3.1.表現(xiàn)出EphA2免疫原性的肽可以分析EphA2肽在哺乳動(dòng)物中引發(fā)EphA2特異性抗體應(yīng)答的能力，例如通過用在Freund’s佐劑中乳化的各個(gè)EphA2肽對(duì)動(dòng)物(例如小鼠、豚鼠或兔)進(jìn)行免疫來分析。在3次注射后(每次注射5至100μg肽)，通過肽特異性的ELISA和針對(duì)EphA2的免疫印跡測(cè)試IgG抗體應(yīng)答。據(jù)報(bào)道產(chǎn)生抗血清的EphA2肽表現(xiàn)出EphA2的抗原性，該抗血清與EphA2肽特異性反應(yīng)并且在免疫印跡中被全長的EphA2蛋白識(shí)別。5.3.2.CD4+T細(xì)胞增殖分析例如，這種分析包括體外的細(xì)胞培養(yǎng)分析，其中從患有與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的疾病的患者的新鮮血液中獲得外周血單核細(xì)胞(“PBMC”)，并基本上如Kruse和Sebald，1992，EMBOJ113237-3244中所述，通過使用FICOLL-PLAQUEPLUS(Pharmacia，Upsalla，Sweden)進(jìn)行離心純化。將外周血單核細(xì)胞與候選EphA2抗原性肽培養(yǎng)7-10天。為了處理和呈現(xiàn)抗原，可以在分析前的24-48小時(shí)選擇性地向培養(yǎng)物中加入抗原呈遞細(xì)胞。隨后通過離心收獲細(xì)胞，并在RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中洗滌。在96孔板中將5×104個(gè)激活的T細(xì)胞/孔置于含有10％胎牛血清、10mMHEPES、pH7.5、2mML-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中在37℃放72小時(shí)，并用每孔1μCi3H胸腺嘧啶(DuPontNEN，Boston，MA)刺激6小時(shí)，收獲并在TOPCPOUNT閃爍計(jì)數(shù)器(PackardInstrumentCol.，Meriden，CT)中測(cè)量放射活性。5.3.3.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)可以基本上如Waldrop等，1997，J.Clin.Invest.991739-1750；Openshaw等，1995，J.Exp.Med.1821357-1367；或Estcourt等，1997，Clin.Immunol.Immunopathol.8360-67所述，測(cè)定T細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子應(yīng)答。將從患有與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的疾病的患者中純化的PBMC，以每管1×106個(gè)細(xì)胞的濃度置于12×75毫米聚苯乙烯組織培養(yǎng)管(BectonDickinson，LincolnPark，N.J.)中。向各管中加入含有0.5毫升HL-1無血清培養(yǎng)基、100單位每毫升的青霉素、100單位每毫升的鏈霉素、2毫摩爾L谷氨酰胺(GibcoBRL)、不同量的各種EphA2抗原性候選肽、以及1單位的抗CD28mAb(Becton-Dickinson，LincolnPark，N.J.)的溶液。將抗CD3mAb加入到兩份正常PBMC培養(yǎng)物中作為陽性對(duì)照。將培養(yǎng)管培養(yǎng)1小時(shí)。將BrefeldinA以1毫克每毫升的濃度加入到各管中，將管再培養(yǎng)17小時(shí)。用溶液洗滌細(xì)胞兩次收獲如上所述刺激的PBMC，該溶液包含Dulbecco′s磷酸緩沖鹽(dPBS)和10單位的BrefeldinA。通過在含有0.5毫升4％多聚甲醛和dPBS的溶液中培養(yǎng)10分鐘來固定這些洗滌過的細(xì)胞。用包含dPBS和2％胎牛血清(FCS)的溶液洗滌細(xì)胞。然后如(Waldrop等，1997，J.Clin.Invest.991739-1750)所述，將該細(xì)胞立刻用于用于胞內(nèi)細(xì)胞因子和表面標(biāo)記的染色，或在冷凍培養(yǎng)基中冷凍不超過3天。可以在37℃水浴中使細(xì)胞制劑迅速融化并用dPBS洗滌一次。將細(xì)胞，無論是新鮮的還是冷凍的，重懸于0.5毫升的通透溶液中(BectonDickinsonImmunocytometrysystems，SanJose，Calif.)，并在室溫下避光培養(yǎng)10分鐘。通透后的細(xì)胞用dPBS洗滌兩次并與直接偶聯(lián)的mAbs在室溫下避光培養(yǎng)20分鐘。抗體的最優(yōu)濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法事先確定。在染色后，洗滌細(xì)胞并通過在含有dPBS和1％多聚甲醛的溶液中培養(yǎng)來重新固定，并在4℃避光儲(chǔ)存以用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。5.3.4.ELISPOT分析ELISPOT分析測(cè)量在李斯特菌接種疫苗后小鼠脾細(xì)胞中發(fā)生的Th1-細(xì)胞因子特異性誘導(dǎo)。進(jìn)行ELISPOT分析以確定T淋巴細(xì)胞應(yīng)答內(nèi)源抗原性肽刺激的頻率，該分析如Geginat等，2001，J.Immunol.1661877-1884中所述。用表達(dá)候選EphA2抗原性肽的單核增生李斯特菌或作為對(duì)照的HBSS接種Balb/c小鼠(每組3只)。在接種后5天收獲并匯集整個(gè)小鼠脾。在各種抗原存在的情況下，將小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液分盤放置在37℃培養(yǎng)箱中過夜。在包被了大鼠抗小鼠INF-γmAb的硝酸纖維素襯底96孔微滴定盤中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了測(cè)試候選EphA2抗原性肽，制備1×10-5M肽溶液。在圓底96孔微滴定盤的每孔中，將135μl培養(yǎng)基(補(bǔ)充了10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1×10-5M2-ME和2mM谷氨酰胺的Eagle’s改進(jìn)培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Eggenstein，德國))中的6×105個(gè)未分離脾細(xì)胞與15μl的1×10-5M肽溶液混和，以產(chǎn)生1×10-6M的最終肽濃度。在37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，用力吹吸使細(xì)胞重懸，將100μl或10μl的細(xì)胞懸浮液(分別為4×105/孔或4×104/孔)轉(zhuǎn)移至Ab包被的ELISPOT盤中，并在37℃培養(yǎng)過夜。在ELISPOT盤中，將終體積調(diào)整至150μl以確保細(xì)胞均一分布。用如下所述的改進(jìn)分析方法測(cè)試純化的CD4+或CD8+T細(xì)胞將15μl預(yù)稀釋的肽(1×10-5M)直接加入到Ab包被的ELISPOT盤中，并與來自未免疫動(dòng)物的作為APC的4×105個(gè)脾細(xì)胞混和，產(chǎn)生100μl的終體積。在37℃預(yù)培養(yǎng)APC4小時(shí)后，將從單核增生李斯特菌免疫小鼠中純化出的1×105個(gè)CD4+或CD8+細(xì)胞以50μl的體積加入到各孔，并在37℃過夜培養(yǎng)。在將1×10-6的肽于37℃加到表達(dá)特異性MHCI類分子的細(xì)胞系2小時(shí)后進(jìn)行基于ELISPOT的體外MHC限制分析。隨后，洗脫未結(jié)合的肽(四次)，以防止肽與應(yīng)答脾細(xì)胞結(jié)合。ELISPOT盤的各孔，將1×105個(gè)帶有肽的APC與4×105或4×104個(gè)應(yīng)答脾細(xì)胞混和成終體積150μl。在37℃過夜培養(yǎng)后，用生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠INF-γmAb、HRP鏈霉素偶聯(lián)物以及每個(gè)脾細(xì)胞的氨乙基咔唑染料點(diǎn)使ELISPOT盤顯影。使用對(duì)對(duì)照抗原具有特異性的INF-γ分泌的CD8T細(xì)胞系控制ELISPOT分析的特異性和敏感性。5.4.預(yù)防/治療方法本發(fā)明供了治療、預(yù)防或控制與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞病癥，優(yōu)選地是癌癥的方法，包括向有此需要的個(gè)體用一種或多種本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。本發(fā)明包括引發(fā)對(duì)抗與過量增殖細(xì)胞病癥有關(guān)的EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向個(gè)體以引發(fā)對(duì)抗EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)的有效量，用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一特定實(shí)施方案中，治療、預(yù)防或控制的所述病癥是與過量EphA2表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的癌前期癥狀。在更特定的實(shí)施方案中，癌前期癥狀是高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)、乳腺纖維瘤、乳腺囊腫病、或復(fù)合型痣。本發(fā)明提供治療、預(yù)防或控制與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞病癥，優(yōu)選地是癌癥的方法，該方法包括向有此需要的個(gè)體用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗和一種或多種其它治療給藥。其它治療的例子包括但不限于以下5.4.3.部分中所列出的。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗可以與用于治療、預(yù)防或控制與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞病癥如癌癥的一種或多種其它治療(例如預(yù)防或治療性試劑)組合給藥。在某些實(shí)施方案中，一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與用于治療或控制癌癥的一種或多種其它治療(例如治療性試劑)對(duì)個(gè)體，優(yōu)選地是人同時(shí)給藥。術(shù)語“同時(shí)”不限于在精確的同一時(shí)間給于治療(例如預(yù)防或治療性試劑)，而是指本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗與另一治療按照順序在一時(shí)間段內(nèi)對(duì)個(gè)體給藥，從而使該基于李斯特菌的EphA2疫苗能夠與該其它治療一起發(fā)揮作用，從而比它們以其它方式給藥提供更好的效果。例如，各治療(例如預(yù)防或治療性試劑)可以在同一時(shí)間給藥，或在不同的時(shí)間點(diǎn)以任何順序相繼給藥；然而，如果不是在同一時(shí)間給藥，它們應(yīng)當(dāng)以足夠接近的時(shí)間給藥以提供理想的治療或預(yù)防效果。各治療(例如預(yù)防或治療性試劑)可以分別地、以任何合適的形式及通過任何合適的途徑給藥。在某些實(shí)施方案種，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗可以在手術(shù)之前、同時(shí)或之后給藥。優(yōu)選地，該手術(shù)完全地去除了局部的腫瘤或減小了大腫瘤的尺寸。手術(shù)也可以作為預(yù)防性措施或?yàn)闇p輕痛苦而進(jìn)行。在各實(shí)施方案中，治療(例如預(yù)防或治療性試劑)可以以小于1小時(shí)的間隔、大約1小時(shí)的間隔、大約1小時(shí)至大約2小時(shí)的間隔、大約2小時(shí)至大約3小時(shí)的間隔、大約3小時(shí)至大約4小時(shí)的間隔、大約4小時(shí)至大約5小時(shí)的間隔、大約5小時(shí)至大約6小時(shí)的間隔、大約6小時(shí)至大約7小時(shí)的間隔、大約7小時(shí)至大約8小時(shí)的間隔、大約8小時(shí)至大約9小時(shí)的間隔、大約9小時(shí)至大約10小時(shí)的間隔、大約10小時(shí)至大約11小時(shí)的間隔、大約11小時(shí)至大約12小時(shí)的間隔、不多于24小時(shí)的間隔或不多于48小時(shí)的間隔給予。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩種或多種治療在同一次患者訪問時(shí)給藥。在此提供的給藥的劑量和頻率由術(shù)語治療有效和預(yù)防有效來涵蓋。該劑量和頻率一般地還根據(jù)各患者的特異性因素而變化，依賴于給予的具體的治療或預(yù)防性試劑、癌癥的嚴(yán)重程度和類型、給藥的途徑以及年齡、體重、反應(yīng)以及患者以往的病史。合適的方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮這些因素并遵照，例如在文獻(xiàn)中報(bào)道的和Physician’sDeskReference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中推薦的劑量來進(jìn)行選擇。5.4.1.1.患者群本發(fā)明提供了治療、預(yù)防、和/或控制與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞疾病特別是癌癥的方法，該方法包括向有此需要的個(gè)體用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗以治療或預(yù)防有效量或以有效引發(fā)對(duì)抗與過量增殖性病癥有關(guān)的EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)的量給藥。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗的有效量與一種或多種其它治療(例如治療或預(yù)防性試劑)組合給藥以治療、預(yù)防、和/或控制與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥和/或過量增殖細(xì)胞疾病特別是癌癥。個(gè)體優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，例如非靈長目(例如牛、豬、馬、貓、狗、鼠等)和靈長目(例如猴、如非洲綠猴(cynomolgousmonkey)和人)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該個(gè)體是人?？捎帽景l(fā)明包含的方法治療的癌癥的具體例子包括但不限于過量表達(dá)EphA2的癌癥。在一實(shí)施方案中，癌癥是上皮源的。這些癌癥的例子是肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和皮膚癌。其它癌癥包括膀胱癌和胰腺癌以及腎細(xì)胞癌和黑素瘤。在另一些實(shí)施方案中，癌癥是實(shí)體瘤。在另一實(shí)施方案中，癌癥是T細(xì)胞源的。這些癌癥的例子是白血病和淋巴瘤。在以下的5.4.1.1.部分中作為例子而非限制性地列舉了其它癌癥。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防來自原發(fā)瘤的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的方法和組合物包含對(duì)患有或可能會(huì)患有癌癥，例如對(duì)特定類型的癌癥有遺傳傾向、已暴露于致癌物、或從特定癌癥中好轉(zhuǎn)的個(gè)體/或患者，用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在本說明書中，使用的“癌癥”是指原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥。這些患者可能此前接受過或未接受過癌癥治療。本發(fā)明的方法和組合物被用作任何線的癌癥治療，例如一線、二線或三線癌癥治療。本發(fā)明還包括對(duì)正在接受其它癌癥治療的患者進(jìn)行治療，且本發(fā)明的方法和組合物可在這些其它癌癥治療出現(xiàn)任何副作用或不耐受性之前使用。本發(fā)明還包括用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥，以治療或改善難以治療的患者的癥狀的方法。在某些實(shí)施方案中，癌癥是療法難以治療的是指癌細(xì)胞的至少一些顯著部分沒有被殺死或它們的細(xì)胞分裂沒有被停止。可以通過本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)治療對(duì)癌細(xì)胞的有效性的任何技術(shù)，在體內(nèi)或體外確定癌細(xì)胞是否是“沒有應(yīng)答的/難以治療的”，在這些上下文中使用本領(lǐng)域接受的“難以治療的”的含義。在各種實(shí)施方案中，癌癥是難以治療的，其中的癌細(xì)胞數(shù)目沒有顯著的減少或有所增加。本發(fā)明還包括用一種或多種基于李斯特菌EphA2疫苗給藥以預(yù)防易于患癌癥的患者體內(nèi)癌癥的發(fā)作或復(fù)發(fā)的方法。在特定實(shí)施方案中，用本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥以逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)某些激素、放射和化療試劑的抗性或降低的敏感性，由此使得癌細(xì)胞對(duì)一種或多種這些試劑重新敏感，隨后可以給予(或繼續(xù)給予)這些試劑以治療或控制癌癥，包括預(yù)防轉(zhuǎn)移。在特定實(shí)施方案中，以本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗向細(xì)胞因子IL-6水平增高的患者給藥，該因子與癌細(xì)胞對(duì)不同治療方案(如化療和激素治療)的抗性的生成有關(guān)。在另一實(shí)施方案中，以本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗向患有乳腺癌的患者給藥，這些患者對(duì)它莫西芬治療具有降低的應(yīng)答性或是難以治療的。在另一特定實(shí)施方案中，以本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗向細(xì)胞因子IL-6水平增高的患者給藥，該因子與癌細(xì)胞對(duì)不同治療方案(如化療和激素治療)的抗性的生成有關(guān)。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或控制患者癌癥的方法，包括向患者以本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗和任何其它治療組合給藥，或向已證實(shí)是其它療法難以治療的并不再進(jìn)行這種療法的患者給藥。在某些實(shí)施方案中，由本發(fā)明的方法治療的患者是接受過化療、放射治療、激素治療或生物學(xué)治療/免疫治療的患者。這些患者包括用現(xiàn)有的癌癥治療難以治療的患者，和接受了該現(xiàn)有的治療但是仍患有癌癥的患者。在其它實(shí)施方案中，患者已被治療且沒有疾病活性，用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥來預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述現(xiàn)有的治療是化療。在特定實(shí)施方案中，該現(xiàn)有的治療包括給于化學(xué)治療，包括但不限于甲氨蝶呤、紫杉醇、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、羥基脲、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、亞硝脲、順鉑、卡鉑、絲裂霉素、達(dá)卡巴嗪、procarbizine、依托泊甙、campathecins、博來霉素、阿霉素、伊達(dá)比星、道諾霉素、更生霉素、普卡霉素、米托蒽醌、天冬酰胺酶、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇等。這些患者包括接受過放療、激素治療、和/或生物學(xué)治療/免疫治療的患者。這些患者還包括為治療或控制癌癥已經(jīng)接受手術(shù)的患者?？蛇x擇地，本發(fā)明還包括治療或控制正在接受或接受過放療的患者的方法。這些患者包括正在接受或此前接受過化療、激素治療和/或生物學(xué)治療/免疫治療的患者。這些患者還包括為了治療癌癥接受過手術(shù)的患者。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療正在接受或接受過激素治療和/或生物學(xué)治療/免疫治療的患者的方法。這些患者包括正在接受或接受過化療和/或放療的治療的患者。這些患者還包括為了治療癌癥接受過手術(shù)的患者。此外，當(dāng)化療、放療、激素治療、和/或生物學(xué)治療/免疫治療被證實(shí)或可能證明毒性過大，即對(duì)正在接受治療的個(gè)體造成了不能接受或無法忍受的副作用時(shí)，本發(fā)明還提供了治療或控制癌癥的這些治療的替換方法。正在接受本發(fā)明的方法治療的個(gè)體可以選擇性地接受其它癌癥治療，例如手術(shù)、化療、放療、激素治療或生物學(xué)治療，這依賴于何種治療是無法接受或無法忍受的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥來治療癌癥，而不需要其它癌癥治療，該癌癥已證實(shí)是這些療法難以治療的。在特定實(shí)施方案中，在缺乏癌癥治療的情況下，用一種或多種EphA2疫苗向用其它癌癥療法難以治療的患者給藥。在其它實(shí)施方案中，可以向患有與過量EphA2表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的癌前期癥狀的患者用本發(fā)明的疫苗給藥，以治療病癥并降低其發(fā)展為惡性癌癥的可能性。在特定實(shí)施方案中，癌前期癥狀是高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)、乳腺纖維瘤、乳腺囊腫病、或復(fù)合型痣。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或控制除癌癥以外的過量增殖細(xì)胞病癥的方法，特別是與EphA2過量表達(dá)有關(guān)的病癥，包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、纖維化(例如肺、腎、心臟和肝纖維化)、再狹窄(平滑肌和/或內(nèi)皮)、牛皮癬等。這些方法包括與上文所述的用于治療、預(yù)防和控制癌癥的方法相似的方法，例如通過本發(fā)明的EphA2疫苗給藥，組合治療(參見，例如下文5.4.3.部分，例如將其它治療與EphA2疫苗組合給于個(gè)體，來治療、預(yù)防或控制除癌癥以外的過量增殖性病癥)，向用特定治療難以治療的患者給藥等。5.4.1.2.癌癥可以由本發(fā)明的方法和組合物治療、預(yù)防或控制的癌癥及相關(guān)病癥包括但不限于上皮細(xì)胞源和/或內(nèi)皮源的癌癥。這些癌癥的例子包括白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓細(xì)胞白血病例如成髓細(xì)胞、前髓細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅血球白血病以及骨髓發(fā)育不良綜合癥；慢性白血病例如但不限于慢性骨髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血??；真性紅細(xì)胞增多癥；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多發(fā)性骨髓瘤，例如但不限于郁積多發(fā)性骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、硬化性骨髓瘤、血漿細(xì)胞白血病、單一性漿細(xì)胞瘤和髓外漿細(xì)胞瘤；巨球蛋白血癥；意義未定的單克隆丙種球蛋白?。涣夹詥慰寺”N球蛋白??；重鏈疾??；骨和結(jié)締組織肉瘤，例如但不限于骨瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、Ewing’s瘤、惡性巨細(xì)胞瘤、骨纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；腦瘤，例如但不限于神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星細(xì)胞瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室鼓膜瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、非膠質(zhì)瘤、聽神經(jīng)瘤、顱咽管瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、松果體細(xì)胞瘤、松果體母細(xì)胞瘤、原發(fā)腦淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于導(dǎo)管癌、腺癌、小葉(小細(xì)胞)癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、髓樣乳腺癌、粘液乳腺癌、管狀乳腺癌、乳頭狀乳腺癌、Paget’s病、以及炎癥乳腺癌；腎上腺癌，例如但不限于嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌，例如但不限于乳頭狀或?yàn)V泡狀甲狀腺癌、髓樣甲狀腺癌和未分化甲狀腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰島瘤、促胃液素瘤、增血糖素瘤、血管活性腸肽瘤、生長激素釋放抑制素分泌瘤和類癌或島細(xì)胞瘤；垂體癌，例如但不限于庫欣氏病、泌乳激素瘤、肢端肥大癥和尿崩癥；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脈絡(luò)膜黑素瘤和睫狀體黑素瘤和眼癌；陰道癌，例如鱗片狀細(xì)胞癌、腺癌和黑素瘤；外陰癌，例如鱗片狀細(xì)胞癌、黑素瘤、腺癌、基底細(xì)胞癌、肉瘤和Paget’s?。蛔訉m頸癌，例如但不限于鱗片狀細(xì)胞癌和腺癌；子宮癌，例如但不限于子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界性腫瘤、生殖細(xì)胞瘤和基質(zhì)瘤；食道癌，例如但不限于鱗片狀癌、腺癌、腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌、腺鱗狀癌、肉瘤、黑素瘤、漿細(xì)胞瘤、疣狀癌、燕麥細(xì)胞(小細(xì)胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈傘(息肉)、潰瘍、表面擴(kuò)散、廣泛擴(kuò)散、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤以及癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌，例如但不限于肝細(xì)胞癌和肝母細(xì)胞癌；膽囊癌，例如腺癌；膽管癌，例如但不限于乳頭狀、結(jié)狀和彌散狀癌；肺癌，例如非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌(表皮狀癌)、腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌；睪丸癌，例如但不限于生殖細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，未分化的、經(jīng)典的(典型的)、精母細(xì)胞型、非精原細(xì)胞瘤，胚胎癌，畸胎瘤癌，絨膜癌(卵黃囊腫瘤)；前列腺癌例如但不限于前列腺上皮內(nèi)瘤、腺癌、平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤；penal癌；口腔癌，例如但不限于鱗片狀細(xì)胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮樣癌和腺樣囊性癌；喉癌，例如但不限于鱗片狀細(xì)胞癌和疣狀癌；皮膚癌，例如但不限于基底細(xì)胞癌、鱗片狀細(xì)胞癌和黑素瘤，表面擴(kuò)展黑素瘤、節(jié)結(jié)型黑素瘤、雀斑惡性黑素瘤、肢端黑痣黑素瘤；腎癌，例如但不限于腎細(xì)胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細(xì)胞癌(腎盂和/或uterer)；Wilms’腫瘤；膀胱癌，例如但不限于移行細(xì)胞癌、鱗片狀細(xì)胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌癥包括粘液肉瘤、骨肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴血管內(nèi)皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、間皮瘤、滑膜癌、成血管細(xì)胞瘤、上皮癌、囊腺瘤、支氣管癌、汗腺癌、脂肪腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(關(guān)于這些病癥的綜述，參見Fishman等，1985，Medicine，第二版，J.B.Lippincott公司，Philadelphia以及Murphy等，1997，InformedDecisionsTheCompleteBookofCancerDiagnosis，Treatment，andRecovery，VikingPenguin，PenguinBooksU.S.A.公司，美國)。本發(fā)明的方法和組合物還可用于治療或預(yù)防各種癌癥或其它異常增殖性疾病，包括但不限于癌，包括膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌和皮膚癌；鱗片狀細(xì)胞癌；淋巴系的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴白血病、急性成淋巴白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt’s淋巴瘤；脊髓系的腫瘤，包括急性和慢性骨髓白血病和成骨髓白血病；間葉細(xì)胞源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘膜瘤；間葉細(xì)胞源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它腫瘤，包括黑素瘤、色素性干皮病、keratoactanthoma、精原細(xì)胞瘤、甲狀腺濾泡狀癌和畸胎癌。預(yù)期由凋亡異常引起的癌癥也能由本發(fā)明的方法和組合物治療。這些癌癥可包括但不限于濾泡狀淋巴瘤，帶有p53突變的癌，乳腺、前列腺以及卵巢的激素依賴性腫瘤；癌前損傷，例如家族性腺瘤樣息肉病和骨髓發(fā)育不良綜合癥。在特定實(shí)施方案中，皮膚、肺、結(jié)腸、乳腺、前列腺、膀胱、腎、胰腺、卵巢或子宮的惡性或病態(tài)增殖變化(例如轉(zhuǎn)化和發(fā)育異常)、或過量增殖性病癥被治療或預(yù)防。在其它特定實(shí)施方案中，肉瘤、黑素瘤或白血病被治療或預(yù)防。在某些實(shí)施方案中，癌癥是惡性的且過量表達(dá)EphA2。在其它實(shí)施方案中，被治療的病癥是與過量EphA2表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的癌前期癥狀。在特定實(shí)施方案中，癌前期癥狀是高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)、乳腺纖維瘤、乳腺囊腫病或復(fù)合型痣。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物被用于治療和/或預(yù)防乳腺癌、卵巢癌、食道癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌以及黑素瘤且在下文非限制性地舉例提供。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物被用于治療和/或預(yù)防T細(xì)胞源的癌癥，包括但不限于白血病和淋巴瘤。5.4.1.3.乳腺癌的治療在特定實(shí)施方案中，向患有乳腺癌的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案種，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于治療乳腺癌的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于阿霉素，表阿霉素，阿霉素和環(huán)磷酰胺的組合(AC)，環(huán)磷酰胺、阿霉素和5-氟尿嘧啶的組合(CAF)，環(huán)磷酰胺、表阿霉素和5-氟尿嘧啶的組合(CEF)，her-2抗體例如赫賽汀、它莫西芬，它莫西芬和細(xì)胞毒性化療的組合，紫杉醇(例如多烯紫杉醇和太平洋紫杉醇)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可與紫杉醇外加標(biāo)準(zhǔn)阿霉素和環(huán)磷酰胺一同給藥作為結(jié)節(jié)陽性、局部乳腺癌的輔助治療。在特定實(shí)施方案中，用本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗向患有癌前乳腺纖維瘤或乳腺囊腫病的患者給藥，以治療病癥和降低其發(fā)展成惡性乳腺癌的可能性。在另一特定實(shí)施方案中，用本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗向用治療，特別是激素治療，更具體地是它莫西芬治療，難以治療的患者給藥，以治療癌癥和/或使患者成為可治療的或應(yīng)答的。5.4.1.4.結(jié)腸癌的治療在特定實(shí)施方案中，向患有結(jié)腸癌的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于治療結(jié)腸癌的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于AVASTINIM(貝伐單抗)，5-FU和甲酰四氫葉酸的組合，5-FU和左旋咪唑的組合，伊立替康(CPT-11)，或伊立替康、5-FU和甲酰四氫葉酸的組合(IFL)。5.4.1.5.前列腺癌的治療在特定實(shí)施方案中，向患有前列腺癌的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案種，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于治療前列腺癌的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于外照放療，放射性同位素(即125I、鈀、銥)的腔內(nèi)移植，亮丙瑞林或其它LHRH激動(dòng)劑，非類固醇抗雄性激素劑(氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺)，類固醇抗雄性激素劑(醋酸環(huán)丙孕酮)，亮丙瑞林和氟他胺的組合，雌激素例如DES、氯烯雌醚、乙炔基雌二醇、偶聯(lián)的雌激素U.S.P.、DES-二磷酸、放射性同位素例如鍶89、外照放療和鍶89的組合、二線激素治療如氨苯哌酮、氫化可的松、氟他胺戒斷、孕酮和酮康唑、低劑量強(qiáng)的松、或其它報(bào)道的會(huì)使癥狀得到主觀改善和PSA水平得到降低的化療方案，包括多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、雌莫司汀/多烯紫杉醇、雌莫司汀/依托泊甙、雌莫司汀/長春堿和雌莫司汀/太平洋紫杉醇。在特定實(shí)施方案中，向患有癌前高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤的患者用本發(fā)明的EphA2疫苗給藥，以治療病癥并降低其將發(fā)展成惡性前列腺癌的可能性。5.4.1.6.黑素瘤的治療在特定實(shí)施方案中，向患有黑素瘤的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案種，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于治療黑素瘤的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于達(dá)卡巴嗪(DTIC)，亞硝脲如卡氯芥(BCNU)和環(huán)磷氮芥(CCNU)，具有中度單試劑活性的試劑包括長春花生物堿、鉑化合物和紫杉醇，Dartmouth方案(順鉑、BCNU和DTIC)、干擾素α(IFN-α)和白介素2(IL-2)。在特定實(shí)施方案中，有效量的本發(fā)明的一種或多種EphA2疫苗可以與隔離高溫肢體灌注(ILP)、美法侖(L-PAM)及有或沒有腫瘤壞死因子α(TNF-α)一起組合給于患有多發(fā)性腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移和脊椎壓迫的患者，以使癥狀減輕并在一定程度上用放療使腫瘤萎縮。在特定實(shí)施方案種，用本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗向患有癌前復(fù)合型痣的患者給藥，以治療病癥并降低其發(fā)展成惡性黑素瘤的可能性。5.4.1.7.卵巢癌的治療在特定實(shí)施方案中，向患有卵巢癌的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案種，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于治療卵巢癌的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于腹腔內(nèi)放療如P32治療，全腹部和骨盆放療，順鉑，太平洋紫杉醇(紫杉醇)或多烯紫杉醇(泰素帝)和順鉑或卡鉑的組合，環(huán)磷酰胺和順鉑的組合，環(huán)磷酰胺和卡鉑的組合，5-FU和甲酰四氫葉酸的組合，依托泊甙、脂質(zhì)體阿霉素，吉西他汀或拓?fù)涮婵?。預(yù)期用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與紫杉醇組合給予患有鉑難以治療的疾病的患者。對(duì)患有難以治療的卵巢癌的患者的治療包括向患有鉑難以治療的疾病的患者用異環(huán)磷酰胺給藥，在基于鉑的組合方案失敗后用六甲密胺(HMM)給藥作為補(bǔ)救性化療，以及向在其腫瘤上具有可檢測(cè)水平的胞質(zhì)雌激素受體的患者用它莫西芬給藥。5.4.1.8.肺癌的治療在特定實(shí)施方案中，向患有小肺細(xì)胞癌的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于肺癌治療的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于單獨(dú)或組合的胸部放療、順鉑、長春新堿、阿霉素和依托泊甙，環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿/依托泊甙和順鉑的組合(CAV/EP)、支氣管內(nèi)激光治療的局部緩解、支氣管內(nèi)支架和/或短程治療。在其它實(shí)施方案中，向患有非小肺細(xì)胞癌的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與有效量的一種或多種用于肺癌治療的其它試劑組合給藥，該試劑包括但不限于緩解性放療，順鉑、長春堿和絲裂霉素的組合，順鉑和長春瑞濱的組合，太平洋紫杉醇，多烯紫杉醇或吉西他汀，卡鉑和太平洋紫杉醇的組合，對(duì)支氣管內(nèi)損傷的間質(zhì)放療或立體定位放射手術(shù)。5.4.1.9.T細(xì)胞惡性腫瘤的治療在特定實(shí)施方案中，向患有T細(xì)胞惡性腫瘤，如白血病和淋巴瘤(參見例如5.8.1.1.部分)的患者用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。在另一實(shí)施方案種，本發(fā)明的肽可以與有效量的一種或多種用于預(yù)防、治療或改善癌癥(特別是T細(xì)胞惡性腫瘤或其一種或多種癥狀)的其它試劑組合給藥，所述組合治療包括向需要的個(gè)體給予預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗，和預(yù)防或治療有效量的一種或多種癌癥治療，該癌癥治療包括化療、激素治療、生物學(xué)治療、免疫治療或放療。在另一實(shí)施方案中，用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與一種或多種癌癥化療試劑向患有T細(xì)胞惡性的患者組合給藥，該試劑包括但不限于阿霉素、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇如多烯紫杉醇和太平洋紫杉醇、甲酰四氫葉酸、左旋咪唑、伊立替康、雌莫司汀、依托泊甙、長春堿、達(dá)卡巴嗪、亞硝脲如卡氯芥和環(huán)磷氮芥、長春花生物堿、鉑化合物、順鉑、絲裂霉素、長春瑞濱、吉西他汀、卡鉑、六甲密胺和/或拓?fù)涮婵?。這些方法任選地進(jìn)一步包含給予其它癌癥治療，例如但不限于放療、生物學(xué)治療、激素治療和/或手術(shù)。在另一實(shí)施方案中，用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與一種或多種類型的放療，向患有T細(xì)胞惡性腫瘤的患者組合給藥，放療例如外照放療、間質(zhì)移植(I-125、鉑、銥)、放射性同位素如鍶-89、胸部放療、腹腔P-32放療、和/或全腹部和骨盆放療。這些方法任選地進(jìn)一步包含給予其它癌癥治療，例如但不限于化療、生物學(xué)治療/免疫治療、激素治療和/或手術(shù)。在另一實(shí)施方案中，用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與一種或多種用于生物學(xué)治療/免疫治療或激素治療，向患有T細(xì)胞惡性的患者組合給藥，所述治療例如它莫西芬，亮丙瑞林或其它LHRH激動(dòng)劑、非類固醇類抗雄性激素(氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺)、類固醇類抗雄性激素(醋酸環(huán)丙孕酮)、雌激素(DES)、氯烯雌醚、乙炔基雌二醇、偶聯(lián)的雌激素U.S.P.、DES-二磷酸、氨苯哌酮、氫化可的松、氟他胺戒斷、孕酮、酮康唑、強(qiáng)的松、干擾素α、白介素2、腫瘤壞死因子α和/或美法侖。生物學(xué)治療也可以包括細(xì)胞因子，例如但不限于TNF配體家族成員，例如誘導(dǎo)凋亡的TRAIL抗癌激動(dòng)劑、與也稱作DR4和DR5(死亡結(jié)構(gòu)域包含受體4和5)的TRAIL受體1和2結(jié)合的TRAIL抗體以及DR4和DR5。TRAIL和TRAIL抗體、配體和受體是本領(lǐng)域已知的，且在美國專利號(hào)6,342,363、6,284,236、6,072,047和5,763,223中有說明。這些方法任選地進(jìn)一步包含給予其它癌癥治療，例如但不限于放療、化療和/或手術(shù)。在另一特定實(shí)施方案中，用有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗與T細(xì)胞惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)治療，向患有T細(xì)胞惡性腫瘤的患者組合給藥。可用于本發(fā)明的方法和組合物的T細(xì)胞惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)治療包括但不限于抗體治療(例如Campath、抗Tac、HuM291(抗CD3的人源化小鼠IgG2單克隆抗體)、抗體藥物偶聯(lián)物(例如吉妥單抗)、放射性標(biāo)記的單克隆抗體(例如Bexxar、擇娃靈、Lym-1))、細(xì)胞因子治療、使用或不使用細(xì)胞毒性試劑的進(jìn)攻性組合化療、嘌呤類似物、造血干細(xì)胞移植以及T細(xì)胞介導(dǎo)治療(例如具有對(duì)抗靶抗原的抗白血病活性的CD8+T細(xì)胞，包括但不限于白血病特異性蛋白(例如bcr/abl、PML/RARa、EMV/AML-1)、白血病相關(guān)蛋白(例如蛋白酶3、WT-1、h-TERT、hdm-2))。(見Riddell等，2002，CancerControl，9(2)114-122；Dearden等，2002，MedicalOncology，19，Suppl.S27-32；Waldmann等，2000，Hematology(AmSocHematolEducProgram)394-408)。5.4.2.與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的治療或預(yù)防EphA2是血管發(fā)生的血管的標(biāo)記，且在血管發(fā)生或新血管形成中發(fā)揮重要作用(見例如Ogawa等，2000，Oncogene.19(52)6043-52；Hess等，2001，CancerRes.61(8)3250-5)。血管發(fā)生的特征為平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞入侵、遷移和增殖。新血管的生長或血管發(fā)生導(dǎo)致病理狀態(tài)，例如糖尿病視網(wǎng)膜病變(Adonis等，1994，Amer.J.Ophthal.，118445)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Peacock等，1992，J.Exp.Med.，1751135)和骨關(guān)節(jié)炎(Ondrick等，1992，Clin.-Podiatr.-Med.-Surg.9185)。因此本發(fā)明的基于李斯特菌的組合物可給予有此需要的個(gè)體以預(yù)防、控制、治療或改善與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥或它的一種或多種癥狀。與異常血管發(fā)生有關(guān)或以其為特征的，并且可用本發(fā)明的基于李斯特菌的組合物來預(yù)防、治療、控制或改善的病癥包括但不限于腫瘤疾病(非限制性例子是腫瘤的轉(zhuǎn)移和白血病)；眼部新生血管化的疾病(非限制性例子是年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、血管再狹窄)；皮膚病(非限制性例子是嬰兒血管瘤、尋常疣、牛皮癬、基底細(xì)胞和鱗片狀細(xì)胞癌、皮膚黑素瘤、卡波西氏肉瘤、神經(jīng)線纖維瘤、隱性萎縮型水泡上皮解離癥)；關(guān)節(jié)炎(非限制性例子是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、系統(tǒng)性狼瘡、干癬性關(guān)節(jié)病變、萊特氏癥候群和舍格倫氏癥候群)；婦科病(非限制性例子是子宮內(nèi)膜異位、孕期子癇前癥、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌)；和心血管疾病(非限制性例子是動(dòng)脈粥樣硬化斑的形成、動(dòng)脈硬化癥和冠狀動(dòng)脈疾病)。在特定實(shí)施方案中，與異常血管發(fā)生有關(guān)或以其為特征的，并且可用本發(fā)明的基于李斯特菌的組合物來預(yù)防、治療、控制或改善的病癥包括慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管青光眼、黃斑變性、動(dòng)脈粥樣硬化斑中的毛細(xì)血管增殖以及癌癥，其中EphA2在脈管系統(tǒng)中表達(dá)。這些癌癥病癥包括例如實(shí)體瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管纖維瘤、晶狀體后纖維膜增生、血管瘤、卡波西氏肉瘤。在某些實(shí)施方案中，將基于李斯特菌的組合物用于包含其它治療的組合治療方案中。這些治療的非限制性例子包括止痛劑、血管發(fā)生抑制劑、抗癌治療和抗炎性試劑，特別是止痛劑和血管發(fā)生抑制劑。5.4.2.1.患者群本發(fā)明包括治療、控制和/或預(yù)防個(gè)體中與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥或其癥狀的方法，該方法包括用一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。本發(fā)明的方法包括向患有或可能將患有(例如具有遺傳傾向的患者或此前患過的患者)與異常血管發(fā)生有關(guān)的疾病的患者用一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥。這樣的患者可能此前接受過治療或目前正在接受該病癥的治療。根據(jù)本發(fā)明，基于李斯特菌的EphA2疫苗可用作任何一線的治療，包括但不限于一線、二線、三線和四線的治療。此外，根據(jù)本發(fā)明，基于李斯特菌的EphA2疫苗可在該基于李斯特菌的EphA2疫苗的任何副作用或非耐受性發(fā)生之前使用。本發(fā)明包括用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥以預(yù)防與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的發(fā)作或復(fù)發(fā)的方法。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了治療或控制與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的現(xiàn)有治療的替代方法。在特定實(shí)施方案中，現(xiàn)有治療已證實(shí)或可能證實(shí)對(duì)患者毒性過大(例如造成不可接受或無法忍受的副作用)。在另一實(shí)施方案中，患者已證實(shí)是現(xiàn)有療法難以治療的。在這種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥來治療或控制與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥，而不需要其它治療。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗可以取代其它治療對(duì)需要的患者給藥以治療或控制與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥。本發(fā)明還包括用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥來治療或改善患者與血管發(fā)生相關(guān)的疾病的癥狀的方法，這些患者是或已經(jīng)成為用非基于李斯特菌的EphA2疫苗療法難以治療的患者。確定癥狀是否難以治療可以在體內(nèi)或體外用本領(lǐng)域已知任何技術(shù)來完成，這些技術(shù)可分析治療對(duì)于病癥或患者中的受影響細(xì)胞的有效性，該病癥與異常血管發(fā)生有關(guān)，該患者是或已經(jīng)成為非基于李斯特菌的EphA2疫苗療法難以治療的。5.4.3.其它治療在一些實(shí)施方案中，將用一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥的治療與一種或多種治療組合，該治療包括但不限于化療、放療、激素治療和/或生物學(xué)治療。預(yù)防/治療性試劑包括但不限于蛋白質(zhì)分子，包括但不限于肽，多肽，蛋白質(zhì)，包括但不限于翻譯后修飾后的蛋白、肽等；或小分子(小于1000道爾頓)、無機(jī)或有機(jī)化合物；或核酸分子包括但不限于雙鏈或單鏈DNA、或雙鏈或單鏈RNA、以及三螺旋核酸分子。預(yù)防/治療性試劑可以衍生自任何已知的生物(包括但不限于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、和原生生物或病毒)或衍生自合成分子的文庫。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗與一種或多種預(yù)防/治療性試劑的給藥組合給藥，該試劑包括抗體，其是激酶的抑制劑，激酶例如但不限于ABL、ACK、AFK、AKT(例如AKT-1、AKT-2和AKT-3)、ALK、AMP-PK、ATM、Aurora1、Aurora2、bARK1、bArk2、BLK、BMX、BTK、CAK、CaM激酶、CDC2、CDK、CK、COT、CTD、DNA-PK、EGF-R、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ERK(例如ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7)、ERT-PK、FAK、FGR(例如FGF1R、FGF2R)、FLT(例如FLT-1、FLT-2、FLT-3、FLT-4)、FRK、FYN、GSK(例如GSK1、GSK2、GSK3-α、GSK3-β、GSK4、GSK5)、G-蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK)、HCK、HER2、HKII、JAK(例如JAK1、JAK2、JAK3、JAK4)、JNK(例如JNK1、JNK2、JNK3)、KDR、KIT、IGF-1受體、IKK-1、IKK-2、INSR(胰島素受體)、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOK、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、MHCK、MLCK、MLK3、NEU、NIK、PDGF受體α、PDGF受體β、PHK、PI-3激酶、PKA、PKB、PKC、PKG、PYK1、PYK2、p38激酶、p135tyk2、p34cdc2、p42cdc2、p42mapk、p44mpk、RAF、RET、RIP、RIP-2、RK、RON、RS激酶、SRC、SYK、S6K、TAK1-TEC、TIE1、TIE2、TRKA、TXK、TYK2、UL13、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70，和這些激酶的所有亞型(見例如Hardie和Hanks(1995)TheProteinKinaseFactsBookI和II，Academic出版社，SanDiego，Calif.)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗與一種或多種試劑的給藥組合給藥，該試劑是Eph受體激酶(例如EphA2、EphA4)的抑制劑。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的EphA2疫苗與一種或多種預(yù)防/治療性試劑的給藥組合給藥，該試劑是EphA2的抑制劑。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將用本發(fā)明的EphA2疫苗給藥與用一種或多種治療性抗體給藥組合?？杀挥糜诒景l(fā)明的方法的治療性抗體的例子包括但不限于AVASTIN，其是抗VEGF抗體；與EphA2免疫特異性結(jié)合誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體(即EphA2激動(dòng)性抗體)；與EphrinA1免疫特異性結(jié)合的抗體；HERCEPTIN(曲妥珠單抗)(Genentech，CA)，其是治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者的人源化抗HER2單克隆抗體；REOPRO(阿昔單抗)(Centocor)，其是防止凝塊形成的血小板上抗糖蛋白受體；ZENAPAX(達(dá)利珠單抗)(RochePharmaceuticals，瑞士)，其是預(yù)防急性腎異源移植排斥的免疫抑制性人源化抗CD25單克隆抗體；PANOREXTM，其是小鼠抗17-IA細(xì)胞表面抗原IgG2a抗體(GlaxoWellcome/Centocor)；BEC2，其是小鼠抗獨(dú)特型(GD3抗原決定簇)IgG抗體(ImCloneSystem)；IMC-C225，其是嵌合抗EGFRIgG抗體(ImCloneSystem)；VITAXINTM，其是人源化抗αvβ3整合素抗體(AppliedMolecularEvolution/MedImmune)；Campath1H/LDP-03，其是人源化的抗CD52IgG1抗體(Leukosite)；SmartM195，其是人源化的抗CD33IgG抗體(ProteinDesignLab/Kanebo)；RITUXANTM，其是嵌合抗CD20IgG1抗體(IDECPharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，其是人源化的抗CD22IgG抗體(Immunomedics)；LYMPHOCIDETMY-90(Immunomedics)；Lymphoscan(Tc-99m-標(biāo)記的，放射成像的；Immunomedics)；Nuvion(抗CD3；ProteinDesignLabs)；CM3，其是人源化抗ICAM3抗體(ICOSPharm)；IDEC-114，其是靈長化抗CD80抗體(IDECPharm/Mitsubishi)；ZEVALINTM，其是放射標(biāo)記的小鼠抗CD20抗體(IDEC/ScheringAG)；IDEC-131，其是人源化抗CD40L抗體(IDEC/Eisai)；IDEC-151，其是靈長化抗CD4抗體(IDEC)；IDEC-152，其是靈長化抗CD23抗體(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3，其是人源化抗CD3IgG(ProteinDesignLab)；5G1.1，其是人源化抗補(bǔ)體因子5(C5)抗體(AlexionPharm)；D2E7，其是人源化抗TNFα抗體(CAT/BASF)；CDP870，其是人源化抗TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151，其是靈長化抗CD4IgG1抗體(IDECPharm/SmithKlineBeecham)；MDX-CD4，其是人抗CD4IgG抗體(Medarex/Eisai/Genmab)；CD20-鏈霉抗生物素(+生物素-釔90；NeoRx)；CDP571，其是人源化抗TNF-αIgG4抗體(Celltech)；LDP-02，其是人源化抗αvβ7抗體(LeikoSite/Genentech)；OrthoCloneOKT4A，其是人源化抗CD4IgG抗體(OrthoBiotech)；ANTOVATM，其是人源化抗CD40LIgG抗體(Biogen)；ANTEGRENTM，其是人源化抗VLA-4IgG抗體(Elan)；以及CAT-152，其是人抗TGF-β2抗體(CambridgeAbTech)。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將用本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥與用一種或多種預(yù)防/治療性試劑給藥組合，該試劑是血管發(fā)生抑制劑，例如但不限于血管抑素(纖溶酶原片段)；抗血管發(fā)生抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay12-9566；氟草胺；貝伐單抗(AVASTINTM)；BMS-275291；軟骨衍生抑制劑(CDI)；CAI；CD59補(bǔ)體片段；CEP-7055；Col3；風(fēng)車子抑堿A-4；內(nèi)皮抑素(膠原XVIII片段)；纖連蛋白片斷；Gro-β；鹵夫酮；肝素酶；肝素六糖片段；HMV833；人絨毛促性腺激素(hCG)；IM-862；干擾素α/β/γ；干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle5(纖溶酶原片段)；馬粒馬司他；金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)；2-甲氧雌二醇；MMI270(CGS27023A)；MoAbIMC-1C11；鯊癌靈；NM-3；Panzem；PI-88；胎盤核糖核酸酶抑制劑；纖溶酶原激活劑的抑制劑；血小板因子-4(PF4)；普利司他(Prinomastat)；泌乳刺激素16kD片段；多育曲霉素相關(guān)蛋白(PRP)；PTK787/ZK222594；類維生素A；Solimastat；角鯊胺；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；四氫化可的松S；四巰基鉬酸鹽；薩利多胺；凝血栓蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；轉(zhuǎn)化生長因子-β；血管抑制素；血管抑制因子(鈣網(wǎng)蛋白片段)；ZD6126；ZD6474；法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)；和雙磷酸鹽。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含將用本發(fā)明的EphA2給藥與用一種或多種抗癌試劑給藥組合，該試劑例如但不限于阿西維新、阿柔比星、鹽酸阿考達(dá)唑、阿克羅寧、阿多來新、阿地白介素、六甲密胺、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、氨苯哌酮、安吖啶、阿納曲唑、安曲霉素、天冬酰胺酶、林曲霉素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴馬司他、苯佐替派、比卡魯胺、鹽酸比生群、二甲磺酸雙萘法德、比折來新、博來霉素硫酸鹽、布喹那鈉鹽、溴匹立明、白消安、放線菌素C、卡普睪酮、卡醋胺、卡貝替姆、卡鉑、卡氯芥、鹽酸卡柔比星、卡折來星、西地芬伐、苯丁酸氮芥、西羅霉素、順鉑、克拉屈濱、甲磺酸crisnatol、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、鹽酸道諾霉素、達(dá)卡巴嗪、地西他濱、右奧馬鉑、地扎胍寧、甲磺酸地扎胍寧、地吖醌、多烯紫杉醇、阿霉素、鹽酸阿霉素、屈洛昔芬、檸檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、偶氮霉素、依達(dá)曲沙、鹽酸依氟鳥氨酸、依沙蘆星、恩洛鉑、恩普胺酯、可溶EphrinA1、EphrinA1-Fc多肽、EphA2-Fc多肽、EphA2反義、EphrinA1反義、依匹哌啶、鹽酸表阿霉素、厄布洛唑、鹽酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉、依他硝唑、依托泊甙、磷酸依托泊甙、etoprine、鹽酸法倔唑、氟達(dá)拉濱、芬維A胺、氮尿苷、磷酸氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、氟西他濱、磷喹酮、福司曲星鈉鹽、吉西他汀、鹽酸吉西他汀、羥基脲、鹽酸伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、依莫福新、白介素2(包括重組白介素2或rIL2)、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素α-n1、干擾素α-n3、干擾素β-Ia、干擾素γ-Ib、異丙鉑、鹽酸伊立替康、醋酸蘭瑞肽、來曲唑、醋酸亮丙瑞林、鹽酸利阿唑、洛美曲索鈉鹽、環(huán)磷氮芥、鹽酸洛索蒽醌、馬索羅酚、美登素、鹽酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美侖孕酮、美法侖、美諾立爾、巰嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤鈉鹽、metoprine、美妥替哌、米丁度胺、mitocarcin、mitocromin、米托潔林、米托馬星、絲裂霉素、米托司培、米托坦、鹽酸米托蒽醌、麥考酚酸、亞硝脲、諾考達(dá)唑、諾拉霉素、奧馬鉑、奧昔舒侖、太平洋紫杉醇、培門冬酶、培利霉素、萘莫司汀、培洛霉素硫酸鹽、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、鹽酸吡羅蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆鈉、紫菜霉素、潑尼莫司汀、鹽酸甲芐肼、嘌羅霉素、鹽酸嘌羅霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、羅谷亞胺、沙芬戈、鹽酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、sparfosate鈉鹽、司帕霉素、鹽酸鍺螺胺、螺莫司汀、螺鉑、鏈黑霉素、鏈脲菌素、磺氯苯脲、他利霉素、tecogalan鈉鹽、替加氟、鹽酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替羅昔隆、睪內(nèi)酪、thiamiprine、硫鳥嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、檸檬酸托瑞米芬、曲妥珠單抗(HERCEPTINTM)、醋酸曲托龍、磷酸曲西立濱、三甲曲沙、三甲曲沙葡糖醛酸脂、曲普瑞林、鹽酸妥布氯唑、烏拉莫司汀、烏瑞替派、伐普肽、維替泊芬、長春堿硫酸鹽、長春新堿硫酸鹽、長春地辛、長春地辛硫酸鹽、長春匹定硫酸鹽、長春甘酯硫酸鹽、長春羅新硫酸鹽、長春瑞濱酒石酸鹽、長春羅定硫酸鹽、長春利定硫酸鹽、呋氯唑、折尼鉑、凈司他丁、鹽酸佐柔比星。其它抗癌藥包括但不限于20-表-1，25-二羥基維生素D3、5-乙炔尿嘧啶、阿比特龍、阿柔比星、?；幌?、adecypenol、阿多來新、阿地白介素、ALL-TK拮抗劑、六甲密胺、氨莫司汀、amidox、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、穿心蓮內(nèi)酯、血管發(fā)生抑制劑、拮抗劑D、拮抗劑G、antarelix、抗背部形態(tài)發(fā)生蛋白-1、抗雄性激素劑、抗雌激素劑、抗腫瘤物質(zhì)、甘氨酸蚜腸霉素、凋亡基因調(diào)節(jié)劑、凋亡調(diào)節(jié)劑、脫嘌呤核酸、阿-CDP-DL-PTBA、精氨酸脫氨酶、asulacrine、阿他美坦、阿莫司汀、axinastatin1、axinastatin2、axinastatin3、阿扎司瓊、重氮毒素(azatoxin)、重氮酪氨酸、巴卡丁III衍生物、balanol、巴馬司他、BCR/ABL拮抗物、苯并二氫卟酚(benzochlorins)、benzoylstaurosprine、β內(nèi)酰胺衍生物、β-alethine、betaclamycinB、白樺酯酸、bFGF抑制劑、比卡魯胺、比生群、bisaziridinylspemine、雙奈法德、bistrateneA、比折來新、breflate、溴匹立明、布度鈦、丁基硫堇亞胺、鈣泊三醇、calphostinC、喜樹堿衍生物、金絲雀痘IL-2、卡培他濱、甲酰胺-氨基-三唑、甲酰胺三唑、CaRestM3、CARN700、軟骨衍生抑制劑、卡折來新、酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)、粟精胺、cecropinB、西曲瑞克、氯喹喔啉磺胺類藥物、西卡前列素、順式-卟啉、克拉屈濱、氯米芬類似物、克霉唑、collismycinA、collismycinB、風(fēng)車子抑堿A4、風(fēng)車子抑堿類似物、conagenin、crambescidin816、crisnatol、念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)8、念珠藻環(huán)肽A衍生物、curacinA、環(huán)五蒽醌(cyclopentanthraquinones)、cycloplatam、cypemycin、阿糖胞嘧啶、細(xì)胞溶解因子、cytostatin、達(dá)昔單抗、地西他濱、脫氫膜海鞘素B、德舍瑞林、地塞米松、右異環(huán)磷酰胺、右雷佐生、右維拉帕米、地吖醌、膜海鞘素(didemnin)B、didox、diethylnorspermine、二氫-5-氮雜胞嘧啶核苷、二氫紫杉醇、dioxamycin、聯(lián)苯螺莫司汀、多烯紫杉醇、二十二烷醇、多拉司瓊、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酚、duocarmycinSA、依布硒、依考莫司汀、依地福新、依決洛單抗、依氟鳥氨酸、欖香烯、乙嘧替氟、表阿霉素、依立雄胺、雌莫司汀類似物、雌激素拮抗劑、雌激素拮抗物、依他硝唑、磷酸依托泊甙、依西美坦、法倔唑、法扎拉濱、芬維A胺、非格司亭、非那雄胺、flavopiridol、flezelastine、fluasterone、氟達(dá)拉濱、fluorodaunorunicin鹽酸、福酚美克、福美坦、福莫司汀、德卟啉釓、硝酸鎵、加洛他濱、加尼瑞克、白明膠酶抑制劑、吉西他汀、谷胱甘肽抑制劑、hepsulfam、heregulin、六亞甲基二乙酰胺、金絲桃素、伊班膦酸、伊達(dá)比星、艾多昔芬、伊決孟酮、伊莫福新、伊洛馬司他、咪唑基吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、類胰島素生長因子-1受體抑制劑、干擾素激動(dòng)劑、干擾素、白介素、碘芐胍、碘阿霉素、甘薯醇、伊羅普拉、伊索拉定、isobengazole、isohomohalicondrinB、伊他司瓊、jasplakinolide、kahalalideF、片螺素-N三醋酸、蘭瑞肽、leinamycin、來格司亭、香菇多糖硫酸鹽、leptolstatin、來曲唑、白血病抑制因子、白細(xì)胞α干擾素、亮丙瑞林+雌激素+孕酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、線性聚胺類似物、親脂性二糖肽、親脂性鉑化合物、lissoclinamide7、洛鉑、lombricine、洛美曲索、氯尼達(dá)明、洛索蒽醌、洛伐他汀、洛索立賓、勒托替康、德卟啉镥、lysofylline、細(xì)胞溶解肽、美坦辛、mannostatinA、馬立馬司他、馬索羅酚、maspin、基質(zhì)裂解素抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、美諾立爾、麥爾巴隆、meterelin、蛋氨酶、甲氧氯普胺、MIF抑制劑、米非司酮、米替福新、米立司亭、錯(cuò)配雙鏈RNA、米托胍腙、二溴衛(wèi)矛醇、絲裂霉素類似物、米托萘胺、絲裂毒素(mitotoxin)成纖維生長因子-肥皂草素、米托蒽醌、莫法羅汀、莫拉司亭、人絨毛膜促性腺激素、單磷酰脂A+結(jié)合菌細(xì)胞壁sk、莫哌達(dá)醇、多重抗藥性基因抑制劑、基于多重腫瘤抑制劑1的治療、芥菜抗癌試劑、印度洋海綿(mycaperoxide)B、結(jié)核菌細(xì)胞壁提取物、myriaporone、N-acetyldinaline、N-取代苯甲酰胺、那法瑞林、nagrestip、納洛酮+噴他佐辛、napavin、naphterpin、那托司亭、奈達(dá)鉑、奈莫柔比星、奈立膦酸、中性肽鏈內(nèi)切酶、尼魯米特、nisamycin、一氧化氮調(diào)節(jié)劑、硝基氧抗氧化劑、nitrullyn、O6-芐基鳥嘌呤、奧曲肽、okicenone、寡核苷酸、奧那司酮、昂丹司瓊、oracin、口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑、奧馬鉑、奧沙特隆、奧沙利鉑、oxaunomycin、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇類似物、太平洋紫杉醇衍生物、palauamine、palmitoylrhizoxin、帕米磷酸、人參炔三醇、帕諾米芬、副菌鐵素(parabactin)、帕折普汀、培門冬酶、peldesine、木聚硫鈉、噴司他丁、pentrozole、全氟溴烷、培磷酰胺、芥子醇、phenazinomycin、乙酸苯酯、磷脂酶抑制劑、溶鏈菌制劑、鹽酸毛果蕓香堿、吡柔比星、吡曲克辛、placetinA、placetinB、纖溶酶原激活劑抑制劑、鉑絡(luò)合物、鉑化合物、鉑-三胺絡(luò)合物、卟吩姆鈉、紫菜霉素、強(qiáng)的松、丙基雙吖啶酮、前列腺素J2、蛋白酶體抑制劑、基于蛋白質(zhì)A的免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白激酶C抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、微藻、蛋白酪氨酸磷脂酶抑制劑、嘌呤核苷抑制劑、紅紫素、吡佐吖啶(pyrazoloacridine)、pyridoxylated血紅蛋白聚氧乙烯偶聯(lián)物、raf拮抗劑、ralititrexd、雷莫司瓊、ras法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、ras抑制劑、ras-GAP抑制劑、去甲基化retelliptine、依替膦酸錸Re186、根霉菌素、核酸酵素、RII維胺脂、羅谷亞胺、rohitukine、羅莫肽、羅喹美克、rubiginoneB1、沙芬戈、saintopin、SarCNU、sarcophytolA、沙格司亭、Sdi1模擬物、司莫司汀、衰老衍生抑制劑1、感應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑、單鏈抗原結(jié)合蛋白、西佐喃、索布佐生、硼卡鈉、乙酸苯酯鈉、solverol、促生長因子結(jié)合蛋白、索納明、斯帕福斯酸、spicamycinD、螺莫司汀、splenopentin、海綿素(spongistatin)1、角鯊胺、干細(xì)胞抑制劑、干細(xì)胞分裂抑制劑、stipiamide、基質(zhì)裂解素抑制劑、超活性的血管活性腸肽拮抗物、suradista、蘇拉明、苦馬豆素、合成粘多糖、他莫司汀、它莫西芬methiodide、牛磺莫司汀、紫杉醇、他扎羅汀、tecogalan鈉鹽、替加氟、tellurapyrylium、端粒酶抑制劑、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、tetrachlorodecaoxide、tetrazomine、thaliblastine、沙利度胺、thiocoraline、硫鳥嘌呤、血小板生成素、血小板生成素模擬物、胸腺法新、促胸腺生成素受體激動(dòng)劑、胸腺托南、促甲狀腺激素、錫乙基初紫紅素、替拉扎明、二氯鈦烯、topsentin、托瑞米芬、全能干細(xì)胞因子、翻譯抑制劑、維甲酸、三乙?；蜍?、曲西立濱、三甲曲沙、曲普瑞林、曲匹西龍、妥羅雄脲、酪氨酸激酶抑制劑、酪氨酸磷酸化抑制劑、UBC抑制劑、烏苯美司、尿殖竇衍生生長抑制因子、尿激酶受體拮抗物、伐普肽、variolinB、載體系統(tǒng)、紅血球基因治療、維拉雷瑣、veramine、verdins、長春瑞濱、vinxaltine、vinxaltine、vitaxin、伏氯唑、扎諾特隆、折尼鉑、亞芐維C和凈司他丁斯酯。優(yōu)選的其它抗癌藥是5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸。在更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括將用本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗給藥與用一種或多種治療給藥組合，該治療例如但不限于例如在以下表5中公開的抗癌試劑，優(yōu)選地用于治療上文所述的乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌。表5本發(fā)明還包含將本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗與放療組合給予來破壞癌細(xì)胞，放療包括X射線、γ射線和其它放射源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，放療以外照放射或遠(yuǎn)距離放射進(jìn)行，其中放射線來自遠(yuǎn)處的放射源。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，放療以內(nèi)部治療或短距離治療給予，其中將放射活性源置于體內(nèi)接近癌細(xì)胞或腫瘤物質(zhì)的地方。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含將用本發(fā)明的EphA2疫苗給藥與用一種或多種抗炎性試劑給藥組合。任何抗炎性試劑，包括用于治療炎性病癥的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的試劑，都可用于本發(fā)明的組合物和方法?？寡仔栽噭┑姆窍拗菩岳影ǚ穷惞檀伎寡姿?NASID)、類固醇抗炎藥、抗膽堿藥(例如阿托品硫酸鹽、阿托品甲基硝酸鹽和異丙托溴銨(ATROVENTTM))、β2激動(dòng)劑(例如沙丁胺醇(VENTOLINTM和PROVENTILTM)、比托特羅(TORNALATETM)、levalbuterol(XOPONEXTM)、奧西那林(ALUPENTTM)、吡布特羅(MAXAIRTM)terbutlaine(BRETHAIRETM和BRETHINETM)、沙丁胺醇(PROVENTILTM、REPETABSTM和VOLMAXTM)、福莫特羅(FORADILAEROLIZERTM)、和沙美特羅(SEREVENTTM和SEREVENTDISKUSTM))、和甲基黃嘌呤(例如茶堿(UNIPHYLTM、THEO-DURTM、SLO-BIDTM和TEHO-42TM))。NSAID的例子包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞來西布(CELEBREXTM)、雙氯芬酸(VOLTARENTM)、依托度酸(LODINETM)、非諾洛芬(NALFONTM)、吲哚美辛(INDOCINTM)、ketoralac(TORADOLTM)、奧沙普秦(DAYPROTM)、nabumentone(RELAFENTM)、舒林酸(CLINORILTM)、托美丁(TOLECTINTM)、羅非考昔(VIOXXTM)、萘普生(ALEVETM、NAPROSYNTM)、酮洛芬(ACTRONTM)和萘丁美酮(RELAFENTM)。這些NSAID通過抑制環(huán)氧合酶(例如COX-1和/或COX-2)發(fā)揮功能。類固醇抗炎藥的例子包括但不限于糖皮質(zhì)激素、地塞米松(DECADRONTM)、皮質(zhì)甾類(例如甲潑尼龍(MEDROLTM))、可的松、氫化可的松、強(qiáng)的松(PREDNISONETM和DELTASONETM)、潑尼松龍(pRELONETM和PEDIAPREDTM)、曲安西龍、柳氮磺比啶和類花生酸的抑制劑(例如前列腺素、凝血噁烷和白三烯類(關(guān)于白三烯的非限制性例子和這些試劑的典型劑量見以下表6))。在某些實(shí)施方案中，抗炎性試劑是用于預(yù)防、控制、治療、改善哮喘或其一種或多種癥狀的試劑。這些試劑的非限制性例子包括促腎上腺素(例如兒茶酚胺(例如腎上腺素、異丙腎上腺素和新異丙腎上腺素)、間二苯酚(例如奧西那林、特布他林和非諾特羅)、和水楊甙(例如沙丁胺醇))、腎上腺類皮質(zhì)激素、blucocorticoids、皮質(zhì)甾類(例如beclomethadonse、布地奈德、氟尼縮松、氟替卡松、曲安西龍、甲潑尼龍、潑尼松龍和強(qiáng)的松)、其它類固醇、β2拮抗劑(例如albtuerol、比托特羅、非諾特羅、新異丙腎上腺素、奧西那林、吡布特羅、沙丁胺醇、特布他林、福莫特羅、沙美特羅和albutamol特布他林)、抗膽堿藥(例如異丙托溴銨和氧托溴銨)、IL-4拮抗劑(包括抗體)、IL-5拮抗劑(包括抗體)、IL-13拮抗劑(包括抗體)、PDE4-抑制劑、NF-κ-β抑制劑、VLA-4抑制劑、CpG、抗-CD23、選擇素拮抗劑(TBC1269)、肥大細(xì)胞蛋白酶抑制劑(例如類胰蛋白酶激酶抑制劑(例如GW-45、GW-58和genisteine)、磷脂酰肌醇-3’(PI3)激酶抑制劑(例如calphostinC)和其它激酶抑制劑(例如staurosporine)(見Temkin等，2002JImmunol169(5)2662-2669；Vosseller等，1997Mol.Biol.Cell8(5)909-922；和Nagai等，1995BiochemBiophysResCommun208(2)576-581))、C3受體拮抗劑(包括抗體)、免疫抑制劑(例如甲氨蝶呤和金鹽)、肥大分子調(diào)節(jié)劑(例如色甘酸鈉(INTALTM)和萘多羅米鈉(TILADETM)和粘液溶解劑(例如乙酰半胱胺酸))。在特定實(shí)施方案中，抗炎性試劑是白三烯抑制劑(例如孟魯司特(SINGULAIRTM)、扎魯司特(ACCOLATETM)、普侖司特(ONONTM)或齊留通(ZYFLOTM)(見表6))。表6.用于治療哮喘的白三烯抑制劑表7.H1抗組胺類癌癥治療以及除癌癥以外的過量增殖細(xì)胞病癥的治療以及它們的劑量、給藥途徑和推薦的用法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且已在諸如Physician’sDeskReference(第56版，2002，第57版，2003，和第58版，2004)的文獻(xiàn)中有說明。5.5.生物學(xué)活性本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方案的毒性和效果可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步驟在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中確定，例如確定LD50(種群50％的致死量)和ED50(種群50％的治療有效量)。毒性效果和治療效果之間的劑量比是治療系數(shù)，其可表示為比率LD50/ED50。表現(xiàn)出大治療系數(shù)的預(yù)防和/或治療性試劑是優(yōu)選的。雖然可以使用表現(xiàn)出毒副作用的預(yù)防和/或治療性試劑，但是應(yīng)當(dāng)仔細(xì)設(shè)計(jì)給藥系統(tǒng)，以將這些試劑定位到受影響的組織位點(diǎn)，從而使受未受影響的細(xì)胞的潛在損傷最小化，因而降低副作用。從動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于制定用于人體的預(yù)防/治療性試劑的劑量范圍。這些試劑的劑量優(yōu)選地落在包含ED50且具有很低或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。該劑量可以根據(jù)使用的劑型和所用的給藥途徑而在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于任何用于本發(fā)明的試劑，可以首先從細(xì)胞培養(yǎng)分析中估算出治療有效劑量。可以制定在動(dòng)物模型中的劑量，以獲得循環(huán)血漿濃度范圍，該范圍包括在動(dòng)物研究中確定的IC50(即實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的疫苗或測(cè)試化合物的濃度)。這樣的信息可用于更準(zhǔn)確地確定人體中的有用劑量。血漿水平可以測(cè)量，例如通過高效液相色譜測(cè)量。本發(fā)明使用的治療的抗癌活性也可以用各種用于癌癥研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型確定，例如免疫活性的小鼠模型，如Balb/c或C57/B1/6或轉(zhuǎn)基因小鼠，其中小鼠EphA2用人EphA2取代，向其給予被構(gòu)建成表達(dá)人EphA2的小鼠腫瘤細(xì)胞系的小鼠模型，以下第6部分中說明的動(dòng)物模型或任何本領(lǐng)域已知的以及在RelevanceofTumorModelsforAnticancerDrugDevelopment(1999，F(xiàn)iebig和Burger編)；ContributionstoOncology(1999，Karger)；TheNudeMouseinOncologyResearch(1991，Boven和Winograd編)，以及AnticancerDrugDevelopmentGuide(1997，Teicher編)中說明的動(dòng)物模型(包括倉鼠、兔等)，這些文獻(xiàn)在此被完整地參考引用。在人體測(cè)試之前，可以在其它合適的動(dòng)物模型中測(cè)試用于治療的化合物，該動(dòng)物模型包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔、倉鼠等，例如以上所述的動(dòng)物模型?；衔镫S后可用于合適的臨床試驗(yàn)中。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何分析方法都可用來評(píng)價(jià)本發(fā)明所公開的組合治療用于治療或預(yù)防癌癥的預(yù)防和/或治療功效。5.6.疫苗組合物本發(fā)明的組合物包括用于制備非藥用組合物(例如不純的或非無菌的組合物)的散裝藥物組合物和用于制備單位劑型的藥用組合物(即適合向個(gè)體或患者給藥的組合物)。這些組合物包括預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明所公開的預(yù)防和/或治療性試劑或這些試劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包括預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗。本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗包括一種或多種表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌和藥學(xué)上可接受的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括基于李斯特菌的EphA2疫苗和其它預(yù)防或治療性試劑，例如抗癌試劑。根據(jù)該實(shí)施方案，該組合物可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指已經(jīng)經(jīng)過聯(lián)邦或州政府管理部門批準(zhǔn)或在美國藥典或其它普遍認(rèn)可的藥典中有列出，可以用于動(dòng)物，特別是人。術(shù)語“載體”是指稀釋劑、佐劑(例如Freund’s佐劑(完全的和不完全的)或更優(yōu)選的可從Chiron，Emeryville，CA獲取的MF59C.1佐劑)、賦形劑或與治療劑一起給藥的賦形劑。這些藥物學(xué)載體可以是無菌液體，例如水或油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物是靜脈內(nèi)給藥時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和水性右旋糖以及甘油溶液也可用作液體載體，特別地用于可注射溶液。合適的藥物學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、云母、氯化鈉、干燥脫脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物還可以包含少量的濕潤劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以是溶液、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋劑等形式。一般地，本發(fā)明的組合物的成分以單位劑型單獨(dú)地或混合在一起提供，例如在密封容器，如標(biāo)記了活性試劑量的安瓶或sachette中，作為干燥凍干粉末或不含水的濃縮物提供。如果該組合物將通過輸液給藥，將其分散在含有無菌藥物級(jí)水或鹽溶液的輸液瓶中。如果該組合物是通過注射給藥，提供含有無菌的注射水或鹽溶液的安瓶以使所述成分可以在注射前混和。本發(fā)明的組合物可配制成中性或鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括帶有陰離子的鹽，如衍生自鹽酸、磷酸、醋酸、酢漿草、酒石酸等的鹽；以及帶有陽離子的鹽，例如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。各種給藥系統(tǒng)是已知的，且可用來給予本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗，或本發(fā)明的EphA2疫苗與用于預(yù)防或治療癌癥的預(yù)防或治療性試劑的組合，該給藥系統(tǒng)如包裹在脂質(zhì)體中的包裹體、微顆粒、微囊體、能夠表達(dá)EphA2抗原性肽的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(見例如Wu和Wu，1987，Biol.Chem.2624429-4432)、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的一部分的核酸的構(gòu)建等。給予基于李斯特菌的EphA2疫苗，或本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗與預(yù)防或治療性試劑的組合的方法包括但不限于腸胃外給藥(例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜外給藥和粘膜給藥(例如鼻內(nèi)、吸入和口腔途徑)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗，或本發(fā)明的EphA2疫苗和預(yù)防或治療性試劑的組合通過肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下給藥。本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗，或本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗和預(yù)防或治療性試劑的組合可以通過任何傳統(tǒng)途徑給藥，例如通過灌輸或快速注射，通過上皮或粘膜皮膚層吸收(例如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜等)給藥，和可以與其它生物學(xué)活性試劑一起給藥。給藥可以是系統(tǒng)的或局部的。在特定實(shí)施方案中，在需要治療的區(qū)域上局部地給予本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗，或本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗和本發(fā)明的預(yù)防或治療性試劑的組合可能是理想的。這可以通過，例如但不限于，局部灌輸、注射或移植來進(jìn)行。所述移植是移植多孔、無孔或凝膠材料，包括膜如sialastic膜，或纖維。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗，或本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗和預(yù)防或治療性試劑的組合可以通過控釋或緩釋系統(tǒng)給藥。在一實(shí)施方案中，可以使用泵來實(shí)現(xiàn)受控或延緩釋放(見Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.RefBiomed.Eng.1420；Buchwald等，1980，Surgery88507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實(shí)施方案中，可以使用聚合材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌的受控或廷緩釋放(參見，例如MedicalApplicationsofControlledRelease，Langer和Wise編，CRC出版社，BocaRaton，F(xiàn)L(1974)；ControlledDrugBioavailability，DrugProductDesignandPerformance，Smolen和Ball編，Wiley，NewYork(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；還參見Levy，1985，Science228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105)；美國專利號(hào)5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463、5,128,326；國際公開號(hào)WO99/15154和WO99/20253。用于緩釋制劑的聚合物的例子包括但不限于聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基甲基丙烯酸酯)、聚丙烯酸、聚(乙烯-共-乙酸乙烯)、聚甲基丙烯酸、聚甘醇酸(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-甘醇酸)(PLGA)和聚原酸酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于緩釋制劑的聚合物是惰性的、無可濾除雜質(zhì)的、儲(chǔ)存穩(wěn)定的、無菌的且生物可降解的。在另一實(shí)施方案中，受控的或延緩釋放系統(tǒng)可位于預(yù)防或治療靶點(diǎn)附近，因此僅需要系統(tǒng)性劑量的一部分(參見例如Goodson，見MedicalApplicationsofControlledRelease中，同上，第2卷，第115-138頁(1984))。受控釋放系統(tǒng)在Langer的綜述(1990，Science2491527-1533)中有討論。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)都可用于制備包含本發(fā)明的一種或多種治療性試劑的緩釋制劑。參見，例如美國專利號(hào)4,526,938；國際公開號(hào)WO91/05548和WO96/20698；Ning等，1996，Radiotherapy&Oncology39179-189；Song等，1995，PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50372-397；Cleek等，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；和Lam等，1997，Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24759-760，各文獻(xiàn)在此被完整地引為參考。5.6.1.制劑本發(fā)明使用的藥物組合物可以使用常規(guī)方法用一種或多種生理學(xué)可接受的載體或賦形劑配制。因此，本發(fā)明的表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌和它們的生理學(xué)可接受鹽和溶劑化物可以配制用來給藥，該給藥是通過吸入或吹入(通過口或鼻)或口服、腸胃外或粘膜(例如口腔、陰道、直腸、舌下)給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用局部給藥或系統(tǒng)性腸胃外給藥。對(duì)于口服給藥，基于李斯特菌的EphA2疫苗可以通過常規(guī)方法使用藥學(xué)上可接受的賦形劑制備成，例如片劑或膠囊的形式，該賦形劑如粘合劑(例如預(yù)先膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、云母或硅石)；崩解劑(例如土豆淀粉或乙醇酸淀粉鈉)；或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。該片劑可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)包被。用于口服給藥的液體制劑可以是，例如溶液、糖漿或懸浮劑的形式，或它們可以是干燥產(chǎn)品，在使用前與水或其它合適的載體混和。這些液體制劑可以通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑制備，該添加劑如懸浮試劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性載體(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾的蔬菜油)；以及防腐劑(例如甲基或丙基-對(duì)-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。如果合適，該制劑還可以包含合適的緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑或甜味劑。口服給藥的制劑可以合適地配制成使活性化合物受控釋放。對(duì)于口腔給藥，組合物可以用常規(guī)方式配制成片劑或錠劑的形式。對(duì)于吸入給藥，本發(fā)明使用的預(yù)防或治療性試劑可以通過使用合適的推進(jìn)劑從加壓包裝或噴霧器中以氣體噴霧的形式方便地遞送，該推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的其它。在加壓氣霧劑的實(shí)例中，可以通過閥來確定劑量單位以遞送預(yù)定的量。用于吸入劑或吹入劑的膠囊和藥管，如凝膠的膠囊和藥管可以配制成含有化合物和合適的粉狀基質(zhì)，例如乳糖或淀粉的粉末狀混合物。基于李斯特菌的EphA2疫苗可以配制成通過注射進(jìn)行腸胃外給藥，例如快速注射或連續(xù)灌輸。用于注射的制劑可以以單位劑量的形式存在，例如在安瓶中或在多劑量容器中，并加有防腐劑。該組合物可以是如懸浮劑、溶液或油性或水性載體中的乳劑的形式，且可以含有配制試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x擇地，所述活性成分可以是粉劑形式，在使用前與合適的載體，例如無菌的無熱原水混和。本發(fā)明的疫苗還可配制成直腸組合物，例如栓劑或保留灌腸劑，例如該組合物含有常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可黃油或其它甘油酯。除了上述制劑，所述預(yù)防或治療性試劑還可以配制成長效制劑。這樣的長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi)植入)或肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如，該預(yù)防或治療性試劑可與合適的聚合物或疏水性材料(例如，在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂一起配制，或作為微溶衍生物，例如微溶鹽來配制。本發(fā)明還提供了將本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗包裝在密封容器，例如標(biāo)明數(shù)量的安瓶或sachette中。在一實(shí)施方案中，疫苗作為密封容器中的干燥無菌凍干粉末或無水濃縮物提供，且能與例如水或鹽溶液重新混合成向個(gè)體給藥的合適濃度。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，與本發(fā)明的疫苗組合使用的各種化療、生物學(xué)治療/免疫治療和激素治療性試劑的配制和給藥是本領(lǐng)域已知的，且通常在Physician’sDeskReference(第56版，2002)中有說明。例如，在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方案中，該試劑可以如表3中所提供的方法配制和提供。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，放療性試劑，例如放射性同位素可作為膠囊中的液體或作為飲料口服給予。放射性同位素還可以配制成用于靜脈內(nèi)注射。有經(jīng)驗(yàn)的癌癥專家能夠確定給藥的最佳劑型和途徑。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌配制成1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml和25mg/ml用于靜脈內(nèi)注射，和5mg/ml、10mg/ml和80mg/ml用于重復(fù)地皮下給藥和肌肉內(nèi)注射。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌配制的量的范圍為大約1×102CFU/ml至大約1×1012CFU/ml，例如1×102CFU/ml、5×102CFU/ml、1×103CFU/ml、5×103CFU/ml、1×104CFU/ml、5×104CFU/ml、1×105CFU/ml、5×105CFU/ml、1×106CFU/ml、5×106CFU/ml、1×107CFU/ml、5×107CFU/ml、1×108CFU/ml、5×108CFU/ml、1×109CFU/ml、5×109CFU/ml、1×1010CFU/ml、5×1010CFU/ml、1×1011CFU/ml、5×1011CFU/ml或1×1012CFU/ml。如果需要，上述組合物可以存在于包裝或分裝裝置中，該裝置可包含一個(gè)或多個(gè)含有所述活性成分的單位劑型。該包裝可以例如包含金屬或塑料薄膜，例如吸塑包裝。包裝或分裝裝置可以附上給藥說明書。5.6.2.劑量在癌癥的治療、預(yù)防或控制中有效的本發(fā)明的組合物的量可以通過標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)確定。例如，在癌癥的治療、預(yù)防或控制中有效的本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗的劑量可通過將該組合物向動(dòng)物模型，例如本發(fā)明所公開的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的動(dòng)物模型給藥來確定。此外，任選地可以進(jìn)行體外分析以幫助確定最佳劑量范圍。優(yōu)選的有效劑量可以由普通技術(shù)人員基于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的若干因素確定(例如通過臨床試驗(yàn))。這些因素包括要治療或預(yù)防的疾病、有關(guān)癥狀、患者的體重、患者的免疫狀態(tài)和普通技術(shù)人員已知的反映給予的藥物組合物的準(zhǔn)確性的其它因素。所述制劑中使用的精確劑量還依賴于給藥途徑以及癌癥的嚴(yán)重性，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)專業(yè)醫(yī)生的判斷和各患者的情況來決定。有效劑量可以從來自體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線外推得到。關(guān)于本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗中的李斯特菌的劑量，該劑量基于群落形成單位(c.f.u.)的量。一般地，在各實(shí)施方案中，該劑量范圍為大約1.0c.f.u./kg至大約1×1010c.f.u./kg；大約1.0c.f.u./kg至大約1×108c.f.u./kg；大約1×102c.f.u./kg至大約1×108c.f.u./kg；大約1×104c.f.u./kg至大約1×108c.f.u./kg。有效劑量可以從來自動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線外推得到。在某些典型實(shí)施方案中，該劑量范圍是小鼠LD50的0.001倍至10,000倍、0.01倍至1,000倍、0.1倍至500倍、0.5倍至250倍、1倍至100倍、5倍至50倍。在某些特定實(shí)施方案中，該劑量范圍是小鼠LD50的0.001倍、0.01倍、0.1倍、0.5倍、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍。對(duì)于向患者給藥的其它癌癥治療性試劑，表3中提供了本領(lǐng)域已知的各種癌癥治療劑的典型劑量。在本發(fā)明中，某些優(yōu)選的實(shí)施方案包含在組合治療方案中以低于單試劑給藥所推薦的劑量的劑量給藥。本發(fā)明提供了用已知的預(yù)防或治療性試劑，用比此前認(rèn)為對(duì)癌癥的治療、控制或改善有效的劑量低的劑量給藥的任何方法。優(yōu)選地，更低劑量的已知抗癌試劑與更低劑量的本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗組合給藥。5.7.試劑盒本發(fā)明提供了包裝或試劑盒，其包含了一或多個(gè)裝有本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗或本發(fā)明的基于李斯特菌的EphA2疫苗的組分的容器。此外，一種或多種可用于治療癌癥或其它過量增殖性病癥的其它預(yù)防或治療性試劑也可包含在該包裝或試劑盒中。任選地，這樣的容器可以附有說明調(diào)整藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府部門的通知，該通知反映該部門批準(zhǔn)了用于人體給藥的制造、使用或銷售。本發(fā)明提供了可用于上文所述方法的試劑盒。在一實(shí)施方案中，該試劑盒包含本發(fā)明的一種或多種基于李斯特菌的EphA2疫苗。在另一實(shí)施方案中，該試劑盒在一或多個(gè)容器中進(jìn)一步包含可用于治療癌癥或其它過量增殖性病癥的一種或多種其它預(yù)防或治療性試劑。在其它實(shí)施方案中，該預(yù)防或治療性試劑是生物學(xué)或激素治療劑。6、實(shí)施例基于李斯特菌的EphA2疫苗提供對(duì)抗表達(dá)EphA2的癌癥的治療和預(yù)防益處受體酪氨酸激酶EphA2在各種惡性細(xì)胞類型和腫瘤中選擇性地過量表達(dá)。此外，近期的研究已經(jīng)鑒別出了從患者中衍生出的T淋巴細(xì)胞，其識(shí)別EphA2。因此，EphA2為活性免疫治療提供了非常需要的靶點(diǎn)。在此，我們揭露了在革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)細(xì)菌，即單核增生李斯特菌(李斯特菌)中異位表達(dá)的人EphA2能夠在接種動(dòng)物中引起抗原特異性的抗腫瘤應(yīng)答。李斯特菌感染關(guān)鍵的抗原呈遞細(xì)胞，并因而提供癌癥治療效果，因?yàn)槠淠苷T導(dǎo)對(duì)抗被編碼抗原的有效而強(qiáng)烈的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。使用減毒李斯特菌突變菌株，該菌株維持了野生菌的抗原傳遞能力，但在小鼠中的致病性降低了近10,000倍。為了證實(shí)基于李斯特菌的EphA2的效果，將李斯特菌actA-菌株構(gòu)建成表達(dá)人EphA2的胞外(ECD)或胞內(nèi)(ICD)結(jié)構(gòu)域(actA-hEphA2-ECD或actA-hEphA2-ICD)。通過Western印跡分析確認(rèn)了hEphA2-EX和-CO從李斯特菌中的表達(dá)和分泌。actA-hEphA2EX的保護(hù)性免疫顯著地抑制了表達(dá)全長hEphA2的CT26細(xì)胞的皮下生長(p＝0.0037)。作為對(duì)照，接種了親代actA菌株的小鼠生成腫瘤，該腫瘤與用運(yùn)載體處理的對(duì)照小鼠相當(dāng)。用actA-hEphA2CO進(jìn)行的保護(hù)性免疫顯著地增加了被RenCA-hEphA2激發(fā)的小鼠的存活率。隨后，使用實(shí)驗(yàn)CT26-hEphA2肺腫瘤模型評(píng)價(jià)actA-hEphA2-ECD或actA-hEphA2-ICD的治療效果。在腫瘤細(xì)胞靜脈內(nèi)移植后，Balb/c小鼠用actA、actA-hEphA2EX或actA-hEphA2-ICD免疫。和匹配的對(duì)照(運(yùn)載體或actA的存活時(shí)間中值分別是19和20天)相比，用actA-hEphA2-ECD或actA-hEphA2-ICD進(jìn)行的免疫顯著地延長了存活(存活中值＞43天，p＝0.0035)。重要的是，80％的huEphA2免疫小鼠存活至腫瘤植入后的43天。總之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了以EphA2腫瘤抗原為靶的李斯特菌介導(dǎo)免疫能夠提供對(duì)抗各種惡性腫瘤的預(yù)防和治療效果。6.1.實(shí)施例1李斯特菌的生命周期圖1A-1B中顯示了單核增生李斯特菌的生命周期，包括內(nèi)吞、吞噬溶酶體裂解以及細(xì)胞至細(xì)胞的擴(kuò)散步驟。6.2.實(shí)施例2表達(dá)EphA2和對(duì)照李斯特菌株的構(gòu)建6.2.1.背景根據(jù)李斯特菌通過MHCI類通路進(jìn)行異源抗原呈遞的機(jī)制，異源基因的表達(dá)以及新合成的蛋白從細(xì)菌中分泌到被感染(抗原呈遞)細(xì)胞的胞質(zhì)中的效率與CD8+T細(xì)胞的啟動(dòng)和/或激活的強(qiáng)度有直接關(guān)系。由于Ag特異性T細(xì)胞啟動(dòng)的水平與疫苗的效果有直接的關(guān)系，因此異源蛋白表達(dá)和分泌的效率與疫苗的強(qiáng)度直接相關(guān)。因此，就啟動(dòng)和/或激活特異于編碼的EphA2蛋白的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答而言，優(yōu)化EphA2表達(dá)和分泌的效率以將基于李斯特菌的疫苗的效果最大化。6.2.2.突變李斯特菌株的制備李斯特菌株衍生自10403S(Bishop等，J.Immnol.1392005(1987))。用已有的方法(Camilli等，Mol.Microbiol.8143(1993))通過SOE-PCR和等位交換制備具有指定基因框內(nèi)刪除的李斯特菌株。在Glomski等，J.Cell.Biol.1561029(2002)中描述突變菌株LLOL461T(DP-L4017)，該文獻(xiàn)在此被參考引用。actA突變(DP-L4029)是DP-L3078菌株，該菌株在Skoble等，J.ofCellBiology，150527-537(2000)中有描述，其已被自愈成原噬菌體，該文獻(xiàn)在此被完整的參考引用。(原噬菌體自愈在(Lauer等，JBacteriol.1844177(2002))，美國專利公開號(hào)2003/0203472中有說明)。在某些疫苗中，使用內(nèi)化素B缺陷的李斯特菌突變株(Genbank登記號(hào)AL591975(單核增生李斯特菌菌株EGD，完全基因組，片段3/12；inlB基因區(qū)域nts.97008-98963)，在此被完整參考引用，和/或Genbank登記號(hào)NC_003210(單核增生李斯特菌菌株EGD，完整基因組，inlB基因區(qū)域nts.457008-458963)所列出的序列，在此被完整地參考引用)。一特別的actA-inlB-菌株(DP-L4029inlB)于2003年10月3日保藏在美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)，且指定的保藏號(hào)為PTA-5562。6.2.3.克隆載體將選定的異源抗原表達(dá)框分子構(gòu)建體插入到pPL2(Lauer等，J.Bacteriol.2002)或pAM401(Wirth等，J.Bacteriol.165831-836)中，修飾成含有pPL2的多克隆序列(AatII小片段，171bp)，插入到四環(huán)素抗性基因(pAM401-MCS)內(nèi)的平末端XbaI和NruI識(shí)別位點(diǎn)之間。通常，將hly啟動(dòng)子和(選定的)信號(hào)肽序列插入到pPL2或pAM401-MCS質(zhì)粒載體特有的KpnI和BamHI位點(diǎn)之間。隨后將選定的EphA2基因(有時(shí)經(jīng)修飾包含N末端和C末端抗原決定簇標(biāo)簽；見以下說明)克隆進(jìn)這些構(gòu)建體特有的BamHI和SacI位點(diǎn)之間。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法，通過電穿孔，將基于pAM401-MCS質(zhì)粒載體的分子構(gòu)建體引入到選定的也經(jīng)過溶菌酶處理的單核增生李斯特菌中。從含有氯霉素的BHI瓊脂盤(10μg/ml)上形成的克隆中分離出DNA，通過限制性酶切分析來驗(yàn)證李斯特菌轉(zhuǎn)化子中的預(yù)期質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。如下文所述，將用各種基于pAM401-MCS的異源蛋白表達(dá)框構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的重組李斯特菌用于檢測(cè)異源蛋白的表達(dá)和分泌。根據(jù)上文所述的方法(Lauer等，2002，J.Bacteriol.1844177-4186)，將基于pPL2的異源蛋白表達(dá)框構(gòu)建體整合到選定李斯特菌株的基因組的tRNAArg基因中。簡(jiǎn)言之，首先通過電穿孔或化學(xué)方法將pPL2異源蛋白表達(dá)框構(gòu)建體質(zhì)粒引入到大腸桿菌宿主菌株SM10中(Simon等，1983，Bio/Technology1784-791)。隨后，通過接合將基于pPL2的質(zhì)粒從轉(zhuǎn)化的SM10轉(zhuǎn)移到選定的李斯特菌中。在如上所述的含有每毫升7.5μg氯霉素和每毫升200μg鏈霉素的藥物選擇性BHI瓊脂盤上培養(yǎng)后，通過在相同組分的盤上傳代3次來純化選定的群落。為了證實(shí)pPL2載體整合進(jìn)了噬菌體附著位點(diǎn)，挑選單個(gè)群落并通過PCR篩選，使用正向引物NC16(5’-gtcaaaacatacgctcttatc-3’)(SEQIDNO47)和反向引物PL95(5’-acataatcagtccaaagtagatgc-3’)(SEQIDNO48)的引物對(duì)。具有整合到選定李斯特菌株基因組的tRNAArg基因中的基于pPL2的質(zhì)粒的選定群落產(chǎn)生499bps的診斷性DNA擴(kuò)增子。6.2.4.啟動(dòng)子異源蛋白表達(dá)框包含prfA-依賴性hly啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼李斯特溶菌素O(LLO)的轉(zhuǎn)錄，且在感染細(xì)胞的微環(huán)境中被激活。使用以下所示引物對(duì)，通過PCR從單核增生李斯特菌菌株DP-L4056中擴(kuò)增核苷酸205586-206000(414bps)。擴(kuò)增的區(qū)域包括hly啟動(dòng)子和LLO的前28個(gè)氨基酸，包括secA1信號(hào)肽(同上)和PEST結(jié)構(gòu)域。單核增生李斯特菌菌株EGD的該區(qū)域的預(yù)期序列可在GenBank中找到(登記號(hào)gi/6802048/ref/NC_003210.1/[16802048])。引物對(duì)正向(KapnI-LLOnts.1257-1276)5’CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQIDNO49)反向(BamHI-LLOnts.X-x)5’CTCTGGATCCATCCGCGTGTTTCTTTTCG(SEQIDNO50)(下劃線為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，將422bpPCR擴(kuò)增子克隆進(jìn)質(zhì)粒載體TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。確定pCR-XL-TOPO-hly啟動(dòng)子質(zhì)?？寺≈械睦钏固鼐禺愋詨A基的核酸序列。和EGD菌株相比，單核增生李斯特菌菌株DP-L4056包含在prfA框兩側(cè)的8個(gè)核苷酸堿基變化。在下圖中顯示了單核增生李斯特菌DP-L4056和EGD菌株的hly啟動(dòng)子比對(duì)(分別為SEQIDNO68和69)。李斯特菌hlyDP-L4056和EGD比對(duì)Query李斯特菌EGDSubjectDP-L4056(野生型，Portnoy株)prfABoxQuery1ggtacctcctttgattagtatattcctatcttaaagtgacttttatgttgaggcattaac60||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1ggtacctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaac6OQuery61atttgttaacgacgataaagggacagcaggactagaataaagctataaagcaagcatata120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct61atttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatata120Query121atattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggg180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct121atattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggg180Shine-DelgarnoLLOstartQuery181gtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatg240||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct181gtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatg240通過用KpnI和BamHI消化，可以從pCR-XL-TOPO-hly啟動(dòng)子質(zhì)粒克隆中釋放出對(duì)應(yīng)于hly啟動(dòng)子和secA1LLO信號(hào)肽的422bpDNA，并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法將其克隆進(jìn)pPL2質(zhì)粒載體(Lauer等，2002，J.Bact)。該質(zhì)粒作為pPL2-hlyP(天然的)是已知的。6.2.5.將EphA2克隆并插入到pPL2載體中以在選定的重組單核增生李斯特菌菌株中表達(dá)分別克隆EphA2跨膜螺旋兩側(cè)的EphA2的外部結(jié)構(gòu)域(EX2)和胞質(zhì)(CO)結(jié)構(gòu)域，用于插入到各種pPL2-信號(hào)肽表達(dá)構(gòu)建體中。使用與天然哺乳動(dòng)物序列或密碼子相對(duì)應(yīng)的基因，該序列或密碼子被優(yōu)化以在單核增生李斯特菌中表達(dá)EphA2EX2和CO結(jié)構(gòu)域。在李斯特菌中，20種氨基酸中的每一種的最優(yōu)密碼子都用于密碼子優(yōu)化的EphA2EX2和EphA2CO。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的技術(shù)，通過延伸重疊的寡核苷酸來合成密碼子優(yōu)化的EphA2EX2和CO結(jié)構(gòu)域。通過核苷酸測(cè)序驗(yàn)證所有合成的EphA2構(gòu)建體的預(yù)期序列。SEQIDNO23、21和22分別表示了EphA2的EX2結(jié)構(gòu)域的初級(jí)氨基酸序列以及天然的和密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。SEQIDNO34、32和33分別表示了EphA2的CO結(jié)構(gòu)域的初級(jí)氨基酸序列以及天然的和密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。此外，F(xiàn)LAG(Stratagene，LaJolla，CA)和myc抗原決定簇標(biāo)簽被分別同框插入到了合成的EphA2EX2和CO基因的氨基和羧基末端，從而可以使用FLAG和蛋白的特異性抗體通過Western印跡分析來檢測(cè)表達(dá)和分泌的EphA2。因此，表達(dá)的蛋白質(zhì)具有以下的順序元件NH2-信號(hào)肽-FLAG-EphA2-myc-CO2。以下是FLAG和myc抗原決定簇標(biāo)簽的氨基酸和密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。FLAG5’-GATTATAAAGATGATGATGATAAA(SEQIDNO51)NH2-DYKDDDDK-CO2(SEQIDNO52)Myc5’-GAACAAAAATTAATTAGTGAAGAAGATTTA(SEQIDNO53)NH2-EQKLISEEDL-CO2(SEQIDNO54)6.2.6.通過Western印跡分析檢測(cè)合成的和分泌的異源蛋白通過Western印跡分析三氯乙酸(TCA)沉淀的細(xì)菌培養(yǎng)液來檢測(cè)EphA2蛋白的合成和從各種選定重組李斯特菌EphA2菌株的分泌。簡(jiǎn)言之，收集在BHI培養(yǎng)基中生長的李斯特菌的對(duì)數(shù)生長期的中期培養(yǎng)物于50mL錐形離心管中，沉淀細(xì)菌，加入冰冷的TCA以使細(xì)菌培養(yǎng)物上清液達(dá)到最終濃度[6％]，并在冰上培養(yǎng)至少90分鐘或過夜。通過在2400×g在4℃離心20分鐘收集TCA沉淀蛋白。隨后將沉淀物重懸在體積為300-600μl的pH8.0的包含15μg/ml酚肽紅的TE中。通過振動(dòng)促進(jìn)樣品的溶解。如果必要加入NH4OH調(diào)節(jié)樣品pH，直至顏色呈粉紅色。通過加入SDS加樣緩沖液并在90℃放置10分鐘來制備所有樣品以用于電泳。隨后在微離心管中以14,000rpm將樣品離心5分鐘，收集上清液并儲(chǔ)存在-20℃。對(duì)于Western印跡分析，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用方法，將20μl制得的部分(等價(jià)于1～4×109個(gè)細(xì)菌的培養(yǎng)液)加樣至4-12％的SDS-PAGE膠上，電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至PDDF膜上。通過在含有5％奶粉的PBS中室溫下振蕩2小時(shí)，制備與抗體一起溫育的轉(zhuǎn)移膜。抗體在PBST緩沖液(PBS中的0.1％Tween20)中進(jìn)行如下稀釋(1)兔抗Myc多克隆抗體(ICLlaboratories，Newberg，Oregon)，以1∶10,000稀釋；(2)小鼠抗FLAG單克隆抗體(Stratagene，同上)，以1∶2,000；以及(3)兔抗EphA2(羧基末端特異性的)多克隆抗體(sc-924，SantaCruzBiotechnology公司，SantaCruz，CA)。通過與和山葵過氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔或抗鼠抗體進(jìn)行二次培養(yǎng)，并用ECL化學(xué)發(fā)光分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)和曝光至膠片來評(píng)價(jià)抗體和蛋白質(zhì)靶的特異性結(jié)合。6.2.7.通過編碼各種形式EphA2的重組李斯特菌分泌EphA26.2.7.1.李斯特菌[DP-L4029(actA)或DP-L4017(LLOL461T)菌株]表達(dá)框構(gòu)建體LLOss-PEST-CO-EphA2(SEQIDNO35)將EphA2CO結(jié)構(gòu)域的天然序列與天然secA1LLO序列進(jìn)行基因融合，且如上文所述，將在李斯特菌hly啟動(dòng)子的控制之下的異源抗原表達(dá)框插入到pPL2質(zhì)粒的KnpI和SacI之間。如上文所述，通過接合將pPL2-EphA2質(zhì)粒構(gòu)建體導(dǎo)入到李斯特菌菌株DP-L4029(actA)和DP-L4017(L461TLLO)中。圖2顯示了TCA沉淀的4029-EphA2CO和4017-EphA2CO的細(xì)菌培養(yǎng)液的Western印跡分析結(jié)果。該分析證明了構(gòu)建的包含由與secA1和EphA2CO融合蛋白相應(yīng)的天然序列組成的異源蛋白表達(dá)框的李斯特菌表達(dá)多個(gè)EphA2特異性片段，這些片段小于52kDa的預(yù)期分子量，這證明了需要修飾表達(dá)框。6.2.7.2.李斯特菌[DP-L4029(actA)]表達(dá)框構(gòu)建體天然LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-密碼子優(yōu)化的(SEQIDNO26)(密碼子優(yōu)化的)LLOss-PEST-(密碼子優(yōu)化的)FLAG-EX2_EphA2-myc(SEQIDNO28)將天然secA1LLO信號(hào)肽序列或密碼子得到優(yōu)化以在李斯特菌中表達(dá)的secA1LLO信號(hào)肽序列與密碼子得到優(yōu)化以在李斯特菌中表達(dá)的EphA2EX2結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行基因融合，且如上文所述，將在李斯特菌hly啟動(dòng)子控制下的異源抗原表達(dá)框插入到pPL2質(zhì)粒的KpnI和SacI位點(diǎn)之間。如上所述，通過接合將pPL2-EphA2質(zhì)粒構(gòu)建體導(dǎo)入到李斯特菌菌株DP-L4029(actA)中。圖3顯示了TCA沉淀的李斯特菌actA的細(xì)菌培養(yǎng)液的Western印跡分析結(jié)果，該李斯特菌actA編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2EX2結(jié)構(gòu)域融合的天然或密碼子優(yōu)化的secA1LLO信號(hào)肽。該分析證明了組合使用密碼子優(yōu)化成單核增生李斯特菌的偏好密碼子的信號(hào)肽序列和異源蛋白序列表達(dá)出了期望的全長EphA2EX2結(jié)構(gòu)域蛋白。僅用密碼子優(yōu)化的全長EphA2編碼序列，全長EphA2EX2結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)不理想。當(dāng)使用密碼子得到優(yōu)化以在單核增生李斯特菌中表達(dá)的單核增生李斯特菌LLOsecA1信號(hào)肽時(shí)，異源蛋白表達(dá)的水平(片段的或全長)最高。6.2.7.3.李斯特菌[DP-L4029(actA)]表達(dá)框構(gòu)建體天然LLOss-PEST-(密碼子優(yōu)化的)FLAG-EphA2_CO-myc(SEQIDNO37)密碼子優(yōu)化的LLOss-PEST-(密碼子優(yōu)化的)FLAG-EphA2_CO-myc(SEQIDNO39)密碼子優(yōu)化的PhoD-(密碼子優(yōu)化的)FLAG-EphA2_CO-myc(SEQIDNO41)將天然的secA1LLO信號(hào)肽序列或密碼子得到優(yōu)化以在李斯特菌中表達(dá)的secA1LLO信號(hào)肽序列，或可選擇地，密碼子得到優(yōu)化以李斯特菌中表達(dá)的來自枯草芽孢桿菌phoD基因的Tat信號(hào)肽與密碼子得到優(yōu)化以在李斯特菌中表的EphA2結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行基因融合，且如上所述，將在李斯特菌hly啟動(dòng)子的控制下的異源抗原表達(dá)框插入到pAM401-MCS質(zhì)粒的KnpI和SacI位點(diǎn)之間。如上所述，通過電穿孔將pAM401-EphA2質(zhì)粒構(gòu)建體引入到李斯特菌菌株DP-L4029中。圖4顯示了TCA沉淀的李斯特菌actA的細(xì)菌培養(yǎng)液的Western印跡分析結(jié)果，該李斯特菌actA編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2CO結(jié)構(gòu)域融合的天然或密碼子優(yōu)化的secA1LLO信號(hào)肽、或密碼子優(yōu)化的枯草芽孢桿菌phoDTat信號(hào)肽。該分析再一次證實(shí)了組合使用密碼子優(yōu)化成單核增生李斯特菌的偏好密碼子的信號(hào)肽序列和異源蛋白序列表達(dá)出了期望的全長EphA2CO結(jié)構(gòu)域蛋白。此外，從重組李斯特菌表達(dá)和分泌表達(dá)出期望的全長EphA2CO結(jié)構(gòu)域蛋白，該重組李斯特菌編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2CO結(jié)構(gòu)域融合的密碼子優(yōu)化的枯草芽孢桿菌phoDTat信號(hào)肽。該結(jié)果證實(shí)了新穎而意想不到的發(fā)現(xiàn)，即來自不同細(xì)菌屬的信號(hào)肽可用于從重組李斯特菌中分泌異源蛋白。僅對(duì)EphA2序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，全長EphA2CO結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)不理想。當(dāng)使用密碼子得到優(yōu)化以在單核增生李斯特菌中表達(dá)的信號(hào)肽時(shí)，異源蛋白的表達(dá)水平是最高的。6.2.8.表達(dá)AH1/OVA或AH1-A5/OVA的李斯特菌菌株的構(gòu)建制備李斯特菌突變株，該突變菌株表達(dá)模型抗原卵清蛋白(OVA)的截短形式、來自小鼠結(jié)腸直腸癌(CT26)的稱作AH1的優(yōu)勢(shì)免疫抗原決定簇(SPSYVYHWF)(SEQIDNO55)、以及經(jīng)改變的抗原決定簇AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQIDNO56)；Slansky等，2000，Immunity，13529-538)。使用pPL2整合載體(Lauer等，J.Bacteriol.1844177(2002)；美國專利公開號(hào)2003/0203472)來衍生OVA和AH1-A5/OVA重組李斯特菌菌株，該菌株包含整合進(jìn)該李斯特菌基因組的無毒位點(diǎn)的單拷貝。6.2.9.表達(dá)OVA的李斯特菌的構(gòu)建(DP-L4056)首先制備抗原表達(dá)框，該表達(dá)框由與截短的OVA融合的刪除了溶血素的LLO組成，且包含在pPL2整合載體(pPL2/LLO-OVA)中。通過將pPL2/LLO-OVA導(dǎo)入到噬菌體自愈性單核增生李斯特菌菌株DP-L4056的PSA(來自ScottA的噬菌體)附著位點(diǎn)tRNAArg-attBB’，從而衍生出李斯特-OVA疫苗菌株。使用PCR擴(kuò)增刪除了溶血素的LLO，使用以下模板和引物來源DP-L4056基因組DNA引物正向(KnpI-LLOnts1257-1276)5’-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQIDNO57)(TmLLO-spec52℃總體80℃)反向(BamHI-XhoI-LLOnts2811-2792)5’-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC(SEQIDNO58)(TmLLO-spec52℃總體102℃)PCR也用于使用以下的模板和引物擴(kuò)增截短的OVA來源來自DP-E3616大腸桿菌的pDP3616質(zhì)粒DNA(Higgins等，Mol.Molbiol.311631-1641(1999))引物正向(XhoI-NcoIcDNAnts.174-186)5’-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC(SEQIDNO59)(TmLLO-spec60℃總體88℃)反向(XhoI-NotI-HindIII)5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT(SEQIDNO60)(Tm總體82℃)完成構(gòu)建過程的一個(gè)方案包括首先用KpnI和BamHI剪切LLO擴(kuò)增子，并將KpnI/BamHI載體插入到pPL2載體(pPL2-LLO)中。然后用XhoI和NotI剪切OVA擴(kuò)增子，并將其插入已經(jīng)用XhoI/NotI剪切過的pPL2-LLO中。(注意pPL2載體不包含任何XhoI位點(diǎn)；pPD-3616包含一個(gè)XhoI位點(diǎn)，其存在于OVA反向引物設(shè)計(jì)中。)通過限制性酶切分析(KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI)和測(cè)序驗(yàn)證pPL2/LLO-OVA。通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pPL2/LLO-OVA導(dǎo)入到大腸桿菌，隨后通過接合而導(dǎo)入并整合進(jìn)李斯特菌(DP-L4056)中，完全如Lauer等的描述(或整合進(jìn)李斯特菌的其它理想菌株中)。6.2.10.表達(dá)AH1/OVA或AH1-A5/OVA的李斯特菌菌株的構(gòu)建為了制備表達(dá)AH1/OVA或AH1-A5/OVA抗原序列的李斯特菌，首先從寡核苷酸制備帶有抗原的插入物，并隨后將其連接進(jìn)載體pPL2-LLO-OVA(如上所述制備)中。以下寡核苷酸用于制備AH1或AH1-A5插入物AH1抗原決定簇插入物(ClaI-PatI相容末端)頂鏈寡核苷酸(AH1Top)5’-CGATTCCCCTAGTTATGTTTTACCACCAATTTGCTGCA(SEQIDNO61)底鏈寡核苷酸(AH1Bottom)5’-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT(SEQIDNO62)AH1-A5抗原決定簇插入物(ClaI-AvaII相容末端)AH1-A5抗原決定簇的序列是SPSYAYHQF(SEQIDNO56)(5’-AGTCCAAGTTatGCATatCATCAATTT-3’)(SEQIDNO63)。頂5’-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC(SEQIDNO64)底5’-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT(SEQIDNO65)將給定抗原的寡核苷酸以等摩爾比混和在一起，在95℃加熱5分鐘。然后讓寡核苷酸混合物緩慢冷卻。隨后將退火的寡核苷酸對(duì)以200∶1的摩爾比與用相關(guān)限制性酶消化的質(zhì)粒pPL2-LLO/OVA連接。通過限制性酶切分析和/或測(cè)序可以驗(yàn)證新構(gòu)建體的身份。隨后通過轉(zhuǎn)化可將質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，之后通過接合而導(dǎo)入并整合進(jìn)李斯特菌(DP-L4056)中，完全如Lauer等的描述，或整合進(jìn)李斯特菌的其它理想菌株中，例如actA-突變株(DP-L0429)、LLOL461T株(DP-L4017)、或actA-/inlB-株(DP-L4029inlB)。6.3.實(shí)施例3表達(dá)人EphA2的小鼠腫瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生6.3.1.背景建立小鼠免疫治療模型用于測(cè)試本發(fā)明的基于李斯特菌的疫苗。建立三種小鼠腫瘤細(xì)胞系，CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系、B16F10小鼠黑素瘤細(xì)胞系和RenCa小鼠腎細(xì)胞癌細(xì)胞系來高水平表達(dá)huEphA2蛋白。進(jìn)行FACS細(xì)胞分類分析以識(shí)別高水平表達(dá)huEphA2的CT26、B16F10和RenCa腫瘤細(xì)胞，聚集這些細(xì)胞并用Western印跡分析進(jìn)行分析。通過FACS細(xì)胞分類進(jìn)一步聚集克隆以生產(chǎn)高水平表達(dá)huEphA2的亞克隆。6.3.2.高水平表達(dá)huEphA2的CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的選擇6.3.2.1.LipofectamineTM的轉(zhuǎn)染分析使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染技術(shù)以及商業(yè)可獲取的LipofectamineTM，根據(jù)生產(chǎn)商說明用包含huEphA2的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CT26細(xì)胞。6.3.2.2.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACS)分析用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞FACS分類分析以識(shí)別高水平表達(dá)人EphA2的CT26小鼠癌腫瘤細(xì)胞。圖5顯示了代表性實(shí)驗(yàn)，顯示了高水平表達(dá)人EphA2蛋白的EphA2-3克隆。6.3.2.3.高水平表達(dá)huEphA2的聚集群落的Western印跡在對(duì)用各種構(gòu)建體(包含huEphA2基因)轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的聚集群落進(jìn)行FACS分類后，還使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行Western印跡，以測(cè)定CT26細(xì)胞中人EphA2蛋白的表達(dá)水平。圖6說明了代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。和各種測(cè)試的克隆相比，huEphA2-3克隆表達(dá)最高水平的人EphA2蛋白，選擇用于下文所述的體內(nèi)效果研究。進(jìn)一步地聚集細(xì)胞以生產(chǎn)最高水平表達(dá)huEphA2的亞克隆。6.3.3.高水平表達(dá)huEphA2的B16F10小鼠黑素瘤細(xì)胞的選擇6.3.3.1.逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將人EphA2導(dǎo)入到B16F10黑素瘤細(xì)胞中，以建立高水平表達(dá)該蛋白的克隆。6.3.3.2.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACS)分析和對(duì)CT26細(xì)胞一樣，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)表達(dá)huEphA2的B16F10細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞FACS分類分析，以產(chǎn)生高水平表達(dá)huEphA2的克隆。聚集最高水平表達(dá)huEphA2的克隆，并通過Western印跡分析對(duì)其作進(jìn)一步的檢測(cè)。圖7中顯示了代表性的FACS實(shí)驗(yàn)，其顯示了B16F10亞克隆高水平表達(dá)huEphA2。6.3.3.3.高水平表達(dá)huEphA2的聚集群落的Western印跡在對(duì)包含通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入的huEphA2基因的細(xì)胞的聚集群落進(jìn)行FACS分類后，如上所述還進(jìn)行Western印跡，以測(cè)定B16F10細(xì)胞中huEphA2蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步聚集細(xì)胞以產(chǎn)生最高水平表達(dá)huEphA2的亞克隆。6.3.4.高水平表達(dá)huEphA2的RenCa小鼠腎細(xì)胞癌細(xì)胞的選擇6.3.4.1.LipofectamineTM的轉(zhuǎn)染分析使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染技術(shù)以及商業(yè)可獲取的LipofectamineTM根據(jù)生產(chǎn)商說明用包含huEphA2的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染RenCa細(xì)胞。6.3.4.2.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACS)分析用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞FACS分類分析以識(shí)別高水平表達(dá)人EphA2的RenCa腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞。6.3.4.3.高水平表達(dá)huEphA2的聚集群落的Western印跡在對(duì)用各種包含huEphA2基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的聚集群落進(jìn)行FACS分類后，還使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行Western印跡，以測(cè)定RenCa細(xì)胞中人EphA2蛋白表達(dá)的水平。進(jìn)一步地聚集細(xì)胞以產(chǎn)生最高水平表達(dá)huEphA2的亞克隆。6.3.5.用編碼全長EphA2的pCDNA4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞表達(dá)框構(gòu)建體pCDNA4-EphA2將天然的全長EphA2基因克隆進(jìn)基于原核CMV啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA4(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。圖8顯示了用pCDNA4-EphA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的細(xì)胞裂解液的Western印跡分析結(jié)果，證實(shí)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中全長EphA2蛋白大量表達(dá)。6.4.實(shí)施例4接種疫苗后抗原特異性免疫應(yīng)答的評(píng)價(jià)可以使用各種體外和體內(nèi)方法來評(píng)價(jià)本發(fā)明的疫苗。一些分析包括對(duì)已接種疫苗的小鼠的脾臟的抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行分析。例如，通過靜脈內(nèi)注射0.1LD50的表達(dá)OVA(或其它合適抗原)的李斯特菌菌株來對(duì)C57B1/6或Balb/c進(jìn)行接種。在接種7天后，將脾放入冰冷的RPMI1640培養(yǎng)基中并從其制備單細(xì)胞懸浮液，收集小鼠脾細(xì)胞(典型地，每組3只小鼠)。可選擇地，可以相似地收集小鼠的淋巴結(jié)，制備成單細(xì)胞懸浮液并取代下文所述分析中的脾細(xì)胞。一般地，脾細(xì)胞用于疫苗的靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥的評(píng)價(jià)，而脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞用于疫苗的肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)給藥的評(píng)價(jià)。除非另外說明，用于這些實(shí)施例的所有抗體可以從Pharmingen，SanDiego，CA獲得。6.4.1.ELISPOT分析使用具有OVA抗原的李斯特菌菌株作為例子，使用ELISPOT分析評(píng)價(jià)在小鼠模型中通過免疫產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量頻率。評(píng)價(jià)的抗原特異性T細(xì)胞是OVA特異性CD8+或LLO特異性CD8+或CD4+T細(xì)胞。該OVA抗原模型評(píng)價(jià)對(duì)插入到疫苗的異源腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，且可用任何其它感興趣的抗原代替。LLO抗原是李斯特菌特異性抗原。通過檢測(cè)在識(shí)別特定抗原后細(xì)胞因子(例如IFN-γ)的釋放來評(píng)價(jià)特異性T細(xì)胞。用抗小鼠IFN-γ單克隆抗體(mAbR4；5μg/ml)于4℃過夜包被基于PVDF的96孔板(BDBiosciences，SanJose，CA)。洗滌板并用200μl完全RPMI在室溫將板封閉2小時(shí)。以每孔2×105個(gè)細(xì)胞加入來自接種小鼠(或未接種的對(duì)照小鼠)的脾細(xì)胞，并在0.01至10μM的各種肽濃度下在37℃培養(yǎng)20至22小時(shí)。用于OVA和LLO的肽是SL8，OVA的MHCI類抗原決定簇；LLO190，(NEKYAQAYPNVS，Invitrogen)，李斯特溶菌素O的MHCII類抗原決定簇(李斯特菌抗原)；LLO296(VAYGRQVYL)，李斯特溶菌素O的MHCI類抗原決定簇；或LLO91(GYKDGNEYI)，李斯特溶菌素O的MHCI類抗原決定簇。LLO190和LLO296用于C57B1/6模型，而LLO91用于Balb/c模型。在洗滌后，將板與在PBS中稀釋至0.5μg/ml的IFN-γ特異性次級(jí)生物素化抗體(XMG1.2)培養(yǎng)。在室溫培養(yǎng)2小時(shí)后，洗滌板并在37℃與稀釋在含有1％BSA的PBS中的1nm金羊抗生物素偶聯(lián)物(GAB-1；以1∶200稀釋；TedPella，Redding，CA)培養(yǎng)1小時(shí)。在徹底洗滌后，將盤在室溫與底物(Silver增強(qiáng)試劑盒；30ml/孔；TedPella)培養(yǎng)2至10分鐘以形成斑點(diǎn)。隨后用雙蒸水洗滌板以停止底物反應(yīng)。在將板空氣干燥后，使用自動(dòng)化ELISPOT讀板儀(CTL，Cleveland，OH)計(jì)算各孔中的斑點(diǎn)。對(duì)于OVA特異性T細(xì)胞或李斯特菌特異性T細(xì)胞，細(xì)胞因子應(yīng)答被表示成每2×105個(gè)脾細(xì)胞中IFN-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量。6.4.2.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色分析(ICS)為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)抗原特異性CD8+或CD4+T細(xì)胞的數(shù)量并將結(jié)果與ELISPOT分析中獲得的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，進(jìn)行ICS并且通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來評(píng)價(jià)細(xì)胞。將從接種組和對(duì)照組小鼠中獲得的脾細(xì)胞與SL8(刺激OVA特異性CD8+細(xì)胞)或LLO190(刺激LLO特異性CD4+細(xì)胞)在BrefeldinA(Pharmingen)存在下培養(yǎng)5小時(shí)。BrefeldinA抑制由于刺激T細(xì)胞而發(fā)生的細(xì)胞因子分泌。與無關(guān)的MHCI類肽培養(yǎng)的脾細(xì)胞用作對(duì)照。20ng/mlPMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-醋酸，Sigma)和2μg/mlionomycin(Sigma)刺激的脾細(xì)胞用作IFN-γ和TNF-α胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的陽性對(duì)照。為了檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞用FITC-抗-CD4mAb(RM4-5)和PerCP-抗-CD8mAb(53-6.7)染色、并用Cytofix/CytoPerm溶液(Pharmingen)固定和通透，用PE偶聯(lián)的抗TNF-αmab(MP6-XT22)和APC偶聯(lián)的抗IFN-γmab(XMG1.2)在冰上染色30分鐘。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACScalibur，BectonDickinson，MountainView，CA)并用CELLQuest軟件(BectonDickinson免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng))分析數(shù)據(jù)來確定表達(dá)胞內(nèi)INF-γ和/或TNF-α的細(xì)胞的百分比。由于在各種抗體上的熒光標(biāo)記均可以被FACScalibur識(shí)別，因此通過選擇著色有抗INF-γ或抗TNF-α染色或兩者的CD8+和CD4+來識(shí)別合適的細(xì)胞。6.4.3.受刺激的脾細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)還可以評(píng)價(jià)對(duì)照和接種C57B1/6小鼠的小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平。用SL8或LLO190刺激脾細(xì)胞24小時(shí)。用無關(guān)的肽HSV-gB2(Invitrogen，SSIEFARL)刺激用作對(duì)照。收集刺激的細(xì)胞的上清液并用ELISA分析(eBiosciences，CO)或細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列試劑盒(Pharmingen)來確定T輔助-1和T輔助-2細(xì)胞因子的水平。6.4.4.細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)可以進(jìn)一步通過在體外或直接在小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性活性來評(píng)價(jià)OVA特異性CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞以抗原特異性的方式識(shí)別并裂解它們對(duì)應(yīng)的靶細(xì)胞。使用鉻釋放分析來測(cè)定體外細(xì)胞毒性。為了在脾細(xì)胞群中擴(kuò)充OVA特異性T細(xì)胞，用照射后的EG7.OVA細(xì)胞(經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)OVA的EL-4腫瘤細(xì)胞系，ATCC，Manassas，VA)或100nMSL8以10∶1的比例刺激天然的和李斯特菌-OVA(內(nèi)部的)接種的小鼠的脾細(xì)胞。培養(yǎng)7天后，在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr-釋放分析中確定效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，分析使用EG7.OVA或SL8刺激的EL-4細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)作為靶細(xì)胞且EL-4細(xì)胞本身作為陰性對(duì)照。為了區(qū)分NK細(xì)胞的活性和T細(xì)胞的活性，將YAC-1細(xì)胞系(ATCC，Manassas，VA)用作靶點(diǎn)來確定NK細(xì)胞的活性。特異性毒性的百分比被計(jì)算作100×(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)。通過培養(yǎng)沒有效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞確定自發(fā)釋放。通過用0.1％TritonX-100裂解細(xì)胞確定最大釋放。如果自發(fā)釋放＜最大釋放的20％，實(shí)驗(yàn)對(duì)于分析而言被認(rèn)為是有效的。為了評(píng)價(jià)OVA特異性CD8+T細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞毒活性，來自天然C57B1/6小鼠的脾細(xì)胞被分成平均的兩份。每組用特定的肽，靶(SL8)或?qū)φ?HSV-gB2)以0.5μg/ml在37℃刺激90分鐘。隨后在培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞3次，用PBS+0.1％BSA洗滌2次。以每毫升1×107個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞重懸于溫暖的PBS+0.1％BSA(10ml或更少)中，用于標(biāo)記羧基熒光素雙乙酸琥珀亞胺脂(CFSE，MolecularProbes，Eugene，OR)。將1.25μl的5mMCFSE儲(chǔ)液加入到靶細(xì)胞懸浮液中并通過振蕩混和樣品。為了控制細(xì)胞懸浮液，加入CFSE儲(chǔ)液的10倍稀釋液倍且通過振蕩混和樣品。37℃培養(yǎng)細(xì)胞10分鐘。通過加入大體積(＞40ml)的冰冷PBS來終止染色。在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞兩次并隨后將其懸浮和計(jì)數(shù)。各細(xì)胞懸浮液被稀釋至50×106每毫升，將各群落的100μl混和并通過天然小鼠或接種小鼠的尾巴進(jìn)行血管注射。12-24小時(shí)后，收獲脾并通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析總計(jì)5×106個(gè)細(xì)胞。對(duì)高的(靶)和低的(對(duì)照)熒光峰計(jì)數(shù)，且將兩數(shù)量的比例用于建立靶細(xì)胞裂解的百分比。體內(nèi)細(xì)胞毒性分析可以評(píng)價(jià)抗原特異性T細(xì)胞的裂解活性，而不需要體外再刺激。此外，本分析評(píng)價(jià)了天然環(huán)境中的T細(xì)胞功能。6.5.實(shí)施例5體內(nèi)EphA2功效研究6.5.1.背景為了表征huEphA2的抗腫瘤效應(yīng)，在接種了表達(dá)人EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域(ED)的CT26腫瘤細(xì)胞的小鼠中進(jìn)行功效研究。測(cè)量的終點(diǎn)是腫瘤接種后小鼠的腫瘤體積和存活百分比。接種的途徑是皮下(s.c.)和靜脈內(nèi)(i.v.)。HBSS和李斯特菌給藥作為對(duì)照。6.5.2.用表達(dá)AH1-A5的李斯特菌進(jìn)行對(duì)照接種在用1×105個(gè)CT26細(xì)胞靜脈內(nèi)接種后3天，用0.1LD50的李斯特菌對(duì)Balb/c小鼠(n＝5)進(jìn)行免疫。圖9A證實(shí)了用表達(dá)AH1-A5的李斯特菌進(jìn)行治療免疫提高了接種的動(dòng)物的存活。圖9B顯示了一個(gè)獨(dú)立但等同的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中在細(xì)胞接種后的第19天收獲并固定實(shí)驗(yàn)小鼠的肺。也進(jìn)行了肺節(jié)結(jié)的交叉評(píng)價(jià)，證實(shí)了與接受李斯特菌對(duì)照的對(duì)照動(dòng)物相比，接受李斯特菌AH1-A5的測(cè)試動(dòng)物的肺中沒有腫瘤。6.5.3.預(yù)防性EphA2接種6.5.3.1.用表達(dá)huEphA2的ECD的李斯特菌進(jìn)行免疫對(duì)CT26-hEphA2腫瘤生長和存活的效果使用上文所述單細(xì)胞FACS分析所產(chǎn)生的表達(dá)huEphA2的CT26細(xì)胞群進(jìn)行預(yù)防性研究。用轉(zhuǎn)染了人EphA2的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(“CT26-hEphA2”)皮下接種每組10只Balb/c小鼠的組，以及靜脈內(nèi)接種每組5只小鼠的組。用0.1LD50李斯特菌對(duì)照或表達(dá)hEphA2的ECD的李斯特菌以200μl的大劑量對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。為了研究CD26的皮下接種，用AH1/A5李斯特菌作為陽性對(duì)照。在CT26-hEphA2腫瘤激發(fā)之前14天和4天進(jìn)行免疫。在研究期間每周進(jìn)行兩次腫瘤體積測(cè)量以確定接種的抗腫瘤效果。圖10A顯示了和陰性對(duì)照相比(*p＝0.0012)，表達(dá)hEphA2的ECD的李斯特菌與表達(dá)huEphA2的CT26細(xì)胞的皮下接種的抗腫瘤效果。其數(shù)據(jù)概述如下表8表8圖10B證實(shí)了和陰性對(duì)照相比(*p＝0.0017)，表達(dá)hEphA2的ECD的李斯特菌與表達(dá)huEphA2的CT26細(xì)胞的靜脈內(nèi)接種的抗腫瘤效果。其數(shù)據(jù)概述如下表9表9根據(jù)下文所述的計(jì)劃進(jìn)行預(yù)防性研究。這些研究使用由上述單細(xì)胞FACS分析產(chǎn)生的表達(dá)huEphA2的CT26細(xì)胞群。組8組，每組10只小鼠。如以下表10所示，用轉(zhuǎn)染了人EphA2的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞皮下接種組1-4并靜脈內(nèi)接種組5-8表10計(jì)劃動(dòng)物在第0天和第10天接受200μl大劑量的如上所列試劑的靜脈內(nèi)給藥。在第14天，動(dòng)物皮下或靜脈內(nèi)(實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移模型)接種由人EphA2轉(zhuǎn)染的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(L4029EphA2-exFLAG)、李斯特菌對(duì)照(L4029)、或包含AH1蛋白的李斯特菌陽性對(duì)照(L4029-AH1)(每100μl體積5×105個(gè)細(xì)胞)。每兩周測(cè)量腫瘤體積(僅對(duì)皮下接種)且每周測(cè)量動(dòng)物體重。腫瘤大于2,000mm3或呈現(xiàn)了病態(tài)跡象(駝背姿態(tài)、呼吸減弱、移動(dòng)性降低、體重減輕大于20％等)的任何動(dòng)物被人道地處以安樂死。其數(shù)據(jù)概述如下表11表11在該研究中，用李斯特菌-huEphA2接種證明了在皮下和實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移模型(靜脈內(nèi))中均有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。在皮下模型中，使腫瘤生長顯著降低且3只小鼠沒有腫瘤。相比于對(duì)照李斯特菌和運(yùn)載體處理動(dòng)物，該應(yīng)答也是特異性的。在實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移模型中，相比于運(yùn)載體處理組，用李斯特菌huEphA2-exFlag接種也證實(shí)具有效果。圖11A-11D顯示了預(yù)防性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖11A顯示了與運(yùn)載體(HBSS)、李斯特菌(L4029)和李斯特菌陽性(L4029-AH1)對(duì)照比較，用表達(dá)huEphA2的ECD的CT26接種的小鼠的腫瘤體積自接種后的第21天開始顯著減小并持續(xù)到第32天。圖11B也顯示了預(yù)防性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，再一次顯示了與李斯特菌(L4029)對(duì)照比較，用表達(dá)huEphA2的ECD的CT26細(xì)胞(L4029-EphA2exFlag)接種的小鼠的腫瘤體積自接種后的第21天顯著減小并持續(xù)到第32天。圖11C顯示了在皮下模型中的預(yù)防性研究結(jié)果，測(cè)定了在CT26腫瘤細(xì)胞接種后的小鼠的存活百分比。與所有對(duì)照組相比，L4029-EphA2exFlag組具有最顯著的存活率(由三角表示)。圖11D顯示了在肺轉(zhuǎn)移模型中的預(yù)防研究，測(cè)量了在腫瘤細(xì)胞接種后的小鼠的存活百分比。與所有對(duì)照組相比，L4029-EphA2exFlag組具有最顯著的存活率。前述數(shù)據(jù)證實(shí)了用表達(dá)hEphA2的ECD的李斯特菌進(jìn)行預(yù)防性免疫抑制了CT26-hEphA2腫瘤的生長并延長了存活。6.5.3.2.用表達(dá)huEphA2的ICD的李斯特菌進(jìn)行免疫對(duì)接種了RenCa-hEphA2的小鼠的存活的效果使用通過上述方法產(chǎn)生和篩選的表達(dá)huEphA2的RenCa細(xì)胞群(美國典型培養(yǎng)物中心，Manassas，VA)進(jìn)行預(yù)防性研究。用表達(dá)人EphA2的RenCa腎細(xì)胞癌細(xì)胞(“RenCa-hEphA2細(xì)胞”)接種每組10只Balb/c小鼠的組。用0.1LD50李斯特菌對(duì)照或表達(dá)hEphA2的ICD的李斯特菌以200ml的大劑量對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在RenCa-hEphA2細(xì)胞腫瘤激發(fā)之前18天和4天進(jìn)行免疫。在研究期間每周進(jìn)行兩次腫瘤體積測(cè)量以確定接種的抗腫瘤效果。圖12證實(shí)了與陰性對(duì)照相比表達(dá)，hEphA2的ICD的李斯特菌和表達(dá)huEphA2的RenCa細(xì)胞的皮下接種的抗腫瘤效果。與僅用李斯特菌接種的動(dòng)物相比，在用表達(dá)hEphA2的ICD的李斯特菌接種的動(dòng)物中觀察到顯著的抗腫瘤應(yīng)答(*p＝0.0079)，這可以通過Kaplan-Meier分析的延長存活來評(píng)價(jià)。6.5.4.治療性EphA2接種利用由上述單細(xì)胞FACS分析產(chǎn)生的表達(dá)huEphA2的CT26細(xì)胞群進(jìn)行治療研究。如下進(jìn)行代表性的治療研究組6組，每組10只小鼠。如下表12所示，用CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下接種組1-3并靜脈內(nèi)接種組4-6表12計(jì)劃用由人EphA2轉(zhuǎn)染的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(L4029EphA2exFLAG)、李斯特菌對(duì)照(L4029對(duì)照)、或運(yùn)載體(HBSS)(每100ml體積5×105個(gè)細(xì)胞)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下或靜脈內(nèi)(實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移模型)接種。在細(xì)胞接種后的第3天，動(dòng)物接受200ml大劑量的上述所列試劑的靜脈內(nèi)給藥，兩周后，動(dòng)物接受加強(qiáng)接種。每兩周測(cè)量腫瘤體積(僅對(duì)皮下接種)且每周測(cè)量動(dòng)物體重。腫瘤大于2,000mm3或呈現(xiàn)了病態(tài)跡象(駝背姿態(tài)、呼吸減弱、移動(dòng)性降低、體重減輕大于20％等)的任何動(dòng)物被人道地處以安樂死。計(jì)劃概述如下表13。表13圖13A-13C顯示了典型的治療性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在圖13A中，在接種后以7天的間隔測(cè)量腫瘤體積。與運(yùn)載體(HBSS)和李斯特菌對(duì)照比較，用表達(dá)huEphA2的ECD的CT26接種的小鼠在第14天具有顯著減小的腫瘤體積并持續(xù)到第28天。圖13B顯示了用包含李斯特菌對(duì)照或huEphA2的CT26細(xì)胞接種的小鼠的平均腫瘤體積。與對(duì)照相比，用表達(dá)huEphA2的CT26細(xì)胞接種的小鼠具有減小的平均腫瘤體積。圖13C顯示了使用肺轉(zhuǎn)移模型的治療研究的結(jié)果，測(cè)量了小鼠在用HBSS或李斯特菌對(duì)照或表達(dá)huEphA2的ECD的李斯特菌的CT26細(xì)胞接種后的小鼠的存活百分比。與對(duì)照相比，用表達(dá)huEphA2的ECD的李斯特菌的CT26細(xì)胞(由三角表示)接種的動(dòng)物顯示了更高百分比的存活率。在另一研究中，用轉(zhuǎn)染了人EphA2的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(“CT26-hEphA2”)對(duì)每組10只Balb/c小鼠的組進(jìn)行皮下或靜脈內(nèi)接種。用0.1LD50actA李斯特菌對(duì)照或表達(dá)hEphA2的ICD的李斯特菌以200μl的大劑量對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在一方案中，在CT26-hEphA2腫瘤皮下接種后6天和14天進(jìn)行免疫。在另一方案中，在CT26-hEphA2腫瘤靜脈內(nèi)接種后3天和14天進(jìn)行免疫。通過每周兩次的腫瘤測(cè)量值和存活率來確定抗腫瘤效果。在用李斯特菌-hEphA2接種的動(dòng)物中觀察到顯著的抗腫瘤效果(p＝0.0035)。圖14A說明了免疫后的動(dòng)物的腫瘤測(cè)量值。該數(shù)據(jù)概述如下表14表14圖14B說明了免疫后的動(dòng)物的存活時(shí)間。該數(shù)據(jù)概述如下表15表15用編碼OVA.AH1(MMTVgp70優(yōu)勢(shì)免疫抗原決定簇)或OVA.AH1-A5(MMTVgp70優(yōu)勢(shì)免疫抗原決定簇，具有增強(qiáng)T細(xì)胞受體結(jié)合的不規(guī)則變化)的重組李斯特菌對(duì)患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/c小鼠進(jìn)行免疫產(chǎn)生了長期存活的結(jié)果(圖14C)。EphA2CO結(jié)構(gòu)域是強(qiáng)免疫原性的，且當(dāng)用編碼密碼子優(yōu)化的或天然的EphA2CO結(jié)構(gòu)域序列的重組李斯特菌免疫時(shí)，在患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/c小鼠中觀察到顯著的長期存活(圖14D)。EphA2EX2結(jié)構(gòu)域是弱免疫性的，且僅當(dāng)用編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2EX2結(jié)構(gòu)域序列融合的密碼子優(yōu)化的secA1信號(hào)肽的重組李斯特菌免疫時(shí)，在患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/c小鼠中觀察到延長的存活。當(dāng)用編碼與密碼子優(yōu)化的EphA2EX2結(jié)構(gòu)域序列融合的天然secA1信號(hào)肽的重組李斯特菌免疫時(shí)，在小鼠中沒有觀察到治療效果(圖14E)。使用密碼子優(yōu)化的secA1信號(hào)肽和EphA2EX2結(jié)構(gòu)域序列是理想的，這得到了統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的治療性抗腫瘤效果的支持，如下表所示。通過對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試圖14E中顯示的存活曲線進(jìn)行比較，如下表16中的概述表16明顯地，盡管pCDNA4-EphA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞產(chǎn)生了非常高水平的蛋白表達(dá)，但是用pCDNA4-EphA2質(zhì)粒對(duì)患有CT26.24(huEphA2+)肺腫瘤的Balb/C小鼠進(jìn)行免疫沒有觀察到任何治療性抗腫瘤效果(圖14F)。為了進(jìn)行治療性體內(nèi)腫瘤研究，用穩(wěn)定表達(dá)EphA2的5×105個(gè)CT26細(xì)胞IV移植進(jìn)雌性Balb/C小鼠中。3天后，將小鼠隨機(jī)化并用各種編碼EphA2的重組李斯特菌菌株IV接種小鼠。在某些情況中(在圖中標(biāo)明)，用100μg的pCDNA4質(zhì)?；騪CDNA4-EphA2質(zhì)粒在前脛肌對(duì)小鼠進(jìn)行接種。作為陽性對(duì)照，用編碼OVA.AH1或OVA.AH1-A5蛋白嵌合物的重組李斯特菌菌株對(duì)小鼠進(jìn)行IV接種。在腫瘤細(xì)胞植入后的第3天和14天對(duì)小鼠進(jìn)行接種。注射了Hanks平衡鹽溶液(HBSS)緩沖液或未修飾的李斯特菌的小鼠作為陰性對(duì)照。所有的實(shí)驗(yàn)組包含5只小鼠。對(duì)于存活研究，當(dāng)小鼠開始表現(xiàn)出任何緊張或呼吸困難的跡象時(shí)，將小鼠處死。上述數(shù)據(jù)說明了用表達(dá)hEphA2的李斯特菌進(jìn)行治療性免疫抑制了成熟CT26-hEphA2腫瘤的生長并延長了存活。6.6.實(shí)施例6再激發(fā)后CT26-hEphA2腫瘤生長的長期抑制用表達(dá)對(duì)抗CT26-hEphA2腫瘤的hEphA2的ICD或ECD的李斯特菌進(jìn)行預(yù)防性免疫后，對(duì)未能形成腫瘤的Balb/c小鼠進(jìn)行再激發(fā)(皮下)，再激發(fā)在初次腫瘤激發(fā)后56天和前一次免疫后的60天用CT26母細(xì)胞系和CT26-hEphA2細(xì)胞在相對(duì)側(cè)進(jìn)行。年齡匹配的小鼠在該實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照。用母CT26細(xì)胞進(jìn)行再激發(fā)在組之間沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腫瘤生長差異(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，如圖15中所示，用表達(dá)hEphA2的ICD或ECD的李斯特菌接種的組表現(xiàn)出了對(duì)再激發(fā)的腫瘤生長的顯著抑制(*p＜0.041)。6.7.實(shí)施例7用表達(dá)hEphA2的李斯特菌進(jìn)行免疫引發(fā)EphA2特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答用表達(dá)hEphA2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(hEphA2-ICD)的李斯特菌L461T或表達(dá)密碼子優(yōu)化的hEphA2的胞外結(jié)構(gòu)域(hEphA2-ECD)的Δact相隔兩周對(duì)ABalb/c小鼠(n＝3)進(jìn)行免疫。在最后一次免疫6天后將小鼠處以安樂死并收獲和聚集脾。為了進(jìn)行ELISPOT分析，用表達(dá)全長hEphA2的P815細(xì)胞或從這些細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解液在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行再刺激。P815母細(xì)胞或細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照。同樣用重組的hEphA2Fc融合蛋白刺激細(xì)胞。使用96孔斑點(diǎn)閱讀儀測(cè)量INF-γ陽性斑點(diǎn)形成群落(SFC)。如圖16中所示，在來自李斯特菌-hEphA2接種小鼠的脾細(xì)胞中觀察到INF-γSFC增加。表達(dá)hEphA2的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液的刺激導(dǎo)致IFN-γSFC增加，這顯示了EphA2特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。用李斯特菌母細(xì)胞對(duì)照進(jìn)行接種的小鼠中的脾細(xì)胞沒有表現(xiàn)出IFN-γSFC增加。6.8.實(shí)施例8CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答均是hEphA2抗腫瘤效果最大化所必需的用2×105個(gè)CT26-hEphA2在第0天對(duì)Balb/c小鼠(n＝10)進(jìn)行靜脈內(nèi)接種。通過在第1天和第3天注射200μg抗CD4(ATCC雜交瘤GK1.5)或抗CD8(ATCC雜交瘤2.4-3)來去除CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞，這通過FACS分析來驗(yàn)證(數(shù)據(jù)未顯示)。隨后用0.1LD50表達(dá)hEphA2ICD的李斯特菌L461T在第4天對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)免疫并監(jiān)測(cè)其存活。如圖17所示，CD4+和CD8+去除組都沒有表現(xiàn)出在非T細(xì)胞去除動(dòng)物中觀察到的抗腫瘤應(yīng)答。數(shù)據(jù)概述如下表17表17上述數(shù)據(jù)說明了CD4+和CD8+T細(xì)胞在腫瘤生長的最佳抑制中是必需的。6.9.實(shí)施例9用表達(dá)人EphA2ICD的李斯特菌進(jìn)行治療性接種增強(qiáng)CD45+腫瘤浸潤在CT26-hEphA2腫瘤皮下接種后6天，用0.1LD50actA-李斯特菌對(duì)照或表達(dá)hEphA2的ECD或ICD的李斯特菌對(duì)Balb/c小鼠(n＝3)進(jìn)行免疫。在接種疫苗后9天，收獲腫瘤，并在10％中性緩沖福爾馬林中固定，包埋在石蠟中，以4μm切片。從腫瘤切片制備顯微鏡切片。將切片上的組織脫石蠟并如下重水合用二甲苯更換4次，每次5分鐘；用純酒精更換2次，每次5分鐘；用95％酒精更換1次，進(jìn)行5分鐘；用70％酒精更換1次，進(jìn)行5分鐘；用雙蒸水更換兩次。使用靶抗原回收(TAR)溶液(DakoCytomation，Carpinteria，CA)用生產(chǎn)商說明的改進(jìn)方案在BlackandDeckerRice蒸汽機(jī)上進(jìn)行蒸氣抗原回收。將切片置于預(yù)熱至僅低于沸騰溫度的TAR溶液中并放置20分鐘。隨后將切片從TAR溶液中取出并使其在室溫下冷卻20分鐘，在PBS分析緩沖液中沖洗兩次。用生物素化抗體對(duì)切片進(jìn)行染色，步驟如下將切片浸入3％的過氧化氫的甲醇溶液中10分鐘以將內(nèi)源過氧化物酶封閉，隨后進(jìn)行2次雙蒸水更換，每次5分鐘。將切片浸入5％牛血清白蛋白的1×Tris緩沖鹽溶液(含有0.01％Tween20)(TBST)中至少30分鐘。在將切片上過多的BSA溶液去除后，以組織為中心制造“池”，將切片平放在潮濕的箱內(nèi)并提供在1％BSA/TBST溶液中以1∶100稀釋的生物素化大鼠抗小鼠CD45/B220(Pharmingen)。將切片小心地平放在潮濕的箱內(nèi)室溫下過夜，以防止組織切片干燥。次日早晨，用TBST洗滌切片2次，第二次持續(xù)10分鐘。使用與鏈霉生物素偶聯(lián)的HRP或AP，在室溫下放置30分鐘。用TBST洗滌切片2次，用合適的底物色原(對(duì)Strep-HRP，使用DAB)顯色。在用雙蒸水洗滌后，通過將切片浸入染料中2分鐘，用Mayers蘇木精對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。隨后用流動(dòng)的自來水沖洗切片直至水變清，將切片浸入漂白試劑(Scotts取代自來水)中30秒，并在自來水中再次洗滌。切片在梯度酒精中通過二甲苯(或二甲苯取代物)重水合并透明，洗滌步驟如下95％酒精1分鐘，3次更換純酒精，每次1分鐘，并4次更換二甲苯，每次1分鐘。將封片膠加在蓋玻片上(對(duì)于二甲苯，使用DPX封片膠)且在觀察前將切片過夜干燥。在尼康EclipseE400上觀察切片且用尼康數(shù)碼相機(jī)獲取圖片(圖18A)。將數(shù)據(jù)根據(jù)腫瘤體積標(biāo)準(zhǔn)化(圖18B)。結(jié)果證實(shí)在治療性接種后腫瘤相關(guān)的浸潤性淋巴細(xì)胞增加了。7.等價(jià)物通過使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠明白許多在此所描述的本發(fā)明的特定實(shí)施方案的等價(jià)物。這些等價(jià)物傾向于包含在以下權(quán)利要求中。在本說明書中提及的所有公開、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖艘韵嗤潭葏⒖家弥帘菊f明書中，如同各個(gè)獨(dú)立的公開、專利或?qū)＠暾?qǐng)被專門且獨(dú)立地被參考引用一樣。序列表序列表<110>醫(yī)學(xué)免疫公司塞萊斯有限公司<120>基于李斯特菌的EphA2疫苗<130>10271-146<150>US60/511,919<151>2003-10-15<150>US60/511,719<151>2003-10-15<150>US60/532,666<151>2003-12-24<150>US60/556,631<151>2004-03-26<150>60/615,470<151>2004-10-01<150>60/617,544<151>2004-10-07<160>72<170>PatentInversion3.2<210>1<211>3963<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(138)..(3068)<400>1attaaggactcggggcaggaggggcagaagttgcgcgcaggccggcgggcgggagcggac60accgaggccggcgtgcaggcgtgcgggtgtgcgggagccgggctcggggggatcggaccg120agagcgagaagcgcggcatggagctccaggcagcccgcgcctgcttcgcc170MetGluLeuGlnAlaAlaArgAlaCysPheAla1510ctgctgtggggctgtgcgctggccgcggccgcggcggcgcagggcaag218LeuLeuTrpGlyCysAlaLeuAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlnGlyLys152025gaagtggtactgctggactttgctgcagctggaggggagctcggctgg266GluValValLeuLeuAspPheAlaAlaAlaGlyGlyGluLeuGlyTrp303540ctcacacacccgtatggcaaagggtgggacctgatgcagaacatcatg314LeuThrHisProTyrGlyLysGlyTrpAspLeuMetGlnAsnIleMet455055aatgacatgccgatctacatgtactccgtgtgcaacgtgatgtctggc362AsnAspMetProIleTyrMetTyrSerValCysAsnValMetSerGly60657075gaccaggacaactggctccgcaccaactgggtgtaccgaggagaggct410AspGlnAspAsnTrpLeuArgThrAsnTrpValTyrArgGlyGluAla808590gagcgtatcttcattgagctcaagtttactgtacgtgactgcaacagc458GluArgIlePheIleGluLeuLysPheThrValArgAspCysAsnSer95100105ttccctggtggcgccagctcctgcaaggagactttcaacctctactat506PheproGlyGlyAlaSerSerCysLysGluThrPheAsnLeuTyrTyr110115120gccgagtcggacctggactacggcaccaacttccagaagcgcctgttc554AlaGluSerAspLeuAspTyrGlyThrAsnPheGlnLysArgLeuPhe125130135accaagattgacaccattgcgcccgatgagatcaccgtcagcagcgac602ThrLysIleAspThrIleAlaproAspGluIleThrValSerSerAsp140145150155ttcgaggcacgccacgtgaagctgaacgtggaggagcgctccgtgggg650PheGluAlaArgHisValLysLeuAsnValGluGluArgSerValGly160165170ccg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李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>44MetLysLysIleMetLeuValpheIleThrLeuIleLauValSerLeu151015ProIleAlaGlnGlnThrGluAlaLysAsp2025<210>45<211>59<212>PRT<213>單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>45MetThrAspLysLysSerGluAsnGlnThrGluLysThrGluThrLys151015GluAsnLysGlyMetThrArgArgGluMetLeuLysLeuSerAlaVal202530AlaGlyThrGlyIleAlaValGlyAlaThrGlyLeuGlyThrIleLeu354045AsnValValAspGlnValAspLysAlaLeuThr5055<210>46<211>53<212>PRT<213>Bacillussubtillus<400>46MetAlaTyrAspSerArgPheAspGluTrpValGlnLysLeuLysGlu151015GluSerPheGlnAsnAsnThrpheAspArgArgLysPheIleGlnGly202530AlaGlyLysIleAlaGlyLeuSerLeuGlyLeuThrIleAlaGlnSer354045ValGlyAlaPheGly50<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>47gtcaaaacatacgctcttatc21<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>48acataatcagtccaaagtagatgc24<210>49<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>49ctctggtacctcctttgattagtatattc29<210>50<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>50ctctggatccatccgcgtgtttcttttcg29<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述單抗原決定簇插入物<400>51gattataaagatgatgatgataaa24<210>52<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述單抗原決定簇<400>52AspTyrLysAspAspAspAspLys15<210>53<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述單抗原決定簇插入物<400>53gaacaaaaattaattagtgaagaagattta30<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述單抗原決定簇<400>54GluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeu1510<210>55<211>9<212>PRT<213>Mussp.<400>55SerProSerTyrValTyrHisGlnPhe15<210>56<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述單抗原決定簇<400>56SerProSerTyrAlaTyrHisGlnPhe15<210>57<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>57ctctggtacctcctttgattagtatattc29<210>58<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>58caatggatccctcgagatcataatttacttcatccc36<210>59<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>59atttctcgagtccatggggggttctcatcatc32<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>60ggtgctcgagtgcggccgcaagctt25<210>61<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>61cgattcccctagttatgtttaccaccaatttgctgca37<210>62<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>62gcaaattggtggtaaacataactaggggaat31<210>63<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述單抗原決定簇插入物<400>63agtccaagttatgcatatcatcaattt27<210>64<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>64cgatagtccaagttatgcatatcatcaatttgc33<210>65<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>65gtcgcaaattgatgatatgcataacttggactat34<210>66<211>8<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述共有序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>nisa，c，g，oru<400>66naggaggu8<210>67<211>19<212>DNA<213>單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>67aaggagagtgaaacccatg19<210>68<211>240<212>DNA<213>單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>68ggtacctcctttgattagtatattcctatcttaaagtgacttttatgttgaggcattaac60atttgttaacgacgataaagggacagcaggactagaataaagctataaagcaagcatata120atattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggg180gtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatg240<210>69<211>240<212>DNA<213>單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>69ggtacctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaac60atttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatata120atattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggg180gtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatg240<210>70<2ll>5<212>PRT<213>單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>70ThrGluAlaLysAsp15<210>71<211>5<212>PRT<213>單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)<400>71AspLysAlaLeuThr15<210>72<211>5<212>PRT<213>Bacillussubtillus<400>72ValGlyAlaPheGly1權(quán)利要求1.在個(gè)體內(nèi)引發(fā)對(duì)抗EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包含向個(gè)體用有效量的組合物給藥以引發(fā)對(duì)抗EphA2表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，該組合物包含表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的李斯特菌是單核增生李斯特菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其中所述的李斯特菌是減毒的。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中編碼EphA2抗原性肽的核酸包含編碼分泌信號(hào)的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼EphA2抗原性肽的序列操作性連接。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的個(gè)體患有癌癥。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的癌癥是上皮細(xì)胞源的。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的癌癥是T細(xì)胞源的。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的癌癥是皮膚癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌，或是腎細(xì)胞癌或黑素瘤。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的癌癥是白血病或淋巴瘤。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的個(gè)體患有非腫瘤性過量增殖性病癥。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的過量增殖性病癥是上皮細(xì)胞疾病。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的過量增殖性病癥是哮喘、慢性肺阻塞病、肺纖維化、支氣管過度反應(yīng)、牛皮癬和脂溢性皮炎。13.治療患有EphA2表達(dá)細(xì)胞過量增殖性疾病的人個(gè)體的方法，所述方法包括向該個(gè)體用有效量的組合物給藥以治療EphA2表達(dá)細(xì)胞過量增殖性病癥，該該組合物包含表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的李斯特菌是單核增生李斯特菌。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的個(gè)體患有癌癥。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的癌癥是上皮細(xì)胞源的。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的癌癥是內(nèi)皮細(xì)胞源的。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的癌癥是T細(xì)胞源的。19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的癌癥包含相對(duì)于非癌細(xì)胞過量表達(dá)EphA2的細(xì)胞，該非癌細(xì)胞具有所述癌細(xì)胞的組織類型。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的癌癥是皮膚癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌或胰腺癌，或是腎細(xì)胞癌或黑素瘤。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的癌癥是白血病或淋巴瘤。22.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的個(gè)體患有非腫瘤性過量增殖性病癥。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的過量增殖性病癥是上皮細(xì)胞疾病。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的過量增殖性病癥是哮喘、慢性肺阻塞病、肺纖維化、支氣管過度反應(yīng)、牛皮癬和脂溢性皮炎。25.根據(jù)權(quán)利要求1或13所述的方法，其中所述的EphA2多肽包含全長EphA2。26.根據(jù)權(quán)利要求1和13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的EphA2多肽包含EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域。27.根據(jù)權(quán)利要求1和13任一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的EphA2多肽是嵌合多肽，該嵌合多肽包含EphA2的至少抗原性部分和第二多肽。28.根據(jù)權(quán)利要求1或13所述的方法，其中所述的組合物包含多種表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。29.根據(jù)權(quán)利要求1或13所述的方法，其中所述的表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌表達(dá)多種EphA2抗原性肽。30.根據(jù)權(quán)利要求1和13任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包含給予額外的抗癌治療。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的額外的抗癌治療是激動(dòng)性EphA2抗體。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的額外的抗癌治療是激動(dòng)性EphA2抗體的抗獨(dú)特型抗體。33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的額外的抗癌治療是化療、生物學(xué)治療、免疫治療、放療、激素治療或手術(shù)。34.根據(jù)權(quán)利要求1和13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的給藥是粘膜、腸胃外、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或口服給藥。35.根據(jù)權(quán)利要求1或13所述的方法，其中所述的給藥引發(fā)CD4+-T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+-T細(xì)胞應(yīng)答、先天性免疫應(yīng)答、抗體應(yīng)答、或一種或多種前述應(yīng)答的組合。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的給藥引發(fā)CD4+-T細(xì)胞應(yīng)答和CD8+-T細(xì)胞應(yīng)答。37.治療患有與異常血管發(fā)生有關(guān)的疾病的人個(gè)體的方法，所述方法包括向個(gè)體用有效量的組合物給藥以治療與異常血管發(fā)生有關(guān)的疾病，該組合物包含表達(dá)EphA2抗原性肽的李斯特菌。38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的個(gè)體患有與異常血管發(fā)生有關(guān)的疾病。39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述的疾病是黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、血管再狹窄、嬰兒血管瘤、尋常疣、牛皮癬、卡波西氏肉瘤、神經(jīng)線纖維瘤、隱性萎縮型水泡上皮解離癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、系統(tǒng)性狼瘡、干癬性關(guān)節(jié)病變、萊特氏癥候群和舍格倫氏癥候群、子宮內(nèi)膜異位、孕期子癇前癥、動(dòng)脈硬化癥和冠狀動(dòng)脈疾病。全文摘要本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)用于治療、控制或預(yù)防癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性癌癥和T細(xì)胞源的癌癥，以及與EphA2表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的過量增殖性疾病的方法和組合物。本發(fā)明的方法包含基于李斯特菌的EphA2疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了包含一種或多種本發(fā)明的基于李斯特菌的疫苗的藥物組合物，該疫苗獨(dú)立地或與一種或多種用于治療癌癥的其它試劑組合，在本發(fā)明的某些方面，本方法包含引發(fā)對(duì)抗EphA2和/或EphA2表達(dá)細(xì)胞的CD文檔編號(hào)C07K1/10GK1893972SQ200480037155公開日2007年1月10日申請(qǐng)日期2004年10月15日優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日發(fā)明者邁克爾·S·金奇,彼得·A·基內(nèi)爾,伊利莎白·布洛克海默,小湯姆斯·W·杜賓斯基,大衛(wèi)·N·庫克申請(qǐng)人:醫(yī)學(xué)免疫公司,塞萊斯有限公司

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基于李斯特菌的EphA2疫苗的制作方法