專利名稱：通過(guò)靶定暴露在細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞上的內(nèi)部抗原殺死腫瘤細(xì)胞的方法
背景技術(shù)：
細(xì)胞生長(zhǎng)是受到精密調(diào)節(jié)的過(guò)程，其應(yīng)答身體的特定需要。偶然地，指揮細(xì)胞分裂規(guī)則的復(fù)雜的、并且高度調(diào)節(jié)的控制損壞。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始獨(dú)立于它的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和分裂，導(dǎo)致通常稱作癌癥的疾病。實(shí)際上，癌癥是年齡25-44歲的美國(guó)人中死亡的第二位主要原因。
當(dāng)前的癌癥療法包括化學(xué)療法和放射療法?；瘜W(xué)治療藥物主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺死癌細(xì)胞(Fisher，D.E.，Cell 78539-542(1994)；Fung，C.Y.，and D.E.Fisher，J.Clin.Oncol.13801-807(1995)；Lowe，S.W.，et al.，Cell 74957-967(1993))。放射療法通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和通過(guò)其他機(jī)制殺死癌細(xì)胞。然而，化學(xué)療法和放射療法不殺死給定腫瘤中的所有細(xì)胞，并且從此類治療幸存的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。從而，這些治療對(duì)于消滅整個(gè)腫瘤通常是不夠的。因此，需要用于治療癌癥的改進(jìn)治療方法。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了癌癥的免疫治療策略，其使用抗體靶定腫瘤細(xì)胞中差別表達(dá)的表面膜標(biāo)記(例如，美國(guó)專利號(hào)5,770,195，“MonoclonalAntibodies to the HER2 Receptor”，F(xiàn)iledMay 23，1995；Issued，Jun.23，1998)。然而，在腫瘤中差別表達(dá)的許多抗原不暴露于腫瘤細(xì)胞的表面上。結(jié)果，此類細(xì)胞內(nèi)抗原不適于作為基于抗體的治療劑的靶標(biāo)。因此，需要用于治療癌癥的免疫治療方法的額外靶標(biāo)。
發(fā)明概述
殺死癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法，和使用有效量的抗體綴合物或者抗體復(fù)合物殺死癌細(xì)胞的方法，所述抗體綴合物或者抗體復(fù)合物結(jié)合在癌細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)但是在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上暴露的癌相關(guān)抗原。安排細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法和抗體綴合物或者抗體復(fù)合物的施用的時(shí)間使得抗體達(dá)到癌細(xì)胞時(shí)正在或者已經(jīng)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌相關(guān)抗原是異戊二烯化的蛋白質(zhì)，其盡管通常在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但是在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上暴露。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，異戊二烯化的蛋白質(zhì)是C35抗原。所述抗體綴合到或者與毒素復(fù)合，其確保所述抗體結(jié)合的細(xì)胞將被殺死，和/或暴露于毒素的周圍癌細(xì)胞被殺死。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒素是放射性同位素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及施用化學(xué)治療劑，同時(shí)或者然后施用綴合到放射性試劑的抗體或者其片段或變體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及施用不綴合到毒素或者不與毒素復(fù)合的抗體，并且結(jié)合該抗體的細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行，并且可以用作患者，包括哺乳動(dòng)物，如人中的治療方法。
針對(duì)C35的抗體和使用C35抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還提供了結(jié)合C35多肽的抗體。本發(fā)明包括抗體(包括包含或者備選地由抗體片段或其變體組成的分子)，所述抗體免疫特異地結(jié)合C35多肽或者C35多肽的多肽片段或變體，如SEQ ID NO2的C35多肽。
本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了免疫特異地結(jié)合一種或多種C35多肽(例如，SEQ ID NO2)的小鼠和人抗體和編碼來(lái)自這些抗體的VH和VL區(qū)的多核苷酸。從而，本發(fā)明包括這些多核苷酸，包括在SEQ ID NO56、58和60中給出和在下面的表2和3中列出的那些多核苷酸，其在表2和3中所列的日期保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)并且給予表2和3中表示的ATCC保藏號(hào)。ATCC位于10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行ATCC保藏。
本發(fā)明還包括編碼免疫特異結(jié)合一種或多種C35多肽(例如，SEQID NO2)的VH和VL區(qū)的保藏的多核苷酸克隆，包含保藏的多核苷酸的細(xì)胞，包含所保藏的多核苷酸編碼的VH和/或VL區(qū)的抗體，編碼此類抗體的多核苷酸，和包含此類多核苷酸的細(xì)胞。本發(fā)明還包括包含SEQ ID NO56、58和60的多核苷酸的細(xì)胞，包含SEQ ID NO56、58和60編碼的VH和/或VL區(qū)的抗體，編碼此類抗體的多核苷酸，和包含此類多核苷酸的細(xì)胞。此類抗體可以有或者沒(méi)有與包含保藏的多核苷酸編碼的VH和VL區(qū)的最初抗體相同的表位特異性，并且可以有或者沒(méi)有與最初抗體的親和性相同或者更高的親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合代表天然C35序列的殘基105到115的表位。
此外，本發(fā)明包含抗體，其包含或者備選地由這些抗體的片段或變體(例如，scFv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、微型抗體(minibody)、重鏈、VH區(qū)、VH CDR(互補(bǔ)決定區(qū))、輕鏈、VL區(qū)或者VL CDR)組成，所述片段或變體具有本發(fā)明的多核苷酸編碼的VH、VH CDRs、VLs、VL CDRs之一的氨基酸序列。此類抗體可以有或者沒(méi)有與包含所保藏的多核苷酸編碼的VH和VL區(qū)的最初抗體相同的表位特異性，并且可以有或者沒(méi)有與最初抗體對(duì)C35的親和性相同或者更高的親和性。
本發(fā)明還提供了結(jié)合一種或多種C35多肽的抗體或者其片段或變體，并且其偶聯(lián)到可檢測(cè)的標(biāo)記，如酶、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、或者生物發(fā)光標(biāo)記。本發(fā)明還提供了抗體或者其片段或變體，其結(jié)合一種或多種C35多肽，并且偶聯(lián)到治療劑或毒素，例如，放射性物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)到放射性同位素。
本發(fā)明還提供了通常分離的、編碼本發(fā)明的抗體(包括分子，如scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、VH區(qū)或者VL區(qū)，其包含，或者備選地由抗體片段或其變體組成)的核酸分子。本發(fā)明還提供了用編碼本發(fā)明的抗體(包括分子，如scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、VH區(qū)或者VL區(qū)，其包含，或者備選地由抗體片段或其變體組成)的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和其后代。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗體(包括包含或者備選地由抗體片段或其變體組成的分子)的方法。本發(fā)明還提供了從核酸分子表達(dá)本發(fā)明的抗體(包括包含或者備選地由抗體片段或其變體組成的分子)的方法。
本發(fā)明涉及治療癌癥的方法和組合物，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用有效量的免疫結(jié)合C35多肽或其片段或變體的一種或多種抗體或其片段或變體，或相關(guān)分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤的基于抗體的方法和組合物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療癌癥的組合療法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用有效量的化學(xué)治療劑和有效量的綴合到毒素，例如，放射性物質(zhì)的一種或多種抗體，其片段或變體。
本發(fā)明還包括用于檢測(cè)、診斷或預(yù)后癌癥的方法和組合物，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用有效量的免疫特異結(jié)合C35或者其片段或變體的一種或多種抗體或其片段或變體，或者相關(guān)分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、診斷或預(yù)后乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤的基于抗體的方法和組合物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括本發(fā)明的抗體的用途，用作監(jiān)視C35在癌癥中的表達(dá)的診斷工具。在某些實(shí)施方案中，該方法還可以用作證實(shí)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方案的功效的診斷方法。
在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的這些和其他方法。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了在表達(dá)C35腫瘤抗原的21MT1乳腺腫瘤細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡后乳腺腫瘤細(xì)胞的C35表面染色。圖1A顯示了未處理的活細(xì)胞(PI陰性的)，其不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性的)，不在表面膜上表達(dá)C35，如通過(guò)用抗-C35抗體和同種型對(duì)照抗體的差別染色的不存在所證實(shí)。圖1B類似地表明保持存活(PI陰性的)并且沒(méi)有誘導(dǎo)以經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性的)的經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞也不在腫瘤細(xì)胞表面膜上表達(dá)C35。相比，圖1C表明存活(PI陰性的)但是經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的)的經(jīng)輻射的腫瘤細(xì)胞與同種型對(duì)照抗體相比用抗-C35抗體清楚地差別染色。
圖2顯示了絲裂霉素C藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡后乳腺腫瘤細(xì)胞的C35表面染色。圖2A顯示了未處理的活細(xì)胞(PI陰性的)，其不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性的)，不在表面膜上表達(dá)C35，如通過(guò)用抗-C35抗體和同種型對(duì)照抗體的差別染色的不存在所證實(shí)。圖2B類似地表明保持存活(PI陰性的)并且還沒(méi)有誘導(dǎo)以經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性的)的絲裂霉素C處理的腫瘤細(xì)胞也不在腫瘤細(xì)胞表面膜上表達(dá)C35。相比，圖2C表明絲裂霉素C處理的腫瘤細(xì)胞是存活的(PI陰性的)，但是經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的)，與同種型對(duì)照抗體相比，所述腫瘤細(xì)胞用抗-C35抗體清楚地差別染色。
圖3A-3C表明TaxolTM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞的表面上C35的暴露。用0.5uM TaxolTM處理后24小時(shí)，將21MT1腫瘤細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-FITC、碘化丙錠，和用100ng抗-C35抗體1F2(黑色線)或者同種型對(duì)照(灰色填充)抗體染色。兩種抗體都直接綴合到Alexa-647。對(duì)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的/PI陰性的)選通(gated)直方圖。將抗體與PAB緩沖液(圖3A)、10倍摩爾過(guò)量的重組C35蛋白(圖3B)，或者100倍摩爾過(guò)量的β-半乳糖苷酶蛋白質(zhì)(圖3C)預(yù)孵育。
圖4表明抗-C35單克隆抗體局部定位到C35+腫瘤的壞死區(qū)中。在BALB/c小鼠的相反側(cè)腹植入用或者沒(méi)有用人C35轉(zhuǎn)染的同系基因的非小細(xì)胞肺癌衍生系1腫瘤細(xì)胞。通過(guò)用抗-C35抗體免疫組化染色證實(shí)C35蛋白質(zhì)表達(dá)。14天體內(nèi)生長(zhǎng)后，動(dòng)物接受靜脈內(nèi)注射125I標(biāo)記的抗-C35抗體。注射放射標(biāo)記的抗體后120天處死小鼠并通過(guò)將腫瘤切片對(duì)膠片曝光測(cè)定C35-陽(yáng)性和C35-陰性腫瘤中抗-C35抗體的濃度。圖4A表明放射標(biāo)記的抗-C35抗體僅在C35-陽(yáng)性而不在C-35陰性腫瘤中濃集。圖4B和4C比較了腫瘤內(nèi)完整細(xì)胞的標(biāo)記分布和H&E染色，證實(shí)在這些條件下，經(jīng)標(biāo)記的抗-C35抗體在C35-陽(yáng)性腫瘤的壞死區(qū)中特異濃集。
圖5顯示了在用Colau.C35腫瘤細(xì)胞移植的Swiss裸小鼠中用131I-標(biāo)記的1B3抗-C35鼠單克隆抗體的放射免疫療法和化學(xué)療法(氟尿嘧啶，150mg/kg；亞葉酸，100mg/kg)的組合對(duì)腫瘤體積的影響。在腫瘤移植后11天啟動(dòng)化學(xué)療法并在第14天施用300μCi 131I-標(biāo)記的1B3抗-C35抗體。跟蹤腫瘤生長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)8周。
圖6顯示了化學(xué)療法和放射免疫療法的組合模式治療對(duì)腫瘤體積的影響。在第0天用Colau.C35細(xì)胞移植Swiss裸小鼠?；瘜W(xué)療法在第15和18天以2mg/kg靜脈內(nèi)施用順鉑；在第18天以180/120mg/kg靜脈內(nèi)施用5FU/LV。放射免疫療法在第21天施用300μCi(～50μg)131I-標(biāo)記的鼠1B3抗-C35IgG。
圖7顯示了在天然表達(dá)的和C35-轉(zhuǎn)染的人乳腺和結(jié)腸腫瘤中的等同表達(dá)。用Alexa-647綴合的抗-C35MAb 1F2或者同種型對(duì)照對(duì)細(xì)胞染色。MFI X是1F2的平均熒光強(qiáng)度/同種型對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度的比值。來(lái)自正常乳腺上皮的H16N2和乳腺腫瘤MDAMB231，和結(jié)腸腫瘤Colau表達(dá)低基礎(chǔ)水平的C35。來(lái)自乳腺癌的21MT1天然表達(dá)高水平的C35。用空載體(null)或者人C35重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Colau和MDA231。所有腫瘤都在體內(nèi)生長(zhǎng)，切除腫瘤，將其解離并染色。
圖8顯示了通過(guò)體重減輕確定的在Swiss裸小鼠中化學(xué)療法、放射免疫療法和組合療法的毒性。
圖9顯示了用Lys-C內(nèi)切蛋白酶完全消化6x His-標(biāo)記的重組人C35(rhC35)后預(yù)期的肽片段。顯示了rhC35的完整序列，包括氨基末端6xHis標(biāo)記。相對(duì)于天然人C35序列的氨基末端甲硫氨酸(粗體M)編號(hào)氨基酸位置。第一個(gè)和第三個(gè)賴氨酸(K)殘基的星號(hào)指出這些位置的消化是無(wú)效的，并且可能產(chǎn)生一些更長(zhǎng)的片段。
圖10顯示了蛋白質(zhì)印跡的1B3(Mab11)或者1F2和抗6x His標(biāo)記染色的比較，指出每種抗體結(jié)合的C35片段。
圖11表明MAb 165是C35特異的。將141D10重組痘苗病毒與UH8重組痘苗病毒共轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。通過(guò)ELISA測(cè)試所得分泌的抗體對(duì)C35或者對(duì)照蛋白質(zhì)A27L(痘苗病毒蛋白質(zhì))的結(jié)合。
發(fā)明詳述
概述
許多研究已經(jīng)描述了經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的表面膜中的改變。如磷脂酰絲氨酸暴露于表面膜的外部小葉上反映的，這些改變中突出的是磷脂不對(duì)稱的早期消失。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)該表面膜組分的改變促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡細(xì)胞的識(shí)別和去除(Fadok，V.A.，et al.，J.Immunol.1482207-2216(1992))。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一般性方法，其允許通過(guò)抗凝劑膜聯(lián)蛋白V與暴露的磷脂酰絲氨酸分子的結(jié)合檢測(cè)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞(Koopman，G.，et al.，Blood 841415-1420(1994))。
更重要的是在細(xì)胞凋亡細(xì)胞中其他表面膜分子，尤其蛋白質(zhì)的表達(dá)和暴露可能改變。許多報(bào)導(dǎo)已經(jīng)描述了似乎在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞凋亡特異蛋白質(zhì)(Grand，R.J.A.，et al.，Exp.Cell Res.218439-451(1995)；U.S.Patent number5,972,622，“Method of DetectingApoptosis Using an Anti-Human GP46 Monoclonal Antibody”，F(xiàn)iledFeb.6，1997；Issued，Oct.26，1999)。更直接的相關(guān)性是一種單克隆抗體的報(bào)導(dǎo)，所述抗體檢測(cè)38kD蛋白質(zhì)抗原，該抗原與細(xì)胞凋亡細(xì)胞的表面膜和線粒體膜結(jié)合但是在正常細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)5,935,801，“Monoclonal Antibody that Detects ApoptoticAntigen”，F(xiàn)iledMar.29，1996；Issued，Aug.10，1999)中檢測(cè)不到。已經(jīng)描述了在細(xì)胞凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞的表面上或接近表面(Casciola-Rosen，L.A.，et al.，J.Exp.Med.1791317-1330(1994))和在胚胎發(fā)育期間經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中(Rotello，R.J.，etal.，Development 120；1421-1431(1994))差別暴露的其他抗原。已經(jīng)描述了三種確定的蛋白質(zhì)抗原CD3、CD69和CD25在細(xì)胞凋亡的胸腺細(xì)胞的表面膜上上調(diào)(Kishimoto，H.，et al.，J.Exp.Med.181649-655(1995))。在每種情況中，這些是正常細(xì)胞和組織中細(xì)胞凋亡的表面標(biāo)記。盡管相同標(biāo)記也可以與經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，但是它們不能將細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞與作為正常組織更新的一部分的正經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的正常細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此，它們將不能用作治療癌癥的靶標(biāo)。
本發(fā)明已經(jīng)確定存在細(xì)胞內(nèi)腫瘤特異的或者腫瘤相關(guān)抗原的子集，所述抗原在化學(xué)療法或者放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的條件下在腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)并可以是用于將抗體綴合的放射性同位素或者毒素濃集在腫瘤內(nèi)的有效靶標(biāo)。使用針對(duì)此類抗原的方法尤其有效，因?yàn)樗鼈兛梢栽鰪?qiáng)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性化學(xué)療法和放射療法在治療癌癥中的治療益處。本發(fā)明將與內(nèi)部細(xì)胞膜結(jié)合的腫瘤特異抗原-具體地，差別表達(dá)的分子，如表達(dá)異戊二烯化基序的C35癌癥特異抗原-鑒定為一類細(xì)胞內(nèi)腫瘤抗原，所述抗原暴露在已經(jīng)通過(guò)輻射和/或化學(xué)療法誘導(dǎo)而經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞的表面膜上。
本發(fā)明描述了與化學(xué)療法或者放射療法對(duì)細(xì)胞凋亡(優(yōu)選大規(guī)模細(xì)胞凋亡)的誘導(dǎo)結(jié)合作用以增強(qiáng)腫瘤根除的方法。它基于如下新的觀察在腫瘤細(xì)胞中差別表達(dá)的一類細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記在細(xì)胞凋亡細(xì)胞的表面上變得暴露，可以通過(guò)綴合毒性有效負(fù)荷的特異抗體靶定所述標(biāo)記。該治療方法的益處是多方面的。例如，該方法允許向腫瘤環(huán)境遞送毒性有效負(fù)荷，其可以破壞細(xì)胞凋亡靶標(biāo)附近中其他非細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞。此外，該方法可以防止已經(jīng)引起細(xì)胞凋亡過(guò)程(如通過(guò)表面膜成分的改變證實(shí))的其它存活細(xì)胞逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡發(fā)展和恢復(fù)生長(zhǎng)(Hammill，A.K.，et al.，Exp.Cell Res.25116-21(1999))。
針對(duì)細(xì)胞凋亡細(xì)胞的本發(fā)明將與針對(duì)壞死細(xì)胞的現(xiàn)有發(fā)明區(qū)別(美國(guó)專利號(hào)6,071,491，“Detection of Necrotic MalignantTissue and Associated Therapy”，F(xiàn)iledAug.9，1999；Issued，Jun.6，2000)。壞死導(dǎo)致向細(xì)胞外腫瘤環(huán)境釋放細(xì)胞內(nèi)含物。這些細(xì)胞內(nèi)抗原的一些在該環(huán)境中積累并且可以通過(guò)特異抗體靶定。然而，壞死與更大腫瘤的含氧量低的區(qū)域相關(guān)，因?yàn)椴淮嬖谘踝杂苫运龈蟮哪[瘤對(duì)放射療法和可能地放射免疫療法有相對(duì)抗性。盡管用化學(xué)治療劑治療后壞死存在一定增加(Desrues B.，et al.，Br.J.Cancer 721076-82，(1995))，但是化學(xué)治療劑的主要作用是增加細(xì)胞凋亡。因此，對(duì)于癌癥的免疫療法，尤其負(fù)責(zé)腫瘤擴(kuò)展的更小的腫瘤和微小轉(zhuǎn)移的根除，壞死是不如細(xì)胞凋亡的靶標(biāo)。從而，在根除小腫瘤和微小轉(zhuǎn)移中有效的方法特別可用于治療侵襲性癌癥。
本發(fā)明還應(yīng)該與專利申請(qǐng)公布號(hào)US 2002/0052308 A1(2002年5月2日)中的公開(kāi)內(nèi)容相區(qū)別，US 2002/0052308 A1公開(kāi)了842種癌癥抗原，包括具有與C35(SEQ ID NO2)的部分相同的大區(qū)域的抗原(SEQ ID NO966)。US 2002/0052308 A1一般性公開(kāi)了針對(duì)842種癌癥抗原的抗體“單獨(dú)或者與其他類型的治療(例如，放射療法、化學(xué)療法、激素療法、免疫療法和抗腫瘤劑)”組合施用，205頁(yè)，
段。然而，所述公布的申請(qǐng)沒(méi)有指出為了對(duì)C35相關(guān)的靶標(biāo)有效，應(yīng)該通過(guò)施用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，如化學(xué)療法、放射療法或者其他抗腫瘤劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后施用綴合毒素的C35-特異的抗體。實(shí)際上，針對(duì)與C35相比在腫瘤細(xì)胞表面膜上天然表達(dá)的抗原的組合化學(xué)療法和放射免疫療法的許多研究已經(jīng)斷定通過(guò)在化學(xué)治療前，即在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡前施用放射免疫治療抗體得到最佳結(jié)果(DeNardo S.J.，et al.Anticancer Res.184011-18，(1998)；Clarke K.，et al.，Clin.Cancer Res.63621-28，(2000)；Burke P.A.，Cancer941320-31(2002)；Stein，R.et al.，Cancer 9451-61(2002)；Odonnel R.T.，et al.，Prostate 5027-37(2002))。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致異戊二烯化并且與未治療的腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部膜結(jié)合的一類細(xì)胞內(nèi)抗原(包括C35)的細(xì)胞膜暴露這一發(fā)現(xiàn)使得本發(fā)明與眾不同。本發(fā)明教導(dǎo)，為了得到最佳效果，最好施用針對(duì)該類別的靶分子的放射免疫療法使得通過(guò)施用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡同時(shí)或者不久后，在腫瘤部位積累所述抗體。US 2002/0052308 A1沒(méi)有描述C35相關(guān)的癌抗原的亞細(xì)胞定位，也沒(méi)有描述應(yīng)該怎樣施用針對(duì)該抗原的抗體以得到治療效果。
殺死癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殺死癌細(xì)胞(在本文中也稱作腫瘤細(xì)胞)的方法，其包括首先施用有效量的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法(例如，化學(xué)治療劑和/或放射)，并隨后施用有效量的抗體綴合物或者抗體復(fù)合物，其結(jié)合在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)但是在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上暴露的癌相關(guān)抗原。如下述，所述抗體綴合到毒素或與毒素復(fù)合。毒素確保抗體結(jié)合的細(xì)胞將被殺死，和/或殺死也暴露于該毒素的周圍細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括組合使用化學(xué)療法和放射免疫療法。在本發(fā)明前，由于累積劑量限制性骨髓毒性，組合化學(xué)療法和放射免疫療法造成了問(wèn)題。本發(fā)明提供了此類組合療法的施用，其中化學(xué)療法導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗原向抗體的暴露。施用的最佳時(shí)間可以使用本文和實(shí)施例中描述的方法精確確定。
在另一實(shí)施方案中，所述方法涉及施用不綴合毒素或者不與毒素復(fù)合的抗體，并且結(jié)合所述抗體的細(xì)胞被殺死。在該實(shí)施方案中，毒素不必綴合到抗體或者與該抗體復(fù)合以殺死該抗體結(jié)合的細(xì)胞?？贵w自身的結(jié)合就殺死了細(xì)胞或確保細(xì)胞死亡。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選在多數(shù)或者幾乎所有癌細(xì)胞，例如，多數(shù)或者幾乎所有腫瘤或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法后，施用抗體、抗體綴合物或者抗體復(fù)合物的時(shí)間可以改變，然而，它必須在某個(gè)時(shí)間窗口內(nèi)，在該時(shí)間窗口內(nèi)腫瘤細(xì)胞正經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。從而，在某一時(shí)限內(nèi)施用抗體、綴合的抗體或者復(fù)合的抗體，在該時(shí)限期間已經(jīng)用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法(例如，化學(xué)治療劑和/或放射)治療的腫瘤細(xì)胞中正誘導(dǎo)或者正在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。化學(xué)治療劑通常在施用后24-72小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。針對(duì)癌相關(guān)抗原的抗體(例如，復(fù)合的或者綴合的抗體)通常在施用24-48小時(shí)后在腫瘤部位積累。完整抗體的積累通常比抗體片段需要更長(zhǎng)時(shí)間。因此，通常，應(yīng)該在本發(fā)明方法中施用化學(xué)治療劑(對(duì)于抗體片段)后0-48小時(shí)和化學(xué)治療劑(對(duì)于完整抗體)施用前24小時(shí)到24小時(shí)后施用針對(duì)癌癥相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體(例如，復(fù)合的和綴合的抗體)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在施用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性療法后0-6小時(shí)、或6-12小時(shí)、或6-24小時(shí)、或6-36小時(shí)、或6-48小時(shí)、或6-72小時(shí)、或6-96小時(shí)、或6-120小時(shí)、或12-24小時(shí)、或12-36小時(shí)、或12-48小時(shí)、或12-72小時(shí)、或12-96小時(shí)、或12-120小時(shí)、或24-36小時(shí)、或24-48小時(shí)、或24-72小時(shí)、或24-96小時(shí)、或24-120小時(shí)、或36-48小時(shí)、或36-72小時(shí)、或36-96小時(shí)、或36-120小時(shí)或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120小時(shí)施用所述抗體或綴合的或復(fù)合的抗體。在另一實(shí)施方案中，在施用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性療法前，例如，在施用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性療法前0-6小時(shí)、0-12、0-24、6-12、6-24、12-24、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小時(shí)、或者1小時(shí)前施用所述抗體(例如綴合的或者復(fù)合的抗體)。在另一實(shí)施方案中，所述抗體(例如綴合的或者復(fù)合的抗體)與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性療法同時(shí)施用。
下面討論用于本發(fā)明方法的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法?！澳[瘤”、“癌”或者“過(guò)度增殖性疾病”是指所有惡性或良性的瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，包括所有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織和所有癌性細(xì)胞和組織。
癌癥的實(shí)例包括，但不限于，癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴惡性腫瘤。此類癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌，包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或者子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門(mén)癌、陰莖癌，以及頭頸癌。癌癥的其他實(shí)例在下面的“過(guò)度增殖性疾病”中列出。
“周圍”癌細(xì)胞是指足夠接近而可以通過(guò)綴合到抗體或者與抗體復(fù)合的毒素殺死的癌細(xì)胞。
本發(fā)明的方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行，并且可以用作患者，包括哺乳動(dòng)物，如人類中的治療方法。
癌相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)抗原
本發(fā)明的方法涉及在某個(gè)時(shí)間施用針對(duì)癌相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體(例如，復(fù)合的或者綴合的抗體)，使得通過(guò)施用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡期間或者之后，所述抗體在癌部位積累。
術(shù)語(yǔ)“抗原”和“表位”是本領(lǐng)域公知的并且指免疫系統(tǒng)的組分特異識(shí)別的大分子的部分，免疫系統(tǒng)的組分例如為抗體或者T細(xì)胞抗原受體。術(shù)語(yǔ)表位包括能夠特異結(jié)合免疫球蛋白的任意蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面簇諸如氨基酸或糖側(cè)鏈組成并且通常具有特異三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定電荷特征。
“癌相關(guān)抗原”或者“腫瘤相關(guān)抗原”是指相對(duì)于來(lái)自相同細(xì)胞類型的非癌性細(xì)胞或者來(lái)自相同組織的非癌性細(xì)胞，由癌細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的抗原。癌相關(guān)抗原可以不是僅由癌細(xì)胞表達(dá)(即，其他正常細(xì)胞仍然可以表達(dá)這些抗原)。然而，癌相關(guān)抗原的表達(dá)通?？偸窃谝环N或多種特定類型的癌癥中受到上調(diào)。癌相關(guān)抗原為可以在具有特定類型癌癥的動(dòng)物中引起特異免疫應(yīng)答的抗原，優(yōu)選蛋白質(zhì)，從而包括癌相關(guān)抗原和癌相關(guān)抗原的片段。所述術(shù)語(yǔ)不僅包括完整的腫瘤相關(guān)抗原，而且包括其包含表位的部分(片段)。腫瘤相關(guān)抗原(TAA)可以是在自然中發(fā)現(xiàn)的TAA，或者可以是在自然中發(fā)現(xiàn)的TAA的合成形式，或者可以是天然發(fā)生的TAA的變體，例如，具有增強(qiáng)的免疫原性性質(zhì)的變體。
許多癌相關(guān)抗原是本領(lǐng)域已知的，并且用于確定新近鑒定的基因或者蛋白質(zhì)是否與一種類型的癌癥或腫瘤相關(guān)的常規(guī)方法是已知的。此類方法包括RNA印跡分析、差別展示、SAGE、二維蛋白質(zhì)凝膠電泳或者串聯(lián)質(zhì)譜法、DNA印跡分析和其他方法，這些方法用于檢測(cè)與來(lái)自癌癥或者腫瘤來(lái)源的組織的正常(非癌性或者非轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞相比，或者與來(lái)自其他組織的正常細(xì)胞相比，來(lái)自特定類型癌癥或腫瘤的癌細(xì)胞中mRNA或者蛋白質(zhì)表達(dá)或特異基因擴(kuò)增的增加的水平。其他方法包括通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法分析與MHC分子結(jié)合的差別表達(dá)的肽(腫瘤相對(duì)于正常細(xì)胞)。
“細(xì)胞內(nèi)的”癌相關(guān)抗原是指在不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞(癌性或者轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的細(xì)胞內(nèi)膜上表達(dá)的癌相關(guān)抗原。其上可以表達(dá)“細(xì)胞內(nèi)的”癌相關(guān)抗原的內(nèi)部膜包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、其他細(xì)胞膜結(jié)合的小泡，包括內(nèi)體和溶酶體小泡、線粒體膜，和核膜。優(yōu)選的“內(nèi)部表達(dá)的”癌相關(guān)抗原包括在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或內(nèi)體或溶酶體小泡的膜上表達(dá)的異戊二烯化蛋白質(zhì)。異戊二烯化的癌相關(guān)抗原的實(shí)例在表1中列出。異戊二烯化的癌相關(guān)抗原還可以排除C35或者表1中列出的任意個(gè)體蛋白質(zhì)，或者它們的組合。例如，異戊二烯化的癌相關(guān)蛋白質(zhì)可以排除CENP-F動(dòng)粒蛋白、CAAX盒蛋白1、DnaJ同系物亞家族A成員1或者2，或者鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亞基。
對(duì)于新鑒定的癌相關(guān)抗原，例如，癌相關(guān)的蛋白質(zhì)，確定它是否異戊二烯化的常規(guī)方法包括在該基因/蛋白質(zhì)序列的3’末端尋找對(duì)應(yīng)于異戊二烯化基序的核苷酸串。許多真核蛋白質(zhì)通過(guò)在半胱氨酸殘基附著法呢基或者牻牛兒基-牻牛兒基進(jìn)行翻譯后修飾(Glomset，J.A.，et al.，Trends Biochem.Sci.15139-142(1990)；Lowy，D.R.，andWillumsen，B.M.，Nature 341384-385(1989)；Imagee，A.I.，Biochem.Soc.Trans.17875-876(1989)；Powers，S.，Curr.Biol.1114-116(1991))。修飾發(fā)生在與C-最末端相距3個(gè)殘基的半胱氨酸殘基上；將該半胱氨酸與C-末端殘基分開(kāi)的兩個(gè)殘基通常是脂族的(Ali)。該Cys-Ali-Ali-X模式通常稱作CAAX盒。脂族氨基酸包括異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸。C35的最后四個(gè)氨基酸是CVIL。末端位置的亮氨酸表明這是異戊烯轉(zhuǎn)移酶GGTase I的底物，所述酶導(dǎo)致加入牻牛兒基-牻牛兒基(Moomaw and Casey，J.Biol.Chem.267，17438-17443(1992))。
從而，本發(fā)明的方法還提供了在施用所述抗體(例如，復(fù)合的和綴合的抗體)或者細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)劑之前，確定癌相關(guān)抗原是否是在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中細(xì)胞表面暴露的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。此類確定可以包括通過(guò)計(jì)算機(jī)或者手工分析候選蛋白質(zhì)氨基酸序列的C-末端的CAAX盒，和/或進(jìn)行測(cè)定來(lái)確定在表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，候選蛋白質(zhì)是否在細(xì)胞外表達(dá)。此類測(cè)定是本領(lǐng)域已知的并且在本文中描述(見(jiàn)，例如實(shí)施例1和2)并且包括在表達(dá)候選蛋白質(zhì)的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和使用對(duì)候選蛋白質(zhì)特異的抗體(例如，標(biāo)記的抗體)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)。
表1.編碼癌相關(guān)的異戊二烯化蛋白質(zhì)的基因
在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，將異戊二烯化蛋白質(zhì)作為單獨(dú)類別處理，它們與經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的表面暴露的膜的易位具有密切相關(guān)的性質(zhì)。
治療方法
可以體內(nèi)使用上述用于殺死癌細(xì)胞的方法，作為治療哺乳動(dòng)物受試者的方法。
“受試者”或者“個(gè)體”或者“患者”或者“哺乳動(dòng)物”在本文中互換使用，是指希望對(duì)其進(jìn)行診斷或治療的任意受試者，尤其哺乳動(dòng)物受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括人、家畜動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，和動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或者寵物動(dòng)物，如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等等。
術(shù)語(yǔ)“治療”指治療性治療和預(yù)防性措施，其中目的是防止或者減慢(減小)不希望的生理改變或者疾病，如癌癥的發(fā)展或者擴(kuò)散。有益的或者所希望的臨床結(jié)果包括，但不限于，可檢測(cè)的或者不可檢測(cè)的癥狀的減輕、疾病程度的減輕、疾病的穩(wěn)定的(即，不惡化)狀態(tài)、疾病發(fā)展的延緩或者減慢、疾病狀態(tài)的改善或者緩和，和減輕(部分或者總的)。“治療”還可以指與不接受治療的預(yù)期存活相比延長(zhǎng)存活。需要治療的那些個(gè)體包括已經(jīng)患有該疾病或者病癥的個(gè)體以及易于患有所述疾病或病癥的個(gè)體或者將預(yù)防所述疾病或病癥的個(gè)體。也可以排除這些治療類型或患者類型的任一個(gè)。
本發(fā)明的方法中優(yōu)選的是在表1中顯示的組合，其中對(duì)所列出的異戊二烯化蛋白質(zhì)特異的抗體(例如，復(fù)合的和綴合的抗體)用于治療針對(duì)該異戊二烯化蛋白質(zhì)所列的癌癥類型。例如，對(duì)CENP-F動(dòng)粒特異的抗體可以用于本發(fā)明的方法中來(lái)治療結(jié)腸、腎、肝、神經(jīng)和皮膚癌癥；對(duì)CAAX盒蛋白質(zhì)1特異的抗體可以用于治療乳腺和胰腺癌；對(duì)DNAJ同系物亞家族A成員1特異的抗體可以用于治療胃腸道、胰腺、胃、和前列腺癌，等等。此外，對(duì)C35蛋白質(zhì)特異的抗體可以用于治療、診斷或者檢測(cè)乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。
本發(fā)明的方法中還優(yōu)選用于治療癌癥的組合化學(xué)療法/放射免疫療法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用有效量的化學(xué)治療劑，然后接著或者同時(shí)施用綴合毒素，優(yōu)選放射性物質(zhì)的本發(fā)明抗體。
在另一實(shí)施方案中，綴合毒素，優(yōu)選放射性物質(zhì)的本發(fā)明的抗體單獨(dú)施用。
抗體
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”或者“免疫球蛋白”指由兩個(gè)免疫球蛋白重鏈和兩個(gè)免疫球蛋白輕鏈組成的抗體以及其它多種形式，包括，例如，F(xiàn)v、Fab和F(ab′)2，以及雙功能雜合抗體(例如，Lanzavecchiaet al.，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和單鏈(例如，Huston etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird et al.，Science 242，423-426(1988)，將其引入本文作為參考)。(一般見(jiàn)，Hood et al.，Immunology，Benjamin，N.Y.，2ND ed.(1984)，Harlow and Lane，Antibodies.A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)和Hunkapiller and Hood，Nature，323，15-16(1986)，將其引入本文作為參考)。
本發(fā)明的抗體包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或者嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、結(jié)構(gòu)域缺失的抗體(包括，例如，CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體)、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括，例如，抗本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)，和上面抗體任一種的表位結(jié)合片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任意類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
本發(fā)明的抗體也包括，但不限于，抗體和抗體片段的工程化形式，如scFv的雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和更高多聚體，以及微型抗體，如通過(guò)兩個(gè)恒定(C)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的兩個(gè)scFv片段。見(jiàn)，例如，Hudson，P.J.and Couriau，C.，Nature Med.9129-134(2003)；美國(guó)公開(kāi)號(hào)20030148409；美國(guó)專利號(hào)5,837,242。
本發(fā)明的抗體可以來(lái)自任意動(dòng)物來(lái)源，包括鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，抗體是人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驢、shiprabbit、山羊、豚鼠、駱駝、馬或者雞。本文所用的“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體并且包括從人免疫球蛋白文庫(kù)或者從對(duì)一種和多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因并且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的動(dòng)物分離的抗體，如上文并且例如，在Kucherlapati等人的美國(guó)專利號(hào)5,939,598中描述的。
在兩種核酸或者多肽(例如，編碼C35抗體的DNA或者C35抗體的氨基酸序列)的上下文中短語(yǔ)“基本上相同的”指這樣的兩種或者多種序列或者子序列，所述序列和子序列當(dāng)為了最大對(duì)應(yīng)進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，具有至少約80％，更優(yōu)選90-95％或者更高核苷酸或者氨基酸殘基同一性，使用下面的序列比較方法和/或通過(guò)目測(cè)檢測(cè)可以確定所述同一性。通常認(rèn)為此類“基本相同的”序列是同源的。優(yōu)選地，在序列的區(qū)域中存在“基本同一性”，所述區(qū)域長(zhǎng)為至少約50個(gè)殘基，更優(yōu)選至少約100個(gè)殘基，最優(yōu)選地，序列在至少約150個(gè)殘基內(nèi)基本相同，或者在待比較的兩個(gè)序列的全長(zhǎng)內(nèi)相同。如下述，可以通過(guò)使用Kabat中的編號(hào)方案，任意兩條抗體序列僅可以以單向比對(duì)。因此，對(duì)于抗體，百分?jǐn)?shù)同一性具有唯一并且確定的含義。
來(lái)自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸分別稱作Hx和Lx，其中x是根據(jù)Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987 and 1991)方案指定氨基酸位置的數(shù)。Kabat列出了每個(gè)亞組的抗體的許多氨基酸序列，并且列出了該亞組中每個(gè)殘基位置的最通常發(fā)生的氨基酸以產(chǎn)生共有序列。Kabat使用對(duì)所列序列中每個(gè)氨基酸分配殘基數(shù)的方法，并且該分配殘基數(shù)的方法已經(jīng)成為本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)。Kabat的方案可延伸到不包括在該目錄中的其他抗體，這可以通過(guò)將所討論的抗體與Kabat中的共有序列之一通過(guò)參考保守氨基酸進(jìn)行比對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。Kabat編號(hào)系統(tǒng)的使用容易鑒定不同抗體的等價(jià)位置的氨基酸。例如，在人抗體的L50位的氨基酸占據(jù)小鼠抗體的氨基酸位置L50的等價(jià)位置。
已知基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個(gè)四聚體由多肽鏈的兩個(gè)相同的對(duì)組成，每對(duì)有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括約100到110或者更多氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每條鏈的羧基末端部分定義了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。每條輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合部位。從而，完整抗體有兩個(gè)結(jié)合部位。
將輕鏈分類為κ或λ。將重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，并且將抗體同種型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)約12個(gè)或更多氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包括約10個(gè)或更多氨基酸的“D”區(qū)。(一般見(jiàn)，F(xiàn)undamentalImmunology，Paul，W.，ed.，3rd ed.Raven Press，N.Y.，1993，SH.9(將其為了所有目的整體引用作為參考))。
從N末端到C-末端，輕鏈和重鏈可變區(qū)都包含交替的構(gòu)架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)FR、CDR、FR、CDR、FR、CDR和FR。對(duì)每個(gè)區(qū)域的氨基酸分配是根據(jù)Kabat(1987)和(1991)，上文，和/或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia et al.，Nature342878-883(1989)的定義。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)架區(qū)”指抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的那些區(qū)域，它們?cè)谝粋€(gè)物種中的不同免疫球蛋白中是相對(duì)保守的(即，不同于CDR)，如Kabat，等人(前面引用)定義。本文所用的“人構(gòu)架區(qū)”是與天然發(fā)生的人抗體的構(gòu)架區(qū)基本相同(約85％或以上)的構(gòu)架區(qū)。
對(duì)于用于人類最優(yōu)選地，抗體是本發(fā)明的人的或者人源化抗體的抗原結(jié)合片段，并且包括但不限于，F(xiàn)ab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域缺失的抗體、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和包含VL或者VH區(qū)的片段?？贵w的抗原結(jié)合片段包括單鏈抗體，可以包含單獨(dú)或者與下面的完整或者部分組合的可變區(qū)鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括抗原結(jié)合片段，其還包括可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任意組合。
在本發(fā)明的治療方法中優(yōu)選的抗體是含有CH2結(jié)構(gòu)域缺失的那些抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化的”免疫球蛋白或者“人源化的”抗體指免疫球蛋白，其包含人構(gòu)架區(qū)、來(lái)自非人抗體的至少一個(gè)CDR，并且其中存在的任意恒定區(qū)與人免疫球蛋白恒定區(qū)基本相同，即有至少約85-90％，優(yōu)選至少95％相同性。所以，除了可能的CDR，人源化免疫球蛋白的所有部分都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的對(duì)應(yīng)部分基本相同。例如，人源化的免疫球蛋白將不包含嵌合小鼠可變區(qū)/人恒定區(qū)抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“嵌合”抗體指通常這樣的抗體，其已經(jīng)通過(guò)遺傳工程，從屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建了該抗體的重鏈和輕鏈。例如，來(lái)自小鼠單克隆抗體的基因的可變(V)片段可以連接到人恒定(C)片段，如γ1和/或γ4。從而典型的治療性或者診斷性嵌合抗體是雜合蛋白質(zhì)，其包含來(lái)自小鼠抗體的至少一個(gè)V區(qū)(例如，VH或者VL)或者整個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，VH和VL)和來(lái)自人抗體的至少一個(gè)C(效應(yīng)子)區(qū)(例如，CH(CH1、CH2、CH3，或CH4)或CL(CL1、CL2、CL3、或者CL4))或者完整C結(jié)構(gòu)域(即CH和CL)，盡管可以使用其他哺乳動(dòng)物物種。在一些實(shí)施方案中，特別對(duì)于用于本發(fā)明的治療方法，嵌合抗體不含有CH2結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的抗體可以是單特異的、雙特異的、三特異的或者有更大的多特異性。多特異的抗體可以對(duì)本發(fā)明多肽的不同表位特異或者可以對(duì)本發(fā)明的多肽以及異源表位(如異源多肽或者固相支持體材料)特異。見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，et al.，J.Immunol.14760-69(1991)；美國(guó)專利號(hào)4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.1481547-1553(1992)。
該小節(jié)中的描述可以應(yīng)用于本發(fā)明方法中使用的C35抗體和其他抗體。此類抗體可以綴合到毒素或者與毒素復(fù)合，如本文描述，或者可以是非綴合或非復(fù)合的。
C35抗體
C35是在乳腺癌和某些其他腫瘤類型(包括黑素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌和胰腺癌)中差別表達(dá)的抗原。已經(jīng)表明C35蛋白質(zhì)是異戊二烯化的并且與內(nèi)部細(xì)胞膜結(jié)合但是在活的腫瘤細(xì)胞的表面膜上不可檢測(cè)。發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了許多免疫特異識(shí)別C35表位的抗體，包括小鼠單克隆抗體和人抗體。本發(fā)明人已經(jīng)闡明通過(guò)用化學(xué)治療劑或者放射處理在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致C35的表面膜暴露，允許完整腫瘤細(xì)胞被C35特異抗體識(shí)別。
C35多核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs1和2)
gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro
1 5 10
gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt
Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys
15 20 25 30
gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg
Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val
35 40 45
aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca
Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr
50 55 60
ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg
Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu
65 70 75
gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga
Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg
80 85 90
aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct
Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro
95 100 105 110
ccc tgc gtc atc ctg tga
Pro Cys Val Ile Leu
115
從而，本發(fā)明還涉及針對(duì)C35的抗體、編碼此類抗體的多核苷酸、使用C35抗體和多核苷酸治療C-35相關(guān)癌癥的方法，和使用C35抗體和多核苷酸檢測(cè)和診斷的方法。還提供了包含C35抗體多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生C35抗體的方法。如本文更詳細(xì)描述的，本發(fā)明還涉及使用C35抗體用于癌癥治療、檢測(cè)和診斷的方法。上面“抗體”章節(jié)中的描述也適用于本文描述的C35抗體。
本發(fā)明還涉及基于抗體的治療方法，其包括對(duì)受試者，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人施用本發(fā)明的C35抗體，用于治療一種或多種C35癌癥。本發(fā)明的治療性化合物包括，但不限于，本發(fā)明的抗體(包括如本文描述的片段、類似物和其衍生物)和編碼本發(fā)明抗體(包括如本文描述的片段、類似物和其衍生物)的核酸。本發(fā)明的抗體還可以用于治療、檢測(cè)或診斷C-35相關(guān)的癌癥，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和膀胱癌和黑素瘤。本發(fā)明的C35抗體可以以本領(lǐng)域已知或者本文描述的可藥用組合物提供。
本發(fā)明的抗體包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或者嵌合抗體、單鏈抗體、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域缺失的抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括，例如，針對(duì)本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)、和上面抗體任一種的表位結(jié)合片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即，含有免疫特異結(jié)合抗原的抗原結(jié)合部位的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任意類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亞類的免疫球蛋白分子。
使用雜交瘤技術(shù)制備了對(duì)C35多肽特異的雜交瘤細(xì)胞系1F2.4.1和1B3.6.1。(Kohler et al.，Nature 256495(1975)；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511(1976)；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292(1976)；Hammerling et al.，inMonoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp.571-681(1981))。簡(jiǎn)言之，將來(lái)自BALB/c小鼠的用經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而過(guò)表達(dá)C35的同基因BCA34成纖維細(xì)胞腫瘤細(xì)胞免疫的脾細(xì)胞與非分泌性的骨髓瘤細(xì)胞系NS-1(P3/NS1/1-AG4-1，ATCC#TIB-18)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PEG融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系。與NS-1PEG融合后，雜交瘤生長(zhǎng)在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中。約2周后，將雜交瘤集落分離到96孔板中并通過(guò)ELISA、蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)測(cè)試個(gè)體上清液與C35的反應(yīng)性。亞克隆陽(yáng)性雜交瘤集落并兩次篩選反應(yīng)性以確?？寺⌒?。通過(guò)蛋白G親和純化，使用標(biāo)準(zhǔn)方法從雜交瘤上清液分離抗體。在ELISA和蛋白質(zhì)印跡測(cè)定中，來(lái)自兩種雜交瘤細(xì)胞系1F2和1B3的抗體特異結(jié)合重組C35蛋白質(zhì)。通過(guò)免疫組織化學(xué)，來(lái)自雜交瘤細(xì)胞系1F2的抗體也特異染色福爾馬林固定的、石蠟包埋的C35陽(yáng)性腫瘤和細(xì)胞系。此外，我們開(kāi)發(fā)了細(xì)胞內(nèi)染色流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法，其使用來(lái)自雜交瘤細(xì)胞系1F2的綴合Alexa-647熒光染料的抗體進(jìn)行定量分析。這些抗體的每一種都是不同的，但是對(duì)C35蛋白質(zhì)都是特異的。來(lái)自細(xì)胞裂解物的C35蛋白質(zhì)可以與這些抗體的一種免疫沉淀并用另一種檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELISA測(cè)定表明雜交瘤細(xì)胞系1F2和1B3產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合C35蛋白質(zhì)的不同表位。
本發(fā)明的C35抗體包括免疫特異結(jié)合本發(fā)明的C35多肽、多肽片段或者SEQ ID NO2的變體，和/或表位的抗體(如通過(guò)用于測(cè)定特異抗體-抗原結(jié)合的本領(lǐng)域公知的免疫測(cè)定法測(cè)定)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”意在描述目的化合物(例如，C35抗體)，其所處環(huán)境不同于該化合物天然發(fā)生的環(huán)境?！胺蛛x的”意在包括樣品內(nèi)的化合物，所述樣品基本上富集了該目的化合物和/或其中目的化合物得到部分或者基本純化。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本富集的”或者“基本純化的”指化合物，其從它的天然環(huán)境移出并且至少60％，優(yōu)選75％，最優(yōu)選90％的不含與該化合物天然相關(guān)的其他組分。本文所用的具有與參考抗體“相同特異性”的抗體是指該抗體與參考抗體結(jié)合相同的表位。確定抗體是否與參考抗體結(jié)合相同的表位可以使用下面的“用于抗體結(jié)合的測(cè)定法”中描述的測(cè)定法進(jìn)行。
來(lái)自本文討論的小鼠雜交瘤細(xì)胞系的抗體是1F2和1B3。編碼這些抗體的VL和VH區(qū)的多核苷酸克隆到如實(shí)施例6中描述的TOPO載體中，它們?cè)诒?中列出的日期保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)，并給予表2中所列的ATCC保藏號(hào)。ATCC位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約進(jìn)行ATCC保藏。
克隆1F2G于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏號(hào)為PTA-5639。克隆1F2K于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏號(hào)為PTA-5640?？寺?B 3G于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏號(hào)為PTA-5637?？寺?B3K于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏號(hào)為PTA-5638。
表2.編碼小鼠抗-C35可變區(qū)的保藏的多核苷酸克隆
小鼠可變區(qū)基因和所保藏克隆的載體的部分的序列在下面給出。
斜體＝Topo載體序列(包括在保藏的克隆中)
小寫(xiě)＝5’非翻譯區(qū)，包括generacer引物
ATG＝鼠信號(hào)肽開(kāi)始
粗體＝構(gòu)架區(qū)(FWR)
下劃線＝小鼠IgG1或者κ恒定區(qū)的5’部分
1F2鼠抗-C35Vγ1基因多核苷酸序列(來(lái)自克隆1F2G)
GAATTTAGCGGCCGC
GCCCTTcgactggagcacg
gaaaacatctctctcattagaggttgatctttgaggaaaacagggtgttgcctaaaggAT
GAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCT
TCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCAC
TGGCTACTCCATCACC
TGGATCCGG
CDR1
CAGTTTCCAGGGAACAAACTGGAATGGATGGGC
CR2
CGAATCTCCTTCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTT
CCTGAAGTTTAATTCTGTGACTACTGACGACTCAGCTGCATATTACTGTACAAGA
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAA
CDR3
AACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCAAGGG
C
GTTTAAACCTGCAGGACTAGTCCCTT(SEQ ID NO3)
信號(hào)肽＝18AA
FR1＝30AA
CDR1＝6AA
FR2＝14AA
CDR2＝16AA
FR3＝32AA
CDR3＝7AA
FR4＝11AA
1F2VH氨基酸序列(克隆1F2G編碼)
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGS
NNSNPSLKNRISFTRDTSKNQFFLKFNSVTTDDSAAYYCTRGTTGFAYWGQGTLVTV
SA(SEQ ID NO4)
1F2鼠抗-C35κV基因多核苷酸序列(來(lái)自克隆1F2K)
CGC
GCCCTTcgactggagcacga
gaaaaatt
agctagggaccaaaattcaaagacagaATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTA
ATCAGTGCCTCAGTCAGAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATG
TCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATATCCTGC
CDR1
TGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGA
TTTAT
GGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCT
CDR2
GGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGC
TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA
AACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAAAGGGCGAATT
CGTTT(SEQ ID NO5)
信號(hào)肽＝22AA
FR1＝23AA
CDR1＝10AA
FR2＝15AA
CDR2＝7AA
FR3＝32AA
CDR3＝9AA
FR4＝10AA
1F2-VK氨基酸序列(克隆1F2K編碼)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYHTSNLASGVPARFSG
SGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO6)
1B3鼠抗-C35VγV-基因(克隆1B3G編碼)(NC1-A7 V139-D-J1(VH36-60)M13281)
CGC
GCCCTTcgactggagcacga
gaaaatc
tctctcactggaggctgatttttgaagaaaggggttgtagcctaaaagATGATGGTGTTAAGT
CTTCTGTACCTGTTGACAGCCCTTCCGGGTATCCTGTCAGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGA
CCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCGACTCCATC
ACC
TGGATCCGGAAATTCCCAGGAAATA
CDR1
AACTTGAATACGTGGGG
CDR2
CGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCACTACTACCTGCAGTTGAATTCT
GTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGA
TGGGGCGCTGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
CDR3
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCC
AAGGGC
GTTTAAACCTGC(SEQ ID NO7)
SIG PEP＝18AA
FR1＝30AA
CDR1＝5AA
FR2＝14AA
CDR2＝16AA
FR3＝32AA
CDR3＝14AA
FR4＝11AA
1B3 VH氨基酸序列(克隆1B3G編碼)
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYVGYISYSGGTYYNPSL
KSRISITRDTSKNHYYLQLNSVTTEDTATYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGAGTTVTVSS
(SEQ ID NO8)
1B3鼠抗-C35κV-基因(來(lái)自克隆1B3K)
GCCCTTcccctggagcacga
gaaaatcagtt
cctgccaggacacagtttagatATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTG
GATATCAGGTGCCCACTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTTTCTTGCTGCATCTCC
TGGAGAAACCATTACTATTAATTGC
CDR1
TGGTATCAGGAGAAACCTGGAGAAACTAAAAAGCTTCTTATCTAC
GGACTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGA
CDR2
TTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGT
TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCT
CDR3
GATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAAAGGGC
(SEQ
ID NO9)
SP＝20AA
FR1＝23aa
CDR1＝11aa
FR2＝15aa
CDR2＝7AA
FR3＝32aa
CDR3＝9AA
FR4＝10AA
1B3 VK氨基酸序列(克隆1B3K編碼)
DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKYISKHLVWYQEKPGETKKLLIYSGSTLQSGLPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO10)
本發(fā)明人已經(jīng)使用2002年9月5日公布的US 2002 0123057 A1描述的方法產(chǎn)生了兩種C35抗體MAb 165和MAb 171。MAb 165和MAb171的重鏈可變區(qū)包含與上述1B3抗體重鏈可變區(qū)相同的CDR3區(qū)。MAb165和MAb 171的剩余部分為人源的。本發(fā)明涉及免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體，其包含SEQ ID NO56、SEQ ID NO58或SEQ ID NO60的VH或VL區(qū)的任一個(gè)，或者SEQ ID NO56或SEQ ID NO60編碼的任一VH區(qū)和SEQ ID NO58編碼的VH區(qū)的組合，和優(yōu)選地，C35-特異抗體MAb 165或MAb 171。MAb 165和MAb 171都包含相同的κ輕鏈UH8 VK L120。
MAb 165和MAb 171的重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列在下面給出。
下劃線＝CDR1，CDR2，或CDR3
MAb 165 VH(141D10 VH H732)核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTCCGGAGACCCTGT
CCCTCACCTGCAATGTCTCTGGTGGCTCTATCGGTAGATACTATTGGAACTGGATC
CDR1
CGACAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGCCATATCCATTACAGTGGGA
GCACCATCTACCATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCAGCATATCGCTGGACACGTCC
CDR2
AAGAACCAGGTCTCCCTGAAGTTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGT
ATTACTGTGCACGAGGTGCTTACTACGGGGGGGCCTTTTTTCCTTACTTCGATGTC
CDR3
TGGGGCCAAGGGACCA CGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO56)
MAb 165 VH(141D10 VH H732)氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPPETLSLTCNVSGGSIGRYYWNWIRQSPGKGLEWIGHIHYSGSTI
YHPSLKSRVSISLDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGQG
TTVTVSS(SEQ ID NO57)
MAb 171 VH(MSH 3VH H835)核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGAGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGA
GACTCTCTTGTGCAGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTACTGGATGCACTGGGTC
CDR1
CGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTGGGTCTCACGTATTGACACTGATGGGA
GTACCACAACCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA
CDR2
CGCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCACGAGGTGCTTACTACGGGGGGGCCTTTTTTCCTTACTTCGA
CDR3
TGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO60)
MAb 171 VH(141D10 VH H732)氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRIDTDGS
TTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARGAYYGGAFFPYFDV
WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO61)
UH8 VK L120核苷酸序列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTATGGGAGACAGAGT
CACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAGGAATCATTTAGCCTGGTATCAG
CDR1
CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAATCTCCTGATCTCTGCTGCATCCACTTTGCAAT
CDR2
CAGGGGTCCCAACTCGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCAC
CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACTCTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATC
GGTACCCCCTCACTTTCGGCCAA GGGACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO58)
CDR3
UH8 VK L120氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASMGDRVTITCRASQGIRNHLAWYQQKPGKAPNLLISAASTLQSGV
PTRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQYNRYPLTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO59)
本發(fā)明人已經(jīng)使用US 2002 0123057 A1中描述的方法產(chǎn)生了人C35抗體MAbc009。本發(fā)明涉及免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體，其包含表3中所列的多核苷酸克隆編碼的VH和VL區(qū)，優(yōu)選完整人C35-特異的抗體MAbc009。編碼該抗體的VL和VH區(qū)的多核苷酸如實(shí)施例6中描述的克隆到TOPO載體中，它們?cè)诒?中列出的日期保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)，并給予表3中所列的ATCC保藏號(hào)。ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約進(jìn)行ATCC保藏。
克隆H0009于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏號(hào)為PTA-5641?？寺0010于2003年11月11日保藏在ATCC，ATCC保藏號(hào)為PTA-5642。
表3.編碼人抗-C35可變區(qū)的保藏的多核苷酸克隆
人可變區(qū)基因和所保藏克隆的載體的部分的序列在下面給出。
ATG＝人信號(hào)肽開(kāi)始
粗體＝構(gòu)架區(qū)
下劃線＝人IgG1GS或者κ恒定區(qū)
MAbc0009 VH核苷酸序列(來(lái)自克隆H0009)
GCCCTTAATTGCGGCCGCAAACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTC
TTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
TCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGC
AGCGTCTGGATTCAACTTCGGT
TGGGTCCGCCA
CDR1
GGCTCAAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA
CGATACACCATCTCCAGAG
CDR2
ACAATTCCCAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAC
GACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAA
CDR3
GACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG
TCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG
TCAAGGACTACTTAAGGGC
(SEQ ID NO11)
MAbc0009 VH氨基酸序列(克隆H0009編碼)
EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFNFGTYAMHWVRQAQGKGLEWVALIWYDGTKKYYADS
VKGRYTISRDNSQNTLYLQMNTLRADDTAVYYCAKSKLQGRVIDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO12)
MAbc0009 VK核苷酸序列(來(lái)自克隆L0010)
GCCCTTAATTGCGGCCGCAAACATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGC
AACAGCTACAGGCGTGCACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACtCCCTGGCTGTGTC
TCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGC
CDR1
TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTAC
GGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCT
CDR2
GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGT
TGGACGTTCGGCC
CDR3
AAGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT
CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAAAGGGC
(SEQ ID NO13)
MAbc0009 VK氨基酸序列(克隆L0010編碼)
IQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGV
PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLWTFGQGTKLEIK(SEQ IDON14)
小鼠C35抗體有稱作SEQ ID Nos3-10的重鏈和輕鏈可變區(qū)。小鼠抗體1F2和1B3有γ1同種型和κ輕鏈。與1B3小鼠抗體有相同重鏈可變區(qū)CDR3的抗體MAb 165和MAb 171具有稱作SEQ ID NOs56-60的重鏈和輕鏈可變區(qū)?？贵wMAb 165和MAb 171有κ輕鏈。人抗體MAbc009有稱作SEQ ID Nos11-14的重鏈和輕鏈可變區(qū)。人抗體MAbc009有γ1同種型和κ輕鏈。
本發(fā)明包括免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段、變體或者融合蛋白的抗體(包括包含，或者備選地，由抗體片段或者其變體組成的分子)。C35多肽包括，但不限于，SEQ ID NO2的C35多肽?？梢酝ㄟ^(guò)編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸的重組表達(dá)產(chǎn)生C35多肽(關(guān)于C35的含有表位的片段，見(jiàn)WO 01/74859)。
優(yōu)選地，所示例的抗體的類似物通過(guò)保守氨基酸替代而與示例的抗體不同。為了將氨基酸替代分類為保守的或者非保守的，可以如下分類氨基酸組I(疏水側(cè)鏈)met，ala，val，leu，ile；組II(中性親水側(cè)鏈)cys，ser，thr；組III(酸性側(cè)鏈)asp，glu；組IV(堿性側(cè)鏈)asn，gln，his，lys，arg；組V(影響鏈定向的殘基)gly，pro；和組VI(芳香族側(cè)鏈)trp，tyr，phe。保守替代包括相同類別中氨基酸之間的替代。非保守替代為將這些類別中一類中的成員與另一類的成員交換。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段和變體的抗體包含具有SEQ ID NO57或61的氨基酸序列的多肽，或者表2或3中提及的多核苷酸的至少一種和/或SEQ ID NO59編碼的任一個(gè)VH區(qū)或者表2或3中提及的多核苷酸的至少一種編碼的任一個(gè)VL區(qū)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQ ID NO57或SEQ IDNO61的氨基酸序列和SEQ ID NO59的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含表3中提及的克隆H0009編碼的VH區(qū)和克隆L0010編碼的VL區(qū)的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含表2的克隆1F2G編碼的VH區(qū)和克隆1F2K編碼的VL區(qū)，或者克隆1B3G編碼的VH區(qū)和克隆1B3K編碼的VL區(qū)的氨基酸序列。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含表3的克隆H0009編碼的VH區(qū)的氨基酸序列、SEQ ID NO57的氨基酸序列，或者SEQ ID NO61的氨基酸序列和表2的克隆1F2K或1B3K編碼的VL區(qū)的氨基酸序列；或者表2的克隆1F2G或1B3G編碼的VH區(qū)，SEQ ID NO57的氨基酸序列，或者SEQ ID NO61和表3的克隆L0010編碼的VL區(qū)的氨基酸序列；或者表2的克隆1F2G或1B3G或表3的克隆H009編碼的VH區(qū)和SEQ IDNO59的氨基酸序列。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含克隆1F2G編碼的VH區(qū)和表2的克隆1B3K編碼的VL區(qū)氨基酸序列，或者表2的克隆1B3G編碼的VH區(qū)和克隆1F2K編碼的VL區(qū)的氨基酸序列。本發(fā)明還包括包含，或者備選地，由表2或表3中提及的至少一種多核苷酸編碼的VH和/或VL區(qū)的抗體片段或變體組成并且免疫特異結(jié)合C35多肽的分子，以及編碼這些VH和VL區(qū)、分子、片段和/或變體的核酸分子。
本發(fā)明還提供了免疫特異結(jié)合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的變體的抗體，其中所述抗體包含，或者備選地，由SEQ ID NOs56或者60或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VH區(qū)中含有的任意1、2、3或多個(gè)VH CDR的氨基酸序列的多肽組成。具體地，本發(fā)明提供了免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體，其包含，或者備選地，由具有SEQ ID NOs56或者60或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VH區(qū)中含有的VH CDR1的氨基酸序列的多肽組成。在另一實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體包含，或者備選地，由具有SEQ ID NOs56或者60或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VH區(qū)中含有的VH CDR2的氨基酸序列的多肽組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體包含，或者備選地，由具有SEQ ID NOs56或者60或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VH區(qū)中含有的VH CDR3的氨基酸序列的多肽組成。本發(fā)明還包括免疫特異結(jié)合C35多肽或者C35多肽片段或者其變體的、包含，或者備選地，由這些抗體或者抗體片段或其變體組成的分子，以及編碼這些抗體、分子、片段和/或變體的核酸分子。
本發(fā)明還提供了免疫特異結(jié)合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的變體的抗體，其中所述抗體包含，或者備選地，由SEQ ID NO58或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VL區(qū)中含有的任意1、2、3或多個(gè)VL CDR的氨基酸序列的多肽組成。具體地，本發(fā)明提供了免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體，其包含，或者備選地，由具有SEQID NO58或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VL區(qū)中含有的VL CDR1的氨基酸序列的多肽組成。在另一實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體包含或者備選地，由具有SEQ ID NO58或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VL區(qū)中含有的VL CDR2的氨基酸序列的多肽組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體包含或者備選地，由具有SEQ ID NOs58或者表2或3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VL區(qū)中含有的VL CDR3的氨基酸序列的多肽組成。本發(fā)明還包括免疫特異結(jié)合C35多肽或者C35多肽片段或者其變體的、包含，或者備選地，由這些抗體或者抗體片段或其變體組成的分子，以及編碼這些抗體、分子、片段和/或變體的核酸分子。
本發(fā)明還提供了免疫特異結(jié)合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的變體的抗體(包括包含，或者備選地由抗體片段或變體組成的分子)，其中所述抗體包含或者備選地由如SEQ ID NOs57、59或61或者如表2或表3中提及的一種或多種多肽編碼的VH區(qū)或者VL區(qū)中含有的1、2、3或多個(gè)VH CDRs和1、2、3或多個(gè)VL CDRs組成。具體地，本發(fā)明提供了免疫特異結(jié)合C35多肽，多肽片段或者C35多肽的變體的抗體，其中所述抗體包含或者備選地由SEQ ID NOs56、58或60或者如表2或表3中提及的一種或多種多核苷酸編碼的VH區(qū)或者VL區(qū)中含有的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VH CDR2和VL CDR3、VHCDR3和VH CDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3，或者其VH CDR和VL CDR的任意組合組成。所述1、2、3或多個(gè)VH CDRs和1、2、3或多個(gè)VL CDRs可以來(lái)自克隆H0009和L0010、克隆H0009和1F2K、克隆H0009和1B3K、克隆H009和SEQ ID NO58、克隆1F2G和1F2K、克隆1F2G和1B3K、克隆1F2G和L0010、克隆1F2G和SEQ ID NO58、克隆1B3G和1B3K、克隆1B3G和1F2K、克隆1B3G和L0010、克隆1B3G和SEQ ID NO58、SEQ ID NO56和SEQ ID NO58、SEQ ID NO56和克隆L0010、SEQ ID NO56和克隆1F2K、SEQ ID NO56和克隆1B3K、SEQ ID NO60和SEQ ID NO58、SEQ ID NO60和克隆L0010、SEQ IDNO60和克隆1F2K、或SEQ ID NO60和克隆1B3K。本發(fā)明還包括免疫特異結(jié)合C35多肽的、包含，或者備選地由這些抗體的片段或變體組成的分子，以及編碼這些抗體、分子、片段或變體的核酸分子。
最優(yōu)選地，所述抗體是本發(fā)明的人、嵌合的(例如，人.小鼠嵌合的)或者人源化的抗體或者抗體的抗原結(jié)合片段，包括，但不限于，F(xiàn)ab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)，和胞內(nèi)抗體(intrabody)和包含VL或者VH區(qū)的片段?？贵w的抗原結(jié)合片段，包括單鏈抗體，可以包含單獨(dú)或者與下面的完整或者部分組合的可變區(qū)鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明包括抗原結(jié)合片段，其包括可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任意組合。在本發(fā)明的治療方法中優(yōu)選的C35抗體是含有CH2結(jié)構(gòu)域缺失的那些抗體。
本發(fā)明的抗體可以根據(jù)本發(fā)明的多肽的表位或者部分描述或者詳細(xì)說(shuō)明，所述抗體識(shí)別或者特異結(jié)合所述表位或者部分。例如，通過(guò)N-末端和C-末端位置，或者通過(guò)連續(xù)氨基酸殘基的大小描述所述表位或者多肽部分。還可以排除特異結(jié)合本發(fā)明的表位或者多肽的抗體。因此，本發(fā)明包括特異結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體，并且允許排除所述抗體。
本發(fā)明的抗體還可以按照它們對(duì)本發(fā)明多肽的結(jié)合親和性描述或者詳細(xì)說(shuō)明。優(yōu)選的結(jié)合親和性包含解離常數(shù)或者Kd小于5×10(-7)M、10(-7)M、5×10(-8)M、10(-8)M、5×10(-9)M、10(-9)M、5×10(-10)M、10(-10)M、5×10(-11)M、10(-11)M、5×10(-12)M、10(-12)M、5×10(-13)M、10(-13)M、5×10(-14)M、10(-14)M、5×10(-15)M、或者10(-15)M的那些結(jié)合親和性。
本發(fā)明的抗體對(duì)C35的親和性與抗體1F2、1B3、MAb 165、MAb 171、或MAbc009對(duì)C35的親和性相同或相似。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體對(duì)C35的親和性高于抗體1F2、1B3、MAb 165、MAb 171、或MAbc009對(duì)C35的親和性。
本發(fā)明還提供了競(jìng)爭(zhēng)性抑制抗體對(duì)C35表位的結(jié)合的抗體，如通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方法，如本文描述的免疫測(cè)定法和抗體結(jié)合測(cè)定法可以測(cè)定所述競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合所述表位至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或者至少50％。
還可以按照它們的交叉反應(yīng)性描述或詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的抗體。包括不結(jié)合本發(fā)明多肽的任意其他類似物、直向同源物或者同源物的抗體。本發(fā)明還包括結(jié)合與本發(fā)明的多肽有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(如使用本領(lǐng)域已知并且在本文中描述的方法計(jì)算)的多肽的抗體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與人蛋白質(zhì)的鼠、大鼠和/或兔同源物和其對(duì)應(yīng)的表位交叉反應(yīng)。本發(fā)明還包括這樣的抗體，其不結(jié)合與本發(fā)明的多肽有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％同一性(如使用本領(lǐng)域已知并且在本文中描述的方法計(jì)算)的多肽。在特定實(shí)施方案中，上述交叉反應(yīng)性是關(guān)于本文公開(kāi)的任意一種特異的抗原性或者免疫原性多肽或者2、3、4、5或者多種特異抗原和/或免疫原性多肽的組合的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明還包括結(jié)合多核苷酸編碼的多肽的抗體，所述多核苷酸在嚴(yán)緊雜交條件(如本文描述)下與本發(fā)明的多核苷酸雜交。
本發(fā)明的抗體可以按照它們識(shí)別或特異結(jié)合的本發(fā)明的多肽的表位或者部分描述或者詳細(xì)說(shuō)明。例如，通過(guò)N-末端和C-末端位置，通過(guò)連續(xù)氨基酸殘基的多少，或者在表和圖中列出的，在本文中描述所述表位或者多肽部分。還可以排除特異結(jié)合本發(fā)明的表位或者多肽的抗體。因此，本發(fā)明包括特異結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體，并且允許排除所述抗體。從本發(fā)明排除US 2002/0052308和/或WO 01/74859中公開(kāi)的C35的抗體，和/或特異結(jié)合其中公開(kāi)的表位的抗體。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合天然C35序列的殘基105-115代表的片段內(nèi)含有的表位。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合天然C35序列的殘基53-104代表的片段內(nèi)含有的表位。
本發(fā)明的抗體還可以按照它們的交叉反應(yīng)性或者交叉反應(yīng)性的缺乏來(lái)描述或者詳細(xì)說(shuō)明。包括不結(jié)合本發(fā)明多肽的任意其他類似物、直向同源物或者同源物的抗體。本發(fā)明還包括結(jié)合與本發(fā)明的多肽有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(如使用本領(lǐng)域已知并且在本文中描述的方法計(jì)算)的多肽的抗體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與人蛋白質(zhì)的鼠、猴、大鼠和/或兔同源物和其對(duì)應(yīng)的表位交叉反應(yīng)。本發(fā)明還包括這樣的抗體，其不結(jié)合與本發(fā)明的多肽有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％同一性(如使用本領(lǐng)域已知并且在本文中描述的方法計(jì)算)的多肽。在特定實(shí)施方案中，上述交叉反應(yīng)性是關(guān)于本文公開(kāi)的任意一種特異的抗原性或者免疫原性多肽或者2、3、4、5或者多種特異抗原性和/或免疫原性多肽的組合的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明還包括結(jié)合多核苷酸編碼的多肽的抗體，所述多核苷酸在嚴(yán)緊雜交條件(如本文描述)下與本發(fā)明的多核苷酸雜交。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(包括包含或者備選地，由抗體片段或者其變體組成的分子)免疫特異結(jié)合C35多肽并且不與任何其他抗原交叉反應(yīng)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體相對(duì)于它們結(jié)合其他抗原的能力優(yōu)先結(jié)合C35多肽(SEQ ID NO2)，或者其片段和變體。
作為非限制性實(shí)例，如果抗體結(jié)合第一種抗原的解離常數(shù)(KD)小于該抗體對(duì)第二種抗原的KD，那么認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一非限制性實(shí)施方案中，如果抗體結(jié)合第一種抗原的親和力小于抗體對(duì)第二種抗原的KD至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，那么認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一非限制性實(shí)施方案中，如果抗體結(jié)合第一種抗原的親和力小于抗體對(duì)第二種抗原的KD至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)，那么認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。
在另一非限制性實(shí)施方案中，如果抗體結(jié)合第一種抗原的解離速率(off rate)(k(off))小于抗體對(duì)第二種抗原的k(off)，那么認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一非限制性實(shí)施方案中，如果抗體結(jié)合第一種抗原的親和力小于抗體對(duì)第二種抗原的k(off)至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，那么認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一非限制性實(shí)施方案中，如果抗體結(jié)合第一種抗原的親和力小于抗體對(duì)第二種抗原的k(off)至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)，那么認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合C35多肽或者其片段或變體的解離速率(k(off))為小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1或10-3秒-1。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合C35多肽或者其片段或變體的解離速率(k(off))為小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1、10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1、或10-7秒-1。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合C35多肽或者其片段或變體的結(jié)合速率(on rate)(k(on))大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合C35多肽或者其片段或變體的結(jié)合速率(k(on))大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、5×106M-1秒-1或107M-1秒-1。
本發(fā)明還提供了包含或者備選地由本文描述的抗體分子(例如，VH區(qū)和/或VL區(qū))的變體(包括衍生物)組成的抗體，所述抗體免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段或者變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于在編碼本發(fā)明的分子的核苷酸序列中引入突變，所述技術(shù)包括，但不限于定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，其導(dǎo)致氨基酸替代。優(yōu)選地，相對(duì)于參考VH區(qū)、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL區(qū)、VLCDR1、VLCDR2、或VLCDR3，變體(包括衍生物)編碼小于50個(gè)氨基酸替代、小于40個(gè)氨基酸替代、小于30個(gè)氨基酸替代、小于25個(gè)氨基酸替代、小于20個(gè)氨基酸替代、小于15個(gè)氨基酸替代、小于10個(gè)氨基酸替代、小于5個(gè)氨基酸替代、小于4個(gè)氨基酸替代、小于3個(gè)氨基酸替代、或小于2個(gè)氨基酸替代?！氨Ｊ匦园被崽娲笔瞧渲袑被釟埢镁哂邢嗨齐姾傻膫?cè)鏈的氨基酸殘基替代。具有相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸的家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中確定。這些家族包括堿性側(cè)鏈氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝的側(cè)鏈氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。備選地，可以沿著編碼序列的全部或者部分隨機(jī)導(dǎo)入突變，例如，通過(guò)飽和誘變，并且可以對(duì)所得突變體篩選生物活性以鑒定保持活性(例如，結(jié)合C35多肽的能力)的突變體。
例如，可能僅在抗體分子的構(gòu)架區(qū)或者僅在CDR區(qū)中導(dǎo)入突變。所導(dǎo)入的突變可以是沉默的或者中性錯(cuò)義突變，即對(duì)抗體結(jié)合抗原的能力沒(méi)有，或者有很小的影響。這些類型的突變可以用于優(yōu)化密碼子利用，或者提高雜交瘤的抗體產(chǎn)生。備選地，非中性錯(cuò)義突變可以改變抗體結(jié)合抗原的能力。多數(shù)沉默和中性錯(cuò)義突變的位置可能在構(gòu)架區(qū)中，而多數(shù)非中性錯(cuò)義突變的位置可能在CDR，盡管這不是絕對(duì)的要求。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以設(shè)計(jì)和測(cè)試突變分子的所希望的性質(zhì)，如抗原結(jié)合活性沒(méi)有改變或者結(jié)合活性的改變(例如，抗原結(jié)合活性的提高或者抗體特異性的改變)。誘變后，所編碼的蛋白質(zhì)可以常規(guī)表達(dá)并且所編碼蛋白質(zhì)的功能和/或生物活性(例如，免疫特異結(jié)合C35多肽的能力)可以使用本文描述的技術(shù)或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)修飾技術(shù)確定。
在特定實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段或變體的本發(fā)明的抗體(包括包含或者備選地，由抗體片段或其變體組成的分子)包含，或者備選地，由核苷酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下與和編碼SEQ ID NOs56、58或60的或者表2或表3中提及的一種或多種核酸編碼的VH或VL區(qū)之一的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列雜交，例如，在高度嚴(yán)緊條件下，在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃下與膜結(jié)合的DNA雜交，然后在0.2xSSC/0.1％SDS中約50-65℃下洗滌1次或多次，例如，在6xSSC中約45℃下與膜結(jié)合的核酸雜交，然后在0.1xSSC/0.2％SDS中約68℃下洗滌1次或多次，或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他嚴(yán)緊雜交條件下雜交(見(jiàn)，例如，Ausubel，F(xiàn).M.et al.，eds.，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，6.3.1-6.3.6頁(yè)和2.10.3)。本發(fā)明還包括編碼這些抗體的核酸分子。
本領(lǐng)域公知具有相同氨基酸序列的多肽、其片段或變體通常有相似的結(jié)構(gòu)和許多相同的生物活性。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段或C35多肽的變體的抗體(包括包含或者備選地，由抗體片段或其變體組成的分子)包含，或者備選地由VH區(qū)組成，所述VH區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NOs56或60或者表2或表3中提及的核酸編碼的VH區(qū)的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性。
在另一實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段或C35多肽的變體的抗體(包括包含或者備選地，由抗體片段或其變體組成的分子)包含，或者備選地由VL區(qū)組成，所述VH區(qū)的氨基酸序列與SEQID NO58或者表2或表3中提及的核酸編碼的VL區(qū)的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性。
本發(fā)明還包括與本文描述的一種或多種抗體有一種或多種相同的生物學(xué)特征的抗體(包括包含或者備選地，由抗體片段或其變體組成的分子)?！吧飳W(xué)特征”指抗體的體外或體內(nèi)活性或性質(zhì)，例如，結(jié)合C35多肽(例如，細(xì)胞凋亡期間在細(xì)胞表面上表達(dá)的C35多肽)的能力；基本上抑制或消除C35多肽介導(dǎo)的生物活性的能力；殺死C35-結(jié)合的癌細(xì)胞(例如，治療或診斷C35相關(guān)的癌癥)；或者檢測(cè)C35的能力；抑制或者消除C35多肽介導(dǎo)的生物活性的能力。任選地，本發(fā)明的抗體將與本文特別提及的至少一種抗體結(jié)合相同的表位。此類表位結(jié)合可以用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法常規(guī)地測(cè)定。
下面關(guān)于產(chǎn)生來(lái)自表2中提及的核酸編碼的小鼠VH和VL區(qū)的人源化抗體描述的規(guī)則也可以用于產(chǎn)生抗體變體，其包含SEQ ID NOs56、58、或60編碼的或者表3中提及的核酸編碼的人VH和/或VL區(qū)。
本發(fā)明的人源化免疫球蛋白和人抗體變體具有基本上來(lái)自人免疫球蛋白(稱作接納體免疫球蛋白)的可變構(gòu)架區(qū)，和基本上來(lái)自表2中克隆編碼的小鼠C35VH和VL區(qū)的CDRs或者來(lái)自表3中克隆編碼的人C35VH和VL區(qū)的CDRs(稱作供體免疫球蛋白)。恒定區(qū)(如果存在)也基本上來(lái)自人免疫球蛋白。人源化抗體和人抗體變體顯示出對(duì)C35的特異結(jié)合親和力為至少102、103、104、105、106、104、108、109或者1010M-1。通常，人源化抗體和人抗體變體的結(jié)合親和力的上限為小鼠抗體1F2或者1B3或者人抗體MAbc009，或者抗體MAb 165或MAb 171的結(jié)合親和力的上限的3、4、5或10倍以內(nèi)。通常，結(jié)合親和力的下限也為小鼠抗體1F2或者1B3或者人抗體MAbc009，或者抗體MAb 165或MAb 171的結(jié)合親和力的下限的3、4、5或10倍以內(nèi)。優(yōu)選的人源化免疫球蛋白和人抗體變體與小鼠抗體1F2或者1B3或者人抗體MAbc009，或者抗體MAb 165或MAb 171競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合C35并且防止C35結(jié)合各自小鼠或者人抗體。
可能的人接納體抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)由Kabat，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.，1987 and 1991)描述。選擇人接納體抗體使得它的可變區(qū)顯示出與小鼠C35抗體的可變區(qū)的高度序列同一性。重鏈和輕鏈可變構(gòu)架區(qū)可以來(lái)自相同或者不同的人抗體序列。人抗體序列可以是天然發(fā)生的人抗體的序列或者可以是一些人抗體的共有序列。
可以如下進(jìn)行人源化免疫球蛋白的設(shè)計(jì)。當(dāng)氨基酸落入下面的類別時(shí)，待使用的人免疫球蛋白的構(gòu)架氨基酸(接納體免疫球蛋白)可以由來(lái)自提供CDR的非人免疫球蛋白(供體免疫球蛋白)的構(gòu)架氨基酸替代
(a)接納體免疫球蛋白的人構(gòu)架區(qū)中的氨基酸對(duì)于人免疫球蛋白在該位置是罕見(jiàn)的，而供體免疫球蛋白中對(duì)應(yīng)氨基酸對(duì)于該位置中的人免疫球蛋白是典型的；
(b)該氨基酸的位置與CDRs之一緊密相鄰；或者
(c)該氨基酸能夠與CDR相互作用(見(jiàn)，Queen et al.WO92/11018.，和Co et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)，將它們都引入本文作為參考)。關(guān)于產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的詳細(xì)描述，見(jiàn)Queen et al.和Co et al。
通常，人源化抗體和人抗體變體中的CDR區(qū)基本上相同，更通常地，與它們所源自的小鼠或者人抗體中對(duì)應(yīng)CDR區(qū)相同。盡管不是通常希望的，但是有時(shí)可以進(jìn)行CDR殘基的一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代而不明顯地影響所得人源化免疫球蛋白或者人抗體變體的結(jié)合親和性。偶然地，CDR區(qū)的替代可以增強(qiáng)結(jié)合親和性。
除了上面討論的特定氨基酸替代，人源化免疫球蛋白和人抗體變體的構(gòu)架區(qū)通常是基本上相同的，更通常地，與它們所源自的人抗體(接納體免疫球蛋白)的構(gòu)架區(qū)相同。當(dāng)然，構(gòu)架區(qū)中的許多氨基酸對(duì)于抗體的特異性或者親和性很少有或者沒(méi)有貢獻(xiàn)。從而，可以耐受構(gòu)架區(qū)殘基的許多個(gè)別的保守替代而不明顯改變所得人源化免疫球蛋白或者人抗體變體的特異性或者親和性。
例如，HuZAF的類似物顯示出與HuZAF的顯著的氨基酸序列同一性。類似物的重鏈和輕鏈可變區(qū)由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下與編碼HuZAF的重鏈或輕鏈可變區(qū)的核酸，或者其簡(jiǎn)并形式雜交。噬菌體展示技術(shù)提供了選擇此類保留結(jié)合親和性和特異性的類似物的技術(shù)(見(jiàn)，例如，Dower et al.，WO 91/17271；McCaffertyet al.，WO 92/01047；和Huse，WO 92/06204(它們每一個(gè)都為了所有目的完整引入本文參考))。
表2或3的核酸克隆中的VH和VL基因或者SEQ ID NO56、58或60可以用于根據(jù)US 2002 0123057A1，“In vitro methods ofproducing and identifying immunoglobulin molecules ineukaryotic cells，”(2002年9月5日公布)教導(dǎo)的方法選擇對(duì)C35特異的完全人抗體。簡(jiǎn)言之，連接人CH的小鼠(或者人)VH用于從此類輕鏈文庫(kù)選擇完全人免疫球蛋白輕鏈，其當(dāng)與小鼠(或者人)VH配對(duì)時(shí)賦予對(duì)C35的特異性。然后將所選的完全人免疫球蛋白輕鏈用于從此類重鏈的文庫(kù)選擇完全人免疫球蛋白重鏈，其當(dāng)與人輕鏈配對(duì)時(shí)賦予對(duì)C35的特異性。類似地，與人CL連接的小鼠(或人)VL可以用于從此類重鏈的文庫(kù)選擇完全人免疫球蛋白重鏈，其當(dāng)與小鼠(或者人)VL配對(duì)時(shí)賦予對(duì)C35的特異性。然后將所選的完全人免疫球蛋白重鏈用于從此類輕鏈文庫(kù)選擇完全人免疫球蛋白輕鏈，其當(dāng)與完全人重鏈配對(duì)時(shí)賦予對(duì)C35的特異性。通常，以該方式選擇的完全人抗體具有表位特異性，其與最初小鼠(或者人)C35-特異抗體的表位特異性相同或者密切相關(guān)。
US 2002 0123057 A1的方法還可以用于輕鏈或重鏈文庫(kù)，其所有成員都有一個(gè)或多個(gè)非人(例如，小鼠)CDR。在一個(gè)實(shí)例中，該文庫(kù)的每個(gè)成員包含來(lái)自對(duì)C35特異的分離的鼠單克隆抗體(例如，1F2或者1B3)的CDR3區(qū)。
本發(fā)明包括通過(guò)使用US 2002 0123057 A1的方法以SEQ ID NO56、58或60的核酸或者表2或3中提及的核酸編碼的免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區(qū)開(kāi)始選擇的所有完全人抗體或者具有一個(gè)或多個(gè)非人(例如，小鼠)CDR的抗體(包括包含，或者備選地由其抗體片段或者變體組成的分子)。
如上述產(chǎn)生的人源化抗體或者人抗體變體的可變片段通常連接到免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。人恒定區(qū)DNA序列可以根據(jù)公知的步驟從多種人細(xì)胞，如永生的B細(xì)胞分離(見(jiàn)Kabat et al.，上文，和WO 87/02671)。抗體可以含有輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以包括CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3，和有時(shí)包括CH4區(qū)。對(duì)于治療目的，可以缺失或者省略CH2結(jié)構(gòu)域。
人源化抗體或者人抗體變體包括具有所有類型的恒定區(qū)的抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE、和任意同種型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。當(dāng)希望人源化抗體或者人抗體變體顯示出細(xì)胞毒性活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以通常是補(bǔ)體-結(jié)合的恒定區(qū)并且該類別通常是IgG1。當(dāng)不希望此類細(xì)胞毒性活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以是IgG2類別。人源化抗體或者人抗體變體可以包含來(lái)自一種以上的類別或同種型的序列。
本發(fā)明還包括嵌合抗體。此類抗體可以包含SEQ ID NO56、58或60的核酸或者表2或3中提及的核酸編碼的VH區(qū)和/或VL區(qū)，其融合到另一物種，如人或小鼠或馬等等的CH區(qū)和/或CL區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合抗體包含表2的核酸編碼的VH和/或VL區(qū)，其融合到人C區(qū)。當(dāng)抗體用于治療目的時(shí)，可以缺失人CH2結(jié)構(gòu)域。嵌合抗體包含如上述的抗體片段。
嵌合抗體的可變片段通常連接到免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。人恒定區(qū)DNA序列可以根據(jù)公知的步驟從多種人細(xì)胞，如永生的B細(xì)胞分離(見(jiàn)Kabat et al.，上文，和WO 87/02671)?？贵w可以含有輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以包括CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3，和有時(shí)包括CH4區(qū)。對(duì)于治療目的，可以缺失或者省略CH2結(jié)構(gòu)域。
如上述產(chǎn)生的嵌合抗體的可變片段通常連接到免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。人恒定區(qū)DNA序列可以根據(jù)公知的步驟從多種人細(xì)胞，如永生的B細(xì)胞分離(見(jiàn)Kabat etal.，上文，和WO 87/02671)?？贵w可以含有輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以包括CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3，和有時(shí)包括CH4區(qū)。對(duì)于治療目的，可以缺失或者省略CH2結(jié)構(gòu)域。
嵌合抗體可以包括具有所有類型的恒定區(qū)的抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE、和任意同種型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。當(dāng)希望嵌合抗體顯示出細(xì)胞毒性活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域通常是補(bǔ)體-結(jié)合的恒定區(qū)并且該類別通常是IgG1。當(dāng)不希望此類細(xì)胞毒性活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以是IgG2類別。嵌合抗體可以包含來(lái)自一種以上的類別或同種型的序列。
多種方法可以用于產(chǎn)生此類免疫球蛋白。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，多種核酸序列編碼每種免疫球蛋白氨基酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)從頭固相DNA合成或者通過(guò)所希望的多核苷酸的較早制備的變體的PCR誘變產(chǎn)生所希望的核酸序列。編碼本申請(qǐng)中描述的抗體的所有核酸都明確地包括在本發(fā)明內(nèi)。
一旦表達(dá)，本發(fā)明的完整抗體、它們的二聚體、單獨(dú)的輕鏈和重鏈或者其他免疫球蛋白形式可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化，所述方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等等(一般見(jiàn)，Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)，將其引入本文作為參考)。對(duì)于制藥目的，優(yōu)選至少約90到95％同質(zhì)性的基本上純的免疫球蛋白，最優(yōu)選98到99％或者更高同質(zhì)性的免疫球蛋白。一旦部分純化或者純化到所希望的同質(zhì)性，就可以將所述多肽治療性(包括體外)地用于開(kāi)發(fā)或者進(jìn)行測(cè)定步驟、免疫熒光染色等等(一般見(jiàn)，Immunological Methods，Vols.I and II，Lefkovitsand Pernis，eds.，Academic Press，New York，N.Y.(1979和1981)，或者檢測(cè)C35或者診斷C-35相關(guān)的癌癥。
本發(fā)明還提供了融合蛋白，其包含或者備選地，由免疫特異結(jié)合C35多肽的抗體(包括包含或者備選地，由其抗體片段和變體組成)和異源多肽組成。優(yōu)選地，該抗體融合的異源多肽用于發(fā)揮功能或者用于靶定表達(dá)C35多肽的細(xì)胞，包括但不限于，乳腺、卵巢、膀胱、結(jié)腸和胰腺癌細(xì)胞，和黑素瘤細(xì)胞。在備選優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體所融合的異源多肽用于T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，和/或單核細(xì)胞功能或者用于將抗體靶定T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或者單核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含或者備選由具有本發(fā)明抗體的任意一個(gè)或多個(gè)VH區(qū)的氨基酸序列或者本發(fā)明抗體的任意一個(gè)或多個(gè)VL區(qū)的氨基酸序列的多肽或者其片段或者變體，和異源多肽序列組成。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含或者備選由具有本發(fā)明抗體的任意1、2、3或多個(gè)VH CDRs的氨基酸序列或者本發(fā)明抗體的任意1、2、3或多個(gè)VL CDRs的氨基酸序列的多肽或者其片段或者變體，和異源多肽序列組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白包含，或者備選由具有本發(fā)明抗體的VH CDR3的氨基酸序列的多肽，或者其片段或變體，和異源多肽序列組成，所述融合蛋白免疫特異結(jié)合C35多肽。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白包含，或者備選由具有本發(fā)明抗體的至少一個(gè)VH區(qū)的氨基酸序列和本發(fā)明抗體的至少一個(gè)VL區(qū)的氨基酸序列或者其片段或變體，和異源多肽序列組成。優(yōu)選地，融合蛋白的VH和VL區(qū)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的一種抗體(或者scFv或者Fab片段)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含或者備選由本發(fā)明抗體的任意1、2、3或多個(gè)VH CDRs的氨基酸序列和本發(fā)明抗體的任意1、2、3或多個(gè)VL CDRs的氨基酸序列的多肽或者其片段或者變體，和異源多肽序列組成。優(yōu)選地，2、3、4、5、6、或者多個(gè)VHCDR(s)或VLCDR(s)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的單個(gè)抗體(或者scFv或者Fab片段)。本發(fā)明還包括編碼這些融合蛋白的核酸分子。
如下文更詳細(xì)討論的，本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)或者與其他組分組合使用?？贵w還可以在N-或者C-末端重組融合到異源多肽或者化學(xué)綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)到多肽或者其他組分。例如，本發(fā)明的抗體可以重組融合到或者綴合到用作檢測(cè)測(cè)定法中的標(biāo)記的分子或者效應(yīng)分子，如異源多肽、藥物、放射性核素或者毒素。見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美國(guó)專利號(hào)5,314,995；和EP 396,387。
作為另一非限制性實(shí)例，可以將本發(fā)明的抗體作為被動(dòng)免疫的形式施用于個(gè)體。備選地，本發(fā)明的抗體可以用于表位作圖以鑒定該抗體結(jié)合的表位。以該方法鑒定的表位又例如，可以用作疫苗候選物，即，免疫個(gè)體以引起針對(duì)天然發(fā)生的形式的C35的抗體，其用于治療方法。
本發(fā)明的抗體可以作為C35多肽的激動(dòng)劑或者拮抗劑。
本發(fā)明的抗體可以用于例如，但不限于，純化、檢測(cè)和靶定本發(fā)明的多肽，包括體外和體內(nèi)診斷和治療方法。例如，抗體可以用于免疫測(cè)定中以定性和定量地測(cè)量生物樣品中本發(fā)明多肽的水平。見(jiàn)，例如，Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2nd ed.1988)(將其完整引入本文作為參考)。
本發(fā)明的抗體包括經(jīng)修飾的衍生物，即通過(guò)將任意類型的分子共價(jià)連接到所述抗體使得該共價(jià)連接不防止該抗體產(chǎn)生抗獨(dú)特型反應(yīng)或者結(jié)合C35。例如，但不限于，抗體衍生物包括經(jīng)修飾的抗體，所述修飾為例如糖基化、乙?；EG化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生、蛋白酶切、連接到細(xì)胞配體或其他蛋白質(zhì)，等等?？梢酝ㄟ^(guò)已知技術(shù)進(jìn)行多種化學(xué)修飾的任一種修飾，所述技術(shù)包括但不限于特異化學(xué)切割、乙?；⒓柞；⒁旅顾氐拇x合成，等等。此外，衍生物可以含有一種或多種非典型的氨基酸。
本發(fā)明的抗體可以由通過(guò)肽鍵或者修飾的肽鍵相互連接的氨基酸，即肽等排物組成，并且可以含有不同于20種基因編碼的氨基酸的氨基酸。C35抗體可以通過(guò)天然過(guò)程，如翻譯后加工，或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。此類修飾在基本教科書(shū)和在更詳細(xì)的專著，以及在大部頭研究文獻(xiàn)中詳細(xì)描述。修飾可以在C35抗體的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端發(fā)生。將理解在給定C35抗體中一些位點(diǎn)可以以相同或者不同程度存在相同類型的修飾。而且，給定C35抗體可以含有許多類型的修飾。C35抗體可以例如由于遍在蛋白化而分枝，并且它們可以是環(huán)狀的，有或者沒(méi)有分枝。環(huán)狀、分枝的和分枝的環(huán)狀C35抗體可以來(lái)自翻譯后天然過(guò)程或者可以通過(guò)合成方法制備。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或者核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂類或脂類衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸化、氨基酸向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的加入，如精氨?；捅樵诘鞍谆?見(jiàn)，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS.B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol 182626-646(1990)；Rattanet al.，Ann NY Acad Sci 66348-62(1992).)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及包含C35抗體序列的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有至少一個(gè)氨基酸替代，但是不多于50個(gè)氨基酸替代，甚至更優(yōu)選地，不多于40個(gè)氨基酸替代，更優(yōu)選地，不多于30個(gè)氨基酸替代，甚至更優(yōu)選地，不多于20個(gè)氨基酸替代。當(dāng)然，按照遞增的優(yōu)選性，高度優(yōu)選該肽的氨基酸序列包含C35抗體序列，其含有至少1個(gè)，但是不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸替代。在特定實(shí)施方案中，C35抗體序列中加入、替代和/或缺失數(shù)為1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150。對(duì)于替代，優(yōu)選保守氨基酸替代。替代可以在構(gòu)架區(qū)或者CDR或者兩者內(nèi)。
該章節(jié)中的描述適用于C35抗體和可用于本發(fā)明方法的其他抗體。此類抗體可以綴合到毒素或者與毒素復(fù)合，如本文描述，或者可以是非綴合或者非復(fù)合的。
編碼C35抗體的多核苷酸
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的C35抗體(包括包含或者備選由其抗體片段或變體組成的分子)的核酸分子。
本發(fā)明還包含在如上定義的嚴(yán)緊雜交條件或者備選地，較低嚴(yán)緊雜交條件下與編碼抗體，優(yōu)選特異結(jié)合C35多肽的抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼抗體(包括包含或者備選由其抗體片段或變體組成的分子)，所述抗體包含或備選由VH區(qū)和VL區(qū)組成，VH區(qū)具有本發(fā)明的核酸編碼的任一個(gè)VH區(qū)的氨基酸序列，VL區(qū)具有本發(fā)明的核酸編碼的任一個(gè)VL區(qū)的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼抗體(包括包含或者備選由其抗體片段或變體組成的分子)，所述抗體包含或備選由VH區(qū)或VL區(qū)組成，VH區(qū)具有本發(fā)明的核酸編碼的任一個(gè)VH區(qū)的氨基酸序列，VL區(qū)具有本發(fā)明的核酸編碼的任一個(gè)VL區(qū)的氨基酸序列。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法得到多核苷酸并且確定該多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，那么可以從化學(xué)合成的寡核苷酸裝配編碼所述抗體的多核苷酸(例如，如Kutmeieret al.，BioTechniques 17242(1994)中描述)，簡(jiǎn)言之，這包括合成含有編碼所述抗體的部分序列的重疊的寡核苷酸，將那些寡核苷酸退火并連接，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增所連接的寡核苷酸。
備選地，可以從適宜來(lái)源的核酸產(chǎn)生編碼抗體的多核苷酸。如果不能得到含有編碼特定抗體的核酸的克隆，但是抗體分子的序列是已知的，那么可以化學(xué)合成或者從適宜的來(lái)源(例如，抗體cDNA文庫(kù)，或者從核酸，優(yōu)選聚A+RNA產(chǎn)生、從表達(dá)所述抗體的組織或細(xì)胞(如選擇表達(dá)本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞)分離的cDNA文庫(kù))使用與所述序列的3’和5’末端雜交的合成引物通過(guò)PCR擴(kuò)增或者使用對(duì)特定基因序列特異的寡核苷酸探針(用于鑒定來(lái)自cDNA文庫(kù)的編碼所述抗體的cDNA克隆)通過(guò)克隆得到編碼所述免疫球蛋白的核酸。然后使用本領(lǐng)域公知的任意方法將PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增的核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體中。
一旦確定了核苷酸序列或者抗體的對(duì)應(yīng)氨基酸序列，就可以使用本領(lǐng)域公知的用于操作核苷酸序列的技術(shù)，例如，重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等等操作抗體的核苷酸序列(見(jiàn)，例如，Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubelet al.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY中描述的技術(shù)，將這些文獻(xiàn)完整引入本文作為參考)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如，產(chǎn)生氨基酸替代、缺失和/或插入。
在特定實(shí)施方案中，可以檢查重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)鑒定互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)的序列，例如，通過(guò)比較其他重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列來(lái)確定序列高變區(qū)。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可以將一個(gè)或多個(gè)CDR插入構(gòu)架區(qū)內(nèi)，例如，插入人構(gòu)架區(qū)以人源化非人抗體，如上述。構(gòu)架區(qū)可以是天然發(fā)生的或者是共有構(gòu)架區(qū)，并且優(yōu)選是人構(gòu)架區(qū)(關(guān)于人構(gòu)架區(qū)列表，見(jiàn)，例如，Chothia et al.，J.Mol.Biol.278457-479(1998))。優(yōu)選地，通過(guò)組合構(gòu)架區(qū)和CDR產(chǎn)生的多核苷酸編碼特異結(jié)合C35的抗體。優(yōu)選地，如上文討論，可以在構(gòu)架區(qū)中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，并且優(yōu)選地，所述氨基酸替代提高了該抗體與其抗原的結(jié)合。此外，此類方法可以用于對(duì)參與鏈內(nèi)二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)半胱氨酸殘基進(jìn)行氨基酸缺失或替代以產(chǎn)生缺少一個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。對(duì)多核苷酸的其他改變被本發(fā)明包括并且在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。
此外，可以使用用于產(chǎn)生“嵌合抗體”而開(kāi)發(fā)的技術(shù)(Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314452-454(1985))，該技術(shù)將來(lái)自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來(lái)自具有適宜生物活性的人抗體分子的基因剪接產(chǎn)生所述嵌合抗體。如上文描述的，嵌合抗體是這樣的分子，其中不同部分來(lái)自不同動(dòng)物物種，如具有來(lái)自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子，例如，人源化抗體。
備選地，所描述的用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,946,778；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward et al.，Nature334544-54(1989))可以適用于產(chǎn)生單鏈抗體。通過(guò)將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段通過(guò)氨基酸橋連接，得到單鏈多肽，可以形成單鏈抗體。也可以使用用于大腸桿菌中功能Fv片段的裝配的技術(shù)(Skerra et al.，Science 2421038-1041(1988))。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體(包括包含或者備選由其抗體片段或變體組成的分子)的核酸分子。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼抗體(包括包含或者備選由其抗體片段或變體組成的分子)，該抗體包含或者備選由VH區(qū)和VL區(qū)組成，其中VH區(qū)具有SEQID NO56或60的核酸或者表2或3中提及的核酸編碼的任意一個(gè)VH區(qū)的氨基酸序列，VL區(qū)具有SEQ ID NO58的核酸或者表2或3中提及的核酸編碼的任意一個(gè)VL區(qū)的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼抗體(包括包含或者備選由其抗體片段或變體組成的分子)，該抗體包含或者備選由VH區(qū)或VL區(qū)組成，其中VH區(qū)具有SEQ ID NO56或60的核酸或者表2或3中提及的核酸編碼的任意一個(gè)VH區(qū)的氨基酸序列，VL區(qū)具有SEQ ID NO58的核酸或者表2或3中提及的核酸編碼的任意一個(gè)VL區(qū)的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了包含或者由本文描述的抗體分子(例如，VH區(qū)和/或VL區(qū))的變體(包括衍生物)組成的抗體，所述抗體免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段或變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于在編碼本發(fā)明分子的核苷酸序列中導(dǎo)入突變，所述技術(shù)包括，例如，定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，其導(dǎo)致氨基酸替代。優(yōu)選地，相對(duì)于參考VH區(qū)、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、和/或VL區(qū)、VLCDR1、VLCDR2、或VLCDR3，變體(包括衍生物)編碼小于50個(gè)氨基酸替代、小于40個(gè)氨基酸替代、小于30個(gè)氨基酸替代、小于25個(gè)氨基酸替代、小于20個(gè)氨基酸替代、小于15個(gè)氨基酸替代、小于10個(gè)氨基酸替代、小于5個(gè)氨基酸替代、小于4個(gè)氨基酸替代、小于3個(gè)氨基酸替代或小于2個(gè)氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是這樣的替代，其中將氨基酸殘基用具有相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。具有相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸的家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中確定。這些家族包括堿性側(cè)鏈氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。備選地，可以沿著編碼序列的全部或者部分隨機(jī)導(dǎo)入突變，例如，通過(guò)飽和誘變，并且可以對(duì)所得突變體篩選生物活性以鑒定保持活性(例如，結(jié)合C35多肽的能力)的突變體。
例如，可能僅在抗體分子的構(gòu)架區(qū)或者僅在CDR區(qū)或者兩個(gè)區(qū)中導(dǎo)入突變。所導(dǎo)入的突變可以是沉默的或者中性錯(cuò)義突變，即對(duì)抗體結(jié)合抗原的能力沒(méi)有，或者有很小的影響。這些類型的突變可以用于優(yōu)化密碼子利用，或者提高雜交瘤的抗體產(chǎn)生。備選地，非中性錯(cuò)義突變可以改變抗體結(jié)合抗原的能力。多數(shù)沉默和中性錯(cuò)義突變的位置可能在構(gòu)架區(qū)中，而多數(shù)非中性錯(cuò)義突變的位置可能在CDR，盡管這不是絕對(duì)的要求。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以設(shè)計(jì)和測(cè)試突變分子的所希望的性質(zhì)，如抗原結(jié)合活性沒(méi)有改變或者結(jié)合活性的改變(例如，抗原結(jié)合活性的提高或者抗體特異性的改變)。誘變后，所編碼的蛋白質(zhì)可以常規(guī)表達(dá)并且所編碼蛋白質(zhì)的功能和/或生物活性(例如，免疫特異結(jié)合C35多肽的能力)可以使用本文描述的技術(shù)或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)修飾技術(shù)確定。
在特定實(shí)施方案中，免疫特異結(jié)合C35多肽或者其片段或變體的本發(fā)明的抗體(包括包含或者備選地，由抗體片段或其變體組成的分子)包含，或者備選地，由核苷酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下與和編碼SEQ ID NOs56、58或60的或者表2或表3中提及的核酸編碼的VH或VL區(qū)之一的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列雜交，例如，在高度嚴(yán)緊條件下，在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃下與膜結(jié)合的DNA雜交，然后在0.2xSSC/0.1％ SDS中約50-65℃下洗滌1次或多次，例如，在6xSSC中約45℃下與膜結(jié)合的核酸雜交，然后在0.1xSSC/0.2％SDS中約68℃下洗滌1次或多次，或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他嚴(yán)緊雜交條件下雜交(見(jiàn)，例如，Ausubel，F(xiàn).M.et al.，eds.，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，6.3.1-6.3.6頁(yè)和2.10.3)。本發(fā)明還包括編碼這些抗體的核酸分子。
注意到上面條件的改變可以通過(guò)包括和/或替代用于抑制雜交實(shí)驗(yàn)中背景的備選封閉試劑來(lái)完成。典型的封閉試劑包括Denhardt′s試劑、BLOTTO、肝素、變性的鮭精DNA，和通過(guò)商業(yè)途徑可得到的專利制劑。由于相容性問(wèn)題，特定封閉試劑的包括可能需要修飾上述雜交條件。
當(dāng)然，僅與多聚A+序列，或者與T(或者U)殘基的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸將不包括在“多核苷酸”的定義中，因?yàn)榇祟惗嗪塑账釋⑴c含有一段多聚(A)或者其互補(bǔ)序列的核酸分子(例如，使用寡聚dT作為引物產(chǎn)生的幾乎任意雙鏈DNA克隆)雜交。
C35抗體多核苷酸可以由任意聚核糖核苷酸或者聚脫氧核糖核苷酸組成，其可以是未修飾的RNA或者DNA或者修飾的RNA或者DNA。例如，C35抗體多核苷酸可以由單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA，和單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA、包含DNA和RNA(其可以是單鏈的，更通常為雙鏈的，或者為單鏈和雙鏈區(qū)的混合物)的雜合分子組成。此外，C35抗體多核苷酸可以由三鏈區(qū)組成，該三鏈區(qū)包含RNA或者DNA或者RNA和DNA。為了穩(wěn)定或者其他原因，C35抗體多核苷酸還可以含有一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基或者經(jīng)修飾的DNA或者RNA主鏈?！靶揎椀摹眽A基包括，例如，三苯甲基化堿基和罕見(jiàn)堿基，如肌苷。可以對(duì)DNA和RNA進(jìn)行多種修飾；從而“多核苷酸”包括化學(xué)、酶促或者代謝修飾的形式。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體(包括抗體片段或變體)。例如，將明白根據(jù)本發(fā)明的抗體可以在不同于雜交瘤細(xì)胞系的細(xì)胞系中表達(dá)。例如，編碼cDNA的序列或者特定抗體的基因組克隆可以用于轉(zhuǎn)化適宜的哺乳動(dòng)物或者非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞或者產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)。此外，本發(fā)明的多肽抗體可以化學(xué)合成或者通過(guò)使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。
產(chǎn)生本發(fā)明抗體的一種方法是克隆SEQ ID NO56、58或60的多核苷酸或者表2或3中提及的多核苷酸的任意一種或多種編碼的VH和/或VL區(qū)。為了從雜交瘤細(xì)胞系或者核酸分離VH和VL區(qū)，可以使用包括VH或者VL核苷酸序列的PCR引物來(lái)擴(kuò)增含有SEQ ID NOs56、58或60或者表2或3中的核酸的載體中所含的VH和VL序列。然后可以使用載體克隆PCR產(chǎn)物，所述載體例如有PCR產(chǎn)物克隆位點(diǎn)，該克隆位點(diǎn)由5’和3’單個(gè)T核苷酸突出端組成，所述突出端與通過(guò)用于PCR反應(yīng)的許多DNA聚合酶加入PCR產(chǎn)物的5’和3’的突出的單個(gè)腺嘌呤核苷酸互補(bǔ)。然后可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法對(duì)VH和VL區(qū)測(cè)序。
克隆的VH和VL基因可以置于一個(gè)或多個(gè)適宜的表達(dá)載體中。作為非限制性實(shí)例，可以用PCR引物擴(kuò)增VH或者VL序列，所述引物包括VH或者VL核苷酸序列、限制性位點(diǎn)和保護(hù)限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆技術(shù)，可以將PCR擴(kuò)增的VH區(qū)克隆到載體中，其中所述載體表達(dá)適宜的免疫球蛋白恒定區(qū)，例如，VH區(qū)的人IgG1或者IgG4恒定區(qū)，和κ和λVL區(qū)的人κ或λ恒定區(qū)。優(yōu)選地，表達(dá)VH或者VL區(qū)的載體包含適于在所選表達(dá)系統(tǒng)中指導(dǎo)重鏈和輕鏈表達(dá)的啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的克隆位點(diǎn)、免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域和選擇標(biāo)記，如新霉素選擇標(biāo)記。VH和VL區(qū)還可以克隆到表達(dá)必要恒定區(qū)的單個(gè)載體。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(見(jiàn)例如，Guo et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.82925-31(1997)，和Ames et al.，J.Immunol.Methods 184177-86(1995)，將它們完整引入本文作為參考)將重鏈轉(zhuǎn)化載體和輕鏈轉(zhuǎn)化載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中以產(chǎn)生表達(dá)全長(zhǎng)抗體，例如IgG的穩(wěn)定或瞬時(shí)細(xì)胞系。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明的抗體和其片段的核苷酸序列。本發(fā)明還包含多核苷酸，其在如上文定義的嚴(yán)緊或者較低嚴(yán)緊的雜交條件下與編碼抗體，優(yōu)選特異結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選結(jié)合具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或者所保藏的克隆編碼的多肽的抗體的多核苷酸雜交。
對(duì)于一些用途，例如對(duì)于本發(fā)明抗體的體外親和性成熟，有用的是在噬菌體展示文庫(kù)中將本發(fā)明的一種或多種抗體的重鏈和輕鏈的VH和VL區(qū)表達(dá)為單鏈抗體或者Fab片段。例如，使用噬菌體展示文庫(kù)，可以以所有可能的組合表達(dá)編碼本發(fā)明的一種或多種抗體的VH和VL區(qū)的cDNA，允許選擇VH/VL組合，該組合以優(yōu)選的結(jié)合特征(如提高的親和性或者提高的解離速率)結(jié)合C35多肽。此外，本發(fā)明的一種或多種抗體的VH和VL片段、VH和VL區(qū)的CDR區(qū)尤其可以在體外突變。具有“突變的”CDR的VH和VL區(qū)在噬菌體展示文庫(kù)中的表達(dá)允許選擇VH/VL組合，該組合以優(yōu)選的結(jié)合特征(如提高的親和性或者提高的解離速率)結(jié)合C35多肽受體多肽。
在噬菌體展示方法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域展示在噬菌體克隆的表面，所述噬菌體顆粒攜帶編碼所述結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列。具體地，從動(dòng)物cDNA文庫(kù)(例如，淋巴組織的人或者鼠cDNA文庫(kù))或者合成的cDNA文庫(kù)擴(kuò)增編碼VH和VL區(qū)的DNA序列。編碼VH和VL區(qū)的DNA通過(guò)PCR方法通過(guò)scFv連接體連接在一起并克隆到噬菌粒載體(例如，pCANTAB6或者pComb 3 HSS)。載體在大腸桿菌中電穿孔并且用輔助噬菌體感染大腸桿菌。用于這些方法的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13，并且VH和VL區(qū)通常與噬菌體基因III或者基因VIII重組融合?？梢杂每乖x擇或鑒定表達(dá)結(jié)合目的抗原(即，C35多肽或者其片段)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體，例如用標(biāo)記的抗原或者結(jié)合或者捕獲到固體表面或者珠子的抗原。可用于制備本發(fā)明抗體的噬菌體展示方法的實(shí)例包括，但不限于，在Brinkman et al.，J.Immunol.Methods18241-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187 9-18(1997)；Burton et al.，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB91/01134；PCT公開(kāi)WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18719；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO97/13844；和U.S.Patent Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,717；5,780,225；5,658,727；5,735,743和5,969,108中公開(kāi)的方法，將這些參考文獻(xiàn)的每一個(gè)都完整引入本文作為參考。
備選地，用于增加本發(fā)明抗體的親和性的優(yōu)選方法公開(kāi)在US 20020123057 A1中。
此外，可以使用用于產(chǎn)生“嵌合抗體”而開(kāi)發(fā)的技術(shù)(Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314452-454(1985))，該技術(shù)將來(lái)自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來(lái)自具有適宜生物活性的人抗體分子的基因剪接產(chǎn)生所述嵌合抗體。如上文描述的，嵌合抗體是這樣的分子，其中不同部分來(lái)自不同動(dòng)物物種，如具有來(lái)自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子，例如，人源化抗體。
備選地，所描述的用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,946,778；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward et al.，Nature334544-54(1989))可以適用于產(chǎn)生單鏈抗體。通過(guò)將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段通過(guò)氨基酸橋連接，得到單鏈多肽，可以形成單鏈抗體。也可以使用用于大腸桿菌中功能Fv片段的裝配的技術(shù)(Skerra et al.，Science 2421038-1041(1988))。
抗體結(jié)合的測(cè)定法
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法測(cè)定本發(fā)明抗體的免疫特異結(jié)合?？梢允褂玫拿庖邷y(cè)定包括但不限于競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定系統(tǒng)，使用諸如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“三明治”免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、沉淀反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、蛋白A免疫測(cè)定，等等。此類測(cè)定是本領(lǐng)域常規(guī)和公知的(見(jiàn)，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，將其完整引入本文作為參考)。下面簡(jiǎn)要描述代表性免疫測(cè)定(但是意在作為示例)。
免疫沉淀方案通常包括在補(bǔ)加蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、釩酸鈉)的裂解緩沖液中裂解細(xì)胞群體，所述裂解緩沖液為諸如RIPA緩沖液(1％NP-40或Triton X-100，1％去氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH 7.2，1％Trasylol)，向細(xì)胞裂解物中加入目的抗體，在4℃孵育一定時(shí)間(例如1-4小時(shí))，向細(xì)胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白Gsepharose珠，在4℃孵育約1小時(shí)或以上，在裂解緩沖液中洗滌珠子，并在SDS/樣品緩沖液中重懸浮珠子。目的抗體免疫沉淀特定抗原的能力可以通過(guò)例如蛋白質(zhì)印跡分析評(píng)估。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這樣的參數(shù)，可以修改這些參數(shù)以增加抗體對(duì)抗原的結(jié)合和降低背景(例如，用sepharose珠子預(yù)清除細(xì)胞裂解物)。關(guān)于免疫沉淀方案的進(jìn)一步討論，見(jiàn)，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的10.16.1。
蛋白質(zhì)印跡分析通常包括制備蛋白質(zhì)樣品，在聚丙烯酰胺凝膠(例如，8％-20％SDS-PAGE，取決于抗原的分子量)中電泳蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜，如硝酸纖維素、PVDF或者尼龍，在封閉溶液中封閉膜(例如，含有3％BSA或者脫脂奶的PBS)，用洗滌緩沖液(例如，PBS-Tween 20)洗滌膜，用在封閉緩沖液中稀釋的一級(jí)抗體(目的抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液洗滌膜，用在封閉緩沖液中稀釋的綴合酶底物(例如，辣根過(guò)氧化物酶或者堿性磷酸酶)或者放射性分子(例如，32P或者125I)的二級(jí)抗體(其識(shí)別一級(jí)抗體，例如，抗-人抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，并檢測(cè)所述抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以修改用以增強(qiáng)所檢測(cè)的信號(hào)和減小背景噪聲的參數(shù)。關(guān)于蛋白質(zhì)印跡方案的進(jìn)一步討論，見(jiàn)，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的10.8.1。
ELISA包括制備抗原，用該抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中加入綴合可檢測(cè)的化合物，如酶促底物(例如，辣根過(guò)氧化物酶或者堿性磷酸酶)的目的抗體，并孵育一定時(shí)間，檢測(cè)所述抗原的存在。在ELISA中，目的抗體不用必須綴合到可檢測(cè)的化合物；或者，可以向孔中加入綴合可檢測(cè)化合物的二級(jí)抗體(其識(shí)別目的抗體)。此外，可以用抗體包被孔，來(lái)代替用抗原包被孔。在該情況下，可以在向包被的孔加入目的抗原后，加入綴合到可檢測(cè)化合物的二級(jí)抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以修改后增強(qiáng)檢測(cè)的參數(shù)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其他變量。關(guān)于ELISA的進(jìn)一步討論，見(jiàn)，例如，Ausubel etal，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的11.2.1。
可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法測(cè)定抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和性和抗體-抗原相互作用的解離速率。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定的一個(gè)實(shí)例是放射免疫測(cè)定，其包括在數(shù)量逐漸增加的未標(biāo)記抗原的存在下孵育標(biāo)記的抗原(例如，3H或者125I)與目的抗體，并檢測(cè)與標(biāo)記的抗原結(jié)合的抗體。目的抗體對(duì)特定抗原的親和性和結(jié)合解離速率可以從斯卡查德圖(scatchardplot)分析的數(shù)據(jù)確定。還可以使用放射免疫測(cè)定法確定與第二種抗體的競(jìng)爭(zhēng)。在該情況中，在數(shù)量逐漸增加的未標(biāo)記的第二種抗體的存在下，將抗原與綴合標(biāo)記的化合物(例如，3H或者125I)的目的抗體孵育。
單克隆抗體(Mab)與特異抗原的親和性和動(dòng)力學(xué)的表征可以用于探測(cè)抗體或者抗原的結(jié)構(gòu)和功能。動(dòng)力學(xué)測(cè)量在用于免疫測(cè)定的適宜試劑的選擇中也是重要的。
有多種方法可用于測(cè)量抗體-抗原相互作用的親和性，但是相對(duì)少的方法可以用于確定速率常數(shù)。多數(shù)方法依賴標(biāo)記抗體或者抗原，其不可避免地使得常規(guī)測(cè)量復(fù)雜化并且在所測(cè)量的量中引入了不確定性。
在BIAcore上進(jìn)行的表面等離子體共振(SPR)相對(duì)于測(cè)量抗體-抗原作用的親和性的常規(guī)方法提供了許多優(yōu)點(diǎn)(i)不需要標(biāo)記抗體或抗原；(ii)抗體不必預(yù)先純化，細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以直接使用；(iii)能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，允許快速半定量比較不同的單克隆抗體相互作用，并且實(shí)時(shí)測(cè)量對(duì)于許多評(píng)估目的是足夠的；(iv)可以再生生物特異表面使得可以在相同條件下容易地比較一系列不同的單克隆抗體；(v)分析步驟完全自動(dòng)化，并且不用用戶干預(yù)就可以進(jìn)行廣泛系列的測(cè)量。BIAapplications Handbook，版本AB(再版1998)，BIACORE code No.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，版本AB(再版1998)，BIACORE code No.BR-1001-84。
基于SPR的結(jié)合研究需要結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員固定在傳感器表面上。所固定的結(jié)合配偶體稱作配體。溶液中的結(jié)合配偶體稱作分析物。在一些情況中，配體通過(guò)另一固定的分子(稱作捕獲分子)間接附著到表面。SPR反應(yīng)反映了檢測(cè)器表面由于分析物結(jié)合或者解離引起的質(zhì)量濃度的改變。
基于SPR，實(shí)時(shí)BIAcore測(cè)量直接監(jiān)視發(fā)生的相互作用。該技術(shù)很適合確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。比較親和性等級(jí)評(píng)定非常容易進(jìn)行，并且可以從sensorgram數(shù)據(jù)得到動(dòng)力學(xué)和親和常數(shù)。
當(dāng)分析物以不連續(xù)脈沖注射穿過(guò)配體表面時(shí)，可以將所得sensorgram分成三個(gè)基本階段(i)在樣品注射期間分析物與配體的結(jié)合；(ii)樣品注射期間的平衡或者穩(wěn)態(tài)，其中分析物結(jié)合速率受到從復(fù)合物解離的平衡；(iii)緩沖液流動(dòng)期間分析物從表面的解離。
結(jié)合和解離期提供了關(guān)于分析物-配體相互作用的動(dòng)力學(xué)的信息(ka和kd，復(fù)合物形成和解離的速率，kd/ka＝KD)。平衡期提供了關(guān)于分析物-配體相互作用的親和性的信息(KD)。
BIAevaluation軟件提供了多種功能用于通過(guò)數(shù)字積分和總體擬合算法進(jìn)行曲線擬合。使用適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析，可以從簡(jiǎn)單的BIAcore研究得到相互作用的單獨(dú)的速率和親和常數(shù)。通過(guò)該技術(shù)可以測(cè)量的親和性范圍非常寬，從mM到pM。
表位特異性是單克隆抗體的重要特征。與使用放射免疫測(cè)定、ELISA或其它表面吸附方法的常規(guī)技術(shù)相比，用BIAcore進(jìn)行表位作圖不需要標(biāo)記或者純化的抗體，并且允許用一些單克隆抗體進(jìn)行多位點(diǎn)特異性測(cè)試。此外，可以自動(dòng)處理許多分析。
逐對(duì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)試兩種MAb同時(shí)結(jié)合相同抗原的能力。針對(duì)分隔表位的MAb將獨(dú)立地結(jié)合，而針對(duì)密切相關(guān)的表位的MAb將干擾相互的結(jié)合。用BIAcore進(jìn)行的這些結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以直接進(jìn)行。
例如，可以使用捕獲分子結(jié)合第一種MAb，然后順序加入抗原和第二種MAb。Sensorgram將揭示1.有多少抗原結(jié)合到第一種MAb，2.第二種MAb結(jié)合到表面附著的抗原的程度，3.如果第二種MAb不結(jié)合，那么改變逐對(duì)測(cè)試的順序是否改變結(jié)果。
肽抑制是用于表位作圖的另一種技術(shù)。該方法可以補(bǔ)充逐對(duì)抗體結(jié)合研究，并且當(dāng)抗原的一級(jí)序列是已知的時(shí)候，可以將功能表位與結(jié)構(gòu)特征聯(lián)系起來(lái)。測(cè)試肽或者抗原片段抑制不同MAb對(duì)固定化抗原的結(jié)合。認(rèn)為干擾給定MAb的結(jié)合的肽在結(jié)構(gòu)上與該MAb定義的表位相關(guān)。
產(chǎn)生抗體的方法
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于合成抗體的方法，尤其通過(guò)化學(xué)合成或者優(yōu)選地，通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)制備本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的抗體，或者其片段、衍生物或者類似物(例如，本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈或者本發(fā)明的單鏈抗體)的重組表達(dá)可能需要構(gòu)建含有編碼所述抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦已經(jīng)得到了編碼本發(fā)明的抗體分子或者抗體的重鏈或輕鏈或者其部分(優(yōu)選含有重鏈或者輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)的多核苷酸，那么可以通過(guò)重組DNA技術(shù)，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備用于生產(chǎn)所述抗體分子的載體。從而，在本文中描述了通過(guò)表達(dá)含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸制備蛋白質(zhì)的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可以用于構(gòu)建表達(dá)載體，其含有抗體編碼序列和適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)，和體內(nèi)遺傳重組。從而，本發(fā)明提供了可復(fù)制的載體，其包含有效連接啟動(dòng)子的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼本發(fā)明的抗體分子，或者其重鏈或輕鏈或者重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。此類載體可以包括編碼抗體分子的恒定區(qū)的核苷酸序列(見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)WO 86/05807；PCT公開(kāi)WO 89/01036；和美國(guó)專利號(hào)5,122,464)并且所述抗體的可變區(qū)可以克隆到此類載體中用于表達(dá)完整重鏈或輕鏈。
將表達(dá)載體通過(guò)常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞并通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。從而，本發(fā)明包括含有有效連接異源啟動(dòng)子的多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明的抗體，或者其重鏈或輕鏈或者本發(fā)明的單鏈抗體。在用于表達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼重鏈和輕鏈的載體可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)以表達(dá)完整免疫球蛋白分子，如下文詳述。
多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可以用于表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。此類宿主表達(dá)系統(tǒng)代表載體，通過(guò)它可以產(chǎn)生目的編碼序列并隨后純化，而且還代表細(xì)胞，其當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染時(shí)，原位表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這些包括但不限于微生物，如細(xì)菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)，其用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或者粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化；酵母(例如，糖酵母屬、畢赤氏酵母屬)，其用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化；昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)，其用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染；植物細(xì)胞系統(tǒng)，其用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或者用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化；或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BIK、293、3T3細(xì)胞)，其含有重組表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或者來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)。優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，更優(yōu)選地，真核細(xì)胞，特別是用于表達(dá)完整重組抗體分子的真核細(xì)胞，用于表達(dá)重組抗體分子。例如，整合載體，如來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的主要中等早期基因啟動(dòng)子元件的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking et al.，Gene45101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 82(1990))。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)待表達(dá)的抗體分子的預(yù)期用途有利地選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)將大量產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)時(shí)(為了產(chǎn)生抗體分子的藥物組合物)，指導(dǎo)高水平表達(dá)容易純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體是所希望的。此類載體包括，但不限于，大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther et al.，EMBO J.21791(1983))，其中抗體編碼序列可以單獨(dú)連接到載體中與lac Z編碼區(qū)按讀碼框連接從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.133101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.245503-5509(1989))；等等。pGEX載體還可以用于將外源多肽表達(dá)為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，此類融合蛋白是可溶的并且可以通過(guò)吸附和結(jié)合到基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠，然后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫從裂解的細(xì)胞容易地純化。將pGEX載體設(shè)計(jì)成包括凝血酶或者因子X(jué)a蛋白酶切割位點(diǎn)，從而可以從GST部分釋放所克隆的靶基因產(chǎn)物。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作載體來(lái)表達(dá)外源基因。該病毒生長(zhǎng)在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中?？贵w編碼序列可以單獨(dú)克隆到病毒的非必需區(qū)(例如，多角體蛋白基因)中并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如，多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。對(duì)于其中腺病毒用作表達(dá)載體的情況，可以將目的抗體編碼序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。該嵌合基因然后可以通過(guò)體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。在病毒基因組的非必需區(qū)(例如，E1或E3區(qū))中的插入將產(chǎn)生這樣的重組病毒，其是活的并且能夠在感染的宿主中表達(dá)抗體分子。(例如，見(jiàn)Logan& Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359(1984))。為了插入的抗體編碼序列的有效翻譯，還需要特異起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。此外，起始密碼子必需與所希望的編碼序列的讀框同相以確保整個(gè)插入片段的翻譯。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是多種來(lái)源的，可以是天然的和合成的。通過(guò)包括合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、翻譯終止子等等可以增強(qiáng)表達(dá)效率(見(jiàn)，Bittner et al.，Methods in Enzymol.15351-544(1987))。
此外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或者以所希望的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的此類修飾(例如，糖基化)和加工(例如，切割)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞對(duì)于蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾有特征性和特定的機(jī)制?？梢赃x擇適宜的細(xì)胞系或者宿主系統(tǒng)來(lái)確保所表達(dá)的外來(lái)蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為此，可以使用真核宿主細(xì)胞，其具有用于正確加工初級(jí)轉(zhuǎn)錄物、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制。此類哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138，尤其乳腺癌細(xì)胞系，如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，和正常的乳腺細(xì)胞系，如CRL7030和Hs578Bst。
為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)率地產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，可以工程化穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以用通過(guò)合適的表達(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點(diǎn)等等)和選擇性標(biāo)記控制的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。導(dǎo)入外源DNA后，可以允許工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予對(duì)選擇的抗性并允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合到它們的染色體并生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)化灶，其又可以克隆和擴(kuò)大成細(xì)胞系。該方法可以有利地用于工程化表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。此類工程化的細(xì)胞系尤其可以用于篩選和評(píng)估與抗體分子直接或者間接相互作用的化合物。
如上面描述的，在US 2002 0123057 A1中公開(kāi)了產(chǎn)生單克隆抗體的優(yōu)選方法。
可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11223(1977))，次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy et al.，Cell22817(1980))基因可以分別用于tk-、hgprt-和aprt-細(xì)胞中。而且，可以基于下面的基因選擇使用抗代謝物抗性dhfr，其賦予甲氨蝶呤抗性(Wigler et al.，Natl.Acad.Sci.USA 77357(1980)；O′Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))；gpt，其賦予麥考酚酸抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072(1981))；neo，其賦予對(duì)氨基糖苷G-418的抗性(ClinicalPharmacy 12488-505；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Scierce 260926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，1993，TIB TECH11(5)155-215)；和hygro，其賦予潮霉素抗性(Santerre et al.，Gene 30147(1984))。重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法可以常規(guī)地用于選擇所希望的重組克隆，并且此類方法描述于例如Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和12和13章，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.1501(1981)，將這些文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。
可以通過(guò)載體擴(kuò)增增加抗體分子的表達(dá)水平(綜述見(jiàn)Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification forthe expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴(kuò)增的時(shí)候，增加宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的抑制劑的水平將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。因?yàn)閿U(kuò)增的區(qū)域與抗體基因相關(guān)，所有抗體的產(chǎn)量將也增加(Crouse et al.，Mol.Cell.Biol.3257(1983))。
宿主細(xì)胞可以用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一種載體編碼來(lái)自重鏈的多肽，第二種載體編碼來(lái)自輕鏈的多肽。兩種載體可以含有相同的選擇性標(biāo)記，其使得等量表達(dá)重鏈和輕鏈多肽。備選地，可以使用一種載體，其編碼并且能夠表達(dá)重鏈和輕鏈多肽兩者。在該情況中，輕鏈應(yīng)該置于重鏈的前面以避免毒性的游離重鏈過(guò)量(Proudfoot，Nature 32252(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包含cDNA或者基因組DNA。
可以開(kāi)發(fā)針對(duì)完整C35多肽或者其部分，或者異戊二烯化、糖基化、磷酸化、豆蔻?；蛘啧０坊牟课坏目贵w。
可以通過(guò)任何常規(guī)方法產(chǎn)生作為表位的片段(見(jiàn)，例如，Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)，在美國(guó)專利號(hào)4,631,211中進(jìn)一步描述)。
類似地，免疫原性表位可以用于根據(jù)本發(fā)明公知的方法誘導(dǎo)抗體。(見(jiàn)，例如，Sutcliffe et al.，上文；Wilson et al.，上文；Chowet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82910-914；和Bittle et al.，J.Gen.Virol.662347-2354(1985)。優(yōu)選的免疫原性表位包括本文公開(kāi)的免疫原性表位，以及這些免疫原性表位的2、3、4、5或者多個(gè)的任意組合。包含一個(gè)和多個(gè)免疫原性表位的多肽可以用于與載體蛋白，如白蛋白一起呈遞以對(duì)動(dòng)物系統(tǒng)(如兔或者小鼠)引起抗體應(yīng)答，或者，如果所述多肽足夠長(zhǎng)(至少約25個(gè)氨基酸)，那么該多肽可以不用載體而直接呈遞。然而，已經(jīng)表明包含少至8到10個(gè)氨基酸的免疫原性表位足夠產(chǎn)生抗體，該抗體能夠至少結(jié)合到變性多肽中的線性表位(例如，在蛋白質(zhì)印跡中)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的表位包括下文表11中給出的那些表位。
本發(fā)明的攜帶表位的多肽可以用于根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法誘導(dǎo)抗體，所述方法包括但不限于體內(nèi)免疫、體外免疫，和噬菌體展示方法。見(jiàn)，例如，Sutcliffe et al.，上文；Wilson et al.，上文，和Bittle et al.，J.Gen.Virol.，662347-2354(1985)。如果使用體內(nèi)免疫，那么可以用游離肽免疫動(dòng)物；然而，通過(guò)將肽偶聯(lián)到大分子載體，如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或者破傷風(fēng)類毒素可以加強(qiáng)抗肽抗體的效價(jià)。例如，使用連接體，如馬來(lái)酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)可以將含有半胱氨酸殘基的肽偶聯(lián)到載體，而使用更一般的連接試劑，如戊二醛可以將其他肽偶聯(lián)到載體。
還可以將本發(fā)明的具有表位的肽作為多抗原肽(MAPs)合成，首先由J.P.Tam在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855409中描述，將該文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。MAP由連接到非免疫原性賴氨酸核心的多個(gè)拷貝的特定肽組成。Map肽通常含有肽的四個(gè)或八個(gè)拷貝，通常稱作MAP-4或者M(jìn)AP-8肽。作為非限制性實(shí)例，可以將MAP合成到賴氨酸核心基質(zhì)，該基質(zhì)附著到聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持體。使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化學(xué)將目的肽合成到賴氨酸殘基上。例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)提供了MAP樹(shù)脂，如Fmoc Resin 4 Branch和Fmoc Resin 8 Branch，它們可以用于合成MAP。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的基于三氟乙酸(TFA)的混合物進(jìn)行MAP從樹(shù)脂的切割。除了脫鹽，MAP的純化是不必要的。MAP肽可以用作免疫疫苗，其引起識(shí)別MAP和衍生該肽的天然蛋白質(zhì)的抗體。
本發(fā)明的具有表位的肽還可以摻入病毒的外殼蛋白質(zhì)，其然后可以用作免疫原或者疫苗免疫動(dòng)物，包括人，以便刺激產(chǎn)生抗-表位抗體。例如，人1型免疫缺陷病毒(HIV-1)的gp120糖蛋白的V3環(huán)已經(jīng)工程化而在鼻病毒的表面上表達(dá)。用展示該V3環(huán)肽的該鼻病毒免疫產(chǎn)生了HIV-1免疫原的表觀有效的模擬物(如通過(guò)它們被抗-HIV-1抗體中和的能力以及它們引起產(chǎn)生能夠中和細(xì)胞培養(yǎng)物中HIV-1的抗體的能力)。該使用工程化的病毒顆粒作為免疫原的技術(shù)在Smith et al.，Behring Inst Mitt Feb；(98)229-39(1997)，Smith et al，J Virol72651-9(1998)，和Zhang et al.，Biol Chem 380365-74(1999)中更詳細(xì)地描述，將這些文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。
用游離的或者偶聯(lián)載體的肽或者M(jìn)AP肽免疫動(dòng)物，如兔、大鼠和小鼠，例如，通過(guò)腹膜內(nèi)和/或皮內(nèi)注射含有約100μg肽或者載體蛋白質(zhì)和弗氏佐劑或者已知用于刺激免疫應(yīng)答的任意其他佐劑的乳液進(jìn)行免疫?？赡苄枰獛状渭訌?qiáng)注射，例如，約兩周間隔的加強(qiáng)注射，以提供有用效價(jià)的抗肽抗體，其可以例如，通過(guò)ELISA測(cè)定使用吸附到固體表面的游離肽檢測(cè)到。可以增加來(lái)自免疫動(dòng)物的血清中抗肽抗體的效價(jià)，這可以通過(guò)選擇抗肽抗體，例如，通過(guò)根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法將肽吸附到固相支持體并洗脫所選抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。
一旦本發(fā)明的抗體分子已經(jīng)通過(guò)動(dòng)物產(chǎn)生、化學(xué)合成或者重組表達(dá)，就可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子的方法，例如，通過(guò)層析法(例如，離子交換、親和，尤其通過(guò)蛋白A后對(duì)特定抗原的親和性，和分篩柱層析)、離心、差別溶解性，或者通過(guò)任何其他用于純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化本發(fā)明的抗體分子。此外，本發(fā)明的抗體或者其片段可以融合到本文描述的或者本領(lǐng)域已知的異源多肽序列以方便純化。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意適宜的方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的多克隆抗體。例如，可以將本發(fā)明的多肽施用于多種宿主動(dòng)物，包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠等等，以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有對(duì)所述抗原特異的多克隆抗體的血清。取決于宿主種類，可以用多種佐劑增加免疫應(yīng)答，并且所述佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全佐劑)、礦物凝膠，如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、普流羅尼(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚、和潛在有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。此類佐劑也是本領(lǐng)域公知的。
可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)制備單克隆抗體，所述技術(shù)包括雜交瘤、重組和噬菌體展示技術(shù)，或者它們的組合。例如，可以使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體，雜交瘤技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的并且在例如Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，et al.，inMonoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述參考文獻(xiàn)完整引入本文作為參考)中教導(dǎo)的那些技術(shù)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”不限于通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指來(lái)自單個(gè)克隆的抗體，所述克隆包括任意真核的、原核的或者噬菌體克隆，而不是指產(chǎn)生它的方法。
用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生和篩選特異抗體的方法是本領(lǐng)域常規(guī)和公知的并且在實(shí)施例中詳細(xì)討論。在非限制性實(shí)例中，可以用本發(fā)明的多肽或者表達(dá)該肽的細(xì)胞免疫小鼠。一旦檢測(cè)到免疫應(yīng)答，例如，在小鼠血清中檢測(cè)到對(duì)所述抗原特異的抗體，就收獲小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞。然后通過(guò)公知技術(shù)將脾細(xì)胞與任意適宜的骨髓瘤細(xì)胞，例如，可以從ATCC得到的細(xì)胞系SP20的細(xì)胞融合。選擇雜交瘤并通過(guò)有限稀釋克隆。然后通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定雜交瘤克隆中分泌能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的細(xì)胞。可以通過(guò)用陽(yáng)性雜交瘤克隆免疫小鼠產(chǎn)生腹水，其一般含有高水平的抗體。
因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生單克隆抗體的方法以及通過(guò)該方法產(chǎn)生的抗體，所述方法包括培養(yǎng)分泌本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中優(yōu)選地，通過(guò)將分離自用本發(fā)明抗原免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，然后對(duì)所述融合得到的雜交瘤篩選分泌能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的雜交瘤克隆，產(chǎn)生所述雜交瘤。
可以通過(guò)已知的技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別特定表位的抗體片段。例如，本發(fā)明的Fab和F(ab′)2片段可以通過(guò)免疫球蛋白分子的蛋白酶解切割產(chǎn)生，使用諸如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab片段)或者胃蛋白酶(以產(chǎn)生F(ab′)2片段)。F(ab′)2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域。
例如，還可以使用本領(lǐng)域已知的多種噬菌體展示方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在噬菌體展示方法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域展示在噬菌體顆粒的表面上，該噬菌體顆粒攜帶編碼所述結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列。在特定實(shí)施方案中，此類噬菌體可以用于展示從庫(kù)或者組合抗體文庫(kù)(例如，人或者鼠的)表達(dá)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？梢杂每乖x擇或者鑒定表達(dá)結(jié)合目的抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體，例如，使用標(biāo)記的抗原或者結(jié)合或者捕獲到固體表面或者珠子的抗原。用于這些方法中的噬菌體通常是絲狀噬菌體，其包括從噬菌體表達(dá)的fd和M13結(jié)合結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab、Fv或者二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體結(jié)構(gòu)域重組融合到噬菌體基因III或者基因VIII蛋白質(zhì)?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明抗體的噬菌體展示方法的實(shí)例包括Brinkman et al.，J.Immunol.Mthods 18241-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187 9-18(1997)；Burton et al.，Advancesin Immunology 57191-280(1994)；PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB91/01134；PCT公開(kāi)WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美國(guó)專利號(hào)5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公開(kāi)的方法，將這些文獻(xiàn)的每一個(gè)完整引入本文作為參考。
如上面的參考文獻(xiàn)中描述的，噬菌體選擇后，可以從噬菌體分離抗體編碼區(qū)并將其用于產(chǎn)生完整抗體，包括人抗體，或者任意其他希望的抗原結(jié)合片段，并在任意希望的宿主中表達(dá)，所述宿主包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌，例如，下文中詳述。例如，可以使用重組產(chǎn)生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技術(shù)，使用本領(lǐng)域已知的方法，如PCT公開(kāi)WO 92/22324；Mullinax et al.，BioTechniques 12(6)864-869(1992)；和Sawai et al.，AJRI3426-34(1995)；和Better et al.，Science 2401041-1043(1988)中公開(kāi)的方法(所述參考文獻(xiàn)完整引入作為參考)。
可以用于產(chǎn)生單鏈Fv和抗體，以及雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體的技術(shù)的實(shí)例包括美國(guó)專利號(hào)4,946,778和5,258,498；Huston etal.，Methods in Enzymology 20346-88(1991)；Shu et al.，PNAS90；7995-7999(1993)；Skerra et al.，Science 240；1038-1040(1988)；美國(guó)公開(kāi)號(hào)20020018749和美國(guó)專利號(hào)5,837,242中描述的那些技術(shù)。對(duì)于一些應(yīng)用，包括抗體在人體的體內(nèi)用途和體外檢測(cè)測(cè)定，可以優(yōu)選使用嵌合、人源化或者人抗體。嵌合抗體是這樣的分子，其中抗體的不同部分來(lái)自不同的動(dòng)物物種，如具有來(lái)自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。見(jiàn)，例如，Morrison，Science 2291202(1985)；Oi etal.，BioTechniques 4214(1986)；Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125191-202(1989)；美國(guó)專利號(hào)5,807,715；4,816,567；和4,816397，將它們完整引入本文作為參考。人源化抗體是來(lái)自結(jié)合所希望的抗原的非人物種抗體的抗體分子，其具有來(lái)自非人物種的一個(gè)和多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)和來(lái)自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)。通常，人構(gòu)架區(qū)中的構(gòu)架殘基將用來(lái)自CDR供體抗體的對(duì)應(yīng)殘基替代以改變，優(yōu)選提高抗原結(jié)合。這些構(gòu)架替代可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法鑒定，例如，通過(guò)CDR和構(gòu)架殘基的相互作用的建模來(lái)鑒定對(duì)于抗原結(jié)合重要的構(gòu)架殘基和通過(guò)序列比較來(lái)鑒定特定位置的不尋常的構(gòu)架殘基(見(jiàn)，例如，Queen et al.，美國(guó)專利號(hào)5,585,089；Riechmann etal.，Nature 332323(1988)，將其完整引入本文作為參考)。可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)人源化抗體，所述技術(shù)包括，例如，CDR嫁接(EP 239,400；PCT公開(kāi)WO 91/09967；美國(guó)專利號(hào)5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，鑲面(veneering)或者表面重建(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5)489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering7(6)805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS 91969-973(1994))，和鏈改組(美國(guó)專利號(hào)5,565,332)。
尤其希望用完全人抗體治療性治療人類患者?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備人抗體，所述方法包括上面描述的噬菌體方法，使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)，和US 2002 0123057 A1中公開(kāi)的方法。也參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,444,887和4,716,111；和PCT公開(kāi)WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741，將這些文獻(xiàn)的每一篇完整引入本文作為參考。
還可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人抗體，所述小鼠不能表達(dá)功能內(nèi)源免疫球蛋白，但是能夠表達(dá)人免疫球蛋白基因。例如，可以將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合體隨機(jī)導(dǎo)入或者通過(guò)同源重組導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中。備選地，除了人重鏈和輕鏈基因外，還可以將人可變區(qū)、恒定區(qū)和多樣化區(qū)導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中?？梢詥为?dú)或者通過(guò)同源重組導(dǎo)入人免疫球蛋白基因座的同時(shí)使得小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因無(wú)功能。具體地，JH區(qū)的純合缺失防止內(nèi)源抗體產(chǎn)生。將修飾的胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增并顯微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后對(duì)嵌合小鼠育種產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。將轉(zhuǎn)基因小鼠用所選抗原，例如，本發(fā)明多肽的全部或者部分以正常方式免疫?？梢杂贸Ｒ?guī)雜交瘤技術(shù)從免疫的、轉(zhuǎn)基因小鼠得到針對(duì)所述抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠含有的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間重排，并隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。從而，使用該技術(shù)，可能產(chǎn)生治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。關(guān)于產(chǎn)生人抗體的該技術(shù)的綜述，見(jiàn)Lonberg andHuszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。關(guān)于用于產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的該技術(shù)的詳細(xì)討論和產(chǎn)生此類抗體的方案，見(jiàn)例如，PCT公開(kāi)WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；歐洲專利號(hào)0 598 877；U.S.Pat.Nos.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，將它們完整引入本文作為參考。此外，諸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和Genpharm(SanJose，Calif.)的公司可以使用與上述相似的技術(shù)提供針對(duì)所選抗原的人抗體。
使用稱作“引導(dǎo)選擇(guided selection)”的技術(shù)可以產(chǎn)生識(shí)別所選表位的完全人抗體。在該方法中，所選的非人單克隆抗體，例如，小鼠抗體，用于引導(dǎo)識(shí)別相同表位的完全人抗體的選擇(Jespers etal.，Bio/technology 12899-903(1988))。
此外，針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體又可以用于使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)產(chǎn)生“模擬”本發(fā)明多肽的抗獨(dú)特型抗體(見(jiàn)例如，Greenspan & Bona，F(xiàn)ASEB J.7(5)437-444；(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)2429-2438(1991))。例如，結(jié)合并且競(jìng)爭(zhēng)性抑制多肽多聚化和/或本發(fā)明多肽對(duì)配體的識(shí)別的抗體可以用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體，其“模擬”多肽多聚化和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且，結(jié)果，結(jié)合并中和多肽和/或它的配體。此類中和性抗獨(dú)特型和此類抗獨(dú)特型的Fab片段可以用于治療方案中中和多肽配體。例如，此類抗獨(dú)特型抗體可以用于結(jié)合本發(fā)明的多肽和/或結(jié)合它的配體/受體，并從而阻斷它的生物活性。
抗體綴合物
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異破壞細(xì)胞的方法(例如，破壞異常細(xì)胞，包括但不限于，腫瘤細(xì)胞)，該方法包括施用與毒素或者細(xì)胞毒性前體藥物結(jié)合的抗癌癥相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體。
“毒素”指結(jié)合并激活內(nèi)源細(xì)胞毒性效應(yīng)系統(tǒng)的化合物、放射性同位素、全毒素、修飾的毒素、毒素的催化亞基、細(xì)胞毒素(細(xì)胞毒性劑)，或者通常不存在于細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞表面上的分子或者酶，但它們?cè)诖_定的條件下導(dǎo)致細(xì)胞死亡。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用的毒素包括但不限于，本領(lǐng)域已知的放射性同位素、化合物，如結(jié)合內(nèi)在的或者誘導(dǎo)的內(nèi)源細(xì)胞毒性效應(yīng)系統(tǒng)的抗體(或者其含有補(bǔ)體結(jié)合的部分)、胸苷激酶、內(nèi)切核酸酶、RNA酶、α毒素、篦麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假單胞菌外毒素A、白喉毒素、皂草素、木鱉子皂苷、多花白樹(shù)毒蛋白(gelonin)、美洲商陸抗病毒蛋白、α-帚曲毒素和霍亂毒素?！岸舅亍边€包括細(xì)胞抑制劑或者殺細(xì)胞劑、治療劑或者放射性金屬離子，例如，α-發(fā)射體，如213Bi，或者其他放射性同位素，例如，103Pd、133Xe、131I、68Ge、54Co、65Zn、85Sr、32P、35S、90Y、153Sm、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、45Se、113Sn、90釔、117錫、186錸、166鈥、和188錸，和在下面的“復(fù)合物”章節(jié)中列出的那些；發(fā)光標(biāo)記物，如魯米諾；和熒光標(biāo)記物，如螢光素和羅丹明，和生物素。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(包括其片段或變體)綴合放射性同位素，例如，131I。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用綴合放射性同位素的抗體以用于放射免疫療法聯(lián)合化學(xué)療法。
細(xì)胞毒素或者細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和其類似物或同系物。細(xì)胞毒素或者細(xì)胞毒性劑包括，但不限于，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C、和順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(舊稱道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(舊稱放線菌素)、博來(lái)霉素、光輝霉素、和氨茴霉素(AMC)，和抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。
“細(xì)胞毒性前體藥物”是指非毒性化合物，其通過(guò)通常存在于細(xì)胞中的酶轉(zhuǎn)化成為細(xì)胞毒性化合物。根據(jù)本發(fā)明可以使用的細(xì)胞毒性前體藥物包括但不限于，苯甲酸氮芥烷化劑的谷氨酰基衍生物、依托泊苷或者絲裂霉素C的磷酸衍生物、阿糖胞苷、柔紅霉素和阿霉素的苯氧基乙酰胺衍生物。
本發(fā)明還涉及重組融合或者化學(xué)綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)到多肽(或者其部分，優(yōu)選該多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸)以產(chǎn)生融合蛋白的抗體。融合不必是直接的，而是可以通過(guò)連接體序列發(fā)生?？贵w可以對(duì)不同于C35多肽(或者其部分，優(yōu)選該多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸)的抗原特異。具體地，抗體可以對(duì)其他癌癥相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)抗原特異。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類細(xì)胞內(nèi)抗原是異戊二烯化的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抗體(包括其片段或者變體)可以融合到異源蛋白質(zhì)的N-或者C-末端(例如，免疫球蛋白Fc多肽或者人血清白蛋白多肽)。本發(fā)明的抗體還可以融合到白蛋白(包括但不限于重組人血清白蛋白(見(jiàn)，例如，1999年3月2日出版的美國(guó)專利號(hào)5,876,969，歐洲專利0 413 622，1998年6月16日出版的美國(guó)專利號(hào)5,766,883，將它們完整引入本文作為參考))，得到嵌合多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(包括其片段或變體)與人血清白蛋白的成熟形式融合(即如歐洲專利0 322 094的圖1和2中所示的人血清白蛋白的氨基酸1-585)，將其完整引入本文作為參考。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(包括其片段或變體)與多肽片段融合，該多肽片段包含或者備選地由人血清白蛋白的氨基酸殘基1-z組成，其中z是369到419的整數(shù)，該人血清白蛋白如美國(guó)專利5,766,883中描述，將該專利完整引入本文作為參考。
本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸。此類融合蛋白可以例如，方便純化并且可以增加體內(nèi)半壽期。使用本領(lǐng)域公知的方法，與多肽融合或綴合的抗體還可以用于體外免疫測(cè)定和純化方法中。見(jiàn)，例如，Harbor et al.，上文，和PCT公開(kāi)WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al.，Immunol.Lett.3991-99(1994)；美國(guó)專利5,474,981；Gillies et al.，PNAS 891428-1432(1992)；Fell etal.，J.Immunol.1462446-2452(1991)，將這些文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。
此外，本發(fā)明的抗體或者其片段可以融合標(biāo)記序列，如肽，以方便純化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是六-組氨酸肽，如在pQE載體等等中提供的標(biāo)記(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，它們中的許多可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得。如在Gentz et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86821-824(1989)中描述的，六-組氨酸提供了融合蛋白的方便的純化。用于純化的其他肽標(biāo)記包括，但不限于，“HA”標(biāo)記，其對(duì)應(yīng)于來(lái)自流感血凝素蛋白的表位(Wilson et al.，Cell 37767(1984))和“flag”標(biāo)記。
本發(fā)明還包括綴合到診斷劑或治療劑的抗體，如C35抗體或其片段。所述抗體可以作為臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程的一部分診斷性地用于例如，監(jiān)視腫瘤的發(fā)生或者發(fā)展以例如，確定給定治療方案的功效。可以將抗體偶聯(lián)到可檢測(cè)的物質(zhì)來(lái)方便檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬(使用多種正電子發(fā)射斷層術(shù))，和非放射性順磁金屬離子。可檢測(cè)的物質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)直接偶聯(lián)或者綴合到抗體(或者其片段)或者間接地通過(guò)中間物(例如，本領(lǐng)域已知的連接體)偶聯(lián)或者綴合到抗體(或者其片段)。對(duì)于金屬離子，見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)4,741,900，所述金屬離子可以綴合到抗體作為根據(jù)本發(fā)明的診斷劑。適宜的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或者乙酰膽堿酯酶；適宜的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；適宜的熒光物質(zhì)的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或者藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；適宜的放射性物質(zhì)的實(shí)例包括125I、131I、111In或者99Tc。
不將治療劑理解局限于常規(guī)化學(xué)治療劑。例如，治療劑可以是具有所希望的生物活性的蛋白質(zhì)或者多肽。此類蛋白質(zhì)可以包括例如，毒素，如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或者白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子、α干擾素、β干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原激活物、細(xì)胞凋亡劑，例如，TNF-α、TNF-β、AIMI(見(jiàn)，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 97/33899)，AIM II(見(jiàn)，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 97134911)，F(xiàn)as配體(Takahashi et al.，Int.Immunol.，61567-1574(1994))，VEGI(見(jiàn)，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO99/23105)、血栓形成劑或者抗血管形成劑，例如，血管生長(zhǎng)抑素或者內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素；或者生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物，例如，淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒細(xì)胞集落刺激因子(″G-CSF″)或者其他生長(zhǎng)因子。
抗體還可以附著到固相支持體，其尤其用于免疫測(cè)定或者靶抗原純化。此類固相支持體包括，但不限于，玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯。
用于將此類毒素和治療劑綴合到抗體的技術(shù)是公知的，見(jiàn)，例如，Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，in MonoclonalAntibodies′84Biological And Clinical Applications，Pincheraet al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe et al.，″The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62119-58(1982)。
備選地，抗體可以綴合到另一抗體形成如Segal在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中描述的抗體異源綴合物(heteroconjugate)，將該專利完整引入作為參考。
單獨(dú)或者與細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子組合施用的抗體(綴合或不綴合毒素或者治療劑)可以用作治療劑。
本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以應(yīng)用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。此類技術(shù)包括但不限于，使用雙功能綴合劑(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003；將每篇文獻(xiàn)完整引入本文作為參考)。
螯合劑分子是本領(lǐng)域已知的。例如，見(jiàn)Subramanian，R.andMeares，C.F.，″Bifunctional Chelating Agents forRadiometal-labeled monoclonal Antibodies，″in Cancer Imagingwith Radiolabeled Antibodies(D.M.Goldenberg，Ed.)KluwerAcademic Publications，Boston；Saji，H.，″Targeted delivery ofradiolabeled imaging and therapeutic agentsbifunctionalradiopharmaceuticals.″Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16209-244(1999)；Srivastava S.C.and Mease R.C.，″Progressin research on ligands，nuclides and techniques for labelingmonoclonal antibodies.″Int.J.Rad.Appl.Instrum.B18589-603(1991)；和Liu，S.and Edwards，D.S.，″Bifunctionalchelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals.″Bioconjug.Chem.127-34(2001)。可以共價(jià)結(jié)合所述抗體的任意螯合劑都可以根據(jù)本發(fā)明使用。螯合劑還包含連接螯合部分與抗體的連接體部分。
可以使用基于大環(huán)配體的雙功能螯合劑，其中通過(guò)連接到配體的碳骨架的活化臂進(jìn)行結(jié)合，如M.Moi et al.，J.Amer.Chem.Soc.492639(1989)(2-對(duì)硝基芐基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸)；S.V.Deshpande et al.，J.Nucl.Med.31473(1990)；G.Ruser et al.，Bioconj.Chem.1345(1990)；C.J.Broan et al.，J.C.S.Chem.Comm.231739(1990)；和C.J.Anderson et al.，J.Nucl.Med.36850(1995)描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑是大環(huán)螯合劑，如聚氮雜大環(huán)螯合劑，任選地含有一個(gè)或多個(gè)羧基、膦酸或者磷酸基團(tuán)。在另一實(shí)施方案中，螯合劑是選自DOTA、DOTA類似物和DOTA衍生物的螯合劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜的螯合劑分子包括DOXA(1--4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷三乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷四乙酸)，和THT(4′-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6″-雙(N′，N′-二羧基甲基-N-甲基肼基)-2，2′6′，2″-三聯(lián)吡啶)，和其類似物和衍生物。見(jiàn)，例如，Ohmono et al.，J.Med.Chem.35157-162(1992)；Kung et al.，J.Nucl.Med.25326-332(1984)；Jurisson et al.，Chem.Rev.931137-1156(1993)；和美國(guó)專利號(hào)5,367,080。其他適宜的螯合劑包括美國(guó)專利號(hào)4,647,447；4,687,659；4,885,363；EP-A-71564；WO89/00557；和EP-A-232751中公開(kāi)的螯合劑。
在另一實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明中使用的適宜的大環(huán)羧酸螯合劑包括1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮雜環(huán)十五烷-N，N′，N″，N-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(9N 3)；1，5，9-三氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″-三乙酸(12N3)；和6-溴乙酰胺-芐基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(BAT)。
抗體綴合物可以平均含有一個(gè)以上的螯合劑分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體綴合物含有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、或35個(gè)螯合劑分子。在另一實(shí)施方案中，抗體綴合物含有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)螯合劑分子。在另一實(shí)施方案中，抗體綴合物含有約1、2、3、4或5個(gè)螯合劑分子。在另一實(shí)施方案中，抗體綴合物含有平均約1個(gè)螯合劑分子。
如上述的抗體綴合物包含共價(jià)鍵合的抗體和螯合劑分子。蛋白質(zhì)和螯合劑之間的共價(jià)鍵在蛋白質(zhì)的原子和螯合劑的原子之間形成。蛋白質(zhì)的形成共價(jià)鍵的原子可以是蛋白質(zhì)的任何合適的原子，如碳、氮、氧和硫。蛋白質(zhì)上的某些官能團(tuán)優(yōu)選與螯合劑形成共價(jià)鍵。此類基團(tuán)包括蛋白質(zhì)末端的氨基；蛋白質(zhì)末端的羧基；賴氨酸殘基上的氨基；天冬氨酸或者谷氨酸殘基上的羧基；精氨酸殘基上的胍基；半胱氨酸殘基上的巰基；絲氨酸或者蘇氨酸殘基上的羥基；組氨酸殘基上的咪唑基；酪氨酸上的羥基；色氨酸基團(tuán)上的羥基；和天冬酰胺或者谷氨酰胺殘基上的酰胺基。
制備抗體綴合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的額外方面涉及制備抗體綴合物的方法。制備抗體綴合物的一般步驟包括將抗體與螯合劑反應(yīng)。適宜的螯合劑將能夠與抗體反應(yīng)而在螯合劑和抗體之間形成共價(jià)鍵。
可以形成綴合物部分的螯合劑是本領(lǐng)域已知的，并且制備此類螯合劑的方法是已知的。能夠與抗體形成共價(jià)鍵的任意螯合劑可以用于形成抗體綴合物。此類螯合劑在下面描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明方法的螯合劑是活化的螯合劑。活化的螯合劑含有官能團(tuán)，其容易與蛋白質(zhì)上的官能團(tuán)反應(yīng)，從而在蛋白質(zhì)和螯合劑之間形成共價(jià)鍵。此類官能團(tuán)是本領(lǐng)域公知的。
適宜的反應(yīng)性官能團(tuán)是能直接與抗體上的羧基、醛基、胺、醇或者巰基反應(yīng)的基團(tuán)。此類基團(tuán)包括例如，含有活性鹵素的基團(tuán)，包括例如，氯代甲基苯基和氯代乙?；?ClCH2C(＝O)-)；活化的2-(離去基團(tuán)取代的)乙基磺?；鸵一驶?，如2-氯代乙基磺?；?-氯代乙基羰基；乙烯基磺?；灰蚁┗驶?；環(huán)氧；異氰酸根合；異硫氰酸根合；醛；氮丙啶；琥珀酰亞胺氧基羰基；活化的酰基，如酰鹵；和混合酸酐。
可以用于本發(fā)明方法的螯合劑包括如本文描述的用于抗體綴合物的任何特定螯合劑。此外，在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的螯合劑是可以用于制備如上面描述的任何特定抗體綴合物的螯合劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑是選自DOTA、DOTA類似物和DOTA衍生物的活化的螯合劑，其中所述DOTA、DOTA類似物和DOTA衍生物的每一種含有適宜的活化基團(tuán)，其能夠使螯合劑分子共價(jià)結(jié)合抗體。
在另一實(shí)施方案中，用于制備根據(jù)本發(fā)明的綴合物的活化的螯合劑是a-(5-異硫氰酸根合-2-甲氧基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，其也稱作MeO-DOTA-NCS。也可以使用a-(5-異硫氰酸根合-2-甲氧基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的鹽或者酯。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制備抗體綴合物的方法包括混合、攪拌或者制備溶液，所述溶液包含抗體和螯合劑。在額外實(shí)施方案中，制備抗體綴合物的方法包括混合、攪拌或者制備溶液，該溶液包含抗體、螯合劑、檸檬酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液，和無(wú)菌水。在額外實(shí)施方案中，所述溶液還包含NaOH。在額外實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約8.5。
在額外實(shí)施方案中，制備綴合物的方法包括a)在約0℃到約50℃的溫度下混合、攪拌或者制備包含抗體和螯合劑的溶液約0.5小時(shí)到約24小時(shí)，其中所述溶液的pH為約8.0到約9.0；和b)任選加入淬滅劑(quenching aqent)。
在上面方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在約0℃到約50℃的溫度下混合、攪拌或者制備溶液。在上面方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，在約20℃到約30℃的溫度下混合、攪拌或者制備溶液?；旌稀嚢杌蛘咧苽淙芤旱臏囟瓤梢詾榧s0、5、10、15、20、25、20、35、40、45或50℃。
如上述的任意合適的螯合劑可以用于本發(fā)明方法。
用于制備綴合物的抗體與螯合劑的摩爾比可以改變?？贵w與螯合劑的摩爾比可以為約1000∶1到約1∶1000，約1到約100；約5到約20，約10到約15，約12。抗體與螯合劑的摩爾比是指反應(yīng)溶液中抗體分子的數(shù)目與螯合劑分子數(shù)目的比。
當(dāng)制備抗體綴合物時(shí)，可以混合、攪拌溶液或者允許其靜置不同的小時(shí)數(shù)，這取決于許多變量，如包括螯合劑的性質(zhì)、抗體的性質(zhì)、反應(yīng)溫度和pH、緩沖液的性質(zhì)、反應(yīng)物的摩爾比、可用的試劑的純度、催化劑或者激活物的存在的因素，和本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其他因素。在上面方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將包含抗體和螯合劑的溶液混合、攪拌或者允許靜置約0.5小時(shí)到約24小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約1小時(shí)到約20小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約2小時(shí)到約10小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約3小時(shí)到約5小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約4小時(shí)。在其他實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí)。
用于制備抗體綴合物的溶液的pH可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH將為約6、7、8、9或10。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約7到約10。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約7.5到約9.5。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約8到約9。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約8.5。
用于制備抗體綴合物的溶液可以還包含緩沖液。緩沖液是本領(lǐng)域公知的。用于制備抗體的適宜的緩沖液在下面關(guān)于用于制備抗體綴合物的方法中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液是檸檬酸緩沖液或者乙酸緩沖液。在另一實(shí)施方案中，緩沖液包括濃度為約1到約50mM并且NaCl濃度為約1到約500mM的乙酸緩沖液。在另一實(shí)施方案中，緩沖液包括濃度為約10mM并且NaCl濃度為約140mM的乙酸緩沖液。適宜的乙酸緩沖液包括濃度為約1、5、10、15、20、25、20、35、40、45或55mM的乙酸緩沖液。適宜的緩沖液和溶液包括NaCl濃度為約1、50、75、100、125、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450或500mM的緩沖液。額外適宜的緩沖液是HEPES緩沖液，尤其濃度為約100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mM的HEPES緩沖液。在額外實(shí)施方案中，所述溶液包含濃度為約500mM的HEPES緩沖液。
用于本發(fā)明方法的抗體的濃度可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液中抗體的濃度為約0.1mg/mL到約10mg/mL。在另一實(shí)施方案中，抗體濃度為約0.5mg/mL到約5mg/mL。在其他特定實(shí)施方案中，抗體濃度為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5mg/mL。在另一特定實(shí)施方案中，溶液中抗體的濃度為約1mg/mL到約2mg/mL。
還可以使用促進(jìn)綴合物形成的試劑。此類試劑通?；罨蟿┮愿菀椎嘏c蛋白質(zhì)反應(yīng)。備選地，所述試劑可以活化蛋白質(zhì)以更容易地與螯合劑反應(yīng)。此類試劑的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的并且包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二乙基偶氮二羧酸(DEAD)，和二異丙基偶氮二羧酸(DIAD)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，抗體綴合物制備到足夠程度后，可以將淬滅劑任選加入反應(yīng)溶液中。適宜的淬滅劑是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，淬滅劑是甘氨酸。在特定實(shí)施方案中，包含甘氨酸緩沖液的溶液用作淬滅實(shí)例。作為實(shí)例，包含抗體和螯合劑的反應(yīng)溶液經(jīng)混合、攪拌或者允許靜置足夠時(shí)間后，例如，1-10小時(shí)、3-5小時(shí)、或者1-3小時(shí)后，向反應(yīng)溶液中加入包含甘氨酸緩沖液的溶液以終止反應(yīng)。然后允許反應(yīng)溶液靜置額外的時(shí)間，例如，約0.25、0.5、0.75、1或1.5小時(shí)。
制備抗體綴合物的方法可以包括混合、攪拌或者制備溶液，該溶液包含
濃度為約1到約2mg/mL的抗體；
MeO-DOTA-NCS，其量使得抗體與MeO-DOTA-NCS的比為約1到12；
檸檬酸緩沖液，其濃度為約0.5到約20mM；
濃度為約1到約200mM的NaCl；
濃度為約10到約500mM的HEPES緩沖液；和
無(wú)菌水。
該方法可以包括
制備包含抗體和檸檬酸緩沖液的第一種溶液；
向所述第一種溶液加入包含HEPES緩沖液的第二種溶液；
向所述第一種溶液加入包含螯合劑和NaOH的第三種溶液；
任選調(diào)節(jié)所述第一種溶液的pH到約8.5；
在約25℃混合、攪拌或者允許所述第一種溶液靜置約3到約5小時(shí)；和
任選向所述第一種溶液加入淬滅劑。
制備根據(jù)本發(fā)明的抗體綴合物的方法還任選包括純化所述綴合物的方法。許多已知的方法可以用于純化所述蛋白質(zhì)綴合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，純化步驟使用法向流過(guò)濾(normal flowfiltration)或者切向流過(guò)濾。在另一實(shí)施方案中，純化根據(jù)本發(fā)明的綴合物的方法是滲濾方法。
抗體復(fù)合物
本發(fā)明的額外方面涉及包含抗體綴合物和金屬離子的抗體復(fù)合物，其中所述金屬離子與所述抗體綴合物的螯合劑部分非共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明的抗體復(fù)合物的特定實(shí)施方案包括包含如本文給出的抗體綴合物和金屬離子的復(fù)合物。
可以使用非共價(jià)結(jié)合所述抗體綴合物的螯合部分的任意金屬離子。此類金屬離子包括選自Ac、Ag、At、Au、Bi、Ce、Co、Cr、Cu、Dy、Er、Eu、Fe、Ga、Gd、Hg、Ho、In、La、Lu、Mn、Mo、Nd、Ni、Os、Pb、Pd、Pm、Pr、Pt、Rb、Re、Rh、Ru、Sb、Sc、Si、Sm、Sn、Sr、Tb、Tc、Tl、Tm、V、W、Y和Yb的金屬離子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合物的金屬離子是放射性核素。用于抗體復(fù)合物的放射性核素是本領(lǐng)域已知的。用于本發(fā)明的放射性核素包括γ-發(fā)射體、正電子發(fā)射體、X射線發(fā)射體、熒光發(fā)射體、β-發(fā)射體、α-發(fā)射體、和電子和中子捕獲劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，γ-發(fā)射體、正電子-發(fā)射體、X射線發(fā)射體和熒光發(fā)射體適于定位和/或治療，而β和α發(fā)射體和電子和中子捕獲劑，如硼和鈾也可以用于治療。
用于本發(fā)明復(fù)合物的放射性核素可以適于治療、診斷或者治療和診斷目的。適宜的金屬的實(shí)例包括Ag、At、Au、Bi、Cu、Ga、Ho、In、Lu、Pb、Pd、Pm、Pr、Rb、Re、Rh、Sc、Sr、Tc、Tl、Y和Yb。用于診斷目的的放射性核素的實(shí)例是Fe、Gd、111In、67Ga或68Ga。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于診斷目的的放射性核素是111In或67Ga。用于治療目的的放射性核素的實(shí)例是166Ho、165Dy、90Y、115mIn、52Fe或72Ga。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于診斷目的的放射性核素是166Ho或90Y。用于治療和診斷目的的放射性核素的實(shí)例包括153Sm、177Lu、159Gd、175Yb或47Sc。在一個(gè)實(shí)施方案中，放射性核素是153Sm、177Lu、175Yb或159Gd。
優(yōu)選的金屬放射性核素包括90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、95Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb和141Ce。
在特定實(shí)施方案中，抗體復(fù)合物的金屬離子選自90Y、111In、177Lu、166Ho、215Bi和225Ac。
此外，γ發(fā)射性放射性核素，如99mTc、111In、67Ga和169Yb已經(jīng)批準(zhǔn)或者正在研究用于診斷成像，而β發(fā)射體，如67Cu、111Ag、186Re和90Y的復(fù)合物用于腫瘤治療。其他有用的放射性核素包括γ發(fā)射體，如99mTc、111In、67Ga和169Yb，和β-發(fā)射體，如67Cu、111Ag、186Re、188Re和90Y，以及其他目的放射性核素，如211At、212Bi、177Lu、86Rb、105Rh、153Sm、198Au、149Pm、85Sr、142Pr、214Pb、109Pd、166Ho、208Tl和44Sc。
在另一實(shí)施方案中，順磁金屬離子包括過(guò)渡金屬和鑭系金屬的離子，如原子序數(shù)為21-29、42、43、44或57-71的金屬，尤其Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的離子。用于磁共振成像的組合物的順磁金屬包括原子序數(shù)為22到29、42、44和58-70的元素。
在另一實(shí)施方案中，熒光金屬離子包括鑭系元素，尤其La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。
在另一實(shí)施方案中，含有重金屬的報(bào)導(dǎo)分子可以包括Mo、Bi、Si和W的原子。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體復(fù)合物包含抗體綴合物和金屬離子，其中所述綴合物的抗體是人抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明綴合物的螯合劑是大環(huán)螯合劑，如聚氮雜大環(huán)螯合劑，任選含有一個(gè)或多個(gè)羧基、膦酸或磷酸基團(tuán)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明綴合物的螯合劑選自DOTA、DOTA類似物和DOTA衍生物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜的螯合劑分子包括DOXA(1--4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷三乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷四乙酸)，和THT(4′-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6″-雙(N′，N′-二羧基甲基-N-甲基肼基)-2，2′6′，2″-三聯(lián)吡啶)，和其類似物和衍生物。見(jiàn)，例如，Ohmono et al.，J.Med.Chem.35157-162(1992)；Kung et al.，J.Nucl.Med.25326-332(1984)；Jurisson et al.，Chem.Rev.931137-1156(1993)；和美國(guó)專利號(hào)5,367,080。其他適宜的螯合劑公開(kāi)在美國(guó)專利號(hào)4,647,447；4,687,659；4,885,363；EP-A-71564；WO89/00557；和EP-A-232751。
在另一實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明中使用的適宜的大環(huán)羧酸螯合劑包括1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮雜環(huán)十五烷-N，N′，N″，N-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(9N 3)；1，5，9-三氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″-三乙酸(12N3)；和6-溴乙酰胺-芐基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(BAT)。
制備抗體復(fù)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的額外方法涉及制備抗體復(fù)合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將如本文描述的抗體綴合物與能夠非共價(jià)結(jié)合該綴合物的金屬離子，如放射性核素反應(yīng)可以制備抗體復(fù)合物。在另一實(shí)施方案中，金屬離子非共價(jià)結(jié)合所述抗體綴合物的螯合劑部分?？贵w復(fù)合物和金屬離子之間的反應(yīng)可以在溶液中，如在適宜的緩沖液中發(fā)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制備抗體復(fù)合物的方法包括將抗體綴合物與放射性核素反應(yīng)。此類方法包括混合、攪拌或者制備包含抗體綴合物和放射性核素的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液還包含緩沖液。
在另一實(shí)施方案中，制備抗體復(fù)合物的方法包括將抗體綴合物與復(fù)合金屬離子的螯合劑反應(yīng)。在該實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域已知的步驟，首先將螯合劑與金屬離子復(fù)合。例如，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,654,361。螯合劑可以是如上述的激活的螯合劑。螯合劑與金屬離子復(fù)合并形成螯合劑-金屬離子復(fù)合物后，使用上面關(guān)于制備抗體綴合物描述的方法或者本領(lǐng)域已知的另一方法可以將抗體與螯合劑-金屬離子復(fù)合物反應(yīng)。根據(jù)該方法，包含抗體與螯合劑-金屬離子復(fù)合物的溶液經(jīng)混合、攪拌或者制備，從而形成所述抗體復(fù)合物。
當(dāng)制備抗體復(fù)合物時(shí)，可以混合、攪拌或者允許所述溶液靜置不同的小時(shí)，這取決于許多變量，如包括螯合劑的性質(zhì)、抗體的性質(zhì)、金屬離子的性質(zhì)、反應(yīng)溫度和pH、緩沖液的性質(zhì)、反應(yīng)物的摩爾比、可用的試劑的純度、催化劑或者激活物的存在的因素，和本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其他因素。包含抗體綴合物和金屬離子的溶液可以混合、攪拌或允許靜置任意時(shí)間，該時(shí)間允許足夠形成抗體復(fù)合物。在上面方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將溶液混合、攪拌或者允許靜置約0.5分鐘到約24小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約1小時(shí)到約20小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約2小時(shí)到約10小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約1分鐘到約1小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約1分鐘到約30分鐘。在另一實(shí)施方案中，將所述溶液混合、攪拌或者允許靜置約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55分鐘。
用于制備抗體復(fù)合物的溶液的pH可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH將為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約4到約8。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約5到約7。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約5.5到約7。在另一實(shí)施方案中，所述溶液的pH為約6.5。
用于制備抗體復(fù)合物的溶液可以還包含緩沖劑。緩沖劑是本領(lǐng)域公知的。用于制備抗體復(fù)合物的適宜的緩沖劑可以包括但不限于，檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、二磷酸、甘氨酰-甘氨酸-哌嗪-2HCl-NaOH、MES-NaOH-NaCl、TRIS-蘋(píng)果酸-NaOH、MES-NaOH、ADA-NaOH-NaCl、ACES-NaOH-NaCl、ACES-NaOH-NaCl、BES-NaOH-NaCl、MOPS-NaOH-NaCl、TES-NaOH-NaCl、MOPS-KOH、HEPES-NaOH-NaCl、TRIS-HCl、HEPPSO-NaOH、BICINE-NaOH-NaCl、TAPS-NaOH-NaCl、HEPPS(EPPS)-NaOH、TRICINE-NaOH、BICINE-NaOH、檸檬酸-磷酸氫二鈉、硼酸-檸檬酸-磷酸二氫鉀-二乙基-巴比妥酸-NaOH、檸檬酸-檸檬酸鈉、乙酸鈉-乙酸、苯二甲酸氫鉀-NaOH、卡可基酸鈉鹽-HCl、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀-NaOH、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、咪唑-HCl、四硼酸鈉-硼酸、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇-HCl、二乙醇胺-HCl、氯化鉀-硼酸-NaOH、硼酸-NaOH-KCl、甘氨酸-NaOH；和碳酸鈉-碳酸氫鈉。
抗體綴合物與金屬離子的摩爾比可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體綴合物與金屬離子的摩爾比為約1∶1000到約1000∶1。在另一實(shí)施方案中，抗體綴合物與金屬離子的摩爾比為約1∶100到約100∶1，在另一實(shí)施方案中，為約1∶10到約10∶1，在另一實(shí)施方案中，為約1∶5到約5∶1，在另一實(shí)施方案中，為約1∶2，在另一實(shí)施方案中為約1∶3，在另一實(shí)施方案中為約2∶1，在另一實(shí)施方案中為約1∶1。在其他實(shí)施方案中，抗體綴合物與金屬離子的摩爾比為約1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。
備選地，抗體和螯合劑-金屬離子復(fù)合物的比例可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體和螯合劑-金屬離子復(fù)合物的比為約1∶1000到約1000∶1。
可用于本發(fā)明的放射性核素在上文描述和列舉并且是公知的和通過(guò)商業(yè)途徑可得到的。此外，一些已知的方法可以用以制備用于本發(fā)明的放射性核素。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子為鹽的形式，例如，氯化物鹽。此類鹽是本領(lǐng)域已知的。在另一實(shí)施方案中，金屬離子鹽是氯化釔或者乙酸釔。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子用于本發(fā)明。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案當(dāng)制備本發(fā)明的復(fù)合物時(shí)，可以與螯合劑競(jìng)爭(zhēng)復(fù)合的其他金屬離子不以顯著量存在于溶液中。例如，當(dāng)制備包含90Y的抗體復(fù)合物時(shí)，F(xiàn)e3+不以顯著量或者濃度存在于溶液中。如關(guān)于本方法中一種或多種競(jìng)爭(zhēng)性金屬離子使用的，術(shù)語(yǔ)顯著量指顯著干擾、延緩、延遲、抑制或者防止抗體復(fù)合物的制備的量或者濃度。
制備抗體復(fù)合物的方法可以還包括從反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物除去過(guò)量金屬離子的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類步驟包括加入二級(jí)螯合劑，其能夠與溶液中的過(guò)量金屬離子復(fù)合。此類二級(jí)螯合劑可以包括一種或多種已知的螯合劑，如DTPA、EDTA和MeO-DOTA-甘氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，MeO-DOTA-甘氨酸用作二級(jí)螯合劑。
制備抗體復(fù)合物的方法可以還包括從包含螯合劑-金屬離子復(fù)合物的反應(yīng)溶液除去過(guò)量金屬離子的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑-金屬離子復(fù)合物形成并且在溶液中后，加入能夠復(fù)合過(guò)量金屬離子的二級(jí)螯合劑。然后將該溶液通過(guò)DEAE-纖維素陰離子交換樹(shù)脂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)洗脫，該樹(shù)脂已經(jīng)轉(zhuǎn)化成乙酸鹽形式以從帶電種類，即二級(jí)螯合劑-金屬離子復(fù)合物純化中性種類的螯合劑-金屬離子復(fù)合物。純化的螯合劑-金屬離子復(fù)合物然后用于制備如本文描述的抗體復(fù)合物。
二級(jí)螯合劑可以作為固體或者溶液加入反應(yīng)混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，向緩沖液中加入二級(jí)螯合劑。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，抗體復(fù)合物形成到滿意的完成水平后，向反應(yīng)溶液加入緩沖液，其包含濃度為約1到約50mM，優(yōu)選約10mM的乙酸緩沖液，濃度為約1到約500mM，優(yōu)選約140mM的NaCl，濃度為約1％到約20％，優(yōu)選約7％到約8％，更優(yōu)選約7.5％的HAS，pH為約3-8，優(yōu)選約6，MeO-DOTA-甘氨酸的濃度為約0.01mM到約100mM，優(yōu)選約1mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成抗體復(fù)合物后約5分鐘加入二級(jí)螯合劑。在其他實(shí)施方案中，形成抗體復(fù)合物后約1、2、3、4、5、6、7，8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50 55或60分鐘加入二級(jí)螯合劑。
在另一實(shí)施方案中，從反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物除去過(guò)量金屬離子的步驟包括將反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物離心。將反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物離心可以除去非螯合的金屬離子。
在另一實(shí)施方案中，從反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物除去過(guò)量金屬離子的步驟包括用緩沖液從反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物洗滌過(guò)量金屬離子。如果必要，洗滌可以重復(fù)一次或多次。在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌重復(fù)兩次或三次。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，除去過(guò)量金屬離子的兩種或多種方法組合用于從除去反應(yīng)溶液和/或抗體復(fù)合物的過(guò)量金屬離子的步驟除去過(guò)量金屬離子。
在本方法的另一實(shí)施方案中，對(duì)于放射藥物和放射治療應(yīng)用，從與所希望的復(fù)合物不同的氧化態(tài)的金屬制備抗體復(fù)合物。在該情況中，取決于所用的金屬的氧化態(tài)和所希望的最終產(chǎn)物的氧化態(tài)，可以將還原劑或者氧化劑加入反應(yīng)混合物中使得金屬達(dá)到所希望的氧化態(tài)?？梢杂醚趸瘎┗蛘哌€原劑形成中間復(fù)合物，其處于所希望的氧化態(tài)但是具有不穩(wěn)定的配體。然后這些不穩(wěn)定配體可以用本發(fā)明的所希望的螯合部分置換。在另一實(shí)施方案中，將不穩(wěn)定配體與還原劑或者氧化劑和所希望的配體一起加入反應(yīng)混合物以實(shí)現(xiàn)在一步中改變到所希望的氧化態(tài)和螯合所希望的金屬。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，制備抗體復(fù)合物的方法包括
制備包含抗體綴合物的第一種溶液；
向所述第一種溶液加入包含能夠與所述抗體綴合物復(fù)合的金屬離子的第二種溶液；
混合、攪拌所述第一種溶液或者允許其靜置；和
任選加入第二種螯合劑，如EDTA，以與未復(fù)合的金屬離子復(fù)合。
在另一實(shí)施方案中，制備抗體復(fù)合物的方法包括
組合第一種溶液、第二種溶液和第三種溶液，
其中
所述第一種溶液包含抗體綴合物，
所述第二種溶液包含乙酸緩沖液；和
所述第三種溶液包含90YCl3；
混合、攪拌合并的溶液或者允許其靜置；
向合并的溶液加入第四種溶液，所述第四種溶液包含MeO-DOTA-NCS、人血清白蛋白(HSA)、乙酸緩沖液，和NaCl。
免疫表型分型
抗體，如本發(fā)明的C35抗體可以用于細(xì)胞系和生物樣品的免疫表型分型。C35可用作腫瘤特異標(biāo)記。針對(duì)特定表位或者表位組合的單克隆抗體可以允許診斷癌癥和篩選細(xì)胞群體。可以利用多種技術(shù)，使用單克隆抗體來(lái)篩選表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞群體，所述技術(shù)包括使用抗體包被的磁珠進(jìn)行磁性分離，用附著到固體基質(zhì)(例如，平板)的抗體“淘選”，和流式細(xì)胞術(shù)(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,985,660；和Morrisonet al.，Cell，96737-49(1999))。
這些技術(shù)允許篩選特定細(xì)胞群體，如可以發(fā)現(xiàn)具有血液學(xué)惡性的細(xì)胞群體(例如，C35-相關(guān)的癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和結(jié)腸癌，和黑素瘤)。
診斷和成像
特異結(jié)合目的多肽的經(jīng)標(biāo)記的C35抗體和其衍生物和類似物可以用于診斷目的，用來(lái)檢測(cè)、診斷或者監(jiān)視與本發(fā)明多肽的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、病癥和/或障礙(例如，C35-相關(guān)的癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和結(jié)腸癌，和黑素瘤)。本發(fā)明提供了目的多肽的異常表達(dá)的檢測(cè)方法，其包括(a)使用對(duì)目的多肽特異的一種或多種抗體測(cè)定個(gè)體的細(xì)胞或者體液中目的多肽的表達(dá)和(b)比較基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平，從而與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平相比所測(cè)定的多肽基因表達(dá)水平的升高或降低表明異常表達(dá)。
本發(fā)明提供了用于診斷病癥的診斷測(cè)定法，其包括(a)使用對(duì)目的多肽特異的一種或多種抗體測(cè)定個(gè)體的細(xì)胞或者體液中目的多肽的表達(dá)和(b)比較該基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平，從而與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平相比所測(cè)定的多肽基因表達(dá)水平的升高或降低表明特定病癥。關(guān)于癌癥，來(lái)自個(gè)體的活組織檢查組織中轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)高的量表明易患該疾病的傾向性，或者可以提供在實(shí)際的臨床癥狀出現(xiàn)前檢測(cè)該疾病的方法。該類型的更確定的診斷可以允許健康專業(yè)人員較早使用預(yù)防性措施或者積極地治療，從而預(yù)防癌癥的發(fā)生或者進(jìn)一步惡化。
本發(fā)明的抗體可以用于測(cè)定生物樣品中的蛋白質(zhì)水平，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)免疫組織學(xué)方法(見(jiàn)，例如，Jalkanen，etal.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell Biol.1053087-3096(1987))。用于檢測(cè)蛋白質(zhì)基因表達(dá)的其他基于抗體的方法包括免疫測(cè)定法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。適宜的抗體測(cè)定標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并且包括酶標(biāo)記，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)、和锝(99Tc)；發(fā)光標(biāo)記，如魯米諾；和熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明和生物素。
本發(fā)明的一方面是檢測(cè)和診斷動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人中與本發(fā)明的多肽的異常表達(dá)相關(guān)的疾病或者病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷包括a)對(duì)受試者施用(例如，腸胃外、皮下或者腹膜內(nèi))有效量的特異結(jié)合目的多肽的經(jīng)標(biāo)記的分子；b)使用后等待一段時(shí)間以允許標(biāo)記的分子在受試者中多肽表達(dá)的部位優(yōu)先濃集(和未標(biāo)記的分子被清除到背景水平)；c)測(cè)定背景水平；和d)檢測(cè)受試者中經(jīng)標(biāo)記的分子，從而檢測(cè)到高于背景水平的標(biāo)記分子表明該受試者患有與目的多肽的異常表達(dá)相關(guān)的特定疾病或病癥?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法確定背景水平，所述方法包括比較檢測(cè)的標(biāo)記分子量和以前對(duì)特定系統(tǒng)確定的標(biāo)準(zhǔn)值。
本領(lǐng)域中將理解受試者的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定需要產(chǎn)生診斷圖像的成像部分的量。對(duì)于放射性同位素部分的情況，對(duì)于人類受試者，注射的放射性的量將通常為約5到20毫居里99mTc。標(biāo)記的抗體或者抗體片段將優(yōu)先積累在含有該特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞部位。體內(nèi)腫瘤成像描述于S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments.″(Chapter 13 inTumor ImagingThe Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)。
取決于幾種變量，包括所用的標(biāo)記類型和施用方式，施用后允許標(biāo)記的分子優(yōu)先在受試者中的部位濃集和未標(biāo)記的分子清除到背景水平的時(shí)間間隔為6到48小時(shí)或者6到24小時(shí)或者6到12小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，施用后的時(shí)間間隔為5到20天或者5到10天。
在一個(gè)實(shí)施方案中，例如在最初診斷后1個(gè)月，最初診斷后6個(gè)月，最初診斷后1年等等，通過(guò)重復(fù)診斷方法進(jìn)行疾病或病癥的監(jiān)視。
使用本領(lǐng)域中已知的用于體內(nèi)掃描的方法，可以檢測(cè)患者中經(jīng)標(biāo)記分子的存在。這些方法取決于所用的標(biāo)記類型。技術(shù)人員將能夠確定檢測(cè)特定標(biāo)記的適宜方法?？捎糜诒景l(fā)明的診斷方法的方法和裝置包括，但不限于，電子計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)線攝影術(shù)(CT)、全身掃描，如正電子發(fā)射體層攝影術(shù)(PET)、磁共振成像(MRI)和聲像圖檢查。
在特定實(shí)施方案中，將分子用放射性同位素標(biāo)記并用放射反應(yīng)性手術(shù)儀器在患者中檢測(cè)(Thurston et al.，美國(guó)專利號(hào)5,441,050)。在另一實(shí)施方案中，將分子用熒光化合物標(biāo)記并用熒光反應(yīng)掃描儀器在患者中檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，將分子用正電子發(fā)射金屬標(biāo)記并用正電子發(fā)射體層攝影術(shù)在患者中檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，將分子用順磁標(biāo)記物標(biāo)記并用磁共振成像(MRI)在患者中檢測(cè)。
本發(fā)明的抗體可用以診斷、治療、預(yù)防和/或預(yù)后哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中的癌癥疾病。此類疾病包括，但不限于，癌癥、贅生物、腫瘤和/或如下面“過(guò)度增殖性疾病”中描述，特別是C35-相關(guān)的癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和結(jié)腸癌，和黑素瘤。
具體地，認(rèn)為患有癌癥的哺乳動(dòng)物的某些組織表達(dá)與對(duì)應(yīng)的“標(biāo)準(zhǔn)”水平相比顯著增強(qiáng)或者降低水平的正常或者改變的癌癥抗原和編碼與癌癥相關(guān)的多肽的mRNA。此外，認(rèn)為當(dāng)與來(lái)自沒(méi)有癌癥的相同物種的哺乳動(dòng)物的血清比較時(shí)，在來(lái)自患有這種癌癥的哺乳動(dòng)物的某些體液(例如，血清、血漿、尿和脊髓液)或者細(xì)胞或組織中可以檢測(cè)到與癌癥相關(guān)的肽的升高或降低的水平。
例如，如本文公開(kāi)的，C35表達(dá)與某些癌癥(例如，乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和胰腺癌，和黑素瘤)相關(guān)。因此，針對(duì)C35的抗體(和抗體片段)可以用于定量或者定性表達(dá)C35的細(xì)胞的濃度。這些抗體還具有診斷應(yīng)用，用于檢測(cè)C35表達(dá)水平的異常，或者C35的結(jié)構(gòu)和/或時(shí)序、組織、細(xì)胞、或者亞細(xì)胞定位的異常。這些診斷測(cè)定可以在體內(nèi)或者體外進(jìn)行，例如，用血樣、活檢組織或者尸檢組織進(jìn)行。
從而，本發(fā)明提供了在癌癥的診斷期間使用的診斷方法，其涉及測(cè)量來(lái)自個(gè)體的組織或其他細(xì)胞或者體液中癌癥抗原多肽的表達(dá)水平并比較所測(cè)量的表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)癌癥抗原表達(dá)水平，從而與標(biāo)準(zhǔn)相比表達(dá)水平的增加指示病癥。
當(dāng)已經(jīng)根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行疾病的診斷，包括腫瘤的診斷時(shí)，本發(fā)明可以用作預(yù)后指示，從而顯示出增強(qiáng)的癌癥抗原基因表達(dá)的患者將相對(duì)于所述基因表達(dá)水平較接近標(biāo)準(zhǔn)水平的患者經(jīng)歷更差的臨床結(jié)果。
“測(cè)定癌癥相關(guān)多肽的表達(dá)水平”意在定性或者定量地測(cè)量或者估計(jì)第一種生物樣品中癌癥抗原多肽的水平，可以直接(例如，通過(guò)確定或者估計(jì)絕對(duì)蛋白質(zhì)水平)或者相對(duì)地(例如，通過(guò)比較第二種生物樣品中癌癥相關(guān)多肽水平)進(jìn)行所述測(cè)量或估計(jì)。優(yōu)選地，測(cè)量或者估計(jì)第一種生物樣品中癌抗原多肽表達(dá)水平并將其與標(biāo)準(zhǔn)癌抗原多肽水平比較，所述標(biāo)準(zhǔn)來(lái)自從沒(méi)有所述疾病的個(gè)體得到的第二種生物樣品得到或者通過(guò)來(lái)自沒(méi)有所述疾病的個(gè)體群體的平均水平確定。如本領(lǐng)域?qū)⒚靼椎模坏┮阎獦?biāo)準(zhǔn)癌抗原多肽水平，它就可以作為比較標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)使用。
“生物樣品”意指從個(gè)體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物，或者含有癌抗原多肽(包括其部分)的其他來(lái)源得到的任意生物樣品。如所指出的，生物樣品包括含有表達(dá)癌抗原多肽的細(xì)胞的體液(如血清、血漿、尿、滑液和脊髓液)，和發(fā)現(xiàn)表達(dá)全長(zhǎng)癌抗原或者其片段的其他組織來(lái)源。從哺乳動(dòng)物得到組織活檢樣品和體液的方法是本領(lǐng)域公知的。
本發(fā)明還涉及診斷測(cè)定，如用于檢測(cè)生物樣品(例如，細(xì)胞和組織)中癌抗原多肽的水平(包括測(cè)定多肽的正常和異常水平)的定量和診斷測(cè)定。從而，例如，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)與正常對(duì)照組織樣品相比癌抗原的過(guò)表達(dá)的診斷測(cè)定可以用于檢測(cè)腫瘤的存在?？梢杂糜跍y(cè)定來(lái)自宿主的樣品中多肽的水平，如本發(fā)明的癌抗原多肽的水平的測(cè)定技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此類測(cè)定方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA測(cè)定。測(cè)定生物樣品中癌抗原多肽水平可以用任意本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
還可以用典型免疫組織化學(xué)方法研究組織中癌抗原多肽表達(dá)(Jalkanen et al.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.，et al.，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。用于檢測(cè)癌抗原多肽基因表達(dá)的其他基于抗體的方法包括免疫測(cè)定法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。適宜的抗體測(cè)定標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并且包括酶標(biāo)記，如葡萄糖氧化酶和放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)、和锝(99mTc)，和熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，和生物素。
待分析的組織或者細(xì)胞類型將通常包括已知或者懷疑表達(dá)癌抗原基因的那些組織或者細(xì)胞類型。本文所用的蛋白質(zhì)分離方法可以例如，為如Harlow and Lane(Harlow，E.and Lane，D.，1988，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)中描述的方法，將該文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。分離的細(xì)胞可以來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物或者來(lái)自患者。從培養(yǎng)物得到的細(xì)胞的分析可以是評(píng)估細(xì)胞的必要步驟，其可以用作基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)的部分，或者備選地，用來(lái)測(cè)試化合物對(duì)癌抗原基因表達(dá)的影響。
在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，針對(duì)癌抗原的構(gòu)象表位的抗體或者抗體片段可以用于定量或者定性地檢測(cè)癌抗原基因產(chǎn)物或者其保守變體或者多肽片段的存在。這可以例如，通過(guò)免疫熒光技術(shù)(使用熒光標(biāo)記的抗體)，結(jié)合光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)或者熒光檢測(cè)來(lái)完成。
本發(fā)明的抗體(或者其片段)和/或癌抗原多肽可以額外地用于組織學(xué)，如在免疫熒光、免疫電子顯微術(shù)或者非免疫學(xué)測(cè)定中，用于原位檢測(cè)癌抗原基因產(chǎn)物或者其保守變體或者肽片段。從患者取出組織學(xué)樣品，并對(duì)其應(yīng)用本發(fā)明的標(biāo)記的抗體或者癌抗原多肽，可以完成原位檢測(cè)。優(yōu)選將標(biāo)記的抗體(或者片段)覆蓋在生物樣品上來(lái)應(yīng)用抗體(或者片段)或者癌抗原多肽。通過(guò)使用這種方法，可以不僅確定癌抗原基因產(chǎn)物或者保守變體或者肽片段的存在，或者癌抗原多肽結(jié)合，還可以確定它在所檢查的組織中的分布。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本發(fā)明將容易地理解為了實(shí)現(xiàn)這種原位檢測(cè)，可以修改多種組織學(xué)方法(如染色步驟)的任一種。
用于癌抗原基因產(chǎn)物或者其保守變體或肽片段的免疫測(cè)定和非免疫測(cè)定將通常包括在能夠結(jié)合癌抗原基因產(chǎn)物或者其保守變體或肽片段的可檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記抗體的存在下，孵育樣品，如生物液體、組織提取物、新鮮收獲的細(xì)胞，或者已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中孵育的細(xì)胞裂解物，并通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)的任一種檢測(cè)結(jié)合的抗體。
可以將生物樣品接觸或者固定在固相支持體或者載體上，如硝酸纖維素，或者能夠固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蛘呖扇苄缘鞍踪|(zhì)的其他固相支持體。然后可以用適宜的緩沖液洗滌支持體，接著用可檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記的抗癌抗原抗體或者可檢測(cè)的癌抗原多肽處理。然后可以用緩沖液再次洗滌固相支持體以除去未結(jié)合的抗體或者多肽。任選地，隨后標(biāo)記抗體。然后可以通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)固相支持體上結(jié)合的標(biāo)記的量。
“固相支持體或者載體”意指能夠結(jié)合抗原或者抗體的任意支持體。公知的支持體或者載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁石。對(duì)于本發(fā)明，載體的形式可以是一定程度上可溶的或者不溶的。支持體材料可以幾乎是任意可能的結(jié)構(gòu)形狀，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合抗原或抗體。從而，支持體形狀可以是球形的，如珠子，或者圓柱形，如試管的內(nèi)表面，或者棒的外表面。備選地，表面可以是平的，如片、試驗(yàn)帶，等等。優(yōu)選的支持體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道用于結(jié)合抗體或者抗原的許多其他適宜的載體，或者將能夠使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定所述載體。
可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法確定給定的許多抗-癌抗原抗體或者癌抗原多肽的結(jié)合活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)每次測(cè)定確定可操作的和最佳的測(cè)定條件。
除了測(cè)定從個(gè)體得到的生物樣品中癌抗原多肽水平或者多核苷酸水平，還可以通過(guò)成像體內(nèi)檢測(cè)癌抗原多肽或者多核苷酸。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，癌抗原多肽和/或抗-癌抗原抗體用于成像患病細(xì)胞，如贅生物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的癌抗原多核苷酸(例如，與癌抗原mRNA的所有或者部分互補(bǔ)的多核苷酸)和/或抗-癌抗原抗體(例如，針對(duì)癌抗原的一種表位或者表位組合的抗體，針對(duì)癌抗原的構(gòu)象表位的抗體，針對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的全長(zhǎng)多肽的抗體)用于成像患病或者瘤性細(xì)胞。
用于癌抗原多肽的體內(nèi)成像的抗體標(biāo)記或者標(biāo)記物包括可以通過(guò)X-放射照相術(shù)、NMR、MRI、CAT-掃描或者ESR檢測(cè)的標(biāo)記。對(duì)于X-放射照相術(shù)，適宜的標(biāo)記包括放射性同位素，如鋇或者銫，所述同位素發(fā)射可檢測(cè)的輻射但是對(duì)受試者無(wú)明顯傷害。用于NMR和ESR的適宜的標(biāo)記物包括具有可檢測(cè)的特征性自旋的標(biāo)記物，如氘，所述標(biāo)記物可以通過(guò)標(biāo)記相關(guān)雜交瘤的營(yíng)養(yǎng)物摻入到抗體中。當(dāng)體內(nèi)成像用于檢測(cè)癌抗原多肽的增強(qiáng)的水平并用于人的診斷時(shí)，優(yōu)選使用人抗體或者“人源化”嵌合單克隆抗體?？梢允褂帽疚拿枋龌蛘弑绢I(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生此類抗體。例如，產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。綜述見(jiàn)，Morrison，Science 2291202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4214(1986)；Cabilly et al.，美國(guó)專利號(hào)4,816,567；Taniguchi et al.，EP 171496；Morrison et al.，EP173494；Neuberger et al.，WO 8601533；Robinson et al.，WO8702671；Boulianne et al.，Nature 312643(1984)；Neuberger etal.，Nature 314268(1985)。
此外，可以施用可以檢測(cè)其存在的任意癌抗原多肽。例如，可以施用用不透射線的或者其他適宜的化合物標(biāo)記的癌抗原多肽并且如上面關(guān)于標(biāo)記的抗體討論的進(jìn)行體內(nèi)顯示。其他此類癌抗原多肽可以用于體外診斷步驟。
將已經(jīng)用適宜的可檢測(cè)的成像部分，如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)，不透射線的物質(zhì)或者通過(guò)核磁共振可以檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記的癌抗原多肽-特異抗體或者抗體片段可以導(dǎo)入(例如，腸胃外、皮下或者腹膜內(nèi)導(dǎo)入)將檢查疾病的哺乳動(dòng)物。本領(lǐng)域?qū)⒗斫馐茉囌叩拇笮『退玫某上裣到y(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像需要的成像部分的量。對(duì)于放射性同位素部分的情況，對(duì)于人類受試者，注射的放射性的量將通常為約5到20毫居里99mTc。標(biāo)記的抗體或者抗體片段將優(yōu)先積累在含有癌抗原蛋白質(zhì)的細(xì)胞部位。體內(nèi)腫瘤成像描述于S.W.Burchielet al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies andTheir Fragments.″(Chapter 13 in Tumor ImagingTheRadiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)。
關(guān)于抗體，可檢測(cè)地標(biāo)記抗癌抗原抗體的方法之一是將所述抗體連接到酶并且在酶免疫測(cè)定(EIA)中使用連接的產(chǎn)物(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)″，1978，Diagnostic Horizons 21-7，Microbiological AssociatesQuarterly Publication，Walkersville，Md.)；Voller et al.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enrymol.73482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la.，；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。結(jié)合抗體的所述酶將與合適的底物，優(yōu)選顯色底物反應(yīng)，以某種方式產(chǎn)生化學(xué)部分，其可以例如通過(guò)分光光度法、熒光法或者通過(guò)目視檢測(cè)?？梢杂糜诳蓹z測(cè)地標(biāo)記抗體的酶包括，但不限于，蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。此外，可以通過(guò)比色法進(jìn)行檢測(cè)，比色法使用酶的顯色底物。還可以通過(guò)目視比較底物與類似制備的標(biāo)準(zhǔn)物的酶反應(yīng)程度完成檢測(cè)。
還可以使用多種其他免疫測(cè)定法完成檢測(cè)。例如，通過(guò)放射性標(biāo)記抗體或者抗體片段，可以通過(guò)使用放射免疫測(cè)定(RIA)檢測(cè)癌抗原(見(jiàn)，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March，1986，將其引入本文作為參考)?？梢酝ㄟ^(guò)包括但不限于γ計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器或者放射自顯影的方法檢測(cè)放射性同位素。
還可能用熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光時(shí)，由于熒光，可以檢測(cè)它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物是異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
還可以使用熒光發(fā)射金屬，如152Eu或者其他鑭系金屬可檢測(cè)地標(biāo)記抗體。使用諸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團(tuán)可以將這些金屬連接到抗體。
還可以將抗體偶聯(lián)到化學(xué)發(fā)光化合物進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。然后通過(guò)檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)期間產(chǎn)生的發(fā)光的存在確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例是魯米諾、異氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。
同樣地，可以用生物發(fā)光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白質(zhì)增加了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過(guò)檢測(cè)發(fā)光的存在確定生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在。用于標(biāo)記的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。
通常，如果從患者得到的生物樣品(例如，血、血清、尿和/或腫瘤活組織檢查)中存在本發(fā)明的一種或多種癌抗原蛋白和/或編碼此類蛋白的多核苷酸，那么可以據(jù)此檢測(cè)患者中的癌癥。換句話說(shuō)，此類蛋白質(zhì)和/或多核苷酸可以用作指示癌癥的存在或不存在的標(biāo)志。用本發(fā)明的組合物可以診斷和/或預(yù)后的癌癥包括但不限于，結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、子宮癌和/或皮膚癌。本文提供的結(jié)合劑通常允許檢測(cè)生物樣品中結(jié)合所述結(jié)合劑的抗原的水平。多核苷酸引物和探針可以用于檢測(cè)編碼癌抗原多肽的mRNA的水平，該mRNA指示癌的存在或缺失。通常，癌抗原多肽將以一定水平存在，即患病組織中的水平比正常組織中的高至少3倍。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種測(cè)定形式可以使用結(jié)合劑檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)記物。見(jiàn)，例如，Harlow and Lane，上文。通常，患者中疾病的存在與否可以如下檢測(cè)(a)將從患者得到的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測(cè)樣品中結(jié)合所述結(jié)合劑的多肽的水平；和(c)比較多肽的水平與預(yù)定的截止值。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述測(cè)定涉及使用固定在固相支持體上的結(jié)合劑結(jié)合和從樣品的剩余部分除去本發(fā)明的癌抗原多肽。然后用檢測(cè)試劑可以檢測(cè)結(jié)合的多肽，所述檢測(cè)試劑含有報(bào)道基團(tuán)并且特異結(jié)合所述結(jié)合劑/多肽復(fù)合體。此類檢測(cè)試劑可以包含，例如，特異結(jié)合所述多肽或抗體的結(jié)合劑或者特異結(jié)合該結(jié)合劑的其他試劑，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或者凝集素。備選地，可以利用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中多肽用報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記并允許在結(jié)合劑與樣品孵育后結(jié)合固定化的結(jié)合劑。樣品的組分抑制經(jīng)標(biāo)記的多肽與結(jié)合劑的結(jié)合的程度表明樣品與固定化的結(jié)合劑的反應(yīng)性。用于此類測(cè)定的適宜的多肽包括癌抗原多肽和其部分，或者結(jié)合劑結(jié)合的抗體，如上述。
固相支持體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的本發(fā)明的癌抗原多肽可以附著的任何材料。例如，固相支持體可以是微量滴定板中的測(cè)試孔或者硝酸纖維素或者其他適宜的膜。備選地，支持體可以是珠子或者盤(pán)，如玻璃纖維玻璃、乳膠或者塑料材料，如聚苯乙烯或者聚氯乙烯。支持體還可以是磁性顆?；蛘呃w維光學(xué)傳感器，如在美國(guó)專利號(hào)5,359,681中公開(kāi)的那些?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)將結(jié)合劑固定在固相支持體上，所述技術(shù)在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中詳細(xì)描述。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“固定化”指非共價(jià)結(jié)合，如吸附，和共價(jià)附著(其可以是試劑和支持體上官能團(tuán)之間的直接連接或者可以是通過(guò)交聯(lián)劑進(jìn)行的連接)。優(yōu)選通過(guò)吸附到微量滴定板中的孔或者吸附到膜進(jìn)行固定。在此類情況中，可以通過(guò)適宜的緩沖液中的結(jié)合劑與固相支持體接觸適宜的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)吸附。接觸時(shí)間隨著溫度而變，但是通常為約1小時(shí)到約1天。通常，塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或者聚氯乙烯)的孔與約10ng到約10μg，更優(yōu)選約100ng到約1μg的結(jié)合劑接觸就足夠固定足量的結(jié)合劑。
首先將支持體與雙功能試劑反應(yīng)可以通常將結(jié)合劑共價(jià)附著到固相支持體，所述雙功能試劑將與支持體和結(jié)合劑上的官能團(tuán)，如羥基或者氨基反應(yīng)。例如，使用苯醌或者通過(guò)支持體上的醛基與結(jié)合配偶體上的胺或者活性氫縮合，可以將結(jié)合劑共價(jià)附著到具有適宜聚合物涂層的支持體(見(jiàn)，例如，Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook，1991，A12-A13)。
治療/預(yù)防性使用和組合物
在一個(gè)實(shí)施方案中，在單次推注(bolus)中提供完整抗體劑量。備選地，可以通過(guò)多次使用提供劑量，如使用延長(zhǎng)輸注方法或者通過(guò)在數(shù)小時(shí)或數(shù)天的時(shí)間內(nèi)，例如，約2到約4天內(nèi)施用重復(fù)注射。也參見(jiàn)實(shí)施例5、9和10，和表6-9。
上面描述了當(dāng)化合物包含核酸或者免疫球蛋白時(shí)，可以使用的制劑和施用方法；額外的合適的制劑和施用途徑可以選自下文描述的那些。
多種遞送系統(tǒng)是已知的并且可以用于施用本發(fā)明的化合物，例如，封裝在脂質(zhì)體中、微粒、微囊、能夠表達(dá)所述化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞(見(jiàn)，例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))，和構(gòu)建核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或者其他載體的部分，等等。導(dǎo)入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和經(jīng)口途徑?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)途徑施用化合物或組合物，例如，通過(guò)輸注或者推注，通過(guò)上皮或者粘膜皮膚內(nèi)層(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等等)吸收，并且可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，希望通過(guò)適宜的途徑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)入本發(fā)明的藥物化合物或組合物，所述途徑包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；可以通過(guò)心室內(nèi)導(dǎo)管，例如，附著到貯庫(kù)，如Ommaya貯庫(kù)的導(dǎo)管方便心室內(nèi)注射。例如，使用吸入器或者噴霧器，和具有霧化劑的制劑，可以使用經(jīng)肺施用。
在特定實(shí)施方案中，希望對(duì)需要治療的部位局部施用本發(fā)明的藥物化合物或者組合物；這可以通過(guò)例如，但不限于，在手術(shù)期間局部輸注、局部應(yīng)用，例如與手術(shù)后傷口敷料結(jié)合，通過(guò)注射，通過(guò)導(dǎo)管，通過(guò)栓劑，或者通過(guò)植入物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述植入物是有孔的、無(wú)孔的、或者膠狀材料，包括膜，如sialastic膜或者纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，包括抗體時(shí)，必須小心使用蛋白質(zhì)不吸收的材料。
在另一實(shí)施方案中，化合物或者組合物可以以囊泡，尤其以脂質(zhì)體遞送(見(jiàn)Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat et al.，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；一般見(jiàn)同前)。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，化合物或者組合物可以以控釋系統(tǒng)遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(見(jiàn)Langer，上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald et al.，Surgery 88507(1980)；Saudek et al.，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料(見(jiàn)Medical Applications ofControlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，BocaRaton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；還參見(jiàn)Levy et al.，Science228190(1985)；During et al.，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard et al.，J.Neurosurg.71105(1989))。在再一個(gè)實(shí)施方案中，控釋系統(tǒng)可以在治療靶標(biāo)，即腦附近放置，從而僅需要遞送劑量的一部分(見(jiàn)，例如，Goodson，in Medical Applications ofControlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。
其他控釋系統(tǒng)由Langer(Science 2491527-1533(1990))在綜述中討論。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是編碼蛋白質(zhì)的核酸，可以體內(nèi)施用該核酸以促進(jìn)它編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過(guò)將核酸構(gòu)建為適宜的核酸表達(dá)載體的一部分并將其施用從而它變成細(xì)胞內(nèi)的，例如，通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,980,286)，或者通過(guò)直接注射，或者通過(guò)使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或者通過(guò)用脂質(zhì)或者細(xì)胞表面受體或者轉(zhuǎn)染試劑包被，或者通過(guò)將它與已知進(jìn)入細(xì)胞核的同源異形框樣肽連接后施用(見(jiàn)例如，Joliot etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868(1991))等等可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)施用。備選地，可以將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過(guò)同源重組整合到宿主細(xì)胞DNA用于表達(dá)。
本發(fā)明還提供了藥物組合物。此類組合物包含治療有效量的化合物，和可藥用載體。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“可藥用的”指得到聯(lián)邦或者州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者在美國(guó)藥典或者其他公認(rèn)的藥典中列出用于動(dòng)物，更具體地用于人。術(shù)語(yǔ)“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者媒介物。此類藥物載體可以是無(wú)菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或者合成來(lái)源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液態(tài)載體，尤其用于注射液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果希望，組合物可以還含有少量濕潤(rùn)劑或者乳化劑，或者pH緩沖劑。這些組合物可以為溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋制劑等等的形式。用常規(guī)粘合劑和載體，如甘油三酯可以將組合物配制成栓劑。經(jīng)口制劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)載體，如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等等。適宜的藥物載體的實(shí)例描述于E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″。此類組合物將含有治療有效量的化合物，優(yōu)選純化形式的化合物，以及適宜量的載體以便提供正確施用于患者的形式。制劑將適于施用方式。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物配制成適于靜脈內(nèi)施用于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時(shí)，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。通常，成分單獨(dú)或者以單位劑型混合提供，例如，作為密封容器如安瓿或者藥囊中干燥凍干的粉劑或者無(wú)水濃縮物，所述容器指出活性劑的量。當(dāng)通過(guò)輸注施用組合物時(shí)，可以用含有無(wú)菌藥物級(jí)水或者鹽水的輸注瓶分配組合物。當(dāng)通過(guò)注射施用組合物時(shí)，可以提供一安瓿注射用水或者鹽水從而可以在施用前混合成分。
本發(fā)明的化合物可以配制成中性或者鹽形式?？伤幱玫柠}包括用陰離子或者用陽(yáng)離子形成的鹽，所述陰離子為例如來(lái)自氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的陰離子，所述陽(yáng)離子為例如來(lái)自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的陽(yáng)離子。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定在與本發(fā)明多肽的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病或病癥的治療、抑制和預(yù)防中有效的本發(fā)明化合物的量。此外，體外測(cè)定可以任選用于幫助鑒定最佳劑量范圍。用于制劑的精確劑量也取決于施用途徑、疾病或病癥的嚴(yán)重性，并且將根據(jù)從業(yè)者的判斷和每位患者的情形決定。可以從來(lái)自體外或者動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推有效劑量。
對(duì)于抗體，施用于患者的劑量通常為0.1mg/kg到100mg/kg患者體重。優(yōu)選地，施用于患者的劑量為0.1mg/kg到20mg/kg患者體重，更優(yōu)選1mg/kg到10mg/kg患者體重。通常，由于對(duì)外來(lái)多肽的免疫反應(yīng)，人抗體在人體中比來(lái)自其他物種的抗體有更長(zhǎng)的半壽期。從而，較低劑量的人抗體和較低頻率的施用通常是可能的。此外，通過(guò)修飾，如脂化，增強(qiáng)抗體的攝入和組織穿透(例如，進(jìn)入腦)可以減少本發(fā)明抗體的劑量和施用頻率。也參見(jiàn)實(shí)施例5。
本發(fā)明還提供了藥物包裝或者藥盒，其包含填裝本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分的一個(gè)或多個(gè)容器。與此類容器任選結(jié)合的可以是由管理藥物或者生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的布告，該布告反映了得到生產(chǎn)、使用或者銷售的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人類施用。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)免疫組織學(xué)方法(見(jiàn)，例如Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987)))，可以用抗體測(cè)定生物樣品中本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的水平。用于檢測(cè)蛋白質(zhì)基因表達(dá)的其他基于抗體的方法包括免疫測(cè)定法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。適宜的抗體測(cè)定標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并且包括酶標(biāo)記，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115mIn、113In、112In、111In)、和锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、88Re、142Pr、105Rh、97Ru；發(fā)光標(biāo)記，如魯米諾；和熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，和生物素。
除了測(cè)定生物樣品中本發(fā)明多肽的水平外，還可以通過(guò)成像體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)的體內(nèi)成像的蛋白質(zhì)標(biāo)記或標(biāo)記物包括通過(guò)X-放射照相術(shù)、NMR或者ESR可以檢測(cè)的那些標(biāo)記。對(duì)于X-放射照相術(shù)，適宜的標(biāo)記包括放射性同位素，如鋇或者銫，所述同位素發(fā)射可檢測(cè)的輻射但是對(duì)受試者無(wú)明顯傷害。用于NMR和ESR的適宜的標(biāo)記物包括具有可檢測(cè)的特征性自旋的標(biāo)記物，如氘，所述標(biāo)記物通過(guò)標(biāo)記相關(guān)雜交瘤的營(yíng)養(yǎng)物摻入到抗體中。
將已經(jīng)用適宜的可檢測(cè)的成像部分，如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc、(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115mIn、113mIn、112In、111In)、和锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Tl)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、59Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru)，不透射線的物質(zhì)或者通過(guò)核磁共振可以檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)特異的抗體或者抗體片段導(dǎo)入(例如，腸胃外、皮下或者腹膜內(nèi)導(dǎo)入)將檢查免疫系統(tǒng)疾病的哺乳動(dòng)物。本領(lǐng)域?qū)⒗斫馐茉囌叩拇笮『退玫某上裣到y(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像需要的成像部分的量。對(duì)于放射性同位素部分的情況，對(duì)于人類受試者，注射的放射性的量將通常為約5到20毫居里99mTc。標(biāo)記的抗體或者抗體片段將優(yōu)先積累在表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的細(xì)胞部位。體內(nèi)腫瘤成像描述于S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments″(Chapter 13 in Tumor ImagingThe RadiochemicalDetection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)施用與異源多肽或者核酸結(jié)合的本發(fā)明多肽(例如，本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽和/或抗體)特異遞送本發(fā)明的組合物的方法。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了向靶細(xì)胞遞送治療性蛋白質(zhì)的方法。在另一實(shí)例中，本發(fā)明提供了向靶細(xì)胞遞送單鏈核酸(例如，反義或者核酶)或者雙鏈核酸(例如，整合到細(xì)胞的基因組或者附加型復(fù)制并且可以轉(zhuǎn)錄的DNA)的方法。
本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以用于標(biāo)記本發(fā)明的多肽(包括抗體)。此類技術(shù)包括，但不限于，使用雙功能綴合劑(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003；將每篇專利的內(nèi)容完整引入本文作為參考)。
基因療法
在特定實(shí)施方案中，通過(guò)基因療法施用包含編碼諸如C35抗體或者其功能衍生物的序列的核酸以治療、抑制或者預(yù)防與C35的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或者病癥?；虔煼ㄖ竿ㄟ^(guò)對(duì)受試者施用表達(dá)的或者可表達(dá)的核酸進(jìn)行治療。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，核酸產(chǎn)生了它們編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)介導(dǎo)治療效果。
根據(jù)本發(fā)明可以使用本領(lǐng)域可利用的任何一種基因治療方法。示例性方法在下文描述。
對(duì)于基因治療方法的一般綜述，見(jiàn)Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy 12488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；和Morgan andAnderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH11(5)155-215(1993)?？梢允褂玫谋绢I(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)的方法描述于Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；and Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)。
在優(yōu)選方面，化合物包含編碼抗體的核酸序列，所述核酸序列是表達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體在適宜的宿主中表達(dá)抗體或者其片段或者嵌合蛋白或者重鏈或輕鏈。具體地，此類核酸序列具有與抗體編碼區(qū)有效連接的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型或組成型的，并且任選為組織特異的。在另一具體實(shí)施方案中，使用核酸分子，其中抗體編碼序列和任意其他希望的序列的側(cè)翼是這樣的區(qū)域，該區(qū)域在基因組的目標(biāo)部位促進(jìn)同源重組，從而提供抗體編碼核酸的染色體內(nèi)表達(dá)(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342435-438(1989)。在特定實(shí)施方案中，所表達(dá)的抗體分子是單鏈抗體；備選地，核酸序列包括編碼抗體的重鏈和輕鏈兩者或者其片段的序列。
核酸向患者的遞送可以是直接的，在該情況中患者直接暴露于核酸或者攜帶核酸的載體，或者是間接的，在該情況中細(xì)胞首先用核酸體外轉(zhuǎn)化，然后植入患者。這兩種方法分別已知為體內(nèi)和離體基因療法。
在特定實(shí)施方案中，直接體內(nèi)施用核酸序列，其中它表達(dá)而產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法的任一種實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)將它們構(gòu)建為適宜的核酸表達(dá)載體的部分并將其施用從而它們變成細(xì)胞內(nèi)的，例如，通過(guò)用缺陷的或者減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或者其他病毒載體感染(見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)4,980,286)，或者通過(guò)直接注射裸DNA，或者通過(guò)使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或者通過(guò)用脂質(zhì)或者細(xì)胞表面受體或者轉(zhuǎn)染試劑包被，封裝在脂質(zhì)體、微?；蛘呶⒛抑?，或者通過(guò)將它們與已知進(jìn)入細(xì)胞核的肽連接后施用，與受到受體介導(dǎo)的內(nèi)吞的配體連接后施用(其可以用于靶定特異表達(dá)受體的細(xì)胞類型)(見(jiàn)，例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))等等。在另一實(shí)施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中配體包含用于破壞內(nèi)體的促融病毒肽，允許核酸避免溶酶體降解。在再一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靶定特定受體，核酸可以體內(nèi)靶定用于細(xì)胞特異吸收和表達(dá)(見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)WO 92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188，WO 93/20221)。備選地，可以將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過(guò)同源重組摻入宿主細(xì)胞DNA用于表達(dá)(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342435-438(1989))。
在特定實(shí)施方案中，使用含有編碼本發(fā)明抗體的核酸序列的病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見(jiàn)Milier et al.，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有病毒基因組正確包裝和整合到宿主細(xì)胞DNA所需的組分。將編碼用于基因治療的抗體的核酸序列克隆到一個(gè)或多個(gè)載體，這促進(jìn)了基因向患者的遞送。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更多細(xì)節(jié)可以見(jiàn)Boesen et al..Biotherapy 6291-302(1994)，其描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送mdrl基因到造血干細(xì)胞以使得干細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療更具抗性。闡明在基因療法中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的其他參考文獻(xiàn)為Clowes et al.，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem et al.，Blood831467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy4129-141(1993)；和Grossman and Wilson，Curr.Opin.inGenetics and Devel.3110-114(1993)。
腺病毒是可以用于基因療法的其他病毒載體。腺病毒是用于將基因遞送到呼吸上皮的特別吸引人的載體。腺病毒天然地感染呼吸上皮，在這里它們導(dǎo)致輕微疾病?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其他靶標(biāo)是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞，和肌肉。腺病毒的優(yōu)點(diǎn)是能夠感染非分裂的細(xì)胞。Kozarsky and Wilson，Current Opinion in Genetics andDevelopment 3499-503(1993)給出了基于腺病毒的基因療法的綜述。Bout et al.，Human Gene Therapy 53-10(1994)闡明使用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到獼猴的呼吸上皮。腺病毒在基因療法中使用的其他實(shí)例可以見(jiàn)Rosenfeld et al.，Science 252431434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公開(kāi)WO94/12649；和Wang，et al.，Gene Therapy 2775-783(1995)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用腺病毒載體。
也已經(jīng)提出將腺伴隨病毒(AAV)用于基因療法(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美國(guó)專利號(hào)5,436,146)。
基因治療的另一種方法包括將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物的細(xì)胞中，這可以使用諸如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者病毒感染的方法。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞。然后選擇細(xì)胞以分離已經(jīng)攝入并且正表達(dá)轉(zhuǎn)移的基因的那些細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞遞送到患者。
在該實(shí)施方案中，在體內(nèi)施用所得重組細(xì)胞前向細(xì)胞導(dǎo)入核酸。此類導(dǎo)入可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法進(jìn)行，這些方法包括但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或者噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等等。本領(lǐng)域已知多種技術(shù)可以向細(xì)胞導(dǎo)入外來(lái)基因(見(jiàn)，例如，Loeffler and Behr，Meth.Enzymol.217599-618(1993)；Cohen et al.，Meth.Enzymol.217618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.2969-92m(1985)并且可以根據(jù)本發(fā)明使用，條件是受體細(xì)胞的必要的發(fā)育和生理功能未受破壞。該技術(shù)將提供核酸向細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移，從而該核酸可以由細(xì)胞表達(dá)并且優(yōu)選是可以通過(guò)它的后代遺傳和表達(dá)的。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法可以向患者遞送所得重組細(xì)胞。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用重組血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞或者祖細(xì)胞)。設(shè)想的使用的細(xì)胞量取決于所希望的效果、患者狀態(tài)等等，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。
為了基因治療目的，可以導(dǎo)入核酸的細(xì)胞包括任意希望的、可以利用的細(xì)胞類型，并且包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；多種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，尤其造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，如從骨髓、臍血、外周血、胎兒肝臟等等得到的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是患者自體的。
在其中重組細(xì)胞用于基因治療的實(shí)施方案中，將編碼抗體的核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞，從而它們可以由細(xì)胞或者它們的后代表達(dá)，然后體內(nèi)施用重組細(xì)胞以得到治療效果。在特定實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞。可以分離并體外保存的任何干細(xì)胞/或祖細(xì)胞都可以根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案使用(見(jiàn)例如PCT公開(kāi)WO 94/08598；Stemple andAnderson，Cell 71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A229(1980)；和Pittelkow and Scott，Mayo Clinic Proc.61771(1986))。
在特定實(shí)施方案中，為了基因治療目的導(dǎo)入的核酸包含有效連接編碼區(qū)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，從而核酸的表達(dá)可以通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄的適宜誘導(dǎo)物的存在和缺失來(lái)控制。
過(guò)度增殖性疾病
本發(fā)明的方法可以用于治療過(guò)度增殖疾病、病癥和/或障礙，包括贅生物。
可以用本發(fā)明的方法治療的過(guò)度增殖疾病、病癥和/或障礙的實(shí)例包括但不限于，位于如下部位的瘤前列腺、結(jié)腸、腹部、骨、乳腺、消化系統(tǒng)、肝臟、胰腺、腹膜、內(nèi)分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經(jīng)(中樞和外周神經(jīng))、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸和泌尿生殖器。
此類過(guò)度增殖疾病的其他實(shí)例包括，但不限于急性兒童成淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、成人(原發(fā))肝細(xì)胞癌、成人(原發(fā))肝癌、成人急性淋巴細(xì)胞性白血病、成人急性髓性白血病、成人何杰金病、成人何杰金淋巴瘤、成人淋巴細(xì)胞性白血病、成人非何杰金淋巴瘤、成人原發(fā)肝癌、成人軟組織肉瘤、艾滋病相關(guān)的淋巴瘤、艾滋病相關(guān)的惡性腫瘤、肛門(mén)癌、星形細(xì)胞瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、乳腺癌、腎盂和輸尿管癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原發(fā))淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、大腦星形細(xì)胞瘤、子宮頸癌、兒童(原發(fā))肝細(xì)胞癌、兒童(原發(fā))肝癌、兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病、兒童急性髓性白血病、兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童小腦星形細(xì)胞瘤、兒童大腦星形細(xì)胞瘤、兒童顱外生殖細(xì)胞腫瘤、兒童何杰金病、兒童何杰金淋巴瘤、兒童下丘腦和視通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童成淋巴細(xì)胞性白血病、兒童成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、兒童非何杰金淋巴瘤、兒童松果體和幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、兒童原發(fā)肝癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童軟組織肉瘤、兒童視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、內(nèi)分泌胰島細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相關(guān)腫瘤、外分泌胰腺癌、顱外生殖細(xì)胞瘤、性腺外生殖細(xì)胞瘤、肝外膽管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌瘤、胃腸腫瘤、生殖細(xì)胞瘤、妊娠性滋養(yǎng)層細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、何杰金病、何杰金淋巴瘤、高γ球蛋白血癥、咽下癌、腸癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞胰腺癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性障礙、巨球蛋白血癥、男性乳癌、惡性間皮細(xì)胞瘤、惡性胸腺瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性隱性原發(fā)性鱗狀細(xì)胞頸癌、轉(zhuǎn)移性原發(fā)性鱗狀細(xì)胞頸癌、轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤、骨髓增生異常綜合征、髓細(xì)胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生病、鼻腔和鼻旁竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、懷孕期間非何杰金淋巴瘤、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌、隱性原發(fā)性轉(zhuǎn)移鱗狀細(xì)胞頸癌、口咽癌、骨/惡性纖維肉瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細(xì)胞瘤、骨肉瘤/骨的惡性纖維組織細(xì)胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞瘤、卵巢低惡性潛力腫瘤、胰腺癌、病變蛋白血、紫癜、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤、漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、腎盂和輸尿管癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉樣瘤病、塞扎里綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞頸癌、胃癌、幕上原始神經(jīng)外胚層和松果體瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌、過(guò)渡性腎盂和輸尿管癌、滋養(yǎng)層細(xì)胞瘤、輸尿管和腎盂細(xì)胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、外陰癌、特發(fā)性巨球蛋白血、維爾姆斯腫瘤和除了瘤形成外，位于上面列出的器官系統(tǒng)中的任意其他過(guò)度增殖性疾病。
本發(fā)明的方法可以用于治療惡化前狀況和預(yù)防發(fā)展到瘤性或者惡性狀態(tài)，包括但不限于，上面描述的那些疾病。此類應(yīng)用適應(yīng)于已知或者懷疑在發(fā)展到瘤形成或者癌癥前的狀況，尤其其中已經(jīng)發(fā)生了由增生、組織變形或者最尤其發(fā)育異常組成的非瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)(關(guān)于此類異常生長(zhǎng)狀況的綜述，見(jiàn)Robbins and Angell，1976，BasicPathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79.)。
增生是受控的細(xì)胞增殖的形式，涉及組織或者器官中細(xì)胞數(shù)目的增加，在結(jié)構(gòu)或功能中沒(méi)有顯著改變。通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療的增生疾病包括但不限于，血管濾泡縱隔淋巴結(jié)增生、嗜酸細(xì)胞增多性血管淋巴樣增生、非典型黑素細(xì)胞增生、基底細(xì)胞增生、良性大淋巴結(jié)增生、牙骨質(zhì)增生、先天性腎上腺增生、先天性皮脂腺增生、囊性增生病、乳腺囊性增生病、牙列增生、導(dǎo)管增生、子宮內(nèi)膜增生、纖維肌性增生、局灶性上皮增生、牙齦增生、炎性纖維增生、炎癥性乳頭狀增生、血管內(nèi)乳頭狀內(nèi)皮增生、前列腺結(jié)節(jié)性增生、結(jié)節(jié)再生性增生、假性上皮瘤性增生、老年皮脂腺增生、和疣狀增生。
組織變形是受控的細(xì)胞生長(zhǎng)的一種形式，其中一種類型的成熟或者完全分化的細(xì)胞取代另一種類型的成熟細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療的組織變形疾病包括，但不限于，特發(fā)性骨髓外化生、頂漿分泌腺化生、非典型組織變形、autoparenchymatous組織變形、結(jié)締組織組織變形、上皮化生、腸化生、組織變形性貧血、化生性骨化、化生性息肉、髓樣化生、原發(fā)髓樣化生、繼發(fā)性髓樣化生、鱗狀化生、羊膜的鱗狀化生和癥狀性髓樣化生。
發(fā)育異常通常是癌癥的先兆，主要在上皮中發(fā)生；它是非瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)的最無(wú)序的形式，涉及個(gè)體細(xì)胞一致性和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)定向的喪失。發(fā)育異常的細(xì)胞通常具有異常大、深度染色的細(xì)胞核，并且顯示出多型現(xiàn)象。當(dāng)存在慢性刺激或炎癥時(shí)，特征性地發(fā)生發(fā)育異常。通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療的發(fā)育異常疾病包括但不限于，無(wú)汗性外胚葉發(fā)育不全、anterofacial dysplasia、窒息性胸廓發(fā)育異常、心房-手指發(fā)育不良、支氣管肺發(fā)育異常、大腦發(fā)育異常、宮頸非典型增生、軟骨外胚層發(fā)育不良、鎖骨顱骨發(fā)育不全、先天性外胚葉發(fā)育不良、craniodiaphysial dysplasia、顱腕跖骨發(fā)育不全、craniometaphysial dysplasia、牙本質(zhì)發(fā)育異常、骨干發(fā)育異常、外胚層發(fā)育不良、釉質(zhì)發(fā)育異常、腦性眼球發(fā)育不全、偏側(cè)骨骺發(fā)育不良、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、亨納曼綜合征、上皮異常增生、面-指(趾)-生殖器綜合征、頜骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、familial white foldeddysplasia、纖維肌性發(fā)育異常、纖維性骨結(jié)構(gòu)不良、旺盛骨性發(fā)育不良、遺傳性腎-視網(wǎng)膜發(fā)育異常、出汗性外胚層發(fā)育不良、少汗性外胚葉發(fā)育不全、lymphopenic胸腺發(fā)育不全、乳腺結(jié)構(gòu)不良、下頜面發(fā)育異常、干骨后端發(fā)育異常、Mondini發(fā)育異常、單骨纖維性骨發(fā)育不良、mucoepitheilal發(fā)育異常、多發(fā)性骺發(fā)育異常、眼耳脊椎發(fā)育不良、眼-牙-指(趾)發(fā)育不良、眼椎骨發(fā)育不全、牙原性發(fā)育異常、眼下頜支發(fā)育不全、根尖周牙骨質(zhì)異常增生、多發(fā)性骨纖維性發(fā)育不良、pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia、視網(wǎng)膜發(fā)育異常、隔-視力發(fā)育異常、spondyloepiphysial發(fā)育異常、和ventriculoradial發(fā)育異常。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療的額外的腫瘤發(fā)生前疾病包括但不限于，良性過(guò)度增殖性疾病(例如，良性腫瘤、纖維囊性疾病、組織肥大、腸息肉、結(jié)腸息肉、和食管發(fā)育異常)、粘膜白斑病、角化病、上皮內(nèi)上皮瘤、農(nóng)民皮膚、日光性唇炎和日光性角化病。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于抑制癌，尤其上面所列癌的生長(zhǎng)、發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療的與增加的細(xì)胞存活有關(guān)的額外疾病和病癥包括但不限于，惡性腫瘤和相關(guān)疾病的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移，如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病(包括成髓細(xì)胞、前髓細(xì)胞、髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞性)白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病))、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(例如，何杰金病和非何杰金病)、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血、重鏈病和實(shí)體瘤，包括但不限于，肉瘤和癌，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、Wilm瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、emangioblastoma、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、menangioma、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療的過(guò)度增殖性疾病和/或病癥包括但不限于，位于肝臟、腹部、骨、乳腺、消化系統(tǒng)、胰腺、腹膜、內(nèi)分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經(jīng)系統(tǒng)(中樞和外周的)、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸腔和泌尿生殖道中的癌。
類似地，通過(guò)本發(fā)明的方法也可以治療其他過(guò)度增殖性疾病。此類過(guò)度增殖性疾病的實(shí)例包括但不限于高γ球蛋白血、淋巴增生性障礙、病變蛋白血、紫癜、肉樣瘤病、塞扎里綜合征、Waldenstron巨球蛋白血癥、高歇病、組織細(xì)胞增多病，和除了瘤形成外，位于上面所列器官系統(tǒng)中的任意其他過(guò)度增殖性疾病。
治療活性的闡明
在人體中使用前，本發(fā)明的方法和抗體優(yōu)選在體外測(cè)試，然后在體內(nèi)測(cè)試所希望的治療或者預(yù)防活性。例如，用于闡明化合物或者藥物組合物的治療或者預(yù)防效用的體外測(cè)定包括化合物對(duì)細(xì)胞或者患者組織樣品的效果?；衔锘蚪M合物對(duì)細(xì)胞和/或組織樣品的效果可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)確定，所述技術(shù)包括但不限于，玫瑰花瓣?duì)钚纬蓽y(cè)定和細(xì)胞裂解測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明，可以用于確定特定化合物的施用是否合適的體外測(cè)定包括體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定，其中將患者組織樣品培養(yǎng)生長(zhǎng)，并暴露于或者對(duì)其施用化合物，并觀察該化合物對(duì)組織樣品的效應(yīng)。
試劑盒
本發(fā)明提供了可以用于上面方法的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含在一個(gè)或多個(gè)容器中的本發(fā)明的抗體，優(yōu)選純化的抗體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有基本上分離的多肽，該多肽包含與該試劑盒中包括的抗體特異免疫反應(yīng)的表位。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含不與目的多肽反應(yīng)的對(duì)照抗體。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有檢測(cè)抗體與目的多肽的結(jié)合的手段(例如，抗體可以綴合可檢測(cè)的底物，如熒光化合物、酶促底物、放射性化合物或者發(fā)光化合物，或者識(shí)別一級(jí)抗體的二級(jí)抗體可以綴合到可檢測(cè)的底物)。
在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，所述試劑盒是診斷試劑盒，其用于篩選含有對(duì)增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽特異的抗體的血清。此類試劑盒可以包括不與目的多肽反應(yīng)的對(duì)照抗體。此類試劑盒可以包括基本上分離的多肽抗原，其包含與至少一種抗多肽抗原抗體特異免疫反應(yīng)的表位。此外，此類試劑盒可以包括檢測(cè)所述抗體與所述抗原結(jié)合的手段(例如，抗體可以綴合熒光化合物，如熒光素或者羅丹明，其可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè))。在特定實(shí)施方案中，試劑盒可以包括重組產(chǎn)生的或者化學(xué)合成的多肽抗原。試劑盒的多肽抗原可以附著到固相支持體。
在更特定實(shí)施方案中，上述試劑盒的檢測(cè)手段包括所述多肽抗原附著的固相支持體。此類試劑盒還可以包括未附著的報(bào)道分子標(biāo)記的抗人抗體。在該實(shí)施方案中，抗體與多肽抗原的結(jié)合可以通過(guò)所述報(bào)道分子標(biāo)記的抗體的結(jié)合檢測(cè)。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明包括診斷試劑盒，其用于篩選含有本發(fā)明多肽的抗原的樣品。該診斷試劑盒包括與多肽或者多核苷酸抗原特異免疫反應(yīng)的基本上分離的抗體和檢測(cè)所述多核苷酸或者多肽抗原與抗體反應(yīng)的手段。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體附著到固相支持體。在特定實(shí)施方案中，抗體可以是單克隆抗體。試劑盒的檢測(cè)手段可以包括二級(jí)的、經(jīng)標(biāo)記的單克隆抗體。備選地，或者附加地，檢測(cè)手段可以包括經(jīng)標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗原。
在一種診斷方案中，試樣與固相試劑反應(yīng)，該固相試劑具有通過(guò)本發(fā)明的方法得到的表面結(jié)合的抗原。特異抗原抗體與試劑結(jié)合并通過(guò)洗滌除去未結(jié)合的樣品組分后，試劑與報(bào)道分子標(biāo)記的抗人抗體反應(yīng)以將報(bào)道分子與固相支持體上結(jié)合的抗-抗原抗體的量成比例地結(jié)合試劑。再次洗滌試劑以除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體，并測(cè)定與試劑結(jié)合的報(bào)道分子的量。通常報(bào)道分子是酶，通過(guò)在適宜的熒光、發(fā)光或者量熱底物(Sigma，St.Louis，Mo.)存在下通過(guò)孵育固相支持體可以檢測(cè)所述酶。
通過(guò)用于將蛋白質(zhì)材料附著到固相支持體材料的已知技術(shù)制備上面測(cè)定中的固體表面試劑，所述固相支持體材料為諸如聚合物珠、標(biāo)尺、96孔板或者過(guò)濾材料。這些附著方法通常包括蛋白質(zhì)與支持體的非特異吸附或者蛋白質(zhì)的共價(jià)附著，通常是通過(guò)游離胺基共價(jià)附著到固相支持體上的化學(xué)反應(yīng)基，如活化的羧基、羥基或者醛基。備選地，鏈霉抗生物素蛋白包被的板可以與生物素化的抗原結(jié)合使用。
從而，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行該診斷方法的測(cè)定系統(tǒng)或者試劑盒。該試劑盒通常包括具有表面結(jié)合的重組抗原的支持體，和用于檢測(cè)表面結(jié)合的抗-抗原抗體的報(bào)道分子標(biāo)記的抗人抗體。
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法包括化學(xué)治療劑(也稱作抗腫瘤劑)、放射療法和放射療法和化學(xué)療法的聯(lián)合。
示例性化學(xué)治療劑是長(zhǎng)春花堿類、鬼臼乙叉甙、蒽環(huán)類抗生素、放線菌素D、普卡霉素、嘌呤霉素、短桿菌肽D、紫杉醇(Taxol.RTM.，Bristol Myers Squibb)、秋水仙堿、細(xì)胞松弛素B、吐根堿、美登素和胺苯吖啶(或者″mAMSA″)。長(zhǎng)春花堿類在Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1277-1280中描述。長(zhǎng)春花堿類的代表是長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春地辛。鬼臼乙叉甙類在Goodman和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1280-1281中描述。鬼臼乙叉甙的代表是依托泊苷、依托泊苷鄰醌和替尼泊苷。蒽環(huán)類抗生素在Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1283-1285中描述。蒽環(huán)類抗生素的代表是柔紅霉素、阿霉素、米托蒽醌和必桑郡。放線菌素D也稱作更生霉素，在Goodmand和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1281-1283中描述。普卡霉素也稱作光輝霉素，在Goodmand和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed)，(1985)，pp.1287-1288中描述。額外的化學(xué)治療劑包括順鉑(Platinol.RTM.，Bristol Myers Squibb)，卡鉑(Paraplatin.RTM.，Bristol MyersSquibb)，絲裂霉素(Mutamycin.RTM.，Bristol Myers Squibb)，六甲密胺(Hexalen.RTM.，U.S.Bioscience，Inc.)，環(huán)磷酰胺(Cytoxan.RTM.，Bristol Myers Squibb)，羅氮芥(CCNU)(CeeNU.RTM.，Bristol Myers Squibb)，卡氮芥(BCNU)(BiCNU.RTM.，Bristol Myers Squibb)。
示例性化學(xué)治療劑還包括阿克拉希霉素A、阿克拉霉素、阿克羅寧、山油柑堿、阿霉素、阿地白介素(白介素-2)、六甲密胺(六甲基密胺)、氨魯米特、氨魯米特(cytadren)、氨基咪唑羧酰胺、胺苯吖啶(m-AMSA；amsidine)、阿那曲唑(瑞寧得)、環(huán)胞苷、anthracyline、氨茴霉素、天冬酰胺酶(elspar)、氮雜胞苷、氮雜胞苷(阿扎胞苷)、氮雜鳥(niǎo)嘌呤、氮絲氨酸、氮尿苷、1，1′，1″-phosphinothioylidynetris氮丙啶、azirino(2′、3′3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、BCG(theracys)、BCNU、BCNU氯乙基亞硝脲、苯甲酰胺、4-(二(2-氯乙基)氨基)苯丁酸、比卡魯胺、二氯乙基亞硝脲、博來(lái)霉素、博來(lái)霉素(blenozane)、博來(lái)霉素、溴脫氧尿苷、溴尿苷、白消安(馬利蘭)、氨基甲酸乙酯、卡鉑、卡鉑(paraplatin)、卡氮芥、卡氮芥(BCNU；BiCNU)、苯丁酸氮芥(leukeran)、氯乙基亞硝脲、chorozotocin(DCNU)、色霉素A3、順式-視黃酸、順鉑(cis-ddpl；platinol)、克拉屈濱(2-氯脫氧腺苷；2cda；克拉立平)、助間型霉素、環(huán)亮氨酸、環(huán)磷酰胺、無(wú)水環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、阿糖胞苷、阿糖胞苷HCl(cytosar-u)、2-脫氧-2-(((甲基亞硝基氨基)羰基)氨基)-D-葡萄糖、達(dá)卡巴嗪、更生霉素(cosmegen)、柔紅霉素、柔紅霉素HCl(cerubidine)、氨烯咪胺、氨烯咪胺(DTIC-dome)、地美可辛、地塞米松、二去水矛醇、重氮氧代正亮氨酸、己烯雌酚、多西他賽(taxotere)、阿霉素HCl(adriamycin)、鹽酸阿霉素、依洛尼塞、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉(emcyt)、乙碘油、依托格魯、氨基甲酸乙酯、甲磺酸乙酯、依托泊苷(VP16-213)、維甲酰酚胺、氟尿苷、氟尿苷(fudr)、氟達(dá)拉濱(fludara)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟氫甲睪酮(halotestin)、氟他米特、氟他米特(eulexin)、fluxuridine、硝酸鎵(granite)、西他濱(gemzar)、染料木黃酮、2-脫氧-2-(3-甲基-3-nitrosoureido)-D-吡喃葡萄糖、戈舍瑞林(zoladex)、己烷雌酚、羥基脲(hydra)、伊達(dá)比星(idamycin)、ifosfagemcitabine、異環(huán)磷酰胺(iflex)、異環(huán)磷酰胺與美司鈉(MAID)、干擾素、α干擾素、α干擾素-2a、α-2b、α-n3、白細(xì)胞介素-2、碘芐胍、碘芐胍碘芐胍、依立替康(camptosar)、異維甲酸(accutane)、酮康唑、4-(二(2-氯乙基)氨基)-L-苯丙氨酸、L-絲氨酸重氮基醋酸酯、香菇多糖、亞葉酸、醋酸亮丙瑞林(LHRH-類似物)、左旋咪唑(ergamisol)、羅氮芥(CCNU；cee-NU)、甘露莫司汀、美登素、氮芥、氮芥HCl(氮芥)、醋酸甲羥孕酮(普維拉、depo provera)、醋酸甲地孕酮(menace)、醋酸美侖孕酮、苯丙氨酸氮芥(alkeran)、美洛格瑞、巰嘌呤、巰嘌呤(purinethol)、無(wú)水巰嘌呤、MESNA、美司鈉(mesne)、甲磺酸乙酯、氨甲喋呤(mtx；氨甲喋呤)、賽氮芥、含羞草堿、醚醇硝唑、光輝霉素、米托蒽醌、二溴甘露醇、丙米腙、二溴衛(wèi)矛醇、絲裂霉素(mutamycin)、絲裂霉素C、米托坦(o，p′-DDD；lysodren)、米托蒽醌、米托蒽醌HCl(novantrone)、單哌潘生丁、N，N-雙(2-氯乙基)四氫-2H-1，3，2-oxazaphosphorin-2-胺-2-氧化物、N-(1-甲基乙基)-4-((2-甲基肼基)甲基)苯甲酰胺、N-甲基-雙(2-氯乙基)胺、尼卡地平、尼魯米特(nilandron)、嘧啶亞硝脲、二胺硝吖啶、氮芥、洛可達(dá)唑、諾加拉霉素、奧曲肽(sandostatin)、紫杉醇(taxon)、紫杉醇、密旋霉素、天門(mén)冬酰胺酶(PEGx-1)、噴司他丁(2′-脫氧柯福霉素)、培來(lái)霉素、苯丙氨酸芥肽、photophoresis、普卡霉素(mithracin)、溶血鏈球菌Su、哌泊溴烷、普卡霉素、普達(dá)非洛、鬼臼毒素、泊非霉素、潑尼松、甲基芐肼、甲基芐肼HCl(matulane)、prospidium、嘌呤霉素、嘌呤霉素氨基核苷、PUVA(補(bǔ)骨脂素+紫外線a)、吡喃共聚物、雷帕霉素、s-氮胞苷、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-三嗪、甲環(huán)亞硝脲、焦土霉素、西羅莫司、鏈脲霉素(zanosar)、蘇拉明、檸檬酸他莫昔芬(nolvadex)、taxon、喃氟啶、替尼泊苷(VM-26；vumon)、細(xì)格孢氮雜酸、TEPA、睪內(nèi)酯、噻替哌、硫鳥(niǎo)嘌呤、噻替哌(thioplex)、替洛龍、拓?fù)涮婵?、維甲酸(vesanoid)、三亞胺醌、木霉素、環(huán)氧甘醚、三亞胺嗪、三亞乙基磷酰胺、噻替哌、曲美沙特(neutrexin)、三(1-氮丙啶基)氧化膦、三(1-氮丙啶基)硫化膦、三(氮丙啶基)-對(duì)-苯醌、三(氮丙啶基)硫化膦、尿嘧啶氮芥、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、長(zhǎng)春堿、硫酸長(zhǎng)春堿(velban)、硫酸長(zhǎng)春新堿(oncovin)、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春瑞濱(navelbine)、(1)-含羞草堿、1-(2-氯乙基)-3-(4-甲基環(huán)己基)-1-亞硝脲、(8S-順式)-10-((3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-lyxo-hexopyranosyl)氧)-7，8，9，10-四氫-6，8、11-三羥基-8-(羥基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘并萘二酮、131-間-碘代芐基胍(I-131 MIBG)、5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-1H-咪唑-4-羧酰胺、5-(二(2-氯乙基)氨基)-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-噻嗪、2，3，5-三(1-氮丙啶基)-2，5-環(huán)己二烯-1，4-二酮、2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺、N，N-二(2-氯乙基)四氫-2H-1，3，2-oxazaphosphorin-2-胺-2-氧化物、3-去氮雜尿苷、3-碘代芐基胍、5，12-萘并萘二酮、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、(1aS，8S，8aR，8bS)-6-氨基-8-(((氨基羰基)氧基)甲基)-1，1a，2，8，8a，8b-六氫-8a-甲氧基-5-甲基azirino(2′，3′3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、6-氮尿苷、6-巰嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、和其組合。
可以作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法施用的優(yōu)選的治療劑和組合包括阿霉素和Doxetaxel、拓?fù)涮婵怠⒆仙即?、卡鉑和紫杉酚、紫杉酚、順鉑和放射、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-FU和放射、Toxotere、氟達(dá)拉濱、Ara C、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿。
示例性化學(xué)治療劑還包括doxetaxel(TOXOTERE)和拓?fù)涮婵?HYCAMTIN)。
可以在本發(fā)明的方法中施用的化學(xué)治療劑包括，但不限于，抗生素衍生物(例如，阿霉素、博來(lái)霉素、柔紅霉素和更生霉素)；抗雌激素藥(例如，他莫昔芬)；抗代謝物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、α干擾素-2b、谷氨酸、普卡霉素、巰嘌呤、和6-硫代鳥(niǎo)嘌呤)；細(xì)胞毒性劑(例如，卡氮芥、BCNU、羅氮芥、CCNU、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、羥基脲、甲基芐肼、絲裂霉素C、白消安、順鉑和硫酸長(zhǎng)春新堿)；激素(例如，甲羥孕酮、磷雌氮芥、乙炔基雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睪酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚和睪內(nèi)酯)；氮芥衍生物(例如，mephalen、chorambucil、氮芥和噻替哌)；類固醇和組合(例如，倍他米松磷酸酯鈉)；和其它(例如，達(dá)卡巴嗪、天冬酰胺酶、曼托坦、硫酸長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春堿、和依托泊苷)。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和潑尼松)的組合或者CHOP組分的任意組合一起施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與利妥昔單抗(Rituximab)組合施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與利妥昔單抗和CHOP，或者利妥昔單抗和CHOP的任意組分的組合施用。
表4用于主要癌癥適應(yīng)癥的常用的化學(xué)治療藥物
治療性放射包括例如，分次放射治療、非分次放射治療和超分次放射治療，和放射與化學(xué)治療的組合。放射的類型還包括電離(γ)放射、粒子輻射、低能量傳遞(LET)、高能量傳遞(HET)、紫外輻射、紅外輻射、可見(jiàn)光、和光敏化輻射。本文所用的化學(xué)治療包括用一種化學(xué)治療劑或者用治療劑的組合進(jìn)行治療。在需要治療的受試者中，化學(xué)治療可以與手術(shù)治療或者放射治療組合，或者與其他抗腫瘤治療形式組合。
其他治療劑
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與抗病毒劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體一起施用的抗病毒劑包括，但不限于阿昔洛維、利巴韋林、金剛烷胺和remantidine。
本發(fā)明的抗體還可以與止吐劑，如2-(乙基硫代)-10-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙基)-10H-吩噻嗪(乙基硫代培拉嗪)、1-(對(duì)-氯-α-苯基芐基)-4-(間-甲基芐基)-哌嗪(美克洛嗪，氯苯甲嗪)等等，和它們的組合施用。本發(fā)明的多核苷酸和多肽還可以與本文公開(kāi)或者本領(lǐng)域已知的其他治療劑，和它們的組合施用。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與抗生素治療劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的抗生素治療劑包括，但不限于，阿莫西林、β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖甙類、β-內(nèi)酰胺(糖肽)、β-內(nèi)酰胺酶、克林霉素、氯霉素、先鋒霉素類、環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、甲硝唑、青霉素類、喹諾酮類、利福平、鏈霉素、氨苯磺胺、四環(huán)素類、甲氧芐氨嘧啶、甲氧芐氨嘧啶-sulfamthoxazole和萬(wàn)古霉素。
可以與本發(fā)明的抗體組合施用的常規(guī)非特異免疫抑制劑包括，但不限于，類固醇類、環(huán)胞菌素、環(huán)胞菌素類似物、環(huán)磷酰胺甲基潑尼松、潑尼松、硫唑嘌呤、FK-506、15-脫氧精胍菌素、和其他通過(guò)抑制反應(yīng)性T細(xì)胞的功能起作用的免疫抑制劑。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與免疫抑制劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的免疫抑制劑制劑包括，但不限于，ORTHOCLONE.TM.(OKT3)、SANDIMMUNE.TM./NEORAL.TM./SANGDYA.TM.(環(huán)胞菌素)、PROGRAF.TM.(他克莫司)、CELLCEPT.TM(麥考酚酯)、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)類固醇和RAPAMUNE.TM.(西羅莫司)。在特定實(shí)施方案中，免疫抑制劑可以用于預(yù)防器官或者骨髓移植的排斥。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體單獨(dú)或者與一種或多種靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑包括，但不限于，GAMMAR.TM.、IVEEGAM.TM.、SANDOGLOBULIN.TM.、GAMMAGARD S/D.TM.、和GAMIMUNE.TM.。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑組合在移植療法(例如，骨髓移植)中施用。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體單獨(dú)或者與消炎劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的消炎劑包括，但不限于，糖皮質(zhì)激素和非類固醇消炎劑、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水楊酸衍生物、噻嗪羧酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群、芐吲酸、芐達(dá)明、丁環(huán)己巴比妥、聯(lián)苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈創(chuàng)藍(lán)油烴、萘普酮、尼美舒利、奧古蛋白、奧沙西羅、瑞尼托林、哌異噁唑、哌酰苯肟、普羅喹宗、胺丙噁二唑和替尼達(dá)普。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與化學(xué)治療劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的化學(xué)治療劑包括，但不限于，抗生素衍生物(例如，阿霉素、博來(lái)霉素、柔紅霉素和更生霉素)；抗雌激素藥(例如，他莫昔芬)；抗代謝物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、α干擾素-2b、谷氨酸、普卡霉素、巰嘌呤、和6-硫代鳥(niǎo)嘌呤)；細(xì)胞毒性劑(例如，卡氮芥、BCNU、羅氮芥、CCNU、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、羥基脲、甲基芐肼、絲裂霉素、白消安、順鉑和硫酸長(zhǎng)春新堿)；激素(例如，甲羥孕酮、雌莫司汀磷酸酯鈉、乙炔基雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睪酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚和睪內(nèi)酯)；氮芥其它(例如，mephalen、chorambucil、氮芥和噻替哌)；類固醇和組合(例如，倍他米松磷酸酯鈉)；和其它(例如，達(dá)卡巴嗪、天冬酰胺酶、曼托坦、硫酸長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春堿、和依托泊苷)。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和潑尼松)組合或者CHOP組分的任意組合施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與利妥昔單抗組合施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與利妥昔單抗和CHOP，或者利妥昔單抗和CHOP的任意組分的組合施用。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與細(xì)胞因子組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的細(xì)胞因子包括，但不限于，IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗-CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與任意白介素施用，所述白介素包括但不限于，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與血管生成蛋白質(zhì)組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的血管生成蛋白質(zhì)包括，但不限于，神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生生長(zhǎng)因子(GDGF)(如歐洲專利號(hào)EP-399816中公開(kāi))；血小板衍生生長(zhǎng)因子-A(PDGF-A)(如歐洲專利號(hào)EP-682110中公開(kāi))；血小板衍生生長(zhǎng)因子-B(PDGF-B)(如歐洲專利號(hào)EP-282317中公開(kāi))；胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)(如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 92/06194中公開(kāi))；胎盤(pán)生長(zhǎng)因子-2(PIGF-2)(如Hauser et al.，Gorwth Factors，4259-268(1993)中公開(kāi))；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 90/13649中公開(kāi))；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)(如歐洲專利號(hào)EP-506477中公開(kāi))；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-2(VEGF-2)(如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 96/39515中公開(kāi))；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-3)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B-186(VEGF-B186)(如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 96/26736中公開(kāi))；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D(VEGF-D)(如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 98/02543中公開(kāi))；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D(VEGF-D)(如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 98/07832中公開(kāi))；和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-E(VEGF-E)(如德國(guó)專利號(hào)DE19639601中公開(kāi))。將上面的參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與造血生長(zhǎng)因子組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的造血生長(zhǎng)因子包括，但不限于，LEUKINE.TM.(SARGRAMOSTIM.TM.)和NEUPOGEN.TM.(FILGRASTIM.TM.)。
在額外實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體施用的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括，但不限于，F(xiàn)GF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。
實(shí)施例1
放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡后暴露于乳腺腫瘤細(xì)胞的表面膜上的C35
將表達(dá)C35腫瘤抗原的連續(xù)生長(zhǎng)的乳腺腫瘤細(xì)胞系用300Gy輻射或者不處理。在體外連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天以允許發(fā)生細(xì)胞凋亡后，收獲細(xì)胞，將其洗滌并用50ng 1F2單克隆抗-C35抗體或者小鼠IgG抗體對(duì)照染色，所述抗體都綴合熒光染料Alexa 647。在25℃孵育50分鐘后，使用標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)試劑盒(Pharmingen)將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)染色。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，使用標(biāo)準(zhǔn)方案分析細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V、碘化丙錠和Alexa 647的染色。
圖1的結(jié)果顯示沒(méi)有經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性)的未處理的活細(xì)胞(PI陰性)不在表面膜上表達(dá)C35，如用抗-C35抗體和同種型對(duì)照抗體不存在差別染色所證明的(圖1A)。類似地，保持存活(PI陰性)和誘導(dǎo)但不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性)的放射的腫瘤細(xì)胞也不在腫瘤細(xì)胞表面膜上表達(dá)C35(圖1B)。形成鮮明對(duì)照的是，存活(PI陰性)但是經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性)的經(jīng)放射的腫瘤細(xì)胞用抗-35抗體與同種型對(duì)照抗體相比清楚地差別染色(圖1C)。
實(shí)施例2
藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡后乳腺腫瘤細(xì)胞的表面膜上暴露的C35
將表達(dá)C35腫瘤抗原的連續(xù)生長(zhǎng)的乳腺腫瘤細(xì)胞系用6ug/ml絲裂霉素C處理或者不處理。在體外連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)以允許發(fā)生細(xì)胞凋亡后，收獲細(xì)胞，將其洗滌并用50ng 1F2單克隆抗-C35抗體或者小鼠IgG抗體對(duì)照染色，所述抗體都綴合熒光染料Alexa 647。在25℃孵育50分鐘后，使用標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)試劑盒(Pharmingen)將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)染色。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，使用標(biāo)準(zhǔn)方案分析細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V、碘化丙錠和Alexa 647的染色。
圖2的結(jié)果顯示沒(méi)有經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性)的未處理的活細(xì)胞(PI陰性)不在表面膜上表達(dá)C35，如用抗-C35抗體和同種型對(duì)照抗體不存在差別染色所證明的(圖2A)。類似地，保持存活(PI陰性)和沒(méi)有誘導(dǎo)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陰性)的絲裂霉素C處理的細(xì)胞也不在腫瘤細(xì)胞表面膜上表達(dá)C35(圖2B)。形成鮮明對(duì)照的是，存活(PI陰性)但是經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性)的絲裂霉素C處理的腫瘤細(xì)胞用抗-35抗體與同種型對(duì)照抗體相比清楚地差別染色(圖2C)。
實(shí)施例3
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抗體的表達(dá)
本發(fā)明的多肽可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的啟動(dòng)子元件、蛋白質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物多聚腺苷酸化所需的信號(hào)。額外的元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列和間插序列，其側(cè)翼是RNA剪接的供體和受體位點(diǎn)。用來(lái)自SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和來(lái)自巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)高度有效轉(zhuǎn)錄。然而，也可以使用細(xì)胞元件(例如，人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。
用于實(shí)踐本發(fā)明的適宜的表達(dá)載體包括，例如，諸如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport 2.0和pCMVSport3.0的載體?？梢允褂玫牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括人Hela、293、H9和Jurkat細(xì)胞、小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞、Cos 1、Cos 7和CV1、quailQC1-3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
備選地，多肽可以在含有摻入到基因組的多核苷酸的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)。用選擇性標(biāo)記，如DHFR、gpt、新霉素、潮霉素共轉(zhuǎn)染允許鑒定和分離轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
也可以擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的基因以大量表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記可用于開(kāi)發(fā)攜帶數(shù)百或者甚至數(shù)千拷貝的目的基因的細(xì)胞系(見(jiàn)，例如，Alt，F(xiàn).W.，et al.，J.Biol.Chem.2531357-1370(1978)；Hamlin，J.L.and Ma，C.，Biochem.et Biophys.Acta，1097107-143(1990)；Page，M.J.and Sydenham，M.A.，Biotechnology 964-68(1991).)。另一種有用的選擇標(biāo)記是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy et al.，Biochem J.227277-279(1991)；Bebbington et al.，Bio/Technology 10169-175(1992)。使用這些標(biāo)記，哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)在選擇培養(yǎng)基中并且選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有整合到染色體的擴(kuò)增的基因。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞通常用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC檢索號(hào)37146)、表達(dá)載體pC4(ATCC檢索號(hào)209646)和pC6(ATCC檢索號(hào)209647)的衍生物含有勞氏肉瘤病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cullen et al.，Molecular and Cellular Biology，438-447(March，1985))和CMV-增強(qiáng)子的片段(Boshart et al.，Cell41521-530(1985).)。多克隆位點(diǎn)，例如具有限制酶切割位點(diǎn)BamHI、XbaI和Asp718的多克隆位點(diǎn)允許克隆目的基因。載體還含有3’內(nèi)含子、大鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化和終止信號(hào)，和處于SV40早期啟動(dòng)子控制下的小鼠DHFR基因。
特別地，例如，將質(zhì)粒pC6用適宜的限制酶消化然后通過(guò)本領(lǐng)域已知的步驟使用小牛腸磷酸酶去磷酸化。然后從1％瓊脂糖凝膠分離載體。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方案擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸。如果用天然發(fā)生的信號(hào)序列產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，那么載體不需要第二種信號(hào)肽。備選地，如果不使用天然發(fā)生的信號(hào)序列，那么可以修飾載體以包含異源信號(hào)序列(見(jiàn)，例如，WO 96/34891.)。
用通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的試劑盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，LaJolla，Calif.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴(kuò)增的片段。然后將該片段用適宜的限制酶消化并在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。
然后將擴(kuò)增片段用相同的限制酶消化并在1％瓊脂糖凝膠上純化。然后將分離的片段和去磷酸化的載體用T4DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL-1 Blue細(xì)胞并使用例如限制酶分析鑒定含有插入質(zhì)粒pC6的片段的細(xì)菌。
缺少活性DHFR基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。用lipofectin將5mu.g表達(dá)質(zhì)粒pC6或pC4與0.5mu.g質(zhì)粒pSVneo共轉(zhuǎn)染(Felgneret al.，如前)。質(zhì)粒pSV2-neo含有顯性選擇標(biāo)記，來(lái)自Tn5的neo基因(編碼賦予對(duì)包括G418的一組抗生素的抗性的酶)。將細(xì)胞接種在補(bǔ)加1mg/ml G418的alpha minus MEM中。2天后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并接種在雜交瘤克隆板(Greiner，Germany)中補(bǔ)加10、25或50ng/ml氨甲蝶呤加上1mg/ml G418的alpha minus MEM中。約10-14天后，將單個(gè)克隆用胰蛋白酶處理并接種在6孔培養(yǎng)皿中或者10ml培養(yǎng)瓶中，使用不同濃度的氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。然后將在最高濃度的氨甲蝶呤中生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)移到含有甚至更高濃度氨甲蝶呤(1uM、2uM、5uM、10mM、20mM)的6孔板中。重復(fù)相同的步驟直到獲得生長(zhǎng)在100-200uM濃度的克隆。通過(guò)例如，SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡或者通過(guò)反相HPLC分析法分析所希望的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
實(shí)施例4
放射標(biāo)記的C-35特異抗體濃集在表達(dá)C35的活腫瘤的壞死區(qū)中
將BALB/c小鼠在相對(duì)的兩個(gè)側(cè)腹移植同基因小細(xì)胞肺癌來(lái)源的系1腫瘤細(xì)胞，其已經(jīng)用人C35轉(zhuǎn)染或者沒(méi)有轉(zhuǎn)染。通過(guò)用抗-C35抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色證實(shí)C35蛋白質(zhì)表達(dá)。體內(nèi)生長(zhǎng)14天后，動(dòng)物接受靜脈內(nèi)注射125I-標(biāo)記的抗-C35抗體。注射放射標(biāo)記的抗體后120小時(shí)處死動(dòng)物并通過(guò)將腫瘤切片對(duì)膠片曝光確定C35陽(yáng)性和C35陰性腫瘤中抗-C35抗體的濃度。如圖4中所示，放射標(biāo)記的C-35抗體僅在C35陽(yáng)性并且不在C-35陰性腫瘤中濃集。比較腫瘤內(nèi)完整細(xì)胞的標(biāo)記分布和H&E染色證實(shí)在這些條件下標(biāo)記的抗C-35抗體在C35陽(yáng)性腫瘤的壞死區(qū)中特異濃集。
實(shí)施例5
施用劑量測(cè)定法的(dosimetric)和治療性放射標(biāo)記的抗體的方案
以注射形式在靜脈內(nèi)或者動(dòng)脈內(nèi)施用放射標(biāo)記的抗體(或者抗體片段)組合物，其包括劑量測(cè)定法的放射標(biāo)記的抗體和治療性放射標(biāo)記抗體?？勺⑸涞姆派錁?biāo)記的抗體組合物將在5分鐘到約60分鐘，優(yōu)選約15分鐘到30分鐘時(shí)間內(nèi)輸入靜脈或者動(dòng)脈。當(dāng)腫瘤由已知的動(dòng)脈供應(yīng)時(shí)，動(dòng)脈內(nèi)施用優(yōu)選適用于治療性放射標(biāo)記的抗體組合物。劑量測(cè)定法的放射標(biāo)記的抗體和治療性放射標(biāo)記的抗體將作為生理磷酸緩沖鹽溶液或者適于腸胃外注射的其他載體中的無(wú)菌水溶液施用。最初劑量測(cè)定法的放射標(biāo)記的抗體劑量將約為5-100mg抗體，其將遞送約5-50mCi放射。施用劑量測(cè)定法的劑量后約5-10天，治療性放射標(biāo)記的抗體將以約10-500mg的劑量施用，其對(duì)于每個(gè)治療劑量將遞送多達(dá)300mCi放射。該劑量測(cè)定法/治療方案可以重復(fù)。也參見(jiàn)US5,057,313和US 5,120,525。
實(shí)施例6
將抗-C35小鼠和人抗體可變區(qū)基因克隆到保藏的TOPO克隆中
將免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)通過(guò)V區(qū)的PCR擴(kuò)增并TA克隆到TOPO載體中從而克隆到TOPO載體(Invitrogen)中。該連接系統(tǒng)不需要限制酶消化(盡管TOPO載體摻入EcoRI位點(diǎn)以允許插入片段的隨后切除)。TA克隆利用Taq聚合酶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中天然加入的3’A突出端，該突出端可以與TOPO克隆試劑盒(Invitrogen)中提供的線性化載體的5’T突出端配對(duì)。
為了PCR擴(kuò)增用于插入TOPO的可變區(qū)基因，我們利用與恒定區(qū)序列(對(duì)于重鏈和輕鏈?zhǔn)遣煌牟⑶覍?duì)于小鼠和人也是不同的)的5’末端互補(bǔ)的下游引物并且通過(guò)5’RACE使用Invitrogen GeneRacer試劑盒在可變區(qū)的5’末端加入已知的固定化引物序列。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
實(shí)施例7
將來(lái)自保藏的TOPO克隆的可變基因克隆到pCMV表達(dá)構(gòu)建體
產(chǎn)生pCMV表達(dá)構(gòu)建體
痘苗轉(zhuǎn)移質(zhì)粒-pVHE、pVKE和pVLE-的構(gòu)建已經(jīng)在以前的專利申請(qǐng)(US 2002 0123057 A1，“In vitro Methods of Producing andIdentifying Immunoglobulin Molecules in Eukaryotic Cells”，2002-09-05公布)中描述。為了產(chǎn)生哺乳動(dòng)物表達(dá)載體來(lái)表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈，從這些痘苗轉(zhuǎn)移質(zhì)粒切除從NotI到SalI的表達(dá)盒并克隆到pCMV-Script載體(其在載體多克隆位點(diǎn)中的XhoI位點(diǎn)通過(guò)填充和鈍端連接而破壞)，產(chǎn)生pCMV-VH、pCMV-VK和pCMV-VL載體。這些表達(dá)盒含有信號(hào)肽、V基因的克隆位點(diǎn)和來(lái)自膜結(jié)合的μ重鏈和κ輕鏈基因的恒定區(qū)。
在pCMV-VH中，表達(dá)盒含有從相對(duì)于起始密碼子氨基酸位置-19[aa(-19)]到aa(-3)的信號(hào)肽，接著是VH基因的aa(109到113)和完整重鏈恒定區(qū)。所選的VH基因(從aa(-4)到aa(110))可以克隆到pCMV-VH中BssHII[aa(-4到-3)]和BstEII[aa(109-110)]位點(diǎn)。
在pCMV-VK(kappa)中，表達(dá)盒含有從aa(-19)到aa(-2)的信號(hào)肽，接著是VK基因的aa(104到107)和完整κ鏈恒定區(qū)。所選的VK基因(從aa(-3)到aa(105))可以克隆到pCMV-VK中ApaLI[aa(-3到-2)]和XhoI[aa(104-105)]位點(diǎn)。
在pCMV-VL(lambda)中，表達(dá)盒含有從aa(-19)到aa(-2)的信號(hào)肽，接著是VL基因的aa(103到107)和完整κ鏈恒定區(qū)。所選的VL基因(從aa(-3)到aa(104))可以克隆到pCMV-VL中ApaLI[aa(-3到-2)]和HindIII[aa(103-104)]位點(diǎn)。所得λ輕鏈將顯示出VλCκ嵌合結(jié)構(gòu)。
為了將所選抗體表達(dá)為分泌型人IgG1，通過(guò)RT-PCR從B細(xì)胞或者骨髓細(xì)胞克隆IgG1的恒定區(qū)。使用的引物對(duì)為
5’正向引物5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ IDNO15)
3’反向引物5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO16)
所得PCR產(chǎn)物顯示出下面的結(jié)構(gòu)BamHI-BstEII(aa109-110)-(aa111-113)-Cγ1-TGA-SalI。使用標(biāo)準(zhǔn)方案將PCR產(chǎn)物亞克隆到pBluescriptII/KS中BamHI和SalI位點(diǎn)以進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從而通過(guò)沉默突變除去CH1區(qū)的內(nèi)部BstEII。然后一旦VH基因亞克隆到該載體中的BssHII/BstEII處，將所得Cγ1亞克隆到pCMV-VH中BstEII和SalI以產(chǎn)生pCMV-Cγ1用來(lái)指導(dǎo)分泌型IgG1重鏈的表達(dá)。
用于插入V基因的分泌型IgG1、人γ1重鏈前導(dǎo)序列和恒定區(qū)盒的序列如下。
下劃線＝限制位點(diǎn)
粗體＝恒定區(qū)
粗體/斜體＝信號(hào)肽
Not1 NcoI
gcggcZcgcaaaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag
BssHIIBsteII
gcgcgcatatggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac
cctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttcc
ccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccgg
ctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagct
tgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaaga
aagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcc
tggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga
cccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaact
ggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagt
acaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcca
aagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaaga
accaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg
agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggct
ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct
catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccct
Sal1
Gtctccgggtaaatgagtcgac(SEQ ID NO17)
用于插入Vκ基因的人輕鏈前導(dǎo)序列和κ恒定區(qū)盒的序列如下。
Not1 NcoI
gcggccgcaaaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag
ApaL1 XhoI
gcgtgcacttgactcgagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca
tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccc
agagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagt
gtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa
gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcaccc
Sal1
Atcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaggtcgac
(SEQ ID NO18)
用于插入Vλ基因的人輕鏈前導(dǎo)序列和κ恒定區(qū)盒的序列如下。
Not 1 Nco1
gcggccgcaaaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag
ApaL1 HindIII
gcgtgcacttgactcgagaagcttaccgtcctacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatc
ttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc
caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacg
ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctg
agctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SAL 1
Taggtcgac(SEQ ID NO19)
為了構(gòu)建表達(dá)其他同種型的分泌型人抗體(包括IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的分泌型)的載體，可以用相同方法克隆各自恒定區(qū)，誘變?nèi)我鈨?nèi)部BstEII位點(diǎn)，并在pCMV-Cγ1載體的BstEII和SalI位點(diǎn)之間用其他同種型的恒定區(qū)替代Cγ1。
為了克隆其他同種型的恒定區(qū)，使用下面的引物對(duì)
IgG2-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ IDNO20)
IgG2-R5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO21)
IgG3-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCT-3’(SEQ IDNO22)
IgG3-R5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO23)
IgG4-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCT-3’(SEQ IDNO24)
IgG4-R5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCAGAGACAGGGA-3’(SEQ IDNO25)
IgA1-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAT-3’(SEQ IDNO26)
IgA1-R5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCGTCCAC-3’(SEQ IDNO27)
IgA2-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAT-3’(SEQ IDNO28)
IgA2-R5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCGTCCAC-3’(SEQ IDNO29)
IgD-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAC-3’(SEQ IDNO30)
IgD-R5’-ATTAGTCGACTCATTTCATGGGGCCATGGTC-3’(SEQ IDNO31)
IgE-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ IDNO32)
IgE-R5’-ATTAGTCGACTCATTTACCGGGATTTACAGA-3’(SEQ IDNO33)
IgM-F5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGGG-3’(SEQ IDNO34)
IgM-R5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCAGCTGT-3’(SEQ IDNO35)
注意到因?yàn)楦叨刃蛄斜Ｊ匦?，所用的引物在IgG1和IgG2之間、IgG3和IgG4之間、IgA1和IgA2之間相同。
將來(lái)自Topo克隆的可變基因克隆到pCMV表達(dá)構(gòu)建體。
步驟1產(chǎn)生V-基因片段
A.人v-基因
MMH1
1.使用標(biāo)準(zhǔn)方法用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO37))消化MMH1質(zhì)粒DNA(克隆H0009)。
2.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法從凝膠切除357bp片段并分離DNA。
MMK1
1.用標(biāo)準(zhǔn)方法使用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO38))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO39))消化MMK1質(zhì)粒DNA(克隆L0010)。
2.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法從凝膠切除343bp片段并分離DNA。
B.小鼠雜交瘤v-基因
1F2 VK
1.必須使用下面的引物從ATCC保藏的克隆1F2K PCR擴(kuò)增小鼠雜交瘤v基因。這對(duì)于在人κ輕鏈恒定區(qū)表達(dá)盒中產(chǎn)生具有人恒定區(qū)的小鼠v-基因的嵌合抗體是必要的。
1F2VK正向引物
5’-tatccgtgcactccCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAG-3’(SEQ ID NO40)
1F2VK反向引物
5’-atattctcgAGCTTGGTCCCCCCTCCGAA-3’(SEQ ID NO41)
(小寫(xiě)＝不與小鼠1F2 VK同源，包括限制性位點(diǎn)。大寫(xiě)＝與小鼠1F2VK序列同源)
2.使用標(biāo)準(zhǔn)方法用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO42))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO43))消化331bp PCR產(chǎn)物。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA。
4.用標(biāo)準(zhǔn)方法從凝膠切除315bp片段并分離DNA。
1F2 VH
1.必須使用下面的引物從ATCC保藏的克隆1F2G PCR擴(kuò)增小鼠雜交瘤v基因。這對(duì)于在人重鏈恒定區(qū)表達(dá)盒中產(chǎn)生具有人恒定區(qū)的小鼠v-基因的嵌合抗體是必要的。
1F2VH正向引物
5’-tataagcgcgcactccGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGAC (SEQ ID NO44)
1F2VH反向引物
5′-atattgGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCC-3′(SEQ ID NO45)
(小寫(xiě)＝非同源的，含有限制性位點(diǎn)。大寫(xiě)＝同源的)
2.用標(biāo)準(zhǔn)方法使用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO37))消化360bp PCR產(chǎn)物。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA。
4.用標(biāo)準(zhǔn)方法切除含有343bp的DNA消化片段的凝膠片并分離DNA。
1B3VK
1.必須使用下面的引物從保藏的克隆1B3K通過(guò)PCR擴(kuò)增小鼠雜交瘤v基因。這對(duì)于在人κ輕鏈恒定區(qū)表達(dá)盒中產(chǎn)生具有人恒定區(qū)的小鼠v-基因的嵌合抗體是必要的。
1B3VK正向引物
5’-tatccgtgcactccGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATC-3’(SEQ IDNO46)
1B3VK反向引物
5’-atattctcgAGCTTGGTCCCAGCACCGAA-3’(SEQ ID NO47)
(小寫(xiě)＝非同源的，含有限制性位點(diǎn)。大寫(xiě)＝同源的)
2.使用標(biāo)準(zhǔn)方法用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO42))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO43))消化334bp PCR產(chǎn)物。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA。
4.用標(biāo)準(zhǔn)方法切除含有消化的322bp的DNA片段的凝膠片并分離DNA。
1B3VH
1.必須使用下面的引物從保藏的克隆1B3G通過(guò)PCR擴(kuò)增小鼠雜交瘤v基因。這對(duì)于在人重鏈恒定區(qū)表達(dá)盒中產(chǎn)生具有人恒定區(qū)的小鼠v-基因的嵌合抗體是必要的。
1B3VH正向引物
5’-tataagcgcgcactccGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC-3’(SEQ IDNO48)
1B3VH反向引物
5’-atattGGTGACCGTGGTCCCAGCG-3’(SEQ ID NO49)
(小寫(xiě)＝非同源的，含有限制性位點(diǎn)。大寫(xiě)＝同源的)
2.使用標(biāo)準(zhǔn)方法用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO37))消化378bp PCR產(chǎn)物。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA。
4.用標(biāo)準(zhǔn)方法切除含有366bp消化的DNA片段的凝膠片并分離DNA。
步驟2表達(dá)構(gòu)建體的裝配
1.用標(biāo)準(zhǔn)方法使用適宜的酶消化pCMV-VH和pCMV-VK表達(dá)載體
a. pCMV-VH-BsteII和BssHII
b. pCMV-VK-ApaL1和XhoI
2.用標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離DNA并切除線性化的載體。
3.用標(biāo)準(zhǔn)方法從凝膠片分離DNA。
4.用標(biāo)準(zhǔn)方法將輕鏈v基因連接到pCMV-VK并將重鏈v-基因連接到pCMV-VH。
5.用標(biāo)準(zhǔn)方法將連接的DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞并分離質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例8
免疫球蛋白恒定區(qū)的序列
下面的基因和編碼的氨基酸序列可以用于制備人源化抗體、人變異抗體、嵌合抗體，和其片段。
免疫球蛋白恒定區(qū)的智人G2基因(IgG2(n-)同種異型)(GenBank號(hào)Z49802)(SEQ ID NO50)
1 tcttctctct gcagagcgea aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc
61 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg
121 acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatetc ttcctcagca ccacctgtgg
181 caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga
241 cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca
301 actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt
361 tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg
421 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca
481 tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt
541 cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc
601 ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt
661 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag
721 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc
781 cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt
841 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct
901 gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc
免疫球蛋白恒定區(qū)的智人G2基因(IgG2(n+)同種異型)(GenBank號(hào)Z49801)(SEQ ID NO51)
1 tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc
61 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg
121 acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg
181 caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga
241 cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca
301 actggtacgt ggacggcatg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt
361 tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg
421 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca
481 tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt
541 cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc
601 ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt
661 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag
721 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc
781 cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt
841 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct
901 gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc
編碼免疫球蛋白恒定區(qū)重鏈α-2亞基的智人CH基因(GenBankNo.AJ012264)(SEQ ID NO52)
1 ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga
61 gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga
121 ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc
181 cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc
241 ccactaaccg ccaacatcac aaaatccggt gggtccagac cctgctcggg gccctgctca
301 gtgctctggt ttgcaaagca tattcctggc ctgcctcctc cctcccaatc ctgggctcca
361 gtgctcatgc caagtacaca gggaaactga ggcaggctga ggggccagga cacagcccag
421 ggtgcccacc agagcagagg ggctctctca tcccctgccc agccccctga cctggctctc
481 taccctccag gaaacacatt ccggcccgag gtccacctgc tgccgccgcc gtcggaggag
541 ctggccctga acgagctggt gacgctgacg tgcctggcac gtggcttcag ccccaaggat
601 gtgctggttc gctggctgca ggggtcacag gagctgcccc gcgagaagta cctgacttgg
661 gcatcccggc aggagcccag ccagggcacc accacctacg ctgtaaccag catactgcgc
721 gtggcagctg aggactggaa gaagggggag accttctcct gcatggtggg ccacgaggcc
781 ctgccgctgg ccttcacaca gaagaccatc gaccgcatgg cgggtaaacc cacccacatc
841 aatgtgtctg ttgtcatggc ggaggcggat ggcacctgct actgagccgc ccgcctgtcc
901 ccacccctga ataaactcca tgctccccca agcagcccca cgcttccatc cggcgcctgt
961 ctgtccatcc tcagggtctc agcacttggg aaagggccag ggcatggaca gggaagaata
1021 ccccctgccc tgagcctcgg ggggcccctg gcacccccat gagactttcc accctggtgt
1081 gagtgtgagt tgtgagtgtg agagtgtgtg gtgcaggagg cctcgctggt gtgagatctt
1141 aggtctgcca aggcaggcac agcccaggat gggttctgag agacgcacat gccccggaca
1201 gttctgagtg agcagtggca tggccgtttg tccctgagag agccgcctct ggctgtagct
1261 gggagggaat agggagggta aaaggagcag gctagccaag aaaggcgcag gtagtggcag
1321 gagtggcgag ggagtgaggg gctggactcc agggccccac tgggaggaca agctccagga
1381 gggccccacc accctagtgg gtgggcctca ggacgtccca ctgacgcatg caggaagggg
1441 cacctcccct taaccacact gctctgtacg gggcacgtgg gcacacatgc acactcacac
1501 tcacatatac gcctgagccc tgcaggagtg gaacgttcac agcccagacc cagttccaga
1561 aaagccaggg gagtcccctc ccaagccccc aagctcagcc tgctccccca ggcccctctg
1621 gcttccctgt gtttccactg tgcacagctc agggaccaac tccacagacc cctcccaggc
1681 agcccctgct ccctgcctgg ccaagtctcc catcccttcc taagcccaac taggacccaa
1741 agcatagaca gggaggggcc gcgtggggtg gcatcagaag
智人恒定區(qū)重鏈α-2亞基(GenBank No.CAA09968.1)(SEQ IDNO53)
LEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPER
DLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNT
FRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPRE
KYLTWASRQEPSQGTTTYAVTSILRVAAEDWKKGETFSCMVGHEALP
LAFTQKTIDRMAGKPTHINVSVVMAEADGTCY
智人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)α1(IGHA1基因)的部分mRNA(GenBank No.AJ294729)(SEQ ID NO54)
1 gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg
61 aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc
121 tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc
181 ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc
241 aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc
301 tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc
361 tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt
421 tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc
481 acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgaccg tgacctctgt
541 ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgtcg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag
601 accttcactt gcactgctgc ctaccccgag tccaagaccc cgctaaccgc caccctctca
661 aaatccggaa acacattccg gcccgaggtc cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg
721 gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgtg gcttcagccc caaggatgtg
781 ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca
841 tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg
901 gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg
961 ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat
1021 gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctac
免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)α1(GenBank No.CAC20453.1)(SEQ IDNO55)
ASLTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVT
ARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDV
TVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCT
LTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLSGCAEPW
NHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNEL
VTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFA
VTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVN
VSVVMAEVDGTCY
額外的恒定區(qū)序列(人IgM1、IgM2、IgD1、IgA1、IgG1、IgG3、IgE1、IgE2、κ、和λ；小鼠IgM1、κ、和λ；大鼠IgM1、κ、和λ；和狗IgM1)可以見(jiàn)FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(3d ed.)，William E.Paul(ed.)，Raven Press，New York，NY(1993)的296-300頁(yè)。許多其他恒定區(qū)序列(多核苷酸和氨基酸)是本領(lǐng)域已知的并且可以用于本發(fā)明。
實(shí)施例9
組合放射免疫療法和化學(xué)療法
化學(xué)療法和抗-C35放射免疫療法的組合經(jīng)證明在減小腫瘤體積方面比單獨(dú)任一種療法更有效。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在用Colau.C35腫瘤細(xì)胞移植的Swiss裸小鼠中測(cè)試131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體與用150mg/kg的5-氟尿嘧啶(FU)以及100mg/kg的亞葉酸(LV)的組合放射免疫療法的效果。Colau.C35是Colau細(xì)胞的C35抗原陽(yáng)性克隆，其是從人結(jié)腸癌適應(yīng)并且用C35逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織培養(yǎng)物。
腫瘤移植后11天開(kāi)始化學(xué)治療并在第14天施用300μCi 131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體。跟蹤腫瘤生長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)8周。
圖5中的結(jié)果表明與僅接受化學(xué)治療或者非-放射標(biāo)記的(“冷的”)1B3抗-C35抗體和化學(xué)治療的組相比，在接受放射免疫治療和化學(xué)治療組合的組中腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。將接受組合放射免疫治療和化學(xué)治療的組與未治療的對(duì)照組相比較，計(jì)算生長(zhǎng)抑制的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。
如圖5中顯示，腫瘤倍增延遲(TDD)等于3.8(在400mm3腫瘤體積)，其中TDD等于(治療的-對(duì)照{(diào)達(dá)到特定體積的天數(shù)})/TVDT，并且TVDT＝對(duì)照的腫瘤體積倍增時(shí)間{在指數(shù)生長(zhǎng)期}。將細(xì)胞殺死對(duì)數(shù)(LCK)定義為T(mén)DD/3.3＝1.15，其滿足有效腫瘤治療的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)，例如，Sipper HE et al.，Cancer Chemotherapy Rep.351-111(1964)；Coldman AJ and Goldie JH，Mathematical Biosciences65291-307(1983)；和Norton L and Simon R，Cancer Treat.Rep.611307-1317(1977))。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在移植Colau.C35腫瘤細(xì)胞的Swiss裸小鼠中測(cè)試在第15和18天時(shí)，組合放射免疫治療131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體與用2mg/kg的順鉑的化學(xué)治療的效果。腫瘤移植后第15和18天施用順鉑。在第21天施用300μCi 131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體。跟蹤腫瘤生長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)10周。
在相同實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)組的用Colau.C35腫瘤細(xì)胞移植的Swiss裸小鼠用180mg/kg的5-氟尿嘧啶(5FU)，以及120mg/kg的亞葉酸(LV)治療或者該相同的化學(xué)治療方案在第18天施用，然后在第21天施用300μCi 131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體。
圖6中的結(jié)果顯示了在僅接受化學(xué)治療(順鉑或者5FU/LV)的組中Colau.C35腫瘤生長(zhǎng)的一定抑制，接受131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體的組中的抑制更大，接受組合化學(xué)治療和131I標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體的組中腫瘤的抑制最大。見(jiàn)下面的表5。
表5圖6中治療形式對(duì)腫瘤體積的影響的比較
RIT＝放射免疫療法
T-C＝治療的(T)和對(duì)照(C)腫瘤達(dá)到給定體積(1200mm3)
所需時(shí)間的差異
TDD＝腫瘤倍增延遲＝T-C/未處理的腫瘤體積倍增時(shí)間
LCK＝細(xì)胞殺死對(duì)數(shù)＝TDD/3.32
為了在這些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蟹奖闶褂?，選擇生長(zhǎng)相對(duì)快速并且必須用重組C 35轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤異種移植物。然而，組合療法的成功不是由于轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤中C35表達(dá)的異常高的水平。圖7表明C35表達(dá)在腫瘤中非常相似，如在天然表達(dá)C35的21MT1的腫瘤中，和在C35-轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤如Colau.C35和MDA231.C35中。將細(xì)胞用綴合Alexa-647的抗-C35MAb 1F2或者同種型對(duì)照染色?！癕FI X”是1F2的平均熒光強(qiáng)度/同種型對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度的比例。來(lái)自正常乳腺上皮的H16N2，和乳腺腫瘤MDAMB231和結(jié)腸腫瘤Colau表達(dá)低的基底水平的C35。來(lái)自乳腺癌的21MT1天然表達(dá)高水平C35。用空載體(空的)或者人C35重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Colau和MDA231。所有腫瘤都在體內(nèi)生長(zhǎng)，切除腫瘤、解離并染色。
實(shí)施例10
確定化學(xué)治療劑的最大耐受劑量(MTD)
因?yàn)榛瘜W(xué)療法和免疫放射療法組合時(shí)，涉及累積劑量限制的骨髓毒性的考慮時(shí)，必須確定組合療法的最大耐受劑量(MTD)，并且當(dāng)兩種治療劑的毒性是累加的時(shí)候，采取將允許施用兩種毒性劑的策略。通過(guò)與外周循環(huán)中血小板和白細(xì)胞回收所需的時(shí)間有關(guān)的管理標(biāo)準(zhǔn)建立MTD。此類標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。對(duì)于鼠模型的情況，通常使用的對(duì)MTD的代替定義是導(dǎo)致平均小于20％重量減輕或者小于10％死亡率的最大劑量。用于標(biāo)準(zhǔn)臨床方案或者動(dòng)物模型中最常用的化學(xué)治療劑的當(dāng)前建立的MTD在下面的表6到9中顯示。
表6異種移植模型(裸小鼠)中代表性化學(xué)治療方案
注釋
TBD待定
1.MTD通過(guò)本發(fā)明人確定。最大耐受劑量定義為≥20％平均重量減輕和/或＞10致死率。
2.所示方案的無(wú)毒劑量。
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表7代表性乳腺癌化學(xué)治療方案
來(lái)源DataMonitor Pipeline InsightBreast Cancer June2004；http//www.bccancer.bc.ca
表8代表性結(jié)腸癌治療方案
來(lái)源http//www.bccancer.bc.ca
表9代表性肺癌化學(xué)治療方案
來(lái)源http//www.bccancer.bc.ca
減小化學(xué)治療和放射免疫治療的組合MTD的有效策略包括將施用的化學(xué)治療劑的劑量減小到當(dāng)與MTD的放射免疫療法組合施用時(shí)不導(dǎo)致累加毒性的水平(見(jiàn)，下面的實(shí)施例10A)；選擇當(dāng)與放射免疫療法組合使用時(shí)不促進(jìn)累加毒性的化學(xué)治療劑(見(jiàn)下面的實(shí)施例10B)；和減小放射免疫治療劑的骨髓毒性(見(jiàn)下面的實(shí)施例10C)。
A.減小化學(xué)治療劑的劑量以減小毒性
將2mg/kg順鉑(約MTD的50％)在第15和18天施用于Swiss裸小鼠并且在72小時(shí)后使用MTD(300μCi)的131I-標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體。如圖8中所示，通過(guò)重量減輕確定的順鉑和放射免疫治療劑的組合毒性與在MTD施用的單獨(dú)放射免疫治療劑的毒性沒(méi)有顯著不同。
B.化學(xué)治療劑不促進(jìn)累加毒性
在第18天施用180mg/kg的處于MTD的5-氟尿嘧啶與120mg/kg的亞葉酸，然后在第21天以MTD(300μCi)施用131I-標(biāo)記的1B3抗-C35單克隆抗體。如圖8中所示，不超過(guò)兩種毒性劑組合的MTD，盡管每種毒性劑都以各自的MTD施用。
C.放射免疫治療劑的減小的骨髓毒性
備選策略是通過(guò)生物化學(xué)修飾減小放射免疫治療劑的骨髓毒性，所述修飾導(dǎo)致放射標(biāo)記的抗體從外周循環(huán)中加速清除。適宜的修飾包括使用不同的抗體同種型，如表10中所示的IgG3、IgA、IgD或IgE，或者缺失IgG的CH2結(jié)構(gòu)域，其負(fù)責(zé)它的延長(zhǎng)的血清半壽期(見(jiàn)Mueller BM，RA Reisfeld，and SD Gillies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875702-5705(1990)；Slavin-Chiorini DC，et al.，Int.J.Cancer 5397-103(1993))。
表10人免疫球蛋白同種型的血清半壽期
另一種工程化抗體和/或抗體片段，或者修飾抗體結(jié)構(gòu)以減小血清半壽期的策略也是可行的。此類工程化的抗體和/或抗體片段的實(shí)例包括，但不限于，結(jié)構(gòu)域缺失的抗體、Fab、F(ab’)2、scFv、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體等等。
實(shí)施例11
1B3和1F2抗體的C35肽表位
為了定位1B3和1F2抗體的表位特異性，將在大腸桿菌中合成的具有6x His標(biāo)簽的重組人C35(rhC35)用Lys-C內(nèi)切蛋白酶消化。該酶在蛋白質(zhì)序列中賴氨酸(K)殘基后切割。圖9顯示了用Lys-C完全消化rhC35后預(yù)計(jì)的肽片段。顯示了rhC35的完整序列，包括氨基末端添加的6x His標(biāo)簽。氨基酸位置相對(duì)于天然人序列的氨基末端甲硫氨酸(M)編號(hào)。注意到在后面為帶負(fù)電殘基的第一和第三個(gè)賴氨酸處消化是無(wú)效的，并且可以產(chǎn)生一些更長(zhǎng)的組合片段。以50∶1的重量比加入Lys-C內(nèi)切蛋白酶至純化的rhC35并在37℃在25mM Tris，pH 8.0中孵育18小時(shí)。將消化物用乙醇沉淀并在還原性Tricine樣品緩沖液中再溶解。100℃下加熱5分鐘后，在16％Tricine凝膠(Invitrogen)上通過(guò)電泳分離樣品。將肽轉(zhuǎn)移到PVDF膜并用考馬斯藍(lán)對(duì)圖10中描繪的印跡染色(左和右圖中的泳道1-3)以檢測(cè)所有肽或者用下面的一種方式處理1μg/ml鼠1F2抗-C35抗體，然后是堿性磷酸酶綴合的山羊抗-小鼠抗體(左圖的泳道4)；1μg/ml連接人恒定區(qū)(MAb11)的1B3抗-C35免疫球蛋白可變區(qū)，然后是堿性磷酸酶綴合的山羊抗-人抗體(左圖的泳道5)；或者抗-6x His標(biāo)記小鼠抗體(Amersham)，然后是堿性磷酸酶綴合的山羊抗-小鼠抗體(右圖的泳道4和5)。加入BCIP/NBT底物并顯色以檢測(cè)二級(jí)試劑。在兩個(gè)圖的側(cè)翼泳道中顯示了分子量標(biāo)記。
在圖10中，所指示的帶A遷移到未消化的rhC35的位置。注意到帶B被1F2但不被MAb11(1B3)抗-C35抗體染色，而帶C不被1F2也不被MAb11(1B3)抗體染色。因?yàn)閹和C都用針對(duì)rhC35的氨基末端的6x His標(biāo)簽的抗-6x His標(biāo)簽抗體染色，所以可以推斷兩個(gè)片段都缺少C-末端肽片段。對(duì)于約15kDa帶B的情況，用MAb11(1B3)染色所需的喪失的表位是11個(gè)氨基酸的C-末端C35肽ITNSRPPCVIL，其代表天然C35序列的殘基105-115。該表位不是用1F2染色所需的。相反，1F2抗體不與約8kDa的帶C反應(yīng)，帶C還缺少天然C35序列的殘基53-104。結(jié)果表明1B3抗體對(duì)C35殘基105-115(ITNSRPPCVIL)內(nèi)的表位是特異的，而1F2抗體對(duì)C35殘基53-104內(nèi)的表位是特異的。
實(shí)施例12
與1B3抗-C35單克隆抗體相關(guān)的人抗體
通過(guò)2002年9月5日公布的US 2002 0123057 A1中公開(kāi)的方法產(chǎn)生兩種抗體，其是人來(lái)源的，只是與小鼠1B3抗-C35單克隆抗體有相同的免疫球蛋白重鏈CDR3區(qū)。
MAb 165包含141D10 VH H732重鏈可變區(qū)(SEQ ID NOS56和57)，和UH8 VK L120κ輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NOS58和59)。如圖11中所示，MAb 165是C35特異的。將141D10重組痘苗病毒與UH8重組痘苗病毒共轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。通過(guò)ELISA測(cè)試所分泌的抗體對(duì)C35或者對(duì)照蛋白質(zhì)A27L(痘苗病毒蛋白)的結(jié)合。
MAb 171包含MSH3 VH H835重鏈可變區(qū)(SEQ ID NOS60和61)和UH8 VK L120κ輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NOS58和59)。
實(shí)施例13
鑒定抗-C35抗體識(shí)別的C35肽表位
用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫方法產(chǎn)生針對(duì)重組C 35的兔多克隆抗體。合成長(zhǎng)為15個(gè)氨基酸的重疊肽，其對(duì)應(yīng)于在從1到101的每個(gè)氨基酸殘基開(kāi)始的115個(gè)氨基酸長(zhǎng)的C35蛋白質(zhì)序列。基于每15個(gè)氨基酸肽中氨基末端殘基的C35位置命名肽。在重疊天然C35序列的30、33和112位的半胱氨酸殘基的每種肽中，用丙氨酸取代半胱氨酸以避免形成二硫鍵交聯(lián)的肽。
用2μg C35蛋白質(zhì)或者來(lái)自C35蛋白質(zhì)序列的14μg或40μg所指示的15個(gè)氨基酸的肽包被96孔Maxisorp微量滴定板的孔并如下面詳細(xì)描述的測(cè)定兔C35免疫血清中抗體的結(jié)合。對(duì)陽(yáng)性和陰性對(duì)照和檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)合的那些C35衍生肽在下面的表11中顯示了數(shù)據(jù)。肽結(jié)合水平的差異可以是由于特定抗體種類的濃度差異、抗體親和性的差異或者它們的組合。
A.肽樣品制備
將100％DMSO中的C35肽15聚體(10mg/ml)在無(wú)菌條件下等分到1.5ml管(40μg/管)，然后真空離心除去DMSO。將肽以1ml/管重懸浮在PBS(pH 7.2)中，混合均勻并離心。每種肽濃度(“肽溶液”)為40μg/ml。肽溶液應(yīng)該保存在-20℃待用。一旦解凍，它將保持在4℃不超過(guò)2周。
B.在Maxisorp板上包被樣品
對(duì)于14μg/ml肽包被的板，每孔加入65μl PBS，pH7.2，然后每孔加入35μl肽溶液(總體積100μl/孔)，并混合均勻。對(duì)于40μg/ml肽包被的板，將100μl肽溶液直接置于板上，100μl/孔。將對(duì)照C35蛋白質(zhì)稀釋入PBS，pH7.2中至2μg/ml并加入到板中，100μl/孔。將包被的板在室溫孵育2小時(shí)，然后4℃過(guò)夜。
C.ELISA條件
每板在板洗滌器上洗滌3次。將板在室溫下用“封閉緩沖液”(PBS，pH7.2和10％FBS)封閉2小時(shí)，然后在板洗滌器上每板洗滌3次。將一級(jí)抗體兔抗-人C35多克隆抗體(由Bethyl生產(chǎn)，批次62902)稀釋到“測(cè)定稀釋劑”(PBS，pH7.2加上0.05％ Tween 20和10％FBS)中并加入板中，100μl/孔。將板在室溫孵育2小時(shí)。對(duì)于14μg/ml肽包被的板，加入100ng/ml一級(jí)抗體。對(duì)于40μg/ml肽包被的板，加入1μg/ml一級(jí)抗體。將板在板洗滌器上洗滌5次。將二級(jí)抗體HRP(來(lái)自Zymed的辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔Fc多克隆抗體)以1∶20,000稀釋到測(cè)定稀釋劑中并加入平板，100μl/孔。平板在室溫孵育2小時(shí)。在板洗滌器上洗滌平板7次。按照試劑盒生產(chǎn)商的說(shuō)明加入底物并在室溫黑暗中孵育15分鐘。通過(guò)加入2N H2SO4，100μl/孔停止反應(yīng)。立即讀取450-570nm的吸收。
表11抗體與C35表位的結(jié)合
在450-570nm的吸收
本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物，如教科書(shū)、雜志文章、GenBank條目和公布的申請(qǐng)，和專利申請(qǐng)都引入本文作為參考，就像將每個(gè)單獨(dú)的出版物或者專利申請(qǐng)?zhí)貏e且個(gè)別地指出引入作為參考一樣。
序列表
<110>Vaccinex，Inc.
<120>通過(guò)靶定暴露在細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞上的內(nèi)部抗原殺死腫瘤細(xì)胞的方法
<130>1843.019PC03
<140>PCT/US2004/040573
<141>2004-12-06
<150>US 60/526,572
<151>2003-12-04
<150>US 60/531,688
<151>2003-12-23
<160>61
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>354
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(7)..(354)
<400>1
gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc 48
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro
1 5 10
gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt96
Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys
15 20 25 30
gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg 144
Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val
35 40 45
aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca 192
Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr
50 55 60
ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg 240
Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu
65 70 75
gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga 288
Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg
80 85 90
aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct 336
Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro
95 100 105 110
ccc tgc gtc atc ctg tga 354
Pro Cys Val Ile Leu
115
<210>2
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Set Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Gly Set Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro
20 25 30
Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Set Ala Val Lys Glu
35 40 45
Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala
50 55 60
Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Set Lys Leu Glu Asn
65 70 75 80
Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala
85 90 95
Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys
100 105 110
Val Ile Leu
115
<210>3
<211>627
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>3
gaatttagcg gccgcgaatt cgcccttcga ctggagcacg ggacactgac atggactgaa 60
ggagtagaaa acatctctct cattagaggt tgatctttga ggaaaacagg gtgttgccta120
aaggatgaaa gtgttgagtc tgttgtacct gttgacagcc attcctggta tcctgtctga180
tgtacagctt caggagtcag gacctggcct cgtgaaacct tctcagtctc tgtctctcac240
ctgctctgtc actggctact ccatcaccag tggttatttc tggaactgga tccggcagtt300
tccagggaac aaactggaat ggatgggcta cataagctac gacggtagca ataactccaa360
cccatctctc aaaaatcgaa tctccttcac tcgtgacaca tctaagaacc agtttttcct420
gaagtttaat tctgtgacta ctgacgactc agctgcatat tactgtacaa gaggaactac480
ggggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc540
cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca agggcgaatt600
cgtttaaacc tgcaggacta gtccctt627
<210>4
<211>116
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>4
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Phe Asn Ser Val Thr Thr Asp Asp Ser Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>5
<211>540
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>5
cgcgaattcg cccttcgact ggagcacgag gacactgaca tggactgaag gagtagaaaa 60
attagctagg gaccaaaatt caaagacaga atggattttc aggtgcagat tttcagcttc120
ctgctaatca gtgcctcagt cagaatgtcc agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca180
gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatat cctgcagtgc cagctcaagt240
gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat300
cacacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc360
tcttactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa420
cagtatcata gttacccacc cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaacgggct480
gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagtg agcaaagggc gaattcgttt540
<210>6
<211>106
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>6
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
His Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>7
<211>618
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>7
cgcgaattcg cccttcgact ggagcacgag gacactggac atggactgaa ggagtagaaa 60
atctctctca ctggaggctg atttttgaag aaaggggttg tagcctaaaa gatgatggtg120
ttaagtcttc tgtacctgtt gacagccctt ccgggtatcc tgtcagaggt gcagcttcag180
gagtcaggac ctagcctcgt gaaaccttct cagactctgt ccctcacctg ttctgtcact240
ggcgactcca tcaccagtgg ttactggaac tggatccgga aattcccagg aaataaactt300
gaatacgtgg ggtacataag ctacagtggt ggcacttact acaatccatc tctcaaaagt360
cgaatctcca tcactcgaga cacatccaag aaccactact acctgcagtt gaattctgtg420
actactgagg acacagccac atattactgt gcaagaggtg cttactacgg gggggccttt480
tttccttact tcgatgtctg gggcgctggg accacggtca ccgtctcctc agccaaaacg540
acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccaagggc600
gaattcgttt aaacctgc 618
<210>8
<211>122
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>8
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Phe Pro Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>9
<211>528
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>9
gaattcgccc ttcccctgga gcacgaggac actgacatgg actgaaggag tagaaaatca 60
gttcctgcca ggacacagtt tagatatgag gttccaggtt caggttctgg ggctccttct120
gctctggata tcaggtgccc actgtgatgt ccagataacc cagtctccat cttttcttgc180
tgcatctcct ggagaaacca ttactattaa ttgcagggca agtaagtaca ttagcaaaca240
tttagtctgg tatcaggaga aacctggaga aactaaaaag cttcttatct actctggatc300
cactttgcaa tctggacttc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggta cagatttcac360
tctcaccatc agtagcctgg agcctgaaga ttttgcaatg tattactgtc aacagcataa420
tgaatacccg ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgatgctgc480
accaactgta tccatcttcc caccatccag tgagcaaagg gcgaattc 528
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>10
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Lys His
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Glu Thr Lys Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100105
<210>11
<211>553
<212>DNA
<213>智人
<400>11
gaattcgccc ttaattgcgg ccgcaaacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg 60
tagcaacagc tacaggcgcg cactccgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg120
tccagcctgg gaggtccctg agactctcct gtgcagcgtc tggattcaac ttcggtacct180
atgccatgca ctgggtccgc caggctcaag gcaaggggct ggagtgggtg gcactcatat240
ggtatgatgg aactaagaaa tactatgcag actccgtgaa gggccgatac accatctcca300
gagacaattc ccagaacacg ctgtatctgc aaatgaacac cctgagagcc gacgacacgg360
ctgtgtatta ctgtgcgaaa tcaaaactcc aggggcgcgt tatagactac tggggccagg420
gaaccctggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac480
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact540
taagggcgaa ttc 553
<210>12
<211>119
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Tyr Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Lys Leu Gln Gly Arg Val Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>13
<211>528
<212>DNA
<213>智人
<400>13
gaattcgccc ttaattgcgg ccgcaaacat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt 60
agcaacagct acaggcgtgc actccgacat ccagatgacc cagtctccag actccctggc120
tgtgtctctg ggcgagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc agccagagtg ttttatacag180
ctccaacaat aagaactact tagcttggta ccagcagaaa ccaggacagc ctcctaagct240
gctcatttac tgggcatcta cccgggaatc cggggtccct gaccgattca gtggcagcgg300
gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag gctgaagatg tggcagttta360
ttactgtcag caatattata gtactcctct gtggacgttc ggccaaggga ccaagctcga420
gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt480
gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaaaagg gcgaattc 528
<210>14
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser
20 25 30
Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Ser Thr Pro Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于將所選抗體表達(dá)為分泌型人IgG1的引物
<400>15
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcc 29
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于將所選抗體表達(dá)為分泌型人IgG1的引物
<400>16
attagtcgac tcatttaccc ggagacaggg a31
<210>17
<211>1084
<212>DNA
<213>智人
<400>17
gcggccgcaa accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg 60
cgcgcatatg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc120
accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta180
cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac240
cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtcg tgaccgtgcc300
ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac360
caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg420
cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga480
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga540
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac600
aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct660
gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc720
agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta780
caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt840
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa900
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa960
gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca 1020
tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgagt 1080
cgac1084
<210>18
<211>413
<212>DNA
<213>智人
<400>18
gcggccgcaa accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg 60
cgtgcacttg actcgagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc120
catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct180
atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc240
aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga300
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg360
gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaggtc gac 413
<210>19
<211>422
<212>DNA
<213>智人
<400>19
gcggccgcaa accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa cagctacagg 60
cgtgcacttg actcgagaag cttaccgtcc tacgaactgt ggctgcacca tctgtcttca120
tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga180
ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg240
gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca300
gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca360
cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttaggtcg420
ac 422
<210>20
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgG2-F引物
<400>20
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcc 29
<210>21
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgI2-R引物
<400>21
attagtcgac tcatttaccc ggagacaggg 31
<210>22
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgG3-F引物
<400>22
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagct29
<210>23
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgG3-R引物
<400>23
attagtcgac tcatttaccc ggagacaggg a 31
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgG4-F引物
<400>24
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagct29
<210>25
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgG4-R引物
<400>25
attagtcgac tcatttaccc agagacaggg a31
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgA1-F引物
<400>26
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcat 30
<210>27
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgA1-R引物
<400>27
attagtcgac tcagtagcag gtgccgtcca c31
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgA2-F引物
<400>28
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcat 30
<210>29
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgA2-R引物
<400>29
attagtcgac tcagtagcag gtgccgtcca c31
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgD-F引物
<400>30
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcac 30
<210>31
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgD-R引物
<400>31
attagtcgac tcatttcatg gggccatggt c31
<210>32
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgE-F引物
<400>32
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcagcc 29
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgE-R
<400>33
attagtcgac tcatttaccg ggatttacag a31
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgM-F
<400>34
attaggatcc ggtcaccgtc tcctcaggg 29
<210>35
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IgM-R
<400>35
attagtcgac tcagtagcag gtgccagctg t31
<210>36
<211>6
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BssHII位點(diǎn)
<400>36
gcgcgc 6
<210>37
<211>7
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BsteII位點(diǎn)
<400>37
ggtcacc7
<210>38
<211>6
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ApaL1位點(diǎn)
<400>38
gtgcac 6
<210>39
<211>6
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Xho1位點(diǎn)
<400>39
ctcgag 6
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1F2VK正向引物
<400>40
tatccgtgca ctcccaaatt gttctcaccc agtctccag39
<210>41
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1F2VK反向引物
<400>41
atattctcga gcttggtccc ccctccgaa 29
<210>42
<211>6
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ApaL1位點(diǎn)
<400>42
gtgcac 6
<210>43
<211>6
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Xho1位點(diǎn)
<400>43
ctcgag 6
<210>44
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1F2VH正向引物
<400>44
tataagcgcg cactccgatg tacagcttca ggagtcagga 41
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1F2VH反向引物
<400>45
atattggtga ccagagtccc ttggcccc28
<210>46
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1B3VK正向引物
<400>46
tatccgtgca ctccgatgtc cagataaccc agtctccatc40
<210>47
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1B3VK反向引物
<400>47
atattctcga gcttggtccc agcaccgaa29
<210>48
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1B3VH正向引物
<400>48
tataagcgcg cactccgagg tgcagcttca ggagtcagga c 41
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>1B3VH反向引物
<400>49
atattggtga ccgtggtccc agcg 24
<210>50
<211>935
<212>DNA
<213>智人
<400>50
tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc 60
ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg120
acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg180
caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga240
cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca300
actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt360
tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg420
gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca480
tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt540
cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc600
ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt660
cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag720
caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc780
cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt840
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct900
gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc 935
<210>51
<211>935
<212>DNA
<213>智人
<400>51
tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc 60
ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg120
acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg180
caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga240
cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca300
actggtacgt ggacggcatg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt360
tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg420
gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca480
tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt540
cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc600
ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt660
cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag720
caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc780
cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt840
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct900
gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc 935
<210>52
<211>1780
<212>DNA
<213>智人
<400>52
ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga 60
gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga120
ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc180
cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc240
ccactaaccg ccaacatcac aaaatccggt gggtccagac cctgctcggg gccctgctca300
gtgctctggt ttgcaaagca tattcctggc ctgcctcctc cctcccaatc ctgggctcca360
gtgctcatgc caagtacaca gggaaactga ggcaggctga ggggccagga cacagcccag420
ggtgcccacc agagcagagg ggctctctca tcccctgccc agccccctga cctggctctc480
taccctccag gaaacacatt ccggcccgag gtccacctgc tgccgccgcc gtcggaggag540
ctggccctga acgagctggt gacgctgacg tgcctggcac gtggcttcag ccccaaggat600
gtgctggttc gctggctgca ggggtcacag gagctgcccc gcgagaagta cctgacttgg660
gcatcccggc aggagcccag ccagggcacc accacctacg ctgtaaccag catactgcgc720
gtggcagctg aggactggaa gaagggggag accttctcct gcatggtggg ccacgaggcc780
ctgccgctgg ccttcacaca gaagaccatc gaccgcatgg cgggtaaacc cacccacatc840
aatgtgtctg ttgtcatggc ggaggcggat ggcacctgct actgagccgc ccgcctgtcc900
ccacccctga ataaactcca tgctccccca agcagcccca cgcttccatc cggcgcctgt960
ctgtccatcc tcagggtctc agcacttggg aaagggccag ggcatggaca gggaagaata 1020
ccccctgccc tgagcctcgg ggggcccctg gcacccccat gagactttcc accctggtgt 1080
gagtgtgagt tgtgagtgtg agagtgtgtg gtgcaggagg cctcgctggt gtgagatctt 1140
aggtctgcca aggcaggcac agcccaggat gggttctgag agacgcacat gccccggaca 1200
gttctgagtg agcagtggca tggccgtttg tccctgagag agccgcctct ggctgtagct 1260
gggagggaat agggagggta aaaggagcag gctagccaag aaaggcgcag gtagtggcag 1320
gagtggcgag ggagtgaggg gctggactcc agggccccac tgggaggaca agctccagga 1380
gggccccacc accctagtgg gtgggcctca ggacgtccca ctgacgcatg caggaagggg 1440
cacctcccct taaccacact gctctgtacg gggcacgtgg gcacacatgc acactcacac 1500
tcacatatac gcctgagccc tgcaggagtg gaacgttcac agcccagacc cagttccaga 1560
aaagccaggg gagtcccctc ccaagccccc aagctcagcc tgctccccca ggcccctctg 1620
gcttccctgt gtttccactg tgcacagctc agggaccaac tccacagacc cctcccaggc 1680
agcccctgct ccctgcctgg ccaagtctcc catcccttcc taagcccaac taggacccaa 1740
agcatagaca gggaggggcc gcgtggggtg gcatcagaag 1780
<210>53
<211>220
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu
1 5 10 15
Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly
35 40 45
Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn
50 55 60
His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr
65 70 75 80
Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu
85 90 95
Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu
100 105 110
Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu
130 135 140
Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu
165 170 175
Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr
180 185 190
Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val
195 200 205
Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr
210 215 220
<210>54
<211>1059
<212>DNA
<213>智人
<400>54
gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg 60
aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc120
tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc180
ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc240
aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc300
tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc360
tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt420
tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc480
acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgaccg tgacctctgt540
ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgtcg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag600
accttcactt gcactgctgc ctaccccgag tccaagaccc cgctaaccgc caccctctca660
aaatccggaa acacattccg gcccgaggtc cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg720
gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgtg gcttcagccc caaggatgtg780
ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca840
tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg900
gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg960
ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat 1020
gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctac 1059
<210>55
<211>353
<212>PRT
<213>智人
<400>55
Ala Ser Leu Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Asp
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Ser Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu ASn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
<210>56
<211>366
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合小鼠/人141D10 VH H732
<400>56
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc ctccggagac cctgtccctc 60
acctgcaatg tctctggtgg ctctatcggt agatactatt ggaactggat ccgacagtcc120
ccagggaagg ggctggagtg gattggccat atccattaca gtgggagcac catctaccat180
ccctccctca agagtcgagt cagcatatcg ctggacacgt ccaagaacca ggtctccctg 240
aagttgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcacg aggtgcttac 300
tacggggggg ccttttttcc ttacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>57
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>嵌合小鼠/人141D10 VH H732
<400>57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Ile Tyr His Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Phe Pro Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>58
<211>321
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合小鼠/人UH8 VK L120
<400>58
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctatgggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca gggcattagg aatcatttag cctggtatca gcagaaacca120
gggaaagctc ctaatctcct gatctctgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccaact180
cgattcagtg gcagtggatc tggaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct240
gaagactctg caacttatta ctgccaacag tataatcggt accccctcac tttcggccaa300
gggaccaagc tcgagatcaa a 321
<210>59
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>嵌合小鼠/人UH8 VK L120
<400>59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Met Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>60
<211>369
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合小鼠/人MSH3 VH(H835)
<400>60
caggtgcagc tgcaggagtc gggaggaggc ttagttcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcttgtgcag gctctggatt caccttcagt agttactgga tgcactgggt ccgccaagct120
ccagggaagg ggctggtgtg ggtctcacgt attgacactg atgggagtac cacaacctac180
gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacactgtat240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtgt attactgtgc acgaggtgct300
tactacgggg gggccttttt tccttacttc gatgtctggg gccaagggac cacggtcacc360
gtctcctca369
<210>61
<211>123
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>嵌合小鼠/人MSH3 VH(H835)
<400>61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asp Thr Asp Gly Ser Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Phe Pro Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
PCT/RO/134表
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
權(quán)利要求
1.對(duì)C35特異的分離的抗體，其選自
a)包含克隆1B3G編碼的VH區(qū)的抗體，
b)包含克隆1B3K編碼的VL區(qū)的抗體，
c)包含克隆1F2G編碼的VH區(qū)的抗體，
d)包含克隆1F2K編碼的VL區(qū)的抗體，
e)包含克隆H0009編碼的VH區(qū)的抗體，
f)包含克隆L0010編碼的VL區(qū)的抗體，
g)包含(a)的VH區(qū)和(b)的VL區(qū)的抗體，
h)包含(c)的VH區(qū)和(d)的VL區(qū)的抗體，
i)包含(e)的VH區(qū)和(f)的VL區(qū)的抗體，
j)包含SEQ ID NO56編碼的VH區(qū)的抗體，
k)包含SEQ ID NO60編碼的VH區(qū)的抗體，
l)包含SEQ ID NO58編碼的VL區(qū)的抗體，
m)包含(j)的VH區(qū)和(1)的VL區(qū)的抗體，
n)包含(k)的VH區(qū)和(1)的VL區(qū)的抗體，
o)包含SEQ ID NO56編碼的VH區(qū)的CDR1或CDR2的至少一個(gè)的抗體，
p)包含SEQ ID NO60編碼的VH區(qū)的CDR1或CDR2的至少一個(gè)的抗體，
q)包含SEQ ID NO58編碼的VL區(qū)的CDR1、CDR2或CDR3的至少一個(gè)的抗體，
r)包含(a)或(c)的VH區(qū)的嵌合抗體，
s)包含(b)或(d)的VL區(qū)的嵌合抗體，
t)包含(a)的VH區(qū)和(b)的VL區(qū)的嵌合抗體，
u)包含(c)的VH區(qū)和(d)的VL區(qū)的嵌合抗體，
v)(r)、(s)、(t)或(u)的嵌合抗體，其是人嵌合抗體，
w)包含(g)或(h)的抗體的1、2、3、4、5或6個(gè)CDR的人源化抗體，
x)包含(i)的抗體的1、2、3、4、5或6個(gè)CDR的抗體，
y)結(jié)合(a)到(x)任一個(gè)的抗體所結(jié)合的表位的抗體。
2.權(quán)利要求1的分離的抗體，其中所述分離的抗體是包含SEQ IDNO56編碼的VH區(qū)的抗體。
3.權(quán)利要求2的分離的抗體，其還包含SEQ ID NO58的VL區(qū)。
4.權(quán)利要求1的分離的抗體，其中所述分離的抗體是包含SEQ IDNO60編碼的VH區(qū)的抗體。
5.權(quán)利要求4的分離的抗體，其還包含SEQ ID NO58的VL區(qū)。
6.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的任一種抗體。
7.載體，其包含權(quán)利要求6的多核苷酸。
8.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7的載體。
9.組合物，其包含權(quán)利要求1的任一種抗體，和可藥用載體。
10.殺死癌細(xì)胞的方法，其包括
(a)對(duì)癌細(xì)胞使用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的療法，和
(b)對(duì)所述細(xì)胞施用對(duì)細(xì)胞內(nèi)的癌相關(guān)蛋白質(zhì)特異的抗體，條件是所述蛋白質(zhì)不是C35，其中所述蛋白質(zhì)在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的細(xì)胞表面上暴露，其中所述抗體綴合到毒素或者與毒素復(fù)合，并且其中所述抗體在(a)之前或者之后的時(shí)間施用，使得當(dāng)在所述癌細(xì)胞中已經(jīng)誘導(dǎo)或者正在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，所述抗體結(jié)合所述癌細(xì)胞，從而殺死經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的癌細(xì)胞和/或周圍的癌細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其包括在(a)之前，確定所述蛋白質(zhì)是否是在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的細(xì)胞表面上暴露的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體選自完整抗體、抗體片段和結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，并且其中(b)在(a)之后0-6小時(shí)、或6-12小時(shí)、或6-24小時(shí)、或6-36小時(shí)、或6-48小時(shí)、或6-72小時(shí)、或6-96小時(shí)、或6-120小時(shí)、或12-24小時(shí)、或12-36小時(shí)、或12-48小時(shí)、或12-72小時(shí)、或12-96小時(shí)、或12-120小時(shí)、或24-36小時(shí)、或24-48小時(shí)、或24-72小時(shí)、或24-96小時(shí)、或24-120小時(shí)、或36-48小時(shí)、或36-72小時(shí)、或36-96小時(shí)、或36-120小時(shí)或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120小時(shí)發(fā)生。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是完整抗體，并且其中(b)在(a)之前0-6小時(shí)、0-12、0-24、6-12、6-24、12-24、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小時(shí)、或1小時(shí)發(fā)生或者與(a)同時(shí)發(fā)生。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)的癌相關(guān)抗原是異戊二烯化的蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求10的方法，其在體外進(jìn)行。
16.權(quán)利要求10的方法，其在體內(nèi)進(jìn)行。
17.權(quán)利要求10的方法，其在需要癌癥治療的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
19.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的癌相關(guān)蛋白質(zhì)特異，所述蛋白質(zhì)選自CENP-F動(dòng)粒蛋白、CAAX盒蛋白1、DnaJ同系物亞家族A成員1、DnaJ同系物亞家族A成員2、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亞基、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-10亞基、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-12亞基、核纖層蛋白B1、核纖層蛋白B2、核纖層蛋白A/C、蛋白質(zhì)磷酸酶1調(diào)節(jié)抑制劑亞基16A、過(guò)氧化物酶體法尼基化蛋白質(zhì)、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-11B、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-22A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-7、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-8、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物2、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物3、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ap-1b、轉(zhuǎn)化蛋白p21/H-Ras-1、轉(zhuǎn)化蛋白p21A、轉(zhuǎn)化蛋白N-Ras、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-10、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-13、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-1A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-1B、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-25、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-27A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-30、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-31、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-32、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-35、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-36、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-38、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-3A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-3D、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-4A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-5C、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-6A、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoA、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoB、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoC、Rho-相關(guān)的GTP-結(jié)合蛋白R(shí)hoD、Rho-相關(guān)的GTP-結(jié)合蛋白R(shí)hoG、Rho-相關(guān)的GTP-結(jié)合蛋白R(shí)hoH、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)-Ras2、和Ras-相關(guān)蛋白R(shí)-Ras。
20.權(quán)利要求10的方法，其排除對(duì)細(xì)胞內(nèi)的癌相關(guān)蛋白質(zhì)特異的抗體，所述蛋白質(zhì)選自CENP-F動(dòng)粒蛋白、CAAX盒蛋白質(zhì)1、DnaJ同系物亞家族A成員1、DnaJ同系物亞家族A成員2、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-5亞基、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-10亞基、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(I)/G(S)/G(O)γ-12亞基、核纖層蛋白B1、核纖層蛋白B2、核纖層蛋白A/C、蛋白質(zhì)磷酸酶1調(diào)節(jié)抑制劑亞基16A、過(guò)氧化物酶體法尼基化蛋白質(zhì)、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-11B、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-22A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-7、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-8、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物2、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物3、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ap-1b、轉(zhuǎn)化蛋白p21/H-Ras-1、轉(zhuǎn)化蛋白p21A、轉(zhuǎn)化蛋白N-Ras、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-10、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-13、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-1A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-1B、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-25、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-27A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-30、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-31、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-32、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-35、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-36、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-38、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-3A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-3D、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-4A、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-5C、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)ab-6A、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoA、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoB、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoC、Rho-相關(guān)的GTP-結(jié)合蛋白R(shí)hoD、Rho-相關(guān)的GTP-結(jié)合蛋白R(shí)hoG、Rho-相關(guān)的GTP-結(jié)合蛋白R(shí)hoH、Ras-相關(guān)蛋白R(shí)-Ras2、和Ras-相關(guān)蛋白R(shí)-Ras。
21.權(quán)利要求10的方法，其中所述毒素是放射性同位素、放射性核素、細(xì)胞毒素或者細(xì)胞毒性前體藥物。
22.權(quán)利要求17的方法，其在需要清除較小腫瘤和/或微轉(zhuǎn)移瘤的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
24.殺死癌細(xì)胞的方法，其包括
(a)對(duì)癌細(xì)胞使用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的療法，和
(b)對(duì)所述細(xì)胞施用抗體，其中所述抗體對(duì)C35特異，并且其中所述抗體在(a)之前或者之后的時(shí)間施用，使得當(dāng)在所述癌細(xì)胞中已經(jīng)誘導(dǎo)或者正在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，所述抗體結(jié)合所述癌細(xì)胞，從而殺死經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的癌細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體綴合到毒素或者與毒素復(fù)合。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述對(duì)C35特異的抗體是選自下面的抗體
a)包含克隆1B3G編碼的VH區(qū)的抗體，
b)包含克隆1B3K編碼的VL區(qū)的抗體，
c)包含克隆1F2G編碼的VH區(qū)的抗體，
d)包含克隆1F2K編碼的VL區(qū)的抗體，
e)包含克隆H0009編碼的VH區(qū)的抗體，
f)包含克隆L0010編碼的VL區(qū)的抗體，
g)包含(a)的VH區(qū)和(b)的VL區(qū)的抗體，
h)包含(c)的VH區(qū)和(d)的VL區(qū)的抗體，
i)包含(e)的VH區(qū)和(f)的VL區(qū)的抗體，
j)包含SEQ ID NO56編碼的VH區(qū)的抗體，
k)包含SEQ ID NO60編碼的VH區(qū)的抗體，
l)包含SEQ ID NO58編碼的VL區(qū)的抗體，
m)包含(j)的VH區(qū)和(l)的VL區(qū)的抗體，
n)包含(k)的VH區(qū)和(l)的VL區(qū)的抗體，
o)包含SEQ ID NO56編碼的VH區(qū)的CDR1或CDR2的至少一個(gè)的抗體，
p)包含SEQ ID NO60編碼的VH區(qū)的CDR1或CDR2的至少一個(gè)的抗體，
q)包含SEQ ID NO58編碼的VL區(qū)的CDR1、CDR2或CDR3的至少一個(gè)的抗體，
r)包含(a)或(c)的VH區(qū)的嵌合抗體，
s)包含(b)或(d)的VL區(qū)的嵌合抗體，
t)包含(a)的VH區(qū)和(b)的VL區(qū)的嵌合抗體，
u)包含(c)的VH區(qū)和(d)的VL區(qū)的嵌合抗體，
v)(r)、(s)、(t)或(u)的嵌合抗體，其是人嵌合抗體，
w)包含(g)或(h)的抗體的1、2、3、4、5或6個(gè)CDR的人源化抗體，
x)包含(i)的抗體的1、2、3、4、5或6個(gè)CDR的抗體，
y)結(jié)合(a)到(x)任一個(gè)的抗體所結(jié)合的表位的抗體。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述抗體包含SEQ ID NO56或SEQID NO60編碼的VH區(qū)。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體選自完整抗體、抗體片段和結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，并且其中(b)在(a)之后0-6小時(shí)、或6-12小時(shí)、或6-24小時(shí)、或6-36小時(shí)、或6-48小時(shí)、或6-72小時(shí)、或6-96小時(shí)、或6-120小時(shí)、或12-24小時(shí)、或12-36小時(shí)、或12-48小時(shí)、或12-72小時(shí)、或12-96小時(shí)、或12-120小時(shí)、或24-36小時(shí)、或24-48小時(shí)、或24-72小時(shí)、或24-96小時(shí)、或24-120小時(shí)、或36-48小時(shí)、或36-72小時(shí)、或36-96小時(shí)、或36-120小時(shí)或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120小時(shí)發(fā)生。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體是完整抗體，并且其中(b)在(a)之前0-6小時(shí)、0-12、0-24、6-12、6-24、12-24、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2小時(shí)、或1小時(shí)發(fā)生或者與(a)同時(shí)發(fā)生。
30.權(quán)利要求24的方法，其在體外進(jìn)行。
31.權(quán)利要求24的方法，其在體內(nèi)進(jìn)行。
32.權(quán)利要求24的方法，其在需要癌癥治療的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行。
33.權(quán)利要求32的方法，其在需要C35相關(guān)癌癥的癌癥治療的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
35.權(quán)利要求25的方法，其中毒素是放射性同位素、放射性核素、細(xì)胞毒素或者細(xì)胞毒性前體藥物。
36.權(quán)利要求32的方法，其在需要清除較小腫瘤和/或微轉(zhuǎn)移瘤的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
38.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗體是選自IgG3、IgM、IgA、IgD、和IgE的免疫球蛋白同種型。
39.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體是結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述結(jié)構(gòu)域缺失的抗體是CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
41.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體是選自Fab、F(ab′)2、scFV、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體的抗體片段。
42.殺死癌細(xì)胞的方法，其包括對(duì)所述細(xì)胞施用抗體，其中所述抗體對(duì)C-35特異，并且其中所述抗體綴合到毒素或者與毒素復(fù)合。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述毒素是放射性同位素、放射性核素、細(xì)胞毒素或者細(xì)胞毒性前體藥物。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體選自
a)包含克隆1B3G編碼的VH區(qū)的抗體，
b)包含克隆1B3K編碼的VL區(qū)的抗體，
c)包含克隆1F2G編碼的VH區(qū)的抗體，
d)包含克隆1F2K編碼的VL區(qū)的抗體，
e)包含克隆H0009編碼的VH區(qū)的抗體，
f)包含克隆L0010編碼的VL區(qū)的抗體，
g)包含(a)的VH區(qū)和(b)的VL區(qū)的抗體，
h)包含(c)的VH區(qū)和(d)的VL區(qū)的抗體，
i)包含(e)的VH區(qū)和(f)的VL區(qū)的抗體，
j)包含SEQ ID NO56編碼的VH區(qū)的抗體，
k)包含SEQ ID NO60編碼的VH區(qū)的抗體，
l)包含SEQ ID NO58編碼的VL區(qū)的抗體，
m)包含(j)的VH區(qū)和(l)的VL區(qū)的抗體，
n)包含(k)的VH區(qū)和(l)的VL區(qū)的抗體，
o)包含SEQ ID NO56編碼的VH區(qū)的CDR1或CDR2的至少一個(gè)的抗體，
p)包含SEQ ID NO60編碼的VH區(qū)的CDR1或CDR2的至少一個(gè)的抗體，
q)包含SEQ ID NO58編碼的VL區(qū)的CDR1、CDR2或CDR3的至少一個(gè)的抗體，
r)包含(a)或(c)的VH區(qū)的嵌合抗體，
s)包含(b)或(d)的VL區(qū)的嵌合抗體，
t)包含(a)的VH區(qū)和(b)的VL區(qū)的嵌合抗體，
u)包含(c)的VH區(qū)和(d)的VL區(qū)的嵌合抗體，
v)(r)、(s)、(t)或(u)的嵌合抗體，其是人嵌合抗體，
w)包含(g)或(h)的抗體的1、2、3、4、5或6個(gè)CDR的人源化抗體，
x)包含(i)的抗體的1、2、3、4、5或6個(gè)CDR的抗體，
y)結(jié)合(a)到(x)任一個(gè)的抗體所結(jié)合的表位的抗體。
45.權(quán)利要求42的方法，其在需要C35相關(guān)癌癥的癌癥治療的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體是選自IgG3、IgM、IgA、IgD、和IgE的免疫球蛋白同種型。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體是結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述結(jié)構(gòu)域缺失的抗體是CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
50.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體是選自Fab、F(ab′)2、scFV、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體的抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了殺死癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)方法，包括人體中的治療方法，還提供了對(duì)癌特異抗原C35特異的抗體，和編碼此類抗體的多核苷酸，以及使用此類抗體的治療和診斷方法。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1913921SQ20048004138
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者E·E·艾萬(wàn)斯, M·J·帕里斯, D·M·薩哈斯拉布赫, E·S·史密斯, M·扎奧德?tīng)?申請(qǐng)人:瓦西尼斯公司