專利名稱：利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑vegi－192a治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑VEGI-192A治療癌癥的方法。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑(VEGI)為內(nèi)皮細(xì)胞特異的基因產(chǎn)物。已報(bào)道了人VEGI的四種異構(gòu)型發(fā)現(xiàn)的VEGI的第一種形式為174個(gè)氨基酸長(zhǎng)度；隨后發(fā)現(xiàn)了192個(gè)氨基酸殘基的兩種不同形式和251個(gè)氨基酸殘基的一種形式。參見Zhai等，Int.J.Cancer 82131-136(1999)；Zhai等，F(xiàn)ASEB J.13181-189(1999)；Chew等，F(xiàn)ASEB J16742-744(2002)；PCT WO03/039491；U.S.Pat.Appl.Pub.No.2003/0170242。所有異構(gòu)型為產(chǎn)生自共同基因的剪接變體。四種異構(gòu)型在其N末端區(qū)域不同但擁有編碼蛋白質(zhì)其余部分的151個(gè)氨基酸的相同的核心部分。
四種異構(gòu)型序列的比較表明它們擁有與腫瘤壞死因子(TNF)蛋白質(zhì)超家族20-30％的同一性。不同異構(gòu)型的作用還不明確，但根據(jù)已報(bào)道分子的膜結(jié)合和分泌形式，其作用無疑是精細(xì)和復(fù)雜的。至今報(bào)道的所有證據(jù)似乎表明VEGI-174的分泌型抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并且促使凋亡。VEGI-174疏水性特點(diǎn)暗示其為具有氨基酸29-174組成胞外域的典型II型跨膜蛋白質(zhì)。全長(zhǎng)VEGI-174當(dāng)在癌細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無任何作用，當(dāng)轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)也不抑制這些細(xì)胞。參見Zhai等，F(xiàn)ASEB J13181-189(1999)；Chew等，F(xiàn)ASEB J.16742-744(2002)。TNF家族的一些成員(包括TNF和Fas配體)已證實(shí)從膜裂解并且作為可溶性蛋白質(zhì)起作用。參見Bjornberg等，Scand J.Immunol.42418-424(1995)；Kayagaki等，J Exp.Med.1821777-83(1995)。此對(duì)于VEGI-174還未證實(shí)。然而，僅包括VEGI-174胞外域和源自分泌性蛋白質(zhì)信號(hào)肽的此VEGI-174(s-VEGI)的人工重組分泌型在癌細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)抑制腫瘤生長(zhǎng)。參見Zhai等，Int.J.Cancer 82131-136(1999)；U.S.Pat.Appl.Pub.No.2002/0111325。豐度最高的異構(gòu)型VEGI-251具有推定的分泌信號(hào)肽。VEGI-251的過表達(dá)引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制。PCT WO03/039491；U.S.Pat.Appl.Pub.No.2003/0170242。同樣，已證實(shí)包含所有VEGI型都擁有的151個(gè)氨基酸核心序列的重組VEGI促使凋亡并且阻斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，雖然只有低的效力。參見Wang等，Acta Biochimica et Biophysica Sinica32(5)485-489(2000)。已報(bào)道重組產(chǎn)生的和重折疊的VEGI-192A在體外抑制成年牛主動(dòng)脈內(nèi)皮(ABAE)細(xì)胞的增殖。PCT WO03/039491；U.S.Pat.Appl.Pub.No.2003/0170242。重折疊蛋白質(zhì)的方法已在美國(guó)專利No.6,583,268中報(bào)道。
此處引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物在此整體引入作為參考。需要指出的是對(duì)背景部分中出版物的參考并不是承認(rèn)該出版物構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于重組產(chǎn)生的VEGI-192A蛋白質(zhì)對(duì)治療癌癥(如肺和乳腺)有效的發(fā)現(xiàn)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明為包括向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A多肽以治療個(gè)體中癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥為肺或乳腺癌。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明為包括向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A多肽以抑制個(gè)體中腫瘤生長(zhǎng)的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥為肺或乳腺癌。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明為包括向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A多肽以延緩個(gè)體中癌癥發(fā)展的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥為肺或乳腺癌。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明為包括向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A多肽以延緩個(gè)體中轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥為肺或乳腺癌。
在另一個(gè)方面，所治療的癌癥為晚期癌癥。在一些實(shí)施方案中，晚期癌癥為肺或乳腺癌。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明為包含VEGI-192A多肽(在一些實(shí)施方案中為有效量的VEGI-192A多肽)和可藥用賦形劑的藥物組合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于本文所述任何方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含容器、含有與可藥用載體結(jié)合的VEGI-192A多肽的組合物和使用本文所述任一方法中的組合物的說明書。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，VEGI-192A多肽為人VEGI-192A。在一些實(shí)施方案中，VEGI-192A多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體為人。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了重折疊的VEGI-192A(帶有His標(biāo)簽)的純化和內(nèi)皮細(xì)胞(ABAE)的生長(zhǎng)抑制測(cè)定法。圖1A顯示了聚丙烯酰胺葡聚糖S-300柱層析。柱用pH8.0的20mM Tris、0.2M NaCl和0.4M尿素平衡并且運(yùn)行。在峰的頂端，1、2和3表示三種級(jí)分的集合。
圖1B顯示了圖1A中顯示的層析級(jí)分，集合1、2和3的非還原SDS-PAGE分析。圖1C顯示了集合3的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定，指出50％的抑制濃度(IC50)為12ng/ml(0.5nM)。
圖2顯示了VEGI-192A(帶有His標(biāo)簽)的親和純化。圖2A顯示了重折疊的VEGI-192A的親和柱純化。箭頭指示VEGI-192A峰。圖2B顯示了來自圖2A的富集并透析的樣品的SDS-PAGE。1非還原的；2還原的。
圖3A顯示了通過腹膜內(nèi)(IP)或瘤內(nèi)(IT)注射如實(shí)施例中所述制備的VEGI-192A(帶有His標(biāo)簽)的Lewis肺腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖3B顯示了VEGI-192A注射后負(fù)瘤小鼠提高的存活時(shí)間。
圖4顯示了在帶有通過MDA-MB-231癌細(xì)胞形成的人乳腺癌異種移植腫瘤的小鼠中用如實(shí)施例中所述制備的VEGI-192A(帶有His標(biāo)簽)瘤內(nèi)注射后增加的凋亡內(nèi)皮細(xì)胞和降低的微血管密度。A欄對(duì)凋亡細(xì)胞熒光標(biāo)記的未治療腫瘤；B欄對(duì)CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)免疫染色的未治療腫瘤；C欄對(duì)凋亡細(xì)胞熒光標(biāo)記的VEGI-192A治療的腫瘤；D欄對(duì)CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)免疫染色的VEGI-192A治療的腫瘤。
圖5顯示通過VEGI-192A抑制Lewis肺癌(LLC)的內(nèi)攝入。LLC細(xì)胞接種于C57B1小鼠的背部。VEGI-192A(5mg/Kg)在LLC細(xì)胞接種的同一天(第0天)經(jīng)腹膜內(nèi)注射(IP)。在第4天測(cè)定賦形劑和VEGI-192A治療(在圖中稱作“VEGI”組)的腫瘤體積。
圖6顯示了VEGI-192A治療后LLC接種的小鼠的脾臟體重。LLC接種的小鼠在第4天(當(dāng)腫瘤變得可觸摸的時(shí))、第7天、第8天、第9天和第10天用VEGI-192A(5mg/Kg)治療。在第11天取回脾臟并且稱重。
圖7A顯示了VEGI-192A治療后細(xì)胞因子的血清分布。細(xì)胞因子的血清濃度以pg/ml表示。在第11天收集血清。利用抗體綴合的發(fā)光測(cè)定試劑盒(LINCOplex)測(cè)定細(xì)胞因子水平。圖7B顯示了以VEGI-192A治療動(dòng)物與賦形劑治療動(dòng)物相比血清細(xì)胞因子水平倍數(shù)變化表示的圖7A數(shù)據(jù)?！皩?shí)驗(yàn)組”指VEGI-192A治療組?！皩?duì)照組”指賦形劑治療組?！?”表示統(tǒng)計(jì)差異(t檢驗(yàn)，α＝0.05)。
圖8顯示了小鼠血清中細(xì)胞因子分布(圖7B中所示的數(shù)據(jù))與增殖和匯合(G0-同步化的)HUVEC的細(xì)胞因子表達(dá)分布的比較。增殖或匯合的HUVEC細(xì)胞用500ng/ml的VEGI-192A處理。HUVEC的細(xì)胞因子表達(dá)分布利用cDNA微陣列(來自Fred Hutchinson Cancer Research Center)測(cè)定。
圖9顯示了新植入的LLC腫瘤的生長(zhǎng)抑制。LLC細(xì)胞(1×106/每次注射/每只動(dòng)物)在第0天接種于C57BL黑色小鼠的肋部。在第5、9和12天通過腹膜內(nèi)(IP)注射施用重組VEGI-192A(20mg/kg)。緊鄰VEGI-192A治療前測(cè)量腫瘤的體積。“無Rx”指賦形劑治療組。“Rx VEGIIP”指VEGI-192A治療組。t檢驗(yàn)p＜0.05(治療組n＝9，未治療組n＝9)。
圖10顯示了LLC腫瘤形成的抑制。LLC細(xì)胞(1×106/每次注射/每只動(dòng)物)在第0天接種于C57BL黑色小鼠的肋部。緊接癌細(xì)胞接種之后用重組VEGI-192A(20mg/kg)(圖中稱作“VEGI組”)治療動(dòng)物。重復(fù)治療每日直至第4天并且在第5天測(cè)定腫瘤體積。星號(hào)t檢驗(yàn)，p＜0.002(未治療的n＝5；治療的n＝6)。
圖11顯示了在LLC腫瘤中通過VEGI-192A的內(nèi)皮細(xì)胞特異性消除。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(3周)從VEGI-192A治療的動(dòng)物和賦形劑治療的對(duì)照取回腫瘤并且如實(shí)施例7中所述而處理。腫瘤切片經(jīng)受熒光免疫染色。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分別由特定的標(biāo)志物CD31(紅色)和SMA(綠色)鑒別。A欄來自VEGI治療組的典型腫瘤切片的圖像；放大倍數(shù)200x。B欄來自賦形劑治療組的典型腫瘤切片的圖像；放大倍數(shù)200x。C欄腫瘤圖像紅色和綠色面積的定量分析。白色條CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞。黑色條SMA陽性平滑肌細(xì)胞。星號(hào)t檢驗(yàn)，CD31染色的賦形劑和VEGI治療組之間p＜0.01(每組5只動(dòng)物；15個(gè)區(qū)域/分析的切片)。
圖12顯示了殘留血管結(jié)構(gòu)的存在。來自VEGI-192A或賦形劑治療動(dòng)物的LLC腫瘤切片經(jīng)免疫染色以鑒別內(nèi)皮細(xì)胞(CD31)、平滑肌細(xì)胞(SMA)和血管基底膜(膠原IV)。A欄顯示CD31陽性血管(褐色)的典型賦形劑治療的腫瘤切片圖像，放大倍數(shù)1000x。B欄顯示具有紅血細(xì)胞但沒有CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞的腔樣空隙的典型VEGI-192A治療的腫瘤切片圖像；放大倍數(shù)1000x。C欄和C′(插圖)用CD31(綠色)和膠原IV(紅色)雙染色的典型VEGI-192A治療的腫瘤切片的圖像；注意在C′中證實(shí)的在由膠原IV劃線的腔樣空隙中CD31+內(nèi)皮細(xì)胞的缺乏。D欄和D′(插圖)用SMA(綠色)和膠原IV(紅色)染色的VEGI治療腫瘤的典型切片的圖像；注意在腔樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)邊界中平滑肌細(xì)胞的存在。E欄和E′(插圖)用CD31(綠色)和膠原IV(紅色)染色的典型賦形劑治療的腫瘤切片的圖像；注意血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞的存在(CD31+)。F欄和F′(插圖)用SMA(綠色)和膠原IV(紅色)染色的典型賦形劑治療的腫瘤切片的圖像；注意血管壁中平滑肌細(xì)胞的存在。藍(lán)色染色細(xì)胞核。C、D、E和F的放大倍數(shù)200x。C′、D′、E′和F′的放大倍數(shù)1000x。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)施用治療有效量的VEGI-192A蛋白質(zhì)可用于治療包括晚期的癌癥，例如肺和乳腺癌的癌癥。
I.常規(guī)技術(shù)除非另有陳述，本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其均在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中充分說明，如Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版(Sambrook等，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Introductionto Cell and Tissue Culture(J.P. Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell編，1993-8)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos編，1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等編，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis等編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.編，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodiesa practical approach(P.Shepherd和C.Dean編，Oxford University Press，2000)；Using antibodiesa laboratorymanual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra編，Harwood AcademicPublishers，1995)；和CancerPrinciples and Practice of Oncology(V.T.DeVita等編，J.B.Lippincott Company，1993)。
II.定義藥物或藥物組合物的“有效量”為足以產(chǎn)生有益或所需結(jié)果的量，所述結(jié)果包括臨床結(jié)果，如縮小腫瘤的大小(癌癥情形中，例如乳房或肺癌)、癌細(xì)胞生長(zhǎng)的阻滯、減輕由疾病引起的一種或多種癥狀、提高患有該疾病的患者的生活質(zhì)量、降低治療該疾病其他所需藥物的劑量、例如通過尋靶增強(qiáng)另一種藥物的作用、延緩疾病的發(fā)展和/或延長(zhǎng)個(gè)體的存活。有效量可以一次或多次給藥而達(dá)到。對(duì)于本發(fā)明，藥物、化合物或藥物組合物的有效量為足以直接或間接地降低(或破壞)癌細(xì)胞的增殖和減緩和/或延緩癌細(xì)胞的發(fā)展或生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的量。如在癌癥臨床語義中所理解的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以或不必與另一種藥物、化合物或藥物組合物聯(lián)合而實(shí)現(xiàn)。因此，“有效量”可在施用一種或多種治療劑的情形中考慮，并且如果與一種或多種其它治療劑聯(lián)合可以或?qū)崿F(xiàn)了所需結(jié)果，那么單個(gè)治療劑可以被認(rèn)為是以有效量施用。
如此處所用的，″聯(lián)合″指除另一種治療形式外一種治療形式的給藥，例如VEGI-192A和其他抗癌藥物的給藥。因而，“聯(lián)合”指對(duì)個(gè)體的另一種治療形式的給藥之前、期間或之后一種治療形式的給藥。
如此處所用的，“治療法”或“治療”為獲得有益或所需效果(包括并優(yōu)選臨床效果)的方法。對(duì)于本發(fā)明的而言，有益或所需的臨床效果包括(但不限于)下列的一種或多種減緩(或破壞)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、延遲癌癥中所發(fā)現(xiàn)的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤的大小、減緩由疾病引起的癥狀、提高患有該疾病的那些的生活質(zhì)量、降低治療該疾病其他所需藥物的劑量、延緩疾病的發(fā)展和/或延長(zhǎng)個(gè)體的存活。
如此處所用的，“延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)展”指推遲、阻礙、減緩、妨礙、穩(wěn)定和/或延緩轉(zhuǎn)移的發(fā)展。該延遲可以是不同的持續(xù)時(shí)間，這取決于癌癥的病史和/或所治療的個(gè)體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，充分的或顯著的延遲可在效果上包括預(yù)防，在這點(diǎn)上個(gè)體并不發(fā)生轉(zhuǎn)移。
“個(gè)體”為脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于家畜、運(yùn)動(dòng)型動(dòng)物、寵物(如貓、狗、馬)、靈長(zhǎng)類、小鼠和大鼠。
如此處所用的，“制劑”指生物、藥物或化合物制劑。非限制性的實(shí)例包括單一或復(fù)合的有機(jī)或無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物或抗體片段?？珊铣衫缧》肿雍偷途畚?例如寡肽和寡核苷酸)的多種化合物，并且合成的有機(jī)化合物基于不同的核心結(jié)構(gòu)。此外，多種天然源可提供用于篩選的化合物，如植物或動(dòng)物提取物等。
如此處所用的，“治療劑”指包括抗腫瘤藥物、毒素或細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒素制劑和放射性制劑的可用于療法(這里通常在癌癥范圍中)的任何制劑。
III.利用VEGI-192A用于治療目的的方法本發(fā)明提供通過將有效量的VEGI-192A施用于個(gè)體的治療個(gè)體中癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥為肺或乳腺癌。
本發(fā)明還提供通過向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A多肽來抑制個(gè)體中腫瘤(如肺或乳腺癌)生長(zhǎng)的方法。
本發(fā)明還提供通過向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A來延遲個(gè)體中癌癥(如肺或乳腺癌)發(fā)展的方法。
本發(fā)明還提供通過向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A來延遲患有癌癥(如肺或乳腺癌)的個(gè)體中轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法。
本發(fā)明還提供通過向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A來抑制患有癌癥(如肺或乳腺癌)的個(gè)體中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的方法。本發(fā)明還提供通過向個(gè)體施用有效量的VEGI-192A來抑制患有癌癥(如肺或乳腺癌)的個(gè)體中血管生成的方法。
所治療的癌癥可以是晚期的。在一些實(shí)施方案中，晚期的癌癥為肺或乳腺癌。
VEGI-192A的多種制劑可用于施用。在一些實(shí)施方案中，VEGI-192A可單獨(dú)施用。在另外的實(shí)施方案中，施用VEGI-192A與可藥用賦形劑，并且可以是多種劑型?？伤幱觅x形劑在本領(lǐng)域公知，并且為促進(jìn)藥理學(xué)有效物質(zhì)施用的相對(duì)惰性的物質(zhì)。例如，賦形劑可賦予形狀或粘稠性，或充當(dāng)稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕和乳化劑、用于改變滲透性的鹽、包膠劑、緩沖液和皮膚滲透增強(qiáng)劑。用于腸胃外和非腸胃外藥物遞送的賦形劑以及制劑在Remington《The Science and Practice ofPharmacy》第20版，Mack Publishing(2000)中闡述。
雖然也可使用其他形式的給藥(例如，口服、經(jīng)粘膜等等)，通常這些制劑配制用于經(jīng)注射(例如，經(jīng)腹膜、靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、肌內(nèi)等)給藥?？梢允侨硇?例如靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))給藥，或局部給藥。VEGI-192A蛋白質(zhì)經(jīng)位點(diǎn)特異的或靶向局部遞送技術(shù)施用。位點(diǎn)特異的或靶向局部遞送技術(shù)的實(shí)例包括VEGI-192A蛋白質(zhì)的多種可移植的儲(chǔ)存源或局部遞送導(dǎo)管，如輸液導(dǎo)管、留置導(dǎo)管或針管、合成的移植物、外膜包裝(adventitialwrap)、分流器(shunt)和支架或其他可移植的裝置、位點(diǎn)特異的載體、直接注射或直接應(yīng)用。參見，例如PCTPublicationNo.WO00/53211和美國(guó)專利No.5,981,568。因此，VEGI-192A蛋白質(zhì)優(yōu)選與可藥用賦形劑(如鹽水、林格氏液、葡聚糖溶液等)組合。
具體的給藥方案，即劑量、時(shí)間和重復(fù)取決于具體的個(gè)體以及該個(gè)體的病史。通常，可使用任何下列劑量至少約50mg/kg體重；至少約20mg/kg體重；至少約10mg/kg體重；至少約5mg/kg體重；至少約3mg/kg體重；至少約1mg/kg體重；至少約750μg/kg體重；至少約500μg/kg體重；至少約250μg/kg體重；至少約100μg/kg體重；至少約50μg/kg體重；至少約10μg/kg體重；至少約1μg/kg體重的劑量或更多的劑量類型被施用。經(jīng)驗(yàn)性的考慮，如半衰期，一般將有助于劑量的確定。
在一些個(gè)體中，可能需要不止一次給藥。給藥的頻率可在整個(gè)治療過程中確定和調(diào)整，并且以減少癌細(xì)胞的數(shù)目、維持癌細(xì)胞的減少、減緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)展為基礎(chǔ)。癌細(xì)胞的存在可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或此處所述的許多方法確定(例如，通過活組織或生物樣品的免疫組織化學(xué)或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè))。有時(shí)，維持VEGI-192A蛋白質(zhì)制劑的持續(xù)釋放可能是合適的。用于實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放的各種制劑和裝置為本領(lǐng)域公知。
在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGI-192A的劑量可在已給予一次或多次施藥的個(gè)體中憑經(jīng)驗(yàn)確定。個(gè)體給予遞增的VEGI-192A劑量。為了評(píng)估VEGI-192A的效力，可監(jiān)測(cè)特定癌癥疾病狀態(tài)的標(biāo)志。這些標(biāo)志包括腫瘤大小經(jīng)觸診或目測(cè)的直接測(cè)定；腫瘤大小經(jīng)X射線或其他成像技術(shù)的間接測(cè)定；如通過腫瘤樣品直接的腫瘤活組織檢查和顯微鏡檢查而評(píng)估的好轉(zhuǎn)；間接的腫瘤標(biāo)記物的測(cè)定(例如，針對(duì)前列腺癌的PSA)；疼痛或麻痹的降低；改善的言語、視力、呼吸或與腫瘤有關(guān)的其他殘疾；增強(qiáng)的食欲或如通過接受檢驗(yàn)衡量的生活質(zhì)量的提高或存活的延長(zhǎng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然的是劑量將隨個(gè)體、癌癥的類型、癌癥的階段、癌癥是否開始轉(zhuǎn)移至其他個(gè)體部位以及之前和目前共同所用的療法而改變。
其他制劑包括本領(lǐng)域已知的合適的傳遞形式，包括但不限于載體，如脂質(zhì)體。參見，例如Mahato等(1997)Pharm.Res.14853-859。脂質(zhì)體制劑包括但不限于細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
VEGI-192A可與其他的癌癥療法聯(lián)合，例如放射治療或化療劑。VEGI-192A可與其他癌癥治療劑(如Rituxan和Herceptin)聯(lián)合給藥。
利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行疾病的評(píng)估，如成像方法和監(jiān)測(cè)合適的標(biāo)志物。
IV.組合物和制備組合物的方法用于本發(fā)明方法的組合物包含VEGI-192A蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，重組產(chǎn)生VEGI-192A蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，VEGI-192A蛋白質(zhì)從大腸桿菌重組產(chǎn)生并且純化。應(yīng)當(dāng)理解的是組合物可包含VEGI-192A和一種或多種其他的抗癌劑。
VEGI-192A(與VEGI-192A蛋白質(zhì)和VEGI-192A多肽互換使用)包括任何天然存在的種類(如來自人或其他哺乳動(dòng)物的全長(zhǎng)多肽)、生物學(xué)活性肽片段(例如，WO03/039491和美國(guó)專利出版物No.2003/017242中所述的VEGI-192A片段和包括SEQ ID NO1的氨基酸26的N末端截短的VEGI-192A片段)和變體(包括天然存在的和非天然存在的變體)，包括不顯著影響其生物學(xué)性質(zhì)的功能等效變體和具有增強(qiáng)或降低的活性(例如抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng))的變體。
人VEGI-192A的核苷酸序列和氨基酸序列在PCT WO03/039491、U.S.Pat.Appl.Pub.No.2003/0170242中描述，并且人VEGI-192A的氨基酸序列還呈現(xiàn)在表1中(SEQ ID NO1)。在一些實(shí)施方案中，VEGI-192A蛋白質(zhì)包含表1中所示的SEQ ID NO1的氨基酸序列。VEGI-192A的實(shí)施方案包括融合蛋白(N端融合或C端融合)，例如表2中所示的N端融合蛋白質(zhì)。VEGI-192A可來自任何物種，如人。
表1.人VEGI-192A的氨基酸序列

本發(fā)明包含利用VEGI-192A功能等效變體的方法。本發(fā)明的VEGI-192A和VEGI-192A功能等效變體通過任何(一種或多種)下列標(biāo)準(zhǔn)鑒定和表征(a)抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的能力；b)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞死亡的能力；b)抑制血管生成的能力；c)抑制腫瘤生長(zhǎng)(例如，乳房和肺癌)的能力；d)激活宿主免疫系統(tǒng)的能力，例如誘導(dǎo)一種或多種細(xì)胞因子(如IL-15和IP-10)產(chǎn)生的能力。VEGI-192A變體的生物學(xué)活性可利用本領(lǐng)域已知的和實(shí)施例2-5中所述的方法測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)上述(或本領(lǐng)域已知的)一種或多種生物學(xué)測(cè)定法，功能等效變體具有相比全長(zhǎng)的天然VEGI-192A至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的活性。在一些實(shí)施方案中，功能等效變體在體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖(例如實(shí)施例2中所述的測(cè)定法)中具有1000ng/ml、100ng/ml、60ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、12ng/ml或6ng/ml的至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的IC50。
本發(fā)明的VEGI-192A變體可包括與VEGI-192A(例如，SEQ ID NO1)至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。
如果兩條序列中的氨基酸序列如以下所述排列用于最大比對(duì)時(shí)是相同的，則兩條多肽序列稱作“相同的”。兩條序列間的比較通常通過在比較窗口比較序列以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域而進(jìn)行。如此處所用的“比較窗口”指至少約20個(gè)連續(xù)位置，通常30至約75、40至約50的區(qū)段，其中在兩條序列最佳排列后序列可與具有相同連續(xù)位置數(shù)目的參照序列作比較。
可以利用生物信息軟件的Lasergene程序組中(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Megalign程序，利用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。該程序包含下列參考文獻(xiàn)中所述的若干排列方案Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices fordetecting distant relationships.Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of ProteinSequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein.J.，1990，Unified Approachto Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS5151-153；Myers，E.W.和MullerW.，1988，CABIOS411-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles and Practice of numericalTaxonomy，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
優(yōu)選，通過在至少20個(gè)位置的比較窗口比較兩條最佳比對(duì)的序列確定“序列同一性的百分?jǐn)?shù)”，其中為了兩條序列的最佳比對(duì)，比較窗口中的多肽序列部分相比參照序列(其不包括添加或缺失)可包括20％或更低，通常5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即缺口)。百分?jǐn)?shù)通過確定兩條序列中存在的相同氨基酸殘基位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以參照序列中位置的總數(shù)(即窗口大小)并且將結(jié)果乘以100以得到序列同一性的百分比而計(jì)算。
本發(fā)明的VEGI-192A變體可包括不顯著改變蛋白質(zhì)活性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失或添加。變體可來自天然突變或人為操作。變化可以是次要的性質(zhì)，如不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸的替換。為了改進(jìn)或改變VEGI多肽的特性，可利用蛋白質(zhì)工程。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)可用于產(chǎn)生新的突變蛋白質(zhì)或包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失、添加的突變體或融合蛋白。所述經(jīng)修飾的多肽可呈現(xiàn)，例如增強(qiáng)的活性或增強(qiáng)的穩(wěn)定性。此外，相比對(duì)應(yīng)的天然多肽，至少在某些純化和儲(chǔ)存條件下其可以較高的產(chǎn)率純化并且呈現(xiàn)更好的溶解度。因此，本發(fā)明還包括具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、添加或替換的VEGI-192A衍生物和類似物，以產(chǎn)生更適于在所選的宿主細(xì)胞中表達(dá)、按比例放大等的VEGI-192A多肽。
用于本發(fā)明方法的VEGI-192A功能等效變體還包括含有VEGI-192A多肽的融合蛋白。生物學(xué)活性的VEGI-192A多肽可與序列融合，如與增強(qiáng)免疫反應(yīng)、促進(jìn)多肽偶聯(lián)至支持物或載體或促進(jìn)重折疊和/或純化的序列(例如表2中所示的編碼如Myc、源自流感病毒血球凝集素的HA、His-6、FLAG或His標(biāo)簽的序列)融合。這些序列可以融合至VEGI-192A多肽N末端或C末端。此外，蛋白質(zhì)或多核苷酸可融合至其他的或增強(qiáng)其功能或在細(xì)胞中特異性定位的多肽(如分泌序列)。用于產(chǎn)生上述重組融合蛋白的方法為本領(lǐng)域所公知。重組融合蛋白可通過本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生、重折疊和分離。在一些實(shí)施方案中，VEGI-192A蛋白質(zhì)利用包含組氨酸殘基的融合多肽，其可如實(shí)施例中所述而制備。在一些實(shí)施方案中，組氨酸融合蛋白包含SEQ ID NO1。
應(yīng)當(dāng)理解的是此處所述的VEGI-192A蛋白質(zhì)實(shí)施方案不包括VEGI-174、VEGI-251、VEGI-192B。參見U.S.Pat.Appl.Pub.No.20020111325；U.S.Pat.Appl.Pub.No.20030170242。
用于本發(fā)明的組合物還可包含以凍干制劑或水溶液形式的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(RemingtonThe Science and practice of Pharmacy 20thEd.(2000)Lippincott Williams和Wilkins編K.E.Hoover.)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在其劑量和濃度上對(duì)接受者無毒，并且可包含緩沖液，如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸緩沖液；包括抗壞血酸和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑(如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六烴季銨、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、苯酚、丁基或苯甲醇、烷基對(duì)羥苯甲酸如甲基或?qū)αu苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽-形成抗衡離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)?？伤幱觅x形劑在此進(jìn)一步描述。
VEGI-192A蛋白質(zhì)和其組合物還可與其他的抗癌制劑聯(lián)合使用，用來增強(qiáng)和/或補(bǔ)足該制劑的有效性。
VEGI-192A(包括變體)可利用本領(lǐng)域已知的方法制備，例如重組制備。VEGI-192A和變體可根據(jù)美國(guó)專利No.6,583,268，共同未決申請(qǐng)(代理人摘要no.54411-20004.00，要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/528,983的優(yōu)先權(quán))所述的方法和實(shí)施例中所述的方法在大腸桿菌中表達(dá)并且重折疊和純化。V.包含用于治療目的的VEGI-192A的試劑盒本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括含有純化的VEGI-192A蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)容器以及根據(jù)本文所述的本發(fā)明任何方法的使用說明書。通常，這些說明書包括根據(jù)本文所述的任何方法施用VEGI-192A蛋白質(zhì)以治療癌癥(例如肺和乳腺癌)的說明。該試劑盒還可包含基于確定個(gè)體是否患有癌癥以及癌癥的階段而選擇適于治療的個(gè)體的說明。
涉及使用VEGI-192A蛋白質(zhì)的說明書通常包括用于設(shè)想療法的劑量、給藥方案和施用途徑的信息。容器可以是單位劑量、散裝(bulk package)(例如多劑量包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明試劑盒中所提供的說明書通常為標(biāo)簽或包裝說明書上的文字說明(例如包含在試劑盒中的紙張)，但是機(jī)器可讀的說明書(例如磁或光存儲(chǔ)盤上攜帶的說明書)也是可接受的。
標(biāo)簽或包裝說明書指示組合物用于治療癌癥(包括轉(zhuǎn)移性的癌癥)。說明書可提供用于操作此處所述的任何方法。
本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行合適的包裝。合適的包裝包括但不限于小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。另外考慮的有用于和特定的裝置，如吸入器、鼻給藥裝置(例如噴霧器)或輸液裝置如小型真空泵結(jié)合的包裝。試劑盒可具有無菌的進(jìn)入口(例如容器可以是靜脈溶液袋或具有通過皮下注射針可刺透的塞子的小瓶)。容器也可具有無菌的進(jìn)入口(例如容器可以是靜脈溶液袋或具有通過皮下注射針可刺透的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為VEGI-192A蛋白質(zhì)。容器還可包括另一種藥物活性劑。
試劑盒可任選地提供額外的組件，如緩沖液和解釋信息。通常，試劑盒包括容器并且在其上或與容器有關(guān)的標(biāo)簽或包裝說明書。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含上述試劑盒內(nèi)容的制成品。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含VEGI-192A蛋白質(zhì)和指示用于治療癌癥(例如肺和乳腺癌)的信息。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含VEGI-192A蛋白質(zhì)和另一種抗癌制劑以及指示彼此聯(lián)合用于治療癌癥(例如肺和乳腺癌)的信息。
實(shí)施例實(shí)施例1重組VEGI-192A的重折疊和純化載體構(gòu)建和表達(dá)通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生表1中所示編碼人VEGI-192A的DNA片段。PCR產(chǎn)物插入pET-19b(Cat.No.69677-3，Novagen，SanDiego，CA)的Nde I/Bam HI位點(diǎn)，產(chǎn)生具有N端融合標(biāo)簽的VEGI-192A蛋白質(zhì)(表2)。PCR、連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21 DE3菌株后，選擇單菌落并擴(kuò)增，并且最終測(cè)序構(gòu)建體以確保DNA序列的正確性。具有N末端His標(biāo)簽的VEGI-192核苷酸序列和氨基酸序列在表2中顯示。
表2.具有N末端His標(biāo)簽的VEGI-192A的核苷酸序列和氨基酸序列

為產(chǎn)生VEGI-192A蛋白質(zhì)，將VEGI-192A表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入大腸桿菌的BL21 DE3菌株并且接種于具有氨芐青霉素的ZB平板上。選擇單菌落且用于接種100mL具有氨芐青霉素的ZB培養(yǎng)基(10g/l NZ胺A(Sigma)和5g/l NaCl)并且在30℃過夜培養(yǎng)(大約16個(gè)小時(shí))。100mL起始培養(yǎng)物的20mL隨后用于接種1L具有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)物在37℃振蕩孵育至600nm的光密度(OD600)達(dá)到0.4-0.6。隨后加至0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘導(dǎo)VEGI-192A的表達(dá)，并且培養(yǎng)物進(jìn)一步振蕩孵育三小時(shí)。大規(guī)模的表達(dá)在37℃利用多個(gè)1L振蕩器細(xì)頸瓶完成。
重折疊前包涵體的處理從細(xì)菌收獲包涵體。通過離心收集細(xì)菌細(xì)胞，隨后重懸浮于具有1％TRITONX-100的20mL TN(150mM NaCl，50mMTris，pH8.0)中。添加十毫克溶菌酶，并且細(xì)胞懸液在-20℃冷凍過夜。隨后融解裂解物并且添加20μl1M的硫酸鎂和100μg的DNase。細(xì)胞攪拌孵育直至釋放的細(xì)菌DNA完全溶解。裂解物隨后用250mL具有1％TRITONX-100的TN稀釋并且攪拌混合物2-4小時(shí)。離心收集包涵體，并且洗滌三次(通過重懸浮和離心)。
重折疊和重折疊蛋白質(zhì)的層析分離洗滌的包涵體溶于pH10.5的8M尿素、0.1M Tris、1mM甘氨酸、10mMβ-巰基乙醇、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、1mM還原的谷胱甘肽(GSH)、0.1mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)中。將蛋白質(zhì)溶液的280nm處的吸光率(OD280)調(diào)節(jié)至2.0。溶液通過超速離心法澄清(30分鐘×66,000g)，隨后重折疊。
澄清的溶液快速稀釋入20倍體積、pH10.5的20mM Tris、1.36mM月桂酰肌氨酸鈉、0.009mM三甲胺N-氧化二水合物、0.005mM十六烷基三甲基溴化銨中。得到的溶液用1M HCl經(jīng)4天時(shí)間逐步調(diào)節(jié)至pH8.0。
重折疊的蛋白質(zhì)通過超濾濃縮(Millipore Pellicon，10,000 Da截留膜)并且施加至用pH8的20mM Tris、0.4M尿素、0.2M NaCl平衡和洗脫的聚丙烯酰胺葡聚糖S-300柱(圖1)。合并來自圖1A的組分(顯示為1、2、3)并且濃縮至約5mg/ml(圖1B中所示的SDS-PAGE)用于實(shí)施例2-4中所述的內(nèi)皮細(xì)胞抑制測(cè)定和腫瘤模型試驗(yàn)。
還利用Ni+親和柱純化功能性的VEGI-192A。Ni+螯合柱(500ml)用pH8的20mM Tris、1.36mM月桂酰肌氨酸鈉、0.4M尿素平衡。重折疊的VEGI-192A(4L)施加至柱，并且柱用1L pH8的20mM Tris、0.4M尿素、0.2M NaCl、5mM Immidozole(緩沖液A)洗滌。用緩沖液A中線性梯度的immidozole(5至500mM)從柱洗脫VEGI-192A。合并圖2A中所示的洗脫峰，并且經(jīng)pH8的20mM Tris、0.4M尿素、0.2M NaCl透析。透析的VEGI-192A隨后通過超濾濃縮至約5mg/ml。產(chǎn)生的VEGI-192A的非還原的和還原的SDS-PAGE分析在圖2B中顯示。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，重折疊過程通過將包含溶解的VEGI-192A的澄清溶液快速稀釋入20倍體積pH10.5的20mM Tris、0.034mM月桂酰肌氨酸鈉、0.009mM三甲胺N-氧化二水合物、0.005mM十六烷基三甲基溴化銨中而進(jìn)行。得到的溶液用1M HCl經(jīng)4天時(shí)間逐步調(diào)節(jié)至pH8.0。重折疊的VEGI-192A以上述同樣的方式濃縮并且純化。通過實(shí)施例2中所述的內(nèi)皮細(xì)胞抑制測(cè)定法測(cè)定，利用該重折疊緩沖液純化的VEGI-192A的活性比上述重折疊條件下的低100倍。
實(shí)施例2通過內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法表征重組VEGI-192A的生物學(xué)活性成年牛主動(dòng)脈內(nèi)皮(ABAE)細(xì)胞在37℃、5％CO2、10％FBS、1ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(Promega，Madison，WI)的IMEM(GibcoBiofluids，Rockville，MD)中培養(yǎng)。通過3H-胸苷的摻入測(cè)定細(xì)胞的休眠程度。如果不超過5％的細(xì)胞摻合3H-胸苷，則考慮在細(xì)胞周期的G0期同步化細(xì)胞。G0同步化的細(xì)胞僅在其重新接種于(5000細(xì)胞/cm2)具有10％FBS和1ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2的IMEM中并在37℃、5％CO2下孵育時(shí)重新進(jìn)入生長(zhǎng)周期。如實(shí)施例1中所述制備的VEGI-192A在接種細(xì)胞的時(shí)候或當(dāng)接種后20小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)周期的時(shí)間點(diǎn)添加至培養(yǎng)基。通過胰蛋白酶消化以給定的時(shí)間間隔從每個(gè)培養(yǎng)孔制備單細(xì)胞懸浮液。通過利用Coulter計(jì)數(shù)器或通過利用使用四唑化合物-MTS(Promega)比色測(cè)定法而測(cè)定每份懸液中的細(xì)胞數(shù)目，MTS可經(jīng)活細(xì)胞代謝而產(chǎn)生在490nm可檢測(cè)的藍(lán)顏色化合物；MTS的代謝率與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)目成正比。該測(cè)定法中使用的VEGI-192A的濃度為0.1ng/mL至1μg/mL的范圍。
在利用MTS比色測(cè)定法的ABAE內(nèi)皮細(xì)胞抑制測(cè)定法中，所有的三個(gè)庫(kù)都具有活性而庫(kù)3具有最大的活性(圖1C)。如圖1C中所示，庫(kù)3中的重組VEGI-192A在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖中呈現(xiàn)12ng/ml(0.49nM)的IC50。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生的重組VEGI-192A在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖中呈現(xiàn)0.24nM(6ng/ml)的IC50。
實(shí)施例3通過重組VEGI-192A抑制Lewis肺癌生長(zhǎng)和提高負(fù)瘤小鼠存活時(shí)間用Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞經(jīng)皮下植入C57B16/J小鼠。癌細(xì)胞用PBS洗滌、分散在0.05％的胰蛋白酶溶液中并且重懸浮。在8℃、4000rpm離心10分鐘后，細(xì)胞沉淀重懸浮于PBS中并且濃度調(diào)節(jié)至2.5×106細(xì)胞/ml。小鼠隨后用0.1ml該癌細(xì)胞懸液經(jīng)皮下注射于肋部。腫瘤用刻度卡鉗測(cè)量，并且腫瘤體積利用公式體積＝寬度×寬度×長(zhǎng)度×0.52確定。在腫瘤體積為至少100-200mm3(體重的0.5-1％)后(其在5-7天內(nèi)發(fā)生)，將小鼠隨機(jī)分入三組。兩組小鼠以5mg/kg或20mg/kg，每周兩次，通過腹膜內(nèi)(IP)或瘤內(nèi)(IT)注射而接受懸浮于PBS中的重組人VEGI-192A(如實(shí)施例1中所述制備的)。IP或IT注射在腫瘤可觸摸到時(shí)或在腫瘤體積達(dá)到700-1000mm3時(shí)開始。第三組僅接受賦形劑(磷酸緩沖鹽)的類似的注射。當(dāng)對(duì)照組中腫瘤體積超過2000mm3時(shí)終止實(shí)驗(yàn)且處死小鼠并尸體剖檢。
當(dāng)腫瘤為可觸摸到或當(dāng)腫瘤體積達(dá)到700-1000mm3時(shí)，通過腹膜內(nèi)(IP)注射至負(fù)瘤動(dòng)物遞送重組VEGI-192A觀察到了負(fù)瘤動(dòng)物中腫瘤生長(zhǎng)速率的顯著抑制。如圖3A中所示，重組VEGI-192A以5mg/Kg通過IP或IT注射至具有700-1000mm3腫瘤體積的小鼠的全身遞送顯示腫瘤生長(zhǎng)的明顯抑制。即使在治療開始時(shí)腫瘤體積幾乎為體重的5％(700-1000mm3)時(shí)仍可實(shí)現(xiàn)差不多50％的腫瘤生長(zhǎng)速率抑制。
由于具有該時(shí)期LLC腫瘤的動(dòng)物可能已經(jīng)產(chǎn)生尤其至肺部的廣泛分布的微轉(zhuǎn)移，一旦原發(fā)腫瘤經(jīng)外科除去其將成長(zhǎng)為大轉(zhuǎn)移，處于腫瘤已達(dá)到幾乎5％(700-1000mm3腫瘤體積)動(dòng)物體重時(shí)期的LLC腫瘤類似于臨床組中晚期的人肺癌。參見Oareilly等，Cell79(2)315-28(1994)；Cao等，J Clin.Invest.101(5)1055-63(1998)。
還測(cè)試了負(fù)瘤小鼠的存活時(shí)間。存活時(shí)間通過植入LLC細(xì)胞與當(dāng)腫瘤體積達(dá)到3000mm3以上的間隔天數(shù)，或植入LLC細(xì)胞與當(dāng)動(dòng)物由于高度侵潤(rùn)性的腫瘤生長(zhǎng)使腫瘤浸潤(rùn)進(jìn)入脊柱而變得癱瘓時(shí)之間的間隔天數(shù)而確定。Lewis肺癌模型的動(dòng)物在當(dāng)腫瘤體積達(dá)到3000mm3以上，或當(dāng)動(dòng)物由于高度侵潤(rùn)性的腫瘤生長(zhǎng)而腫瘤浸潤(rùn)進(jìn)入脊柱而變得癱瘓時(shí)處死。如在那個(gè)時(shí)候生存動(dòng)物的存活時(shí)間和數(shù)目的曲線圖所示(圖3B)，半數(shù)存活時(shí)間(從治療開始，其開始于當(dāng)未治療組的腫瘤平均大小為700mm3時(shí)的第11天)大約為4天，而治療組的半數(shù)存活時(shí)間為12天，反映出3倍更長(zhǎng)的存活時(shí)間。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，LLC細(xì)胞(每次注射1×106)經(jīng)皮下注射于C57BL/6黑色小鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的肋部并且治療在可觸摸到腫瘤的早期開始(圖9)。在第5天、第9天和第12天通過IP施用VEGI-192A(20mg/kg)治療動(dòng)物。對(duì)照組用賦形劑治療。如圖9中所示，VEGI-治療組觀察到顯著減慢的腫瘤生長(zhǎng)速率。
實(shí)施例4用重組VEGI-192A治療人乳腺癌異種移植腫瘤MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞注射入(每次注射1×106細(xì)胞)雌性無胸腺裸鼠乳房脂肪墊。注射的癌細(xì)胞在5-7天中形成可觸摸到的腫瘤。腫瘤體積通過利用用于卵形體積的方程式V＝0.52LW2確定。一旦腫瘤體積達(dá)到約100mm3，通過在腫瘤部位的皮下(SC)注射而將如實(shí)施例1所述產(chǎn)生的重組VEGI-192A遞送至該動(dòng)物(5mg/Kg，每周兩次)。除了利用賦形劑(PBS)替代外，對(duì)照組在相同的實(shí)驗(yàn)條件下治療。一旦腫瘤體積超過2000mm3或腫瘤體重超過2克(其大約為體重的10％)時(shí)處死動(dòng)物。收集腫瘤、其他器官(肺、肝臟、脾臟)和外周血用于生物病理分析。
為了分析VEGI-192A治療對(duì)腫瘤脈管的作用，新冷凍的切片(來自對(duì)照組動(dòng)物和在腫瘤部位接受SC注射的組)通過凋亡細(xì)胞的熒光標(biāo)記(圖4的A和C欄中所示)或?qū)D31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)的免疫染色(圖4的B和D欄中所示)而分析。A欄中，未治療的腫瘤顯示幾乎沒有凋亡細(xì)胞而在B欄中未治療的腫瘤顯示大量的微血管。比較而言，VEGI-192A治療的腫瘤(C欄)顯示凋亡細(xì)胞強(qiáng)的熒光標(biāo)記以及腫瘤內(nèi)部的壞死區(qū)。如D欄中描述的，VEGI-192A治療的腫瘤顯示明顯降低的微血管密度。腫瘤組織中觀察到細(xì)胞死亡。
實(shí)施例5通過施用重組VEGI-192A抑制Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞的攝入LLC細(xì)胞如實(shí)施例3中所述制備并且接種(1×105細(xì)胞/注射)于C57B1小鼠的背部。在LLC細(xì)胞接種(第0天)的同時(shí)通過腹膜內(nèi)(IP)注射5mg/kg VEGI-192A(如實(shí)施例1中所述制備)的而治療動(dòng)物。腫瘤體積在第4天測(cè)定。如圖5中所示，在腫瘤接種時(shí)動(dòng)物的治療導(dǎo)致腫瘤內(nèi)攝入速率的明顯抑制(t檢驗(yàn)，p＜0.002)。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中(圖10中所示)，LLC細(xì)胞(1×106每次注射)接種于C57BL/6黑色小鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的肋部并且在癌細(xì)胞接種后用VEGI-192A(20mg/kg，如實(shí)施例1中所述準(zhǔn)備)立即治療動(dòng)物。每天重復(fù)治療直至第4天。當(dāng)在接種后第5天評(píng)估腫瘤體積時(shí)，賦形劑治療組中的所有動(dòng)物已發(fā)展有皮下腫瘤(5/5或100％)，具有35mm3的平均體積(+/-SD)，而VEGI治療組的約一半呈現(xiàn)可測(cè)量的腫瘤(2/6或33％)，并且腫瘤體積更加小(圖10)。結(jié)果顯示全身施用VEGI引起通過癌細(xì)胞的腫瘤形成的阻滯。
實(shí)施例6宿主免疫系統(tǒng)通過施用重組VEGI-192A的激活LLC細(xì)胞如實(shí)施例3所述制備并且接種(1×105細(xì)胞/注射)于C57B1小鼠的背部。在腫瘤變得可觸摸到時(shí)的第4天開始施用VEGI-192A。在第4天、第7天、第8天、第9天和第10天以5mg/Kg注射VEGI-192A(如實(shí)施例1中所述制備)。在第11天取回脾臟并且稱重。在第11天還收集血清。血清中細(xì)胞因子的水平利用抗體綴合的發(fā)光測(cè)定試劑盒(LINCOplex，LINCO Research，Inc.，Missouri)按照產(chǎn)品說明書測(cè)定。
動(dòng)物用VEGI-192A的治療導(dǎo)致明顯的脾腫大(圖6中所示)以及一些細(xì)胞因子明顯增強(qiáng)的產(chǎn)生(圖7中所示)，如TNF-α、IL-6、IL-1B、IL-15和IP-10。IL-15和IP-10已知參與各種淋巴細(xì)胞的激活和血管生成的抑制。
上述小鼠血清中細(xì)胞因子的分布與培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGI-192A治療的應(yīng)答相當(dāng)。增殖或匯合(G0-同步化的)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)用500ng/ml VEGI-192A處理5小時(shí)。處理后，用獲自FredHutchinson Cancer Research Center，Seattle，Washington的cDNA微陣列測(cè)定處理和未處理的增值和匯合的HUVEC的細(xì)胞因子表達(dá)分布。來自圖7B的小鼠血清中細(xì)胞因子的分布與用VEGI-192A處理的增殖和匯合的HUVEC的細(xì)胞因子分布相當(dāng)。如圖8所示，VEGI-192A的處理在增殖和匯合的HUVEC中誘導(dǎo)IL-15和IP-10的表達(dá)，提示VEGI-192A治療可在人中提高這兩種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
實(shí)施例7LLC負(fù)瘤小鼠中VEGI-192A治療后腫瘤脈管的免疫組織化學(xué)分析我們測(cè)定了用VEGI-192A(如實(shí)施例1中所述制備)全身治療LLC負(fù)瘤小鼠對(duì)腫瘤血管豐度和結(jié)構(gòu)的影響。LLC細(xì)胞如實(shí)施例3中所述制備并且皮下接種(1×106細(xì)胞/注射)于C57BL/6黑色小鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的肋部。在第4天開始腹膜內(nèi)施用VEGI-192A或賦形劑。每周兩次VEGI-192A(5mg/Kg)，注射三周。賦形劑治療組接受類似的磷酸緩沖鹽的注射。免疫組織化學(xué)分析如下述進(jìn)行。摘除腫瘤并且在4℃置于PBS中4％低聚甲醛的固定劑中4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入無RNase的30％蔗糖PBS(4℃)中4℃過夜。腫瘤隨后置于干冰上的OCT化合物中。免疫染色前切片(8μM厚)在載玻片上45℃干燥兩小時(shí)。內(nèi)皮細(xì)胞用CD31的大鼠單克隆抗體(PECAM-1；BD PharMingen，MEC13.3克隆，1∶250稀釋，cat.#01951D)鑒定。血管平滑肌細(xì)胞用單克隆抗肌動(dòng)蛋白-α-FITC(Sigma，clone1 A4，1∶250稀釋，cat.#F3777)鑒定。血管基底膜用抗IV型膠原的兔多克隆抗體(1∶10,000稀釋；Cosmo Bio Co.，Tokyo，Japan)鑒定。細(xì)胞核用Hoechst(100ng/ml；Sigma)鑒定。所用的第二抗體為生物素化的抗大鼠(Vector Laboratories，Burlingame，CA.cat.#BA4001)、兔抗大鼠IgG-TRITC(Sigma，cat.T4280)和驢抗大鼠IgG-FITC(Jacksoncat.#_712-096-153)、用于生物素檢測(cè)的AMCA抗生物素蛋白D(Vector Laboratories，cat.#A-2008)，和山羊抗兔IgG-TRITC(Sigmacat.#T6778)。ABC標(biāo)準(zhǔn)試劑盒和DAB試劑盒(Vector Laboratories)用于該免疫組織化學(xué)。樣品與0.03％的H2O2(Sigma)在室溫下孵育15分鐘以封閉內(nèi)源性的過氧化物酶活性，隨后與包含0.2％TritonX-100和5％牛血清白蛋白(Sigma)的PBS孵育以封閉非特異性的抗體結(jié)合。樣品隨后與PBS中稀釋至1-2μg/ml的第一抗體在室溫下孵育1小時(shí)，或在4℃孵育12-15小時(shí)。除了第一抗體用PBS替換外，對(duì)照樣品在相同條件下處理。用PBS漂洗后，樣品與第二抗體在室溫下孵育1小時(shí)、用PBS漂洗，隨后與ABC標(biāo)準(zhǔn)試劑盒或AMCA抗生物素蛋白D在室溫下孵育30分鐘。樣品用PBS漂洗并且與DAB試劑盒孵育，隨后漂洗且固定于Vectashield中(Vector Laboratories)。
樣品用配備有單個(gè)、雙個(gè)和三個(gè)熒光過濾器的NikonEclipseE800熒光顯微鏡和帶有Qcapture軟件的低照度RETIGA1300CCCD照相機(jī)(Quantitative Imaging Corporation，Burnaby，BC，Canada)檢查。圖像保存為數(shù)字文件。圖像分析用Image-pro plus軟件(Media Cybernetics，Inc)或Image-J(NIH)進(jìn)行。
腫瘤中內(nèi)皮細(xì)胞的特異性消除新冷凍的腫瘤制成切片并且經(jīng)受對(duì)內(nèi)皮標(biāo)志物CD31(紅色)和平滑肌細(xì)胞抗原-α(SMA-α)(綠色)的免疫染色(圖11A、11B)。我們隨后通過計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析分析了每個(gè)載玻片上包含最大數(shù)目微血管(“熱點(diǎn)”)的15個(gè)視野。測(cè)定每個(gè)視野的紅色或綠色像素的密度(400×放大倍數(shù))(圖11C)。結(jié)果(如圖11所示)顯示腫瘤血管中內(nèi)皮細(xì)胞的特異性消除。作為由CD31陽性細(xì)胞所占的總像素所測(cè)量的內(nèi)皮細(xì)胞的密度表現(xiàn)出治療一周內(nèi)88％的降低，以及三周內(nèi)進(jìn)一步的降低。有趣的是，平滑肌細(xì)胞的數(shù)目維持相對(duì)不變。因此，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)平滑肌細(xì)胞的比率在VEGI-治療的腫瘤中明顯降低，在動(dòng)物治療一周或三周后分別從1.8變化至0.4以及從1.8變化至0.15。對(duì)另一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，CD105進(jìn)行類似的免疫染色，并且獲得相同的結(jié)果。這些結(jié)果顯示VEGI-191A的抗血管生成活性導(dǎo)致腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性消除。
內(nèi)皮細(xì)胞消除后腫瘤中血管平滑肌細(xì)胞的存留我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞消除后血管平滑肌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)期間存留(圖12)。似乎多少保留了一些腫瘤脈管系統(tǒng)的腔。此提高了具有良好的平滑肌細(xì)胞支持的腫瘤血管在大部分內(nèi)皮細(xì)胞不再存在后可能保留了少許殘留功能的可能性。
VEGI-192A治療的腫瘤中殘留的血管結(jié)構(gòu)的存在殘留的血管結(jié)構(gòu)得到進(jìn)一步研究。不同于賦形劑治療的腫瘤中由內(nèi)皮細(xì)胞排列的血管腔(圖12A)，在VEGI治療的腫瘤中存在包含紅血細(xì)胞的空隙，但沒有內(nèi)皮細(xì)胞排列(圖12B)。隨后測(cè)定這些空隙是否為內(nèi)皮細(xì)胞消除的殘留的血管。此通過對(duì)血管基底膜主要組分的膠原IV的免疫染色完成。如圖12C和12D所示，與在賦形劑治療的對(duì)照組腫瘤中與血管基底膜關(guān)聯(lián)的易于檢測(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞相比(圖12D)，腫瘤脈管的基本結(jié)構(gòu)維持幾乎完好，即使在內(nèi)皮細(xì)胞通過VEGI-192A的治療幾乎完全消除的時(shí)候亦是如此(圖12C)。這些基底膜結(jié)構(gòu)常常伴隨平滑肌細(xì)胞，而不管腫瘤是否用VEGI-192A(圖12E)或賦形劑(圖12F)治療。除了未治療腫瘤中的血管結(jié)構(gòu)包含內(nèi)皮細(xì)胞這僅有的差異，這些殘留血管的出現(xiàn)與來自未治療腫瘤中所見的那些區(qū)分不開。這些結(jié)果顯示由基底膜和平滑肌細(xì)胞組成的殘留的血管結(jié)構(gòu)在內(nèi)皮細(xì)胞從這些腫瘤血管除去后至少在實(shí)驗(yàn)期間存在。
雖然上述發(fā)明已經(jīng)通過用于澄清和理解目的的說明和實(shí)施例較詳細(xì)地描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很顯然可進(jìn)行某些變化和改變。因此，說明和實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍通過附帶的權(quán)利要求描述。
權(quán)利要求
1.用于治療個(gè)體中肺癌的方法，包括施用有效量的VEGI-192A多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中癌癥為晚期癌癥。
3.權(quán)利要求1的方法，其中癌癥為轉(zhuǎn)移的癌癥。
4.權(quán)利要求1的方法，其中VEGI-192A多肽為人VEGI-192A。
5.權(quán)利要求1的方法，其中VEGI-192A多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中VEGI-192A多肽從大腸桿菌中重組產(chǎn)生。
7.用于治療肺癌的試劑盒，其包含VEGI-192A多肽和指導(dǎo)施用VEGI-192A多肽以治療肺癌的說明書。
8.用于治療個(gè)體中乳腺癌的方法，包括施用有效量的VEGI-192A多肽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中癌癥為晚期癌癥。
10.權(quán)利要求8的方法，其中癌癥為轉(zhuǎn)移的癌癥。
11.權(quán)利要求8的方法，其中VEGI-192A多肽為人VEGI-192A。
12.權(quán)利要求8的方法，其中VEGI-192A多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求8的方法，其中VEGI-192A多肽從大腸桿菌中重組產(chǎn)生。
14.用于治療乳腺癌的試劑盒，其包含VEGI-192A多肽和用于指導(dǎo)施用VEGI-192A多肽以治療乳腺癌的說明書。
全文摘要
本發(fā)明以施用有效量的VEGI－192A多肽來治療癌癥的方法和組合物為特征。在一些實(shí)施方案中，癌癥為肺癌或乳腺癌。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1997277SQ200480041540
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月11日
發(fā)明者藺新力, 李魯遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:普羅特奧姆技術(shù)公司, 高等教育聯(lián)邦體系匹茲堡大學(xué)