專利名稱：制備肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用固相Fmoc-化學(xué)，制備式(1)的N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨?；?L-α-天冬氨?；?L-色氨?；?L-脯氨?；?L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物的改進方法。
背景技術(shù)：
美國專利No.5318899描述了式(1)的N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨?；?L-α-天冬氨酰基-L-色氨?；?L-脯氨?；?L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物作為用于治療和預(yù)防與血小板有關(guān)的局部缺血疾病的治療劑。它結(jié)合到人類血小板的血小板受體糖蛋白(GP)上并抑制血小板聚集。血小板聚集由在血小板膜表面上的GP配合物介導(dǎo)。它以非活性形式存在于未受到刺激的血小板表面上。當血小板通過粘合和生理興奮劑激活時，GP也被激活，以便它變?yōu)檠w蛋白原、vonWillebrand因子(vWF)和纖連蛋白的受體。然而，它是血纖蛋白原和/或vWF的結(jié)合物，認為這種結(jié)合物是造成血小板聚集和體內(nèi)血栓形成的主要原因。這教導(dǎo)特異地抑制血纖蛋白原或vWF結(jié)合到GP上的物質(zhì)，抑制血小板聚集且可成為在體內(nèi)抑制血栓形成的候選物(Eric J.Topol，Tatiana V.Byzova，Edward F.Plowand The Lancet；Vol 353；1999年1月16日；第227-231頁)。該文章描述了具有血小板聚集抑制活性的化合物，但沒有教導(dǎo)合成該分子的方法。
血小板糖蛋白IIb/IIIa的拮抗物在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention)(PCI)過程中在降低導(dǎo)致心肌損壞的血栓復(fù)雜程度方面具有得到證明的作用。
式(1)的化合物是二硫化物成環(huán)的環(huán)狀七肽，其含有六個氨基酸和一個巰基丙酰(脫氨半胱氨酰)殘基。在半胱酰胺和巰基丙?；糠种g形成二硫化物橋。已知它通過溶液相肽合成生產(chǎn)并通過制備反相液相色譜純化并凍干(www.fda.gov/cder/foi/label/1998/20718lbl.pdf)。
關(guān)于肽的合成方法，兩種主要的合成技術(shù)主導(dǎo)目前的實踐。這些是在溶液中合成(均相)和在固相上合成(非均相)。但與固相路線相比溶液相路線更麻煩，因為在每一次偶聯(lián)之后必需分離已形成的肽，而在固相合成中，通過簡單的過濾洗滌掉過量的試劑和副產(chǎn)物。在兩者中，通過逐步添加氨基酸部分到形成的肽鏈上，從而制備所需的肽化合物。
美國專利5958732和5318899要求保護關(guān)于重組技術(shù)來合成肽，例如式(1)的N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨?；?L-α-天冬氨酰基-L-色氨?；?L-脯氨?；?L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物。將通過這一重組方法獲得的肽通過溶液相合成來改性，以將賴氨酸殘基轉(zhuǎn)化成高精氨酸殘基。這些專利文獻還要求保護使用Boc化學(xué)的固相合成，且這些專利的主題從根本上不同于本發(fā)明。
與Boc化學(xué)相比，基于Fmoc化學(xué)的合成利用溫和的工序，且由于Fmoc基團的堿不穩(wěn)定性，因此使用酸活潑側(cè)鏈保護基，從而提供垂直(orthogonal)保護。使用保護基的原理是斷開保護基的化學(xué)鍵的能量低于任何其它基團。
專利US5686566、US5686567、US5686569、US5686570和US5756451涉及式(1)化合物的鹽或其它形式的不同的PAI，但沒有教導(dǎo)使用Fmoc固相合成制備它的方法。
同樣，專利US5759999、US5786333、US5770564、US5807825、US5807828、US5843897、US5968902和US5935926描述了治療與血小板有關(guān)的疾病的方法以及使用boc化學(xué)制備式(1)的肽酰胺的方法。
專利US5344783和US5851839涉及選擇并鑒定血小板聚集抑制劑(PAI)的方法并公開了制備式(1)的肽酰胺的boc化學(xué)。
美國專利5780595要求保護對PAI特異的抗體，且還公開了制備式(1)的肽酰胺的boc化學(xué)。
合成各種其它肽的Fmoc路線是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，且可獲得數(shù)篇文獻用于其制備。然而，開發(fā)經(jīng)濟、包括最少步驟且還生態(tài)友好的制備式(1)的化合物的方法存在明確的需要。
如前所述，基于Fmoc化學(xué)的合成利用溫和的工序，且由于Fmoc基團的堿活潑性，因此使用酸活潑側(cè)鏈保護基，從而提供垂直保護。在Fmoc化學(xué)中所使用的保護基基于叔丁基部分對于Ser、Thr來說，為叔丁基醚，對于Asp、Glu來說為叔丁基酯，和對于Lys、His來說為Boc。Trt和acm基已用于保護Cys。Arg和Har中的胍基受到Mtr、Pmc或Pbf保護。大多數(shù)Fmoc-氨基酸衍生物可以商購。然而，在制備某些氨基酸類似物，例如含有高精氨酸的肽以及基于二硫化物鍵的環(huán)狀肽化合物領(lǐng)域中存在問題，因為在純化最終產(chǎn)物之前要求分離操作，這會增加成本且可影響最終產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。Fmoc-高精氨酸殘基若商購以用于鏈的組裝，則變的昂貴。可選地，在肽的組裝中，通過在α-NH2處鳥苷酸化(guanylation)賴氨酸殘基形成Har單元，這已證明獲得了后葉加壓素類似物用于評價其生物活性(Lindeberg et al，Int.J.Peptide Protein Res.10，1977，240-244)。
WO03/093302公開了使用Fmoc-α-氮保護的Cα-碳酰胺(carboxamide)半胱氨酸合成式(1)的肽。它描述了將沉淀形式的第一氨基酸，半胱氨酸通過其硫羥基側(cè)鏈連接到固體載體4-甲氧基三苯甲基聚苯乙烯樹脂上，接著除去α-氮保護基并在所述氮上組裝肽。然而，該方法使用固體載體-4-甲氧基三苯甲基聚苯乙烯樹脂，它不是常見的商業(yè)實施方案，且Fmoc-α-氮保護的Cα-碳酰胺半胱氨酸也不是可商購的。這使得該方法具有增加數(shù)量的步驟且相對于本發(fā)明的方法來說還昂貴。解離條件利用乙二硫醇，它使得該方法高度有毒和非環(huán)境友好，從而要求使用昂貴的滌氣器。提及在鏈的組裝中使用Fmoc-高精氨酸殘基，若它可商購的話，則也使得該方法非常昂貴。總之，在這一文獻中要求保護的方法不同于在本發(fā)明中要求保護的方法。另外，WO03/093302的方法與一些局限有關(guān)，在本發(fā)明的方法步驟中，通過提供合適的改性，從而克服了所述局限。
因此，與WO03/093302-A2專利公開中所述的方法相比，本發(fā)明的方法是改進和有效的方法，正如以下所提及的。
1.不包括生產(chǎn)-SH肽，該肽對空氣氧化敏感，從而導(dǎo)致形成雜質(zhì)，所述雜質(zhì)將阻礙最終產(chǎn)物的純化和產(chǎn)率。
2.精確選擇氨基酸的保護基，形成肽鏈。
3.使用合適的活化試劑，活化氨基酸中的羧基官能，防止氨基酸的外消旋化。
4.在不分離-SH肽下由銀-肽鹽中間體獲得式(1)的在肽酰胺中的二硫化物環(huán)的有效方法。
合成了相當數(shù)量的已知的，天然存在的小和中等尺寸的環(huán)狀肽以及擁有所需的藥學(xué)性能的一些它們的合成衍生物和類似物。然而，因為它們的合成和純化復(fù)雜，較寬的醫(yī)療應(yīng)用常常受到阻礙。因此，以簡單、較少的步驟和以較低的成本制備這些化合物的改進方法是所需的且是工業(yè)和人類的需要。
肽的純度和產(chǎn)率是任何合成路線的重要方面。用藥理學(xué)的活性化合物在最終產(chǎn)物中的相對含量表示的產(chǎn)率應(yīng)當盡可能高。通過藥理學(xué)的活性雜質(zhì)的存在程度來表示純度，所述雜質(zhì)盡管僅僅以痕量存在，但當用作治療劑時，可干擾或甚至使肽的有益作用無效。在藥理學(xué)的這兩個方面必需考慮。通常，在較大的肽分子情況下，純化變得愈加困難。在均(溶液)相合成(它是目前工業(yè)生產(chǎn)較大量肽所選的方法)，在分離的步驟之間要求的反復(fù)純化提供較純的產(chǎn)品，但產(chǎn)率較低。因此，需要在合成的最后階段改進產(chǎn)率和純化技術(shù)。本發(fā)明是工業(yè)上可行的固相合成方法，且是得到具有提高的產(chǎn)率的高純產(chǎn)品的新方法。
現(xiàn)有技術(shù)描述了使用HOBt和DIC活化氨基酸，這會導(dǎo)致形成OBt酯。然而，使用這一工序的主要缺點是制備OBt酯本身花費約20分鐘，且反應(yīng)還必需在0℃下進行。在SPPS內(nèi)逐步引入Nα保護的氨基酸通常包括引入的氨基酸的就地羧基活化或者使用預(yù)成形的活化氨基酸衍生物。近年來，基于鋁和磷鎓的衍生物(HBTU、TBTU、Py Boc和HATU)成為就地羧基活化的優(yōu)選工具。已顯示它們在偶聯(lián)效率和抑制對映異構(gòu)化二者方面給出優(yōu)異的結(jié)果。(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis by Chan W.C.andWhite P.D.，Oxford University Press，2000，第41-74頁)。使用HBTU提供高的產(chǎn)率和高的純度。它在活化步驟中節(jié)約時間且不要求冷卻。對于Mpr(Acm)-OH來說，也不要求雙偶聯(lián)。
大多數(shù)Fmoc-氨基酸衍生物是可商購的。然而，在制備某些氨基酸類似物，例如含有高精氨酸的肽以及基于二硫化物鍵的環(huán)狀肽化合物領(lǐng)域中存在問題，因為在純化最終產(chǎn)物之前要求分離操作，這將增加成本且可影響最終產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。Fmoc-高精氨酸殘基若商購用于在肽鏈的組裝中使用的話，則非常昂貴。或者，可使用賴氨酸，接著在α-NH2處鳥苷酸化賴氨酸殘基，從而進行肽的組裝(Lindeberg et al，Int.J.Peptide Protein Res.10，1977，240-244)。
通常作為最后的合成步驟進行氧化環(huán)化受護的或者未保護的硫氫基并形成二硫化物結(jié)構(gòu)，原因是二硫化物鍵的顯著熱和化學(xué)活潑性。在少數(shù)情況下，它也可在從固體載體中解離肽分子之前進行。在CRC Handbook of Neurohypophyseal HormoneAnalogs，Vol.1，Part1；Jost，K.，et al.Eds.，CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)la.1987，p.31中進一步解釋了在，例如，甲醇或乙酸中含有游離和/或某些類型的被保護的硫氫基和碘的開鏈肽的氧化。然而，碘作為環(huán)化劑不是沒有缺點。例如，存在于肽基質(zhì)內(nèi)的色氨酸部分具有碘化的危險，使在起始材料的完全轉(zhuǎn)化和最小化副反應(yīng)之間的平衡變?yōu)榫艿钠胶?，這反過來會影響產(chǎn)物純度。Tam(Tam J.P.et al.，1990，J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，p.6657)證明，與其它方法，例如空氣氧化相比，在各種緩沖體系中使用20-50％的DMSO溶液大大地促進二硫化物鍵的形成。還發(fā)現(xiàn)DMSO大大地降低，和在一些情況下，完全抑制使用其它氧化工序發(fā)生的肽的聚集和沉淀。因此，與其它已知的方法相比，通過DMSO氧化的二硫化物環(huán)肽的產(chǎn)率和純度高得多。在本發(fā)明中，通過不選擇用于氧化環(huán)化的碘路線，正好解決了這一方面。此外，在本發(fā)明中，使肽酰胺的銀鹽代替含硫羥基的肽酰胺進行氧化，而沒有分離SH-肽并消除在氧化反應(yīng)過程中形成的副產(chǎn)物。因此，脫保護接著氧化在本發(fā)明中采用的鳥苷酸化肽酰胺的工序步驟得到含提高純度和產(chǎn)率的式(1)化合物的粗肽酰胺。最后純化粗肽導(dǎo)致最終純肽的提高的產(chǎn)率。
在已知的合成路線中另一復(fù)雜的因素是在所需的環(huán)狀二硫化物和在反應(yīng)最后還原(reducing)過量碘所使用的無機硫化合物，例如連二硫酸鈉或硫代硫酸鈉之間相互作用的可能性。這種還原的含硫化合物可與二硫化物鍵相互作用，所述二硫化物鍵對親核進攻一般來說敏感。由于本發(fā)明的方法避免使用碘，因此所得產(chǎn)品具有高的純度和檢測不到相關(guān)雜質(zhì)。
以幾個容易和簡單的步驟實現(xiàn)該方法。使用固相合成使得該方法更加簡單，和使用Fmoc-化學(xué)省去使用苛刻的化學(xué)品，例如HF，從而不影響產(chǎn)品穩(wěn)定性。該方法省去純化中間體，從而增加產(chǎn)率和降低成本。通過不必須使用硫醇用滌氣器，在步驟(b)和(e)中替代硫醇作為清除劑使得該方法更加環(huán)境友好和經(jīng)濟。
方法的選擇常常決定治療學(xué)上肽的穩(wěn)定性。長期以來要求獲得克服與現(xiàn)有技術(shù)方法有關(guān)局限性的式(1)的肽。因此，含有色氨酸、二硫化物環(huán)、ε-NH2側(cè)鏈等的肽合成的工業(yè)方法要求合適地選擇保護基和反應(yīng)條件以構(gòu)建肽鏈。通過申請人開發(fā)在本申請中此處完整地描述的方法，現(xiàn)已成功地實現(xiàn)了這一目的。
說明書中所使用的術(shù)語一覽表AA 氨基酸Acm乙酰氨基甲基ACT活化劑ADP腺苷二磷酸AgOTf 三氟甲烷磺酸銀Arg精氨酸Asp天冬氨酸Boc/boc叔丁氧羰基Cys半胱氨酸DCM二氯甲烷DEP脫保護劑DMF二甲基甲酰胺DMSO 二甲亞砜DTT二硫蘇糖醇EDT乙二硫醇
Fmoc 9-芴基甲氧羰基Glu谷氨酸Gly甘氨酸HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(uronium)六氟磷酸鹽HF氟化氫HIC疏水作用色譜法His組氨酸IEC離子交換色譜法LC-MS 液相色譜-質(zhì)譜Lys賴氨酸Mpr巰基丙酸Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基NMMN-甲基嗎啉Obut O-叔丁基Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；鵓mc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基PPP貧血小板血漿Pro脯氨酸PRP富血小板血漿RP-HPLC反相高效液相色譜RV 反應(yīng)容器Ser絲氨酸SOLV 溶劑SP 合成肽
TEA三乙胺TFA三氟乙酸Thr蘇氨酸TIS三異丙基硅烷Trp色氨酸Trt三苯甲基發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供獲得式(1)的N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨?；?L-α-天冬氨?；?L-色氨?；?L-脯氨?；?L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物的改進方法。
本發(fā)明的另一目的是公開用于獲得高產(chǎn)率和高純度的式(1)的肽酰胺的方法。
本發(fā)明又一目的是公開通過使用Fmoc化學(xué)固相合成式(1)的肽酰胺的方法。
本發(fā)明的再一目的是公開生產(chǎn)式(1)的肽的方法，其與溶液相合成相比具有較少數(shù)量的步驟。
本發(fā)明的又一目的是設(shè)計生產(chǎn)式(1)的肽酰胺的方法，其沒有與式(1)的化合物的現(xiàn)有技術(shù)固相合成有關(guān)的局限性。
本發(fā)明再一目的是提供用于制備具有提高的純度的含有二硫化物部分的小和中等尺寸的肽的方法。
本發(fā)明的又一目的是選擇合適的保護基和試劑，在方法步驟中使形成的伴隨雜質(zhì)最小化，因而提高產(chǎn)率和降低成本。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于制備式(1)的N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨?；?L-α-天冬氨?；?L-色氨?；?L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物的改進的方法，它包括在固相樹脂上組裝氨基酸殘基和具有合適的保護基的硫代烷基羧酸，從樹脂上解離如此獲得的肽，同時除去除了硫羥基部分的Acm保護基以外的側(cè)鏈保護基，以獲得式(3)的肽酰胺，將具有被保護的硫羥基基團的式(3)的肽酰胺的賴氨酸殘基通過鳥苷酸化轉(zhuǎn)化成高精氨酸殘基，接著同時脫保護，獲得式(5)的銀肽，并氧化銀肽，以獲得式(1)的粗肽酰胺，并最后進行色譜純化。所述方法簡單、容易、環(huán)境友好且成本有效。


圖1來自樹脂的HBTU-粗肽的分析RP-HPLC洗脫分布圖(柱子PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速0.5ml/min；注射體積20μl；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％乙腈)。
圖2來自樹脂的DIC-粗肽的分析RP-HPLC洗脫分布圖(柱子PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速0.5ml/min；注射體積20μl；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％乙腈)。
圖3粗的鳥苷酸化肽的分析RP-HPLC洗脫分布圖(柱子PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速0.5ml/min；注射體積20μl；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％乙腈)。
圖4SH肽的分析RP-HPLC洗脫分布圖(柱子PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速0.5ml/min；注射體積20μl；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％乙腈)。峰A-粗SH肽。
圖5粗環(huán)狀肽的分析RP-HPLC洗脫分布圖(柱子PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速0.5ml/min；注射體積20μl；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％乙腈)。峰A-粗環(huán)狀肽。
圖6粗環(huán)狀肽的制備RP-HPLC純化洗脫分布圖(柱子Phenomenex Luna；C-18(2)；10μ；250×50mm；流速50ml/min；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％甲醇)。
圖7純化的環(huán)狀肽的分析RP-HPLC洗脫分布圖(柱子PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速0.5ml/min；溶劑體系A(chǔ)0.1％TFA，B100％乙腈)。峰A-純化的肽。
圖8純肽的MS分析，顯示質(zhì)量(mass)為832和雜質(zhì)為903。
表1通過式(1)的合成肽抑制ADP誘導(dǎo)的聚集。
具體實施例方式
根據(jù)本發(fā)明，提供在固相上制備式(1)的肽N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨?；?L-色氨?；?L-脯氨?；?L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物的方法，所述方法包含下述步驟 式(1)a)通過偶聯(lián)，借助肽鍵彼此直接相連，在固體載體樹脂上以所要求的順序組裝包含六個氨基酸和一個硫代烷基羧酸的肽鏈，獲得式(2)的肽；(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂式(2)b)在每次偶聯(lián)之后用乙酸酐使步驟(a)的游離氨基封端；c)從固體載體樹脂上解離并脫保護除了在步驟(b)的肽中的acm基團以外的所有基團，以獲得式(3)的肽酰胺；(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2式(3)；d)在有機溶劑中，在ε-賴氨酸-NH2處鳥苷酸化步驟(c)的肽，接著用另一溶劑沉淀，以獲得式(4)的肽酰胺；(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2式(4)e)在合適的溶劑中，用重金屬鹽處理步驟(d)式(4)的肽酰胺，接著使用有機溶劑沉淀，以獲得式(5)的重金屬-肽鹽； 式(5)f)用合適的親核試劑處理步驟(e)的重金屬-肽鹽，以獲得式(1)的粗肽酰胺；和g)通過色譜技術(shù)純化步驟(f)的粗肽酰胺。
本發(fā)明的一個實施方案涉及使化合物的氨基和羧基當量反應(yīng)，以形成所述肽鍵。
本發(fā)明的另一實施方案提供通過連接體鍵合到固相樹脂上的被保護的第一氨基酸的C端，以獲得固相鍵合的氨基酸。
本發(fā)明的又一實施方案使用具有任何酰胺樹脂，優(yōu)選Rink酰胺樹脂，的固體載體。
本發(fā)明的再一實施方案使用第一被保護的氨基酸作為硫羥基保護的Fmoc半胱氨酸。
本發(fā)明的又一實施方案使用HBTU作為偶聯(lián)劑。
本發(fā)明的再一實施方案提供用連接體解離樹脂，導(dǎo)致釋放組裝的肽酰胺。
本發(fā)明的再一實施方案提供通過連接每一端基官能度而獲得的式(1)的肽酰胺化合物，所述端基官能度是氨基或羧酸基或其衍生物。
本發(fā)明的再一實施方案使用選自由Cys、Pro、Trp、Asp、Lys、Gly、Arg、Har、Leu、Glu組成的組中的氨基酸。
本發(fā)明的一個實施方案使用硫代烷基羧酸2-硫代丙酸。
本發(fā)明的另一實施方案提供以Fmoc或Boc方式使用用于氨基酸的氨基官能的保護基。
本發(fā)明的又一實施方案提供以未保護的或者被保護O-tBu酯的方式使用羧基官能。
本發(fā)明的再一實施方案用于使用硫羥基官能的保護基作為Acm基。
本發(fā)明的再一實施方案提供以確定的比例使用試劑TFA、TIS、EDT、DCM、苯酚和水，優(yōu)選TFA(85-98％)∶TIS(0-5％)∶H2O(0-5％)∶EDT(0-5％)∶苯酚(0-5％)，更優(yōu)選TFA(94.5-95.5％)∶TIS(0-2.5％)∶H2O(0-3％)∶EDT(0-2.5％)，從固體載體樹脂上解離該肽。
本發(fā)明的另一實施方案使用選自由DMF、乙醇和甲醇組成的組中的用于鳥苷酸化的有機溶劑。
本發(fā)明的又一實施方案優(yōu)選通過使用溶劑DMF進行肽的鳥苷酸化。
本發(fā)明的再一實施方案使用選自由丙酮、乙腈、甲醇、醚、戊烷、己烷及其混合物組成的組中的溶劑，進行式(4)的肽酰胺的沉淀。
本發(fā)明的再一實施方案優(yōu)選使用乙腈進行沉淀。
本發(fā)明的另一實施方案可通過RP-HPLC實現(xiàn)式(4)的肽的純化。
本發(fā)明的又一實施方案，所得式(1)的肽酰胺具有大于99％的純度。
本發(fā)明的再一實施方案，使用Fmoc化學(xué)，通過固相合成進行式(1)的肽的制備。
本發(fā)明進一步的實施方案使用選自三氟甲烷磺酸鉈、乙酸汞或三氟甲烷磺酸銀中的重金屬鹽，優(yōu)選三氟甲烷磺酸銀除去acm。
本發(fā)明的另一實施方案，優(yōu)選在TFA中，用三氟甲烷磺酸銀處理式(4)的肽，獲得重金屬肽鹽。
本發(fā)明的再一實施方案，優(yōu)選使用醚溶劑和更優(yōu)選二異丙基醚，進行式(5)的重金屬-肽鹽的沉淀。
本發(fā)明的再一實施方案，可用HCl和DMSO處理重金屬-肽鹽，以同時除去重金屬并氧化所得肽，以得到式(1)的粗肽酰胺。
本發(fā)明的再一實施方案，可通過RP-HPLC純化式(1)的粗肽酰胺。
本發(fā)明的另一實施方案，優(yōu)選通過RP-HPLC，使用C-4、C-8或C-18二氧化硅或聚合物反相柱，使用甲醇和/或乙腈，與含水TFA(0-0.5％)結(jié)合作為流動相，進行式(1)的粗肽酰胺的純化。
本發(fā)明的再一實施方案使用甲醇(AR等級)純化粗肽，使得該方法便宜。
本發(fā)明的再一實施方案提供制備以下給出的式(2)中間體肽的方法(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂式(2)
本發(fā)明的又一實施方案提供制備以下給出的酰胺式(3)的中間體肽的方法(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2式(3)本發(fā)明的又一實施方案提供制備以下給出的式(4)的肽酰胺的方法(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2式(4)本發(fā)明的再一實施方案提供制備以下給出的式(5)的中間體肽酰胺銀鹽的方法 式(5)下述實施例是本發(fā)明的說明且不解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例(1)化學(xué)合成直鏈肽(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(OBut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂式(2)通用程序按照下述方式進行肽鏈的組裝。將樹脂轉(zhuǎn)移至肽合成儀[CS936，CS BIO，Calif.Peptide Synthesizer]的RV，并在肽合成儀上，使用1.5-4.0倍摩爾過量的氨基酸衍生物，在樹脂上組裝直鏈肽。通過在樹脂上使Fmoc-基脫保護，將第一氨基酸Fmoc-Cys(C)偶聯(lián)到樹脂上，接著在NMM存在下，通過HBTU活化Fmoc-Cys(C)。為了偶聯(lián)下一個氨基酸，脯氨酸，使第一氨基酸，即Fmoc-Cys(C)的α-氮脫保護，接著在NMM存在下，通過HBTU活化Fmoc-Pro。用所有氨基酸重復(fù)這一方法，直到將全部直鏈肽鏈組裝在固體載體上。在端處組裝Mpr。每一次偶聯(lián)在45-90分鐘的時間范圍內(nèi)進行。偶聯(lián)步驟之后緊跟著用乙酸酐封端30-60分鐘。在完成偶聯(lián)之后，用有機溶劑洗滌樹脂，所述有機溶劑可選自DMF、N-甲基吡咯烷酮或DCM，優(yōu)選DMF，其次DCM，然后真空干燥。獲得式(2)的直鏈肽。
通過固相肽合成技術(shù)，在rink酰胺樹脂上，使用Fmoc化學(xué)，以肽酰胺形式合成該肽。

將樹脂(15.38g-rink酰胺，10mmol)轉(zhuǎn)移到CS 936的RV，并在DMF中溶脹。
(i)合成Fmoc Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Cys(Acm)/HBTU至樹脂。用DMF洗滌預(yù)溶脹的樹脂(10mmol)2次，接著通過用20％哌啶處理2次，除去Fmoc。用DMF洗滌樹脂6次。將Fmoc Cys(Acm)(20mmol)和HBTU(與氨基酸等摩爾)溶解在0.4M NMM中，并加入到樹脂中。在優(yōu)化的攪拌下進行偶聯(lián)60分鐘。再次用DMF洗滌樹脂三次。在偶聯(lián)之后，通過乙酸酐(2.5M)封端游離氨基45分鐘，接著用DMF洗滌3次。這一HBTU方法是其中酯沒有分離的一步方法。
合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV10分鐘 X3 洗滌樹脂
2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 ACT 30秒X1 溶解Fmoc-Cys(Acm)/HBTU5 AA 45分鐘 X1 Fmoc-Cys(Acm)偶聯(lián)6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(ii)合成Fmoc-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過將Fmoc-Pro/HBTU偶聯(lián)至Fmoc-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 ACT 30秒X1 溶解Fmoc-Pro/HBTU5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Pro6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(iii)合成Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Trp/HBTU至Fmoc-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 ACT 30秒X1 溶解Fmoc-Trp/HBTU5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Trp6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(iv)合成Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Asp(Obut)/HBTU至Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 ACT 30秒X1 溶解Fmoc-Asp(Obut)/HBTU5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Asp(Obut)6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(v)合成Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Gly/HBTU至Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 ACT 30秒X1 溶解Fmoc-Gly/HBTU5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Gly6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(vi)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)/HBTU至Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂
4 ACT 30秒X1溶解Fmoc-Lys(Boc)/HBTU5 AA 45分鐘 X1偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)6 SOLV30秒X3洗滌樹脂(vii)合成Mpr(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Mpr(Acm)/HBTU至Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 ACT 30秒X1 溶解Mpr(Acm)/HBTU5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Mpr(Acm)6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂實施例(2)化學(xué)合成直鏈肽(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(OBut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂式(2)通用程序按照下述方式進行肽鏈的組裝。將樹脂轉(zhuǎn)移至肽合成儀[PS3，Protein Technologies，Peptide Synthesizer]的RV，并在肽合成儀上，使用1.5-4.0倍摩爾過量的氨基酸衍生物，在樹脂上組裝直鏈肽。通過在樹脂上使Fmoc-基脫保護，將第一氨基酸Fmoc-Cys(C)偶聯(lián)到樹脂上，接著活化Fmoc-Cys(C)。將Fmoc-Cys(C)(1.3mmol)和HOBt(2.6mmol)溶解在DMF(5.0ml)中，并在冰浴中冷卻到低于10℃。將DIC(1.74mmol)以單一的等分部分加入到反應(yīng)混合物中。然后在引入至反應(yīng)容器內(nèi)的潮濕(damp)樹脂之前，攪拌該混合物6分鐘。該偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生60分鐘。
為了偶聯(lián)下一個氨基酸，脯氨酸，使第一氨基酸，即Fmoc-Cys(C)的α-氮脫保護。隨后在如上所述的冷卻條件下，通過DIC/HOBt活化Fmoc-Pro，然后將這一混合物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中。用所有氨基酸重復(fù)這一方法，直到將全部直鏈肽鏈組裝在固體載體上。在端處組裝Mpr。每一次偶聯(lián)在45-90分鐘的時間范圍內(nèi)進行。重復(fù)Mpr的偶聯(lián)。偶聯(lián)步驟之后緊跟著用乙酸酐封端30-60分鐘。在完成偶聯(lián)之后，用有機溶劑洗滌樹脂，所述有機溶劑可選自DMF、N-甲基吡咯烷酮或DCM，優(yōu)選DMF，其次DCM，然后真空干燥。獲得式(2)的直鏈肽。
通過固相肽合成技術(shù)，在rink酰胺樹脂上，使用Fmoc化學(xué)，以肽酰胺形式合成該肽。

將樹脂(1g-rink酰胺，0.65mmol)轉(zhuǎn)移至PS3的RV，并在DMF內(nèi)溶脹。
合成Fmoc Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)已活化的Fmoc-Cys(Acm)到樹脂上。用DMF洗滌預(yù)溶脹的樹脂(0.65mmol)2次，接著通過用20％哌啶處理2次，除去Fmoc。用DMF洗滌樹脂6次。將Fmoc Cys(Acm)(1.3mmol)和HOBt(2.6mmol)溶解在DMF(5.0ml)中，并在冰浴內(nèi)冷卻到低于10℃。將DIC(1.74mmol)作為單一等分部分(single aliquot)加入到反應(yīng)混合物中。然后在引入至潮濕樹脂之前，攪拌該混合物6分鐘。在優(yōu)化的攪拌下進行偶聯(lián)60分鐘。再次用DMF洗滌樹脂三次。在偶聯(lián)之后，通過乙酸酐(2.5M)封端游離氨基45分鐘，接著用DMF洗滌3次。這一DIC/HOBt方法是手工且多步的方法。
合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV10分鐘 X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸5 AA 45分鐘 X1 Fmoc-Cys(Acm)偶聯(lián)6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(ii)合成Fmoc-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)已活化的Fmoc-Pro至Fmoc-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Pro6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(iii)合成Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)已活化的Fmoc-Trp至Fmoc-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Trp6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(iv)合成Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Asp至Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Asp(Obut)6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(v)合成Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Gly至Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Fmoc-Gly6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂(vi)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)至Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動
1 SOLV30秒X3洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2N末端脫保護3 SOLV30秒X6洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸5 AA 45分鐘 X1偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)6 SOLV30秒X3洗滌樹脂(vii)合成Mpr(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂，通過偶聯(lián)Mpr(Acm)至Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂。與步驟1一樣進行反應(yīng)。合成循環(huán)如下程序化步驟試劑時間重復(fù)活動1 SOLV30秒X3 洗滌樹脂2 DEP 5分鐘 X2 N末端脫保護3 SOLV30秒X6 洗滌樹脂4 手工添加已活化的Fmoc氨基酸5 AA 45分鐘 X1 偶聯(lián)Mpr(Acm)6 SOLV30秒X3 洗滌樹脂在合成中，偶聯(lián)Mpr(Acm)必需進行2次，以完成偶聯(lián)反應(yīng)。
實施例(3)從樹脂中解離肽以產(chǎn)生肽酰胺(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2(式(3))在室溫下，在CS936中，用500ml由TFA(95％)∶TIS(2.5％)∶H2O(2.5％)∶EDT(0％)∶苯酚(0％)組成的解離雞尾酒(cocktail)處理組裝的肽樹脂(來自實施例1或2)2小時。通過RV過濾反應(yīng)混合物，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置(Rotavap)上蒸發(fā)TFA。在20℃下，通過添加300ml冷的二異丙基醚，在恒定的攪拌下進行肽的沉淀。在-20℃下，使在溶劑中的粗肽沉淀靜置10小時。通過經(jīng)Whatman紙no.5過濾，分離肽，接著用冷的溶劑洗滌(100ml×3)，以除去在解離雞尾酒中所使用的清除劑。在P2O5上真空干燥粗肽沉淀，并通過RP-HPLC表征(圖1和2)。
實施例1實施例2產(chǎn)率58.73產(chǎn)率48.73肽的純度％90％ 肽的純度％79.68％實施例(4)鳥苷酸化粗肽以產(chǎn)生(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2(式(4))將肽(1g，1.157mmol)溶解在15ml DMF內(nèi)，用TEA調(diào)節(jié)pH到9.0。添加在DMF(15ml)中的試劑3，5-二甲基吡唑-1-甲脒(carboxamidine)硝酸鹽(931.5mg)到該肽中。在多次添加1倍過量的試劑3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸鹽情況下，在30℃下攪拌反應(yīng)混合物4天。
通過添加280ml乙腈(用TEA調(diào)節(jié)pH到8.0)，從反應(yīng)混合物中沉淀肽。在-20℃下進一步保持混合10小時。經(jīng)Whatman no.5濾紙過濾，并用乙腈(pH8.0)洗滌3次，接著用普通(plain)乙腈洗滌，以中和pH。在高真空下干燥沉淀過夜。產(chǎn)率85％。通過RP-HPLC表征肽(圖2)。
實施例(5)使鳥苷酸化肽脫ACM，接著氧化以產(chǎn)生 式(1)將TFA(134.9ml)和茴香醚(2.7ml)混合，在冰中冷卻，添加至658mg來自實施例3的預(yù)冷卻的肽中，并用氮氣飽和。接著添加AgOTf(3.47g)，并在冰浴中攪拌2小時。在高真空下除去TFA，并通過添加二異丙醚(～400ml)沉淀肽的銀鹽。經(jīng)G-4燒結(jié)漏斗過濾反應(yīng)混合物，并將沉淀(銀-肽)再懸浮在二異丙醚(60ml×3)中，如上所述洗滌，并在真空下經(jīng)P2O5干燥。
通過在冰冷條件下，在15.6ml 50％DMSO/IM HCl內(nèi)溶解10mg銀-肽鹽，進行銀肽的氧化。在25℃下攪拌反應(yīng)混合物3小時。經(jīng)G-4燒結(jié)漏斗或Hyflo床過濾沉淀，除去氯化銀。為氧化的完成檢測濾液(圖4)。一旦反應(yīng)完成，獲得式(1)的粗肽。純度百分數(shù)85％。
實施例(6)純化S-S-肽將式(1)的粗二硫化物環(huán)肽裝載在制備型C-18柱子(50×250mm，100埃)上。通過使用含水TFA(0.1％)和甲醇，以梯度程序純化肽(圖5)。緊跟著使用以上所述的溶劑體系，在由控制器、2臺LC8A泵、UV-Vis檢測器組成的Shimadzu制備型HPLC體系上進行等度操作(isocratic run)。通過分析型RP-HPLC，分析式(1)的純化的肽酰胺(圖6)。通過質(zhì)譜分光光度計測定質(zhì)量(圖7)。
實施例(7)純化S-S-肽以與實施例5相同的方式進行純化，除了使用乙腈而不是甲醇，以獲得式(1)的肽酰胺之外。
實施例(8)使用乙酸汞(II)，使鳥苷酸化肽脫ACM與實施例(4)一樣，除了通過用乙酸汞(II)處理，從鳥苷酸化肽中除去半胱氨酸中的Acm基團保護之外。
將肽(13.4mg，通過Lowry方法評估，Cys-Acm中的肽)溶解在400μl乙酸(10％)中。將10倍過量的乙酸汞(II)(82.96mg)加入其中，將反應(yīng)物渦旋，并在室溫下保持5小時。添加100倍過量的β-巰基乙醇(181.37μl)，將溶液渦旋，并使之在室溫下靜置過夜。將反應(yīng)混合物離心4分鐘，并收集上清液。通過離心，用400μl×3的10％乙酸提取沉淀。匯集濾液，通過RP-HPLC測定的純度百分數(shù)為55％(圖3)。
實施例(9)使用碘使鳥苷酸化肽脫ACM與實施例(4)一樣，除了通過用碘處理，從鳥苷酸化肽中除去半胱氨酸中的Acm基團保護之外。
將肽(9.18mg，通過Lowry方法評估，Cys-Acm中的肽)溶解在17.8ml乙酸(80％)中，并用氮氣吹掃15分鐘。在1小時內(nèi)，將1mM碘溶液(在80％乙酸中，～4ml)加入到肽溶液中，直到存在持久穩(wěn)定的黃色。再攪拌混合物30分鐘，接著用1N Na2S2O3中和，直到黃色消失，并凍干。通過Ellamn Test進行‘SH’的評估，其為負則表示沒有實現(xiàn)ACM的除去。
實施例(10)純化脫ACM的肽通過RP-HPLC，使用hyperprep(250×10mm，12μ，C-18柱)，使經(jīng)乙酸汞(II)處理和經(jīng)I2處理的肽樣品脫鹽。
實施例(11)血小板聚集抑制分析以檢測式(1)生物活性使用4×Laser Aggregometer(EMA)，使用血小板聚集抑制分析，檢測式(1)的肽的生物活性。抽取來自已同意的人類捐贈者的新鮮靜脈血，并收集在檸檬酸鹽緩沖液內(nèi)。通過離心分離富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿。調(diào)節(jié)PRP內(nèi)的血小板數(shù)為2-3×108個血小板/ml。在用PPP調(diào)節(jié)基線聚集之后，用10-20mMADP處理PRP，并檢測總的聚集百分數(shù)。然后隨參考標準和式(1)的合成肽的濃度變化，首先培育PRP。然后添加ADP，以檢測聚集抑制。數(shù)次檢測式1的合成肽的生物活性的再現(xiàn)性，并與參考標準物比較。表1代表許多實驗(來自12個實驗)之一。與商業(yè)參考標準相比，合成肽(SP)的IC50劑量小于140nM。在大多數(shù)樣品中觀察到采用SP存在大于50％ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制，且結(jié)果與商業(yè)參考標準相當。
表1通過式(1)的合成肽(SP)抑制ADP誘導(dǎo)的聚集

權(quán)利要求
1.一種用于在固相上制備式(1)的肽N6-(氨基亞氨基甲基)-N2-(3-巰基-1-氧代丙基-L-賴氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨?；?L-色氨酰基-L-脯氨?；?L-半胱酰胺，環(huán)狀(1→6)-二硫化物的方法， 式(1)所述方法包含a.通過偶聯(lián)，借助肽鍵彼此直接相連，在固體載體樹脂上以所要求的順序組裝包含六個氨基酸和一個巰基烷基硫代烷基羧酸的肽鏈，以獲得如以下給出的式(2)的肽鍵合的樹脂；(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂式(2)b.在每次偶聯(lián)之后用乙酸酐使游離氨基封端；c.從樹脂上解離并脫保護步驟(a)的肽的除acm基團以外的所有基團，以獲得如以下給出的式(3)的肽酰胺(AAcm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(BAcm)-CONH2式(3)d.在有機溶劑中在ε-賴氨酸-NH2處鳥苷酸化肽，接著用另一溶劑沉淀，通過用另一溶劑沉淀，以獲得如以下給出的式(4)的肽(AAcm)CysMpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(BAcm)-CONH2式(4)e.在合適的溶劑中用重金屬鹽處理式(4)的肽，接著使用有機溶劑沉淀重金屬-肽鹽，以獲得式(5)的重金屬-肽鹽； 式(5)f.用硫醇處理步驟(e)的重金屬-肽鹽，接著脫鹽和氧化，以獲得式(1)的肽；和g.通過RPHPLC單獨或與HIC和IEC色譜技術(shù)結(jié)合，純化步驟(f)或(g)的粗肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中化合物的氨基和羧基當量的反應(yīng)形成所述肽鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中被保護的第一氨基酸的C端通過連接體鍵合到固相上，以獲得固相鍵合的氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所使用的固體載體是任何酰胺樹脂，優(yōu)選Rink酰胺樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第一被保護的氨基酸是硫羥基保護的Fmoc半胱氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在用連接體解離樹脂中導(dǎo)致釋放已組裝的肽酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中肽酰胺化合物是通過肽鍵連接到每一端基官能度上的化合物，且其中每一端基官能度是氨基或羧酸基或其衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所使用的氨基酸選自由Cys、Pro、Trp、Asp、Lys、Gly、Arg、Har、Leu和Glu組成的組中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所使用的巰基烷基硫代烷基羧酸是2-巰基丙酸硫代丙酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，氨基酸的-NH2官能團的保護基是Fmoc或Boc。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中-COOH官能團的保護基是未保護的或者被保護的O-tBu酯或者游離的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中SH-官能的保護基是Acm基。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(c)中，以確定的比例使用試劑TFA、TIS、EDT、DCM、苯酚和水，優(yōu)選TFA(85-98％)∶TIS(0-5％)∶H2O(0-5％)∶EDT(0-5％)∶苯酚(0-5％)，更優(yōu)選TFA(94.5-95.5％)∶TIS(0-2.5％)∶H2O(0-3％)∶EDT(0-2.5％)，從固體載體樹脂上解離該肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中，用于鳥苷酸化的有機溶劑選自由DMF、乙醇和甲醇組成的組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中，通過實施使用選自由丙酮、乙腈、甲醇、醚、戊烷、己烷及其混合物組成的組中的溶劑，進行式(4)的肽的沉淀。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中優(yōu)選實施使用乙腈進行沉淀。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(g)中，所得式(1)的肽的純度大于99％。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用Fmoc化學(xué)，進行通過固相合成制備式(1)的肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中氨基酸的組裝得到式2的肽鍵合的樹脂(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂式(2)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中，優(yōu)選通過使用在DMF中的溶劑，進行實施式3的肽的鳥苷酸化。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過RP-HPLC，可進行式(4)的肽的純化。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于處理式(4)的肽的重金屬鹽是在TFA中的三氟甲烷磺酸銀。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中優(yōu)選使用醚溶劑，和更優(yōu)選二異丙醚，進行式(5)的重金屬-肽鹽的沉淀 式(5)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(f)中，可用HCl和DMSO處理重金屬-肽鹽，以同時除去重金屬并氧化所得肽，得到式(1)的粗肽酰胺。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中可通過RP-HPLC純化式(1)的粗肽酰胺。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中優(yōu)選通過RP-HPLC，使用C-4、C-8或C-18二氧化硅或聚合物反相柱，使用甲醇和/或乙腈單獨或與含水TFA(0-0.5％)結(jié)合作為流動相，進行式(1)的粗肽酰胺的純化。
27.式(2)的中間體肽(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(“Acm)-樹脂式(2)。
28.式(3)的中間體肽(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2式(3)。
29.式(4)的中間體肽(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2式(4)。
30.式(5)的中間體肽鹽 式(5)。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備式(1)的N
文檔編號C07K1/06GK1968961SQ200480043109
公開日2007年5月23日 申請日期2004年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月14日
發(fā)明者蒂夫亞·拉爾·撒克森納, 施力康德·米施拉, 錢德拉克散·穆拉利德哈蘭, 米林德·撒卡利, 尼賴施·帕蒂爾, 阿魯納·克哈利 申請人:Usv有限公司