專(zhuān)利名稱(chēng)：朊病毒的色譜分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域海綿狀腦病是哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，其造成過(guò)早癡呆，而且一般都是致命性的。這種腦病中的一些是涉及人類(lèi)的，例如，皮質(zhì)-紋狀體-脊髓變性癥、庫(kù)魯病、腦頂枕葉綜合癥、羊痢疾、牛海綿狀腦病等。雖然有很強(qiáng)的證據(jù)表明這些疾病都是由共同的病原體或一些緊密相關(guān)的病原體所引起的，但是，對(duì)這些病原體的本質(zhì)的了解還很少[Prusiner，Science 2521515-1522(1991)]。不斷增長(zhǎng)的證據(jù)建議，轉(zhuǎn)譯后修飾的抗蛋白酶形式的宿主細(xì)胞蛋白在致病性方面起著重要的作用，但是，尚不清楚的是，是否這種被修飾的蛋白自身就是病原體或它僅僅是病原體的必要組成部分。這種蛋白已經(jīng)被定名為朊病毒蛋白(此后簡(jiǎn)稱(chēng)為“PrP”)，而海綿狀腦病的致病物被稱(chēng)為朊病毒。
一般而言，雖然它們不是傳染性的，但是，已經(jīng)有證據(jù)表明，在某些條件下，有一些海綿狀腦病可以從一個(gè)動(dòng)物個(gè)體傳遞到另一個(gè)動(dòng)物個(gè)體，而且，在一些病例中，可以發(fā)生物種之間的傳遞。例如，在七十年代報(bào)道的一系列皮質(zhì)-紋狀體-脊髓變性癥的病例中，那些患病個(gè)體都經(jīng)過(guò)從收集的垂體提取的人生長(zhǎng)激素的治療[Brown et al.，N.Eng.J.Med.313728-731(1985)]。據(jù)信，第一例牛海綿狀腦病是因?yàn)槲廴镜氖澄飳⒀蛄〖矀魅窘o小牛而引發(fā)的。另外，將被污染的羊的組織顱內(nèi)注射給小鼠后，已經(jīng)建立了羊痢疾的鼠模型。
對(duì)組織中或其它的生物產(chǎn)品中的朊病毒的鑒定方法，目前仍然依靠用被懷疑的物質(zhì)的提取物對(duì)小鼠或倉(cāng)鼠進(jìn)行感染后的檢測(cè)。但是，由于對(duì)這些疾病的培養(yǎng)的時(shí)間可以長(zhǎng)達(dá)一年甚至更長(zhǎng)，因此，這些鑒定方法是即費(fèi)時(shí)，又昂貴的。
與朊病毒有關(guān)的疾病的普遍發(fā)生以及可能發(fā)生物種間的傳染都對(duì)生物工業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的影響，因?yàn)樯锕I(yè)從哺乳動(dòng)物的組織中獲取眾多的產(chǎn)品[Di Martino，Biologicals 2161-66(1993)]。對(duì)這些產(chǎn)品的安全性的關(guān)注導(dǎo)致了對(duì)朊病毒的滅活的眾多研究。這些研究表明，朊病毒比更為常規(guī)的病原體如病毒和細(xì)菌等都更具有對(duì)滅活的抵抗性。因此，對(duì)于含有朊病毒的生物材料的凈化就需要更為猛烈的條件。目前所知道的對(duì)含有高效價(jià)朊病毒的生物材料的消毒方法僅有長(zhǎng)時(shí)間的在130℃或更高溫度下的蒸煮消毒和用高濃度的氫氧化鈉溶液進(jìn)行處理。這些方法已經(jīng)被推薦為常規(guī)的朊病毒滅活方法[Department of Health and Social SecurityCircular 8416(1989)]。還被報(bào)道過(guò)的是，以100kD為限的超濾并結(jié)合用6M的脲的處理也得到了對(duì)含有朊病毒的制劑的消毒結(jié)果[Pocchiari et al.，Arch.Virol.98131-135(1988)]。其它的降低朊病毒活性的方法包括用有機(jī)溶劑、清潔劑、蛋白變性劑、離液序列高的鹽和酚來(lái)進(jìn)行處理[Millson et al.，in Prusiner and Hadlow，eds.Slow Transmissible Diseases of the Nervous System，vol.II.New YorkAcademic Press 409-424(1979)；Prusiner et al.，PNAS784606-4610(1981)；Kimberlin et al.，J.Neurol.Sci.59390-392(1983)；Walker et al.，Am.J.Public Health 73661-665(1983)；Brown et al.，J.Infect.Dis.1531145-1148(1986)]。
去除朊病毒的傳染性所需要的極端化條件一般都與保存生物分子的有用活性的方法不相容，結(jié)果造成眾多生物分子變性和基本上破壞了它們的活性。因此，就需要有能夠在不使所需要的生物活性受到損害的條件下對(duì)朊病毒進(jìn)行滅活或?qū)⑵鋸纳锊牧现蟹蛛x出來(lái)的方法。
本發(fā)明的概述在本發(fā)明涉及將朊病毒從含有朊病毒和至少一種其它的生物分子的溶液中分離出來(lái)的方法。
本發(fā)明的方法包括的步驟有，在造成梯度洗脫的條件下將溶液通過(guò)陰離子交換色譜柱，將朊病毒與該至少一種的另外的生物分子分離，使所述的生物分子被收集在與含有朊病毒的洗脫組分不相同的洗脫組分中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從含有朊病毒和血紅蛋白的溶液中去除朊病毒的方法。該方法包括的步驟有，在造成梯度洗脫的條件下將溶液通過(guò)陰離子交換色譜柱。將朊病毒與血紅蛋白分離，洗脫的朊病毒所在的組分不同于含有血紅蛋白的組分。
本發(fā)明的方法可以在溫和條件下進(jìn)行，不用加熱、強(qiáng)堿或氧化劑。因此，本發(fā)明能夠在有其它的生物分子存在并且不顯著地影響這些生物分子的活性的條件下，將朊病毒從中分離出來(lái)。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述本發(fā)明方法的特征和其它的細(xì)節(jié)都將在下面給以更為詳細(xì)的描述，并且在權(quán)利要求書(shū)中給予指明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施方案都是以說(shuō)明本發(fā)明來(lái)進(jìn)行的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。在不違背本發(fā)明的精神和不離開(kāi)本發(fā)明的范圍的條件下，本發(fā)明的主要特征都可以用在各種不同的實(shí)施方案中。
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了對(duì)加有朊病毒的小牛血紅蛋白溶液以陰離子交換柱進(jìn)行色譜可以將令人驚奇高水平的朊病毒感染性從洗脫的血紅蛋白組分中去除掉。本發(fā)明的將朊病毒從包括朊病毒和至少一種其它的生物分子的溶液中去除的方法包括將該溶液在形成pH梯度洗脫的條件下通過(guò)陰離子交換色譜柱。這樣，朊病毒就被與至少一種生物分子相分離，也就是說(shuō)，至少一種生物分子從色譜柱上洗脫在與含有朊病毒的組分不同的組分中。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“朊病毒”指的是作為引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病劑的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“致病劑”指的是引起疾病的物質(zhì)或是引起疾病的體系中的必要成分。與朊病毒有關(guān)的疾病包括各種海綿狀腦病，例如，人的皮質(zhì)-紋狀體-脊髓變性癥、庫(kù)魯病、腦頂枕葉綜合癥、羊痢疾、牛海綿狀腦病、以及可傳染的猴類(lèi)腦病等。朊病毒可以是蛋白質(zhì)，例如，轉(zhuǎn)錄后修飾的PrP蛋白質(zhì)，也可以是帶有信息分子如聚核苷酸的蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如，聚脫氧核苷酸與轉(zhuǎn)錄后修飾的PrP蛋白質(zhì)的復(fù)合物。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“生物分子”指的是任何生物來(lái)源的分子，包括蛋白質(zhì)，如酶、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多肽，荷爾蒙如生長(zhǎng)激素、胰島素和類(lèi)固醇激素，聚核苷酸，糖，和脂肪等。在本文中，優(yōu)選的生物分子是具有已經(jīng)證實(shí)了的用途或具有潛在用途的蛋白質(zhì)、多肽、以及聚核苷酸等。
可以用于對(duì)陰離子交換色譜柱進(jìn)行洗脫的適宜的pH梯度包括，如連續(xù)pH梯度，其中的洗脫液的pH是時(shí)間的函數(shù)而連續(xù)變化的。連續(xù)pH梯度的例子有線性pH梯度，其中的pH的變化是時(shí)間的線性函數(shù)。建立連續(xù)pH梯度時(shí)，可以將兩種或兩種以上的具有不同pH值的緩沖液混合后形成洗脫液。在洗脫液中各種緩沖液的比率以及所實(shí)現(xiàn)的洗脫液的pH值都可以作為時(shí)間的函數(shù)而連續(xù)變化。一般采用流量控制器來(lái)對(duì)緩沖液的混合過(guò)程進(jìn)行控制，具體根據(jù)所需要的pH梯度而確定。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，pH梯度可以是分階式的pH梯度，其中的pH對(duì)時(shí)間的變化是不連續(xù)的，造成一階或更多個(gè)階，或者在不同的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生pH值的突然變化。具體的方法是用具有不同的pH值的第二種緩沖液取代第一種緩沖液而作為洗脫液。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的是分階式pH梯度。
在一種具體進(jìn)行分階式pH梯度洗脫的方法中，具有不同的pH值的一系列緩沖液被逐一按順序地加入到色譜柱中。優(yōu)選的是，緩沖液是經(jīng)過(guò)了過(guò)濾的，例如通過(guò)10,000道爾頓的脫熱源膜過(guò)濾。使用的緩沖液應(yīng)該是離子強(qiáng)度低的一價(jià)緩沖液，這樣，對(duì)溶液中的成分的洗脫將依據(jù)pH值來(lái)進(jìn)行，而不是主要依據(jù)離子強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。通常，離子強(qiáng)度為50mM或更低的緩沖液是適宜的。
適用于本發(fā)明方法的陰離子交換介質(zhì)的例子有，二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂、衍生的聚合物或共聚物，例如聚丙烯酰胺、聚羥乙基異丁烯酸、以及苯乙烯-二乙烯苯等，它們被陽(yáng)離子功能團(tuán)如二乙基氨乙基或四氨乙基基團(tuán)所修飾了。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，陰離子交換介質(zhì)是硅膠為基礎(chǔ)的。該介質(zhì)是用對(duì)硅膠進(jìn)行水熱處理來(lái)加大孔徑，隨后將該硅膠暴露于(γ-甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷來(lái)形成活性的表面環(huán)氧基團(tuán)。然后，將這種被衍生的硅膠用叔胺處理，如用HOCH2CH2N(CH3)2處理來(lái)形成表面季胺基團(tuán)。
陰離子交換色譜柱可以是重力柱，即流動(dòng)相在柱中的運(yùn)動(dòng)是由重力造成的。流動(dòng)相還可以受到柱的入口和出口之間的壓力差別的作用，例如，在將樣品裝入柱內(nèi)后再把加壓的流體送入柱的進(jìn)口。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，陰離子交換色譜柱是高效液相色譜柱。
在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液包括朊病毒和血紅蛋白，例如小牛血紅蛋白。在該實(shí)施方案中，用第一緩沖液將溶液加入到色譜柱內(nèi)的介質(zhì)上并促進(jìn)血紅蛋白與介質(zhì)的結(jié)合。然后，用第二緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH，洗脫非血紅蛋白的各種成分，如朊病毒。然后用第三緩沖液洗脫血紅蛋白，此時(shí)的血紅蛋白基本不含有朊病毒。含有血紅蛋白的洗脫組分的最開(kāi)始和最后的部分可以被丟棄，例如，丟棄最開(kāi)始的3-4％和最后的3-4％的部分，從而保證血紅蛋白的純度。
優(yōu)選地，第一緩沖液是三-羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液(濃度為約20mM，pH范圍在約8.4-9.4之間)。第二緩沖液是第一緩沖液和第三緩沖液的混合物，其中的第二緩沖液的pH在約8.2-8.6的范圍內(nèi)。第三緩沖液是Tris溶液(濃度為約50mM，pH在約6.5-7.5之間)。第四緩沖液是NaCl/Tris溶液(約1.0MNaCl和約20mM Tris；pH范圍是約8.4-9.4，優(yōu)選約8.9-9.1)。特別優(yōu)選的是，第二緩沖液的pH范圍在8.2-8.4之間。
一般所使用的緩沖液的溫度范圍是約0℃-50℃。使用時(shí)的優(yōu)選的溫度范圍是約12.4±1.0℃。此外，一般將緩沖液保存在約9℃-11℃的溫度下。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將溶液用超濾膜過(guò)濾。這一步驟可以在陰離子交換色譜之前或之后進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶液在加入到陰離子交換色譜柱之前，先經(jīng)過(guò)超濾膜如100,000道爾頓超濾膜過(guò)濾。適用于本發(fā)明方法的超濾膜包括可以從Millipore公司(Bedford，MA catalog No.CDUF050H1)和A/G Technology公司(Needham，MA，Model No.UFP100E55)購(gòu)買(mǎi)的100,000道爾頓超濾膜。
在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液包括屬于牛海綿狀腦病的致病劑的朊病毒和第二種牛的蛋白質(zhì)。該第二種牛的蛋白質(zhì)可以是牛血紅蛋白、牛生長(zhǎng)激素、牛免疫球蛋白、牛胰島素、牛血清球蛋白、牛抑肽酶、牛轉(zhuǎn)鐵球蛋白、牛血清、牛凝血酶、和牛纖維蛋白原等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二種牛的蛋白時(shí)牛血紅蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，溶液包括作為海綿狀腦病的致病劑的朊病毒，如作為皮質(zhì)-紋狀體-脊髓變性癥、庫(kù)魯病、腦頂枕葉綜合癥、羊痢疾等致病劑的朊病毒，以及一種或一種以上的來(lái)源于人或其它的動(dòng)物的生物分子，例如，蛋白質(zhì)或荷爾蒙。適宜的生物分子包括血紅蛋白、胰島素、生長(zhǎng)激素、促性腺激素、髓磷脂、膠原、彈力蛋白、血清、血清蛋白、乳清蛋白、抗體和抗血清、因子VIII、因子IX、前凝血酶和凝血酶、紅細(xì)胞生成素、組織纖維蛋白溶酶原激活子、血小板激活因子、蛋白酶、蛋白酶抑制因子、干擾素、白細(xì)胞介素、以及細(xì)胞因子等。
現(xiàn)在將用以下的實(shí)施例進(jìn)一步具體描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1采用陰離子交換色譜對(duì)牛血紅蛋白的純化牛血紅蛋白溶液的制備牛血紅蛋白溶液的制備按照在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第08/473,497號(hào)中所描述的方法來(lái)進(jìn)行。首先，收集牛全血的樣品，與抗凝固劑檸檬酸鈉混合形成檸檬酸化的血溶液，然后，分析其內(nèi)毒素水平。收集到血溶液的樣品后，將其保存在2℃的溫度下，然后將其用600目的篩子過(guò)濾去除大的凝集塊和顆粒。
然后將檸檬酸化的血溶液按順序通過(guò)800μm和50μm的聚丙烯過(guò)濾器來(lái)去除血溶液中大的碎片。
然后對(duì)紅血細(xì)胞進(jìn)行清洗，從紅血細(xì)胞中分離出細(xì)胞外血漿蛋白質(zhì)，例如BSA或IgG。在清洗紅血細(xì)胞時(shí)，先將血溶液放在透析過(guò)濾容器內(nèi)，然后用等體積的已經(jīng)被10,000道爾頓超濾膜(從Millipore公司購(gòu)買(mǎi)，Bedford，MA catalog No.CDUF 050G1)過(guò)濾的等滲溶液稀釋。該等滲溶液包括6.0g/L二水合檸檬酸鈉和8.0g/L存在與注射用水中的氯化鈉。
然后，用0.2μm的空心纖維透析過(guò)濾器(Microgon Krosflo II微過(guò)濾芯，Spectrum/Microgon，Laguna Hills，CA)將被稀釋的血溶液濃縮回原來(lái)的體積。同時(shí)，連續(xù)地將已經(jīng)過(guò)濾了的等滲溶液作為補(bǔ)充以相等于過(guò)濾的損失率的速率加入進(jìn)去。在透析過(guò)濾中，明顯地小于紅血細(xì)胞的血液成分或溶于溶液中的成分如血漿溶質(zhì)等，都通過(guò)了含有過(guò)濾介質(zhì)的透析過(guò)濾器的外壁。稀釋的血溶液中的紅血細(xì)胞、血小板、和個(gè)體比較大的成分如白細(xì)胞等就被保留在連續(xù)加入的等滲溶液中而形成透析的血溶液。
清洗紅血細(xì)胞時(shí)，將被稀釋的血溶液保持在大約10-25℃的溫度下，在透析過(guò)濾器入口處的液體壓力為約25-30psi以提高效率。
當(dāng)被透析過(guò)濾出的液體達(dá)到用等滲溶液稀釋前的血溶液體積的約600％時(shí)終止對(duì)紅血細(xì)胞的清洗。
然后將透析過(guò)的血溶液以每分鐘約4升的速率泵入安裝有28號(hào)環(huán)封的離心機(jī)(Sharples Super Centrifuge Model No.AS-16，Sharpies Division of Alfa-Laval Separation，Inc.)內(nèi)。離心的同時(shí)，加入被透析的血溶液，將紅血細(xì)胞與白細(xì)胞和血小板分離開(kāi)來(lái)。進(jìn)行離心的時(shí)候，轉(zhuǎn)速要足以使血液被分離為重的紅血細(xì)胞部分和輕的白細(xì)胞部分，一般為15,000rpm。在離心的過(guò)程中，不斷地將紅血細(xì)胞部分與白細(xì)胞部分相分離，并從離心機(jī)中排放出來(lái)。
分離完成后，對(duì)紅血細(xì)胞進(jìn)行溶胞，得到含有血紅蛋白的溶液。當(dāng)紅血細(xì)胞被從離心機(jī)中釋放出來(lái)的時(shí)候，由于紅血細(xì)胞相的液體流與排放它們的管道之間的一定角度所造成的相互沖擊力，所以大部分的紅血細(xì)胞的細(xì)胞壁都已經(jīng)被機(jī)械地溶胞了，并將血紅蛋白從紅血細(xì)胞中釋放到該紅血細(xì)胞相中。
被溶胞了的紅血細(xì)胞相通過(guò)其排放管道進(jìn)入靜電混合器(Kenics 1/2英寸，六片扇葉Chemineer，Inc.)。與此同時(shí)，將等體積的WFI加入到該靜電混合器中使WFI與紅血細(xì)胞相發(fā)生混合。紅血細(xì)胞相以及WFI進(jìn)入靜電混合器的流速各自都是約每分鐘0.25升。
將紅血細(xì)胞相與WFI在靜電混合器中的混合產(chǎn)生溶胞了的紅血細(xì)胞膠體。然后，將該膠體轉(zhuǎn)移到Sharples Super離心機(jī)(型號(hào)為AS-16)中，該離心機(jī)適合于將血紅蛋白與其它的非血紅蛋白的紅細(xì)胞成分互相分開(kāi)。離心時(shí)的轉(zhuǎn)速要足以使溶胞了的紅血細(xì)胞膠體被分離為輕血紅蛋白相和重血紅蛋白相。輕血紅蛋白相包括血紅蛋白和密度低于重血紅蛋白非血紅蛋白成分。
將血紅蛋白相從離心機(jī)中釋放出來(lái)，通過(guò)0.45μm的PelliconCassette微過(guò)濾器(Millipore Corporation，cat.no.HVLP 000 C5)進(jìn)入存放容器以用于血紅蛋白的提純。然后，將細(xì)胞質(zhì)同離心機(jī)中的滯留物一起進(jìn)入存放容器。在微過(guò)濾中，存放容器的溫度保持在10℃或更低的溫度。為了提高效率，當(dāng)把在微過(guò)濾器入口處的流體的壓力從開(kāi)始的約10psi提高到約25psi時(shí)，微過(guò)濾完成。經(jīng)過(guò)微過(guò)濾后的血紅蛋白被轉(zhuǎn)移到微過(guò)濾物的存放容器內(nèi)。此時(shí)，將微過(guò)濾物分為樣品A和樣品B兩部分。樣品A在此時(shí)不進(jìn)行進(jìn)一步的提純。
將樣品B用泵送入100,000道爾頓的超濾器(MilliporeCorporation，cat.No.CDUF 050 H1)。在微過(guò)濾物中的大部分血紅蛋白和水都通過(guò)超濾器而形成超濾物，而比較大的微過(guò)濾成分如分子量大于約100,000道爾頓的蛋白質(zhì)等就被超濾出來(lái)并循環(huán)回到微過(guò)濾物存放容器內(nèi)。與此同時(shí)，WFI被連續(xù)地加入到微過(guò)濾物的存放容器內(nèi)來(lái)補(bǔ)足超濾中損失的水分。繼續(xù)進(jìn)行超濾，直到在微過(guò)濾物存放容器內(nèi)的血紅蛋白的濃度低于8克/升。在超濾中，微過(guò)濾物存放容器內(nèi)的溫度保持在約10℃。
然后，將血紅蛋白的超濾物轉(zhuǎn)移到超濾物存放容器內(nèi)，循環(huán)通過(guò)30,000道爾頓的超濾器(Millipore Corporation，cat.No.CDUF 050 T1)來(lái)去除小的細(xì)胞成分，例如，電解質(zhì)、代謝的中間產(chǎn)物、水、和分子量低于30,000道爾頓的蛋白質(zhì)。這樣，就得到濃縮了的血紅蛋白溶液，其含有約每升100克的血紅蛋白。在此時(shí)，終止對(duì)樣品B的初始純化。
陰離子交換色譜介質(zhì)的制備用70℃的存在于水中的(γ-甘油脫氧丙基)三甲氧硅烷來(lái)處理硅膠，得到帶有表面環(huán)氧基團(tuán)的衍生硅膠。然后，將該衍生的硅膠用N，N-二甲基乙醇胺(OHCH2CH2)N(CH3)2處理，得到帶有表面季胺基團(tuán)的衍生硅膠。
用羊痢疾致病劑對(duì)樣品的感染在本研究中使用的羊痢疾致病劑(scrapie agent)是從Instituteof Animal Health，Edinburgh，Scotland被許可來(lái)的小鼠適應(yīng)ME-7的品系。其原始的來(lái)源是天然的對(duì)Suffolk羊的感染性痢疾。將這些被感染了的羊的腦子提取物經(jīng)過(guò)對(duì)Moredun隨機(jī)培育的小鼠的兩代傳遞、經(jīng)過(guò)C57BL/6N的九代傳遞、經(jīng)過(guò)C3H小鼠的一代傳遞、以及對(duì)C57BL/6N的另一代傳遞。在本研究中使用的感染材料是經(jīng)過(guò)了13代傳遞的。
樣品A(180mL)用20mL體積的羊痢疾致病物感染，得到樣品A’。樣品A’的等份試樣被保留下來(lái)進(jìn)行“證實(shí)感染”的檢測(cè)，其余的就按照上述對(duì)樣品B的方式進(jìn)行100,000道爾頓的超濾。得到的超濾物被稱(chēng)為樣品A”，對(duì)其按照實(shí)施例2進(jìn)行羊痢疾感染性的檢測(cè)。
對(duì)20mL樣品B的等份試樣用2mL的羊痢疾致病物進(jìn)行感染，得到樣品B’。樣品B’的等份試樣被保留下來(lái)進(jìn)行“證實(shí)感染”的對(duì)照檢測(cè)。其余的被感染的樣品進(jìn)行陰離子交換色譜。將被感染的樣品B’通過(guò)色譜柱內(nèi)的介質(zhì)，通過(guò)陰離子交換的高效液相色譜對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化。色譜柱的內(nèi)徑為8英寸，長(zhǎng)度為24英寸。色譜柱內(nèi)的介質(zhì)是上述的硅膠介質(zhì)。
對(duì)該色譜柱用促進(jìn)血紅蛋白結(jié)合的緩沖液進(jìn)行預(yù)處理。然后，按照每分鐘1.78升的速率將樣品B’加入到色譜柱內(nèi)。然后，將三種不同的緩沖液通過(guò)該色譜柱來(lái)在色譜柱內(nèi)產(chǎn)生pH梯度，對(duì)血紅蛋白進(jìn)行洗脫。每一種所用的緩沖液的溫度都是約12.4℃。在將各緩沖液加入到色譜柱內(nèi)之前，先讓它們通過(guò)10,000道爾頓的超濾膜(Millipore Corporation，cat.No.CDUF 050 G1)。每一種緩沖液的流速是每分鐘3.56升。
第一種緩沖液是20mM的三-羥甲基胺甲烷(Tris，pH范圍是約8.4-9.4)，它將被濃縮的血紅蛋白溶液加入到色譜柱內(nèi)的陰離子交換介質(zhì)上。第二種緩沖液是pH為約8.3的由第一種緩沖液和第三種緩沖液組成的混合物，它對(duì)色譜柱內(nèi)的pH進(jìn)行調(diào)整，使感染成分被洗脫，而血紅蛋白被保留。用第二種緩沖液連續(xù)平衡約30分鐘。第二種緩沖液所洗脫下來(lái)的部分被作為廢物丟棄掉。第三種緩沖液是50mM的Tris(pH范圍是約6.5-7.5)，它將血紅蛋白從色譜柱上洗脫下來(lái)。最開(kāi)始的3％和最后的4％血紅蛋白洗脫部分被作為廢物丟棄掉。其余的血紅蛋白洗脫部分，即現(xiàn)在稱(chēng)為樣品B”的洗脫部分，按照實(shí)施例2所述進(jìn)行羊痢疾感染活性的檢測(cè)。
實(shí)施例2從牛血紅蛋白制劑中去除朊病毒的方法的確認(rèn)對(duì)上述的去除方法的確認(rèn)是在專(zhuān)門(mén)登記的設(shè)施中進(jìn)行的，所遵循的程序符合美國(guó)食物和藥品管理局的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)定(21CFR 58)、英國(guó)GLP規(guī)定的程序、和日本GLP的規(guī)定和OECD實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)定原則[U.S.Food and Drug Administration GoodLaboratory Practice Regulation(21 CFR 58)，the United KingdomGLP Compliance Programme，the Japanese GLP Standard and theOECD Principles of Good Laboratory Practice]。
通過(guò)活體內(nèi)檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)羊痢疾感染性的各種溶液是1)用來(lái)對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行感染的羊痢疾致病物溶液；2)樣品A’；3)樣品A”；4)樣品B’；5)樣品B”。
體內(nèi)檢測(cè)對(duì)羊痢疾感染性的檢測(cè)是由Microbiological Associates，Rockville，MD，按照公開(kāi)的方法[Chesebro，SpongiformEncephalopathiesthe Trasmissible Agents，in Virology，F(xiàn)ields，Knipe，et al.，eds.Raven Press LTD.New York，Chapter 81，pp.2325-2336(1990)]進(jìn)行的。該方法涉及用被測(cè)試的溶液的等份試樣接種小鼠，監(jiān)視小鼠的羊痢疾感染的臨床特征，并確定一年內(nèi)的存活率。
對(duì)下述溶液檢測(cè)了它們的羊痢疾感染性感染材料、樣品A’(澄清的和未澄清的)、樣品A”、樣品B’、以及樣品B”。對(duì)這些溶液的一系列的稀釋如下感染材料，稀釋因子1(未稀釋)、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、以及10-8；未澄清的樣品A’，稀釋因子1；澄清的樣品A’，稀釋因子1、10-1；樣品A”，稀釋因子1、10-1、10-2、10-3、10-4、以及10-5；樣品B’，稀釋因子1、10-1；樣品B”，稀釋因子1、10-1、10-2、10-3、10-4、以及10-5。
雌性C57BL/6小鼠被分為10只或15只一組。對(duì)15只對(duì)照組小鼠不接種，而另一組15只的載體對(duì)照組的小鼠僅用0.020mL的載體接種。其余各組的小鼠分別用0.02mL的實(shí)驗(yàn)溶液的各種稀釋度的等份試樣接種。
在365天內(nèi)監(jiān)視羊痢疾感染的臨床特征。羊痢疾最終疾病特征包括對(duì)大的噪音的敏感、排尿不規(guī)則、毛發(fā)粗糙、行動(dòng)異常、目光呆滯等。對(duì)死亡的小鼠和殺死的小鼠的腦組織進(jìn)行組織學(xué)鑒定，確認(rèn)羊痢疾的感染，腦組織內(nèi)存在的中空結(jié)構(gòu)證實(shí)了對(duì)羊痢疾的感染的診斷。
結(jié)果對(duì)牛血紅蛋白的純化方法的總體描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?8/473,479，該篇文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)在此引述而全部合并于本文。按照該方法的要求制備了兩種牛血紅蛋白溶液，如實(shí)施例1所述，但是，在每一次的純化中，在不同的地方終止純化程序。樣品A進(jìn)行到微過(guò)濾(0.45μm孔徑)為止，而對(duì)樣品B進(jìn)行到透析過(guò)濾(100,000道爾頓分子量的截取)為止。
采用確認(rèn)程序檢驗(yàn)100,000道爾頓超濾步驟和陰離子交換色譜對(duì)樣品的感染性的效果，這些樣品是被小鼠適應(yīng)的ME-7羊痢疾致病物感染的小鼠的腦勻漿物。羊痢疾致病物被用于引起牛海綿狀腦病的致病劑的模型。所使用的方法是小鼠體內(nèi)檢測(cè)法，這是目前僅有的對(duì)朊病毒感染性的檢測(cè)方法。提純目標(biāo)物之前的兩種感染物的樣品作為對(duì)照進(jìn)行感染性檢測(cè)，它們都在365天內(nèi)造成了對(duì)照小鼠的100％死亡率，并且極大部分的小鼠都表現(xiàn)了與羊痢疾感染相吻合的腦組織形態(tài)的改變。與此相對(duì)，經(jīng)過(guò)100,000道爾頓超濾膜或陰離子交換色譜所純化的感染樣品在體內(nèi)檢測(cè)中沒(méi)有羊痢疾感染的癥狀出現(xiàn)。
體內(nèi)檢測(cè)的結(jié)果總結(jié)于下表中。該表中的結(jié)果表明了對(duì)每一組測(cè)試小鼠的在365天研究中的存活數(shù)、表現(xiàn)了羊痢疾臨床特征的小鼠數(shù)、在該研究期間死亡的小鼠數(shù)和殺死的小鼠數(shù)、以及通過(guò)組織病理學(xué)確認(rèn)羊痢疾感染的死亡小鼠數(shù)。
表中的數(shù)據(jù)顯示，用稀釋因子為10-4或更高的感染材料接種的20只小鼠中有19只表現(xiàn)了羊痢疾感染的臨床特征，組織病理學(xué)的檢查確認(rèn)了羊痢疾的感染。在該組中唯一存活的小鼠可能是由接種誤差造成的。
用未澄清的、未稀釋的樣品A’處理的小鼠全部死亡，但是，沒(méi)有表現(xiàn)出羊痢疾的臨床特征。死亡的原因是這種異源性混合物中固體物質(zhì)的毒性引起的。用澄清的樣品A’處理的10只小鼠在表現(xiàn)出羊痢疾臨床特征后都死亡了，用組織病理學(xué)檢查確認(rèn)了其中的9只的羊痢疾感染，另外的一只因?yàn)榘l(fā)生了顯著的自溶胞而無(wú)法用組織病理學(xué)來(lái)鑒定羊痢疾的感染。與此相對(duì)，用稀釋的樣品A”處理的90只小鼠中，86只在研究結(jié)束的時(shí)候依然存活，沒(méi)有任何一只表現(xiàn)了羊痢疾感染的臨床特征，對(duì)死亡的4只小鼠的腦組織的組織病理學(xué)檢查結(jié)果為正常。
用樣品B’接種的5只小鼠全部死亡，其中的4只顯示了臨床和組織病理學(xué)的羊痢疾特征。樣品B”的稀釋物被接種于90只小鼠，其中的84只在研究結(jié)束的時(shí)候依然存活，而死亡的小鼠也沒(méi)有表現(xiàn)出羊痢疾感染的臨床或組織病理學(xué)特征。
這些結(jié)果清楚地表明，被羊痢疾致病物感染的血紅蛋白溶液可以在溫和的條件下被消除污染。通過(guò)100,000道爾頓的超濾或陰離子交換色譜和pH梯度洗脫，所得到的溶液中的羊痢疾感染性被降低到體內(nèi)檢測(cè)的可探察水平之下。
表去除羊痢疾致病物的確認(rèn)研究的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種從包括有朊病毒和血紅蛋白的溶液中去除朊病毒的方法，該方法包括的步驟是將該溶液在造成pH梯度洗脫的條件下通過(guò)陰離子交換色譜柱，其中，所述的陰離子交換色譜柱包含用陽(yáng)離子基團(tuán)衍生的氧化硅，從而將所述的朊病毒收集在一個(gè)洗脫組分中，該洗脫部分從pH在約6.5到約8.3的陰離子交換色譜柱中洗脫出來(lái)，由此，使得該朊病毒與該收集的蛋白分開(kāi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的pH梯度是連續(xù)梯度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的pH梯度是分階梯度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的陰離子交換色譜介質(zhì)選自由氧化硅、氧化鋁、氧化鈦、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥乙酯、或聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)所組成的組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的陽(yáng)離子基團(tuán)是季銨基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括用超濾膜對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的超濾膜截取的分子量為約100,000道爾頓。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白來(lái)自于哺乳動(dòng)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人、牛、豬、羊、或鼠類(lèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的朊病毒是海綿狀腦病的致病物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的海綿狀腦病是羊痢疾、皮質(zhì)-紋狀體-脊髓變性癥、庫(kù)魯病、腦頂枕葉綜合癥或牛海綿狀腦病。
全文摘要
本發(fā)明涉及從含有朊病毒和至少一種其它的生物分子的溶液中分離朊病毒的方法，該方法包括將該溶液經(jīng)過(guò)陰離子交換色譜柱并在形成梯度的條件下洗脫，其中的朊病毒被與該至少一種生物分子相分離，使所述的生物分子被收集在與含有朊病毒的洗脫組分不同的洗脫組分中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的梯度使pH梯度，例如分步梯度。朊病毒可以是病原體，例如，海綿狀腦病的病原體，如皮質(zhì)－紋狀體－脊髓變性癥、腦頂枕葉綜合癥、羊痢疾、牛海綿狀腦病等的病原體。
文檔編號(hào)C07C1/00GK1743340SQ200510003908
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期1997年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月1日
發(fā)明者瑪麗亞·S·加瑞爾, 羅伯特·A·胡特陳斯, 威廉姆·R·賴(lài)特 申請(qǐng)人:柏爾純公司