專利名稱：β－D－二氧戊環(huán)核苷的制藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于治療乙型肝炎病毒(也叫作“HBV”)方法領(lǐng)域，包括施用有效量的一種或多種本文公開的活性化合物或一種這些化合物的藥用可接受衍生物或前藥。
背景技術(shù)：
HBV是僅次于煙草的人體癌癥病因。HBV誘發(fā)癌癥的機(jī)理雖然尚不清楚，但是人們假定它直接引發(fā)腫瘤發(fā)展，或者通過感染涉及的慢性炎癥、肝硬變和細(xì)胞再生而間接引起腫瘤發(fā)展。
HBV在世界范圍內(nèi)已達(dá)到流行病程度。經(jīng)過2至6月宿主不知道的感染潛伏期之后，HBV感染能夠?qū)е录毙愿窝缀透螕p傷，引起腹痛、黃疸和某些酶在血液中的升高的濃度。HBV能夠造成暴發(fā)性肝炎，一種快速進(jìn)行性和常常是致命的大面積肝受破壞的疾病。
患急性肝炎的病人一般能復(fù)原。但是，在一些患者血液中，長期或無限期地存在高水平的病毒抗原，造成慢性感染。慢性感染能導(dǎo)致慢性持久性肝炎。被慢性持久性HBV感染的病人，在發(fā)展中國家最普遍。截止到1991年中，僅在亞洲就有大約二億二千五百萬HBV的慢性攜帶者，而世界上幾乎達(dá)三億。慢性持久性肝炎能造成疲勞、肝硬變和肝細(xì)胞癌(一種主要的肝癌)。
在西方工業(yè)化國家中，高HBV感染危險(xiǎn)的人群，包括與HBV攜帶者或與其血樣接觸的那些人。HBV的流行病學(xué)，事實(shí)上與獲得性免疫缺陷綜合征的情況很相似，這說明了為什么HBV感染在愛滋病或HIV有關(guān)的感染病病人中普遍的原因。然而，HBV與HIV相比更具接觸性。
為了使病人對HBV免疫研制出了人血漿源疫苗，已經(jīng)通過遺傳工程生產(chǎn)了一些疫苗。雖然發(fā)現(xiàn)這種疫苗有效，但是其生產(chǎn)因從慢性攜帶者取人血漿受限制而且提純操作既貴又長而帶來麻煩。此外，由不同的血漿制備的每批疫苗還必須在黑猩猩上試驗(yàn)來保證安全，而且這種疫苗無助于已經(jīng)感染上此病毒的病人。
每天用α-干擾素(一種遺傳工程法得到的蛋白質(zhì))治療也證明是有前途的方法。但是迄今為止，尚無有效抑制所說病毒在人體內(nèi)復(fù)制的已經(jīng)藥劑。
鑒于HBV已達(dá)到世界性流行病程度，以及對被感染的病人具有嚴(yán)重的和悲慘的影響，一直迫切需要提供新而有效并且對宿主低毒性的藥劑來治療受此病毒感染的人。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于治療被HBV感染的病人和其他宿主的方法和組合物。
在一種優(yōu)選的方案中，本發(fā)明是一種治療受HBV感染的病人的方法，其中包括施用HBV治療有效量的、對映體純的式(I)所示的β-D-二氧戊環(huán)基嘌呤核苷或其藥物可接受的鹽或衍生物 其中R是OH、Cl、NH2或H，X是選自氫、?；⒁涣姿狨セ?、二磷酸酯基和三磷酸酯基，而且選擇性地輔以藥物可接受載體或稀釋劑。其中R是Cl的所說化合物是(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤。其中R是羥基的所說化合物是(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]鳥嘌呤。其中R是氨基的該化合物是(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]腺嘌呤。其中R是氫的該化合物是(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤。這些化合物的絕對構(gòu)型尚未經(jīng)結(jié)晶學(xué)測定。這些名稱是根據(jù)與制造該化合物所用母糖的構(gòu)型進(jìn)行結(jié)構(gòu)比較得出的。
在另一實(shí)施方案中，給病人施用有效量的β-L二氧戊環(huán)基嘌呤核苷對映體或者所說的-β-L-和β-D-二氧戊環(huán)基嘌呤核苷的外消旋混合物。
所公開的β-二氧戊環(huán)嘌呤核苷或其藥物可接受的衍生物或鹽，或者含這些化合物的藥物可接受制劑，可以用于預(yù)防和治療HBV感染和其它有關(guān)的癥狀，如抗HBV抗體陽性和HBV陽性病狀、由HBV引起的慢性肝炎、肝硬變、急性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性持久性肝炎和疲勞。這些化合物或制劑也可以用于預(yù)防性地阻止或延遲抗HBV抗體或HBV-抗原陽性或者接觸過HBV的個(gè)體中臨床疾病的發(fā)展。
按另一方案，本發(fā)明包括一種治療HBV感染病人的方法，其中包括施用HBV治療有效量的專門公開的對映體純β-D-二氧戊環(huán)基嘌呤核苷的一種前藥。本文使用的“前藥”，指專門公開的核苷的一種藥物可接受的衍生物，用藥時(shí)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成所說的核苷，或者其自身的活性。該活性化合物的藥物可接受的鹽(或叫作“生理可接受的鹽”)以及5′和N6酰化或烷基化的衍生物(也叫作“生理或藥物可接受的衍生物”)是非限定性實(shí)例。在一種方案中，所說的?；且环N羧酸酯，其中所說酯基的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C20烷基、烷氧烷基(包括甲氧甲基)、芳烷基(包括芐基)、芳氧烷基(如苯氧甲基)、芳基(包括未取代的或被鹵素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基任意取代的苯基)、二羧酸(如丁二酸)、磺酸酯(如烷基或芳烷基磺?；?，包括甲磺酰基)、和一、二及三磷酸酯。
本文所用術(shù)語“烷基”，具體包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、正戊基、叔戊基、環(huán)戊基和環(huán)己基。本文所用術(shù)語“酰基”，具體包括(但不限于)乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊?；?、3-甲基丁?；⒍《釂熙セ?、3-氯苯甲酸基、苯甲酰、乙酰、新戊酰、甲磺酸酯基、丙酰、戊酰、己酰、辛酰、癸酰、月桂酰、肉豆蔻酰、棕櫚酰、硬脂酰和油?；?。所說的核苷，了可以像下列參考文獻(xiàn)所公開的那樣以5′醚脂形式提供，這些文獻(xiàn)引入本文作為參考Kucera L.S.N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.J.，D.L.W.和C.Piantadosi在<AIDS Res HumRetroviruses>，6491-501(1990)上發(fā)表的文章“抑制傳染性HIV-1產(chǎn)生和誘導(dǎo)缺陷病毒形成的新膜-內(nèi)活性醚脂類似物”；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F(xiàn).Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N，Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi和E.J.Modest在<J.Med.Chem.>341408-1414(1991)上發(fā)表的文章“抗HIV活性的新醚脂核苷共軛物的合成及評價(jià)”；Hostetler，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk和H.van den在<Antimicrob Agents Chemother>362025-2029(1992)上發(fā)表的文章“利用3’-脫氧胸苷的一種脂前藥-3’-脫氧胸苷二磷酸酯二肉豆蔻酰甘油，顯著提高在CEM和HT4-6C細(xì)胞中I型人免疫缺陷病毒復(fù)制的抑制作用”；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van denBosch和D.D.Richman在<J.Biol Chem.>2656112-7(1990)上發(fā)表的文章“疊氮基胸苷和其他抗病毒核苷的磷脂類似物的合成及抗反轉(zhuǎn)錄病毒活性”。
該β-二氧戊環(huán)基嘌呤核苷可以通過與適當(dāng)?shù)孽セ瘎?如酰鹵或酐)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成藥物可接受的酯。該核苷或其藥物可接受的衍生物可以按傳統(tǒng)方式，例如用適當(dāng)?shù)膲A處理轉(zhuǎn)化成其藥物可接受的鹽。所說的酯或鹽例如通過水解可以轉(zhuǎn)化為所說的母體核苷。
此活性化合物可以以藥物可接受鹽形式提供。本文所用術(shù)語“藥物可接受鹽或配合物”，指保留母體化合物所需生物活性并且顯示出最小(若有的話)不希望之毒理作用的那些核苷的鹽或配合物。這種鹽的非限定性實(shí)例有(a)與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)形成的酸加成鹽，和與有機(jī)酸(如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、雙羥萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸)形成的鹽(b)與陽離子(鈉、鉀、鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等等)形成的堿加成鹽，或與由N，N-二芐亞乙基二胺、銨或乙二胺形成的有機(jī)陽離子形成的堿加成鹽；或(c)(a)和(b)的混合物，如丹寧酸鋅鹽等等。
該活性化合物的改變，特別是在N6和51-O鄰位上的改變，能夠影響該活性物質(zhì)的生物有效度和代謝速度，因而控制活性物質(zhì)的輸送。
該活性化合物或其藥物可接受衍生物或鹽，也可以與不損害所需作用的其他活性物質(zhì)或者與補(bǔ)充所需作用的物質(zhì)如抗生素、抗真菌劑、抗炎藥或其他抗病毒藥(包括抗HBV或抗HIV劑)混合。
在本發(fā)明的一種方案中，將一種或多種所說活性化合物與一種或多種其他抗HBV劑交替施用，以提供有效的抗HBV治療?？梢杂糜诮惶嬷委煹目笻BV劑的實(shí)例包括(但不限于)2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫戊環(huán)(oxathiolane)(“FTC”，見WO 92/14743)的(-)對映體或外消旋混合物、其生理可接受的衍生物或鹽；2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫戊環(huán)(oxathiolane)(也叫作“BCH-189”，或3TC，見EPA 0382526)的(-)對映體或外消旋混合物、其生理可接受的衍生物或鹽，2′-氟-5-碘-阿糖尿嘧啶(FIAU)的對映體或外消旋混合物；2′-氟-5-乙基阿糖尿嘧啶(FEAU)的對映體或外消旋混合物；carbovir或干擾素。
可以采用任何交替方法治療病人。交替法的非限定性實(shí)例，包括在1-6周施用有效量的一種藥劑后，再于1-6周內(nèi)施用有效量的第二種抗HBV藥。此交替方案可以包括不處置期。
按另一方案，該活性化合物或其衍生物或鹽可以與另一種抗HBV藥(包括上列的那些)合并給藥。一般而言，在變替治療，將每種抗HBV藥的有效劑量依次給藥；而在合并治療時(shí)，將兩或多種抗HBV劑按減少的劑量同時(shí)給藥。所說的劑量取決于藥物的吸收、失活和分泌速度以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他因素。應(yīng)注意，劑量的大小也隨所患病癥的嚴(yán)重程度而變化。還應(yīng)當(dāng)知道，對于具體患者、具體劑量制度和計(jì)劃來說，按照個(gè)體的需要和根據(jù)給藥人和監(jiān)督服藥人的專業(yè)判斷，隨時(shí)調(diào)整給藥劑量。


圖1是說明各種對映體純β-D-二氧戊環(huán)基嘌呤核苷的制備方法。
本文所用術(shù)語“對映體純”指這樣一種核苷組成，即其中至少含約95％(優(yōu)選97％)的該核苷單一對映體。
本文所公開的發(fā)明是治療人或其他宿主動物HBV感染的方法和組合物，其中包括施用選擇性地處于藥物可接受載體中的有效量的一種或多種上面所說的化合物或其生理可接受的衍生物(包括5′和/或N6烷基化或?；苌?或生理可接受的鹽。本發(fā)明的化合物或具有抗HBV活性或被代謝為一種或多種顯示抗反轉(zhuǎn)錄病毒活性的化合物。
I.對映體純二氧戊環(huán)核苷的制備對映體純β-D-二氧戊環(huán)核苷可以按下面詳述的方式和按PCT/US91/09124中所述的方式制備。方法包括由1，6-脫氫甘露糖(一種包含所說對映體純最終產(chǎn)物所需的全部立體化學(xué)特征的糖，在此糖的“1”位上(在后來形成的核苷中4’位上)具有正確的非對映體構(gòu)型)出發(fā)，第一步制備(2R，4R)-和(2R，4S)-4-乙酰氧-2-(被保護(hù)氧甲基)二氧戊環(huán)。
此(2R，4R)和(2R，4S)-4-乙酰氧-2-(被保護(hù)氧甲基)二氧戊環(huán)，在SnCl4、其他路易斯酸或三甲基硅烷基triflate存在下，于有機(jī)溶劑如二氯乙烷、乙腈或二氯甲烷中與所需的雜環(huán)堿縮合，生成立體化學(xué)純的二氧戊環(huán)核苷。
制備對映體純二氧戊環(huán)核苷時(shí)，應(yīng)當(dāng)小心避免會使二氧戊環(huán)環(huán)裂開的強(qiáng)酸性條件?？赡艿那闆r下，應(yīng)當(dāng)在堿性或中性條件下完成反應(yīng)；必須在酸性條件下反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)減至最短。
二氧戊環(huán)嘌呤核苷時(shí)的外消旋混合物，可以按EPA 0382526所述制備。用已知方法(包括流經(jīng)所用的手性HPLC柱)可以從外消旋混合物中分離出β-L對映體。
圖1和實(shí)施例1說明了制備活性化合物的方法。原料化合物1按PCT/US91/09124中所述制備(該申請中化合物8)。2，6-二取代的嘌呤衍生物利用乙酸酯1和硅烷化的6-氯-2-氟嘌呤縮合法合成，生成2和3的混合物(α/β＝1/1.3)。再將開始形成的N7-異構(gòu)體在室溫下攪拌過夜轉(zhuǎn)化成N9-異構(gòu)體。利用以CH2Cl2-丙酮(19∶1)作展開劑的制備薄層色譜(TLC)將α，β-混合物分離成單個(gè)異構(gòu)體2和3的方法，得到了分析樣品。但是，為了制備最終產(chǎn)物10-15，在DME中用NH3處理2和3的混合物(Robins，M.J.，Vznanski，B.，在<Can.J.Chem.>1981，2608上的文章“核酸相關(guān)化合物34。用亞硝酸叔丁酯的非水重氮作用。在嘌呤核苷的C-2上引入氟、氯和溴”)，得到10-13的混合物，再將其分離成單個(gè)異構(gòu)體4(24％)、5(18.6％)、6(25.8％)和7(16％)。該鳥嘌呤8和2，6-二氨基9衍生物分別用2-疏基乙醇-甲醇鈉和氨乙醇液處理4的方法制備。用四正丁基氟化銨處理相應(yīng)的5′-硅烷化的核苷得到了高產(chǎn)率的游離核苷10-15。α-異構(gòu)體12和13用與β-異構(gòu)體相似的操作制備。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1對映體純β-D-二氧戊環(huán)基嘌呤核苷的制備(2R，4R)和(2R，4S)-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]-6-氯-2-氟嘌呤(2和3)。
2-氟-6-氯嘌呤(4.05克，23.47mmol)和硫酸銨(催化量)于940ml六甲基二硅氮烷中回流2小時(shí)。無水條件下濃縮形成的溶液，產(chǎn)生硅烷化的2-氟-6-氯嘌呤白色固體。向由硅烷化的2-氟-6-氯嘌呤(5.69克，23.69mmol)和化合物1(7.84克，19.57mmol)在無水二氯甲烷(175ml)中的冷卻(0℃)和攪拌的溶液中，加入TMSOTf(4.41ml，23.44mmol)。反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝財(cái)嚢?6小時(shí)，在此期間內(nèi)最初形成的N7縮合產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化成N9異構(gòu)體。用飽和NaHCO3溶液使反應(yīng)混合物驟冷，并于室溫下再攪拌20分鐘，然后減壓蒸干。殘?jiān)苡谝宜嵋阴?200ml)中，用水和鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，蒸發(fā)得到固體殘?jiān)?，用硅膠柱色譜提純(20％乙酸乙酯的己烷液洗脫)得到β-異頭物8和α-異頭物9的混合物(β∶α＝1.3∶1)，為白色晶狀固體(6.30克，62.8％)。分析樣品用使用CH2Cl2-丙酮(19∶1)作展開劑的制備TLC法純化，得出經(jīng)NMR測定為2(Rf＝0.50)和3(Rf＝0.55)的物質(zhì)UV(甲醇)μmax269.0nm。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]-6-氯嘌呤(4)，(-)-(2R，4R)-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]-2-氟腺嘌呤(5)，㈩-(2R，4S)氨基-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]-6-氯-嘌呤(6)和((+)-(2R，4S)-9-[[2-[(叔丁基二苯基硅烷基)氧]甲基]-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]-2-氟腺嘌呤(7)。
在2和3(6.25克，12.18mmol)于DME(125ml)中攪拌下的溶液中通入干燥NH3氣過夜。減壓蒸發(fā)溶劑，殘余物在硅膠柱上色譜分離四種化合物(20-30％乙酸乙酯的CH2Cl2溶液洗脫)。4(Rf-0.35，1.49克，24％)是白色晶形固體，UV(甲醇)λmax 309.5nm，對(C25H28ClN5O3Si)作了C、H、Cl、N元素分析。5(Rf＝0.21，1.12克，18.6％)，是無色針狀物質(zhì)，UV(甲醇)λmax 261.0，268.0(sh)nm，對(C25H28FN5O3Si)作了C、H、F、N元素分析。6(Rf＝0.43，1.60克，25.76％)，是白色晶狀固體，UV(甲醇)λmax 261.0，269.0(sh)nm，對(C25H28FN5O3Si)作了C、H、F、N元素分析。7(Rf＝0.12，0.96克，16％)是微晶固體，UV(甲醇)λmax 261.0，269.0(sh)nm，對(C25H28FN5O3Si)作了C、H、F、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤(10)。
用1M四正丁基氟化銨-THF(1.1ml，1.1mmol)處理4(0.46克，0.91mmol)在THF(20ml)中的溶液，得到晶狀固體10(RF＝0.50，0.21克，84％)，該固體用甲醇重結(jié)晶UV(H2O)λmax 307.0(ε8370)(pH7)，307.5(ε8590)(pH2)，307.0(ε8800)(pH11)，對(C9H10ClN5O3)作了C、H、Cl、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氟-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]腺嘌呤(11)。
用1M四正丁基氟化銨-THF(1.35ml，1.35mmol)處理5(0.56克，1.12mmol)在THF(20ml)中的溶液，得出白色晶狀固體22(0.24克，85％)，該固體用甲醇重結(jié)晶UV(H2O)λmax260.8nm(ε17010)，268.5(sh)nm(ε13510)(pH7)，261.0(ε16390)，268.5(sh)(ε13300)(pH2)，260.8(ε16700)，268.5(sh)(ε13200)(pH11)。對(C9H10FN5O3)作了C、H、F、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]鳥嘌呤(14)。
水4(0.29克，0.57mmol)、巰基乙醇(0.51ml)和1.0M甲醇鈉-甲醇(11.5ml)在甲醇(20ml)中的混合物回流3小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻并用冰醋酸中和，溶液蒸干后用CHCl3研制殘余物。過濾后將濾液蒸干，得到粗產(chǎn)物8(0.21克，75％)此物質(zhì)不經(jīng)提純直接進(jìn)行脫硅烷處理，得到微晶狀固體化合物3(0.07克，61％)，該固體用甲醇重結(jié)晶UV(H2O)λmax252.0nm(ε8730)(pH7)，254.4(ε12130)，277.5(sh)(ε8070)(pH2)，264.3(ε10800)(pH11)，對(C9H11N5O4)作了C、H、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]腺嘌呤(15)。
在鋼彈中加入化合物4(0.28克，0.55mmol)和用NH3飽和的無水乙醇(20ml)，在90℃加熱6小時(shí)。冷卻后，真空蒸除溶劑得到化合物9(0.26克，95％)，然后按制備12所述同樣操作脫硅烷，得到白色微針狀化合物15(0.10克，75％)，從甲醇中重結(jié)晶UV(H2O)λmax 279.0nm(ε8040)(pH7)，290.0(ε7070)(pH2)，278.8(ε7580)(pH11)，對(C9H12N6O3)作了C、H、N元素分析。
(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤，可以用各種還原劑包括披鈀炭和氫氣或者三丁基氫化錫和偶氮雙異丁腈還原化合物10的方法制備。
II二氧戊環(huán)核苷的抗HBV活性可以用各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)測量β-D-二氧戊環(huán)核苷抑制HBV的能力。本文所用的評價(jià)所公開化合物抑制HBV復(fù)制的能力的方法，詳細(xì)載于Korba和Gerin在<Antiviral Res.>1955-70(1992)之中。僅僅為了說明而不是限制本發(fā)明，給出下列物質(zhì)毒性和抗BV活性評價(jià)結(jié)果(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤；(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]腺嘌呤；和(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]鳥嘌呤。本文公開的其他化合物按相似的方式評價(jià)。
就細(xì)胞的兩個(gè)分開的傳代(每個(gè)傳代兩個(gè)培養(yǎng)物，共計(jì)四個(gè)培養(yǎng)物)完成了抗病毒評價(jià)。在所有試驗(yàn)板的全部試孔中均同時(shí)同密度地接種。
由于在細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA諸水平的固有變化，與未處置細(xì)胞中這些HBV DNA型的平均水平相比，只有抑制作用大于3.0倍(對于HBV毒粒DNA)或2.5倍(對于HBV DNA復(fù)制中間體)的才認(rèn)為滿足顯著性水準(zhǔn)[P＜0.05](Korba和Gerin，<Antivira Res.>1955-70(1992)。使用了每一細(xì)胞DNA制劑中諸整合的HBV DNA水平(在這些實(shí)驗(yàn)中其水平以每個(gè)細(xì)胞為基礎(chǔ)保持恒定)，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA型的諸水平，借以消除印跡雜交分析(the blot hybridization assays)中固有的技術(shù)變化。
未處置細(xì)胞中細(xì)胞外HBV毒粒DNA的典型值，處于50-150pg/ml培養(yǎng)基(平均約76pg/ml)。在未處置細(xì)胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制中間產(chǎn)物為50-100pg/μg細(xì)胞DNA(平均值約74pg/μg細(xì)胞DNA)。一般來說，因用抗病毒化合物處置而產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平的抑制作用，與HBV毒粒DNA水平的抑制作用相比，較不顯著而且發(fā)生得較慢。
例如，在這些實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行所說雜交分析的方法，得出大約1.0pg細(xì)胞內(nèi)HBV DNA/μg細(xì)胞DNA相當(dāng)于2-3基因組拷貝/細(xì)胞以及1.0pg細(xì)胞外HBV DNA/ml相當(dāng)于3×55病毒顆粒/ml。
為了評定所觀察到的抗病毒作用是否緣于對細(xì)胞生活能力的一般作用，作了毒性分析，所用的方法基于中性紅染料的攝入，一種分析在各種病毒宿主體系、其中包括HSV(單純性皰疹病毒)和HIV中細(xì)胞生存能力的廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法。此方法的細(xì)節(jié)列表該毒性表的注中。
使用的試驗(yàn)化合物呈在DMSO中的40mM貯存液態(tài)(于干冰上被冷凍的)。將試樣制成日分量并于-20℃下冷凍，以便使每單個(gè)劑量經(jīng)受單一凍融循環(huán)。將該日試驗(yàn)分量融化后，室溫下懸浮在培養(yǎng)基中后立即加到細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)。試驗(yàn)了0.0和1μM所說化合物的抗病毒活性，并試驗(yàn)了不高于300μM濃度下所說化合物的毒性。
在表中使用了下列縮寫符號ACPD(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤；DAPD(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]腺嘌呤；和Dioxolane-G(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]鳥嘌呤。
實(shí)施例2化合物的毒性評價(jià)了ACPD、DAPD和Dioxolane-G的對映體在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)物(用肝炎毒粒轉(zhuǎn)化的HepG2細(xì)胞)中抑制病毒生長的能力。如表1所說的那樣，對在抗病毒評價(jià)中所用濃度下的全部試驗(yàn)化合物，均未觀察到顯著性毒性(在未處置的細(xì)胞中所觀察到的該染料攝入量的抑制作用高于50％的)。該試驗(yàn)化合物在100μM下對2.2.15細(xì)胞無毒。但是這些化合物在300μM下有中等毒性，而且與ddC相比此濃度下三種化合物的毒性較小。
在96孔平底組織培養(yǎng)板中作了毒性分析。毒性分析用細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，按抗病毒評價(jià)中所用的同樣方案用試驗(yàn)化合物處理。每種試驗(yàn)化合物試驗(yàn)了四種濃度，每種濃度用三份培養(yǎng)液。利用中性紅染料的攝入確定了相對毒性水平。采用510mM下內(nèi)部化染料的吸收(A510)作定量分析。諸數(shù)值以與試驗(yàn)化合物一樣保持在同樣的96孔培養(yǎng)板中的未處理細(xì)胞之9個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的平均A510值(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的百分?jǐn)?shù)表示。在培養(yǎng)板40上所說9個(gè)對照培養(yǎng)物中染料攝入的百分?jǐn)?shù)為100±3。在這些試驗(yàn)中一般觀察到在150-190μM 2′，3′-ddC下染料的攝入(與未處置細(xì)胞中所觀察到的水平相比)減少二倍(Korba和Gerin，<Antiviral Res.>1955-70，1992)。
表1試驗(yàn)化合物在2.2.15細(xì)胞中的毒性分析在所指出的藥物濃度下中性紅染料的攝入(相當(dāng)對照的％)培養(yǎng)板化合物 1000μM300μM100μM30μM402′，3′-ddC5±1 44±1 97±2 101±1在所指出的藥物濃度下中性紅染料的攝入(相當(dāng)對照的％)培養(yǎng)板化合物 300μM 100μM 30μM 10μM40ACPD 63±199±1101±198±240DAPD 49±388±199±3 99±140Dioxolane-G 56±388±3101±2100±3
實(shí)施例3抗乙型肝炎病毒活性如表2中所示，在激發(fā)期間內(nèi)，HBV毒粒DNA和細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間產(chǎn)物(HBV RI)的水平與未處置的細(xì)胞內(nèi)保持恒定(處于正常變化范圍內(nèi))。而陽性處理對照，2′，3′-二脫氧胞嘧啶(2′，3′-ddC)，誘導(dǎo)了在所用濃度下HBV DNA復(fù)制的顯著抑制作用。過去的研究表明，9-12μM 2′，3′-ddC在此試驗(yàn)體系中通常觀察到HBV RI的90％抑制作用(相對于未處置細(xì)胞中的平均水平)，(參見Korba和Gerin，<Antiviral Res.>1955-70，1992)。
三種試驗(yàn)化合物都是HBV復(fù)制的有效抑制劑，與用2′，3′-ddC處置后所觀察到的情況相比，對HBV毒粒DNA和HBV RI的抑制作用與之相當(dāng)或比之更高。
表2各種核苷對在2.2.15細(xì)胞中生產(chǎn)HBV的影響

表2(續(xù))各種核苷對在2.2.15細(xì)胞中生產(chǎn)HBV的影響

*在第9天處置后作了24小時(shí)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA分析。使用了每種細(xì)胞DNA制劑中的DNA計(jì)算游離基因3.2kB HBV基因組(單)和HBV DNA復(fù)制中間產(chǎn)物[RI]的水平。
**“Zero”(零)表示不能檢出的HBV DNA水平，靈敏度下限為0.1pg(m)。
IV.藥物組合物的制備本文公開的化合物及其藥物可接受的鹽、前藥和衍生物，可以用于預(yù)防和治療HBV感染和其他有關(guān)癥狀，如抗HBV抗體陽性和HBV陽性癥狀、由HBV引起的慢性肝炎、肝硬變、急性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性持久性肝炎和疲勞。這些化合物或制劑也可以預(yù)防性地用于阻止或延遲抗HBV抗體陽性或HBV抗原陽性或接觸過HBV的個(gè)體臨床疾病的蔓延。
患有任何種這樣癥狀的人，可以通過給病人施用有效量的下列選擇性處于藥物可接受載體或稀釋劑中的下列物質(zhì)的方法加以治療(-)-(2R，4R)-2-氨基-6-氯-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤、(-)-(2R，4R)-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)鳥嘌呤、(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]腺嘌呤或(-)-(2R，4R)-2-氨基-9-[(2-羥甲基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]嘌呤或其藥物可接受的衍生物或鹽。這些活性物質(zhì)可以通過任何適當(dāng)途徑給藥，如口服、非腸道、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或局部以液體或固體形式給藥。
將此活性物質(zhì)包括在藥物可接受的載體或稀釋劑中，其量應(yīng)足夠向病人輸送治療有效量的活性物質(zhì)而不會在被治療的病人中產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用。
治療上述疾病所需活性化合物的優(yōu)選劑量，約為1-60(優(yōu)選1-20)mg/kg受試者體重/天，更一般地講約為0.1-100mg/kg受試者體重/天。所說的藥物可接受衍生物的有效劑量范圍，可以根據(jù)應(yīng)供給母體核苷的重量計(jì)算出來。若該衍生物本身具有活性，則可以用該衍生物重量按上述方式估計(jì)，或者用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方式估計(jì)有效劑量。
所說的化合物便于以任何適當(dāng)?shù)膭┬蛦挝唤o藥，該單位劑型包括(但不限于)含7-3000(優(yōu)選70-1400)mg活性成分/單位劑型的那些。50-1000mg的口服劑量便于使用。
理想的是，該活性成分應(yīng)當(dāng)施用到這樣一種程度，即，使得該活性化合物在血漿中的峰濃度達(dá)到約0.2-70(優(yōu)選約1.0-10)μM?？梢赃_(dá)到此目的方法，例如靜脈注射0.1-5％活性成分(選擇性地于生理鹽水中)的溶液或以活性成分大丸劑給藥。
活性化合物在藥物組合物中的濃度，取決于該藥物的吸收、失活和分泌速度以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他諸因素。應(yīng)當(dāng)注意，劑量的大小也會隨欲處置病癥的嚴(yán)重程度而變化。此外，還應(yīng)當(dāng)知道，對于具體病人來說，具體的劑量制度應(yīng)當(dāng)隨時(shí)根據(jù)個(gè)體病人的需要和給藥或監(jiān)督給藥人的職業(yè)判斷加以調(diào)整，而以，本文所述的濃度范圍僅僅是為了舉例說明，而不在于限制所要求組合物的范圍和實(shí)施?；钚猿煞挚梢砸淮谓o藥，也可以將其分成一些較小的劑量按變化的時(shí)間間隔給藥。
活性化合物的優(yōu)選給藥方式是口服。口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用的載體。組合物可以包封在明膠膠囊中或壓成片劑。為了口服治療，可以將活性化合物與賦形劑混合后制成片劑、錠劑或膠囊使用。藥物可配伍的粘合劑和/或佐劑也可以作為組合物的部分成分被包含在其中。
所說的片劑、丸、膠囊和錠劑等等，可以含任何下列成分或具有類似性質(zhì)的化合物粘合劑(如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠)；賦形劑(如淀粉或乳糖)、崩解劑(如藻酸、Primogel或玉米淀粉)；潤滑劑(如硬脂酸鎂或Sterotes)；助流劑(如膠體二氧化硅)；甜味劑(如蔗糖或糖精)或調(diào)味劑(如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精)。單位劑型為膠囊時(shí)，除了上述類型的物質(zhì)之外，還可以含如脂肪油等液體載體。此外，單位劑型還可以含有改變劑量單位之物理形狀的其他物質(zhì)，如糖衣、蟲膠或其他腸內(nèi)吸收劑。
所說的活性化合物或其藥物可接受的衍生物或鹽，可以作為酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑、口香糖劑等的成分給藥。糖漿除含活性化合物之外可以含有作為甜味劑的蔗糖以及含有防腐劑、染料、著色劑和香料。
所說的活性化合物或其藥物可接受的衍生物或鹽，也可以與不損害其所需作用的其他活性物質(zhì)，或者與補(bǔ)充所需作用的物質(zhì)混合，例如與抗生素、殺真菌劑、抗炎劑或其他抗病毒劑(包括HBV、抗巨細(xì)胞病毒或抗HBV劑)混合。
非腸道、真皮內(nèi)、皮下或局部施藥所用的溶液或懸浮液，可以包含下列成分無菌稀釋劑(如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑)；抗菌劑(如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯)；抗氧劑(如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)；螯合劑(如乙二胺四乙酸)，緩沖劑(如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)和調(diào)節(jié)張力用的試劑(如氯化鈉或右旋糖)。非腸道制劑可以封入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多劑小瓶中。
若靜脈給藥，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。
在一種優(yōu)選方案中，將活性化合物與保護(hù)該化合物使之不會從體內(nèi)迅速消失的載體一起制成制劑，如控釋制劑，其中包括植入物和微膠囊化的給藥體系。可以使用可生物降解和生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些材料可以在市場上買到由Alza公司和Nova藥物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
脂質(zhì)體懸浮液(包括以被對病毒抗原的單克隆抗體侵染細(xì)胞為靶向的脂質(zhì)體)也是優(yōu)選的藥物可接受的載體。它們可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如US-4522811中所述的方法(通過參照將其內(nèi)容并入本文)制備。例如，脂質(zhì)體制劑可按下述制備將適當(dāng)脂(類)(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、二十烷酰磷脂酰膽堿和膽甾醇)溶解在無機(jī)溶劑中后蒸發(fā)，在容器表面上留下干燥的脂的薄膜。然后將活性化合物或其單磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液注入此容器中。接首用手回旋此容器，使脂物質(zhì)自該容器側(cè)壁上游離下來，分散此脂的聚集物制成脂質(zhì)體懸浮液。
V.β-D-二氧戊環(huán)核苷磷酸鹽衍生物的制備β-D-二氧戊環(huán)核苷的單、二和磷酸鹽衍生物可按以下所述制備所說的單磷酸鹽可以按Imai等人在<J.Org.Chem.>34(6)，1547-1550(1969.6)上所述的操作方法制備。例如于0℃溫度下使大約100mgβ-D-二氧戊環(huán)核苷和大約280μl磷酰氯在大約8ml無水乙酸乙酯中攪拌下反應(yīng)約4小時(shí)，用冰熄滅反應(yīng)后，水相在活性炭柱上純化，用5％氫氧化銨在乙醇和水的1∶1混合物中的溶液洗脫。蒸發(fā)洗脫液得到(β-D-二氧戊環(huán)核苷)-5′-單磷酸銨。
二磷酸鹽可以按Davisson等人于<J.Org.Chem.>52(9)，1794-1801(1987)上的操作制備。β-D-二氧戊環(huán)核苷可以由相應(yīng)的甲苯磺酸鹽制備，即例如通過使所說核苷和甲苯磺酰氯于吡啶中室溫下反應(yīng)約24小時(shí)，并按通常方式處理產(chǎn)物(如洗滌、干燥和使之結(jié)晶)的方法制備。
三磷酸鹽可以按Hoard等人于<J.Am.Chem.Soc.>87(8)，1785-1788(1965)上所述的操作制備。例如按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備N-咪唑酰胺，并在DMF中用三丁基焦磷酸銨處理，用這種方法使β-D-二氧戊環(huán)核苷活化。此反應(yīng)主要生成核苷的三磷酸鹽，其中含一些未反應(yīng)的單和二磷酸鹽。用DEAE柱作陽離子交換色譜純化后，例如以四鈉鹽形式分離出該三磷酸鹽。
本發(fā)明參照其優(yōu)選方案作了說明。由上述詳細(xì)說明本發(fā)明，本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯然知道本發(fā)明即各種對映體純的β-D-二氧戊環(huán)核苷的變化和改進(jìn)。因此全部這些變化和改進(jìn)都應(yīng)當(dāng)被包括在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.治療有效量的式(I)所示的β-D-二氧戊環(huán)基核苷或其藥物上可接受的鹽，和藥物上可接受的載體在制造用于治療人或其它宿主動物的HBV感染的藥物組合物中的用途， 其中R選自O(shè)H、NH2、H或Cl，和X選自氫、乙?；⒈；⒍□；⑽祯；?、3-甲基丁酰基、丁二酸單酯基、3-氯苯甲酸基、苯甲?；?、新戊?；?、甲磺酸酯基、戊?；⒓乎；?、辛酰基、癸酰基、月桂?；⑷舛罐Ⅴ；⒆貦磅；⒂仓；?、一磷酸酯基、二磷酸酯基和三磷酸酯基。
2.權(quán)利要求1的用途，其中R是NH2。
3.權(quán)利要求1的用途，其中R是OH。
4.權(quán)利要求1的用途，其中R是Cl。
5.權(quán)利要求1的用途，其中R是H。
6.權(quán)利要求1的用途，其中X是H。
7.權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是適合口服給藥的。
8.權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是片劑的形式。
9.權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是膠囊的形式。
10.權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是適合于非腸道給藥的。
11.權(quán)利要求1的用途，其中核苷的至少95％不含相應(yīng)的β-L-對映體。
12.權(quán)利要求11的用途，其中R是NH2。
13.權(quán)利要求11的用途，其中R是OH。
14.權(quán)利要求11的用途，其中R是Cl。
15.權(quán)利要求11的用途，其中R是H。
16.權(quán)利要求11-15中任何一項(xiàng)的用途，其中X是H。
17.權(quán)利要求11-15中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是適合口服給藥的。
18.權(quán)利要求11-15中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是片劑的形式。
19.權(quán)利要求11-15中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是膠囊的形式。
20.權(quán)利要求11-15中任何一項(xiàng)的用途，其中所述載體是適合于非腸道給藥的。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療有效量的下式(I)所示的β－D－二氧戊環(huán)基核苷或其藥物上可接受的鹽，和藥物上可接受的載體在制造用于治療人或其它宿主動物的HBV感染的藥物組合物中的用途，式(I)中的R是OH、Cl、NH
文檔編號C07D411/04GK1679612SQ20051000803
公開日2005年10月12日 申請日期1993年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月28日
發(fā)明者R·F·辛納齊 申請人:埃莫里大學(xué)