專利名稱：丙二酰基人參皂苷的制備工藝及其治療糖尿病的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療糖尿病的藥物，尤其是公開(kāi)一種丙二酰基人參皂苷制備工藝及其治療糖尿病的藥物用途，同時(shí)還提供了一種丙二酸單?；咴碥?R4新化合物和它的醫(yī)用用途，屬于中醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的丙二?；藚⒃碥?Malonyl-ginsenosides)又稱為丙二酸單酰基人參皂苷，主要包括M-Rb1、M-Rb2、M-Rc、M-Rd和M-NR4系列化合物。
目前，丙二?；藚⒃碥盏纳虡I(yè)化生產(chǎn)中，用正丁醇萃取總皂苷時(shí)，這部分皂苷易混溶于水層，被當(dāng)作糖分、無(wú)機(jī)鹽等水溶性雜質(zhì)而除掉；將總皂苷提取物直接上大孔樹(shù)脂柱，也會(huì)造成一部分水溶性皂苷隨水而流失。通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比，人參各部位的丙二?；藚⒃碥盏暮?，以其鮮人參須根中丙二酸單?；藚⒃碥盏目偤扛哌_(dá)4％以上，而生曬參、紅參及其它加工品種中該類皂苷的含量明顯減少，甚至沒(méi)有。在人參的各種制品中一方面丙二酰基人參皂苷在加工中損失一部分，另一方面是加工過(guò)程中脫掉丙二?；D(zhuǎn)化生成其它皂苷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)一種丙二?；藚⒃碥盏闹苽浞椒ā?br> 本發(fā)明丙二?；藚⒃碥赵谥苽渲委熖悄虿〉乃幬镏械挠猛?。
本發(fā)明還公開(kāi)一種新化合物丙二酸單?；咴碥?R4(簡(jiǎn)稱M-NR4)及其醫(yī)用用途。
本發(fā)明涉及的丙二酰基人參皂苷具有下述結(jié)構(gòu)通式 丙二?；藚⒃碥瞻∕-Rb1、M-Rb2、M-Rc、M-Rd和本發(fā)明的化合物M-NR4其中，丙二?；藚⒃碥盏闹苽涔に嚢ㄒ韵虏襟E以1kg鮮人參(須根、支根、根莖、主根等)為原料，切碎，用10-20kg的20-98％的乙醇在室溫下冷浸提取2-6次，每次8-16小時(shí)，提取過(guò)程要充分?jǐn)嚢?，將提取液?0℃條件下減壓回收溶劑，濃縮為水溶液，用正丁醇水反復(fù)萃取，水層溶液濃縮后上大孔樹(shù)脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脫，60％乙醇部分回收乙醇得到的水溶液凍干后保存?zhèn)溆茫?0％乙醇部分為丙二?；傇碥?，再開(kāi)發(fā)制劑。每步實(shí)驗(yàn)過(guò)程越短越好，得到的樣品要低溫保存。
丙二酸單?；咴碥?R4(簡(jiǎn)稱M-NR4)具有以下結(jié)構(gòu) 分子式C62H102O30分子量1326為3-O-[6-O-丙二?；?β-D-葡萄吡喃糖(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖]-20-O-[β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]-20(S)-原人參二醇。
M-NR4的制備工藝為取上述制備丙二酰基人參皂苷的60％乙醇相(丙二酸單?；傇碥?10-30g，干法上樣，用硅膠干柱減壓分離(硅膠G2Kg青島海洋化工廠生產(chǎn))，用洗脫液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下層)洗至柱底，然后分割切斷，用硅膠薄層檢查，合并含有M-NR4組份。
將M-NR4組份再上硅膠干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脫，分?jǐn)嗲懈詈笥霉枘z薄層檢查，將M-NR4上H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，繼續(xù)用乙醇洗脫，洗脫液在40℃條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物即丙二酸單?；咴碥?R4。
本發(fā)明還提供了據(jù)有很強(qiáng)的藥理活性的一類丙二?；藚⒃碥罩苿?，其成分包含5種化合物M-NR4、M-Rb1、M-Rb2、M-Rc和M-Rd。
本發(fā)明丙二?；藚⒃碥盏乃幬锖兄委熡行Я康奶崛∥锛皢误w為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明可以組合物的形式通過(guò)口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥方式施用于這種治療的患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種劑型如片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑、口服液體劑型和注射劑。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，制成所需劑型。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括如防腐劑、色素、稀釋劑、賦形劑，填充劑，粘合劑，矯味劑，濕潤(rùn)劑，崩解劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，吸附載體。
本發(fā)明的的藥物作用經(jīng)過(guò)藥理學(xué)試驗(yàn)篩選，對(duì)該類皂苷進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠(四氧嘧啶型、鏈尿霉素型、腎上腺素性和外源性葡萄糖型)的降糖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該類化合物具有明顯的降糖效果。
下述的藥理試驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明化合物的降糖藥理活性。
1試驗(yàn)材料、儀器和試劑
1.1實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物系昆明種小白鼠，體重18-22g，雌雄均用。分別購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所動(dòng)物室，許可證號(hào)2002-0001；吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)2003-0001。
1.2儀器752型紫外光柵分光光度計(jì)，上海第二分析儀器廠制造；A-6半自動(dòng)生化分析儀，北京松上技術(shù)有限公司。
1.3藥物及試劑丙二?；藚⒃碥?、丙二酸、人參二醇組皂苷和丙二酸單?；咴碥?R4均由本實(shí)驗(yàn)組提供。
陽(yáng)性藥胰島素注射液，江蘇萬(wàn)幫生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)0307214。葡萄糖，北京化工廠，批號(hào)20000901?？偰懝檀荚噭┖校猩笨厣锟萍脊煞萦邢薰?，批號(hào)050105。鹽酸腎上腺素注射液，北京市永康藥業(yè)有限公司，批號(hào)03070241。四氧嘧啶，Sigma產(chǎn)品。鏈脲佐菌素，Sigma產(chǎn)品。血糖試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號(hào)041119。肝糖元測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20050307。檸檬酸，北京化工廠，批號(hào)991105；檸檬酸鈉，北京化工廠，批號(hào)9911505。
2試驗(yàn)方法2.1對(duì)正常動(dòng)物血糖的影響取健康小鼠60只，隨機(jī)分為五組空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組，每天靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥三天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，以血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.2對(duì)高血糖動(dòng)物模型的影響2.2.1對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖動(dòng)物模型的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠均靜脈注射鏈脲佐菌素200mg/kg(10ml/kg)，次日將這60只小鼠隨機(jī)分為六組模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。分組后按組別靜脈注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥四天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，以血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.2.2對(duì)四氧嘧啶致高血糖動(dòng)物模型的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠均靜脈注射四氧嘧啶80mg/kg(10ml/kg)，次日將這60只小鼠隨機(jī)分為六組模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。分組后按組別靜脈注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥四天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，以血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.2.3對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物模型的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)分為六組空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。每天靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥三天，末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射腎上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分鐘后將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，用血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.2.4對(duì)外源性葡萄糖升高血糖動(dòng)物模型的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)分為六組空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。每天靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥三天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均靜脈注射葡萄糖2g/kg(10ml/kg)，15分鐘后將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，以血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.2.5M-NR4對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物模型的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)分為六組空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥M-NR430、20、10mg/kg三個(gè)劑量給藥組。每天靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥三天，末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射腎上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分鐘后將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，用血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.3丙二酸單?；藚⒃碥詹煌纸猱a(chǎn)物對(duì)高血糖模型動(dòng)物的影響取健康小鼠110只，隨機(jī)分為十一組空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60mg/kg二個(gè)劑量給藥組，二醇組皂苷110.94、55.47mg/kg二個(gè)劑量給藥組，丙二酸4.57、2.28mg/kg二個(gè)劑量給藥組，二醇組皂苷+丙二酸110.94+4.56、55.47+2.28mg/kg二個(gè)劑量給藥組，每天靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥三天，末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射腎上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分鐘后將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，用血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
2.4對(duì)高血糖模型動(dòng)物肝糖元的影響2.4.1對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病小鼠肝糖元的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠均靜脈注射鏈脲佐菌素200mg/kg(10ml/kg)，次日將這60只小鼠隨機(jī)分為六組模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。分別按組別靜脈注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥四天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，將小鼠斷頭處死，取肝臟，用肝糖元試劑盒測(cè)小鼠肝糖元含量。
2.4.2對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠肝糖元的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠均靜脈注射四氧嘧啶80mg/kg(10ml/kg)，次日將這60只小鼠隨機(jī)分為六組模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。分別按組別靜脈注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥四天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，將小鼠斷頭處死，取肝臟，用肝糖元試劑盒測(cè)小鼠肝糖元含量。
2.5對(duì)高血糖模型動(dòng)物血清膽固醇含量的影響2.5.1對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖模型小鼠血清膽固醇的含量影響取健康小鼠72只，隨機(jī)取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠均靜脈注射鏈脲佐菌素200mg/kg(10ml/kg)，次日將這60只小鼠隨機(jī)分為六組模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。分組后按組別靜脈注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥四天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，以總膽固醇試劑盒測(cè)血清膽固醇含量。
2.5.2四氧嘧啶致高血糖模型小鼠血清膽固醇含量的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠均靜脈注射四氧嘧啶80mg/kg(10ml/kg)，次日將這60只小鼠隨機(jī)分為六組模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。分組后按組別靜脈注射給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥四天。末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，以總膽固醇試劑盒測(cè)血清膽固醇含量。
3試驗(yàn)結(jié)果丙二酰人參皂苷以120、60、30mg/kg劑量給藥，可明顯降低小鼠正常血糖；對(duì)葡萄糖所致小鼠血糖升高有明顯降低作用；可明顯抑制腎上腺素引起的小鼠血糖升高；對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠高血糖有明顯降低作用，對(duì)鏈脲佐菌素所致雄性小鼠血糖升高亦有明顯降低作用；有使實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠肝糖元升高的趨勢(shì)；對(duì)四氧嘧啶、鏈脲佐菌素致高血糖動(dòng)物血清膽固醇有明顯升高作用；劑量實(shí)驗(yàn)說(shuō)明其對(duì)糖尿病可能既有預(yù)防又有治療作用。
3.1對(duì)正常動(dòng)物血糖的影響由表3.1結(jié)果可知，陽(yáng)性藥胰島素注射液、丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量均能明顯降低正常小鼠血糖含量，具有明顯的量效關(guān)系，說(shuō)明胰島素注射液、丙二酰人參皂苷對(duì)正常動(dòng)物有降糖作用。
表3.1丙二酰基人參皂苷對(duì)正常小鼠血糖的影響(x±s)

與模型對(duì)照組比***p＜0.001，**p＜0.01，**p＜0.05與空白對(duì)照組比ΔΔΔp＜0.001，ΔΔp＜0.01，Δp＜0.05(以下各表均同)3.2對(duì)高血糖動(dòng)物模型的影響3.2.1對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖動(dòng)物模型的影響由表3.2.1結(jié)果可知，同空白對(duì)照組比，鏈脲佐菌素模型組小鼠血糖明顯升高，而陽(yáng)性藥胰島素注射液及試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量均能明顯降低小鼠血糖含量，說(shuō)明胰島素注射液、丙二酰人參皂苷對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖模型動(dòng)物有降糖作用。
表3.2.1丙二酰基人參皂苷對(duì)鏈脲佐菌素致小鼠血糖升高的影響(x±s)


3.2.2對(duì)四氧嘧啶致高血糖動(dòng)物模型的影響由表3.2.2結(jié)果可知，同空白對(duì)照組比，注射四氧嘧啶小鼠血糖明顯升高，而陽(yáng)性藥胰島素注射液及試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量均能明顯降低小鼠血糖含量，說(shuō)明胰島素注射液、丙二酰人參皂苷對(duì)四氧嘧啶致高血糖模型動(dòng)物有降糖作用。
表3.2.2丙二?；藚⒃碥諏?duì)四氧嘧啶致小鼠血糖升高的影響(x±s)

3.2.3對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物模型的影響由表3.2.3結(jié)果可知，同空白對(duì)照組比，注射腎上腺素液組小鼠血糖明顯升高，而陽(yáng)性藥胰島素注射液及試藥丙二酰人參皂苷120mg/kg劑量組均能明顯降低小鼠血糖含量，具有量效關(guān)系，說(shuō)明胰島素注射液、丙二酰人參皂苷對(duì)腎上腺素致高血糖模型動(dòng)物有降糖作用。
表3.2.3丙二酰人參皂苷對(duì)腎上腺素致小鼠血糖升高的影響(x±s)


3.2.4對(duì)外源性葡萄糖升高血糖動(dòng)物模型的影響由表3.2.4結(jié)果可知，同空白對(duì)照組比，外源性注射葡萄糖可使小鼠血糖明顯升高，而陽(yáng)性藥胰島素注射液及試藥丙二酰人參皂苷120、60mg/kg二個(gè)劑量給藥組均能明顯降低小鼠血糖含量，且試藥組降糖作用隨給藥劑量增加，作用增強(qiáng)，說(shuō)明胰島素注射液、丙二酰人參皂苷對(duì)外源性葡萄糖致高血糖模型動(dòng)物有降糖作用。
表3.2.4丙二酰人參皂苷對(duì)外源性葡萄糖小鼠血糖升高的影響(x±s)

3.2.5M-NR4對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物模型的影響由表3.2.5結(jié)果可知，同空白對(duì)照組比，注射腎上腺素液組小鼠血糖明顯升高，而陽(yáng)性藥胰島素注射液及試藥M-NR4120mg/kg劑量組均能明顯降低小鼠血糖含量，具有量效關(guān)系，說(shuō)明胰島素注射液、M-NR4對(duì)腎上腺素致高血糖模型動(dòng)物有降糖作用。
表3.2.3丙二酰人參皂苷對(duì)腎上腺素致小鼠血糖升高的影響(x±s)


3.3丙二酸單酰基人參皂苷不同分解產(chǎn)物對(duì)高血糖模型動(dòng)物的影響由表3.3結(jié)果可知，同空白對(duì)照組比，腎上腺素注射液模型組小鼠血糖明顯升高，而陽(yáng)性藥胰島素注射液及試藥丙二酰人參皂苷120、60mg/kg二個(gè)劑量均能明顯降低小鼠血糖含量，其余各藥對(duì)腎上腺素引起的小鼠血糖升高無(wú)明顯影響，給藥組與模型組比血糖含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明胰島素注射液、丙二酰人參皂苷對(duì)腎上腺素致高血糖模型動(dòng)物有降糖作用，二醇組皂苷、丙二酸、二醇組皂苷與丙二酸的混合物均無(wú)此作用。
表3.3丙二酰人參皂苷不同分解產(chǎn)物對(duì)鹽酸腎上腺素致小鼠血糖升高的影響(x+s)


3.4對(duì)高血糖模型動(dòng)物肝糖元的影響3.4.1對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病小鼠肝糖元的影響由表3.4.1結(jié)果可見(jiàn)，試藥丙二酰人參皂苷對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖模型動(dòng)物肝糖元含量有增加的趨勢(shì)。
表3.4.1丙二酰人參皂苷對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖小鼠肝糖元含量的影響(x±s)

3.4.2對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠肝糖元的影響由表3.4.2結(jié)果可見(jiàn)，注射四氧嘧啶后，小鼠肝糖元含量無(wú)明顯變化各給藥組與模型組間無(wú)明顯差異。
表3.4.2丙二酰人參皂苷對(duì)四氧嘧啶致高血糖小鼠肝糖元含量的影響(x±s)

3.5對(duì)高血糖模型動(dòng)物血清膽固醇含量的影響3.5.1對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖模型小鼠血清膽固醇的含量影響由表3.5.1結(jié)果可見(jiàn)，模型組小鼠注射鏈脲佐菌素后，與空白對(duì)照組比，血清膽固醇含量明顯降低，給予胰島素和試藥丙二酰人參皂苷后，血清膽固醇含量增加，與模型組比有明顯差異，與空白組動(dòng)物膽固醇含量相似。
表3.5.1丙二酰人參皂苷對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖小鼠血清膽固醇含量的影響(x±s)

3.5.2四氧嘧啶致高血糖模型小鼠血清膽固醇含量的影響由表3.5.2結(jié)果可見(jiàn)，模型組小鼠注射四氧嘧啶后，與空白對(duì)照組比，血清膽固醇含量有降低的趨勢(shì)，給予胰島素和試藥丙二酰人參皂苷后，血清膽固醇含量明顯增加。
表3.5.2丙二酰人參皂苷對(duì)四氧嘧啶致高血糖小鼠血清膽固醇含量的影響(x±s)

4對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物模型的影響取健康小鼠72只，隨機(jī)分為六組空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥胰島素注射液114.29u/kg給藥組，試藥丙二酰人參皂苷120、60、30mg/kg三個(gè)劑量給藥組。每天靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥三天，末次給藥前將小鼠饑餓16小時(shí)，末次給藥后15分鐘，除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射腎上腺素注射液100μg/kg(10ml/kg)，30分鐘后將小鼠斷頭處死，取血，分離血清，用血糖試劑盒測(cè)血糖含量。
4結(jié)論與討論目前隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。高血糖是糖尿病的最基本的病理特征，也是引起糖尿病一些慢性并發(fā)癥的重要原因，如何逆轉(zhuǎn)糖尿病的高血糖狀態(tài)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。由于口服降糖藥的副作用及長(zhǎng)期注射胰島引起的胰島素依賴性和蘇木杰效應(yīng)，使得人們迫切需要在中藥中尋找合適的降糖藥物。因此中藥對(duì)于糖尿病的治療近年來(lái)引起了廣大醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)鮮人參中丙二酰人參皂苷的降糖作用觀察結(jié)果顯示，丙二酰人參皂苷能降低正常小鼠血糖，且具有明顯的量效關(guān)系，表明丙二酰人參皂苷可能具有促進(jìn)糖代謝的作用。
鏈脲佐菌素為一種廣譜抗菌素，具有抗菌、抗腫瘤和致糖尿病的作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性毒性作用，引起胰島細(xì)胞損傷。四氧嘧啶是一種特異性β細(xì)胞毒劑，可選擇性地破壞胰島-β細(xì)胞，引起細(xì)胞壞死，而致糖尿病。丙二酰人參皂苷能明顯降低鏈脲佐菌素、四氧嘧啶引起的小鼠高血糖，這表明丙二酰人參皂苷可能具有減弱鏈脲佐菌素、四氧嘧啶對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷或改善受損β細(xì)胞的功能。
腎上腺素能促進(jìn)體內(nèi)糖元分解及糖酵解，抑制胰島素分泌；靜脈注射葡萄糖則屬于直接外源性增加體內(nèi)糖含量，這些都是對(duì)胰腺β細(xì)胞無(wú)直接毒害作用，而是對(duì)抗胰島素作用而引起糖尿病。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙二酰人參皂苷不僅能對(duì)抗鏈脲佐菌素、四氧嘧啶破壞胰島β細(xì)胞引起的高血糖，而且對(duì)不損傷胰島β細(xì)胞，只是對(duì)抗胰島素作用引起的高血糖也有降糖作用，說(shuō)明其對(duì)血糖的影響是非特異性的。
在試驗(yàn)中根據(jù)不同的動(dòng)物模型采用了預(yù)防和治療兩種不同的給藥方式，結(jié)果表明，均有降糖作用，故提示其對(duì)糖尿病可能既有預(yù)防又有治療作用。丙二酰人參皂苷對(duì)鏈脲佐菌素、四氧嘧啶高血糖動(dòng)物有促進(jìn)肝糖元合成的趨勢(shì)，說(shuō)明丙二酰人參皂苷其降糖作用機(jī)制可能與促進(jìn)糖原的合成與貯存，抑制糖原的分解和異生有關(guān)。
從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，丙二酰人參皂苷可明顯增加鏈脲佐菌素與四氧嘧啶動(dòng)物血中膽固醇含量，與胰島素作用相似，這可能與其促進(jìn)脂肪合成，抑制其分解有關(guān)。至于其與胰島素具有促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)合成甘油三酯而儲(chǔ)存，或抑制脂肪酶活性、減少脂肪分解是否完全一致；還是與其結(jié)構(gòu)中含有丙二酰基，這個(gè)脂肪分解過(guò)程中重要的酶——胞漿脂酰CoA合成酶的部分結(jié)構(gòu)相似有何關(guān)系，都需進(jìn)行深入研究。
通過(guò)丙二酰人參皂苷不同分解產(chǎn)物對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物血糖含量的研究，可見(jiàn)，丙二酰人參皂苷具有明顯的降糖作用，而相關(guān)劑量的二醇組皂苷、丙二酸、二醇組皂苷與丙二酸的混合物則沒(méi)有此作用，說(shuō)明二醇組皂苷及丙二酸不具有降糖作用，同時(shí)也說(shuō)明丙二酰人參皂苷降糖作用的機(jī)制比較復(fù)雜，而不是其分解產(chǎn)物的簡(jiǎn)單組合。從M-NR4對(duì)腎上腺素致高血糖動(dòng)物模型的影響可見(jiàn)M-NR4作為丙二酰人參皂苷中的一種化合物也具有明顯的降糖作用。本實(shí)驗(yàn)為丙二酰人參皂苷臨床用于治療糖尿病提供了初步的藥理學(xué)依據(jù)，關(guān)于其對(duì)糖耐量、糖代謝、脂代謝的影響及其降糖作用的機(jī)制、對(duì)胰島素的敏感性等等還有待于深入研究。


圖1為本發(fā)明丙二酸單?；藚⒃碥罩苽淞鞒虉D。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1以1kg鮮人參(須根、支根、根莖、主根等)為原料，切碎，用15kg的80％的乙醇在室溫下冷浸提取3次，每次8-16小時(shí)，提取過(guò)程要充分?jǐn)嚢?，將提取液?0℃條件下減壓回收溶劑，濃縮為水溶液，用正丁醇∶水反復(fù)萃取，水層溶液濃縮后上大孔樹(shù)脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脫，得到60％乙醇部分為丙二?；傇碥?，回收乙醇得到的水溶液凍干后保存?zhèn)溆?，再開(kāi)發(fā)制劑。每步實(shí)驗(yàn)過(guò)程越短越好，得到的樣品要低溫保存。
實(shí)施例2以西洋參(須根、支根、根莖、主根等)為原料，切碎，用20％的乙醇在室溫下冷浸提取6次，每次16小時(shí)，提取過(guò)程要充分?jǐn)嚢?，將提取液?0℃條件下減壓回收溶劑，濃縮為水溶液，用正丁醇∶水反復(fù)萃取，水層溶液凍干后低溫保存?zhèn)溆?。取出凍干樣品再上大孔?shù)脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脫，得到60％乙醇部分為丙二?；傇碥眨厥找掖嫉玫降乃芤簝龈?，再開(kāi)發(fā)制劑。每步實(shí)驗(yàn)過(guò)程越短越好，得到的樣品要低溫保存。
實(shí)施例3取實(shí)施例1或2制備的60％乙醇相(丙二酸單?；傇碥?10g，干法上樣，用硅膠干柱減壓分離(硅膠G 2Kg青島海洋化工廠生產(chǎn))，用洗脫液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下層)洗至柱底，然后分割切斷，用硅膠薄層檢查，合并含有M-NR4組份。
將M-NR4組份再上硅膠干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脫，分?jǐn)嗲懈詈笥霉枘z薄層檢查，將M-NR4上H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，繼續(xù)用乙醇洗脫，洗脫液在40℃條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物即丙二酸單?；咴碥?R4。
實(shí)施例4取實(shí)施例3中60％乙醇相(丙二酸單?；傇碥?20g，干法上樣，用硅膠干柱減壓分離(硅膠G 2Kg青島海洋化工廠生產(chǎn))，用洗脫液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下層)洗至柱底，然后分割切斷，用硅膠薄層檢查，合并含有M-NR4組份。
將M-NR4組份再上硅膠干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脫，分?jǐn)嗲懈詈笥霉枘z薄層檢查，將M-NR4上H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，繼續(xù)用乙醇洗脫，洗脫液在40℃條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物即丙二酸單酰基三七皂苷-R4。
實(shí)施例5取實(shí)施例3中60％乙醇相(丙二酸單?；傇碥?30g，干法上樣，用硅膠干柱減壓分離(硅膠G 2Kg青島海洋化工廠生產(chǎn))，用洗脫液(CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下層)洗至柱底，然后分割切斷，用硅膠薄層檢查，合并含有M-NR4組份。
將M-NR4組份再上硅膠干柱(600g、300～400目、4.5×60cm)，用氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)洗脫，分?jǐn)嗲懈詈笥霉枘z薄層檢查，將M-NR4上H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，繼續(xù)用乙醇洗脫，洗脫液在40℃條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物即丙二酸單?；咴碥?R4。
實(shí)施例6取方案1或方案2制備的丙二酰基總皂苷1kg，加入賦形劑藥用環(huán)糊精1kg，混合均勻，造粒，制得片劑，每片含丙二?；傇碥?00mg。
實(shí)施例7取方案1或方案2制備的丙二酰基總皂苷1kg，加入賦形劑藥用環(huán)糊精1kg，混合均勻，造粒，裝入膠囊，每粒含丙二?；傇碥?00mg。
實(shí)施例8取方案1或方案2制備的丙二酰基總皂苷1kg，加入藥用丙二醇2L，注射用水8L，溶解，膜過(guò)濾；膜過(guò)濾(0.2μm)，分裝，每瓶2mL，含丙二酰基總皂苷200mg。所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
實(shí)施例9取方案3、方案4或方案5制備的丙二酸單酰基三七皂苷-R4 5g，加入賦形劑藥用環(huán)糊精40g，混合均勻，造粒，制得片劑，每片含丙二酸單?；咴碥?R4 10mg。
實(shí)施例10取方案3、方案4或方案5制備的丙二酸單?；咴碥?R4 5g，加入賦形劑藥用環(huán)糊精40g，混合均勻，造粒，裝入膠囊，每粒含丙二酸單酰基三七皂苷-R4 10mg。
實(shí)施例11取方案3、方案4或方案5制備的丙二酸單?；咴碥?R4 5g，加入藥用丙二醇100mL，注射用水400mL，溶解，膜過(guò)濾；膜過(guò)濾(0.2μm)，分裝，每瓶2mL，含丙二?；傇碥?0mg。所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種丙二酰基人參皂苷的制備方法，包括以下步驟將1kg鮮人參粉碎后用10-20kg的20-98％的乙醇在室溫下冷浸提取2-6次，每次8-16小時(shí)，提取過(guò)程要充分?jǐn)嚢?，將提取液?0℃條件下減壓回收溶劑，濃縮為水溶液，用正丁醇∶水反復(fù)萃取，水層溶液濃縮后上大孔樹(shù)脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脫，60％乙醇部分回收乙醇得到的水溶液凍干后保存?zhèn)溆茫?0％乙醇部分為丙二酰基總皂苷，回收乙醇得本發(fā)明；丙二酰基人參皂苷包括M-Rb1、M-Rb2、M-Rc、M-Rd和M-NR4。
2.丙二?；藚⒃碥赵谥苽渲委熖悄虿〉乃幬镏械挠猛尽?br> 3.丙二酸單?；咴碥?R4，具有以下結(jié)構(gòu) 分子式C62H102O30分子量1326為3-O-[6-O-丙二酰基-β-D-葡萄吡喃糖(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖]-20-O-[β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]-20(S)-原人參二醇。
4.丙二酸單?；咴碥?R4的制備工藝為包括以下步驟將1kg鮮人參粉碎后用10-20kg的20-98％的乙醇在室溫下冷浸提取2-6次，每次8-16小時(shí)，提取過(guò)程要充分?jǐn)嚢?，將提取液?0℃條件下減壓回收溶劑，濃縮為水溶液，用正丁醇∶水反復(fù)萃取，水層溶液濃縮后上大孔樹(shù)脂柱，用水、30％、60％乙醇洗脫，60％乙醇部分回收乙醇得到的水溶液凍干后保存?zhèn)溆茫?0％乙醇部分為丙二?；傇碥眨厥找掖嫉帽景l(fā)明；丙二酰基人參皂苷包括M-Rb1、M-Rb2、M-Rc、M-Rd和M-NR4；取上述60％乙醇相10-30g，干法上樣，用硅膠干柱減壓分離，用洗脫液CHCl3-MeOH-H2O 65∶35∶10下層，洗至柱底，然后分割切斷，用硅膠薄層檢查，合并含有M-NR4組份；將M-NR4組份再上硅膠干柱，用氯仿-甲醇-水為6∶4∶1洗脫，分?jǐn)嗲懈詈笥霉枘z薄層檢查，將M-NR4上H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，繼續(xù)用乙醇洗脫，洗脫液在40℃條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物即丙二酸單酰基三七皂苷-R4。
5.丙二酸單?；咴碥?R4在制備治療糖尿病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種丙二?；藚⒃碥罩苽涔に嚰捌渲委熖悄虿〉乃幬镉猛荆瑫r(shí)還提供了一種丙二酸單?；咴碥眨璕4新化合物和它的醫(yī)用用途。鮮人參粉碎后用乙醇在室溫下冷浸提取，將提取液減壓回收溶劑，濃縮為水溶液，用正丁醇∶水反復(fù)萃取，水層溶液濃縮后上大孔樹(shù)脂柱，乙醇洗脫，回收乙醇得丙二酰基人參皂苷；本發(fā)明制備工藝操作簡(jiǎn)單，提取率高，為丙二?；藚⒃碥盏墓I(yè)化生產(chǎn)提供了保證。
文檔編號(hào)C07J9/00GK1696144SQ20051001684
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者孫光芝, 李向高, 王繼彥, 劉志, 孫曉波, 徐慧波 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)