專利名稱：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)它涉及一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽及這種活性肽的制備方法和在醫(yī)學(xué)上促進(jìn)骨再生、骨缺損修復(fù)上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)每年因創(chuàng)傷和疾病所致骨缺損患者達(dá)數(shù)百萬(wàn)，急需大量骨修復(fù)材料。近年來(lái)，用組織工程學(xué)技術(shù)，即用人工細(xì)胞外基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子與種子細(xì)胞復(fù)合移植或單獨(dú)植入修復(fù)骨缺損，引起各國(guó)高度重視。但目前國(guó)內(nèi)外骨相關(guān)研究尚處于起步階段，有許多問(wèn)題亟待解決，其中如何研制出具有顯著修復(fù)骨缺損效果的藥物或材料是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，簡(jiǎn)稱BMPs)是目前唯一能誘導(dǎo)異位成骨的一組細(xì)胞因子，迄今已發(fā)現(xiàn)了大約15種BMP。目前廣泛認(rèn)為BMP-2是BMP家族中最重要的生長(zhǎng)因子，BMP-2誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向定向分化的能力最強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是半衰期短，難以持續(xù)的發(fā)揮作用。如何大規(guī)模的生產(chǎn)BMP-2從而使其在臨床上更加廣泛地發(fā)揮作用一直是骨組織工程研究的一個(gè)難點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外多采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)BMP-2，但由于其生產(chǎn)設(shè)備、制備工藝非常復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)率低，價(jià)格亦非常昂貴，難以大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)亦存在基因工程產(chǎn)品安全性的問(wèn)題(Wozney J，Seeherman H.Protein-based tissue engineering in bone andcartilage repair.Curr Opin Biotechnol，2004，15(5)392-398.)。另外，大分子蛋白質(zhì)吸附在材料表面后會(huì)隨機(jī)折迭，活性位點(diǎn)暴露不充分導(dǎo)致其生物活性不高。另一種方法是運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP-2基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，簡(jiǎn)稱BMSCs)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)BMP-2，然而亦存在轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)時(shí)間較短及病毒載體的潛在致癌性等缺點(diǎn)(Chadderdon R，Shimer A，Gilbertson L.Advances in gene therapy forintervertebral disc degeneration[J].Spine J.2004，4(6Suppl)341S-34.)。因此，以BMP-2為基礎(chǔ)的基因治療還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能運(yùn)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提供一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是將本發(fā)明骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽在臨床上應(yīng)用于促進(jìn)骨再生、骨缺損的修復(fù)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下措施來(lái)達(dá)到一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽，其結(jié)構(gòu)為S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽1)或CCCCDDDS[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYL(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2)。
制備上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽的方法為BMP-2氨基酸序列中的BMP-2II型受體具有很多抗原表位，其特征性的“指節(jié)抗原表位”(Kirsch T，Sebald W，Dreyer MK.Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.Nat Struct Biol，2000，7(6)492-6.)中具有誘導(dǎo)成骨的核心功能區(qū)，其核心功能區(qū)中氨基酸序列為(KIPKASSVPTELSAISTLYL)(Saitoa A，Suzuki Y，Ogataa S，et al.Activation ofosteo-progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogeneticprotein-2knuckle epitope.Biochimica et Biophysica Acta，2003，165160-67.)在其一端加上一個(gè)磷酸化的絲氨酸，另外一端加上三個(gè)天冬氨酸，形成的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽1(S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD)；或在其一端加上四個(gè)半胱氨酸一個(gè)磷酸化的絲氨酸，形成的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽2(CCCCDDDS[PO4]KIPKASSVPTELSAI STLYL)。
兩條多肽均通過(guò)常規(guī)的FMOC/tBu固相多肽合成法(Barany G，Merrifield RB.1979.Solidphase peptide synthesis.InGross E，Meienhofer J.eds.The peptides uol2.New YorkAcademiPc ress.pp 1-284.)采用對(duì)堿不穩(wěn)定的9-芴甲基羰基(Fmoc)保護(hù)氨基酸的α-氨基，采用對(duì)酸不穩(wěn)定的叔丁基型或其它保護(hù)基團(tuán)保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈官能團(tuán)，用聚酰胺樹(shù)脂作為多肽合成的固相載體。所得粗肽經(jīng)過(guò)凝膠層析初步純化，最后經(jīng)過(guò)高效液相色譜法分析其純度，冷凍而得。
這兩條多肽能夠極好的模擬天然骨基質(zhì)的促發(fā)及指導(dǎo)生物礦化的功能，在局部形成偏酸的環(huán)境，促進(jìn)局部的鈣、磷自組裝沉積到體內(nèi)局部組織中膠原纖維表面，生長(zhǎng)成按同一方向排列的、堅(jiān)硬的羥基磷灰石微型晶體結(jié)構(gòu)，形成與天然骨極為相似的結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮與天然BMP-2類似的功能。
與常規(guī)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白藥品相比，該活性多肽具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)該活性多肽可發(fā)揮與其蛋白質(zhì)類似的作用，同時(shí)短鏈多肽活性位點(diǎn)能充分暴露并與細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合，達(dá)到其較好生物活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其異位成骨能力較強(qiáng)(參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)中動(dòng)物體內(nèi)異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究)；(2)此活性多肽兩端的序列中含有磷酸化的絲氨酸、半胱氨酸(兩種氨基酸為極性中性氨基酸)及天冬氨酸(它為酸性氨基酸)，多肽在與相關(guān)基質(zhì)材料結(jié)合后，在模擬體液中其兩端的這些氨基酸能在材料表面形成磷酸基、羧基等陰離子活性基團(tuán)。這些陰離子基團(tuán)是體內(nèi)促發(fā)并指導(dǎo)礦化的重要的功能位點(diǎn)，它們對(duì)鈣磷離子具有很強(qiáng)的的親和力，能促進(jìn)鈣磷離子的沉積、晶體的成核生長(zhǎng)和自組裝礦化，起到調(diào)控機(jī)體內(nèi)生物自組裝礦化的作用。這幾種中性及酸性氨基酸的存在使此活性多肽具有了更好的骨誘導(dǎo)活性，促進(jìn)了其成骨的效能。我們的研究表明磷酸基等陰離子活性基團(tuán)能更好的促進(jìn)基質(zhì)材料的礦化(參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)中材料生物礦化方面的實(shí)驗(yàn)研究)；(3)多肽較易大規(guī)模合成，費(fèi)用更低，大大減輕了骨缺損病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；(4)多肽在與相關(guān)基質(zhì)材料復(fù)合過(guò)程中穩(wěn)定性更好，且復(fù)合后隨著材料本體的逐漸降解而釋放，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，達(dá)到了緩釋的效果，將更好更快的促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。


圖1為磷酸化絲氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
圖2為骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1在Wistar大鼠體內(nèi)異位成骨的CT照片圖。圖3為骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2在Wistar大鼠體內(nèi)異位成骨的CT照片圖。
圖4為光鏡下(×10倍)8周時(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1異位成骨的HE染色切片圖。
圖5為光鏡下(×20倍)8周時(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1異位成骨的HE染色切片圖。
圖6為光鏡下(×10倍)8周時(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2異位成骨的HE染色切片圖。
圖7為光鏡下(×10倍)8周時(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2異位成骨的HE染色切片圖。
圖8為光鏡下(×10倍)8周時(shí)置入單純膠原海綿材料部位的HE染色切片圖。
圖9為鈣離子吸附質(zhì)量分析結(jié)果圖。
圖10為掃描電鏡顯示的PLGA-(PEG-ASP)n支架材料(×50倍)圖。
圖11為掃描電鏡顯示的第8天時(shí)PLGA-(PEG-ASP)n支架材料在模擬體液中(×2000倍)的圖。
圖12為掃描電鏡顯示的第16天時(shí)PLGA-(PEG-ASP)n支架材料在模擬體液中(×3000倍)的圖。
圖13為掃描電鏡顯示的第16天時(shí)PLGA-PEG支架材料在模擬體液中(×3000倍)的圖。
圖14為PLGA-(PEG-ASP)n材料及PLGA-PEG支架材料在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施情況其中圖2，3，4，5，6，7，8為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽1，2置入Wistar大鼠體內(nèi)后異位成骨的影像學(xué)及組織學(xué)檢驗(yàn)圖。其中圖9，10，11，12，13為基質(zhì)材料材料生物礦化的實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果圖。
(1)動(dòng)物體內(nèi)異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究①材料的準(zhǔn)備通過(guò)FMOC/tBu固相多肽合成法(現(xiàn)有常規(guī)方法)分別合成骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽1(S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽2(CCCCDDDS[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYL)。
所用的膠原海綿為武漢博士德公司產(chǎn)品。
以5×5×5mm大小的膠原海綿為支架材料，將兩種骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽以生理鹽水溶解，按照0.4mg劑量分別滴加于膠原海綿上，同時(shí)將等量的生理鹽水滴加于對(duì)照的單純膠原海綿上，待其充分吸收后凍干備用。
②分組將24只Wistar大鼠隨機(jī)平均分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即0.4mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1/膠原海綿組、0.4mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2/膠原海綿組，對(duì)照采用單純膠原海綿。
③植入多肽/膠原海綿及單純膠原海綿實(shí)驗(yàn)大鼠采用氯胺酮腹腔注射麻醉。在背部骶棘肌切口1cm，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別植入0.4mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1/膠原海綿、0.4mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2/膠原海綿于一側(cè)骶棘肌肌肉間隙內(nèi)，對(duì)側(cè)骶棘肌肌肉間隙內(nèi)植入同樣大小的單純的膠原海綿。兩組小鼠分別在植入后3、6、8周行CT攝片檢查，然后處死4只，并對(duì)植入材料的局部組織進(jìn)行取材，甲醛固定后，經(jīng)石蠟包埋切片，H E染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果中影像學(xué)CT檢查顯示分別置入了骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1、2的動(dòng)物體內(nèi)均有明顯的異位成骨(圖2、圖3)；組織學(xué)檢驗(yàn)(圖4、圖5)顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1/膠原海綿組可見(jiàn)明顯新骨形成，且發(fā)育很充分，多數(shù)新骨連續(xù)存在。組織學(xué)檢驗(yàn)(圖6、圖7)顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2/膠原海綿組可見(jiàn)明顯新骨形成，骨小梁較為寬粗，其表面可見(jiàn)成排的活躍的骨細(xì)胞。單純膠原海綿材料組僅見(jiàn)纖維組織形成，未見(jiàn)類骨質(zhì)形成，到8周時(shí)已被完全降解吸收(圖8)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽1及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性多肽2均具有良好的異位成骨能力，和骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有類似的成骨活性，在骨組織工程領(lǐng)域具有前景廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
(2)基質(zhì)材料材料生物礦化的實(shí)驗(yàn)研究①材料的準(zhǔn)備高分子材料丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇(英文名稱PLGA-(PEG-ASP)n)多元共聚物的合成由丙交酯(DLLA)、乙交酯(GA)及天冬氨酸-聚乙烯預(yù)聚物開(kāi)環(huán)共聚合成。材料制成直徑為5mm的圓片狀，厚度為2mm。
高分子材料聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙二醇(英文名稱PLGA-PEG)制成直徑為5mm的圓片狀，厚度為2mm。
②鈣離子吸附質(zhì)量分析40片兩種多聚物材料共分5組，分別放入含有不同鈣離子濃度的NaCl緩沖液(PH＝7.4，150mM)的24孔板中，37度條件下放置。各組中鈣離子的濃度分別為0.05，0.1，1，5及10mM。48小時(shí)后，通過(guò)測(cè)定溶液中殘留的鈣離子的量，得出吸附于每份支架材料上的鈣離子含量。溶液中的鈣離子濃度運(yùn)用比色分析法測(cè)定。
③生物礦化將PLGA-(PEG-ASP)n及PLGA-PEG支架材料放置于24孔組織培養(yǎng)皿中，在各孔中均加入15ml的改良后的模擬體液。分別放置0，4，8，12，16天。每天更換新鮮的模擬體液以保證足夠的離子濃度。改良后的模擬體液的組成為H2O141mM NaCl，4.0mM KCl，0.5mM MgSO4，1.0mM MgCl2，4.2mM NaHCO3，5.0mM CaCl2，and 2.0mm KH2PO4.合成后的溶液用Tris-HCl溶液進(jìn)行緩沖至pH＝6.8。每份材料在每個(gè)培養(yǎng)期處理前及處理后均凍干后進(jìn)行掃描電鏡觀察及質(zhì)量檢測(cè)。
④實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析鈣離子吸附質(zhì)量分析結(jié)果表明PLGA-PEG材料上的鈣離子吸附質(zhì)量明顯少于PLGA-(PEG-ASP)n材料上鈣離子吸附質(zhì)量。另外，兩種材料上鈣離子吸附量均隨溶液中的鈣離子濃度增加而增加(圖9)。
生物礦化結(jié)果表明處理前PLGA-(PEG-ASP)n共聚物支架材料掃描電鏡如圖(圖10)。在不同的培養(yǎng)期，掃描電鏡顯示在PLGA-(PEG-ASP)n共聚物支架材料內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，充滿二氧化碳的低晶狀的羥基磷灰石納米晶體持續(xù)的成核和生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)期的延長(zhǎng)，材料內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)生物礦物的析出范圍明顯增大。8天時(shí)，許多獨(dú)立的礦化晶體在材料內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)生長(zhǎng)(圖11)。16天時(shí)，出現(xiàn)連續(xù)的礦化層，生物礦化晶體顯示出薄片狀的結(jié)構(gòu)形態(tài)(圖12)。PLGA-PEG支架材料表面在各個(gè)培養(yǎng)期均未見(jiàn)明顯的礦物生長(zhǎng)(圖13)。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示隨時(shí)間的增加PLGA-(PEG-ASP)n材料的質(zhì)量有明顯的增加，PLGA-PEG支架材料組的質(zhì)量無(wú)明顯變化(圖14)。
目前普遍采用聚乙二醇(PEG)引發(fā)丙交酯和乙交酯共聚來(lái)改善PLGA材料的親水性。然而，形成的嵌段共聚物中缺乏功能基團(tuán)，難以進(jìn)一步與生物活性分子復(fù)合，材料的細(xì)胞親和性改善不明顯，且材料誘導(dǎo)鈣磷離子的沉積、晶體的成核生長(zhǎng)和自組裝礦化的能力均不強(qiáng)。我們?cè)赑LGA-PEG嵌段共聚物中引入含活性基團(tuán)的氨基酸序列，以期改善以往報(bào)道的該類共聚物中缺乏功能基團(tuán)的缺陷。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)含活性基團(tuán)的氨基酸序列修飾后，產(chǎn)生了表面化學(xué)的差異性，對(duì)于多聚物支架材料上鈣離子吸附量有明顯的影響。天冬氨酸-聚乙二醇預(yù)聚物修飾的PLGA共聚物，具有豐富的陰離子基團(tuán)功能。這些陰離子基團(tuán)是體內(nèi)促發(fā)并指導(dǎo)礦化的重要的功能位點(diǎn)，它們對(duì)鈣磷離子具有很強(qiáng)的的親和力，能促進(jìn)鈣磷離子的沉積、晶體的成核生長(zhǎng)和自組裝礦化，起到調(diào)控機(jī)體內(nèi)生物自組裝礦化的作用。
序列表<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院<120>骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽及制備方法和應(yīng)用<130>無(wú)<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>磷酸化絲氨酸<222>(1)..(1)<223>
<400>1Ser Lys Ile Pro Lys Ala Ser Ser Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile1 5 10 15Ser Thr Leu Tyr Leu Asp Asp Asp20<210>2<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>磷酸化絲氨酸<222>(8)..(8)
<223>
<400>2Cys Cys Cys Cys Asp Asp Asp Ser Lys Ile Pro Lys Ala Ser Ser Val1 5 10 15Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Thr Leu Tyr Leu20 2權(quán)利要求
1.一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽，其特征在于其結(jié)構(gòu)為S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD或CCCCDDDS[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYL。
2.制備權(quán)利要求1所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽的方法，它包括如下步驟BMP-2氨基酸序列BMP-2II型受體具有很多抗原表位，其特征性的“指節(jié)抗原表位”中具有誘導(dǎo)成骨的核心功能區(qū)，核心功能區(qū)中氨基酸序列的結(jié)構(gòu)為KIPKASSVPTELSAISTLYL；其特征在于在所述KIPKASSVPTELSAISTLYL的一端加一個(gè)磷酸化的絲氨酸，另一端加三個(gè)天冬氨酸，可得到骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽1，其結(jié)構(gòu)為S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD；在所述KIPKASSVPTELSAISTLYL的一端有四個(gè)半胱氨酸和一個(gè)磷酸化的絲氨酸，可得到骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽2，其結(jié)構(gòu)為CCCCDDDS[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYL。
3.骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽在藥物制備中的應(yīng)用，所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽為骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽1或骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽2；其特征在于該藥物用于治療促進(jìn)骨再生、骨缺損修復(fù)。
全文摘要
一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽，其特征在于其結(jié)構(gòu)為S
文檔編號(hào)C07K1/00GK1752103SQ200510019679
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月27日
發(fā)明者郭曉東, 鄭啟新, 袁泉, 段德宇, 劉建湘, 段智霞, 別婧華 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院