專利名稱：一種法氏囊素三肽合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制劑的合成方法，尤其是涉及一種法氏囊素三肽合成方法。
背景技術(shù)：
病毒性傳染病的發(fā)生是影響畜牧業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素，大多數(shù)病原微生物侵入機(jī)體后，能造成免疫器官包括法氏囊素的損傷，使機(jī)體免疫功能低下，抗病力減弱，使疫病進(jìn)一步發(fā)展，同時(shí)，引發(fā)繼發(fā)感染及免疫失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，實(shí)踐證明，單純依靠疫苗免疫一方面由于多種原因引起的免疫失敗，另一方面由于疫苗本身保護(hù)率的限制，很難完全防止傳染病的發(fā)生，因而，探求免疫增強(qiáng)劑，保護(hù)、提高機(jī)體免疫力和研制積極有效的病毒性疾病防治方法，已成為世界各國獸醫(yī)工作者努力的熱點(diǎn)。
目前研究較多的免疫增強(qiáng)劑主要有微生物、化學(xué)劑、生物劑、生物制劑和中藥制劑，生物制劑的免疫增強(qiáng)效果好，但由于成本高而極大地限制了其在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用。因此，降低成本或探求成本低廉、效果好的免疫增強(qiáng)劑已成為獸醫(yī)工作者的一項(xiàng)重要任務(wù)。
法氏囊素是法氏囊組織提取物中唯一一種化學(xué)組成已被確定的生物活性分子，由T.Audhya等于1986年從雞法氏囊組織抽提液中純化并定名，其化學(xué)組成為三肽，即Lys-His-Gly-NH2。研究證明BS在體外具有誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞系分化的功能，并對B淋巴細(xì)胞抑制有拮抗作用，能提高人B細(xì)胞系-Duadi細(xì)胞內(nèi)cGMP水平，發(fā)育生物學(xué)研究表明，BS能保護(hù)和促進(jìn)法氏囊的正常發(fā)育，對雞的促腎上腺皮質(zhì)激素中樞和生物節(jié)律調(diào)節(jié)中樞的形成和發(fā)育起關(guān)鍵作用。
對法氏囊素的研究表明顯示BS在提高機(jī)體免疫力及作為免疫增強(qiáng)劑，在提高疫苗效果和疫病防治等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而BS在哺乳動(dòng)物及人類某些方面的免疫功能更顯示了廣泛的應(yīng)用前景。但是由于法氏囊素其在組織內(nèi)含量甚微，加之法氏囊素組織本身體積較小，因而很難獲得大量純品，限制了其研究與應(yīng)用，在此情況下，建立人工合成方法，使BS的產(chǎn)量提到提高具有十分誘人的前景，同時(shí)具有重大的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
針對傳統(tǒng)方法對法氏囊素制取較難，制取量小的問題，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低的法氏囊素三肽合成方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種法氏囊素三肽合成方法，其特征在于合成方法按如下步驟進(jìn)行氨基酸保護(hù)→保護(hù)組氨酸-甘氨酸甲酯二肽合成→保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的脫氨基保護(hù)→保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成→保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的脫氨基保護(hù)→法氏囊素三肽粗品的合成→法氏囊素三肽粗品的純化，其中(1)氨基酸保護(hù)a、將賴氨酸、組氨酸溶于NaOH中，置冰鹽浴中冷卻，攪拌下滴入預(yù)先用THF溶解的Z-Cl或Fmoc-Cl或(Boc)2O，同時(shí)滴入NaOH使溶液保持pH＝8～10。加完后自然升溫至室溫，繼續(xù)攪拌0.5～2小時(shí)，然后，用乙醚洗2～3次，分去醚層，水相在攪拌下滴入鹽酸使pH＝0.5～1.5，再加入乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌5～10分鐘后分液，乙酸乙酯層用稀NaCl洗至中性、無水Na2SO4干燥、減壓蒸餾除去乙酸乙酯溶劑，最后得到氨基保護(hù)賴氨酸Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys和氨基保護(hù)組氨酸Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His；b、將甘氨酸溶于甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-5～-10℃，緩慢滴入氯化亞砜，再加入濃硫酸，15～25℃放置1.5～4小時(shí)，再在70～80℃水浴回流30～50分鐘，然后，減壓蒸餾除去甲醇后加入乙醚，0～4℃放置1～2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用無水乙醇洗滌結(jié)晶，最后得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成取Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His溶解于水四氫呋喃中，用冰鹽浴冷至-5～0℃，在攪拌過程中分別滴入預(yù)先用四氫呋喃溶解的HOSu和DCC或HOBt和DCC。滴完后在-5～0℃反應(yīng)20～60分鐘，然后在-5～0℃加入預(yù)先用DMF溶解的GlyOCH3及NMM，再在-5～0℃反應(yīng)20～60分鐘，然后室溫反應(yīng)2～6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋蒸至干，加入水和乙酸乙酯，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌，并用無水Na2SO4干燥8～16小時(shí)、過濾、旋蒸出乙酸乙酯，最后得到為淡黃色粘稠液體的保護(hù)基2-His-GlyOCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成；將上述淡黃色粘稠液體的保護(hù)基2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢瑁敝敛辉傥龀龃罅堪咨恋頌橹?，反?yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，最后得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF中，并加入N-甲基嗎啉(NMM)，然后在-5～0℃攪拌20～60分鐘，得到待用化合物；將氨基保護(hù)賴氨酸Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys，用適量THF溶解，冰鹽浴冷卻至0～5℃，在該溫度下滴加用THF溶解的DCC，HOSu或DCC，HOBt。滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～4小時(shí)，然后在0～5℃滴入待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0～5℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)20～60分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24～48小時(shí)，待反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，再加入乙酸乙酯，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層用乙酸乙酯萃取2～3次，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸、飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌，洗至pH＝6～7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥8～16小時(shí)、過濾、減壓旋蒸出溶劑，最后得到保護(hù)基2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將保護(hù)基2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?～6小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0～5℃，通入干燥的NH3至溶液飽和，室溫放置3天以上，然后將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，最后得到粗品；(7)、純化將上述粗品用無水乙醇溶解，再過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，最后得純度達(dá)95％以上的法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl。
在所述的保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成方法中，在Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His加入預(yù)先用DMF溶解的GlyOCH3及NMM后，在反應(yīng)過程中用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，該TLC的薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色。
在所述的保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成方法中，在Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys滴入待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液后，在反應(yīng)過程中用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。
本方案改變了以前從雞法氏囊組織抽提法氏囊素的狀況，因?yàn)榉ㄊ夏宜仄湓诮M織內(nèi)含量甚微，加之法氏囊素組織本身體積較小，很難獲得大量純品，限制了其研究與應(yīng)用，而通過本發(fā)明的合成方法，可以大量合成制取高純度的法氏囊素三肽，因而使BS的產(chǎn)量得到了提高，生產(chǎn)成本降低，具有十分誘人的前景，而且具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明實(shí)施例1(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.1克賴氨酸、13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·1-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的34.1克Z-Cl，同時(shí)滴加入2mol·1-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升溫至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·1-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌5分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Z2-Lys和Z2-His；b、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃溫度下放置2小時(shí)，70℃溫度下水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解，減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚，有大量結(jié)晶析出，2℃溫度下放置1.5小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取11.73克Z2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的0.87克HOSu和6.16克DCC，用滴液漏斗加入，滴畢，于0℃溫度下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃溫度下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Z2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Z2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢瑁敝敛辉傥龀龃罅堪咨恋頌橹?，反?yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；
(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用化合物；在250毫升圓底燒瓶中加入21.91克Z2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至2℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后在3℃溫度下用滴液漏斗滴加待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在5℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)。用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝6，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將上述Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0～5℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例2(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.1克賴氨酸、13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9。加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌8分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Z2-Lys和Z2-His；
b、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解。減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，4℃放置1小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶。得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取11.73克Z2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的1.03克HOBt和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥14小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Z2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Z2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用化合物；在250毫升圓底燒瓶中加入21.91克Z2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.51克HOBt。滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時(shí)。然后在0℃用滴液漏斗滴加待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝6，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0～5℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例3(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.1克賴氨酸、13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌6分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-Lys和Boc2-His；b、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解。減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，0℃放置1小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的0.87克HOSu和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到(His-Gly OCH3·HCl)；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用化合物；在250毫升圓底燒瓶中加入19.03克Boc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后在0℃用滴液漏斗滴加待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Boc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將上述Boc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例4(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.1克賴氨酸、13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9。加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)。用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH值1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌6分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Z2-Lys和Z2-His；b、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，70℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解，減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出。4℃放置2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶。得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的1.03克HOBt和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)。滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3，及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，達(dá)到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入19.03克Boc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至5℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.51克HOBt，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時(shí)。然后在0℃用滴液漏斗滴加待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在5℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Boc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Boc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例5(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.1克賴氨酸、13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的52克Fmoc-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌10分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Fmoc2-Lys和Fmoc2-His；b、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升。20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解。減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，0℃放置2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶。得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取16.81克Fmoc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的0.87克HOSu和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3，及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)。合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Fmoc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Fmoc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢瑁敝敛辉傥龀龃罅堪咨恋頌橹?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成。
將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入31.61克Fmoc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后在0℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天。將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化。
將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例6(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.1克賴氨酸、13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的52克Fmoc-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)。用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌8分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Fmoc2-Lys和Fmoc2-His；b、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，75℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解。減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，0℃放置2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取16.81克Fmoc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的1.03克HOBt和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)。滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3，及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Fmoc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Fmoc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入31.61克Fmoc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.51克HOBt，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后在3℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在3℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH值6～7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例7(1)、氨基酸保護(hù)
a、將13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌5～10分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-His；b、將13.1克賴氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的52克Fmoc-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌6分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Fmoc2-Lys；c、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升。20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解，減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，0℃放置2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的0.87克HOSu和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)。合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢瑁敝敛辉傥龀龃罅堪咨恋頌橹?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；
(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入31.61克Fmoc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時(shí)，然后在0℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例8(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌10分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-His；b、將13.1克賴氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的52克Fmoc-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)。用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌10分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Fmoc2-Lys；c、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解。減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，4℃放置1小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的1.03克HOBt和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3，及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入31.61克Fmoc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時(shí)，然后在0℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝6，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥14小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例9a、將13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌10分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-His；b、將13.1克賴氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的34.1克Z-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌10分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Z2-Lys；c、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，70℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解，減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，4℃放置1小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的0.87克HOSu和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴完，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入21.91克Z2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)。然后在0℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝6，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例10a、將13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌8分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-His；b、將13.1克賴氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的34.1克Z-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌8分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Z2-Lys；c、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升。20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解，減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，0℃放置2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的1.03克HOBt和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)。滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)。合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)。合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥過夜，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體(Boc2-His-Gly OCH3·HCl)加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入21.91克Z2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至2℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.27克HOSu，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后在0℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝6，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天。將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例11(1)、氨基酸保護(hù)a、將13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌8分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-His；b、將13.1克賴氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的52克Fmoc-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌8分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Fmoc2-Lys；c、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，80℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解。減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，3℃放置1小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的0.87克HOSu和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)，合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入31.61克Fmoc2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至3℃，在該溫度下滴加用THF溶解的1.81克DCC，1.51克HOBt，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后在4℃用滴液漏斗滴加待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在3℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝6，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥13小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Fmoc2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-Gly OCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至2℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例12a、將13.9克組氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的22克(Boc)2O，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌7分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Boc2-His；b、將13.1克賴氨酸溶于50毫升2mol·l-1NaOH中，冰鹽浴，攪拌下滴加入預(yù)先用THF溶解的34.1克Z-Cl，同時(shí)滴加入2mol·l-1NaOH使溶液保持pH＝9，加畢，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用50毫升乙醚洗兩次，分去醚層，水相在攪拌下滴加入6mol·l-1鹽酸至pH＝1，加入75毫升乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌7分鐘，分液，乙酸乙酯層用5％NaCl洗至中性，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得到Z2-Lys；c、將5.9克甘氨酸溶于50毫升甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-10℃，緩慢滴加氯化亞砜20毫升，再加入98％濃硫酸10毫升，20℃放置2小時(shí)，75℃水浴回流30分鐘，使甘氨酸全部溶解，減壓蒸餾除去甲醇后加入50毫升乙醚.有大量結(jié)晶析出，2℃放置1.5小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用25毫升無水乙醇洗滌結(jié)晶，得到GlyOCH3。
(2)、保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成稱取10.0克Boc2-His溶解于50毫升無水THF中，用冰鹽浴冷至0℃，于攪拌下，分別加入預(yù)先用四氫呋喃溶解的1.03克HOBt和6.16克DCC(用滴液漏斗加入)，滴畢，于0℃下反應(yīng)30分鐘，然后在0℃下加入預(yù)先用DMF溶解的3.54克GlyOCH3及1.2克NMM，再在0℃下反應(yīng)30分鐘，然后室溫反應(yīng)4小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入水30毫升，乙酸乙酯50毫升，轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取(2×40毫升)。合并有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(2×30毫升)，合并有機(jī)層，并用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，旋蒸出乙酸乙酯，得淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸-甘氨酸二肽的合成將上述淡黃色粘稠液體Boc2-His-Gly OCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為?大約2～4小時(shí))，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將14.4g的His-Gly OCH3·HCl溶于適量的DMF(10～15ml)中，并加入5.7克N-甲基嗎啉(NMM)，然后0℃下攪拌30分鐘，得到待用混合物；在250毫升圓底燒瓶中加入21.91克Z2-Lys，用適量THF溶解(約50毫升)，冰鹽浴冷卻至0℃，在該溫度下滴加用THF溶解的11.81克DCC，1.51克HOBt，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3小時(shí)。然后在0℃用滴液漏斗滴加待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，在0℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)36小時(shí)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程(薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色)，反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，加入60ml乙酸乙酯，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層再用乙酸乙酯萃取2次(2×60毫升)，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌(3×30毫升)，洗至pH＝7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥12小時(shí)，過濾，減壓旋蒸出溶劑，得到Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將Z2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入大約150ml飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至4℃，通入干燥的NH3至溶液飽和(約4～6小時(shí))，室溫放置3天，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑得到粗品；(7)、純化將粗品用無水乙醇溶解，過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl，純度達(dá)95％以上。
權(quán)利要求
1.一種法氏囊素三肽合成方法，其特征在于合成方法按如下步驟進(jìn)行氨基酸保護(hù)→保護(hù)組氨酸-甘氨酸甲酯二肽合成→保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的脫氨基保護(hù)→保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成→保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的脫氨基保護(hù)→法氏囊素三肽粗品的合成→法氏囊素三肽粗品的純化，其中(1)氨基酸保護(hù)a、將賴氨酸、組氨酸溶于NaOH中，置冰鹽浴中冷卻，攪拌下滴入預(yù)先用THF溶解的Z-Cl或Fmoc-Cl或(Boc)2O，同時(shí)滴入NaOH使溶液保持pH＝8～10。加完后自然升溫至室溫，繼續(xù)攪拌0.5～2小時(shí)，然后，用乙醚洗2～3次，分去醚層，水相在攪拌下滴入鹽酸使pH＝0.5～1.5，再加入乙酸乙酯，繼續(xù)攪拌5～10分鐘后分液，乙酸乙酯層用稀NaCl洗至中性、無水Na2SO4干燥、減壓蒸餾除去乙酸乙酯溶劑，最后得到氨基保護(hù)賴氨酸Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys和氨基保護(hù)組氨酸Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His；b、將甘氨酸溶于甲醇中，置冰鹽浴中冷卻至-5～-10℃，緩慢滴入氯化亞砜，再加入濃硫酸，15～25℃溫度下放置1.5～4小時(shí)，再在70～80℃水浴回流30～50分鐘，然后，減壓蒸餾除去甲醇后加入乙醚，0～4℃溫度下放置1～2小時(shí)，待結(jié)晶完全后，過濾，再用無水乙醇洗滌結(jié)晶，最后得到GlyOCH3；(2)、保護(hù)組氨酸—甘氨酸二肽的合成取Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His溶解于水四氫呋喃中，用冰鹽浴冷至-5～0℃，在攪拌過程中分別滴入預(yù)先用四氫呋喃溶解的HOSu和DCC或HOBt和DCC，滴完后在-5～0℃溫度下反應(yīng)20～60分鐘，然后在-5～0℃溫度下加入預(yù)先用DMF溶解的GlyOCH3及NMM，再在-5～0℃溫度下反應(yīng)20～60分鐘，然后室溫反應(yīng)2～6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，將濾液旋蒸至干，加入水和乙酸乙酯，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗分液，水相用適量的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯有機(jī)層，分別用蒸餾水，飽和檸檬酸，飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌，并用無水Na2SO4干燥8～16小時(shí)、過濾、旋蒸出乙酸乙酯，最后得到為淡黃色粘稠液體的保護(hù)基2-His-GlyOCH3·HCl；(3)、脫氨基保護(hù)的組氨酸—甘氨酸二肽的合成；將上述淡黃色粘稠液體的保護(hù)基2-His-GlyOCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?，直至不再析出大量白色沉淀為止，反?yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，最后得到His-GlyOCH3·HCl；(4)、保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成將His-GlyOCH3·HCl溶于適量的DMF中，并加入NMM，然后在-5～0℃溫度下攪拌20～60分鐘，得到待用化合物；將氨基保護(hù)賴氨酸Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys，用適量THF溶解，冰鹽浴冷卻至0～5℃，在該溫度下滴加用THF溶解的DCC，HOSu或DCC，HOBt，滴畢后，在該溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～4小時(shí)，然后滴入上述待用化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液，滴畢，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20～60分鐘，然后升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24～48小時(shí)，待反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液過濾，濾液旋蒸至干，再加入乙酸乙酯，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入蒸餾水，分液，水層用乙酸乙酯萃取2～3次，合并有機(jī)層，分別用飽和檸檬酸、飽和NaHCO3液和飽和NaCl液洗滌，洗至pH＝6～7，有機(jī)層用無水Na2SO4干燥8～16小時(shí)、過濾、減壓旋蒸出溶劑，最后得到保護(hù)基2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脫氨基保護(hù)的賴氨酸-組氨酸-甘氨酸三肽的合成將保護(hù)基2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入飽和的無水HCl-乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?～6小時(shí)，反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成將Lys-His-Gly OCH3·HCl用無水乙醇溶解，用冰鹽浴冷卻至0～5℃，通入干燥的NH3至溶液飽和，室溫放置3天以上，然后將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，最后得到粗品；(7)、純化將上述粗品用無水乙醇溶解，再過濾，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，最后得純度達(dá)95％以上的法氏囊素三肽純品Lys-His-Gly-NH2·HCl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種法氏囊素三肽合成方法，其特征在于在所述的保護(hù)組氨酸-甘氨酸二肽的合成方法中，在Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His加入預(yù)先用DMF溶解的GlyOCH3及NMM后，在反應(yīng)過程中用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，該TLC的薄層板為市售硅膠G板，展開劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液顯色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種法氏囊素三肽合成方法，其特征在于在所述的保護(hù)賴氨酸-組氨酸-甘氨酸的合成方法中，在Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys滴入待用的化合物和N-甲基嗎啉DMF溶液后，在反應(yīng)過程中用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。
全文摘要
一種法氏囊素三肽合成方法，合成方法按如下步驟進(jìn)行氨基酸保護(hù)→保護(hù)組氨酸－甘氨酸甲酯二肽合成→保護(hù)組氨酸－甘氨酸二肽的脫氨基保護(hù)→保護(hù)賴氨酸－組氨酸－甘氨酸的合成→保護(hù)賴氨酸－組氨酸－甘氨酸的脫氨基保護(hù)→法氏囊素三肽粗品的合成→法氏囊素三肽粗品的純化，本發(fā)明的合成方法，可以大量合成制取高純度的法氏囊素三肽，因而使BS的產(chǎn)量得到了提高，生產(chǎn)成本降低，同時(shí)具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C07K5/00GK1696151SQ200510020910
公開日2005年11月16日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日
發(fā)明者曹冶, 李鍵, 靳亞平, 李清寒, 張紅, 趙素君, 李紅, 周洪群 申請人:四川鍵宇胚胎工程有限公司